SU1720003A1 - Способ определени липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови - Google Patents
Способ определени липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови Download PDFInfo
- Publication number
- SU1720003A1 SU1720003A1 SU904777248A SU4777248A SU1720003A1 SU 1720003 A1 SU1720003 A1 SU 1720003A1 SU 904777248 A SU904777248 A SU 904777248A SU 4777248 A SU4777248 A SU 4777248A SU 1720003 A1 SU1720003 A1 SU 1720003A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- marker
- determination
- liposomes
- complement
- accuracy
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims abstract 2
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 abstract description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 abstract description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 abstract 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- UCQFCFPECQILOL-UHFFFAOYSA-N diethyl hydrogen phosphate Chemical compound CCOP(O)(=O)OCC UCQFCFPECQILOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008344 egg yolk phospholipid Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний. Цель изобретени - повышение точности способа. Определ емый антиген обрабатывают 0,1 н.щелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин, встраивают его в мембрану липосом, внутрь липосомы включают маркер, в качестве которого используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальци , и определ ют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплементзависимого лизиса и по рассчитанной доле иммунного лизиса по калибровочной кривой определ ют концентрацию липополисахаридных антигенов. Способ позвол ет повысить точность определени в 2-3 раза. 3 табл.
Description
Изобретение относитс к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний.
Цель изобретени - повышение точности способа.v
Способ осуществл ют следующим образом .
Осуществл ют встраивание определ емого антигена (АГ) в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосомы, проведение реакции комплемент-зависимого лизиса с последующим определением АГ по выходу маркера из лизированных липосом. Перед включением маркера определ емый АГ обрабатывают 0,1 N сцелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин. В качестве маркера используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальцин. Определ ют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплемент-зависимого лизиса липосом с контрол ми и рассчитывают долю иммунного лизиса по выражению
ю
о
F6-(F3-Fi) + F5 F2-(F3-Fi) + F4
х 100%, (1)
о ы
где Fi - интенсивность флуоресценции суспензии липосом;
F2 - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой стандартной антисыворотки и комплемента:
Рз - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только стандартной антисыворотки;
F4 интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только комплемента;
FS - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки больного и комплемента;
Fe - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки боль- ного, комплемента, стандартной антисыворотки.
Концентрацию липополисахаридных антигенов определ ют по калибровочной кривой.
Пример 1. Получение липосомаль- ного иммунореагента.
Раствор липидов - ичный лецитин, холестерин , дицетилфосфат(в мол рном соотношении 2:1, 5:0,22) в смеси хлороформ, метанол (2:1 пообъему)упариваютна роторном- испарителе до образовани липидной пленки. Полученную пленку липидов раствор ют в 1,5 мл диэтилового эфира, добавл ют 0,5 мл раствора липополисахарида (ЛПС), предварительно обработанного 0,1 N NaOH и содержащего 175 мМ кальцеина.
Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука в дезинтеграторе при частоте 22 кГц в течение 20-30 с. Полученную эмульсию упаривают на роторном испарителе до образовани твердого гел при 35-45 КПа. а затем при 25 КПа до полного удалени эфира. Невключающийс маркер отдел ют гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-50. Полученный липосомальный иммунореагент сохран етс при +4°С в течение 3-4 мес цев без утраты своей биологической активности.
П р и м е р 2. Количественное определение содержани ЛПС в сыворотке крови больного.
В две пробирки внос т по 10 мкл сыворотки больного и по 20 мкл антисыворотки с разведением 1:32.
Через 10 мин инкубации при комнатной температуре добавл ют 40 мкл (60 нмолей липида) суспензии липосомального иммунореагента , дополнительно инкубируют 10 мин, после чего внос т 10 мкл триссолевого буфера, содержащего 5 мМ MgCfe и 1,5 мМ CaCl2 и 20 мкл комплемента, в качестве которого используют сыворотку крови морской свинки или кролика. Объем смеси довод т до ТОО мкл трис-солевым буфером. Параллельно став т контроли на неспецифический лизис липисом антисывороткой и исследуемой сывороткой больного в присутствии комплемента. Через 30 мин реакции останавливают 3 мл трис-солевого буфера. Флуоресценцию измер ют в кювете с длиной оптического пути 1 см или пробирке при длине волн эмиссии и возбуждени 493 и 520 нм соответственно.
Расчет величины иммунного лизиса
проводитс по уравнению (1), при этом берутс средние значени двух параллельных измерений. По калибровочной кривой опре- дел ют содержание ОПС-антигена в мкг/мл, которое дл трех образцов сывороток больных сальмонеллезом составило 0,7; 11,2; 29,5 мкг Л ПС/мл образца сыворотки крови больного.
В табл. 1 отражены результаты определени интенсивности флуоресценции и расчет величины концентрации и процента иммунного лизиса дл трех различных сывороток больных с различными содержани ми соматического 0-антигена Salmonella fyphlmurium в сыворотке крови.
П р и м е р 3. Повышение воспроизводимости и точности метода.
Липосомы приготовили, как указано в примере 1, определение антигена провод т,
как указано в примере 2. В табл. 2 приведены значени доли иммунного лизиса и концентрации антигена, определенного с одной партией липосом в сыворотке крови больного, что отражает воспроизводимость
метода.
В табл. 3 приведены значени определени величин иммунного лизиса, соответствующего определенным концентраци м ЛПС-антигена в растворе. Дл проведени
анализа вз ты приготовленные каждый раз заново партии липосомального иммунореагента , что отражает воспроизводимость метода .
П р и м е р 4. Построение калибровочной кривой.
Дл построени калибровочной кривой готов т р д разведений стандартного раствора ЛЛС S. ityphlmurulm в трис-солевом
буфере. 10 мкл раствора ЛПС каждой концентрации смешивают с 20 мкл стандартной антисыворотки. Используют такое разведение антисыворотки, которое дает 90-60% от максимального иммунного лизиса. Определ ют иммунный лизис в тех же услови х, что ис образцами сыворотки больного. Став т также контроли: липосомы только с буферным раствором, липосомы только с антисывороткой , липосомы только с
комплементом. За 100% принимают величину иммунного лизиса липосом в отсутствие ЛПС. Диапазон измер емых концентраций от 0,5 до 200 мкл/ЛПС/мл исходного раствора . Стро т кривую зависимости величины иммунного лизиса от логарифма концентрации Л ПС в растворе.
Предложенный способ позвол ет в 2-3 раза повысить точность в сравнении с известным способом.
Изобретением может быть использовано в практике здравоохранени дл экспресс- диагностики инфекционных заболеваний и определени т жести их протекани контрол загр знени окружающей среды, в научно- исследовательской практике дл изучени динамики антигенемии при экспериментальном инфицировании животных.
Предложенный способ легко может быть автоматизирован, требует малого (10 мкл) количества исследуемой сыворотки.
0
5
Claims (1)
- Формула изобретени Способ определени липополисахарид- ных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови, включающий встраивание антигена в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосом, проведение реакции комплементозависимого лизиса с последующим определением антигена по выходу маркера, отличающ и и с тем, что, с целью повышени точности способа, липополисахариды перед встраиванием в липосомы обрабатывают 0.1 н.щелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин, в качестве маркера используют кальцеин, невключившийс маркер отдел ют гельфильт- рацией, а выход маркера определ ют флюориметрически.Таблица 1Таблица 2Таблица 3
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU904777248A SU1720003A1 (ru) | 1990-01-05 | 1990-01-05 | Способ определени липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU904777248A SU1720003A1 (ru) | 1990-01-05 | 1990-01-05 | Способ определени липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1720003A1 true SU1720003A1 (ru) | 1992-03-15 |
Family
ID=21488923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU904777248A SU1720003A1 (ru) | 1990-01-05 | 1990-01-05 | Способ определени липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1720003A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2146368C1 (ru) * | 1997-10-21 | 2000-03-10 | Осипов Георгий Андреевич | Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорганизма |
-
1990
- 1990-01-05 SU SU904777248A patent/SU1720003A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Власов П. С. и др. Журн. микробиологии и экспериментальной иммунологии, 1985, № 8. с. 81-91. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2146368C1 (ru) * | 1997-10-21 | 2000-03-10 | Осипов Георгий Андреевич | Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорганизма |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schild et al. | A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: Proposals for an assay method for the haemagglutinin content of influenza vaccines | |
| Brown et al. | Safranin O-stained antigen microagglutination test for detection of Brucella antibodies | |
| Mikac-Dević et al. | A method for determination of free fatty acids in serum | |
| RU2244933C2 (ru) | Антигенная композиция и способ обнаружения присутствия treponema pallidum у человека | |
| CN106290907B (zh) | 全血中血清淀粉样蛋白a定量检测试剂以及检测方法 | |
| SU1720003A1 (ru) | Способ определени липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови | |
| CN106124768A (zh) | 一种一步均相saa检测试剂盒及其制备和使用方法 | |
| JP2002525605A (ja) | サルモネラ抗原処方物及びサルモネラ抗体検出用キット | |
| CN120427352A (zh) | 一种样本稀释液及其制备方法和应用 | |
| US20190331680A1 (en) | Method for stabilizing glycerophospholipids and reagents using same | |
| JPH08304406A (ja) | カリブレーターマトリックス | |
| JP2577930B2 (ja) | 抗ストレプトリジンｏの新規測定法 | |
| RU2203499C1 (ru) | Способ постановки диагностической реакции при бруцеллезе | |
| US7081348B2 (en) | Immunoassay of human medullasin and diagnosis of multiple sclerosis using the same | |
| RU2008684C1 (ru) | Способ диагностики иерсиниоза | |
| RU2203495C2 (ru) | Способ липосомального иммуноанализа для детектирования аналитов в образце | |
| US4224306A (en) | Preparation of an infectious mononucleosis antibody neutralizing antigen and product thereof | |
| EP0518319A2 (en) | Liposome immunoassays for detection of antigens, antibodies and haptens | |
| RU2290642C2 (ru) | Тест-система для количественного определения анти-hbs в биологическом образце | |
| US4228148A (en) | Heterophil antibody differentiation (HAD) test | |
| CN101451993A (zh) | 抗Lp(a)抗体制备及检测Lp(a)的诊断试剂盒 | |
| SU1394708A1 (ru) | Способ количественного определени вирусов | |
| Umeda et al. | Homogeneous liposome lysis assay for determination of anti-streptolysin O antibody titer in serum | |
| JPH0758293B2 (ja) | 抗ストレプトリジンｏ価の測定法 | |
| RU2176794C2 (ru) | Способ иммунодиагностики инфекций |