JPH08304406A - カリブレーターマトリックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、免疫検定法または臨床化学試験な
どの血清中のアナライトに係わる試験の校正に使用する
ための改良されたカリブレーターマトリックスおよびこ
のような検定方法において、さらに正確な校正曲線を得
るために、このカリブレーターを使用することに関す
る。 【構成】 カリブレーターマトリックスに関する本発明
による改良は、脂質を取り除いた血清に、脂質製剤、例
えばコレステロールまたはトリグリセライドなどを添加
することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫検定法または臨床
化学試験などの血清中のアナライトの試験法の校正（ｃ
ａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）に使用するための改良されたカ
リブレーターマトリックス（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｍ
ａｔｒｉｘ）およびこのような検定法のための特に正確
な校正曲線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）を
作成するために、当該カリブレーターを使用することに
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】免疫検定法および臨床化学試験法は通
常、一般的には生物学的液体である種々の媒質中の特定
の成分、すなわちアナライトの検出および定量に使用さ
れる技術である。この目的に使用される化学試験では、
試験用試薬との相互反応による、アナライトそれ自体の
化学的変換から生じる、検定媒質中の検知できる変化が
追跡される。免疫検定法では、特定の抗体にアナライト
が結合することによって生じる検定媒質中の検知可能な
変化をモニターするという意味で、免疫検定法は本来そ
れほど直接的ではない。このために、免疫検定法では、
アナライトに特異的な抗体および共役体（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ）（またはトレーサー）が使用される。この共役
体（またはトレーサー）は、検知できるシグナルを発生
することができる部分を有するアナライト、アナライト
類縁体または抗体のいずれかである。免疫検定の実施に
は各種方法が開発されており、これらの方法では、結合
すると、共役体によって発生する検知可能なシグナルに
変化がもたらされる種々の技術が採用されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】この検定法からの検知
可能なシグナルを、定量的結果またはアナライト濃度に
変換するためには、この検定法を校正しなければならな
い。この校正は、先ず既定濃度の一連の試料を用いて検
定を行うことによってなされる。これらの試料は、カリ
ブレーターとして知られている。このカリブレーターか
らのシグナルを読み取ることによって得られる結果を使
用して、全検定範囲を走査する校正曲線が、種々の曲線
適合モデルを使用して作成される。次いで、この校正曲
線を使用して、未知試料が発生するシグナルから、その
濃度を決定することができる。カリブレーターまたは試
験マトリックスのどちらかが、時間の経過にしたがい変
化する場合には、当該カリブレーターはしばしば、検定
に対して患者の血清とは異なって応答し、これによりこ
の校正は無効になる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明の目的
は、特に信頼できるカリブレーターおよび校正曲線を得
るための手段を提供することにある。ここに、脂質を取
り除いた血清に、脂質、例えばコレステロール製剤また
はトリグリセライド製剤などを添加することによって、
患者の試料にさらに類似した様相で、検定試薬における
変化に応答するカリブレーターが提供されることが見出
だされた。さらに詳細に言えば、カリブレーターに使用
されるマトリックスは、或る問題を提供する。例えば、
安定性、利用性および感染危険性などの種々の理由か
ら、非生物学的液体、例えば緩衝剤水溶液から形成され
たカリブレーターの使用が望ましい。しかしながら、多
くの場合、マトリックス効果により、このような可能性
が排除されてしまうのである。

【０００５】かなりの場合に、それらの正確な起因は充
分に理解されていないが、「マトリックス効果」は良く
知られており、生物学的検定に関連する厄介な現象であ
る。血清などの生物学的液体は、主要部分は水が占めて
いるのではあるが、他の種々の成分の完全混合物を含有
している。このような成分の中の或るものは検定に影響
を及ぼすことがあり、このような場合には、血清などの
１種の液体中の或る濃度のアナライトによって発生する
シグナルは、純水などの異なる媒質中の同一濃度のアナ
ライトから発生するシグナルとは、有意に異なったもの
になることがある。マトリックス効果はまた、相互に密
接に類似しているマトリックス間、例えばヒト血清と他
種の血清、あるいは程度は小さいが、異なる個人からの
ヒト血清どうしの間、でもしばしば見られる。

【０００６】マトリックス効果は、種々の理由で生じう
る。例えば、カリブレーターと試験マトリックスの物理
的性質の相違、例えば粘度および色、ｐＨ、イオン強
度、塩濃度、蛋白質濃度、および干渉性物質の相違は、
マトリックス効果をひき起こし得る幾つかの因子であ
る。マトリックス効果は、検定における問題点の有力な
原因であり、様々な様相で、共通して精度に影響を及ぼ
す。カリブレーターマトリックスと患者の試料との間に
見出だされるマトリックス効果は、精度に影響を及ぼす
ばかりでなくまた、当該検定法の有効寿命にも影響を及
ぼす。

【０００７】検定安定性とは、経過時間にわたる検定パ
ラメーターの変化を意味する。検定有効寿命とは、その
検定法が依然としてその要件を完全に満たしており、そ
の特定の用途に応じて正確な結果を提供することができ
る期間を意味する。検定用試薬が化学的に不安定である
と、経過時間にわたり、或るレベルのアナライトに対し
て、当該検定によって生成するシグナルのレベルの変化
が生じる。検定における、このような変化は多くの場
合、比較的短時間の経過時点で見られる。このことは、
しかし、或る期間で当該検定を再校正することによっ
て、このような変化を補償することができる、すなわち
「再校正する」ことができるからといって、当該検定が
その有効性を保ち続けたことを意味するものではない。

【０００８】検定用試薬における変化の再校正は、カリ
ブレーターと試験マトリックスとの両方が、同一様相で
試薬の変化に応答する場合にのみ、成功することができ
る。校正に使用されるマトリックスが、患者のマトリッ
クスまたは試験マトリックスと同一ではない場合には、
このマトリックス効果は検定有効寿命を格別に短縮する
結果をもたらすことがある。多くの検定法では、試料は
使用前に予備処理されるか、または水あるいは緩衝溶液
中で稀釈される。このような場合には、カリブレーター
マトリックスと試料マトリックスとの間の初期の相違
は、重要ではなくなる。しかしながら、予備処理または
予備稀釈はマニュアル操作で、かつ労働集約的であり、
あるいは自動化されている系においても時間を消費する
ものであり、一定時間内の処理量を制限する。従って、
予備処理または予備稀釈を排除または最小にすることが
できる、検定方法が開発されてきた。このような検定法
の場合には、マトリックス効果が最大限に発現するか
ら、試料媒質にできるだけ類似したカリブレーターマト
リックスの使用が不可避となる。

【０００９】未稀釈のヒト血清中のアナライト濃度の測
定に使用しようとする検定法の場合の、理想的カリブレ
ーターマトリックスは、未処理ヒト血清である。このよ
うなマトリックスの使用に包含される問題はその安定性
にあり、特に脂質は血清中で乳化され、時間の経過にと
もない分離する傾向を有する。このプロセスは「シェデ
ィング（脱落）」（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）として知られて
おり、不透明なミルク状外観が生じる。このシェディン
グは、検定結果に影響を及ぼすことが知られており、従
ってこのようなマトリックスを用いて製造されたカリブ
レーターの有効寿命は制限される。

【００１０】このシェディングに付随する問題を回避す
るために、カリブレーターに使用しようとする血清集団
から脂質成分を除去するための各種方法が開発されてお
り、この方法は「脂質取り除き」（ｌｉｐｉｄ ｓｔｒ
ｉｐｐｉｎｇ）と称されている。脂質を取り除いた血清
はヒト血清とほとんど類似しているけれども、完全血清
と脂質を取り除いた血清との間には、マトリックス効果
が存在する。この効果は、種々の因子に依存する、例え
ばアナライトが脂質に結合する親和性を示すことがあ
り、あるいは血清脂質が検定における非特異的結合レベ
ルに影響することがある。

【００１１】非特異的結合は、免疫検定法で、特に固体
相を使用する異種検定法で、遭遇する一般的問題であ
る。最も一般的な種類の免疫検定法、例えば競合結合検
定法および２部位サンドイッチＥＬＩＳＡなどでは、遊
離の共役体と結合した共役体との分離が、検定プロトコ
ルの一部として必要である。この工程は通常、「洗出」
（ｗａｓｈ）工程と称される。これは、この工程が未結
合の共役体の洗出を包含しているからである。典型的な
洗出では、検定に使用される抗体が、またある場合に
は、アナライトが、固相に不動化されている場合には、
この洗出は容易である。

【００１２】しかしながら、共役体の一部は固相材料に
非特異的に結合することができることから、誤ったシグ
ナルが生じることがある。この誤ったシグナルによる効
果は、カリブレーターおよび患者の試料中における、各
非特異性結合が一定のままである場合には、最少にされ
る。カリブレーターマトリックスにおける非特異性結合
のレベルと患者の試料における非特異性結合のレベルと
が、時間経過にしたがい相違する程度で変化して、検定
用試薬に対する応答に変化をもたらす場合には、このよ
うな変化が、校正不能の劣化作用をもたらし、この検定
用試薬の有効寿命を制限する。

【００１３】一例として、得られるシグナルが測定され
るアナライトの量に逆比例する、ジゴキシンの競合ＥＬ
ＩＳＡ免疫検定法がある。この場合には、ジゴキシンに
対するモノクローナル抗体をガラス繊維マトリックスに
非共有結合により不動化させる。ジゴキシン- アルカリ
性リン酸塩共役体により処理し、次いで蛍光源性基質溶
液により洗出する。この蛍光源性基質は、洗出および当
該検定シグナルの発現の両方に使用される。この場合に
は、共役体の繊維マトリックスに対する非特異的結合が
或るレベルで存在し、これが検定シグナルに関与する。

【００１４】約６ヵ月またはそれ以上の保存の後に、抗
原- アルカリ性リン酸塩共役体非特異的結合レベルは、
４℃で保存した場合でさえも、変化することが見出され
た。これらの結合における変化は、当該検定を脂質を取
り除いたカリブレーターを用いて、または患者の試料を
用いて行なわれた場合に、異なっていた。従って、再校
正を行わないかぎり、結果に相違が生じる。この不安定
性は、３７℃で４−７日間、当該共役体を維持すること
によって、加速されることがまた見出だされた。このよ
うな不安定性の加速を用いることにより、問題の研究が
容易になった。

【００１５】脂質を取り除いた血清に、血清脂質部分の
或る成分、例えばコレステロールまたはトリグリセライ
ドなどを添加することによって、検定用試薬の変化に対
して、患者の試料により類似した様相で、応答するマト
リックスが提供されることが見出された。コレステロー
ルまたはトリグリセライド製剤を添加すると、当該カリ
ブレーターの長期間安定性は変わらず、かつまた脂質成
分のシェディングが見られなかった。従って、マトリッ
クス効果が、カリブレーター安定性を犠牲にすることな
く、最低にされ、検定有効寿命が有意に延長された。本
発明のカリブレーターを、６ヵ月以上にわたり保存され
た成分とともに使用した場合でさえも、信頼できる結果
が得られる。

【００１６】カリブレーターマトリックスは一般に、市
販されている脂質を取り除いた血清から調製される。次
いで検定で測定される成分を或る濃度範囲で含有する一
連の溶液を調製する。コレステロールまたはトリグリセ
ライドを、ほぼ生理学的濃度で、さらに好ましくは約１
５０−２５０ｍｇ／ｄｌの広範囲のレベルで、最も好ま
しくは約２００ｍｇ／ｄｌのレベルで添加する。本発明
は、上記したように、コレステロールまたはトリグリセ
ライドなどの脂質が添加されているカリブレーターを包
含する。本発明はまた、このカリブレーターを検定の実
施に使用することを包含する。本発明の追加の態様は、
下記の非制限的例により示されている。

【００１７】

【実施例】

例１ ＯＰＵＳ（登録商標）ジゴキシン免疫検定法における血
清試料の回収 血清中のジゴキシン検定は、Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．により市販されているＯＰＵ
Ｓ（登録商標）免疫検定システムで行うことが指定され
ている。この検定法は原則的に、競合免疫検定法に基づ
いており、順次形式（逆滴定）で行われている。この検
定法は、３つの別々の工程で行われ、これらの工程はい
ずれも、装置により自動的に操作されている。

【００１８】第１工程において、装置はファイバー（ガ
ラスファイバーマトリックスＧＦ／Ｆ、Ｗｈａｔｍａ
ｎ）上に、血清試料３０リットルを適用した。この試料
を４分間、インキュベートし、次いで試料中のジゴキシ
ンを、ガラスファイバー上の抗体に結合させた。次い
で、ジゴキシン- アルカリ性リン酸塩共役体溶液２０リ
ットルを添加し、次いでこの試料を１分間、インキュベ
ートした。次いで、試験モジュール（ｍｏｄｕｌｅ）側
上の洗出口の壁部中に、基質（４- メチル- ウンベリフ
ェリホスフェート溶液）を供給した。この溶液から未結
合共役体部分を、毛細管作用により、ガラスファイバー
の別の末端に向かって、吸着床に洗出した。これによ
り、その中央部に結合部分が残された。メチルウンベリ
フェリフェロンにより発生される蛍光の強度を測定し、
装置メモリーで脂質が取り除かれたカリブレーターマト
リックスから作成された保存校正曲線を使用する装置に
より、ジゴキシンの量に変換した。

【００１９】この結果を、第１表に示す。

【表１】 第１表：新鮮モジュールによる試料回収率 試料 回収率、ｎｇ／ｍｌ 試料１ ０．７１ 試料２ ２．０１ 試料３ ３．００ 試料４ ３．０７ この試料の回収率は、検定範囲にとって妥当なものであ
る。

【００２０】例２ １．５ヶ月および６ヶ月経過後のモジュールによる回収
率 この検定は、例１に記載のとおりに行ったが、ただしこ
の検定には１．５ヶ月および６ヶ月経過後のモジュール
を使用した。結果を第２表に示す。

【表２】 第２表：老化モジュールによる試料回収率 試料 １．５ヶ月後 ６ヶ月後 ６ヶ月後 ロット１ ロット２ 試料１ ２．９４ ３．６９ ３．２２ 試料２ ３．００ ＞４．０ ３．９５ この表から、モジュールを４℃において６ヶ月、保存し
た時点で、この検定が、適切な３．０ｎｇ／ｍｌの代わ
りに、４．０ｎｇ／ｍｌの高い試料１および２の血清を
回収することがわかる。この検定は、３−４ｎｇ／ｍｌ
の領域ではもはや機能性ではない。

【００２１】例３ 高められた温度において保存された共役体による回収率 この検定は例１に記載のとおりに行ったが、ただし３７
℃で４日間保存されたモジュールを使用した。この結果
を第３表に示す

【表３】第３表：３７℃で４日間保存された共役体によ
る試料回収率 レベル ４℃ ３７℃ 試料１ ２．９３ ＞４．０ 試料２ ３．０７ ＞４．０

【００２２】例４ 老化モジュールおよびコレステロール補給カリブレータ
ーを使用する試 料回収率 この検定は、例２に記載のとおりに行ったが、ただし脂
質を取り除いた血清中に、コレステロール［ＰＥＮＴＥ
Ｘ（登録商標）ＣＨＯＬＥＳＴＥＲＯＬ ＳＵＰＥＲＴ
ＲＡＴＥ，Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，１９５ Ｗｅｓｔ Ｂｉｒｃｈ
Ｓｔｒｅｅｔ，Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ
６０９０１］を、２００ｍｇ／ｄｌの濃度で添加し
た。この結果を第４表に示す。

【表４】 第４表：老化モジュールおよびコレステロール補給カリブレーター を使用する試料回収率 試料 １．５ヶ月後 ６ヶ月後 ６ヶ月後 ロット１ ロット２ 試料１ ２．５７ ２．７６ ２．８５ 試料２ ３．０８ ３．１４ ３．２０

【００２３】例５ 高められた温度において保存された共役体およびコレス
テロール補給カ リブレーターを使する試料回収率 この検定は例３に記載のとおりに行ったが、ただし脂質
を取り除いたカリブレーター血清に、コレステロール
（２００ｍｇ／ｄｌ）を添加した。この結果を第５表に
示す

【表５】第５表：３７℃で保存された共役体およびコレ
ステロール補給カリブレーターによる試料回収率 試料 ４℃ ３７℃ 試料１ ２．７３ ２．６ 試料２ ３．００ ３．０５

【００２４】例６ 高められた温度において保存された共役体およびトリグ
リセライド補給 カリブレーターを使する試料回収率 この検定は例５に記載のとおりに行ったが、ただしカリ
ブレーターに、コレステロールの代わりにトリグリセラ
イド［ＰＥＮＴＥＸ（登録商標）ＴＲＩＧＬＹＣＥＲＩ
ＤＥ ＳＵＰＥＲ- ＴＲＡＴＥ，Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ，
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，１９５
Ｗｅｓｔ Ｂｉｒｃｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｋａｎｋａｋｅ
ｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６０９０１］を補給した。この
結果を第６表に示す

【表６】第６表：３７℃で保存された共役体およびトリ
グリセライド補給カリブレーターを用いる試料回収率 試料 ４℃ ３７℃ 試料１ ２．６２ ２．５９ 試料２ ２．９１ ３．０６

【００２５】本発明の或る好適態様のみを例により示し
たが、多くの修正および変更は当業者に予想されること
である。従って、前記特許請求の範囲は、本発明の真の
精神の範囲内に包含されるものとして、これらの修正お
よび変更の全部を包含する意図を有するものであるもの
と理解されるべきである。

フロントページの続き (72)発明者 シャイ インバー アメリカ合衆国マサチューセッツ州ブルッ クリン，マンチェスター ロード 23

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血清中のアナライト検定法におけるカリ
   ブレーターのためのマトリックスとして、脂質を取り除
   いた血清を使用することから生じるマトリックス効果を
   減少させる方法であって、上記脂質を取り除いたマトリ
   ックスに、脂質製剤を添加することからなる方法。
2. 【請求項２】 上記脂質製剤がコレステロールである、
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 上記脂質製剤がトリグリセライドであ
   る、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 上記検定法が免疫検定法である、請求項
   １に記載の方法。
5. 【請求項５】 上記検定法が、ジゴキシンの存在の検出
   に使用される免疫検定法である、請求項１に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 上記脂質製剤を、生理学的濃度で添加す
   る、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 上記脂質製剤を、約１５０−２５０ｍｇ
   ／ｄｌの濃度で添加する、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 上記脂質製剤を、約２００ｍｇ／ｄｌの
   濃度で添加する、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 上記脂質製剤がコレステロールである、
   請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 上記脂質製剤がトリグリセライドであ
    る、請求項８に記載の方法。
11. 【請求項１１】 脂質を取り除いた血清を使用すること
    から生じるマトリックス効果を減少させるために使用さ
    れるカリブレーター血清であって、脂質を取り除いたカ
    リブレーター血清および脂質製剤からなるカリブレータ
    ー血清。
12. 【請求項１２】 既知量のジゴキシンをさらに含有す
    る、請求項１１に記載のカリブレーター血清。
13. 【請求項１３】 上記脂質製剤がコレステロールであ
    る、請求項１２に記載のカリブレーター血清。
14. 【請求項１４】 上記脂質製剤がトリグリセライドであ
    る、請求項１２に記載のカリブレーター血清。
15. 【請求項１５】 上記脂質製剤が、生理学的濃度で存在
    する、請求項１１に記載のカリブレーター血清。
16. 【請求項１６】 上記脂質製剤が、約１５０ｍｇ／ｄｌ
    −約２５０ｍｇ／ｄｌの濃度で存在する、請求項１５に
    記載のカリブレーター血清。
17. 【請求項１７】 上記脂質製剤が、約２００ｍｇ／ｄｌ
    の濃度で存在する、請求項１６に記載のカリブレーター
    血清。
18. 【請求項１８】 上記脂質製剤がコレステロールであ
    る、請求項１７に記載のカリブレーター血清。
19. 【請求項１９】 上記脂質製剤がトリグリセライドであ
    る、請求項１７に記載のカリブレーター血清。