SU1761803A1 - Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II - Google Patents
Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II Download PDFInfo
- Publication number
- SU1761803A1 SU1761803A1 SU904896775A SU4896775A SU1761803A1 SU 1761803 A1 SU1761803 A1 SU 1761803A1 SU 904896775 A SU904896775 A SU 904896775A SU 4896775 A SU4896775 A SU 4896775A SU 1761803 A1 SU1761803 A1 SU 1761803A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- bav
- biomass
- bii
- enzyme
- restriction
- Prior art date
Links
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 241000178961 Paenibacillus alvei Species 0.000 title claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 abstract description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 3
- XWPCYYOZOJKYKQ-UHFFFAOYSA-N 1-(2-chloroethyl)-3-[2-[2-[[2-chloroethyl(nitroso)carbamoyl]amino]ethyldisulfanyl]ethyl]-1-nitrosourea Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NCCSSCCNC(=O)N(N=O)CCCl XWPCYYOZOJKYKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 abstract description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 abstract description 2
- 229910052500 inorganic mineral Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 abstract description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 101710184216 Cardioactive peptide Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 description 1
- 241000648768 Anabaena subcylindrica Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биотехнологи и в мо- лекул рно-генетических работах и генноин- женерных исследовани х. Сущность изобретени : биомассу В alvei BKM В-674 выращивают в аэробных услови х в питательной среде, содержащей источники углерода , азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма бактерий В.alvei BKM В-674 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Bav В II, узнающую и расщепл ющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 ... G CNCC ... 3 , в количествах, достаточных дл получени рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы Bav BII в биомассе 3-4 х 10 ед/г сырой микробной массы. Дл рестриктазы Asu I, изошизомера эндонуклеазы рестрикции Bav BII, содержание фермента в биомассе и выход очищенного препарата фермента не указаны. Выход очищенного препарата рестриктазы Bav BII составл ет 8-12 х 103ед на 1 г сырой биомассы. Рестриктазы Bav BII не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эн- донуклеаз и экзонуклеаз. V fe
Description
Изобретение относитс к области биотехнологии и может быть использовано в молекул рно-генетических работах и генно- инженерных исследовани х.
Рестриктазы II класса (синонимы: эндонуклеазы рестрикции, сайт-специфические эндонуклеазы ), осуществл ющие расщепление фосфодиэфирных св зей ДНК по специфическим нуклеотидным последовательност м (сайтам), вл ютс незаменимым инструментом исследовани в практике молекул рно-генетических и. генно-инженерных работ, представл ют собой уникальный объект дл изучени природы и механизмов белково-нук- леиновых взаимодействий. Этими обсто тельствами и объ сн етс огромный интерес
исследователей в области биохимии, молекул рной биологии, микробиологии, вирусологии к вы влению продуцентов новых рестриктаз, разработке способов их очистки , изучению свойств, использованию в молекул рно-генетических экспериментах.
Рестриктазы выделены и частично или полностью охарактеризованы из более чем 1100 микроорганизмов самых различных таксонов /1/, Одна из рестриктаз, Asul, выделена из штамма Anabaena subcylindrica ССАР 1403/4В 111.
Эндонуклеаза рестрикции Asul расщепл ет ДНК фага Я в 74 участках, ДНК аденовируса Ad 2 в 164, ДНК обезь ннего вируса SV 40 в II, ДНК фага$Х174 в 2 и плазмиду
Х| Os
00 О СО
pBR322 в 15, Фермент гидрслизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 ...GAGNCC...3
Содержание рестриктазы Asul в биомассе Anabaena subcyllndrica CCAP 1403/4В и выход очищенного от примесей неспецифических нуклеаз фермента не привод тс .
Целью изобретени вл етс получение штамма бактерий, продуцирующих с высоким выходом новую рестриктазу Bav BII, узнающую и расщепл ющую последовательность нуклеотидов 5 ... G CNCC ... 3.
Поставленна задача достигаетс тем, что биомассу B.alvei BKM В-674 выращивают в аэробных услови х в питательной среде , содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами.
Рестриктаза Bav BII, изошизомер Asul, узнает и гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 ... G GNCC ... 3. Эндонуклеаза рестрикции Bav BII расщепл ет ДНК фага Я по 74 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 164, ДНК обезь ннего вируса SV40 по 11, ДНК фага0Х174 по 2 и плазмиду pBR322 по 15.
Поиск штамма-продуцента проводили с использованием экспресс-метода определени сайт-специфической энедонуклеаз- ной активности в толуольных лизатах микробных клеток с последующим электро- форетическим разделением вагарозном геле продуктов расщеплени ДНК фага Я. Всего обследовано 18 штаммов Bacillus alvei.
Штамм B.alvei BKM В-674 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранитс под № ВКМ В-674 NCI B8199 NRRLB-384
Характеристика штамма
Морфологические особенности. Палочковидные клетки, пр мые или почти пр мые, размером 0,5-0,8 х 2-5 мкм, подвижные (признак варьирует). Расположены поодиночке и парами , образуют споры. Грамположительны (признак непосто нный, варьирует Гр - Гр).
Культу рал ьно-биохимические свойства
На скошенном агаре - слабый, нежный налет. Колонии на МПА очень мелкие, блест щие , выпуклые с ровными кра ми.
На м со-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера - заметное равномерное помутнение , серовата нежна пленка.
Отношение к кислороду - аэроб.
Каталаза - образует.
Утилизаци углеводов - на глюкозе, лактозе , сахарозе образуют кислоту; на араби- нозе, ксилозе и манните кислоту не образуют. Крахмал - гидролизуют.
Лакмусовое молоко - свертывание, пеп- тонизаци .
Индол и диоксиацетон - образуют.
Казеин - расщепл ют. 0 Тирозин - не расщепл ют,
Фенилаланин - не дезаминируют.
Оптимальные услови выращивани и хранени культуры.
Культура B.alvei BKM В-674 хорошо рас- 5 тет на жидких и твердых полноценных питательных средах- бульоне Хоттингера, среде LB, м сопептонном бульоне.
Максимальна и минимальна температура роста культуры соответственно 35-45° 0 С и 15-20° С, а оптимальна температура - 37° С. Оптимум роста рН 7,0-7-2. При рН 10 культура не растет.
Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу Bav BII, получают в том 5 случае, когда штамм-продуцент выращивают при 37° С в аэробных услови х в ферментере на питательной среде Хоттингера, котора содержит в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера; 10rNaCI;1 rK2HPO/i; 0 Н20 до 1 л. Выращивание прекращают через 3-4 в конце логарифмической фазы роста , когда рост достигает ,3-1,5. Выход биомассы 6,5-8,5 г/л. На среде рыбный экстракт (на основе гидролизата киль- 5 ки) культура растет медленно, а накопление активности рестриктазы в 3-4 раза ниже, чем при культивировании на средах LB или Хоттингера.
Ферментацию культуры провод т после 0 добавлени в ферментер инокул та в соотношении 1:10 к объему среды.
Рабочие культуры пересевают на м со- пептонный бульон или бульон Хоттингера один раз в 7-10 дней.
5 Хран т культуру а полужидком м сопептонном агаре под вазелиновым маслом в лиофилизированном виде в ампулах.
Культура непатогенна дл мышей.
Выделение рестриктазы Bav BII прово- 0 д т фракционированием бесклеточных экстрактов изопропанолом и хроматографией на ионообменнике и аффинном сорбенте.
Инкубационна смесь дл определени активности рестриктазы Bav BII, объемом 5 30-50 мкл, содержит: 0,01 М трис-HCI буфер , рН 7,5, 0,01 М MgCl2, 0,001 М дитиот- реитола (или 0,007 М 2-меркаптоэтанола), 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина , 1 мкг ДНК фага А и 0,1-1,0 мкл фермента . Инкубацию провод т при 37° С в
течение 60 мин. Продукты расщеплени ДНК фагаД анализируют электрофоретиче- ски в 0,8-1 % агарозном геле с последующим прокрашиванием гел в бромистом этидии. За единицу активности рестриктазы Bav BII принимают количество фермента (в мкл), которое за 1 ч инкубации полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага при оптимальных услови х реакции.
Пример 1. Культура B.alvei BKMB-674 предварительно адаптируют на основной питательной среде, содержащей в 1 л: 250 мл перевара Хоттингера; 10 г NaCI; 1 г
К2НР04, ДО 1 Л ВОДЫ.
Инокул т дл ферментера готов т, пе- ресева адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10 и размножают в услови х аэрации.
Выращивание культуры провод т после добавлени в ферментер инокул та в соот- ношении 1:10 к объему при температуре 37° С в аэробных услови х (1 л воздуха на 1 л питательной среды), рН среды 7,0. Во врем выращивани рН культуральной жидкости поддерживают в интервале рН 7,2-7,5.
Выращивание продолжают до достижени конца логарифмической фазы роста.
Выход сырой биомассы составл ет 6,5- 8,5 г/л культуральной жидкости.
Содержание рестриктазы Bav BII - 4 х 104 ед/г биомассы.
Выделение рестриктазы Bav Bil
10 г биомассы Bacillus alvei BKM В-674 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при +2-4° С. Остатки клеточных оболочек и неразрушенные клетки удал ют ультрацентрифугирова- нием, а бесклеточный экстракт
фракционируют изапропаколом. Обогащенный рестриктазой материал хроматографи- руют в калий-фосфатном буфере в градиенте КС на колонке с ДЭАЭ-целлюло- зой DE-52, а затем на колонке с голубой сефарозой CL-6B.
Получают 12 х 104 ед активности рестриктазы Bavls в 10 мл буфера с 50% глицерином . Выход очищенного препарата фермента 12 х 103 ед активности на 1 г сырого веса биомассы, Препарат рестриктазы Bav BI стабилен при хранении в течение 8-10 мес цев при температуре - 20° С.
Препарат фермента не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эндонукле- аз и экзонуклеаз и пригоден дл структурных исследований ДНК и генно-инженерных работ.
П р и м е р 2. Культивирование штамма Bacillus alvei BKM В-674 провод т аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в качестве питательной средь: используют среду LB, котора содержит в 1 л: 10 г триптона; 5 г дрожжевого экстракта; 5 г NaCi; до 1 л воды.
Выход биомассы 6-7 г/л культуральной жидкости.
Содержание ресгриктазы Bav BII 3 х 104 ед/г микробной массы.
После проведени очистки, как описано выше, выход рестриктазы Bav BII составл ет 8 х 10 ед активности/г сырого веса биомассы ,
Таким образом, по предложенному способу получают новую рестриктазу.
Claims (1)
- Формула изобретнийШтамм бактерий Bacillus alvei BKM B- 674 - продуцент рестриктазы Bav BII.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU904896775A SU1761803A1 (ru) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU904896775A SU1761803A1 (ru) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1761803A1 true SU1761803A1 (ru) | 1992-09-15 |
Family
ID=21552286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU904896775A SU1761803A1 (ru) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1761803A1 (ru) |
-
1990
- 1990-12-27 SU SU904896775A patent/SU1761803A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Roberts R.J., Nucl. Acids Res., 1989, v.16, pr 271-r 31,3 Hughes S.G., Bruce Т., Murray K., Biochemical J., 1980 v. 185, p. 59-63. Авторское свидетельство СССР Ne 1170777, кл. С 21 N9/14, 1983. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1188236A (en) | Plasmids | |
| IE52434B1 (en) | A process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| US4806480A (en) | Novel E. coli hybrid plasmid vector conferring sucrose fermenting capacity | |
| CS272753B2 (en) | Method of alpha-galactosidase production | |
| SU1761803A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II | |
| US5061628A (en) | Restriction endonuclease FseI | |
| US4430432A (en) | Endo-deoxyribonuclease and process for the production thereof | |
| SU1761804A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS coaGULaNS - продуцент рестриктазы Всо AI | |
| SU1678832A1 (ru) | Штамм бактерий LастовасILLUS рLаNтаRUм - продуцент рестриктазы LP @ | |
| EP0206595B1 (en) | Thermally stable tryptophanase process for producing the same, and thermally stable tryptophanase-producing microorganism | |
| EP0124076A2 (en) | Method for preparation of recombinant plasmids, microorganisms transformed by said plasmids and thermo-stable alpha-amylase | |
| JPH022349A (ja) | ピリミジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 | |
| SU1659480A1 (ru) | Штамм бактерий КLевSIеLLа рNеUмоNIае-продуцент рестриктазы Кр @ 378 1 | |
| SU1707077A1 (ru) | Способ получени рестриктазы BSp DI | |
| SU1712415A1 (ru) | Способ получени рестриктазы В @ AI | |
| SU1832129A1 (ru) | Шtamm бaktepий bacillus brevis-пpoдуцeht pectpиktaзы b b i | |
| SU1678833A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы В @ 1 | |
| EP0179025A1 (en) | Method for the production of neutral protease | |
| SU1648976A1 (ru) | Штамм бактерий АснRомовастеR aGILe - продуцент рестриктазы AaG 525 I | |
| RU2044055C1 (ru) | Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki | |
| RU2070925C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 71 ki | |
| SU1486516A1 (ru) | Штамм бактерий вас1ьшз месатек1цм - продуцент эндонуклеазы рестрикции вме 12 i | |
| RU2044053C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco27k1 | |
| SU1458388A1 (ru) | Способ получени эндонуклеаз-рестриктаз, обладающих способностью узнавать и расщепл ть последовательности нуклеотидов 5 @ -GPUCGPYC-3 @ и 5 @ -CATG-3 @ | |
| DK157562B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af mindst to deoxyribonukleaser |