JPH022349A - ピリミジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
ピリミジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途Info
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- JPH022349A JPH022349A JP1018939A JP1893989A JPH022349A JP H022349 A JPH022349 A JP H022349A JP 1018939 A JP1018939 A JP 1018939A JP 1893989 A JP1893989 A JP 1893989A JP H022349 A JPH022349 A JP H022349A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はピリミジンアナログ１耐性化遺伝子を含むＤＮ
Ａ、それが組み込まれたプラスミド、そのプラスミドを
用いて形質転換せしめたエシェリヒア属細菌およびバチ
ルス属細菌およびそれを利用ずろウラシルおよび／また
はウリジンの製造法に関する。
Ａ、それが組み込まれたプラスミド、そのプラスミドを
用いて形質転換せしめたエシェリヒア属細菌およびバチ
ルス属細菌およびそれを利用ずろウラシルおよび／また
はウリジンの製造法に関する。
従来の技術
ウラシルおよび／またはウリジンは生化学試薬あるいは
、医薬の合成原料として育用な物質であるが、発酵法に
よりウラシルおよび／またはウリジンを製造しようとす
る場合、野生味は、はとんど菌体外にウラシルおよび／
またはウリジンを生産しないので、野生株に人工的突然
異変を生起せしめてウラシルおよび／またはウリノン生
成能を付与する方法がとられている。従来、ウラシルお
よび／またはウリジンの発酵生産法としては、ミクロモ
ノスポラ属菌から誘導されたピリミジンアナログ耐性株
を用いる方法（特公昭５７−１８８７３号）、ブレビバ
クテリウム属細菌から誘導されたプリンアナログ耐性株
を用いる方法（特公昭５７−３０４７６号）、バチルス
属細菌から誘導されたウリノンヌクレオノドホスポリラ
ーゼ活性を欠１ｆｉＬかつピリミジンアナログ耐性を有
する株を用いる方法（特公昭６１−１０４７９５号）な
どが翔られている。
、医薬の合成原料として育用な物質であるが、発酵法に
よりウラシルおよび／またはウリジンを製造しようとす
る場合、野生味は、はとんど菌体外にウラシルおよび／
またはウリジンを生産しないので、野生株に人工的突然
異変を生起せしめてウラシルおよび／またはウリノン生
成能を付与する方法がとられている。従来、ウラシルお
よび／またはウリジンの発酵生産法としては、ミクロモ
ノスポラ属菌から誘導されたピリミジンアナログ耐性株
を用いる方法（特公昭５７−１８８７３号）、ブレビバ
クテリウム属細菌から誘導されたプリンアナログ耐性株
を用いる方法（特公昭５７−３０４７６号）、バチルス
属細菌から誘導されたウリノンヌクレオノドホスポリラ
ーゼ活性を欠１ｆｉＬかつピリミジンアナログ耐性を有
する株を用いる方法（特公昭６１−１０４７９５号）な
どが翔られている。
発明か解決しようとする課題
ウラシルおよび／またはウリノン生産菌の改良こついて
は、上記のような技術が知られているが、従来の変異処
理方法では、特定の遺伝子を選択的に増幅させることに
よって収量の増大をはかることは事実上できない。
は、上記のような技術が知られているが、従来の変異処
理方法では、特定の遺伝子を選択的に増幅させることに
よって収量の増大をはかることは事実上できない。
課題を解決するための手段
本発明者らは、遺伝子組換え技術をウラシルおよび／ま
たはウリノン生産菌の育種にｆｌｌ用する研究を重ねた
結果、ピリミジンアナログ耐性化遺伝子の組み込まれた
プラスミドを用いてエシェリヒア属細菌またはバチルス
属細菌を形質転換せしめた菌株が、培地中にウラシルお
よび／またはウリノンをより良く蓄積することを見出し
、さらに研究して本発明を完成するに至った。
たはウリノン生産菌の育種にｆｌｌ用する研究を重ねた
結果、ピリミジンアナログ耐性化遺伝子の組み込まれた
プラスミドを用いてエシェリヒア属細菌またはバチルス
属細菌を形質転換せしめた菌株が、培地中にウラシルお
よび／またはウリノンをより良く蓄積することを見出し
、さらに研究して本発明を完成するに至った。
ずなわら、本発明は以下のＤＮＡ１それか組み込まれた
プラスミド、該プラスミドで形質転換された細菌および
該細菌を用いるウラシルおよび／またはウリジンの製造
法を提供するものである。
プラスミド、該プラスミドで形質転換された細菌および
該細菌を用いるウラシルおよび／またはウリジンの製造
法を提供するものである。
（＋）ピリミジンアナログ耐性化遺伝子を有するＤＮＡ
０ （２）約ｌＯキロヘースペア（ｋｂ）離れたＰｓｔＩの
切断点を有し、かつ該ＰｓｔＩ断片中に、２箇所のＥｃ
ｏＲ１ザイトと、８箇所のＨｉｎｄＩＩＩサイトを有す
る上記（１）項記載のＤＮＡ０ （３）ピリミジンアナログ耐性を存し、かつウラシルお
よび／またはウリジン生産能を宵するバチルス属細菌の
染色体ＤＮＡから得られた上記（１）または（２）項記
載のＤＮＡ０ （４）上記（３）項記載のＤＮＡが組み込まれたプラス
ミド。
０ （２）約ｌＯキロヘースペア（ｋｂ）離れたＰｓｔＩの
切断点を有し、かつ該ＰｓｔＩ断片中に、２箇所のＥｃ
ｏＲ１ザイトと、８箇所のＨｉｎｄＩＩＩサイトを有す
る上記（１）項記載のＤＮＡ０ （３）ピリミジンアナログ耐性を存し、かつウラシルお
よび／またはウリジン生産能を宵するバチルス属細菌の
染色体ＤＮＡから得られた上記（１）または（２）項記
載のＤＮＡ０ （４）上記（３）項記載のＤＮＡが組み込まれたプラス
ミド。
（５）上記（４）項記載のプラスミドで形質転換された
エシェリヒア属細菌またはバチルス属細菌。
エシェリヒア属細菌またはバチルス属細菌。
（６）ピリミジンアナログ耐性を有するバチルス属細菌
の染色体ＤＮＡから得られたピリミジンアナログ耐性化
遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質転換されたエシ
ェリヒア属細菌またはバチルス属細菌を培地に培養し、
培俺物中にウラシルおよび／またはウリノンを生成蓄積
せしめこれを採取することを特徴とするウラシルおよび
／またはウリジンの製造法。
の染色体ＤＮＡから得られたピリミジンアナログ耐性化
遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質転換されたエシ
ェリヒア属細菌またはバチルス属細菌を培地に培養し、
培俺物中にウラシルおよび／またはウリノンを生成蓄積
せしめこれを採取することを特徴とするウラシルおよび
／またはウリジンの製造法。
本発明のＤＮＡはピリミジンアナログ耐性を有する微生
物から得られる。
物から得られる。
ここでいう「ピリミジンアナログ耐性株」とは、エシェ
リヒア属細菌またはバチルス属細菌を親株として誘導さ
れる微生物であって、親株が生育出来ないような高い濃
度のピリミジンアナログを含む培地でも生育てきるよう
に遺伝的性質の変化した微生物をいう。また、「ピリミ
ジンアナログ」とは、ウラシルやシトシンなどのピリミ
ノン塩基と類似の構造を有する物質、例えば６−アザウ
ラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラツル、２
−チオシトノン、５−フルオロシトシンなどやこれらの
りボサイドおよびリボタイドなどをいう。
リヒア属細菌またはバチルス属細菌を親株として誘導さ
れる微生物であって、親株が生育出来ないような高い濃
度のピリミジンアナログを含む培地でも生育てきるよう
に遺伝的性質の変化した微生物をいう。また、「ピリミ
ジンアナログ」とは、ウラシルやシトシンなどのピリミ
ノン塩基と類似の構造を有する物質、例えば６−アザウ
ラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラツル、２
−チオシトノン、５−フルオロシトシンなどやこれらの
りボサイドおよびリボタイドなどをいう。
本発明でいうピリミジンアナログ耐性株は、ピリミジン
アナログの少なくとも一つに耐性を有するらのであれば
よい。
アナログの少なくとも一つに耐性を有するらのであれば
よい。
このようなりＮＡの供与菌の例としては、ウラシルおよ
び／またはウリジン生産能を有するバチルス属細菌があ
げられる。その具体例としては、バチルス・ズブチリス
ＡＡ４７（［ＦＯｌ ４７０５、ＦＥＲＭ ＢＰ−
２１８３）があげられる。
び／またはウリジン生産能を有するバチルス属細菌があ
げられる。その具体例としては、バチルス・ズブチリス
ＡＡ４７（［ＦＯｌ ４７０５、ＦＥＲＭ ＢＰ−
２１８３）があげられる。
ピリミジンアナログ耐性化遺伝子を含むＤＮＡ断片を調
製する方法としては、例えば、エイヂ・サイト−および
ケイ・ミウラ、バイオヒミカ・工・バイオフィジカ・ア
クタ（Ｉｌ、 ５ａｉｔｏ ａｎｄ ＫＭｉｕｒａ
、Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Δｃｔａ）、
７２． ６１９（１９６３）の方法によりまず、供与
菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次いてこれを制限酵素Ｐ
ｓｔＩを用いて切断する方法があげられる。次に、この
ようにして得られたピリミジンアナログ耐性化遺伝子を
含む染色体ＤＮＡ断片は、ベクターＤＮＡに挿入される
。
製する方法としては、例えば、エイヂ・サイト−および
ケイ・ミウラ、バイオヒミカ・工・バイオフィジカ・ア
クタ（Ｉｌ、 ５ａｉｔｏ ａｎｄ ＫＭｉｕｒａ
、Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Δｃｔａ）、
７２． ６１９（１９６３）の方法によりまず、供与
菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次いてこれを制限酵素Ｐ
ｓｔＩを用いて切断する方法があげられる。次に、この
ようにして得られたピリミジンアナログ耐性化遺伝子を
含む染色体ＤＮＡ断片は、ベクターＤＮＡに挿入される
。
本発明にて使用されるベクターＤＮＡは、エシェリヒア
属細菌で増殖しうるしの、バチルス属細菌で増殖しうる
ものあるいは、エシェリヒア属細菌およびバチルス属細
菌の双方で増殖しうるちの（いわゆるシャトルベクター
）の中から適宜選択することができる。まず、エシェリ
ヒア属細菌で増殖可能なプラスミドとしては、例えばｐ
ｓｃＩｏｌ［プロノーデインゲス・オブ・ナンヨナル・
アカデミ−・才ブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ
、）、７０．３２４０（＋９７３）１、ｐＢＲ３２２［
ジーン（Ｇｅ＋児）。
属細菌で増殖しうるしの、バチルス属細菌で増殖しうる
ものあるいは、エシェリヒア属細菌およびバチルス属細
菌の双方で増殖しうるちの（いわゆるシャトルベクター
）の中から適宜選択することができる。まず、エシェリ
ヒア属細菌で増殖可能なプラスミドとしては、例えばｐ
ｓｃＩｏｌ［プロノーデインゲス・オブ・ナンヨナル・
アカデミ−・才ブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ
、）、７０．３２４０（＋９７３）１、ｐＢＲ３２２［
ジーン（Ｇｅ＋児）。
２．９５（１９７７）］、ｐＢＲ３２５［ジーン（乱ｙ
曖）。
曖）。
４ １２１（１９７８）］などがあげられる。バチルス
属細菌で増殖可能なプラスミドとしては、ｐＵＢＩＩＯ
［ジャーナル・オブ・バクテリオロジ（Ｊ 、ｒ３ａｃ
Ｌｃｒｉｏ１．）、 ｌ ３４．３１８（１９７８）］
、ｐＣ１９４［ブロン−デインゲス・オブ・ナンヨナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ
、）７４．１６８０（１９７７）］、ｐＬ９２Ｂ［ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロノー（Ｊ 、 Ｂ ａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 ）＋３１，６９９（１９７７）］などが
あげられる。また、エエシェリヒア属細およびバチルス
属細菌双方で増殖しつるいわゆるシャトルベクターとし
ては、例えば、ｐＨＶ１４［プロノーデインゲス・才ブ
・ナノヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ０６０［
モレキュラー・アンド・フェネテル・ジェネティックス
（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、）、ｌ ９３ 、２
９９（１９８４）］などがあげられる。また、これら既
知のものの他に、新たに分離されたり合成されたりした
ベクターＤＮＡであっても、本発明の目的を達成しうる
らのであれば用いることができる。
属細菌で増殖可能なプラスミドとしては、ｐＵＢＩＩＯ
［ジャーナル・オブ・バクテリオロジ（Ｊ 、ｒ３ａｃ
Ｌｃｒｉｏ１．）、 ｌ ３４．３１８（１９７８）］
、ｐＣ１９４［ブロン−デインゲス・オブ・ナンヨナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ
、）７４．１６８０（１９７７）］、ｐＬ９２Ｂ［ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロノー（Ｊ 、 Ｂ ａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 ）＋３１，６９９（１９７７）］などが
あげられる。また、エエシェリヒア属細およびバチルス
属細菌双方で増殖しつるいわゆるシャトルベクターとし
ては、例えば、ｐＨＶ１４［プロノーデインゲス・才ブ
・ナノヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ０６０［
モレキュラー・アンド・フェネテル・ジェネティックス
（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、）、ｌ ９３ 、２
９９（１９８４）］などがあげられる。また、これら既
知のものの他に、新たに分離されたり合成されたりした
ベクターＤＮＡであっても、本発明の目的を達成しうる
らのであれば用いることができる。
これらのプラスミドベクターにピリミジンアナログ耐性
化遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入するには、ティ・マニ
アナイスら、［モレキュラークロニングｊ（Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ、、 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、東大出版会、１９８２年）などに記載さ
れた公知の方法が用いられる。
化遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入するには、ティ・マニ
アナイスら、［モレキュラークロニングｊ（Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ、、 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、東大出版会、１９８２年）などに記載さ
れた公知の方法が用いられる。
ピリミジンアナログ耐性化遺伝子が組み込まれたプラス
ミドベクターを受容菌へ導入する場合には、エシェリヒ
ア属細菌に対しては塩化カルシウムで受容菌細胞を処理
してＤＮＡを導入する方法［ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジイ（Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、
５３，１５９（１９７９）］など、また、バチルス属細
菌に対しては、受容菌をプロトプラストにしてＤＮＡを
導入する方法［モレキュラー・アンド・フェネテル・ジ
エネテイツクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ、）、
ｌ ６８ 、 Ｉ １１ （１９７９）コあるいはコン
ピテントセルを用いる方法［ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジ−（Ｊ 、 Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ）８１．７
＋４（１９６＋）］などの通常の形質転換法が用いられ
る。受容菌としては、エンエリヒア・コリ、バチルス・
ズブチリス、バチルス・プミルスあるいはバチルス・リ
ケニホルミスなどがあげられ、ウラシルおよび／または
ウリジンの生産性の有無は問わない。該受容菌の具体例
としてはエンエリヒア・コリ ｃ６０］ｔ［バクテリオ
ロジー・レビュー （Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、 Ｒｅｖ
、）、 ３６ 、５２５ 、（１９７２）］や、バチル
ス・ズブチリス（ＩＦ０１３７１９、ＡＴＣＣ６０５１
）などの公知法があげられる。また供試するベクターＤ
ＮＡが抗生物質耐性などの選択マーカーを有する場合に
は、上記の選択用培地に当該抗生物質を添加するなどの
方法を用いれば、目的とずろ形質転換株の選択がより一
回容易となる。このようにして得られたピリミジンアナ
ログ耐性化遺伝子が組み込まれたベクターＤＮＡは、そ
の保Ｒｉから抽出し他の受容菌に導入したりあるいは、
抽出された組換えＤＮＡからピリミジンアナログ耐性遺
伝子を含むＤＮＡ断片を調製後これを他のベクタープラ
スミドに連結して用いることが出来る。このようにして
得られた形質転換株の例として、エシェリヒア・コリ０
６００株の形質転換株であるエシェリヒア・コリ ＴＦ
ＡＩ ７株（ＩＦＯ１４７０４，ＦＥＲＭ Ｉ３１”
−２１８２）、バチルス・ズブチリス（ＩＦＯＩ３７１
９．ＡＴＣＣ６０５１）株の形質転換株である バチル
ス・ズブチリス ＴＰＢＡ１６株（ＩＦＯＩ４７０７．
ＦＥＲＭ ＢＰ〜２１８４）、バチルス・ズブチリス
ＡＡ４７株（ＩＦＯＩ４７０５．ＦＥＲＭ ＢＰ−
２１８３）の形質転換株である バチルス・ズブチリス
ＴＦ八 Ａ ４７ （宋（ＩＦＯ１４７０８，Ｆ’Ｅ
ＲＭ ＢＰ２１８５）があげられろ。
ミドベクターを受容菌へ導入する場合には、エシェリヒ
ア属細菌に対しては塩化カルシウムで受容菌細胞を処理
してＤＮＡを導入する方法［ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジイ（Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、
５３，１５９（１９７９）］など、また、バチルス属細
菌に対しては、受容菌をプロトプラストにしてＤＮＡを
導入する方法［モレキュラー・アンド・フェネテル・ジ
エネテイツクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ、）、
ｌ ６８ 、 Ｉ １１ （１９７９）コあるいはコン
ピテントセルを用いる方法［ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジ−（Ｊ 、 Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ）８１．７
＋４（１９６＋）］などの通常の形質転換法が用いられ
る。受容菌としては、エンエリヒア・コリ、バチルス・
ズブチリス、バチルス・プミルスあるいはバチルス・リ
ケニホルミスなどがあげられ、ウラシルおよび／または
ウリジンの生産性の有無は問わない。該受容菌の具体例
としてはエンエリヒア・コリ ｃ６０］ｔ［バクテリオ
ロジー・レビュー （Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、 Ｒｅｖ
、）、 ３６ 、５２５ 、（１９７２）］や、バチル
ス・ズブチリス（ＩＦ０１３７１９、ＡＴＣＣ６０５１
）などの公知法があげられる。また供試するベクターＤ
ＮＡが抗生物質耐性などの選択マーカーを有する場合に
は、上記の選択用培地に当該抗生物質を添加するなどの
方法を用いれば、目的とずろ形質転換株の選択がより一
回容易となる。このようにして得られたピリミジンアナ
ログ耐性化遺伝子が組み込まれたベクターＤＮＡは、そ
の保Ｒｉから抽出し他の受容菌に導入したりあるいは、
抽出された組換えＤＮＡからピリミジンアナログ耐性遺
伝子を含むＤＮＡ断片を調製後これを他のベクタープラ
スミドに連結して用いることが出来る。このようにして
得られた形質転換株の例として、エシェリヒア・コリ０
６００株の形質転換株であるエシェリヒア・コリ ＴＦ
ＡＩ ７株（ＩＦＯ１４７０４，ＦＥＲＭ Ｉ３１”
−２１８２）、バチルス・ズブチリス（ＩＦＯＩ３７１
９．ＡＴＣＣ６０５１）株の形質転換株である バチル
ス・ズブチリス ＴＰＢＡ１６株（ＩＦＯＩ４７０７．
ＦＥＲＭ ＢＰ〜２１８４）、バチルス・ズブチリス
ＡＡ４７株（ＩＦＯＩ４７０５．ＦＥＲＭ ＢＰ−
２１８３）の形質転換株である バチルス・ズブチリス
ＴＦ八 Ａ ４７ （宋（ＩＦＯ１４７０８，Ｆ’Ｅ
ＲＭ ＢＰ２１８５）があげられろ。
」ゴ己のバチルス・ズブチリス ＡＡ４７味は、公知味
であるバチルス・ズブチリス（Ｔ Ｆ’Ｏｌ ３７１９
、ＡＴＣＣ６０５１）を親株として誘導されたものであ
り、ビリミノンアナログに耐性で、ウラシルおよび／ま
たはウリジン生産能を有しているがその他の菌学的性質
は親株と同じである。
であるバチルス・ズブチリス（Ｔ Ｆ’Ｏｌ ３７１９
、ＡＴＣＣ６０５１）を親株として誘導されたものであ
り、ビリミノンアナログに耐性で、ウラシルおよび／ま
たはウリジン生産能を有しているがその他の菌学的性質
は親株と同じである。
なお、本明細書においてＩＦＯ番号は財団法人発酵研究
所（ＩＦＯ１大阪市淀川区十用木町２丁目１７番８５号
）への寄託番号を、またＦＥＲＭｒ３Ｐ一番号はブタペ
スト条約の下での工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ
ＲＩ、茨城県つくば市東１丁目１番３号）への寄託番号
をあられす。本明細書に記載のＩＦＯＩ４７０４、ＩＦ
Ｏ１４７０５、ＩＦＯ１４７０７およびＩＦＯＩ４７０
８の各菌株は１９８８年１月１９日付で■ＦＯに、また
、ＦＥＩＩＭ ＢＰ−２１８２、ＦＥＲＭ［３Ｐ−２
１８３、Ｆ’ＥＲＭ ＢＰ−２１８４およびＦＥＲＭ
ＢＰ−２１８５の各菌株は１９８８年２月ＩＯ日付
でＦＲＩにそれぞれ寄託されている。
所（ＩＦＯ１大阪市淀川区十用木町２丁目１７番８５号
）への寄託番号を、またＦＥＲＭｒ３Ｐ一番号はブタペ
スト条約の下での工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ
ＲＩ、茨城県つくば市東１丁目１番３号）への寄託番号
をあられす。本明細書に記載のＩＦＯＩ４７０４、ＩＦ
Ｏ１４７０５、ＩＦＯ１４７０７およびＩＦＯＩ４７０
８の各菌株は１９８８年１月１９日付で■ＦＯに、また
、ＦＥＩＩＭ ＢＰ−２１８２、ＦＥＲＭ［３Ｐ−２
１８３、Ｆ’ＥＲＭ ＢＰ−２１８４およびＦＥＲＭ
ＢＰ−２１８５の各菌株は１９８８年２月ＩＯ日付
でＦＲＩにそれぞれ寄託されている。
上記のようにして得られたウラシルおよび／またはウリ
ノン生産菌の培養には、従来、これら物質の生産に用い
られてきた微生物の培養方法と同様の方法を用いること
かできる。すなわち、培地としては、炭素源、窒素源、
金属イオン類のほかに、必要に応じて、アミノ酸、核酸
、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が用いられる
。例えば、炭素源としては、グルコース、ンユークロー
ス、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜などが用いら
れる。窒素源としては、ペプトン、コーン・ステイープ
・リカー、犬豆扮、酵母、尿素などの有機窒素源のほか
に、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩や、
アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素源が、そ
れぞれ単独もしくは混合して用いられる。その他の栄養
源としては、閑の生育に必要な各種の無機塩類、アミノ
酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、それぞれ単独ら
しくは混合して用いられる。さらに、培地には、必要に
応じて、シリコンオイル、ポリアルキレングリコールエ
ーテルなどの消泡剤や界面活性剤などを添加することか
できる。培養は、通常、振盪あるいは通気攪拌深部培養
などの好気的条件下に行われろ。培地のｐＨは、通常、
４ないし９の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観
察されろ場合は、これを好ましい範囲に修正するために
、硫酸、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニ
アガス、アンモニア水などを適宜添加してらよい。培養
温度は、通常、２０℃ないし４５℃の範囲から、使用さ
れる微生物の生育およびウラシルおよび／またはウリジ
ンの画情に好適な温度が選択される。培養は実質的にウ
ラシルおよび／またはウリジンの蓄積量が最大になるま
で行われるが、通常２４時間ないし１４４時間の培養で
目的を達することができる。
ノン生産菌の培養には、従来、これら物質の生産に用い
られてきた微生物の培養方法と同様の方法を用いること
かできる。すなわち、培地としては、炭素源、窒素源、
金属イオン類のほかに、必要に応じて、アミノ酸、核酸
、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が用いられる
。例えば、炭素源としては、グルコース、ンユークロー
ス、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜などが用いら
れる。窒素源としては、ペプトン、コーン・ステイープ
・リカー、犬豆扮、酵母、尿素などの有機窒素源のほか
に、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩や、
アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素源が、そ
れぞれ単独もしくは混合して用いられる。その他の栄養
源としては、閑の生育に必要な各種の無機塩類、アミノ
酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、それぞれ単独ら
しくは混合して用いられる。さらに、培地には、必要に
応じて、シリコンオイル、ポリアルキレングリコールエ
ーテルなどの消泡剤や界面活性剤などを添加することか
できる。培養は、通常、振盪あるいは通気攪拌深部培養
などの好気的条件下に行われろ。培地のｐＨは、通常、
４ないし９の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観
察されろ場合は、これを好ましい範囲に修正するために
、硫酸、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニ
アガス、アンモニア水などを適宜添加してらよい。培養
温度は、通常、２０℃ないし４５℃の範囲から、使用さ
れる微生物の生育およびウラシルおよび／またはウリジ
ンの画情に好適な温度が選択される。培養は実質的にウ
ラシルおよび／またはウリジンの蓄積量が最大になるま
で行われるが、通常２４時間ないし１４４時間の培養で
目的を達することができる。
培養物からウラシルおよび／またはウリジンを分離・採
取するには、すでに公知とされている通常の精製手段、
例えば、沈殿法、イオン交換樹脂や活性炭によるクロマ
トグラフィー法などの分離精製法が用いられる。
取するには、すでに公知とされている通常の精製手段、
例えば、沈殿法、イオン交換樹脂や活性炭によるクロマ
トグラフィー法などの分離精製法が用いられる。
寒敷鯉
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１
）染色体ＤＮＡの調製
ウラシルおよび／またはウリジンの生産能力をＲＬ、ピ
リミジンアナログ耐性を有するハヂルス・ズブチリス
ＡＡ４７株（ＩＦＯ１４７０５ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
８３）を１リツトルのし培地（バクト・トリプトンｌ
０％、酵母エキス０５％、塩化ナトリウム０５％）に接
種し、３７°Ｃで一夜培養し、得られた菌体からフェノ
ールを用いろサイト−らの方法（Ｂ ｉｏｃｈｉｍ、
Ｂ １ｏｐｈｙｓ、 Ａ ｃｔａ。
リミジンアナログ耐性を有するハヂルス・ズブチリス
ＡＡ４７株（ＩＦＯ１４７０５ＦＥＲＭ ＢＰ−２１
８３）を１リツトルのし培地（バクト・トリプトンｌ
０％、酵母エキス０５％、塩化ナトリウム０５％）に接
種し、３７°Ｃで一夜培養し、得られた菌体からフェノ
ールを用いろサイト−らの方法（Ｂ ｉｏｃｈｉｍ、
Ｂ １ｏｐｈｙｓ、 Ａ ｃｔａ。
７２ ６１９（１９６３））によって最終６ 、０ ｍ
ｇの染色体ＤＮＡを得た。
ｇの染色体ＤＮＡを得た。
）染色体ＤＮＡのベクタープラスミドｐＨＶＩ・１への
挿入 以後の実験における実験操作の方法は、特に断りの無い
限りティ・マニアティスら、［モレキュラー クローニ
ングＪ（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ〜１ｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
挿入 以後の実験における実験操作の方法は、特に断りの無い
限りティ・マニアティスら、［モレキュラー クローニ
ングＪ（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ〜１ｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｉ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、東大出版会発行、１９８２年）に記載の方
法に従った。
ａｔｏｒｙ、東大出版会発行、１９８２年）に記載の方
法に従った。
上記１）項で得た染色体ＤＮＡ １０μｇと１）ＨＶ
Ｉ４ １０μｇにッポンジーン製）を制限酵素ｐｓｉに
ッポンジーン製）を用いてそれぞれ切断した後、両者を
混合しＴ４ファーン由来のＤＮＡリガーゼにッポンノー
ン製）によって連結させた。
Ｉ４ １０μｇにッポンジーン製）を制限酵素ｐｓｉに
ッポンジーン製）を用いてそれぞれ切断した後、両者を
混合しＴ４ファーン由来のＤＮＡリガーゼにッポンノー
ン製）によって連結させた。
１１１）ピリミノンアナロク耐性化遺伝子のクローニン
グ 形質転換には、コンピテントセル法を用いた。
グ 形質転換には、コンピテントセル法を用いた。
すなわち、エシェリヒア・コリ Ｃ６００株より調製し
たコンピテントセルの懸濁液に上記１１）項で作製した
プラスミドＤＮＡを加えて、取り込ませ、形質転換を行
わせた。次に、この形質転換株を含む懸濁液を６−アザ
ウランル２００μｇ／ ｍＱおよびクロラムフェニコー
ルｌＯμｇ／ｍｃを含むＭＡＣ−９寒天培地（リン酸２
水素ナトリウム０６％、リン酸２水素カリウム０３％、
塩化アンモニウムＯ１％、塩化すトリウム０，０５％、
硫酸マグネンウム１ｍＭ１塩化カルノウム１ｍＭ、カザ
ミノ酸０３％、Ｌ−トリプトファン０．０１％、グルコ
ース０５％、および寒天２．０％ｐＨ７。
たコンピテントセルの懸濁液に上記１１）項で作製した
プラスミドＤＮＡを加えて、取り込ませ、形質転換を行
わせた。次に、この形質転換株を含む懸濁液を６−アザ
ウランル２００μｇ／ ｍＱおよびクロラムフェニコー
ルｌＯμｇ／ｍｃを含むＭＡＣ−９寒天培地（リン酸２
水素ナトリウム０６％、リン酸２水素カリウム０３％、
塩化アンモニウムＯ１％、塩化すトリウム０，０５％、
硫酸マグネンウム１ｍＭ１塩化カルノウム１ｍＭ、カザ
ミノ酸０３％、Ｌ−トリプトファン０．０１％、グルコ
ース０５％、および寒天２．０％ｐＨ７。
２）の平板培地上に塗抹して３７°Ｃで２日間培養した
。平板培地上に生じたコロニーからクロラムフェニコー
ル耐性および６−アザウランル耐性を有する形質転換株
エシェリヒア・コリ ＴＦＡ １７株（ｒＦＯＩ４７０
４．ＦＥＲＭ ＢＰ−２１８２）を得た。
。平板培地上に生じたコロニーからクロラムフェニコー
ル耐性および６−アザウランル耐性を有する形質転換株
エシェリヒア・コリ ＴＦＡ １７株（ｒＦＯＩ４７０
４．ＦＥＲＭ ＢＰ−２１８２）を得た。
Ｖ）形質転換株からのプラスミド抽出
形質転換株エシェリヒア・コリ ＴＦＡｌ ７株の培ａ
ｒＩｊＬ＋リットルより最終的に５００μｇのプラスミ
ドを得、これをｐＹＲｃｌｏｏと命名した。
ｒＩｊＬ＋リットルより最終的に５００μｇのプラスミ
ドを得、これをｐＹＲｃｌｏｏと命名した。
■）プラスミドｐＹＲＣ１００の解析
１）ＹＲＣｌｏｏを種々の制限酵素で切断し、ラムグフ
ァーノのＤＮＡにッポンンーン製）Ｈｉｎｄ■分解物の
分子ｍを基準にするアガロースゲル電気泳動のパターン
から第１図に示すような制限酵素切断地図を得た。ｐＹ
Ｒｃｌｏｏは、ｐＨＶ１４のＰｓｔＩサイトに約１０．
０ｋｂのＤＮＡ断片か挿入された組換えプラスミドで図
の右側のＰｓｔＩサイトから、０２および６ 、２ ｋ
ｂの位置にＥｃｏＲＩザイトを有し、同じく右側のＰｓ
ｌＩザイトから、０７．０９．１．５．３５．５１．７
．３．８゜３および９．４ｋｂの位置に合計８箇所のＨ
ｉｎｄＩＩＩサイトを有する。
ァーノのＤＮＡにッポンンーン製）Ｈｉｎｄ■分解物の
分子ｍを基準にするアガロースゲル電気泳動のパターン
から第１図に示すような制限酵素切断地図を得た。ｐＹ
Ｒｃｌｏｏは、ｐＨＶ１４のＰｓｔＩサイトに約１０．
０ｋｂのＤＮＡ断片か挿入された組換えプラスミドで図
の右側のＰｓｔＩサイトから、０２および６ 、２ ｋ
ｂの位置にＥｃｏＲＩザイトを有し、同じく右側のＰｓ
ｌＩザイトから、０７．０９．１．５．３５．５１．７
．３．８゜３および９．４ｋｂの位置に合計８箇所のＨ
ｉｎｄＩＩＩサイトを有する。
ｖｉ）再形質転換
ｐＹＲＣ１００上にピリミノンアナログ耐性化遺伝子が
存在ずろことを確認するために、上記プラスミドＤＮＡ
を用いてエシェリヒア・コリ Ｃ６００株を再度形質転
換した。生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれＩＯｇを釣りあげてピリミノンアナログ耐性
度をテストしたところ、全ての菌株がピリミノンアナロ
グ耐性を獲得しており、ｐＹＩｌｃＩｏｏ上にピリミノ
ンアナログ耐性化逍転子が存在することか明らかとなっ
た。表１にエシェリヒア・コリ Ｃ６００味およびエシ
ェリヒア・コリ ＴＦＡｌ７株をピリミノンアナログま
たはクロラムフェニコールを含むＭＡＣ−９平板培地上
て培養したときの生育を示す。
存在ずろことを確認するために、上記プラスミドＤＮＡ
を用いてエシェリヒア・コリ Ｃ６００株を再度形質転
換した。生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれＩＯｇを釣りあげてピリミノンアナログ耐性
度をテストしたところ、全ての菌株がピリミノンアナロ
グ耐性を獲得しており、ｐＹＩｌｃＩｏｏ上にピリミノ
ンアナログ耐性化逍転子が存在することか明らかとなっ
た。表１にエシェリヒア・コリ Ｃ６００味およびエシ
ェリヒア・コリ ＴＦＡｌ７株をピリミノンアナログま
たはクロラムフェニコールを含むＭＡＣ−９平板培地上
て培養したときの生育を示す。
表 １
ＭＡＣ−９への添加物
（）内は添加量（μ９／ｍＱ）
無添加
クロラムフェニコール （ｌＯ）
６−アザウラシル （２００）
５−フルオロウラシル （５）
２−チオウラシル （１００）
５−フルオロノドノン （５）
５−フルオロウラシル （１０）
＊＋：生Ｉ￥存り、 −：生育なし
ｖｉｉ）形質転換株のウラシルおよび／またはウリノン
生産能 」二足の形質転換株エンエリヒア・コリ Ｔ Ｆ Ａ１
７株をグルコース３％、硫酸アンモニウム０２％、リン
酸ｌカリウムＯ１％、コーンスチーブリカー１％、硫酸
マグネシウム０．Ｏ１％、炭酸カルシウム２％からなる
発酵培地２０ｍＱを含む２００ｍＱ容フラスコに接種し
て２８℃で３日間振盪培養したところ７５０ｍｇ／Ｑの
ウラシルが蓄積菌株の生育＊ Ｃ６００昧ＴＦＡ１７株 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 十 ＋ ＋ した。一方、エンエリヒア・コリ Ｃ６００ｆｔを上記
と同し条件下で培養したところ、ウラシルの蓄積は、全
く認められなかった。
生産能 」二足の形質転換株エンエリヒア・コリ Ｔ Ｆ Ａ１
７株をグルコース３％、硫酸アンモニウム０２％、リン
酸ｌカリウムＯ１％、コーンスチーブリカー１％、硫酸
マグネシウム０．Ｏ１％、炭酸カルシウム２％からなる
発酵培地２０ｍＱを含む２００ｍＱ容フラスコに接種し
て２８℃で３日間振盪培養したところ７５０ｍｇ／Ｑの
ウラシルが蓄積菌株の生育＊ Ｃ６００昧ＴＦＡ１７株 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 十 ＋ ＋ した。一方、エンエリヒア・コリ Ｃ６００ｆｔを上記
と同し条件下で培養したところ、ウラシルの蓄積は、全
く認められなかった。
実施例２
）ｐＹｎｃｌｏｏによるバチルス・ズブチリスの形質転
換 実施例１のｉｖ）項で得たプラスミドｐＹＲｃ１００を
用いてバチルス・ズブチリス（［ＦＯ１３７１９、ＡＴ
ＣＣ６０５１）味を形質転換した。形質転換は、受容菌
のプロトプラストにポリエチレングリコールを作用させ
てＤＮＡを取り込ませる方法［ニス・ノヤンおよびニス
・エヌ・コーヘン、モレキュラー・アンド・ジェネラル
・ジエネティックス（Ｓ、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｓ、Ｎ
、Ｃｏｈｅｎ、 Ｍｏ１．ＧｅｎＧｅｎｅｔ、）、１６
Ｂ、ｌ ｌ １（１９７９）］によった。
換 実施例１のｉｖ）項で得たプラスミドｐＹＲｃ１００を
用いてバチルス・ズブチリス（［ＦＯ１３７１９、ＡＴ
ＣＣ６０５１）味を形質転換した。形質転換は、受容菌
のプロトプラストにポリエチレングリコールを作用させ
てＤＮＡを取り込ませる方法［ニス・ノヤンおよびニス
・エヌ・コーヘン、モレキュラー・アンド・ジェネラル
・ジエネティックス（Ｓ、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｓ、Ｎ
、Ｃｏｈｅｎ、 Ｍｏ１．ＧｅｎＧｅｎｅｔ、）、１６
Ｂ、ｌ ｌ １（１９７９）］によった。
上記の１０μｇ／ｍρのクロラムフェニコールを含む再
生用培地に生育した形質転換株をｌＯμｇ／ｍＱのクロ
ラムフェニコールおよび２００μｇ／ｍρの６−アザウ
ラシルを含むＭＡＣ−９培地の寒天平板にレプリカして
３７°Ｃで２日間培養後、生じたコロニーから形質転換
株バチルス・ズブチリスＴＦＢＡ１６株（Ｉｒ’０１４
７０７ ＦＥＲＭＢＰ−２１８４）を得た。バチルス
・ズブチリスＴＦＩ３Ａ Ｉ ６株は、クロラムフェニ
コールおよびピリミジンアナログに耐性な形質転換株で
ある。
生用培地に生育した形質転換株をｌＯμｇ／ｍＱのクロ
ラムフェニコールおよび２００μｇ／ｍρの６−アザウ
ラシルを含むＭＡＣ−９培地の寒天平板にレプリカして
３７°Ｃで２日間培養後、生じたコロニーから形質転換
株バチルス・ズブチリスＴＦＢＡ１６株（Ｉｒ’０１４
７０７ ＦＥＲＭＢＰ−２１８４）を得た。バチルス
・ズブチリスＴＦＩ３Ａ Ｉ ６株は、クロラムフェニ
コールおよびピリミジンアナログに耐性な形質転換株で
ある。
表２に、バチルス・ズブチリス（ＩＦＯＩ３７１９、Ａ
ＴＣＣ６０５１）昧およびバチルス・ズブヂｌ）ス Ｔ
ＦＢＡ１６昧を、クロラムフェニコール、またはピリミ
ジンアナログを含むＭＡＣ−９培地の寒天平板上で培養
した場合の生育を示す。
ＴＣＣ６０５１）昧およびバチルス・ズブヂｌ）ス Ｔ
ＦＢＡ１６昧を、クロラムフェニコール、またはピリミ
ジンアナログを含むＭＡＣ−９培地の寒天平板上で培養
した場合の生育を示す。
表２
ＭＡＣ９への添加物
（）内は添加量（μ９／、’ｌＱ）
無添加
クロラムフェニコール （ｌＯ）
６−アザウラシル （２００）
５−フルオロウラシル （５）
２−チオウラシル （１００）
５−フルオロノドノン （５）
５−フルオロウラシル （１０）
＊＋・生育有り、 −０生育なし
）形質転換株のウラシルおよび／またはウリノンの生産
能 バチルス・ズブチリス（ＩＦＯ１３７１９Ａ’ｒｃｃ６
０５１）、バチルス・ズブチリスＴＦ’ＢＡ ｌ ６Ｄ
およびバチルス・ズブチリス Ａ Ａ ４７を朱をグル
コース１５％、コーンスチープリヵー３％、尿素１％、
炭酸カルシウム２％からなる発酵培地２０ｍ（を含む２
００ｍ１２容フラスコに接種して３７℃で３日間振盪培
養したところ、表３に示菌株の生育＊ ＩＦＯ１３７１９ＴＦＢ八１へ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ す結果が得られた。
能 バチルス・ズブチリス（ＩＦＯ１３７１９Ａ’ｒｃｃ６
０５１）、バチルス・ズブチリスＴＦ’ＢＡ ｌ ６Ｄ
およびバチルス・ズブチリス Ａ Ａ ４７を朱をグル
コース１５％、コーンスチープリヵー３％、尿素１％、
炭酸カルシウム２％からなる発酵培地２０ｍ（を含む２
００ｍ１２容フラスコに接種して３７℃で３日間振盪培
養したところ、表３に示菌株の生育＊ ＩＦＯ１３７１９ＴＦＢ八１へ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ す結果が得られた。
表３
（ｌＦＯ１３７１９，ＡＴＣＣ６０５１）バチルス・ズ
ブチリス ＴＰＢＡ Ｉ ６ ２．０ バチルス・ズブチリス １．６ ０．５ＡＡ＝１
７ ＊ｘｇ／ｌｎρ 実施例３ 実施例２と同様にしてプラスミドｐＹＲＣ１００を用い
てバチルス・ズブチリス ＡＡ４７ｎ（ＩＰＯ１４７０
５，ＦＥｆｌＭ ＢＰ−２１８３）を形質転換した。
ブチリス ＴＰＢＡ Ｉ ６ ２．０ バチルス・ズブチリス １．６ ０．５ＡＡ＝１
７ ＊ｘｇ／ｌｎρ 実施例３ 実施例２と同様にしてプラスミドｐＹＲＣ１００を用い
てバチルス・ズブチリス ＡＡ４７ｎ（ＩＰＯ１４７０
５，ＦＥｆｌＭ ＢＰ−２１８３）を形質転換した。
１０μｇ／ｍ（ｌのクロラムフェニコールを含む再生用
培地に生育した形質転換株をｌＯμｇ／ｍ（ｌのクロラ
ムフェニコールおよび２００ｔｔｇ／ｍρの６−アザウ
ラシルを含むＭＡＣ−９培地の寒天平板にレプリカして
３７°Ｃで２日間培養後、生じたコロニーの中からバチ
ルス・ズブチリス ＴＦＡＡ４７ｔ’Ｊ（ＩＦＯ１４７
０８，ＦＥＴ′ｔＭ ＢＰ−２１８５）を得た。バチ
ルス・ズブチリス ΔＡ４１に＆びバチルス・ズブチリ
スＴＦＡＡ４７株を実施例２の１１）に示す発酵培地に
接種して３７℃で３日間振盪培養したときのウラシルお
よびウリノン生産量を表４に示す。
培地に生育した形質転換株をｌＯμｇ／ｍ（ｌのクロラ
ムフェニコールおよび２００ｔｔｇ／ｍρの６−アザウ
ラシルを含むＭＡＣ−９培地の寒天平板にレプリカして
３７°Ｃで２日間培養後、生じたコロニーの中からバチ
ルス・ズブチリス ＴＦＡＡ４７ｔ’Ｊ（ＩＦＯ１４７
０８，ＦＥＴ′ｔＭ ＢＰ−２１８５）を得た。バチ
ルス・ズブチリス ΔＡ４１に＆びバチルス・ズブチリ
スＴＦＡＡ４７株を実施例２の１１）に示す発酵培地に
接種して３７℃で３日間振盪培養したときのウラシルお
よびウリノン生産量を表４に示す。
表４
ＡＡ＝１７
バチルス・ズブチリス ３２ １５１’ Ｆ Ａ
Ａ ４７ ＊み７９／ｍＱ 実施例４ 実施例２の１１）に示した発酵培地２０ｍＱを含む２０
０ｍｆｆ容フラスコ５０個を用いて実施例３に従ってバ
チルス・ズブチリス ＴＦＡＡ４７を培ｊｔシた。得ら
れた培谷物から遠心分離により菌体を除去し、この」二
ｉＮ液をＩＮの塩酸溶液によりｐＨ２０とした後遠心分
離により沈殿を除いた。得られた上〆ｎ液中のウラシル
およびウリジンを活性炭カラムに吸着させた後、■ ４
％のアンモニア水を含む５０％エタノール溶液により溶
出させた。
Ａ ４７ ＊み７９／ｍＱ 実施例４ 実施例２の１１）に示した発酵培地２０ｍＱを含む２０
０ｍｆｆ容フラスコ５０個を用いて実施例３に従ってバ
チルス・ズブチリス ＴＦＡＡ４７を培ｊｔシた。得ら
れた培谷物から遠心分離により菌体を除去し、この」二
ｉＮ液をＩＮの塩酸溶液によりｐＨ２０とした後遠心分
離により沈殿を除いた。得られた上〆ｎ液中のウラシル
およびウリジンを活性炭カラムに吸着させた後、■ ４
％のアンモニア水を含む５０％エタノール溶液により溶
出させた。
ウリジンおよびウラシルの溶出画分を集め減圧濃縮させ
た後、濃縮液をアンモニア水を加えてｐＨ８０とした。
た後、濃縮液をアンモニア水を加えてｐＨ８０とした。
次に、これに等容量の０．０１Ｍホウ酸カリウム溶液を
加えた後、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ） −１Ｘ ２
（ＣＩ−型、２００−４００メツシユ）のカラムを用い
てウラシルおよびウリジンを吸着させた。このカラムを
蒸留水で洗浄した後、ｌリットル中に００８Ｍ塩化カリ
ウムおよび００２Ｍホウ酸カリウムを含む水溶液を用い
てウラツルおよびウリノンを溶出させた。ウラシルおよ
びウリジン溶出画分を別個に集め、各溶出液に等容１の
メタノールを加え濃縮乾固を繰り返した。
加えた後、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ） −１Ｘ ２
（ＣＩ−型、２００−４００メツシユ）のカラムを用い
てウラシルおよびウリジンを吸着させた。このカラムを
蒸留水で洗浄した後、ｌリットル中に００８Ｍ塩化カリ
ウムおよび００２Ｍホウ酸カリウムを含む水溶液を用い
てウラツルおよびウリノンを溶出させた。ウラシルおよ
びウリジン溶出画分を別個に集め、各溶出液に等容１の
メタノールを加え濃縮乾固を繰り返した。
得られた固形物を少量の水に溶かし、冷却下にエチルア
ルコールを添加しウラシルの結晶２０ｇ、ウリジンの結
晶０．８ｇを得た。
ルコールを添加しウラシルの結晶２０ｇ、ウリジンの結
晶０．８ｇを得た。
発明の効果
本発明によると、各種微生物にピリミノンアナログ耐性
を効率よく付与できろ。その結果、ウラシルおよび／ま
たはウリノン非生産株であっても、該ピリミジンアナロ
グ耐性化遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入することに
より、ウラシルおよび／またはウリノン生産株にするこ
とができる。さらに、ウラシルおよび／またはウリノン
生産株の場合は、これを本発明の方法に従って形質転換
することによりこれら物質の生産性を向」ニさせろこと
かできろ。
を効率よく付与できろ。その結果、ウラシルおよび／ま
たはウリノン非生産株であっても、該ピリミジンアナロ
グ耐性化遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入することに
より、ウラシルおよび／またはウリノン生産株にするこ
とができる。さらに、ウラシルおよび／またはウリノン
生産株の場合は、これを本発明の方法に従って形質転換
することによりこれら物質の生産性を向」ニさせろこと
かできろ。
第１図は、実施例で得られた組換えプラスミドｐＹＲｃ
Ｉｏｏの制限酵素地図を示す。括弧内の数字は、ｋｂを
示す。またトｌは１ＩｉｎｄｌＴＩの切断ザイト、ｌ〕
はＰｓｔ［の切断ザイト、ＥはＥｃｏＲＩの切断ザイト
を示す。 特許出願人 弐田築品工業株式会辻
Ｉｏｏの制限酵素地図を示す。括弧内の数字は、ｋｂを
示す。またトｌは１ＩｉｎｄｌＴＩの切断ザイト、ｌ〕
はＰｓｔ［の切断ザイト、ＥはＥｃｏＲＩの切断ザイト
を示す。 特許出願人 弐田築品工業株式会辻
Claims (6)
- （１）ピリミジンアナログ耐性化遺伝子領域を有するＤ
ＮＡ。 - （２）約１０キロベースペア離れたＰｓｔ I の切断点
を有し、かつ該Ｐｓｔ I 断片中に、２箇所のＥｃｏＲ
Ｉサイトと、８箇所のＨｉｎｄIIIサイトを有する請求
項（１）記載のＤＮＡ。 - （３）ピリミジンアナログ耐性を有し、かつウラシルお
よび／またはウリジン生産能を有するバチルス属細菌の
染色体ＤＮＡから得られた請求項（１）または（２）記
載のＤＮＡ。 - （４）請求項（１）記載のＤＮＡが組み込まれたプラス
ミド。 - （５）請求項（４）記載のプラスミドで形質転換された
エシェリヒア属細菌またはバチルス属細菌。 - （６）ピリミジンアナログ耐性を有するバチルス属細菌
の染色体ＤＮＡから得られたピリミジンアナログ耐性化
遺伝子が組み込まれたプラスミドで形質転換されたエシ
ェリヒア属またはバチルス属細菌を培地に培養し、培養
物中にウラシルおよび／またはウリジンを生成蓄積せし
めこれを採取することを特徴とするウラシルおよび／ま
たはウリジンの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-36398 | 1988-02-17 | ||
| JP3639888 | 1988-02-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022349A true JPH022349A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=12468747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1018939A Pending JPH022349A (ja) | 1988-02-17 | 1989-01-27 | ピリミジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH022349A (ja) |
| KR (1) | KR890013180A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
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