SU463268A3 - Способ получени св занных носителем протеинов - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ НОСИТЕЛЕМ

ПРОТЕИНОВ

3

получен в салюм водном растворе полимериJruntoii вплор с 1,(1|)имых мономеров. Прн этом прсд1111|ти1слыи1 осуществл п, предлагаемый способ превращени  протеина с эпоксидным соединепнсм в присутствии полимеризующегос  мо 1омера (или мономеров), или полимеризую ннйс  лгономер (или смесь мономеров) добав;  т1)СЯ в реакционный раствор лишь пас.те )е,кннн между нротеином и эпоксидным спсдилепнем.

Д;1Я осуолествлени  предлагаемого способа прсдпочтите.тьпы эпоксидные соединени  общеь форлгулы

. :

C.

в KOTOpoii Ri означает алкиленовый радикал с одной или несколькими двойными св з ми, алкиленоксирадикал или ненасыщеннвш ацильиый радикал; п - 0,1 или 2; Rg - атом водорода илп низпла  алкильна  группа (под Hi-Bineii алкильной грунной понимаетс  пр ма  1-1ЛИ развствлспна  группа с 1-4 атомами углерода ). Группа RI содержит преимущественно 2-6 атомов углерода. Однако могут нримеп тъс  и более длинноценочные радикалы, поскольку при этом водорастворимость эпоксидного соедииени  уменьшаетс  незначительно .

Примерными групп Ri могут служить аллилОКСИ- , метилаллилокси, этилаллилокси-, диметилаллилокси- , метилэтилаллилокси, проиилаллилокси- и диэтилаллилоксигруппы, а также другие аллилоксигомологи, предпочтительна ацильна  группа, в которой оксигруппа находитс  в сопр жении с двойной св зью. Подобные группы RI образуютс , например, от а,3-ненасыщенных кислот таких, как акрилова , метакрилова , фумарова  и малеинова  ккслоты.

Примерами соединений общей формулы I  вл ютс  2,3-эпоксипропиловый сложный эфир акриловой и метакриловой кислот, 2,3-эпоксиироппловый сложный моноэфир и диэфир малеиповой кислоты, 2,3-эпоксипропиловый сложный мопоэфир и диэфир фумаровой кислоты , 2,3-эпоксибутиловый эфир акриловой кислоты, 2,3-эпоксипентиловый сложный эфир акриловой кислоты, 2,3-эпоксигексилсвый СЛОЖНВ1Й эфир акриловой кислоты, соответствуюпще эфиры метакриловой, (|)умарово1 | и малеиновой кислот, 1-(аллилoi;cn )-2,3-Э11оксибута11 и т. п.

Особенно предпочтительны в качестве мономеров водорастворимые нроизводные акрилоHoii плп метакриловой кислоты, например амнды п сложпые эфиры этих соединений. Соединени5 с ограниченной водорастворимостью нл-еют преимущество в том случае, когда примен етс  св занный носителем фермент в нечисто водной системе, например в водно-оргаiiH4ecKoii среде. Пригоды также соответствую4

щие производные малеиновой или фумаровой кислоты.

В зависимости or требуемо консистенции конечного нродукта к мономеру добавл ют

сшивающий агент, содержащий более одной нолимеризующейс  груипы, например N,N-Meтиленбисакриламид и диэтиленакрилат, которые предпочитают при работе с водным раствором . Если полимеризацию ведут в гетерогепной фазе, т. е. в суснепзии, могут нримеп тьс  такие водонерастворимые еп:ивающие агенты, как дивппилбензол п зтилендиметакрилат и др. Полученные по предлагаемому способу протеипы, св занные носителе:м, не

образующим сшивки, можно сшивать дополнительно .

Взаи.модействие протеипа с эпоксидным соединением не требует особых меропри тий: нротеин и эпоксидное соединение можно вводить вместе при нор.лшльной температуре в водный раствор, целесообразно в буферный водный раствор с величиной рП, приемлемой дл  соответствующего JipOTenna. Продолжительность взаимодействи  протеина и эпоксидкого соединени  зависнт от примен емых веществ и колеблетс  от 5 мин до 1 час, ио в отдельных случа х может быть более продолжительной или более короткой. Взаимодействие нротенна и эпоксидного соединени  можно вести в нрисутствии носител  или исходных продуктов дл  получени  носител . В последнем случае нецелесообразно начинать реакцию полимеризации добавкой ицициатора после образовани  промежуточного продукта протеина с эноксидным соедипепием . В качестве инициаторов могут примеп тьс  употребл емые обычпо в химии полимеров инициаторы и катализаторы, так как они не оказывают отрицательного вли ни  на

активность протеина. В качестве инициаторов или катализаторов при применении мономеров с ненаевшденными олефиновыми св з .ми или форполимеров используют, например, неорганические или органические нерекиеи, азосоединени  и т. д. Могут примен тьс  также ускорители реакцпп, в частности амины и т. н. Использование инициаторов в комбинации из перекисного сульфата и амина, нанример 3-диметила .мииопронионитрила, нредпочтительно.

При применении нпициаторов в этой комбинацпи целесообразно вести процесс в ипертной атмосфере, например в атмосфере азота. Продукт получают ii)ocTijiM отфпльтровыванпем п 1громывкой.

По предлагаемому сцособу чувствительные протеииы и протеиновые соединени , наприме ) ферме1ггы, люжно св зывать без большой нотери их активности. При фиксации на носи1ел х подобных чуветвительпых протеинов но

известным методам ночтн во всех случа х они дезактивируютс  или получаемые препараты имеют небольшую стойкость и ограниченную активность. Преимущество получаемых по изобретению продуктов состоит в том, что во

врем  прон,ессов их пабухапп  и другнх проueccoB ферментное или протеиновое соединение сохран етс . Это иро вл ете , например, в том, что при фиксации фермента уреазы на ДЕАЕ-целлюлозе по известному триазиновому способу нолучают продукт с активностью 4,9 ед./г, а но нредлагаемому - с активностью 1200 ед./г при той же ферментативной активности . Причем и после хранени  в течение нескольких недель при температуре 34°С продукт не тер ет активности. Аналогично по известному способу можно фермент глюкозаоксидазу с активностью 300 ед./г лиофилизата св зывать с целлюлозой. Но после 11 дней хранени  активность снижаетс  менее чем на половину. По предлагаемому способу, использу  одинаковые количества фермента, можно нолучать продукты почти с удвоенной активностью. Такие продукты сохран ютс  более 6 мес цев в готовой форме как катализаторы без существенного уменьшени  активности.

Продукты, получаемые по изобретению, стойки к поражению микроорганизмами, режим набухани  их управл емый, что важпо, если продукты примен ют дл  насадки колонны , кроме того, они обеспечивают легкое регулирование требуемого зар да или отсутствие зар да. Преимущество способа состоит также в простоте его осуществлени .

Пример I. Исходные вещества: глюкозаоксидаза (GOD, 220 ед./мг) акриламид, 2,3эпоксипропиловый слолсный эфир акриловой кислоты, М,Ы-метиленбисакриламид, 3-диметиламинопропионитрил , перекисный сульфат аммони .

0,1 г GOD раствор ют в 2 мл. 0,5 М буферного раствора триэтаноламина (рН 8,0) в атмосфере азота при 30°С, смещивают с 0,25 мл 2,3-эпоксипропилового сложного эфира акриловой кислоты и перемещивают 30 мин. Затем охлаждают до 10°С, смещивают с 3 г акриламида и 0,1 г К,Н-метиленбисакриламида, растворенного в 18 мл дистиллированной воды.

В атмосфере азота приблизительно через 15 мин начинаетс  полимеризаци  при помощи 0,5 мл 5%-ного 3-диметиламинонропионитрила и 3 мл 5%-ного перекисного сульфата аммони . Раствор приблизительно через 5 мин становитс  в зким, затем он нолимеризуетс  в желтьп прозрачный и твердый гель. Блок полимеризации оставл ют на 18 час в холодильном П1кафу. Далее полимеризат нродавлипают сквозь металлическое сито с отверсти ми диаметром 0,5 мм и промывают 2000 мл дистиллированной воды. Частички гел  помещают в колонну внутренним диаметром 2 см с 0,2 М буферным раствором фосфата кали  (рП 7,5), промывают адсорбционно св занной GOD, пока активность элюата не будет равна нулю. Ферментативна  активность св занного носителем фермента (лиофилизата) 500 ед./г.

Пример 2 (сравнительный пример). Повтор ют пример 1, однако не внос т эпоксидное соединение.

3,0 г акриламида и 0,1 г N,N-мeтилeпбиcaкриламида в 18 мл дистиллировагпюй воды

смешивают, перелгешива  и заморажива  с 0,1 г GOD, раствореипой в 2 гл 0,05 М буферного раствора триэтанолампна (рП 8,0). Затем , как в примере I. в атмосфере азота добавл ют раствор инициатора, п продукт обрабатывают , как описапо в прпмере 1. Активпость элюата около 40% от активности введеппого GOD. После лиофилизагши полученного продукта актиБПОсть лпофилпзата составл ет от 9dдо 100 ед./г.

Пример 3. 1-1с.ходпые вещества: GOD-1, 220 ед./мг, акриламид, 2,3-эпоксппропиловый сложный эфир акриловой кислоты, Х,Х-метилеибисакрпламид , 3-диметиламинонроппонитрил , нерекпсны) сульфат аммони .

0,15 г GOD в 1,5 л днстиллпрова1пкп 1 воды и 1.5 мл 1,0 М буферного раствора триэтаиолампна (рН 8,0) охлаждают в атмосфере азота до 10°С. Этот раствор разбавл ют 3,0 г акриламида и 0,1 г К,Х-метпленбисакрплампда, растворенного в 14 мл воды. При добавке в реакционный раствор 0.25 л 2,3-эпоксппропилового сложного эфира акриловой кислоты, 0,5 мл 5%-ного З-диметиладгинопроппопитрила и 0,2 мл 5%-ного перекнсного сульфата аммопп  начинаетс  реакци  полимеризации. Врем  иолимернзации около 10 мин. Полимеризационный блок продавливают сквозь металлическое сито и обрабатывают, как оиисано в примере 1. Определенпе активпостн элюата показывает, что св зываетс  ковалептно 100% протеииа. Активность лиофилпзата 140 ед./г.

Пример 4. Псходные вещества: GOD-1, 200 ед./г, акриламид, 1-(аллилокси)-2.3-эпоксинропан , ,1 -метпленбпсакриламид, 3-диметилампнопрогпюнитрил , нерекисньи су,чьфат аммони .

50 мг GOD в 0,5 .мл дистиллировапной воды и 0,5 мл 1 М буферного раствора триэтаполампна (рП 8,0), раствореппые в атмосфере азота при 30°С, и 0,1 мл 1-(аллнлокси)-2,3эпоксипронана выдерживают 40 мин, зате: 1

охлаждают до , смешивают с 3 г акриламида и 0,1 г N.N-метиленбпсакрилампда, растворенного в 20 мл бпдистиллнрованпой воды. Дальне1п1 ую обработку ведут, как описано в 1. Активность элюата составл ет 10% от активности использованного фер ieптa . Активность лиофилизата 210 ед./г.

Пример 5. Псходпые вещества: урпказа, 4,5 ед./мг, раствореппа  в 50%, глицерина. 0,05 М глицин п 0.13 Д раствор Ха2СОз, акрнламид , 2.3-эпоксппроп ловьп | сложны эфир акрил OBofi кислоты. Х.Х-метиле б1 Сакриламид , 3-ди eтнлaмнпoпpo П oнптp л, ерекис ЬП1 сульфат аммони .

10 уриказы подвергают диализу i 1 л

0,01 лМ буферного раствора гл1П1И 1а (рН 10) при 4°С около 4 час. Дпалпзат смешива от с 1 мл 1 М буферного раствора тр)этанолам 1па (рП 8,0). При в атмосфере азота выдержива от получеп 1ую смес с добавлением

0,1 мл 2.3-э110ксп рО П5лового эфира

7

акриловой кислоты при перемегпиваини в течение 30 мни. Обработку ведут по 1. Активиоеть лиофилизата 3,5 од./г.

Пример 6. 1--1сходиые вещеетва: гекеокипаза , 140 ед./мг, акриламид, 2,3-эпоксипрои 1ловый сложный эфир акриловой кислоты, ,Nметилепбисакриламид , З-диметиламиноиропионитрил , иерекисный суль(1)ат лмиони .

20 мг суспсизии кристаллов гексокииаз1 ; раствор ют в 5 мл воды и иодвергают диализу в 1 л 0,01 М буфериого раствора триэтаиоламииа (рН 8,0) при 4°С, В присутствии 2,3эиоксииропилового сложного эфира акриловой кислоты выдерживают иолучеииую смесь в атмосфере азота ири 10°С с охлаждеиие, после 30 мии выдерживани  до 10°С. Раствор фермеита смешивают с 3 i акриламида и 0,1 г Ы,Ы-метилеибисакриламида, раствореииого в 20 мл диcтиллиpoвaIИIoi воды. Дальне1 пиую обработку ведут ио иримеру 1. Лктивиость лиофилизата 12 ед,/г,

Пример 7. Пеходиые вещества: глюкозаоксидаза , 220 ед,/мг (GOD), 1,2-эиоксибутеи3 ,4, акриламид, N,N-метил енбисакрил амид, 3-диметиламииоироииоиитрил,1герекисиый

су.аьфат аммоии .

100 мг GOD в 2 мл 0,5 М буфериого раствора триэтаиоламипа (рП 8,0), раствореипоГ в атмосфере азота ири 30°С, и 0,05 -мл 1,2-Э110ксибутена-3 ,4 выдерживают в течеиие 30 мии. Затем охлаждают до 0°С, смешивают с 3 г акриламида и 0,125 г .N-мeтилeибиcaкpиламида , раствореииы л- в 18 .мл бидистилли)ованпой ВОДВ1. ДалвиеГииую обработку ведут ио примеру 1. Активность элюата 37% «т исрвоначальиой активности исходного фермента. Активность лиофилизата 540 ед./г.

Пример 8. Исходные вещества: глюкозаоксидаза , 220 ед./мг, эноксииронилоиый елож8

ный эфир акриловой кислоты, акриламид, Х ,М-метилеибисакриламид, 3-диметиламиионроииоиитрил , иерекисиый сульфат аммони .

100 .мг глюкозаокеидазы, растворенной в атмосфере азота ири 30°С в 2 мл 0,5 М буфериого раствора триэтаиоламина (рП 8,0), и 0,25 мл 2,3-эноксинронилового сложного эфира акриловой кислопз выдерживают 30 мии. Затем раствор иеревод т в диализную камеру диализна  трубка (Калле-целлофан) и дважды иодвергают диализу в 1000 мл 0,05М буферио1ч-) раетвора трнэтаиоламина, рН 8,0. Предзарительио иикубироваинви раствор ферл;ента (объе.м 10 мл) охлаждают до , объем дополн ют до 20 лгл бидистиллироваииой водой, сл еи1ивают е 3 г акриламида и 0,15 г ,К-метилснбисакриламида. Далее процесс ведут ио примеру 1.

Активность элюата 5% от первоначальной aKiTiiiHOCTH 1:еиользоваииого фермента. АктивHocii ) лиофилизата 305 ед./г.

Ире ;1, е т :i.-; о б р е т е н и  

Liiocoo Ч)лучеии  ев загщых носителем протеинов иутел 1 заимоде| 1етви  нротет-гов с сое ,ini-ienne: i. содержанлим эпоксидную грунпу и способную к сополимеризаини двойиую св зь, о т л и ч а К) щ н 11 е   тем, что, с целью иолучеии  бпологическп активиых иродуктов, в качестве 1)о1еиног) исиользуют биологичееки активные п|к)теппы и процесс осуществл ют в водной среде, а нолучеииый иродукт иодвергают с;пнвап по нутс.м взаимоде11етви  с акриламндом н.ли дпфуикциональным спп-гваюшим агеп iOAi.