SU552907A3 - Способ получени антибиотиков - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

Микроорганизм, используемый дл  получени  антибиотика согласно данному изобретению , выделен из образца ночвы в Егинте. Дл  выращивани  иримен ли картофельноморковный агар-агар и установили, что он принадлежит к классу актиномицетов, дающих спорангий, подобный спорангию вида Actinoplanes. Поэтому дл  роста его примен ли различные среды, иснользующиес  при выращивании этих видов. Суспензии культуры готовили путем дроблени  кусков культуры , сн той с пластинок с агар-агаром, и вели выращивание в небольщих пробирках с добавлением стерильной дистиллированной воды и доведением объема культуры до 5 мл.

Затем эти суснензии выращивали в пробирках , .на пластинках или в чащках Петри на различных средах. Температура инкубации составл ла 28°С. Результаты оценивались через 14-22 дней. Эта нова  культура (Пфизер F.D. 24090) была доставлена в Американскую Коллекцию типов культур в Роквилле, Мэриленд , И марта 1974 г. и получила название Actinoplanes auranticolor АТСС 31011.

Использовали следующие среды дл  идентификации культуры:

1)2%-ный агар-агар иа водопроводной воде;

2)«артофельно-морковный агар-агар по

М. П. Лещевалье (1968 г.);

3)сахарозный агар-агар Чапека по Уоксмен (1961 г.);

4)глюкозно-аспарагиновый агар-агар по Уоксмен (1961 г.);

5)агар-агар с экстрактом и солодом;

6)агар-агар Хики и Треснера;

7)картофельно-глюкозный агар-агар;

8)крахмальный агар-агар;

9)л елатина;

10)тирозиновый агар-агар;

11)л елезо-пептоновый агар-агар Дифко;

12)сн тое молоко Дифко;

13)декстрозно-нитратный бульон;

14)бульон на основе органического соединени  и нитрата;

15)среда АТСС 172, американский Каталог типов культур;

16)с применением углерода.

Признаки, характеризующие данную культуру .

Рост на среде, содержащей агар-агар на водопроводной воде, слабый, колонии тонкие, плоские, примерно 9D2 (очень слабо-розовые ) ; воздущный мицелий отсутствует, субстрат мицели  от бесцветного до 9D2, растворимый пигмент отсутствует.

Сахарозный агар-агар Чапека. Рост от умеренного до хорощего, колонии плоские, примерно 9G6 (светло-оранжевые); воздушный мицелий отсутствует; субстрат мицели  около 9G6; растворимый пигмент отсутствует.

Глюкозно-аспарагиновый агар-агар. Рост умеренный, колонии возвыщающиес , шероховатые , примерно 9G9 (светло-оранжевые);

воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмент отсутствует.

Агар-агар с экстрактом и солодом . Рост не наблюдаетс .

Агар-агар Хики и Треснера. Рост от умеренного до хорошего, колонии слегка возвыщающиес  и шероховатые, примерно 9F9 (мутно-оранжевые), слабый беловатый налет на поверхности, субстрат мицели  примерно 918, бледно-коричневый растворимый пигмент.

Картофельно-глюкозный агар-агар. Рост умеренный, колонии возвышающиес , щероховатые , примерно 9L9 (светло-оранжевые), воздушный .мицелий отсутствует, субстрат мицели  примерно 9L9, -растворимый пигмент отсутствует.

Тирозиновый агар-агар. Рост от слабого до умеренного, колонии плоские, примерно 13А10 (мутный красновато-оранжевый цвет) воздушный мицелий отсутствует, субстрат мицели  примерно 10D11, коричневый растворимый пигмент.

Желатина. Рост умеренный, колонии плоские , примерно 9К12 (красновато-оранжевые); следы беловатого налета, субстрат мицели  примерно 9К12, растворимый пигмент отсутствует .

Крахмальный агар-агар. Рост от умеренного до хорошего, колонии возвышающиес , примерно 9К10 (оранжевые), слабый беловатый налет, субстрат мицели  примерно 9К10, светло-желтый растворимый пигмент.

Крахмал подвергаетс  слабому гидролизу, степень ожижени  желатины высока , нитраты не восстанавливаютс  до нитритов в любой среде, содержащей нитраты, даже за 22 дн  (рост очень слабый в декстрозно-нитратном бульоне, но хороший в бульоне, содержащем органические вещества и нитрат).

Образование сероводорода незначительное. В железо-пептоновом агар-агаре образование растворимого пигмента не наблюдаетс . В молоке не наблюдаетс  каогул ции или гидролиза даже по истечении 22 дней. Тирозин не дегидрируетс .

Рост в среде АТСС 172 наблюдаетс  при температуре от 21 до 37°С, наилучший рост при температуре от 28 до 37°С, при температуре 45°С роста не наблюдаетс .

Арабиноза, фруктоза, маннит, раффиноза, рамноза, сахароза и ксилоза потребл ютс , инозит не потребл етс . Ни на какой из сред не наблюдаетс запаха.

Спорангий образовываетс  лишь на картофельно-морковиом агар-агаре. При этом образовываетс  палисадный слой, 5,5;-11X4,5- 8 мкм по ширине и 9-12 мкм по высоте. Колонии многочисленны, неправильные по форме и выбрасывают споры при постепенном разм гчении. Спорангий на картофельно-морковном агар-агаре по прошествии трех недель инкубации выдел ет споры за несколько часов при температуре около 2ГС, если куски колоний погружают в небольшое количество раствора: 1 г глюкозы и 1 мл «Твина 80 в 1 л воды. Споры образовывают цепочки неправильной формы в снорангии, но будучи освобожденными от споранги , станов тс  -субглобозными и имеют ширину от 1,6 мкм доэллиптической формы 1,6-2,2X1,1 - 1,6 мкм. Почти все они подвижны. Культивирование А. auranticolor АТСС 31011 предпочтительно происходит -в водной питательной среде при 26-36°С в погруженном аэробном состо нии при перемешивании. К числу питательных сред, пригодных дл  его выращивани  относ тс  те, которые включают источник усво емого углерода, такие как сахара, крахмал и мела-сса; И€точники органически св занного азота, такие, как казеин , продукт энзиматического расщенлени  казеина, соева  мука, мука из сем н хлопчатника , мука из арахиса и глютен пшеницы. Источниками роста могут также  вл тьс  отходы винокуренных заводов, рыбна  мука и экстракт дрожжей, а также соли, такие, как хлористый натрий и карбонат кальци , и микроэлементы , например, железо, магний, цинк, кобальт и марганец. При чрезмерном пенообразовании во врем  культивировани  можно вводить в питательную среду антивспениватель , например растительные масла или силиконы. Аэраци  среды в резервуарах при выращивании культуры глубинным способом проводитс  предпочтительно со скоростью около 1,2-2,0 объема свободного воздуха на 1 объем бульона в минуту. Скорость перемешивани  поддерживаетс  при помощи мещалок, обычно употребл емых в бродильной промышленности . Агент ннокулировани  дл  приготовлени  антибиотиков может быть получен путем использовани  культуры с пластинки на среде, например, АТСС 172, упоминавшейс  выше. Эта культура может быть использована дл  инокулировани  либо содержимого колб, наход щихс  на встр хивателе, либо содержимого в резервуарах дл  инокулировани , или в резервуары могут быть внесены зародыши из колб, подвергавшихс  встр хиванию. В колбах на встр хивателе рост культуры обычно достигает своего максимума нримерно через 4 дн , в то врем  как при инокулировании в резервуарах наиболее благопри тен период от 2 до 3 дней. Значительна  антибиотическа  активность достигаетс  на конечной стадии ферментации примерно за 20-30 час. Снособ производства антибиотиков во врем  процесса ферментации обычно контролируетс  биологической проверкой бульона с применением чувствительного штамма Staphylococcus aureus. При этом используетс  стандартный метод испытаний на пластинке, при котором зона ингибировани , окружающа  кружок фильтровальной бумаги, насыщенной бульоном, принимаетс  за меру антибиотической активности. После того, как антибиотическа  активность сбраживаемого бульона достигла желательного уровн , продукты выдел ют либо из всего бульона, либо из профильтрованного бульона. В последнем случае мицелий удал ют фильтрованием или центрифугированием . Можно использовать также метод тонкослойной хроматографии на силикагеле . Этот метод служит дл  анализа смеси антибиотиков, полученных в ферментационной среде, и дает возможность установить состав сырых и очищенных материалов, выделенных экстракцией из сбраживавшихс  бульонов. Разделение компонентов смеси антибиотиков зависит от содержани  антибиотиков в системе. Слишком мала  бактерицидна  активность не дает возможности обнаружить те компоненты антибиотика, которые присзтствуют в малых количествах; слишком высока  бактерицидна  активность приводит к эффекту сопротивлени  с вытекающим из этого неудовлетворительным разделением. Система про вителей при тонкослойной хроматографии представл ет собой смесь хлороформа с этанолом (9:1). Тонкослойные хроматограммы после про влени  могут просматриватьс  в ультрафиолетовом свете при длнпе волны 254 ммк и 366 ммк. Биоавтографическое обнаружение бактерицидных компонентов быть осуществлено путем наложени  тонкослойной хроматограммы на агарагар с пнтательнымп веществами, в который внесены зародыши чувствительного штамма SZ. aureus или другого чувствительного организма . К числу главных компонентов смеси антнбиотиков , выдел емой А. auranticolor АТСС 31011, относитс  р д макроциклических лактонов и депсипептидных антибиотических компонентов . По вление или непо вление или процентный состав смеси этих антибиотиков мен етс  от ферментации к ферментации и  вл етс  функцией воемени, величины рН, состава среды и т. д. При соблюдении словий, приведенных в помещаемых ниже примерах, главными бактерицидными компонентами смеси антибиотиков  вл ют   соединени  № 37 277 (депсипептнд) и № 39 926 (макроциклический лактон), в то врем  как к числу антибиотических компонентов, присутствующих в незначительном количестве, относ тс  соединени  № 37 932 (депсипептид) и № 35 763 (макроциклический лактон). Компоненты смеси антибиотиков могут быть разделены и выделены из ферментационного бульона при применении самых различных способов, включающих экстракцию растворителем , противоточное распределение по Крэгу, колоночную хроматографию или комбинацию этих способов. При экстракции антибиотиков из бульона молшо использовать различные органические растворители, такие как хлороформэтплацетат и метилизобутилкетон. Экстракцию растворителем предпочтительно провод т путем двукратной экстракции бульона при величине рН 7 при помощи объема растворител  равного 1/3-1/2 объема бульона , из которого желательно выделить смесь антибиотиков. Наиболее рекомендуемый метод выделени  и рекуперации компонентов смеси антибиотиков заключаетс  в следующем. В неосветленном или осветленном бульоне довод т рН до величины около 7 и экстрагируют его двум  порци ми метилизобутилкетона, объем которых составл ет примерно 1/3 до 1/2 объема экстрагируемого бульона. Экстракт в растворителе концентрируют в вакууме, и концентрат обезжиривают путем экстракции его гептаном или петролейным эфиром. После этого обезжиренный экстракт в растворителе вьпаоивают досуха в вакууме. Твердые вещества подвергают противоточному распределению по Крэгу (6 таоелок) с использованием толуола (5 частей), этанола (2 части) водного (Ьосфатного буферного раствора с рН 4,5 (3 части). Разделившиес  слои образуют верхнюю и .нижнюю фазы системы поотивоточного распределени . После распределени  слои а-нализируют методом тонкослойной хроматографии. Разделенные фракции выпаривают досуха в вакууме. Твердые вещества, содержащие  епсипептиды , раствор ют в хлороформе, обрабатывают активированным древе.--гым Углем, фильтруют и выпаривают в вакууме. Остаток, полученный после выпаривани  хлороформа, раствор ют в ацетоне. Твердые вещества, осадившиес  при прибавлении гептана, раствор ют в небольшом количестве хлороформа и внос т в колонку силикагел , забуференного по рНб. изготовленную в присутствии хлороЛоРма и н.-пропанола в соотношении 99:1. Koлoнкv про вл ют той же системой растворителей под давлением 5600 Н/м. Отдельные участки колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии. Фракции, содержащие разделенные депсипептиды, объедин ют, выпаривают в вакууме, и содержимое их кристаллизуют из апетона-гептана.. Фракции, полученные противоточным м тодом , содержащие макроциклические лактоны, объедин ют, выпаривают в вакууме, и тв пдые вещества раствор ют в этилапетате. Раствор перемешивают с силикагелем. ФИЛЬТРУЮТ , и растворитель удал ют в вакууме. Огтаток раствор ют в этилацетате и производ т осаждение гексаном. Тверлые вещества -паствор ют в небольшом количестве хлорогЬоРм  и хроматографируют под давлением 5600H/ i на колонке силикагел , забуференной до рН 6,0 и изготовленной в присутствии этиланетата . Дл  про влени  пользуютс  системой из этилацетата, тетрагидрофурана и гексана в соотношении 80:20:20. Участки колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии . Фракции, содержащие разделенные макроциклические лактоны, объедин ют и выпаривают в вакууме. Отдельные фракции обрабатывают дополнитгтьпым противоточным распределением по Крэгу и/или колоночной роматографией с использованием различных истем про вителей. Тщательное -контролиро.ание каждой стадии очистки дает возможость выделить индивидуальные макроциклические лакгонь в достаточно чистом состо нии , так что фракции в растворителе могут быть выпарены досуха с получением чистых компонентов. А. auranticolor АТСС 31011 образует по меньшей мере четы-ре депсипептида (из них главное соединение № 37277 и побочное - 37 932) и четыре макроциклических лактона . (соединение № 36 926 - главное, № 35763 - побочное). Однако первичными компонентами  вл ютс  депсипептиды. Сырые смеси антибиотиков, получаемые непосредственно из бульона, и очищенные индивидуальные компоненты обладают широким спектром антибактериальных свойств. К числу организмов, не сиособных к размножению в присутствии антибиотиков, относ тс : Salmonella typhasa, Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Klebsiella рпецтоп ае, Staphylococcus ai.ireus. Streptococcus pyogenes. Streptococcus faecalis, Diplocoocus pneimoniae. Bacillus subtiiis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium septicum, Brucella abortus, Neisseria sioca, Lactobacillus acidophilus,. Pasteurella multocida. Антибиотики, охватываемые насто щим изобретением , как в форме сырой смеси, так и в форме очищенных индивидуальных компонентов или их смесей могут примен тьс  при лечении различных инфекционных заболеваний у людей и у животных. Как правило, эти антибиотики ввод т орально ежедневными дозами в 0,5-1,0 г или парэтерально дозами в 100--500 мг в зависимости от типа и серьезности инфекционного заболевани  и особенностей больного. Они могут вводитьс  в отдельности или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, и дл  лечени  можно исиользовать как одинарные, так и многократные дозы. Дл  орального введени  можно примен ть таблетки, содержащие различные добавки (цитрат натри , карбонат кальци  и дикальиийфосфат ), а также различные агенты дезинтеграции , такие как крахмал, альгинова  кислота и некоторые комплексные силикаты, чуесте со св зующими, такими как поливинилпирролидон , сахароза, желатина и аравийска  камедь. Кроме того, можно вводить смазочные вещества, такие как стеарат магни , луарилсульфат натри  и тальк, которые часто создают преимущества при таблетировании . Твердые вещества сходного типа могут также примен тьс  в качестве наполнителей в м гких и твердых желатиновых капсулах. К числу реком ендуе.мых материалов относ тс  лактозы, а такЖб полиэтиленгликоли высокого молекул рного веса. При применении суспензий и/или эликсиров важным ингредиентом могут

 витьс  агенты подслащивани  или вкусовые веще-ства вместе -с такими разбавител ми, как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и различные комбинации этих веществ.

Растворы антибиотиков в сезамовом или в арахисовом масле или в водном пропиленгликоле могут примен тьс  при парэнтеральном введении.

Индивидуальные антибиотики про вл ют бактерицидную активность, котора  в основном  вл етс  бактериостатической. Однако сырые смеси антибиотиков или смеси очищенных депсипептидов и очищенных макроциклических лактонов про вл ют синергическую активность,  вл ющуюс  по существу бактерицидной .

При индивидуальных испытани х главного макроциклического лактона - соединение № 36 926 (А) - и главного депсипептида - соединение № 37 277 (В) - или их комбинаций (путем разбавлени  в пробирках) против различных организмов были вы влены минимальные ингибирующие концентрации. Результаты даны в табл. .

Таблица 1

Сходные результаты были получены при индивидуальных испытани х побочного макроцик -ическоголактона - соединение

№ 35 763 (А ) и побочного депсипептида - соединени  jNb 37 932 (В ), а также при испытании различных комбинаций: А-А, ВВ, (А+В), (А+В), (А+В), (А+В).

Максимальна  синергическа  активность у комбинаций очищенных макроциклических лактонов и депсппептидов была достигнута при соотношении около 1-2: 1. Примерно такие же соотношени  иаблюдаютс  дл  ферментационных бульонов А. auranticolor АТСС 31011 и дл  выделенных из них сырых смесей антибиотиков.

Это  вление противоположно наблюдаемому дл  других синергических смесей антибиотиков , дл  которых синергетические факторы наблюдаютс  у ферментационных бульонов и сырых смесей при бус-оптимальных соотношени х .

Данные, полученные in vivo, при оральном и субкутанном введении при проведении опытов на мышах, инифицированцых штаммом Staphylococcus aiireus 01А005, представлены в табл. 2.

Антибиотики, охватываемые насто щим изобретением, могут примен тьс  в качестве агентов стимулировани  роста домашней птицы и животных из-за глгрокого бактерицидного спектра и при лечении дизентерии у свиТаблица 2

ней благодар  значительной активности против анаэробной спирохеты, вызывающей это заболевание. Промотирующа  рост активность сырой

смеси антибиотиков определ етс  на молодых порос тах в течение 40 дней. Средний привес в день, потребление корма и эффективность оказались значительно улучщенными у животных , получавших антибиотики, по сравпению с контрольными животными (,01). Результаты приведены в табл. 3. Сходные результаты получены и дл  других -смесей антибиотиков, примен емых в количестве 10-100 частей на 10 частей корма.

Аналогичные результаты получены также при использовании .индивидуальных чистых соединений №№ 36 926, 37 932 и 37 277 или смесей чистых соединений. Таблица 3 Эффективность применени  антибиотиков дл  стимулировани  роста была продемонстрирована при проведении опытов на цыпл тах , в корм которым вводили антибиотики. У них отмечаетс  значительное улучигение привеса но сравнению С контрольными цыпл тами (,01). Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 Такие же результаты получены при применении других сырых смесей антибиотиков, составы которых приведены ниже, или использовании индивидуальных чистых соединений №№ 36 926, 37 932 и 37 277 или смесей чистых соединений. Профилактическую эффективность антибиотиков , охватываемых насто щим изобретением , определ ют на свинь х, экспериментально инфицированных дизентерией. Корм, содержащий антибиотики, ввод т в течение 28 дней. Полученные результаты представлены в табл. 5. Таблица 5 Аналогичные результаты получены при введении (10-100 частей на 10 корма) чистых индивидуальных соединений №№ 36 926, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 37 932 И 37 277 или смесей чистых соединеПример I. Готов т стерильную водную среду состава (г/л): Глюкоза10 Растворимый крахмал20 Экстракт дрожжей5 Продукт энзиматического дегидрировани  казеина5 Карбонат кальци 1 Величина рН7 Клетки с пластинки с А. auranticolor АТСС 31011, выращенные на среде АТСС 172, перенос т в несколько 300-ми.ллилитровь1х конических колб Эрленмейера. в каждой из которых находитс  50 мл этой среды и которые встр хивают на вращающемс  сепараторе в течение 3-4 дней при 28-30°С. Аликвотные пориии по 5 мл выращенного инокул та перенос т в 300-миллилитровые конические колбы Эоленмейера, кажда  из которых содержит 100 мл описанной выше стерильной среды. После встр хивани  в течение 3-4 дней при 28-30°С 5-10% выращенного инокУл та перенос т в четырехлитровый бродильный чан, солеожащий 2 л стерильной среды состава (г/л): Экстракт дрожжей2,000 Глюкоза10,000 Жидкость после замачивани  кукурузы1 (мл) Продукт энзиматического дегидрировани  казеина5,000 Хлорид двухвалентного кобальта0,002 Величина рН7,0 Ферментацию провод т 20-30 час при 28- 30°С, пои перемещивании со скоростью 1700 об/мин и аэрации - 1 объем воздуха на 1 объем бульона в 1 мин. В случае необходимости величину рН всего бульона устанавливают на уровне 7 и дважды экстрагируют метилизобутилкетоном (1/3-1/2 от объема бульона). Экстракт в растворителе конпентрипуют в вакууме и обезжиривают экстракцией петролейным эфиром. Активность бульона, экстракт в растворителе и последующие фракции контролируют методом тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием системы про вителей, состо щей из хлороформа-этанола (9:1), и провод т наблюдени  в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 254 ммк и 336 ммк. Обезжиренный концентрат в растворителе высущивают досуха в вакууме. Твердые вещества подвергают противоточному распределению по Крэгу на шести тарелках с использованием толуола (5 частей), этанола (2 частей ), водного фосфатного буферного раствора (рН 4,5; 3 части). После распределени  слои контролируют методом тонкослойной хром.атографии . Депсипептид (соединение № 37 277) концентрируют в верхнем слое, в основном на нулевой тарелке. Второй депсипептид (соединение № 37 932) выдел ют из верхних тарелок - 1-ой, 2-ой и 3-ей. Макроциклический лактон (соединение № 35 763)  аходигс  в основном в нижних сло х тарелок 0-ой и 1-ой. Соединение № 36 926 концентрируют в нижних фазах тарелок 2-ой, 3-ей, 4-ой и 5-ой. Верхнюю фазу нулевой тарелки, содержащую соединение № 37 277, высушивают досуха в вакууме, раствор ют в хлороформе и перемешивают мин с активированным углем . Раствор фильтруют и высушивают в вакууме . Остаток раствор ют в ацетоне, твердые веш,ества осаждают, прибавл   гептан. Осадившиес  твердые вещества раствор ют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют на колонке силикагел , забуференного до рН 6,0, изготовленной в црисутствии смеси хлороформа с н.-цропанолом (99 : 1). Колонку про вл ют той же системой под давлением 5600 Н/м. Фракции из колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии . Фракции, содержащие выделенное соединение № 37 277, объедин ют, выпаривают В вакууме, и соединение кристаллизуют из ацетона-гептана. Соединение № 37 277 не имеет отчетливой точки плавлени . Разложение начинаетс  при 140-150°С. Соединение нерастворимо в диэтиловом эфире, гексане, гептане и воде. Оно слегка растворимо в ацетоне и бензоле и легко растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене. Анализ соединени  № 37 277 дает следующие примерные результаты (%): С 60,91; Н 5,98; N 10,45; О (по разности) 22,66. Соединение № 37 277 оптически активно и имеет угол вращени  + 11° (,0 этанол). Максимумы поглощени  в ультрафиолетовой области наход тс  при длинах волн (ммк): 225, 274, 282, 303 и 355; е},, 309,3; 36,67; 45,01 и 20. Хлороформный раствор показывает характерное поглощение в инфракрасной области при следующих длинах волн (мкм): 3,05; 3,40; 5,70; 5,77; 6,07; 6,62; 6,82 и 7,67. Фракции, полученные при противоточном распределении и содержащие соединени  №№ 35 763 и 36 926, выпаривают в -вакууме, остатки раствор ют в этилацетате, раствор перемешивают с силикагелем. Профильтрованный раствор выпаривают в вакууме, остаток раствор ют в этилацетате, твердые вещества осаждают, прибавл   гексан. Осадившиес  твердые вещества раствор ют в небольпюм количестве хлороформа и хроматографируют в колонке силикагел , забуференного до рН 6,0, изготовленной в присутствии этилацетата. Колонку про вл ют смесью этилацетата, тетрагидрофурана и гексана (80:20:20), насыщенной водным фосфатным буферным раствором с рН 6,0, под давлением 5600 Н/м2. Первые 17 из полученных фракций (кажда  объемом 20 мл) содержат желтое масло, которое отбрасывают. Фракции 26-40 имеют высокое содержание соединени  № 36 926. Фракции 41-50 представл ют собой главным образом смеси соединений - 36 962 и 35 763. Фракции 26-40 объедин ют, концентрируют в вакууме и вновь хроматограф фуют на силикагеле с отбором фракций по 20 мл. Первые 15 фракций содержат желтое масло, которое отбрасывают. Фракции 16-30 представл ют собой, в основном, соединение № 36 926. Фракции 31-40 содержат смесь соединений № 36 962 и № 35 763. Фракции 16-30 выпаривают в вакууме, остаток раствор ют в небольшом количестве хлороформа и внос т в колонку силикагел , забуференного до рН 6,0, изготовленной в присутствии хлороформа. Колонку про вл ют смесью хлороформа с этанолом (95,5-4,5 об. %) под давлением 9100 Н/м и собирают 160 фракций по 6 мл. Фракции 60-90 содержат только соединение № 36 926. Эти фракции объедин ют и выпаривают в вакууме. Остаток раствор ют в минимальном количестве этанола и осаждают диэтиловым эфиром дл  получени  чистого аморфного соединени  № 36 926. Соединение № 36 926 растворимо в метаноле , этаноле, хлороформе и хлористом метилене , нерастворимо в диэтиловом эфире, гексане и гептане. Оно не имеет отчетливой температуры плавлени , разложение начинаетс  при температуре 100°С. При анализе установлены следуюшие средние соотношени  (%): С 57,89; Н 6,78; N 8,04; О (по разности) 27,29. Молекул рный вес, определенный по массовому спектру с высоким разрешением, равен 501, молекул рна  формула С2бПз5ЙзО7. Соединение № 36 926 обладает оптической активностью с углом вращени  а о - 130°С (,0, этанол). Максимум поглощени  в ультрафиолетовой области спектра в растворе этанола находитс  при длине волны 214 ммк; 723,8. Таблетка с бромистым калием показывает характерные максимумы поглощени  в инфракрасной области при следующих длинах волн ( мкм): 2,95; 3,40; 5,75; 5,98; 6,23; 6,58; 6,87; 7,45; 8,25; 8,38; 8,80; 9,08; 10,15; 10,35; 11,10 и 13,30. Соединение № 35 763 выдел ют и очищают таким же образом, как и соединение № 36926. Чистое соединение растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене, не растворимо в диэтиловом эфире, гексане и гептане. Оно не имеет отчетливой температуры плавлени , разложение начинаетс  при температуре 100°С. Анализ дает следующие средние соотношени  (%): С 61,29; Н 6,73; N 8,83; О (по разности) 23,15. Молекул рный вес, определенный по массовому спектру с высоким разрешением, состав