SU611596A3 - Способ получени фермента -1,6 глюкозидазы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА а-1,6-ГЛЮКОЗИДАЗЫ

Изобретение относитс  к вопросам биохимии, а именно к способам получени  а-1,6-глюкозидазы и |3-амилазы одновременно. Известен способ получени  а-1,6-глюкозидазы путем культивировани  микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus на питательной среде, в которой в качестве источников углерода и азота используют продукты неполного гидролиза крахмала или мальтозы и гидролизат железа или смесь их с солью аммони  11. При этом поддерживают температуру среды на уровне 30° С и рН 7,0-7,3. Известен также способ получени  |3-амилазы с помощью шкроорганизмов, относ щихс  к разновидности Bacillus, например Bacillus poiymyха . Bacillus megaterium. Таким образом, известные способы получени  ,6-глюкозидазы и -амилазы независимые, преду сматривающие использование не одной и той же культуры, а различных. Как известно, cs-1,6-глюкозидазу и Д-амилазу используют при производстве мальтозы из крахмала , которое ведут двум  стади ми: на первой стадии обеспечивают воздействие на крахмал первого фермента, а на второй - второго. Таким образом, дл  получени  указанные знзимов культивируют соответствующие микроорганизмы по отдельности, а при осуществлении процесса получени  мальтозы создают различные услови  дл  осуществлени  последовательно двух производственных стадий. Все эти недостатки усложн ют процесс. Целью изобретени   вл етс  разработка способа , обеспечивающего получение одновременно с ферментом а-1,6-глюкозидаза фермента )3-амилаза. Дл  достижени  указанной цели из рода Bacillus дл  культивировани  на питательной среце, содержащей источники, углерода, азота и минеральные соли, при работе по прецлагаймому способу используют щтаммы Bacillus cereuc var. mycosi des (PERM N 2391) илиBad I us sp. УТ 1002 (FERM №2837) или Bacillus sp. УТ 1003 (PERM № 2838). Baci 11 us cereus была представлена Fermentation Research institute of Cluba-shi, JlSpan согласно . FERM № 2391 20 декабр  1973 г. Bacillus sp. УТ 1002 и Bacillus sp. УТ 1003 были представлены этим же институтом 12 декабр  1974 г согласно FERM N 2837 и FERM N 2838. Ниже представлена характеристика этих микроорганизмов . Bacillus cereus липоидна  ра1зновидность (FERM № 2391), Палочка размером (1,1-1,4) х X (4,2-7,0) мкм, обычно наход щемс  в длинной или короткой цепи подобно :алесени или Actinomyces . Неподвижна , грам-положительна , сп ранпш без ощутимого разрастани . Штательный бульон. Хороший рост, осадо Питательный косой агар. Обильное прораста филаментный, распределен по поверхности, кре вато-белый. Гдюкозо-асп агиновый агар. Нет хорошего роста. Филаментный. Глюкозо-нитратный агар. Нет роста, а если есть - очень незначительный. Тиразиновый косой агар. Хороший рост, филаментный, слегка коричневый. Использование цитрата. Положительное. Молоко. Пептонизаци . Картофель. Хороший рост, желтовато-белы слегка коричневый. Желатин. Разжижает. Получение аммиака. Положительное. Получение ацетилметшткарбшюла. Положи тельное. Восстановление нитрата до нитрита. Отриц тельное. Катапаза. Положительна . Получение индола. Отрицательное. Гидролиз крахмала. Положительный. Бульон с NaCI. В бульоне с 4% NaCI не р виваетс . Bacillus sp. УТ 1002 (PERM № 2837). Палочка размером (1-12) х (5-6) мкм, н ; подвижна , грам-положительна , встречающа с  в виде короткой или длишГой цепи. Питательный бульон. Осадок. Питательный косой агар. Незначительный рост. Молоко. Медленна  пепгонизаци . Картофель. Хороший рост, распредел етс  по поверхности, желтовато-белый. йСслатин. Разжижение. Получение аммиака. Положительное. Восстановление нитрата в нитрит. Положи ное. Каталаза. Положительное. Ацетилметилкарбонил. Производитс . Цитратнатри . Незначительный рост. Органический источник азота. Необходим роста. Карбогидрат. Из глюкозы, фруктозы, гала тозы, маннозы, лактозы, сорбита, глицерина, тр галозы, крахмала и гликогена образуетс  кисл а не газ. Температура роста. Произрастает при темп туре не выше 50° С, оптимальна  температура 3 35С. Эта культура вьщелена из почвьь Bacillus sp. УТ 1003 (PERM N 2838). Палочка размером (1-1,6) х (2-7) мкц, подвижна , грам-положительна , встречаетс  в де короткой или длинной цепи. Питательный бульон. Хороший рост, обра Питательный косой агар. Хороший рост, распредел етс  по поверхности, желтовато-бе ый. Глюкоза-аспарагиновый агар. Незначительный рост. Молоко. Пептонизаци  без коагул ции. Желатин. Медленное разжижение. Получение аммиака. Положительное. Ацетилметилкарбинол. Производитс . Цитрат. Используетс  как источник углерода. Карбогидрат. Глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, а-арабиноза, D-ксилоза, лактоза, сукроза , мальтоза, трегалоза, раффиноза, маннит, сорбит , глицерин, инсулин используютс  без образовани  газа. Температура роста. Максимальна  45° С, оптимальна  30-33° С. Культура вьщелена из почвы. Предлагаемый способ заключаетс  в следующем . Одну из указанных культур культивируют в среде,включающей источники углерода к азота. В качестве первых используют мальтозу, крахмал, гидролизаты последнего (декстрин), в качестве вторых - пептон, казеин, экстракты м са, дрожжей , воду после замачивани  зерна, сено, соевый жмых. Источьшки азота при необходимости пополн ют неорганическими сол ми - фосфатом, солью магни , солью бари  и солью кальци . В случае использовани  воды после замачивани  зерна из нее предварительно удал ют вещество , ингибирующее образование /З-амилазы. Дл  увеличени  выхода а-1,6-глюкозидазы и |3-амилазы добавл ют в среду соли марганца или различные его соединени , например сульфат марганца . В первом случае соли марганца добавл ют в среду в количестве пор дка 1x10 -1х10 мол , во втором случае соединение марганца добавл ет в среду в количестве пор дка 1x10 мол . В среду добавл ют цитрат и/или тартрат в количествах пор дка 0,01-1%. При использовании цитрата или тартрата натри  их внос т в среду в количестве 0,1%. В среду добавл ют также (дл  увеличени  выхода ферментов рапсовое сем , рапсовый жмых, экстракт. Культивируют бактерии в услови х аэрации при 20-40° С в течение 24-72 час. При культивировании рН среды мен етс  от 5,5 до 9,5, оптимальное значение 6-8. Полученные энзимы имеют  чеистую структуру . Их регенерируют фильтрацией культуральной жидкости, затем фильтрат концентрируют путем добавлени  ацетона, этанола, метанола или изопропанола и образовани  осадка. Дл  осаждени  примен ют также сульфат аммони . Получают /3-амилазу и а-1,6-глюкозидазу в смеси в виде осадка , насыщенного сульфатом аммони . Дл  регенерации ферментом используют также такие адсорбенты, как крахмал, активировантов с помощью крахмала улучшаетс , если его предварительно нагреть до 40-65° С. Адсорбированную Э-амилазу элюируют раствором , содержащим 1-10% мапыоэы, или раствором , содержащим растворимый крахмал, декстрин мальтозу. Адсорбированные на активированном угле энзимы могут использоватьс  как св занные энзимы. Так, /3-амилаза адсорбируетс  в количестве 8000-12000 единиц, а а-1,6-глюкозидаза в количестве 500-1000 единиц на 1 г активированного уг л . Адсорбированные энзимы сохран ют свою активность на уровне 90-100% от ее первоначального значени . Ферменты хорошо адсорбируютс  и на диатомовых веществах, например перлите, и сохран ют в таком состо нии активность на высоком уровне (50-70% от первоначального значени ). Характеристики энзимов - /3-амилазы и а- 16-глюкозидазы, полученных описываемым спосо бом, приведены ниже. |3-Амилаза. Действие. Энзим производит мальтозу из крахмала, амилозы, амилопектина, гликогена, дек стрина и др. Специфичность в отнощешш воздействи  субстрат. Степень гидролиза мальтозы в амилозу ближе к 100% и крахмала в мальтозу к 60%. Энзим не гидролизует а-1,6-глюкозидазную св зь, ко тора  содержитс  в амилопектине, гликогене, декстрине и т.п. рН реакции составл ет 3-10, оптимальное значение около 7,0. Температура реакции до 65° С, оптимальна  около . Дезактиваци . Около 20% активности тер етс  через 10 мин пребывани  при 55°С. При 70°С через 10 мин наступает полна  дезактиваци . рН-Устойчивость. Энзим неустойчив в кислой среде при рН ниже 5,0. Стабилен в интервале рН 6-10,0. Ингибнрование. Ингибируетс  п-хлормеркурбензоатом и ,в некоторой степени монойодацетатом Активность после ингибировани  п- хлормеркурбензоатом восстанавливаетс  путем добавлени  цистеина... +4 Сильно Ингибируетс  ионами Си . Нд Ад, а также ионом Fe , Способ очистки. Энзим фракционируют путем осаждени  из культурального бульона в результате насыщени  30-50% сульфата аммони  с последующей высокоэффективной очисткой на хроматографической колонке с использованием Sephadex G-100. Измерение активности энзима. Энзимный раствор внос т в 2 мл 0,1 И раствора фосфзтного буфера (рн 7,0), содержащего 2,0% растворимо крахмала, и доливают дистиллированную воду до общего obbcivra 4 мл. Смесь инкубируют при лпОг .. ti. UpnftT 1 ЦЯС с начала реакции производит 1 мг мальтозы, обозначают как 1 единица. От 1,6- Глюкозидаза. Действие. Этот энзим гидролизует а-1,6-гл1окозидазную смесь амилопектина, который уже был в некоторой степени гидролизован Э-амилазой. Специфичность по субстрату. Энзим производит мальтотриазу путем гидролиза Ь(-1,6-глюкозиддзной св зи пуллулана. В случае реакции с амилопектшюм не наблюдаетс  усилени  йодной крас щей способности. Энзим про вл ет активность на амилопектине, предварительно гидролизованном в некоторой степени амилазой. Энзим не действует на изомальтозу. рН реакции в пределе 5-10, оптимальное значение около 6-6,5. Температура реакции около 50° С, оптимальна  около 50° С. Дезактиваци . Около 50% активности тер етс  после 10-минутной выдержки при 50° С. Полна  дезактиваци  наступает через 10 мин пребьшани  при 65°С. рН-Стабильность. Энзим устойчив при рН 6-9, нестабилен в кислой среде и относительно устойчив вщелочной. Ингибирование. Энзим в некоторой степени Ингибируетс  п-хпормеркурбензоатом и незначительно - монойодацетатом. Значительное isiHni6Hpyющее действие оказывают ионы Но и Ад, инги р- + бируетс  также ионом Fe Способ очистки. Энзим фракционируют из культуральной жидкости путем осаждени  60-70% сульфата аммони  с последующей очисткой на хроматографической колонке с использованием Sephadex G-100. Измерение энзимной активности. Активность измер ют по реакции, при которой в качестве субстрата используют пуллулан. Энзим производит из пуллулана мальтотриозу. Дн  этого некоторое количество энзима добавл ют к 0,5 мл 0,1 М раствора фосфата буфера (рН 7,0), содержащего 1% пуллулана. Смесь довод т до общего объема пор дка 0,1 мл дистиллированной водой. Затем ее инкубируют при 40° С в течение 60 мин. Количество энзима, которое производит 1 мг мальтотриозы, обозначают как 1 единица. Из препарата можно независимо выделить /3-амилазу и «-1,6-глюкозидазу. Дл  этого жидкость насьицают сульфатом аммони  до концентрации 30-50%. Происходит осаждение j3-амилазы. Затем насыщаю жидкость сульфатом аммони  до концентрации 60-70%. При этом осаждаетс  второй знзим. Полученные энзимы очищают на колонке , зар женной Sephadex. Пример Ь В эрленмейеровскую колбу емкостью 200 мл помещают 50 мл среды, содержащей 1% пептона, 0,3 КгНГОА, 0.1 MgSb47H2O и 1 мальтозы. Стерилизуют обычным способом, в среду внос т микоиды разновидности Bacillus nerpiis fFERM № 239П и культивируют при 30°С

в течение двух дней. После культивировани  из культурального бульона центрифугированием удал ют клетки. Затем всплывающий слой исследуют дл  определени  количества полученных энзимов . В результате было получено 628 единиц /J-амилазы и 18 единиц о-1,6-гликозидазы, счита  на 1 мл среды.

Культуральный бульон помещают в целлофановую трубку и диализируют по отношению к дистиллированной воде дл  того, чтобы удалить остаточный сахар.

Часть указанных диализированных знзимов (в которых содержалось 204 единицы j3-амилазы и 5,6 единиц а-1,6-глюкозкдазы) привод т во взаимодействие с картофельной амилазой, амилопектином картофельным крахмалом, гликогеном и декстрином , каждый из которых был вз т в концентрации 4% при рН 7 и 40° С (обадай реакционный объем составл л 4,3 мл).

Через посто нные промежутки времени отбирают пробы реакционного раствора, каждую из которых , берут в посто нном количестве, и в них определ ют количество редуцирующего сахара по методу Somogyi Nelson. Состав сахара в реакционной смеси определ ют с помощью метода хроматографии на бумаге (4 ч. пиридина, 6 ч. бутанола и 3 ч. воды). В результате установлено, что образовавшийс  сахар почти полностью представл ет собой мальтозу (90-96%), в том случае когда амилоза, амш1опектин, картофельный крахмал использовались в качестве субстрата и в конечном реакционном растворе наблюдали очень небольшое количеств сахара, имеющего Rf, соответствующий мальтотриозе (4-8%), В результате испытани  с помощью Hucostat (производимого Vorthington Biochemical Corporation U.S.A ) было установлено, что образование глюкозы происходит в чрезвычайно небольшом процентном количестве (менее 0,1%). Картофельна  амилаза, амилопектин, декстрин и картофельный крахмал, испытанные таким образом, практически нацело гидролизуютс  в мальтозу через 8 час реакции. Гликоген также гидролизуетс  не менее 4eiyi на 90% в мальтозу через 23 час реакции .

Пример 2. В среду, имеющую такой жесостав, что использовалс  в примере 1, инокулируют Baci 11 us; sp. УТ 1002 (PERM N 2837) и подвергают культивированию со встр хиванием при 30° С. Через 48 час культивировани  в культуральном бульоне определ ли количество образовавщихс  энзимов. Было получено 121 единица /3-амилазы и 10,5 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл бульона.

Пример 3. В среду того же, что и в примере .1, состава инокулируют Bacillus зр.УТЮО ( PERM N 2838) и подвергают культивированию со встр хиванием при 30° С. Через 48 час культивировани  в культуральном бульоне определили количество образовавшихс  энзимов. В результате получено 152 ч, /З-амилазы и 5,3 ч. а-1,6-глюкозидазы

J Пример 4. В колбу емкостью 1 л помещают 250 мл среды, содержащей (%) 1 полипептона , 0,3 К2НР04, ОД Мд8047НгЪ и 1 декстрина , и подвергают ее стерилизации по обычной методике. Затем среду инокулируют микоидами разновидности Bacillus cereus и провод т культивирование ее встр хиванием при 30° С. Через 48 час культивации культуральный бульон центрифугируют дл  удалени  клеток и полученный всплывший слой испытьшают на знзиматическую активность .

Было получено 420 единиц /S-амилазы и 7,8 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл бульона. В 200 мл (часть указанного культурального бульона ) внос т ю 75% сульфата аммони  и полученную в результате осажденную фракцию центрифугируют и раствор ют в небольшом количестве воды, а полученный в результате раствор испытывают на энзиматическую активность. В результате получено 83000 единиц /З-амилазы и 952 единицы а-1,6-глюкозидазы.

П р и м е р 5. Часть раствора энзима, полученного в примере 1 и состо щего из 10000 еданиц /3-амилазы и 275 едашиц а-1,6-глюкозидазы, привод т во взаимодействие с 1 г амилопектина при концентрации 1% в присутствии СаСЦ Реакци  протекает при 40° С, рН среды при этом поддерживают на уровне 7. Редуцирующий сахар в реакционной смеси определ ют по методике Somogyi Nelson. Получено 972 мг мальтозы. Количество полученной глюкозы составило 3,7 мг. Путем бумажной хроматографии обнаружено п тно мальтозы и п тно, соответствующее очень небольшому количеству мальтотриозы.

П р и м е |j 6. ПРИГОТОВЛЯЮТ среду, содержащую (%) 1 полипептона, 1 декстрина, 0,3 К2НРО4 и 0,1 MgS047H2O, а также среду, полученную в результате добавлени  к указанной среде различных количеств (1x10 -1x10 моли) сульфата марганца, как показано в табл. 1. Эти среды помещают (каждую объемом 50 мл) в эрленмейеровскую колбу объемом 200 мл и стерилизуют по обычной методике. После этого среды инокулируют микоидами равновидности Bacillus cereus и подвергают культивированию в услови х аэрации при 30 С в течение 42 час.

После культивировани  культуральный бупьс  центрифугируют и верхний слой подвергают испытанию на содержание образовавшихс  0-амилазы и а-1,6-глюкозидазы. Результаты представлены в табл. 1.

Как следует из табл. 1, добавление сульфата магни  повьццает количество полученной а-1,6-глн козидазы приблизительно в 3 раза.

Пример 7. В эрленмейеровские колбы емкостью 200 мл помеп т 50 мл среды, содержащей (%) 1 полипептона, 0,3 К2НГО4 и 0,1 MgS0 хТНаО, и стерилизуют. Затем среду инокулируют микоидами разновидности BacHlus cereus и подotnnn n/ Tn rvT7n itrUJ L« mtu

30° С. На 24-м часу культавировашш, когда количество -амилазы составило 237 единиц на 1 мл среды , в среду стерильно добавл ют сульфат марганца в количестве 1x10, счита  на количество среды, и цродолжают культивацию.

На 42-м часу культивирование прекращают. Культуральный бульон центрифугируют дл  удалени  из него клеток и полученный в результате всплывший слой испытывают на (З-амилазную и а-1 ,6-гл козидазную активности. Результаты зтого испытани  представлены в табл. 2.

Соль марганца, добавленна  в среду в середин культивировани , повышает количество полученной ,6-глюкозидазы приблизительно в 1,7 раза и благопри тствует образованию |3-амилазы. Когда культивирование осушествл ют в среде, содержащей марганцевую соль с самого начала, количество полученной а-1,6-глюкозидазы повышаетс  приблизительно в 2 раза по сравнению с количеством, которое может быть получено без добавлени  соли марганца, а количество полученной амилазы понижено , всего лишь 28,8 единиц на 1 мл.

Пример 8. Готов т среду, содержащую (%) 2 полипептона, 0,3 Кг НЮ,, 0,1 MgSO47HjO и CaCl2, а также среды, полученные в результате добавлени  к указанной среде цитрата натри  в количествах, соответствующих концентрации 0,5 и 1%, и среды, полученные в результате добавлени  тартрата натри  к указанной среде в количествах, отвечающих концентрации пор дка 0,25 и 0,5%. В эрленмейеровские колбы емкостью 200 мл помещают среды (в количестве 50 мл) и стерилизуют по обычной методике. В среды ннокулируют микоиды разновидности Bacillus cereus и подвергают их культивированию при 30° С в течение 42 час.

Затем культивируют, жидкость из каждой колбы центрифугируют и полученный в результате всплывший слой подвергают пробе на определение |3-амилазной и а-1,6-глюкозидазной активности Полученные в результате данные представлены в табл. 3.

В том случае, когда культивирование осуществл ют в среде, содержащей рапсовый жмых, количество полученной а-1,6-глюкозидазы приблизительно в 2,4 раза превышает то количество, которое получаетс  в среде, не содержащей рапсового жмыха.

Культуральный бульон, полученный в результате культивации в среде, содержащей рапсовый жмых, центрифугируют дл  удалени  клеток. 2 л полученного всплывшего сло  объедин ют с 4 л холодного этанола. Полученный осадок отдел ют фильтрацией, а затем сушат. В результате получен порошкообразный знзим, состо щий из 115800 единиц |3-амилазы и 4640 единиц а-1,б-глюкозидазы на 1 г, что указывает степень регенерации р-амилазы 75%, а степень регенерации а-1 6-глюкозидазы -Добавление солей органических кислот заметно повышает количества полученных -амилазы и а-1,6-глюкозидазы.

Пример 9. В два баночных феркюнтатора емкостью 10 л помещают среду, содержащую (%) 4 молочного казеина, 0,3 К2НЮ4 и 0,lMgSO4 7Н2О и 5-10 М CaClj, а также 0,5 растворимого крахмала, причем в каждый ферментатор загружают по 0,5 л. В один из двух ферментаторов добавл ют рапсовый жмых в количестве, соответствующем 4%, счита  на вес среды. Затем среды двух ферментаторов стерилизуют 30 мин при 12lC. После этого среды инокулируют микоидами разновидности Bacillus cereus (100 мл) и осуществл ют культивирование в услови х аэрации при 30° С при подаче воздуха с объемной скоростью пор дка 5 мин при перемешивании со скоростью пор дка 250 об/мин. Через 24 час культивации культуральный бульон центрифугируют и полученный в результате всплывший слой подвергают испытанию на энзиматическую активность. Полученные ре- . зультаты представлены в табл. 4.

Нагревают до 60° С 30 мин. К полученному раствору добавл ют 300 мл фильтрата культуры микоидов разновидности BaciHus cereus. Фильтрат имеет рН7, 1403 единицы /3-амилазы на 1 мл и 28,0 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл. Смесь перемешивают дл  адсорбировани  двух энзимов.

Затем смесь отфильтровывают дл  регенерации энзимов и испытьшают ца активность. Полученные результаты представлены в табл. 5.

Затем смесь крахмала и целита, на котором бьши адсорбированы оба энзима, добавили к 109feному водному раствору декстрина, содержащему 10% хлористого натри . Это делают, чтобы осуществить элюирование энзимов с адсорбентов. В результате /3-амилазу и а-1,6-глюкозидазу регенерировали с выходами 100 и 85% соответственно.

Пример 13. Фильтрат (каждый объемом 100 мл) культуры микоидов разновидности Bacillus cereus, содержащей 758 единиц амилазы и 37,1 единицы а-1,6-глюкозидазы на 1 мл, смешивают с 5 г каждого из следующих веществ: кислой глины, бентонита, талька, целита и перлита с целью адсорбщш а-1,6-глюкозидазы.

Адсорбированный знзим регенерируют фильтрацией или центрифугированием, тщательно промывают водой и затем определ ют его активность Полученные результаты представлены в таблице БКак видно из приведенных данных, а-1,6-глюкозидаза удовлетворительно адсорбируетс  всеми адсорбентами, количество адсорбированного энзима 400-700 единиц на 1 г.

Пример 14. К 100 г (вес сухого вещества ) сжиженного крахмала с декстрозным эквивалентом 1,5% добавл ют 30000 единиц р- амилазы, 3000 единиць1а-1,6-глюкозидазы и 0,73 CaClj. Смесь разбавл ют до общего объема

ттг пс1п1 -а son Ап uarrv nQwiT пг SO С И VPTawawnnвают рН в интервале 6-6,5. В этих услови х осуществл ют реакцию. Через 100 час в реакционной смеси определ ют состав сахара методом буДобавлено к концу 24-го часа культивировани .

-ХЧДобавлено в начале культивировани .

мажной хроматографии. Сахар содержал (%) 90,6 мальтозы, 7,1 мальтотриозы, 0,0 глюкозы и 2,3 других сахаридов.

Таблица 1

4.0

Активность фиксированного энзима (С)

Выход фиксированного энзима (С/А-Вх100).%

Таблица 3

Таблица 4

106,0

24700

6220

95300

95.1

Кисла  глига

Бентонит

Тальк

Целит

Перлит

Claims (1)

1. Патент Великобритании № 1281093, кл. С 3 Н, 1972.