JPH0789920B2 - 微生物による−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 - Google Patents
微生物による−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法Info
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- JPH0789920B2 JPH0789920B2 JP25813687A JP25813687A JPH0789920B2 JP H0789920 B2 JPH0789920 B2 JP H0789920B2 JP 25813687 A JP25813687 A JP 25813687A JP 25813687 A JP25813687 A JP 25813687A JP H0789920 B2 JPH0789920 B2 JP H0789920B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 近年、生体内で複合糖質の糖鎖部分が細胞の分化・成
長、細胞間認識あるいは悪性腫瘍を含む多くの病気の発
症などに重要な役割を果していることが明らかにされて
いる。
長、細胞間認識あるいは悪性腫瘍を含む多くの病気の発
症などに重要な役割を果していることが明らかにされて
いる。
こうした糖鎖の機能の解明には、糖鎖の構造解析、結合
様式の決定が必要とされ、複合糖質の糖鎖構造に高い特
異性を有する各種のグリコシダーゼの利用が重要な手段
となっている。
様式の決定が必要とされ、複合糖質の糖鎖構造に高い特
異性を有する各種のグリコシダーゼの利用が重要な手段
となっている。
血液型物質はその糖鎖構造が細胞内認識機構に大きな役
割を果たしていることが示される顕著な例である。血液
型のＡ型物質は糖鎖の非還元末端にＮ−アセチルガラク
トサミンがα結合し、Ａ型物質としての抗原決定基を形
成している。
割を果たしていることが示される顕著な例である。血液
型のＡ型物質は糖鎖の非還元末端にＮ−アセチルガラク
トサミンがα結合し、Ａ型物質としての抗原決定基を形
成している。
Ａ型物質に作用し、末端にα結合しているＮ−アセチル
ガラクトサミンを以下の様に切断遊離する酵素であるα
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（以下α−GalNAc
aseと略す。）は糖鎖構造の解析のための試薬としての
みならず、Ａ型血液のＯ型への転換等抗原性を変化させ
る手段として用いられる酵素である。
ガラクトサミンを以下の様に切断遊離する酵素であるα
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（以下α−GalNAc
aseと略す。）は糖鎖構造の解析のための試薬としての
みならず、Ａ型血液のＯ型への転換等抗原性を変化させ
る手段として用いられる酵素である。
（従来の技術） （発明が解決しようとする問題点） 従来微生物起源のα−GalNAcaseとしては、クロストリ
ジウム・パ−フリンゲンス（Clostridiumperfringens）
およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
由来の酵素が部分精製されているにすぎない。この内ク
ロストリジウム パ−フリンゲンスは嫌気性の病原菌の
ため培養が困難であり、一方アスペルギルス ニガー由
来の粗酵素中には多くの他のグリコシダーゼが存在し、
精製酵素を得ることは不適当である。
ジウム・パ−フリンゲンス（Clostridiumperfringens）
およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
由来の酵素が部分精製されているにすぎない。この内ク
ロストリジウム パ−フリンゲンスは嫌気性の病原菌の
ため培養が困難であり、一方アスペルギルス ニガー由
来の粗酵素中には多くの他のグリコシダーゼが存在し、
精製酵素を得ることは不適当である。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らはα−GalNAcase生産能を有する微生物を広
く自然界より検索した結果、土壌より分離された一菌株
が、その目的にかなった性質を有していることを見出
し、本発明に到達したものである。
く自然界より検索した結果、土壌より分離された一菌株
が、その目的にかなった性質を有していることを見出
し、本発明に到達したものである。
本発明に用いられる菌株の菌学的性質は以下に示す通り
である。
である。
（１）形態学的性質 分生子（胞子）： 球形、突起物を有する粗面、1.5〜1.7×1.5〜1.8μｍと
いう特徴を持った分生子からなるアクレモニウム型分生
子構造を有する。栄養菌糸からは、はっきり分化しない
分生子柄上または直接栄養菌糸上に２、３個から20個ぐ
らいの分生子が球状にかたまりを形成。
いう特徴を持った分生子からなるアクレモニウム型分生
子構造を有する。栄養菌糸からは、はっきり分化しない
分生子柄上または直接栄養菌糸上に２、３個から20個ぐ
らいの分生子が球状にかたまりを形成。
分生子柄： 分生子形成細胞は隔壁がみられ、分生子柄は先端がとが
っており、無分枝のものと分枝したものとが認められ
る。
っており、無分枝のものと分枝したものとが認められ
る。
栄養菌糸： 巾1.5〜3.2μｍと太く明瞭な隔壁が認められる。表面は
滑らかで先端は丸く、屈曲した細胞もみられる。
滑らかで先端は丸く、屈曲した細胞もみられる。
気菌糸： 巾0.5〜1.2μｍで先端は丸みを帯び、隔壁が認められ
る。
る。
（２）各培地における生育状態 麦芽汁寒天培地 発育の良否：適度 菌糸の形態：白色、綿毛状 培地裏面：黄褐色 バレイショ、ブドウ糖寒天培地 発育の良否：良好 菌糸の形態：中央は白色綿毛状、周辺はフェルト状。
培地裏面：淡黄色 ファペック寒天培地 発育の良否：不良 生育の様相：寒天に潜行するように放射状に伸長。
菌糸の形態：中央は白色綿毛状、時間経過とともに白点
散在。
散在。
（３）生理的性質 生育のpHは中性付近、生育温度は28℃が適当で、37℃で
は生育はきわめて遅い。
は生育はきわめて遅い。
通常の微生物の培養に用いられる培地によく生育し、炭
素源としてはアミノ糖よりグルコースを資化しやすい。
素源としてはアミノ糖よりグルコースを資化しやすい。
以上の諸性質よりこの菌株はアクレモニウム属に属する
新菌株と同定し、アクレモニウム・エスピーNo.413（Ac
remonium sp.No.413）と命名した。本菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第9585号として寄託
されている。
新菌株と同定し、アクレモニウム・エスピーNo.413（Ac
remonium sp.No.413）と命名した。本菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第9585号として寄託
されている。
次に、本発明により製造されるα−GalNAcaseの酵素化
学的および理化学的性質を示す。
学的および理化学的性質を示す。
（１）酵素の作用 本発明酵素は末端にGalNAcがα結合している糖鎖に作用
して以下のようにGalNAcを遊離せしめる。
して以下のようにGalNAcを遊離せしめる。
（２）基質特異性 種々のｐ−ニトロフェニル−グリコシドに対して、本発
明酵素を作用させた結果を第１表に示した。表から明ら
かなように本発明酵素はｐ−ニト ロフェニル−α−Ｄ−GalNAc以外のｐ−ニトロフェニル
−グリコシドに対しては実質的にはほとんど活性を示さ
ない。
明酵素を作用させた結果を第１表に示した。表から明ら
かなように本発明酵素はｐ−ニト ロフェニル−α−Ｄ−GalNAc以外のｐ−ニトロフェニル
−グリコシドに対しては実質的にはほとんど活性を示さ
ない。
一方、本発明酵素はｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−GalN
Acの他、非還元末端にα結合したGalNAcを有する糖鎖に
作用し、馬胃Ａ型物質、アシアロ牛顎下腺ムチン、豚胃
ムチン糖ペプチド、羊ムチン、Ａ型ヒト唾液糖ペプチ
ド、A1型血球等の天然物質抗原決定部位よりGalNAcを遊
離する。
Acの他、非還元末端にα結合したGalNAcを有する糖鎖に
作用し、馬胃Ａ型物質、アシアロ牛顎下腺ムチン、豚胃
ムチン糖ペプチド、羊ムチン、Ａ型ヒト唾液糖ペプチ
ド、A1型血球等の天然物質抗原決定部位よりGalNAcを遊
離する。
（３）力価の測定法 酵素活性の測定は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−GalN
Acを基質としてpH4.5のクエン酸緩衝液中37℃で反応を
行い、ホウ酸緩衝液（pH9.8）を加えて反応を停止させ
た後、遊離のｐ−ニトロフェノールの量を400nmの吸光
度を測定することにより行った。酵素活性の単位は１分
間に１μmoleのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量
を１ユニットとした。
Acを基質としてpH4.5のクエン酸緩衝液中37℃で反応を
行い、ホウ酸緩衝液（pH9.8）を加えて反応を停止させ
た後、遊離のｐ−ニトロフェノールの量を400nmの吸光
度を測定することにより行った。酵素活性の単位は１分
間に１μmoleのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量
を１ユニットとした。
血球以外の天然物質を基質とした場合は、pH4.5のクエ
ン酸緩衝液中37℃で反応を行い、Reissig法で遊離のGal
NAcを定量した。
ン酸緩衝液中37℃で反応を行い、Reissig法で遊離のGal
NAcを定量した。
天然物質のうちＡ型の型活性を持つものについては、抗
Ａ血清に対する血球凝集阻止能の減少を測定し、酵素活
性を確認した。
Ａ血清に対する血球凝集阻止能の減少を測定し、酵素活
性を確認した。
（４）至適pHおよび安定pH範囲 反応の至適pHは4.0〜4.5にあった。
安定pH範囲は４℃、２日間の処理条件の場合pH6.0〜7.5
であった。
であった。
（５）反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は55℃であった。安定温度範囲はpH7.
0、10mMリン酸緩衝液中に10分間保温したとき35℃以下
であり、45℃では約80％の活性が残存していた。
0、10mMリン酸緩衝液中に10分間保温したとき35℃以下
であり、45℃では約80％の活性が残存していた。
（６）阻害剤等の影響 本酵素に対する種々の添加物質の影響について検討した
結果を第２表に示した。表から明らかなように水源イオ
ンにより著しく阻害されたが、SH試薬やその他の金属イ
オンおよび糖によりほとんど阻害されなかった。
結果を第２表に示した。表から明らかなように水源イオ
ンにより著しく阻害されたが、SH試薬やその他の金属イ
オンおよび糖によりほとんど阻害されなかった。
（７）精製方法 本酵素の精製は、塩析法、各種クロマトグラフ法等を適
宜に組合わせて行うことができる。精製の具体例は実施
例に示すとおりである。
宜に組合わせて行うことができる。精製の具体例は実施
例に示すとおりである。
（８）分子量 本酵素の分子量はセファデックスＧ−150を用いるゲル
過法により約55,000、SDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によって約57,000と算出された。
過法により約55,000、SDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によって約57,000と算出された。
（９）ポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製された酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて単一のバンドを示した。
おいて単一のバンドを示した。
（10）アミノ酸分析 精製酵素標品を6N−Hcl中で110℃、22時間加水分解した
後、アミノ酸自動分析機でアミノ酸組成を測定した。そ
の結果を第３表に示した。
後、アミノ酸自動分析機でアミノ酸組成を測定した。そ
の結果を第３表に示した。
次に本発明をより具体的に説明する。
本発明に使用する微生物は、アクレモニウム属に属し、
上記性質を有するα−GalNAcaseを生産する能力を有す
るものがあれば如何なるものでもよい。このような微生
物の具体例としては、本発明者らにより土壌から分離さ
れたNo.413株があげられる。
上記性質を有するα−GalNAcaseを生産する能力を有す
るものがあれば如何なるものでもよい。このような微生
物の具体例としては、本発明者らにより土壌から分離さ
れたNo.413株があげられる。
当該菌を用いてα−GalNAcaseを生産するには、通常の
微生物の培養に用いられるものであれば特に限定されな
い。
微生物の培養に用いられるものであれば特に限定されな
い。
炭素源としては例えば、グルコース、アラビノース、シ
ュークロース、可溶性澱粉、糖蜜、デキストリン、豚ア
シアロムチンなどの糖質、窒素源としては、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスティープ
リカー、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩、尿素等があ
げられる。培地のpHは6.5、培養温度は28℃、培養時間
は72時間程度が適当であり、好気的に培養を行う。本酵
素は培養後の菌体を用いた誘導生産によっても得ること
ができる。
ュークロース、可溶性澱粉、糖蜜、デキストリン、豚ア
シアロムチンなどの糖質、窒素源としては、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスティープ
リカー、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩、尿素等があ
げられる。培地のpHは6.5、培養温度は28℃、培養時間
は72時間程度が適当であり、好気的に培養を行う。本酵
素は培養後の菌体を用いた誘導生産によっても得ること
ができる。
培養終了後、培養液からα−GalNAcaseを採取、精製す
るには既知の方法を適当に組合せて行うことができる。
本酵素は培養液中に分泌されるので遠心分離等により菌
体を除いた培養上澄液（培養瀘液）を硫安分画後、イオ
ン交換、ゲル過、吸着等のクロマトグラフィーを行い
精製することができる。
るには既知の方法を適当に組合せて行うことができる。
本酵素は培養液中に分泌されるので遠心分離等により菌
体を除いた培養上澄液（培養瀘液）を硫安分画後、イオ
ン交換、ゲル過、吸着等のクロマトグラフィーを行い
精製することができる。
（実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、以
下の実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではな
い。
下の実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではな
い。
実施例１ グルコース0.5％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、
塩化ナトリウム0.5％を含む培地を２容振盪フラスコ1
0本に各500ml分注し、滅菌した後、同培地で前培養した
アクレモニウム・エスピーNo.413を5ml接種し、28℃で
３日間振盪培養した。培養終了後、遠心分離により菌体
を除き、培養液を得た。この液を０〜５℃に保ちな
がら硫安を添加し、0.40〜0.55飽和の間の沈澱画分を採
取した。
塩化ナトリウム0.5％を含む培地を２容振盪フラスコ1
0本に各500ml分注し、滅菌した後、同培地で前培養した
アクレモニウム・エスピーNo.413を5ml接種し、28℃で
３日間振盪培養した。培養終了後、遠心分離により菌体
を除き、培養液を得た。この液を０〜５℃に保ちな
がら硫安を添加し、0.40〜0.55飽和の間の沈澱画分を採
取した。
得られた沈澱を0.01Mリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、
同緩衝液で一夜透析した。この透析内液を同緩衝液で予
め平衝化したDEAE−セファデックスＡ−50カラム（4.8
×5.0cm）に通し、0.1MのNaclを含むリン酸緩衝液（pH
6.0）で洗浄後、0.25M Naclを含む同緩衝液で酵素を溶
出した。活性画分を限外過にて濃縮後、90％硫安飽和
にて沈澱を集めた。
同緩衝液で一夜透析した。この透析内液を同緩衝液で予
め平衝化したDEAE−セファデックスＡ−50カラム（4.8
×5.0cm）に通し、0.1MのNaclを含むリン酸緩衝液（pH
6.0）で洗浄後、0.25M Naclを含む同緩衝液で酵素を溶
出した。活性画分を限外過にて濃縮後、90％硫安飽和
にて沈澱を集めた。
この沈澱に0.001Mリン酸緩衝液（pH7.0）を加えて溶解
し、同緩衝液で透析した。この透析内液を同緩衝液で予
め平衝化したハイドロキシアパタイトカラム（1.4×5c
m）に通し、同緩衝液で洗浄後、0.005Mリン酸緩衝液（p
H7.0）で溶出した。活性画分を限外過にて濃縮後、0.
01Mリン酸緩衝液（pH7.0）で平衝化したセファデックス
Ｇ−150カラム（1.8×123cm）を用いてゲル過を行っ
た。活性画分を濃縮後、0.1M Naclを含む0.02Mリン酸緩
衝液（pH7.0）で平衝化したConAセファロースカラム
（0.8×2.5cm）に通した。同緩衝液で非吸着画分に溶出
された活性画分、及び0.005Mα−メチル−マンノシドを
含む同緩衝液で溶出された活性画分を濃縮し、α−GalN
Acaseの精製標品3mg（比活性90units/mg,収率15％）を
得た。
し、同緩衝液で透析した。この透析内液を同緩衝液で予
め平衝化したハイドロキシアパタイトカラム（1.4×5c
m）に通し、同緩衝液で洗浄後、0.005Mリン酸緩衝液（p
H7.0）で溶出した。活性画分を限外過にて濃縮後、0.
01Mリン酸緩衝液（pH7.0）で平衝化したセファデックス
Ｇ−150カラム（1.8×123cm）を用いてゲル過を行っ
た。活性画分を濃縮後、0.1M Naclを含む0.02Mリン酸緩
衝液（pH7.0）で平衝化したConAセファロースカラム
（0.8×2.5cm）に通した。同緩衝液で非吸着画分に溶出
された活性画分、及び0.005Mα−メチル−マンノシドを
含む同緩衝液で溶出された活性画分を濃縮し、α−GalN
Acaseの精製標品3mg（比活性90units/mg,収率15％）を
得た。
実施例２ ペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、豚アシアロムチン0.5％を含む培地100mlを容量500m
lの振盪フラスコに分注し、120℃、15分間加圧滅菌した
後、同じ組成の培地で前培養したアクレモニウム・エス
ピーNo.413の菌株を5ml接種し、28℃、２日間振盪培養
した。培養終了後遠沈により菌体を集菌し、生理食塩水
でよく洗浄した後、培養液と等容の0.5％Ｎ−アセチル
ガラクトサミンを含む培地に懸濁し、28℃、18時間振盪
し、酵素を誘導産生させた。誘導終了後遠心分離によっ
て菌体を除き、0.11units/mlの活性をもつ誘導液を得
た。
％、豚アシアロムチン0.5％を含む培地100mlを容量500m
lの振盪フラスコに分注し、120℃、15分間加圧滅菌した
後、同じ組成の培地で前培養したアクレモニウム・エス
ピーNo.413の菌株を5ml接種し、28℃、２日間振盪培養
した。培養終了後遠沈により菌体を集菌し、生理食塩水
でよく洗浄した後、培養液と等容の0.5％Ｎ−アセチル
ガラクトサミンを含む培地に懸濁し、28℃、18時間振盪
し、酵素を誘導産生させた。誘導終了後遠心分離によっ
て菌体を除き、0.11units/mlの活性をもつ誘導液を得
た。
（発明の効果） 本発明によれば、α−GalNAcaseを大量かつ簡便、安価
に製造できるので、糖鎖構造の解析や抗原性の転換に極
めて有用な手段を提供するものである。
に製造できるので、糖鎖構造の解析や抗原性の転換に極
めて有用な手段を提供するものである。
Claims (1)
- 【請求項１】アクレモニウム属に属し、α−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニダーゼを生産する能力を有する微生物
を培養し、培養物からα−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼを採取することを特徴とする微生物によるα−Ｎ
−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25813687A JPH0789920B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-10-12 | 微生物による−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25813687A JPH0789920B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-10-12 | 微生物による−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0198485A JPH0198485A (ja) | 1989-04-17 |
| JPH0789920B2 true JPH0789920B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=17316015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25813687A Expired - Fee Related JPH0789920B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-10-12 | 微生物による−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789920B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4828363B2 (ja) * | 2006-09-15 | 2011-11-30 | 日本圧着端子製造株式会社 | 差込側コネクタ |
| JP4924901B2 (ja) * | 2007-10-24 | 2012-04-25 | 住友電装株式会社 | ロック構造およびコネクタ |
| JP4924902B2 (ja) * | 2007-10-24 | 2012-04-25 | 住友電装株式会社 | ロック構造およびコネクタ |
| JP2009104938A (ja) * | 2007-10-24 | 2009-05-14 | Sumitomo Wiring Syst Ltd | ロック構造およびコネクタ |
| EP2053702B1 (en) | 2007-10-24 | 2012-06-20 | Sumitomo Wiring Systems, Ltd. | A connector device and locking structure |
-
1987
- 1987-10-12 JP JP25813687A patent/JPH0789920B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0198485A (ja) | 1989-04-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |