SU687794A1 - "Октапептид,облобладающий способностьюСпЕцифичЕСКи иНгибиРОВАТь пРЕССОРНый эффЕКТи МиОТРОпНОЕ дЕйСТВиЕ АНгиОТЕНзиНА п4 - Google Patents

Description

(54) ОКТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ

Claims (3)

1. СПЕЦИФИЧЕСКИ ИНГИБИРОВАТЬ ПРЕССОРНЫЙ ЭФФЕКТ И МИОТРОПНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНГИОТЕНЗИНА II нацией остова пептидной цепи - наличием дополнительной NH-группы между С и карбонильным углеродным атомом в остатке валина в положении 3. Однако это неожиданно усиливает антагонистическое действие этого аналога гормона и снижает нежелйтельный прессорный эффект. Предлагаемое соединение было синтезировано путем конденсации (согласно схеме) отдельных фрагментов при использовании известныхметодов пептидной химии (например азидного,карбодиимидного и пр.) 3. Трет-бутоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-аспарагинил-Nr -нитроаргинил валина (4) (см. схему 1) получают карбодиимидным методом, конденсиру  бензилоксикарбониласпарагинил-№ -нитроаргинин (2) с трет-бутоксикарбонилгидразидом валина (3) в присутствии двух молей 1-гидроксибензотриазола . Защиту гидразидной фунции - трет-бутоксикарбонильную группу соединени  (4) - отщепл ют трифторуксусной кислотой при комнатной температу , ре. Азид (6), полученный по методу Рудингера из гидразида (5), выдерживают в растворе диметилформамида I ч при 50°С. В таких услови х происходит полна  перегруппировка азида в изоцианат (7), который без выделени  ввод т в реакцию с аминокомпонеЕ1Тной (8). Защитные группы у полученного окт-апептида (9) удал ют каталитическим гидрогенолизом. Диацетат аспарагиниларгинил-аза- -гомовалилтирозил-гистидил- , пролил-фенилаланина (1) чист т, экстрагиру  н-бутаНОЛОМ из водного раствора. Получают соединение I хроматографически и электрофоретически однородное, данные аминокислотного анализа продуктов кислотного гидролиза подтверждают наличие аминокислот ,, вход щих в последовательность октапептида (I), в ожидаемых соотношени х. Пример. В работе используют аминокислоты L-р да. Органические растворители чист т согласно общеприн тым методам. Растворители упаривают на ротационном испарителе при остаточном давлении 12- 15 мм рт. ст. и температуре бани 30-40°С. Температуру плавлени  (или разложени ) соединений определ ют в открытых капилл рах без исправлени . Удельное оптическое вращение измер ют на цифровом пол риметре «Parkin Elmer (модель 141). Электрофорез провод т , на бумаге FN-16 (ГДР) в 30%-ной уксусной кислоте (рН.1,9) при 18 В/см, электрофоретическую подвижность соединений привод т ро отношению к гистидину (Е«а ). Дл  нисход щей хроматографии примен ют бумагу FN-3 (ГДР) и следующие системы: н-бутанол -пиридин-уксусна  кислота-вода при соотношении соответственно 30:20:6:24 (А); н-бутанол-уксусна  кислота-вода при соотношении 5:1:2 {Б). Хроматографию в тонком слое (ТСХ) провод т на пластинках«Silufol фирмы «KavaИег (Чехословаки ) в системах этилацетатпиридин-уксусна  кислота-вода при соотношении 5:5:1:3 (В); хлороформ-метанол- вода при соотношении 40:30:5 (Г); н-бутанол-изо-пропанол-вода-хлоруксусна  кислота при соотношении 65-15:20:3 (Д); н-бутанол-уксусна , кислота-вода при соотношении 4:1:1 (Е); и хлороформ-этанол-этилацетат-вода при соотношении 5:5: : 1,5:0,5 (Ж). Вещества на хромато- и электрофореграммах в зависимости от структуры соединени  обнаруживают нингидрином и реактивами Паули, Сакагучи, Рейндел -Хоппе и Бартона. Дл  элементного анализа вещества высушивают в пистолете Фишера в течение 24 ч над п тиокисью фосфора при 60°С и остаточном давлении 0,1 мм рт. ст. Кислотный гидролиз пептидов провод т в 6 н. сол ной кислоте при 105°С в запа нных ампулах в течение 24 ч. Аминокислотный состав определ ют на автоматическом анализаторе ВС-200 фирмы «BiocaU (ФРГ). Трет-бутоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-аспарагинил-ЬЯ-нитроаргинилвалина- 3. К охлажденному до 0°С раствору 11,7 г (25 ммоль) бензилоксикарбонил-аспарагинил-Г -нитроаргинина и 6,8 г (50 ммоль) 1-гидроксибензотрйазола в 80 мл диметилформамида приливают раствор 5,2 г (25 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 15 мл диметилформамида и выдерживают 1 ч при 4-2°С. Добавл ют 5,8 г (25 ммоль) трет-бутоксикарбонилгидразида валина и смесь выдерживают 24 ч при +2°С. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, к фильтрату приливают воду до помутнени  (около 120 МЛ; 60°С) и выдерживают 15 ч при +4°С Юсадок (дициклогексилмочевину и 1-гидроксибензотриазол ) отфильтровывают и фильтрат выливают в смесь, состо щую из 300 мл насыщенного раствора NaCL и 50 мл насыщенного раствора NaHCO. Выпавший мелкий осадок отфильтровывают, промывают водой, затем-суспендируют в 300 мл этилацетата . Отфильтровывают, промывают этанолом (50 мл), водой и высушивают в вакууме над PjOs- КОН. Выход fS,8 г, 92/о, т. пл. 180-185°С (разЛ.). Д/й, а- 22,4/С I, диметилформамид); R 0,88 (А); % 0,85 (Б) RfO,96/(B); Rt 0,78 (Г), EHIS 0,33 (рН 1,9). Найдено: %: С 48,81; Н 6,43; N 20.33. Вычислено, %: С 49,40; Н 6,51; N 20,58. Трифторацетат гидразида бензилоксикарбонил-аспарагинил-М -нитроаргинил-валнна (4). Раствор 13,6 г (20 ммоль) (3) в 50 мл трифторуксусной кислоты выдерживают 30 мин при 20°С , затем в вакууме (12мм, 20°С) отгон ют 35 мл трифторуксусной кислоты , остаток растирают с эфиром, выпавший в осадок продукт отфильтровывают и сушат в вакууме над PjOe/KOH. Выход 13,5 г (98%), т.-пл. 191 -193°С (разл.).. - 10,3(CL, диметилформамид); RiO,75 (А), R 0,67 (Б), Rr 0,73 (Г), foO,93 (В), ЕНВ 0,47 (рН 1,9) Найдено, «/о: С 43,64; Н 5,57; N 20,34. Вычислено, %: С 43,22; . Н 5,37; N 20,02. Ci,H,,,COOH п-Нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбонил-0-бензилтирозил-валил-гистидилпролил-изолейцина 02). К раствору 6 г (10ммоль) п-нитробензил вого эфира валил-гистиднл-пролйл-изолейцина в 50 мл (диметилформамида) прибавл ют 6 г (12 ммоль) п-нитробензилового эфира трет-бутоксикарбонил-0-бензилтирозина , 0,5 г 1-гидроксибензотриазола и выдерживают при 20°С 15 ч. К реакционной смеси прибавл ют 0,1 мл (3 ммоль) N, N-диэтилендиамина , перемешивают в течение 15 мин и смесь вливают в 400 мл этилацетата и промывают последовательно 15°/о раствором KHSO водой, 10%МаНСОз, водой и высушивают над NatSO /MgSO. Растворитель упаривают до объема 50 мл и (12) высаживают в виде аморфного вещества смесью эфир-гексан при соотношении (1:1). Выход 8,2 гр (8651), т. пл. 106-109°C/i4)-24 (С 1, диметилформамид); R 0,78 (Г),Я 0,57 (Д). Найдено, %: С 63,24, Н 6,82, N 11,14. Вычислено, %: С 63,01; Н 6,77; N 11,76. CsoHetfl lfOn Дихлоргидрат п-нитробензилового эфира О-бензилтирозил-валил-гистидил-пролилизолейцина (13). 8 гр (8,2 ммоль) (12) раствор ют в 50 мл лед ной уксусной кислоты, прибавл к)т 50 мл 2 Н. раствора HCL в уксусной кислоте, выдерживают при 20°С 15 мин, упаривают (30°), остаток растирают с эфиром, отфильтровывают и высушивают над KOH/F Qy . Выход 7,5 г( 965I&), т. пл. 138-140°С. Mg - 19,9 (С 1, диметилформамид); EifiS 0,66 (рН 2,4), Rf 0,25 (Д). Найдено, %: С 58,49 , Н 6,22; N 12,48. Вычислено, %: С 58,37; Н 6,31; N 12,01. ,О,2НС1 п-Нитррбёнзиловьш эфир бензилоксикарбонил-аспарагинил-1 -нитрраргинил-аЗачЛ-гомовалил-О-бензилтирозиЛ-валил-гистидил -пролил-изолейцина (14). К раствору 2,43 г (3,5 ммоль) (4) в 15 мл диметилформамида прибавл ют 2 мл 7 н раО вора .HCL в диоксане (14 ммоль), реакционную смесь охлаждают до -20°С, прибавл ют 0,55 мл (4 ммоль) третбутилнитрита, вы-держивают 20 мин при -15°С и вливают в 200 мл охлажденного до -5°С раствора KCL. (При дальнейшей обработке температуру раствора азида поддерживают не выше +3 ) Азид (5) экстрагируют этилацетатом (2 раза по 200 мл), промывают последовательно водой, 5% раствором NaHCQj, водой, высушивают над (10 мин) и упаривают досуха в вакууме (5°С, 0,1 мм рт. ст.) Остаток раствор ют в 30 мл диметилформамида , 15 мин встр хивают с размельченными молекул рным ситами А5(2 гр), отфильтровывают и фильтрат выдерживают 1 ч при 50°С (в течение первых 15-20 мин выдел ютс  пузырьки азота). Полученный раствор гзоцианата (6) прибавл ют к раствор2 ,23 гр (2 ммоль) трифторацетата п-нитробензи лового эфира о-бензилтирозил-валилгистидил-пролил-фенилаланина (7) и 0,55 мл (4 ммоль) триэтиламина в 12 мл диметилформамида и выдерживают 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь выливают в 200 мл воды, объемистый осадок отфильтровывают , промывают последовательно 5% раствором NaHCOi, водой, раствором KHSO, водой. Влажный продукт суспендируют в этилацетата, отфильтровывают , промывают этанолом (30 мл), высушивают и переосаждают из диметилформамида - этанол-вода. Высушивают в .вакууме над P«O,/KOH. Выход 1,92 гр (62%), счита  на аминокомпоненту , т. пл. 187-190°С (разл.). /«ti,2 2 - 22 (С 1, диметилформамид); %0,93 (А Rf 0,95 (Б), R/0,67 (Г); RiO,54 (Д); Ен 0,48 (рН 1,9) Найдено, %: С 57,94, Н 5,96; N Вычислено, %: С 57,66; Н 6,33; N Сев Нвз Nf7 О/г Аспарагинил-аргиннл-аза- t-гомо-валил-тирозил-валил-1 истидил-пролил-изолейцин (15). К раствору 1,8 г (1,24 ммоль) (6) в 40 мл смеси метанол-уксусна  кислота-вода (6: :1:1) прибавл ют 1 гр палладиевой черни и гидрируют 24 ч, катализатор отфильтровывают , фильтрат упаривают до объема 5 мл приливают 50 мл абсолютного этанола и сно-. ва упаривают до объема 5 мл. Упаривание этанола повтор ют еше 2 раза, образовавшийс  осадок отфильтровывают, промывают этанолрм и эфиром. Полученный продукт раствор ют в 100 мл воды и после насышени  н-бутанолом промывают 2 раза по 5 мл н-бутанола ij н-бутанрлом экстрагируют октапептид (9) (3 раза по 150 мл). Объединенные экстракты упаривают в вакууме (30°С, 12 мм рте. ст) (до объема 15 мл, остаток растирают с этанолом, осадок отфильтровывают и высушивают, в вакууме над РгОу (КОН при 60°С. Выход 1,1 г (80%), т. пл. 195-197°С (разл.). ,9 (С I, 1 н. CHjCOOH), RiO,24 (А).Rf 0,12 (Б). RrO,12 (Г); Rr 0,08 (Д); ЕНЙ 0,75 (рН 2,4). Найдено: %: С 50,76; Н 6,99; N 18,64. Вычислено,% С 51,19; Н 7,43; N 18,65. С4 Нгз N««O« CHjCOOH ЗНгО . Аминокислотный состав: 0,9; Aggrg 0,9, Val 1,0; Туг 0,9; His 1,1; Pro 0,9; lie 1.0. Полученные соединени  октапептид-(Г-аспарагин , 3-аза-({-гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин ) ангиотензин II испытывают на ингибирование специфической миотропной активности ангиотензина II в опытах in vitro и понижение его эффекта на кров ное давление крыс в опытах in vivo. Методика исследовани . Миотропные свойства (1-аспарагин, 3-аза-с (-гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ан гиотензина И в опытах in vitro изучали согласно методике, регистрирующей изотонические сокращени  восход щей ободощной кишки (colon ascendens) крыс,  вл ющейс  наиболее чувствительным тест-органом дл  исследовани  миотропнойактивности ангио: тензина II. Использован прибор ВИ6-5МА в нашей модификации. Антагонистические свойства изучены в диапазоне концентраций - 10 ммол /л, врем  предварительной экспозиции кишки с исследуемым соединением составило 3 мин. При вычислении кумул тивных кривых концентраци -эффект (КККЭ) применена машинна  обработка экспериментальных данных (кажда  точка определ лась как средн   из 6-10 опытов) .с определением доверительных интервалов при Р 0,05. Дл  количественной-характеристики кон курентного антагонизма (1-аспарагин, 3-аза Х -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин)- ангиотензина II вычислены параметры pAj. В опытах in vivo регистрируют кров ное давление у наркотизированных уретаном крыс. После предварительной (1 мин) инъекции исследуемого соединени  в дозах 10,50, 100, 250 и 500 мгк/кг животным ввод т ангиотензинамид в стандартных дозах 0,05, 0,5 и 5,0 и 25 мкг/кг. Антагонизм соединени  исследован также при инфузионном .его введении 10 и 100 мгк/кг/мйн в течение 20 мин. Вычислены кривые доза-эффект дл  ангиотензина в присутствии и в отсутствии антагониста . Результаты В опытах на изолированной восход щей ободошной кишке крыс (1-аспарагчн, 3-аза- -гомовалин , 5-валин, 8-изолейцин) ангиотензин ,II в концентраци х - не про вл ет миотропное действие, но в концентраци х пор дка - моль вызывает прогрессивное параллельное перемещение кумул тивных кривых концентраци -эффект ангиотензина II в сторону высших концентраций , т. е. про вл ет типичный конкурентный антагонизм с ангиотензином. Вычисленные параметры pAj составл ют 9,70±0,20. В опытах in vivo соединение I значительно антагонизирует прессорное действие ангиотензина II. При инъекционном введении (З-аза-оС-гомовалин, 8-изолейцин) -ангиотензина в доз 50 мкг/кг требуетс  10кратное увеличение дозы ангиотензина и 100-кратное при дозе 100 мкг/кг. Инфузи  антагониста со скоростью 10 мйг/кг/мин перемещает кривую доза-эффект ангиотензина на 1 .пор док (10-кратно), ЮОмкг/ /кг/мин - на 2 пор дка (100-кратно). Формула изобретени  Октапептид формулы L-Asn-L- Ar -ага-ct-homo- L -Val-Туг-L-Уаэ;-L-His-L-Pro-С-He обладающий способностью специфически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина И. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Regoli D., Park W. К., Rioux F,Phar nacology of angiotensin, Pharmacol. Rev., 1974. 26, c. 69.
2. 2.Pettinger W. A., Mitchell H. C. Clinical pharmacology of angiotensin antagonists, Federation Proc., 1976, 35, c. 2521.
3. 3.Шредер Э., Любке К., Пепт ды. М., «Мир, 1967, с. 116.

   g

   S

   i

   g

   tvj

   t

   M