SU763464A1 - Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы - Google Patents
Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы Download PDFInfo
- Publication number
- SU763464A1 SU763464A1 SU782626246A SU2626246A SU763464A1 SU 763464 A1 SU763464 A1 SU 763464A1 SU 782626246 A SU782626246 A SU 782626246A SU 2626246 A SU2626246 A SU 2626246A SU 763464 A1 SU763464 A1 SU 763464A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- methanol
- yeast
- subdependent
- alcoholdehydrogenase
- preparing
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 15
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 title description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 title description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 13
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 claims 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FQIYBGJSPWHUQN-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxymethane Chemical compound COS FQIYBGJSPWHUQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 101710122414 NAD-dependent alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241000191338 Candida methylica Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical class [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1
Изобретение относитс к микробио логической промышленности, а именно , к способам получени НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей. Изобретение может найти применение в фармацевтической и медицинской промышленности , а также в научных исследовани х .
В последние годы было показано, что НАД-зависима алкогольдегидрогеназа из печени человека, лошади и пекарских дрожжей обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует нар ду с окислением этанола и окисление метанола.
Способна окисл ть метанол и НАДзависима дегидрогеназа из метанолокисл ющих дрожжей 1.
Однако активность по метанолу НАДзависимой алкогольдегидрогеназы из названных источников очень низка.
Получение НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы с высокой активностью по метанолу имеет,кроме чисто научного , также практическое значение. Окисление метанола с помощью НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы может найти применение в процессах, в коTjoptix необходима регенераци кофактора , а именно НАДН. Это многие биохимические окислительные процессы, например получение аминокислот, модификаци стероидов и т.д. Перспективным вл етс также создание биоэлектрохи- Мичёских систем окислени различных органических соединений дл создани топливных элементов, в - которых НАДН выполн л бы роль переносчика злектронов с органических соединений на электрод.
Наиболее близким к изобретению вл етс способ получени НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей Pichia pinas, предусматривающий культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и 2% метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение:фермента 2.
Недостатки способа: низка актив25 ность фермента по отношению к метанолу , составл квда 402 нмоль/мг белка-мин; периодические услови культивировани , которые не позвол ют поддерживать культуру в одном и том
30 же физиологическом состо нии с высокой феЕментативной активностью;, применение в качестве источника углерода метилового спирта усложн ет культивирование в промышленных масштабах , так как он летуч и токсичен. В этом случае необходима очистка сточных вод от метанола. Цель изобретени - повышениеметанолокисл ющей активности фермент и эффективности процесса. Указанна цель достигаетс тем, что в качестве продуцента используют дрожжи Candida methylica ИБФМ У-670 а культивирование ведут в проточных услови х, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01-0,1 об.%. . Повышение эффективности процесса происходит за счет того, что культивирование в услови х Протока позвол ет получать большие количества биомассы , а также поддерживать культуру в одной и той же фазе роста при посто нной концентрации источника углерода в среде, что вл етс необходимым условием дл получени фермента с высокой метанолокисл ющей активностью. Эффективность процесса повышаетс и за счет использовани в качестве источника углерода этилового спирта, что упрощает технологию . Способ осуществл ют следующим образом . Дрожжи Candida methylica ИБФМ ,670 культивируют да синтетической питательной среде следующего состава: ( NHjLHPO. 0,5 г/л; КНдНгРОд. 1,5 г/л; KN02,4,0 г/л; MgSO4 0,25 г/Л дрожжевой автолизат 0,01 г/л,-этиловый спирт 0,01-0,1 об, %. Культивирование провод т в ферментере в непрерывно-проточном режиме с коэффициентом разбавлени 0,1-0,05 ч при аэрации, рН среды 6,0. Дл выделени фермента биомассу разрушают путем растирани стекл нными бусами и центрифугируют, супернатант хроматографируют на ДЕАЕ-целпюлозе . Активность полученного препа рата по метанолу 7100 нм/мг белкаМи П р и м е р 1.В качестве продуцен га используют метило трофных дрожжей Candida-methyJica ИБФМ У670 ,который хранитс в коллекции ин ститута биохимии и физиологии микро организмов АН СССР в г,Пущино-на.гЬк Штамм защищай авторским- свидетельством № 449933, кл. с 21 Q 11/18, Дрожжи культивируют на минеральной среде следующего состава,г/л: (NH4)HP04 0,5 NH4H2P04 1,5; KNO 4,0; МдЗОд 0,25; дрожжевой автолизат 0,01. Вода дистиллированна . Значение рН среды довод т сол ной кислотой до 0,0. Стерилизацию среды провод т при 1 атм 20 мин, В качестве источника углерода используют эти новый спирт, который добавл ют после Стерилизации в количеств.е 0,05 об. % Дл выращивани -культуры используют ферментеры фирм LKB (Швеци ) или B.Braun Melsunger (ФРГ), Культивирование провод т в непрерывно-проточном режиме по хёмостатному принципу . Дл предотвращени вспенивани в среду добавл ют силиконовое масло (0,01 %) , Подача среды осуществл етс регулируемыми перистальтическими насосами. Коэффициент разбавлени ,1-0,05 ч Аэрацию провод т воздухом из расчета один объем в минуту на один объем среды. Скорость вращени мешалки 400 об/мин. Температура среды культивировани . Значение рН среды поддерживают посто нным (6,0) при автоматической подаче И1елочи (0,5 % NaOH)-, Рост культуры измер ют по плотности суспензии. Выход щую из ферментера суспензию клеток охлаждают до 2°С и подвергают сепарирова ию на суперцентрифуге при 2800 об/мин, Отсепариро-. ванные клетки (20 г) суспендируют в 40 1Л 0,1.м фосфатного буфера. (KHjPO - NaOH, рИ-7,5), содержащего 1 мМ дитиотрейтола и разрушают на СР-дезинтеграторе (Швеци ) при скорости вреицени мешалки 3000 об/мин в течение 25 мин, Гомогенат центрифугируют в течение 1 ч при 4000 д, Супернатант развод т 0,02 М фосфатным буфером с дитиотрейтолом (1мМ) до 100 мл и используют дл ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-г-целлюлозой, уравновешенной .тем же буфером. Элюирование провод т с помощью ступенчатого градиента, получаемого добавлением к исходному буферу NaCi, Препарат алкогольдегидЕхэззеназы элюируетс 0,2 М NaCl, В результате ,ионооа 1енной хрсматографии на ДЕАЕ-целлюлозе получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз и обладающий высокой удельной активностью по метанолу (7100 нм/мг белка мин). П р .и -м ё р 2,Дрожжи Candida methyjica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01 об. %, После выделени фермента, осуществленного способом , описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 1200 нм/мгбелка-мин. Пример 3.Дрожжи Candida methyAica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,1 об, %, После выделени фермента, осуществленного способом, описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 500 нм/мг белка-мин.
предлагаемый способ позвол ет получить НАД-эависимую алкогольдегидрогеназу с высокой метанолокисл ющей активностью (в 15 раз выше, чем в известном способе), а также повысить эффективность процесса за счет применени проточных условий культивировани и использовани нетоксичного этилового спирта как ,источника углерода.
Claims (2)
1. Семискер Я.А., Микельсаар С.К., Хейнару Э,Х. СЯсислёние метанола НАДспецифичной дёгйдрогеназой метанол-. усваивающих дрожжей. - Микробиологи ., 19J1, т.46, ВЫП.1, с. 169-171.
2.Metra R.J. Pyridine NucleotideLinked:0xidation of methano L in metanol-assimifating yeastsr Journal of Bacteriology, 1975, 124, № 3, 1165-1Г67.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU782626246A SU763464A1 (ru) | 1978-06-07 | 1978-06-07 | Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU782626246A SU763464A1 (ru) | 1978-06-07 | 1978-06-07 | Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU763464A1 true SU763464A1 (ru) | 1980-09-15 |
Family
ID=20769154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU782626246A SU763464A1 (ru) | 1978-06-07 | 1978-06-07 | Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU763464A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2437935C2 (ru) * | 2009-09-10 | 2011-12-27 | ООО "Инновационно-исследовательский центр" | Способ производства мультиферментного препарата |
-
1978
- 1978-06-07 SU SU782626246A patent/SU763464A1/ru active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2437935C2 (ru) * | 2009-09-10 | 2011-12-27 | ООО "Инновационно-исследовательский центр" | Способ производства мультиферментного препарата |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS5886093A (ja) | アミドの生物学的製造法 | |
| US3922194A (en) | Process for producing 2-keto-L-gulonic acid | |
| KR880001944B1 (ko) | 2,5-디케토-d-글루콘산 리덕타제의 제조방법 | |
| SU763464A1 (ru) | Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы | |
| JPS611384A (ja) | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 | |
| US4357425A (en) | Process for producing L-amino acid oxidase | |
| US4060455A (en) | Process for the microbial production of L-serine using pseudomonas Sp. DSM 672 | |
| EP0206595B1 (en) | Thermally stable tryptophanase process for producing the same, and thermally stable tryptophanase-producing microorganism | |
| RU2053292C1 (ru) | Штамм бактерий alcaligenes eutrophus - продуцент белковой биомассы | |
| SU871525A1 (ru) | Способ получени НАД-зависимой формиатдегидрогеназы | |
| US5610045A (en) | Producing a high content of acetate kinase using bacillus stearothermophilus | |
| JP2708536B2 (ja) | ロドコッカス属細菌及びそれを用いる２―ヒドロキシ酪酸の製造法 | |
| JP2770030B2 (ja) | ケトヘキソキナーゼの製造法 | |
| JP2801694B2 (ja) | 新規酵素 | |
| KR910004362B1 (ko) | 세라티아 sp.Y-4가 생산하는 신규의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 그의 생산방법 | |
| SU763463A1 (ru) | Способ получени дегидрогеназ | |
| Nakajima et al. | . DEG. C. | |
| JPH09247A (ja) | Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 | |
| JPS6147194A (ja) | Ｎ−カルバモイル−ｄ−バリンまたはｄ−バリンの製造法 | |
| SU1698286A1 (ru) | Питательна среда дл культивировани штамма РSеUDомоNаS SтUтZеRI ВКПМ В-4724 - продуцента рестриктазы PS и 1 | |
| JPS5817590B2 (ja) | Ｌ−リンゴ酸脱水素酸素の製造法 | |
| JPH0856666A (ja) | 耐熱性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼおよびその製造法 | |
| JPH0346115B2 (ru) | ||
| JPS62155085A (ja) | Ｌ−フコ−ス・デヒドロゲナ−ゼの製造法 | |
| JPH04141096A (ja) | Ｒ（―）―１，３―ブタンジオールの製造法 |