JPS5886093A

JPS5886093A - アミドの生物学的製造法

Info

Publication number: JPS5886093A
Application number: JP56184688A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Yamada; 山田秀明; Yoshiki Tani; 谷吉樹
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-11-18
Filing date: 1981-11-18
Publication date: 1983-05-23
Also published as: EP0093782A1; EP0093782B1; JPS5937951B2; DE3275434D1; US4637982A; EP0093782A4; WO1983001784A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔■〕発明の背景技術分野本発明は、微生物の作用によって低級脂肪族ニトリルを
水和して対応するアミドな製造する方法に関する。さら
に具体的には、本発明は、使用する微生物に特許をゴす
るアミドの生物学的製造法に関する。

低級脂肪族アミド、たとえばアクリルアミド、は対応ニ
トリル、たとえばアクリロニトリル、の水和によって製
造されるが、この水和を微生物の作用によって行なう方
法が提案されている（たとえば、特開昭５１−８６１８
６号および特公昭ｌ−１７９１８号各公報参照）。

叩発明の概要要　　　旨本発明は、シュードモナス属またはアシネトバクタ−属
に属する微生物によって低級脂肪族ニトリルを生物学的
に水和して対応するアンドを製造する方法に関する。

従って、本発明によるアミドの生物学的製造法は、炭素
数２〜４０二）＋１ルな微生物の作用により水・和して
対応するアミＰＫ変換させる方法において、使用する微
生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ−ｏｍｏｎａｓ　）
属またはアシネトバクタ−（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃ−１
ｅｒ）　　属に属し、該ニトリルを水和して対応するア
ばドに変換する能力な有するものであること、を％徴と
するものである。

効　　果後記実施例に示されているように１本発明で使用する微
生物は特にアクリルアオド生成能が大きくしかもいった
ん生成したアクリルアミドをさらど認められないので、
水和反応生成液中にはアクリルアさドが高濃度で蓄積さ
″れ、従ってアクリルアミドの回収も容易となる。

また、水和反応の至適温度が一般に０〜２０℃と低いの
で、熱経済上π利である。

帥発明の詳細な説明１、対象ニトリル本発明で水和子べ（対象とするニトリルは、炭素数２〜
４のニド刃ルである。このようなニトリルの具体例は、
たとえば、アセトニトリル、プロピオニトリル、アクリ
ロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル
およびイソブチロニトリル、である。これらのうちでは
、アクリロニトリルが代表的であり、また水和の成績も
よい。

本発明で便用テる微生物を使用する場合には、対象ニト
リルの炭素数が５以上になるかあるいは芳香族のニトリ
ルは炭素２〜４のニトリルに比べて水和し難くなる傾向
がある。

２、生物学的水和反応本発明によるニトリルの微生物学的水和反応は、便用す
る微生物が特定のものであるという点を除けば、前記の
公知の方法と本質的には変らない。

従って、本発明で「ニトリルを微生物の作用により水和
して対応するアミドに変換させる」−ということはニト
リルの存在下に微生物を培養する場合、ならびに微生物
培養後の菌体培養物、そこかニトリルとを接触させる場
合、のいずれをも包含するものとする。また、菌体また
はこの菌体が産生する酵素を固定化して反応に利用する
場合をも包含するものである。なお、本発明による生物
学的水和反応は、この微生物の産生する酵素にトリルヒ
ドラター−１！？）Ｋより行なわれるものと解される。

本発明で使用される微生物の培養は、合目的的な適当な
方法に従って行なうことができる。一般に、使用する培
地はグルコース、マルトース、デキストリン等の炭素源
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、対象ニトリル
以外のニトリル、たとえばアクリロニトリルの水和の場
合はイソブチロニトリル、等の窒素源、酵母エキス、麦
芽エキス、ペプトン、肉エキス等の有機栄養源、リン酸
塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、マンガン等の
無機栄養源、その他、を適宜含んだものが適当である。

培地のｐ）（４６〜９程度、好ましくは７〜８程度、培
養温度は加〜訂℃、好ましくはδ〜３０’Ｃ程度で、こ
の培養物を水和しようとするニトリルの存在下（培養物
中の該ニトリル濃度は０．５〜２重量シ程度）Ｋ行なっ
てもよいことは前記したところであるが、より好ましい
方法は、この培養物から一体を分離して（たとえば、遠
心分離による）水、生理食塩水その他の水性媒体に分散
させ、これに対象ニトリルを添加して水和反応を行なわ
せることである。

この好ましい実施態様でのニトリルの水和は、微生物菌
体０．１〜５重量シおよびニトリル０．５〜２重ｆ％程
度を含む水性分散液を温度０〜２０℃程度、好ましくは
θ〜ｌｓ℃程度、ｐＨ６〜９＠度好ましくは７〜８１！
度、で１〜３０時間程度反応させる。

消費される二）リルはこれを連続的または間歇的に補充
して反応液中の濃度が上記の範囲内に維持されるようＫ
するのが望ましい。声価を上記範囲内に維持するために
は適当な緩衝系を使用するのが好ましい０本発明で使用
する微生物は生成したアミドをさらに水和させる能力が
低いが、反応系のｐＨが過度Ｋｌ！性またはアルカリ性
となると加水分解が進んでカルゼン陵たとえばアクリル
域が生成しやすくなる０反応温度は一般に上記の範囲が
適当であるが、ニトリルを補充して水和反応を長時間（
たとえば５時間以上）実施するようた場合には５℃以下
の温度が適当である。

所定時間の水和の後で、ニトリルははｙ　ｉｏｏ％の転
換率で対応するアミドとなって、高濃度で反応液中に蓄
積される０反応液からのアミトリ採取は、合目的的な任
意の方法に従って行なうことができる。丁なわち、たと
えば、反応液から菌体な遠心分離等圧よって除き、活性
炭、イオン交換樹脂等圧よる処理によって着色物質、不
純物等を除去したのち、減圧清縮丁れば、目的のアンド
たとえばアクリルアミドの結晶が得られる。

３、［用する微生物１）　　Ｍの種類および菌学的性質本発明で使用する微生物は、シュードモナス属またはア
クネトノ９クター属に属する前記対象ニトリルの水和に
よる対象アミド生産−である。

このような微生物の具体的な株の例を挙げれば、シュー
ドモナス・クロロラフイスＢ　２３（Ｐ、　ｃｈｌｏｒ
　−ｏｒａｐｈｉｓ　Ｂ２３　）　Ｃ以下、Ｂ２３と略
称する）、シュードモナスｓｐ、Ｐｓ　ｌ　（Ｐ、　ｓ
ｐ、ｐｓ　１　）　（以下、Ｐ８１と略称″″ｆる）、
アシネトバクタ−ｉｐ、　ＢＧ　１３およびＢＣｌ２（
Ａ、　ｉｐ、　ＢＣｌ２およびＢＣｌ２）（以下、それ
ぞれＢＣｌ２およびＢＧ　１６と略称する）がある。

これらの微生物の菌学的性質のおもなものは、下記の通
りである。

２）寄　託これらの微生物は、工業技術院微生物工業技術研究所に
下記の番号で寄託されている。

菌株　　寄託番号　　寄託臼Ｂ２３　　　　徹工研曹寄第６２２０　　昭和圀年１１
月ノロ日Ｐ８１　　　　　　　同　　第６２２１　　　
　　同　　上ＢＧ１３　　　　　　同　　＠６２２２　
　　　　　同　　上ＢＧ１６　　　　　　同　　第６２
２３　　　　　同　　上４、実験例実施例１１）培　養１２３株を下記の条件で培養した。

（１）培　地デキスト、リン　　　　０．５　　％に、ＨＰＯ４０，２％ＭｇＢＯ，−７Ｈ，ＯＯ，０２％イソブチロニトリル　　　０．２　　％ＮａＣ１０，１
％声　　　　　　　　　　　７．０（２）培養条件　　公℃／３日間２）アクリロニトリルの水和得られた培養液をそのまへ酵素源として利用して、アク
リロニトリルをそこへ間歇的に添加してその水和を行な
った。

反応はアクリロニトリルの添加時から０〜４℃で行ない
、１りＩＪ　Ｅｌ　＝　）リル濃度が０．４Ｍとなるよ
うにアクリロニトリルの添加を続けた。

反応開始後あ時間で約ＩＱＯｇ／ｊ　のアクリルアミド
が生産された。アクリルア＜Ｆの収率ははｙ９９％であ
り、副成物としてのアクリル酸は添加したアクリロニト
リルの０．４％に丁ぎなかった。

反応液からのアクリルアミドの単ｌｌｌ１は、反応液を
凍結乾燥してからメタノールによる抽出に付し、メタノ
ール抽出物を濃縮して結晶を析出させることにより行な
った。得られる結晶をメタノールから再結晶後、無色の
板状結晶として得られたものを、融点、元素分析、ＮＭ
Ｒ，およびＩＲＫよりアクリルアミドと同定した。

実施例２１）培　養実施例１の場合と同じであった。

２）アクリロニトリルの水和得られた培養液から菌体を分離して水洗し、乾させてな
る休止菌体分散液にアクリロニトリルを連続的に添加し
てその水和を行なった。

反応は０〜４℃で行ない、アクリロニトリル濃度が０．
４Ｍとなるようにアクリロニトリルを間歇的に添加した
。

反応開始後７．５時間ではｙ直線的に４００ｇ／ｌのア
クリルアミドが生産された０反応はまだ十分圧進行する
ようであったが、この時点で反応液が粘稠となったので
反応を停止した。

アクリルアミド収率ははｒ９９％であり、副成物として
のアクリル酸は添加したアクリロニトリル０．７％程度
にすぎなかった。

なお、生成アクリルアミドの回収および同定は、実施例
１の場合と同様に行なった。

実施例３８２３株におけるニトリルヒドラターゼの基質特異性を
菌体法で検討した。

ｉｌｌ　　菌体の培養実施例１の場合と同じであった。

（２）ニトリルの水和得られた培養液から菌体な分離し℃水洗し、下記の条件
で反応を行なつ隔反応液は、１ｍｌである。

基質のニトリル　　　　３００μモルリン酸カリウムノ々ツファ−ｐＨ７，０／１００μモル
菌　　体　　　　　　　　　１０　ｍｇ　（乾燥菌体と
して）温　　度　　　加℃ 反応時間　　　１時間得られた結果は、下表に示す通りであった。

アセトニトリル　　　　０．１１　　　３１プロピオニ
トリル　　　　０．４１　　　１１７アクリロニトリル
　　　　０．３５　　　１００メタクリ四ニトリル　　
　　０．０８　　　　２８ｎ−ブチロニトリル　　　　
０．２０　　　　５フイソブチ四ニトリル　　　　０．
１８　　　　５１本単ｖｍ１　１　ｍｇの菌体が１分間
に１μモルのアクリルア４１’を生成する活性を１単位とした。

実施例４本実施例はＢＺ３．、Ｐ８１％ＢＧ１３およびＢＧ　１
６株について、アクリロニトリルの水和反応の比較を行
なったものである。

ｉｌｌ　　１体の培養実施例１の培地に、さらに酵母エキスを０．０１％添加
した以外は実施例１と同様に各菌体の培養を行なった。

（２）アクリロニトリルの水和得られた培養液から菌体を分離して水洗し、下記の条件
で反応を行なりも反応液は１ｍｌである。

アクリロニトリル　　　　　３００μモルリン酸カリウ
ムノ々ツ７アー　　ｐＨ７，０／１００μモル菌　　体
　　１０　ｍｇ　（乾燥菌体として）温　　度　　１５
℃ 反応時間　　２および４時間得られた結果は、下表に示す通りであった。

手続補正書昭和５７年１り／什凹特許庁長官　　着　杉　和　夫　　殿１、事件の表示昭和５６年特許願第１１１４６８８号２、発明の名称ア々ｒの生物学的製造法３、補正をする者事件との関係特許出願人７、補正の対象＠細書の「特許請求の範囲」および「発明の詳細な説明
」の欄　　　　　　　　　ｌ≦：〉＼８、補正の内容（１）　　％許請求の範囲の欄を別紙の通り補正する。

（２）明細書第３頁、第５〜６行の「またはアシネト７
セクター属」を削除する。

（３）同第３頁、１ｇ１３〜１４行の［またはアシネト
オクタ−（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属」を削除す
る。

（４）同第８ｊｊ、第１θ行の「アシネト７セクター属
」を削除する。

（５）同第８頁、第１４〜１８行の「（以下、１１２Ｂ
と略称する）、シュードモナス・・・がある。」を「（
以下、Ｂ２３と略称する）およびシュードモナスｉｐ。

ＰＯ２（Ｐ、ｓｐ、ＰＯ２）　（以下、ＰＯ２と略称す
る）がある。」Ｋ補正する。

記載）を削除する。

（７）同第化頁、第７行のｌ’−ＢＧ１３　　同　＄　
６２２２　　同上」および第８行の「ＢＧ１６　　同　
第番２２３　　ｆｊｌ上」を削除する。

（８）同第１６頁、下から第７行の「本実施例はＢ２３
、Ｐ８１、ＢＧ　１３および１０００株」を「本実施例
はＢ２３およびＰ８１株」Ｋ補正する・（９）第１７頁の表の下２行（すなわちＢＧ　１３およ
びＢＣｌ２に関する記載）を削除する。

１、炭素数２〜４のニトリルを微生物の作用により水和
して対応するアζＦＫ変換させる方法において、使用す
る微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａ　
）属に属し、骸ニトリルを水和して対応するアミドに変
換する能力を有するものであること、を特徴とする、ア
ミドの生物学的製造法。

２、微生物の培養液にニトリルを添加してこれを対応す
るアンドに変換させる、特許請求の範囲１．１項記賊の
方法。

３、微生物の培養液から分離した画体の水性分散液にニ
トリルを添加しくこれを対応するアミドに変換させる、
特許請求の範囲＠１項記載の方法。

４、ニトリルの添加を連続的または間歇的に行な５％特
許請求の範囲第２〜３項のいずれかに記載の方法。

５、ニトリルが７クリロニトリルであり、微生物がシュ
ードモナス・クロレラフイス１２３（ＩＩ工研曹寄第６
２２０号）である、特許請求の範囲第１〜４項のいずれ
かに記載の方法。

手続補正書昭和６７年１１月９ρ日特許庁長官　　若　杉　和　夫　殿１、事件の表示昭和５６年特許願第１８４６８８号２、発明の名称アミドの生物学的製造法３、補正をする者事件との関係特許出願人山　　　１）　　秀　　　明７、補正の対象明細書の「％＃Ｖ−請求の範囲」および「発明の詳細な
説明」の掴　　　　　　　　　　　−７ζ丁ン連、８、
補正の内容（１）特許請求の範囲を、別紙の通りに補正する。

（２）明細書第１２頁第４〜６行を、下記の通りに補正
する。

シュウトモナスｓｐ、　　同第１８８号　　　同　　　
上Ｐｇ　　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｊ
特許請求の範囲１、炭素数２〜４の二）　！３ルな微生物の作用により
水和して対応するアミドに変換させる方法において、使
用する微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　）属に属し、誼ニトリルを水和して対応するアミド
に変換する能力を有するものであること、を特徴とする
、アミドの生物学的製造法。

２、微生物の培養液にニトリルを添加してこれを対応す
るアミドに変換させる、特許請求の範囲第１項記載の方
法。

３、微生物の培養液から分離した菌体の水性分散液にニ
トリルを添加してこれを対応するアミドに変換させる、
％ＩＦＦａｉ！求の範囲第１項記載の方法。

４、ニトリルの添加を連続的または間歇的に行なう、％
１ＦＦｉｔｉｉ求の範囲第２〜３項のいずれかに記載の
方法。

５、ニトリルがアクリロニトリルであり、微生物がシュ
ードモナス・クロロラフイスＢ２３（微工研条寄第１８
７号）である％特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに
記載の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１、炭素数２〜４のニトリルを微生物の作用により水和
して対応するア々ドに変換させる方法において、使用す
る微生物がシュードモナス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　）属またはアシネト／饗りター（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ　）属に属し、咳ニトリルを水和して対応する
ア建ＰＫ変換する能力を有するものであること、を特徴
とする。アミドの生物学的製造法。２、微生物の培養液に＝　）　リルを添加してこれを対
応するニトリルに変換させる、特許請求の範囲第１項記
載の方法。３、ｇ生物の培養液から分離した菌体の水性分散液［二
）リルを添加してこれを対応するニトリルに変換させる
、特許請求の範囲第１項記載の方法。４、＝）ＩＪルの添加を連続的または間歇的に行なう、
特許請求の範囲第２〜３項のいずれかに記載の方法。５、ニトリルがアクリロニトリルであり、微生物がシュ
ードモナス・り四ロラフイスＢ２３（微工研菌寄第６２
２０号）である、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか
に記載の方法。