SU793408A3

SU793408A3 - Способ получени азотсодержащего полисахарида, промотирующего чувствительность к лекарствам у бактерий, устойчивых к антибиотикам

Info

Publication number: SU793408A3
Application number: SU782602548A
Authority: SU
Inventors: Есикуми Тикао; Омура Есио; Хотта Тецуя
Original assignee: Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся (Фирма)
Priority date: 1977-04-13
Filing date: 1978-04-12
Publication date: 1980-12-30
Also published as: IT1095587B; NL170593B; JPS53127813A; CS226174B2; NL170593C; SE7804110L; CH638983A5; GB1572387A; DK162678A; FR2387037B1; AU519028B2; DK155916B; IT7822280A0; JPS5639288B2; FR2387037A1; MX5409E; DD138276A5; HU179217B; SE446818B; AU3501078A

Description

Вещество представл ет собой поро кообразный к коричневый по цвету ма териал, который не имеет определенн температуры плавлени и карбонизует при сильном нагревании. Оно не раст вор етс в органических растворител х , таких как пиридин, хлороформ, |бензол, гексан и т.д., но раствор етс в воде. Инфракрасный спектр этого вещест ва характеризуетс наличием полос п глощени в области 3600-3200 см , 2920-2900 см 1660-1610 см 1460 1410 см , 1360 см-, 1230 cм- 1150 1080 см-, 1060-990 см 925 смЧ 890 см- 840 см 755 см и Таким -образом, в ИК-спектре азотсодержащего полисахарида имеетс полоса поглощени в области 890 см, характерна дл |Ь-св зей глюкана в . харидной части молекулы, и друга п лоса поглощени в области 840 см пот-лгнпрни и пйп г-ти ЙЛП г-м характерна дл ck-св зей глюкана. Элементарный анализ азотсодержащего полисахарида показывает -следую щий состав.вещества: содержание угл рода от 42 до 46%, содержание водорода от 5,3 до 7,0% и содержание аз та от 0,5 до 8,0%. Все остальное по балансу приходитс на долю кислорода . Оптическое вращение азотсодержащ го полисахарида, определенное стандартным методом и выраженное через величину удельного оптического вращени dv варьируетс от О до 50 . Азотсодержащий полисахарид дает положительную реакцию с фенолсерной кислотой, положительную реакцию - с антронсерной кислотой и положительную реакцию с нингидрином. Тот факт что это вещество дает положительные цветные реакции с указанными реаген тами, вл етс свидетельством того, что активное вещество включает в своем составе сахаридную и белковую часть, т.е. вл етс гликопротеином Дл определени углеводного состава азотсодержащего полисахарида образец вещества гнцролизуют метанольным раствором хлористоводородной (сол ной ) кислоты и, после триметилсилили ровани известным методом, анализируют гидролизат - методом газо-жидкостной хроматографии. Результаты анализа показали, что полисахарид состоит в основном из глюкозы, а так же содержит маннозу, галактозу, ксилозу и фукозу. Аминокислотный ана лиз белковой части азотсодержащего п лисахарида позволил определить, что белкова часть вещества включает в своем составе аспарагиновую кислоту треонин, серии, глутамйновую кислоту , пролин, глицин, аланин, цистин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, триптофан, фенилаланин, лизин, гистидин и аргинин.Основна дол среди этих аминокислот приходитс на аспарагиновую кислоту, треонин, глутамйновую кислоту, глицин, аланин, валин и лейцин. Суммарна дол этих аминокислот от общего аминокислотного состава составл ет более 70%. Исследование азотсодержащего полисахарида методом, дерного магнитного ,резонанса провод т с целью определе- ни отношени между углеводной (сахаридной ) и белковой част ми в указанном веществе, а также дл . уточнени типа св зей в углеводной части этого вещества . Спектр протонного магнитного резонанса (ИМР-спектр) образца азотсодержащего полисахарида снимают на ЯМР-спектрометре с напр женностью магнитного пол в 100 мегагерц, использу в качестве растворител т желую воду, а в качестве внутреннего стандарта 2,2-диметил-2-силанопентан-5-сульфонат . В спектре ЯМР исследуемого вещества имеютс полосы поглощени в области 0,9-0,2-1,,2 миллионных долей, 2,0±0,2 миллионных долей, 4,5tO,2 миллионных долей, 4,,2 миллионных долей, 5,,2 миллионных долей и 5,,2 миллионных долей соответственно, в спектре видна также широка полоса поглощени в области 3,4-4,4 миллионных долей . Белкова компонента вещества изучена , исход из допущени , что область от 0,5 до 2,5 миллионных долей ..св зана с интенсивностью сигналов : ротонов белковой части образца, а область от 2,5 до 6,0 миллионных долей св зана с интенсивностью сигналов протонов углеводной (сахаридной) части образца. При этом дол белковой части была оценена менее чем в 40%. Исход из того, что область. от 4,4 до 4,9 миллионных долей св зана с /Ь-св з ми в сахаридной части образца, а область от 4,9 до 5,4 миллионных долей св зана с ч-св з ми, удалось определить, что их отношение, т.е. отношение числа fc-св зей к числу d. -св зей в полисахаридной части гликопротеина варьируетс от 85/15 до 40/60. Молекул рный вес азотсодержащего полиса}сарида, измеренный методом ультрацентрифугировани , варьируют , дл различных образцов исслед емого вещества в диапащоне от до 300000 . Испытани азотсодержащего полисахарида на острую токсичность провод т на мышах линии ICR-ЗСЬ, имеющих возраст от 4 до 5 недель и вес щих от 21 до 24 граммов, и на крысах линии Донриу, имеющих возраст от 4 о 5 недель и вес щих от 100 до 150 граммов. Азотсодержащий полисахарид раствор ют в физиологическом солевом растворе и вйод т животным внутривенно , подкожно, внутрибрюшинно и иерорально. Общие симптомы воздейс ви вещества на подопытных животных гибель животных и изменение их вес наблюдают в течение 7 дней, после чего животных забивают и провод т аутопсию (вскрытие трупов). В резу тате проведенных испытаний не было зафиксировано ни одного случа гибе |ли животных, ни на крысах, ни на м ШАх, даже при введении им самой высокой дозы из тех, что показаны на приведенной ниже таблице 1. В табл. 1 представлены вводимые дозы азотсодержащего полисахарида. Таблица 1300 1300 Внутривенный 5000 5000 Подкожный Внутрибрюишнный 5000 5000 Пероральный 20000 2000 Внутривенный 600 600 Подкожный 5000 5000 Внутрибрюшинный 5000 5000 Пероральный 20000 2000 К числу антибиотиков, которые пр вл ют свое действие против резистентных к лекарственных препаратам бактерий в комбинации с азотсодержа щим полисахаридом, относ тс , антибиотики , вьщеленные из плесеней, пл невых грибов, бактерий, актиномицетов и других микроорганизмов. Типич ные примеры таких антибиотиков пере числены ниже: Пенициллин &(ниже он сокращенн обозначен как PG) Стрептомицин (SM) Канамицин (КМ) Хлорамфеникол (СР) Тетрациклин (,ТС) Эритромицин (ЕМ) Аминобензилпенициллин (АВРС) Цефалоридин (СЕ) колистин (CER) Эффект, вызываемый азотсодержащим полисахаридом, состоит в промотировании (стимулировании) чувствительности к лекарствам у следующих резистентных к лекарственным препаратам (антибиотикам) бактерий: Es che г i ch i а со 1 i Streptococcus faecalis Stcephy1ococcus aureus tnterobacter aerogenes Salmonella enteritides Shigella Sonnei Klebsiella Ptoreus mirabilis Pseu domona ч . r i no sa Действие азотсодержащего полисахарида по стимулированию чувствительности к лекарствам у резистентных к антибиотикам штаммов бактерий подтверждено следующим образом. Резистентные к антибиотикам штаммы бактерий получены с помощью метода , описанного ниже, при выращивании культуры в градиентной чашке (в чашке Петри с концентрационным градиентом -соответствующего антибиотика ). Чашки Петри с агаровой средой и с концентрационным градиентом лекарсвенного вещества в диапазоне от 10 до 100 микрограмм/мл подготавливают надлежащим образом и используют дл инокул ции бактерий каждого штамма методами штриховой разводки или мазка . Эти чашки инкубируют при 37°С в течение нескольких дней и колонии бактерий, сформировавшиес в области высокой концентрации антибиотика, отдел ют и снова инокулируют аналогичным образом в другие чашки. Подобную операцию повтор ют несколько раз с целью получени бактериальных штаммов , резистентных к cooтвeтcтвyJOщим лекарственным веществам (антибиотикам ). Лекарственную чувствительность штаммов, резистентных к антибиотикам , и первоначальных штаммов тех же бактерий (чувствительных штаммов) сравнивают путем нахождени минимальной ингибирующей концентрации, т.е. минимальной концентрации соответствующего лекарственного соединени , ингибирующей рост бактерий ( чиже эта величина сокращенно обозначена как МИК) . Были приготовлены двойные разбавленные системы каждого лекарства, которые смешивают с агаровой средой дл вливаний с целью подготовки чашек с агаровой средой. Затем отбирают петелькой образец каждого штамма, который культивируют при 37°С на Трипто-соевом бульоне в течение 18 ч, и нанос т мазком на каждую чашку. После культивировани в течение 18 ч при температуре 37°С в каждой чашке провер ют степень роста инокулированного бактериального штамма. Дл того, чтобы увидеть, насколько измен етс минимальна ингибирующа концентраци Смик) дл каждого резистентного штаг1ма при комбинированном использовании полисахарида и соответствующих антибиотиков (тех, которые перестали действовать на определенные бактериальные штаммы), провод т процедуру, аналогичную вышеописанной , с тем исключением, что в системы добавл ют, с целью получени соответствующих комбинаций, от 10 до 1000 микрограммов/мл азотсоержащего полисахарида, и величину ИК определ ют в соответствии с вышеупом нутым методом, основанном на использовании чашек с агаровой средой и концентрационным градиентом антибиотиков.

При этом наблюдаетс отчетливо выраженный эффект - величина минимальной ингибирующей концентрации СМИК) уменьшалась в результате прибавлени азотсодержащего полисахарида по крайней мере на половину по сравнению с уровнем, который фиксировалс до прибавлени , или даже еще ниже. Количество прибавл емого азотсодержащего полисахарида состав л ет более 10 микрограммов/мл, а в предпочтительном варианте - более 100 микрограммов/мл. Величину рН среды поддерживают при этом на уровне 7,2-0,1 с тем, чтобы на определ емую величину МИК не оказывало вли ние рН среды. Кроме того, использу метод культивировани в услови х разбавлени агаровой среды, азотсодержащий полисахарид сам по себе не обладает антибактериальной активностью против бактериальных штаммов, отобранных дл проведени испытаний Терапевтический тест по воздействию на инфекционные заболевани провод т следующим образом. Подопытной мыши ввод т внутрибрюшинно, с целью заражени , 1x10 клеток лекарственнорезистентных бактерий. Через 1-3 ч после этого мьошам ввод т либо внутрибрюшинно , либо перорально от 10 до 1000 миллиграммов на килограмм веса тела мыши соответствующего лекарства и от 1 до 10 миллиграммов/кг азотсодержащего полисахарида Наблюдение за подопытными животными продолжают в течение 7 дней после введени с целью изучени их выживаемости и оценки эффективности действи азотсодержащего полисахарида. Было обнаружено, что эффективна доза вещества насто щего изобретени в предпочтительном варианте составл ет более 1о мг/кг при внутрибрюшинном введении, и более 100 мг на килограм при пероральном введении. Это было выше, чем 40%.

Азотсодержащий полисахарид способен усиливать терапевтический (лечебный ) эффект лекарственных препаратов не толькр в опытах in vitrojHO также и в химиотерапии инфекционных заболеваний, т.е. в опытах in vivo с р дом резистентных штаммов болезнетворных бактерий.

Азотсодержащий полисахарид про вл ет также чрезвычайно низкую острую токсичность и может вводитьс в организм различными пут ми, в частности посредством внутрибрюшинных инъекций, путем подкожного введени , пероральным путем и ректальным путем (через пр мую кишку). Таким образом, азотсодержащий полисахарид может быть смешан с антибиотиком пр

проведении курса лечени этим лекарственным препаратом или же может вводитьс в организм отдельно.

Когда азотсодержащий полисахарид предполагаетс вводить пероральным путем и его оформл ют в виде таблеток гранул, порошков, капсул и других лекарственных форм дл перорального введени , рецептура любого такого препарата может содержать различные добаки того типа, которые обычно используютс при получении лекарственных препаратов и, в частности св зующий агент, эксципиент С воспринимающее средство), смазывающее вещество ( замасливатель ), дезинтегрирующий агент, смачивающий агент и т.д. Когда азотсодержащий полисахарид используетс в виде жидкости дл перорального введени , он может быть приготовлен в виде жидкого лекарственного средства дл внутреннего применени , такого , например, как взбалтываема микстура , суспензи , эмульси , сироп и т.д., или же может быть получен в виде сухого продукта,.который подвергаетс растворению непосредственно перед использованием. Такие жидкие препараты могут также содержать в своем составе различные добавки и/или консерванты того типа, который обь1чно используетс при получении лекарственных препаратов. Растворы дл инъекций могут содержать в качестве добавок вещества-стабилизаторы, буферные (забуферивающие) вещества, консерванты , вещества дл создани изотоничности раствора и т.п. Такие растворы дл инъекций могут быть расфасованы в ампулы однократного использова ни , рассчитанные на введение определенной дозы активного ингредиента за один раз или во флаконы содержащие не -одну, а несколько доз препарата. Кроме того, вышеупом нутые композиции (рецептуры) могут выпускатьс в виде водного раствора и или суспензии, а также в виде раствора или эмульсии в масл ном или водном разбавителе при условии, что активный компонент может быть в виде порошка, который раствор етс в таком разбавителе, например, в стерилизованной непирогенной воде, непосредственно перед использованием. В случае , когда полисахарид используетс в виде мази или средства дл втирани , он может содержать соответствующую масл ную или жировую основу, эмульсивную основу, водорастворимую основу,, консервант и другие подобные вещества и/или добавки.

Пример. Приготавливают жидкую питательную среду следующего состава, г:

Пептон 5

Дрожжевой экстракт 3

,3

К2.НРО/4.0,3 . SO,0,3 Глюкоза50 ВодаДо 1 литра рН:б , О Аликвоту этой среды объемом 150 миллилитров ввод т в каждую из 100 конических колб емкостью 1 литр, и после закупорки каждой колбы ватной пробкой жидкую среду подвергают сте рилизации в течение 30 мин при 120 и затем внос т в каждую колбу (инок лируют )посевной материал - отдельн культивированнный на скошенном агар мицелий базодиомицета Coriolus versicolor (Фр.), штамм Quel СМ-105, после.чего осуществл ют стационарну культивацию инокул та в течение 20-дневного периода при температуре диапазоне от 25 до . Полученный таким образом культуральный шламм (бульон высушивают в барабанной су шилке, в результате чего получают 451 грамм сухого продукта. 150 грамм этого сухого продукта измельчают и экстрагируют 0,1 н раствором гидро окиси натри при температуре 95-98°С при обычном давлении, в течение 3ч использу дл этой цели экстрактор из нержавеющей стали. Полученный та ким образом щелочный экстракт нейтрализуют , подвергают фильтрации и п лученный фильтрат концентрируют затем до остаточного объема, равного 500 миллилитрам. Этот концентрирова ный раствор помещают затем в целлофановый мешочек и подвергают диализу против проточной воды в течение 90 ч Полученный диализат концентрирую при пониженном давлении и концентри рованный раствор подвергают затем, распылительной сушке, в результате, которой получают 19,5 г порошкообра ного продукта. Дл изучени свойств этого порошк образного продукта небольшую его порцию подвергают элементарному анализу с использованием С, Н, N-анализатора (CHN-COCORDER), в результате чего найдено, что в состав вещества входит 42,1% углерода, 6,0% водорода и 5,8% азота. Определение удельного оптического вращени образца получен ного продукта производ т дл О,25%ного водного раствора этого вещества с использованием пол риметра VANAKO -OR-50. Измерени показали, что удельное оптическое вращение этого продукта равн етс +12. Дл того, чтобы узнать углеводный ( сахаридный) состав этого продукта, образец весом 10 миллиграммов прибавл ют к 3%-ному метанольному раствору хлористоводородной кислоты и метанолиз провод т в течение 16 ч пр температуре . После нейтрализации сол ной кислоты карбонатом серебра реакционную смесь профильтровывают при комнаткой температуре и полученный фильтрат сначала концентрируют , а затем упаривают досуха. Полученный при этом твердый продукт раствор ют в 0,5 миллилитрах пиридина , к раствору прибавл ют 0,2 милли;питра гексаметилдисилазана и 0,3 милг лилитра триметилхлорсилана и реакционную смесь оставл ют сто ть при комнатной температуре в течение 30 мин дл завершени реакции триметилсилилировани . Продукт раствор ют затем в хлороформе, и после отмывки избытка реагента и дегидратации фильтрат упаривают досуха. Затем этот прюдукт раствор ют в четыреххлористом углероде и подвергают анализу методом газо-жидкостной хроматографии . ГЖХ-анализ показал, что продукт состоит из 70,5% глюкозы, 3,8% галактозы, 10,3% маннозы, 5,4% ксилозы и 10,0% фукозы. Дл определени аминокислотного состава белковой части порошкообразного продукта его образец подвергают аминокислотному анализу в соответствии со стандартным методом Мура и Штейна. В результате аминокислотного анализа получают следующий состав: 15% аспарагиновой кислоты, 8% треонина, 6% серина, 14% глутаминовой кислоты, 4% пролина, 8% глицина, 10% аланина, 4% изолейцина, 6% лейцина , 1% тирозина, 4% фанилаланина, 2% триптофана, 2% лизина, 3% аргинина , 4% аммиака и 1% N-глюкозамина, а также следы гистидина. Дл исследовани продукта методом ЯМР-спектроскопии в качестве растворител используют т жел17ю воду, а в качестве внутреннего стандарта 2,2-диметил-2-силанопентан-5-сульфонат , причем дл устранени любого возможного вли ни на результаты анализа остаточного количества легкой воды , содержащегос в т желой воде, используют величины, которые подверглись коррекции, проделанной на основе предполагаемой кривой Лоренца. В этих услови х отношение доли углеводной части вещества к его белковой части было.определено, исход из допущени , что поглощение в области 0,5-2,5 миллионных долей обусловлено протонами белковой части продукта, тогда как поглощение в области от 2,5 до 6,0 миллионных долей относитс к протонам углеводной (сахаридной) части продукта. Полученное отношение углеводной части к белковой равно 89:11. Кроме того, полоса поглощени 4,14 ,9 миллионных долей св зана с -св з ми сахаридной части, а полоса поглощени в области 4,9-6,0 миллионных долей св зана с ч-св з ми сахарида , анализиру ЯМР-спектр продукта , определ ют также отношение долиfe-св зей к доле д -свчзей в полисахаридной части продукта. Это отношение (5/г/.) равно 65:35. Молекул рный вес исследуемого продукта определ ют посредством ультрацентрифугировани его раствора, причем измерение провод т с использованием седиментационно-равновесного мерода и синтетической граничной модепи картинки). Дл этой цели используют интерференционную оптическую сис тему, причем измерени провод т в следующих услови х: концентраци образца в растворе 0,3%; растворитель М/10 KCti температура 25°С; столбик жидкости высотой 1,7 миллиметра; скорость вращени ротора 22000 об./ми продолжительность измерени 5 ч. Полученное значение среднего молекул рного веса вещества равно 100000. Испытани продукта на эффективность стимулировани лекарственной чувствительности у резистентных к лекарственным препаратам бактерий, которые , в частности, приобретают резистентность к антибиотикам, провод т следующим образом. Образцы резистентных к лекарственным препаратам бактерий получают согласно вышеупом нутой методике культивировани бактерий в чашках с концентрационным градиентом антибиотиков в агаровой среде при использовании бактерий Staphy1OCOCCUS aureus. Strep tococcus faecaiis, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumonia), Pseudomonas aeruginosa. Минимальные ингибирующие концентрации {МИК) антибиотиков дл исходных бактерий и тех бактерий, которые приобрели резистентность (устойчивость) к лекарствам, приведены в, табл. 2. Таблица 2 Бактерии Продолжение табл. 2 En te robacte r aerogenes Sa1moneI 1 a enteritidis Shigella sonnei Klebs i el 1 a pneumon i ae Proteus mirabi 1 i S Pseudomonas aeru-CL g i nosa

coll PC12,5100

SM3,1lOOC

KM6,3200

CP1,650

TC3,125

CER3,125

EM100

Величины минимальной ингибирующей концентрации (МИК) пенициллина (РС) вычислены, исход из допущени , что 1,667 Е (единицы ) 1 мг.

Величины МИК цефалоридина CCL) вычислены , исход из допущени , что 30000 Е (единиц) 1 мг.

Дл того, чтобы увидеть изменение величины минимальной ингибирующей концентрации (МИК) дл соответствующих , резистентных к лекарственным препаратам штаммов бактерий при совместном использовании предлагаемого вещества и различных антибиотиков (те которые использовались дл выработки резистентности у бактерий), азотсодержащий полисахарид прибавл ют в культуральную среду в количествах от 10 до 1000 микрограммов/мл и величины МИК получают в соответствии с методом культивировани в чашках с агаровой средой. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Staphy1ococcus

aureus

PC-resistant

CP- t reptococcus faeca1i s TC-resistant

Escherlchia co

KM 1000 100

CP 100 12,5

TC 100 . 12,5

Klebsiel la pneumon i a 1 SM-res i stant

CP 1000 50

двРС 10 25

CL 1000 200

. Вещество насто щего изобретени

прибавл ли в культуральную среду. Вещество насто щего изобретени не прибавл ли в культуральную .

Таблица

1,6

г/мл 12,5 25 6,3 3,2 25 12,5 3,2

6,3

25

12,5

3,2 6,3

12,5

100

Пример 2. Испытани по вы в 1ению терапевтического (лечебного) воздействи на инфекционные эаболева ни провод т на п ти группах самцов

мьоией линии ICR-ICL (каждый из которых весил 22il грамм), причем кажда группа состоит из 10 мышей, при использовании резистентного к пенициллину G штамма бактерий Streptococcus , полученного в примере 1.Этот резистентный к пенициллину G-штамм aureus, который культивировалс на Трипто-соевой агаровой среде при температуре 37°С в течение 18 ч, суспендируют в Трипто-соевом бульоне, содержащем 5% муцина, и 0,25 миллилитра такой суспензии ввод т fинокулируют ) внутрибрюшинно каждой подопытной мыши. Заражение регулируют таким образом, чтобы кажда мышь получала в инокул те 5x10 клеток бактерий. Через два часа после заражени (инокул ции ) мышам ввод т внутрибрюшинно пенициллин Q- в дозе 2,5 X 10 единиц/кг веса тела мышей и 5 X 10 Е/кг соответственно. Одновременно мышам ввод т внутрибрюшинно азотсодержащий полисахарид, полученный в соответствии с методикой примера 1, в дозе, равной 100 мг/кг веса тела. Обработанные таким образом мыши наход тс под посто нным наблюдением каждый день в течение 7 дней после введени с целью определени выживаемости зараженных мышей . Комбинированное использование антибиотика и азотсодержащего полисахарида (NP/) может существенно улуч1иить лечебное действие пенициллина G- за счет повышени чувствительности к пенициллину С} резистентных к нему in vivo бактерий.

Пример 3. Аналогичный тест на терапевтическую эффективность в лечении инфекционных заболеваний проведен на, п ти группах самцов мышей линии ICR-ICL (кажда мышка весит грамм, причем кажда групп подопытных животных состоит из 10 мшей ) при использовании резистентного к тетрациклину штамма Е.соП и азотсодержащего полисахарида, полученных в соответствии с методикой, описанной в примере 1. Дл заражени каждой мышки ввод т внутрибрюшинно 0,25 мл Трипто-соевой бульонной суспензии, включающей 5% муцина резистентных к тетрациклину бактери приготовленной как описано в примере 1. Инокулирование регулируют таким образом, чтобы кажда мъаика полчила внутрибрюшинно 5 к 10 клеток бактерий. Через 2 ч после инокул ции мышам ввод т перорально тетрациклин в дозах 80 мг/кг веса тела и 160 мг/кг соответственно. Одновремено мышам ввод т пероральным путем азотсодержащий полисахарид в дозе 100 миллиграмм/кг. Комбинированное

использование азотсодержащего полисахарида и тетрациклина способно вызывать значительно более .высокий лечебный эффект, чем использование одного тетрациклина. Кроме того, поскольку практически один и тот же эффект может быть достигнут как при пероральном введении вещества, так и при внутрибрюшинном его введении, вещество может найти самое широкое применение вследствие его высокой эффективности.

Пример 4. Резистентный к пенициллину G штам Staphy1OCOCCUS aureus инокулируют п ти группам (по 10 мышей в группе) мышей-самцов линии ICR-ICL, каждый из которых и 1eeт вес 2211 грамм, с нагрузкой 5 х 10® клеток на каждую подопытную мьплку, следу методике примера 2. После этого четырем группам мышей ввод т внутрибрюшинно 2,5 X Ю Е/кг пенициллина G и соответственно 1, 10, 100 и 1000 мг/кг азотсодержащего полисахарида (того же, что используют в примере 1). Ежедневные наблюдени за подопытными мышами велись в течение 7 дней после введени указанных препаратов .

Пример 5. Осуществл ют аналогичный опыт по лечению инфекционных заболеваний с использованием б групп из самцов-мышей ICR-ICL.причем кажда группа, состо ща из 10 мышей , инокулированных клетками устойчивых к тетрациклину бактерий E.Coli в количестве 5x100000000 клеток на мьппь, с использованием процедуры примера 3.

Через два часа после инокул ции ввод т тетрациклин в дозе 80 мг на .кг веса тела 1«1ыши с одновременным оральным введением азотсодержащего полисахарида , используемого в примере 1, в соответствуюодих дозах О, 10,100, 1000 и 10000 мг/кг, при этом шеста группа была контрольной. Обследование мышей проводилось ежедневно до 7-го дн .

Пример 6. Штамм СМ-151 базидиомицета Coriolus hirsutus (Фр.) (Juel (Perm . Res . I ns t . Depos i t N-FERM-P 2711) культивирутот, как в примере 1, и затем экстрагируют и очищают в соответствии с аналогичной методикой, в результате чего получают 17,5 грамма порошкообразного вещества. Свойства этого вещества следующие:

Элементарный анализ: 43,7% углерода; 6,4% водорода и 5,5% азота. 2

Удельное оптическое вращение :о(/. +30°.°

Углеводный состав: 79% глюкозы, 15% маннозы, 2% ксилозы, 4% галактозы и следы фукозы.

Содержание белка в веществе: .

Отношение сахаридных СБЯзги.Д ) : : 71/29. 5 Средний молекул рный -с : К-ГИн: .

Аминокислотный состав белковой части: 15% аспарагиновой кислоты; 9% треонина, 5% серина, 14% глутаминово кислоты, 6% пролина, 9% глицина, 9% аланина, 7% валина, 1% метионина, 5% изолейцина, 6% лейцина, 2% триптофана , 4% фенилаланина, 2% лизина, 3% аргинина, 2% аммиака, 1% глюкозамина и следовые количества цистина, тирозина и гистидина.

Полученное таким образом вещество имеющее вышеупом нутые характеристики , используют дл проведени следующего эксперимента.

По аналогии с примером 1 получают резистентный к хлорамфениколу штамм Salmonella enteritidis. Затем 0,25 миллилитра суспензии вьдиеупом нутых хлорамфеникол-резистентных бактерий в Трипто-соевом бульоне (см. пример включающем 5% муцина, инокулируют внутрибрюшинно п ти группам мы1ией (каждой мышке-), причем кажда из эти групп состоит из 10.животных. Каждой подопытной МЕЛШке ввод т 1 X 10° клеток . Через 25 ч после инокул ции мышам ввод т внутрибрюшинно по 50 миллиграмм/кг хлорамфеникола. Мышам другой группы помимо этого ввод т перорально азотсодержащий полисахарид в дозе 500 мг/кг. В группе, где мышкам вводили один хлорамфеникол , выживаемость через 5 дней после введени составила 40%, тогда как в группе, где антибиотик давали в комбинации с азотсодержащим полисахаридом , выживаемость оказалась на Уровн 80%.

Пример 7. По методике примера 1 получают резистентный к стрептомицину штс1ММ Klebsiella pneumonial 0,25 миллилитра Трипто-соевого бульона (см. пример 2), содержащего 5% муцина и указанные резистентные бактерии , инокулируют внутрибрюшинно подопытным мышам, образующим 2 группы по 10 мышей в каждой, выдержива норму пор дка 1 х 10 клеток на каждую мышку. Через 3 ч после этой инокул ции 1иышам ввод т внутрибрюшинно по 100 мг/кг стрептомицина. Мышам одной группы ввод т кроме того по 120 мг/кг азотсодержащего полисахарида , полученного в соответствии с методикой, описанной в примере 6, использу внутрибрюшинный путь введеНИН . Через 6 дней после введени выживаемость мышей в группе, где животным вводили один стрептомицин, составила 50%, тогда как в группе, где мышам вводили стрептомицин в комбинации с полисахаридом, выживаемость оказалась намного выше (около 80%),

Пример 8. О,25 мл суспензии колистин-резистентных бактерий Pseudomonas aeruginesa,культивированных в соответствии с методикой, аналогичной описанной в примере 1, в Трип0 то-соевом бульоне (см. пример 2), содержащем 5% муцина, инокулируют внутЬибрюшинно подопытным мышам-самцам линии ICR - ICR, кажда весом 22tl грамм, распределенным в 2 груп5 пы по 10 мышей в каждой, вьщержива норму введени 1 х 10 клеток на каждую мышку. Через 2 ч после инокул ции мышам ввод т внутрибрюшинно антибиотик колистин 190 мг/кг (1 микрограмм 30 единицам). Помимо

0 этого мышам одной группы ввод т также перорально азотсодержащий полисахарид, полученный по методике, аналогичной описанной в примере 6, в дозе 1500 мг/ /кг. Через 6 дней после введени вы5 живаемость мьпиой в группе, где им вводили один Kt.vnистин, составила 40%, тогда как в группе, где колистин примен лс в комбинации с предлагаемым веществом, выживаемость мьлией оказа0 лась равной 70%.

Предлагаемый способ позвол ет получить азотсодержащий полисахарид, промотирующий чувствительность к лекарствам у бактерий, устойчивых к ан5 тиьиотикам.

Форрлула изобретени

Claims

1.Способ получени азотсодержащего полисахарида, прюмотирующего

0 чувствительность к лекарствам у бактерий ,, устойчивых к антибиотикам, отличающийс том, что штамм СМ-105 Coriolus versi color (Fr) .Quel или штамм СМ-151 Coriolus

5 hirsutus (Fr) Quel выращивают в питательной среде, отдел ют мицелий, высушивают его и измельчают и экстрагируют гор чим водным растворителем .

0

2.Способ по п. 1, отличаю щ и и с тем, что в качестве водного растворител используют 0,1 н раствор гидроокиси натри .