SU884575A3

SU884575A3 - Способ получени антибиотического комплекса

Info

Publication number: SU884575A3
Application number: SU671157604A
Authority: SU
Inventors: Куинси Томпсон Роберт; Макс Старк Уильям; Евгений Хиггенс Калвин
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани(Фирма)
Priority date: 1967-05-10
Filing date: 1967-05-10
Publication date: 1981-11-23

Description

(54) СПОСОБ 1ЮЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО Изобретение относитс к микробиологической промьшшенности и касаетс получени антибиотиков. Предлагаемый антибиотический комп леке новый и способ его получени в научно-технической и патентной литературе не описан. Цель изобретени - получение антибиотического комплекса. Поставленна цель достигаетс тем что штамм Streptomyces 1елеЬгаг1и5 АТСС 17920 культивируют в глубинных услови х аэробно в питательной среде содержащей источники углерода, азо та и минеральные соли при температуре 37-43°С в течение 4-7 дней, затем В14цел ют целевой продукт в свободном виде или в виде его солей и при необ ходимости раздел ют комплекс на соетавные антибио- ические компоненты О W, Ч и С и перевод т их в соли. Новый антибиотический комплекс ха рактеризуетс наличием секи компонен тов, из которых каждый отличаетс активностью, свойственной антибиотику .. Этот комплекс, в качестве свободного основани растворим в воде и диметилсульфоксиде, слабо растворим в метаноле и нерастворим в большинКОМПЛЕКСА стае других органических растворителей , таких как ацетон, высшие спирты, дИоксан, зтилацетат, дизтиловый эфир/ ацетонитрил, метил-изобутил кетон и растворители, относ щиес к классу углеводородов. Свободное основание комплекса ycf тойчиво при пониженных температурах и температуре 37°С. Антибиотический комплекс тенебримицин содержит семь различных фак торов (компонентов : тенебримйцин Г , тенебримицнн Т; тенебримиции il , тенебримйцин UJ , тенебримйцин (V , тенебримйцин н тенебримйцин-Ё.. В комплексе, получаемом Нри обычных услови х, тенебримйцин I тенебршлицин и тенебримйцин ill присутствуют в незначительных количествах, Тенебримйцин Г входит в состав в количестве 45-50% и тенебримйцин J содержитс в комплексе а количестве около 30%, тенебримщии (у присутствует в количестве около 15-20%, атенебримйцин 7) около 10%. Тенебримйцин Т| вл етс белым твердым ве.|цествЬм. Электрометрическое титрование в водной покаэывает наличие способных титроватьс группировок, имеющих значени рН около 5,7 6,7 7,7 и8,7. Удельное вращение, определ емое в свете линии D натри при 25С, обусловленное данным фактором, равна +159°, если концентраци антибиотика равна 1%, счита на весовое количество приход щеес на единицу объема в водном растворе.. Данные микроорганизма свидетельствук1Т о том, что тенебримицин имеет приблизительно следующий процентный состав: С 46,47; Н 7,99; N 13,05 О 32,29. Молекул рный вес, по результатам титровани , составл ет около 539. Эмпирическа формула .

Инфракрасный спектр поглощени тенебримицина JT в среде, содержащей минеральное масло, показывает следующие различимые полосы в составе спектров инфракрасного поглощени в пределах от 2 до 15 мк: 3,02 3,14, 60,5 J 6,23; 7,4) 8,5; е,75 9,17, 9,65; 10,11; 11,15; 11,7 12,6 мк.

Тенебримицин 1 образует ацетильное производное, имеющее удельное вращение cl D около-1-130° при концентрации соединени 1%, счита на весовое .количество, приход щеес на единицу .объема в водном растворе. У производного не имеетс оставшихс группировок , способных титроватьс . Элемен .тарный состав, определенный по методу микроорганизма, показывает, что к структуре тенебромицина 1 присоедин ютс четыре ацетильные группировки. Тенебримицин W вл етс основнк м веществом, содержеицим группировки, способные титроватьс , имеющим значени показател рК. а около 5,3 6,8; 7,8 и 9,0, суд по данным электрометрического титровани , в воде, Удельное вращение тенебримицина у , определенное в 1%-ном водном растворе при 25°С, равно +114° Процентный состав тенебримицина iV по данным микроанализа; С 41,91;Н 7,53, . N 15,16 Молекул рный вес, определенный по данным титровани - около 544. Эдтирическа формула дл тенебримицина iy

6°

Инфракрасный спектр поглощени тенебримицина N -в среде минерального масла показывает различные полосы поглощени в рределах 2-15 мк составл ют: 3,05. 3,17; 5,85; 6,27; 7,46 8,75; 9,7; 10;5; 11-,1 и 12,85 мк.

Тетра-ацетильное производное тенебримицина 5 вл етс твердым, кристаллическим веществом с точкой плавлени около 265-267 С. Удельное вращение в том случае, если концентраци производного равна 1% в водном растворе.

Электрометрическое титрование тенебримицина 2 свидетельствует о наличии способных титроватьс группировок , имеющих значение рка около 5,5

7,0; 8,0 и 9,1. Удельное вращение в свете D линии натри в однопроцентном водном растворе данного фактора определ емое при 25с, +118°. Элементарные составы, определенные по мето Ду микроорганизма, таковы: С 43,21; Н 7,86; N 13,69. Молекул рный вес равен 483. Эмпирическа формула дл тенебримицина V CjgHjYN j-O-Q. НлО.

Спектр инфракрасного поглощени .тенебримицина в среде, содержащей минеральное масло, имеет следующие различные полосы в пределах 2-15 мк, 3,05; 3,19; 6,32; 7,45 8,75; 9,7; 11,35 и 12,25.мк.

Подобно тенебримицину , тенебримицин ( образует кристаллическое тетра-ацетильное производное. Производное плавитс с разложением при температуре около и характеризуетс удельным вращением d) около +190°, при концентрации 0,42% в водном растворе.

Тенебримицин имеет способные титроватьс группировки, характеризуемые значени ми рКа около 5,6; 7,,2 и 9,3, определенными в водном растворе путем электрометрического титровани . Молекул рный вес 467. Удельное вращение в свете D линии в однопроцентном водном растворе тенебримицина Y1 при температуре 25°С равно, примерно +127. Микроанализы свидетельствуют о приблизительном процентном составе: С 44,3; Н 8,1 N 14,3 32,8. Эмпирическа формула C a j-yNyOg .

Спектр инфракрасного поглощени тенебримицина VI показывает различные полосы поглс цени в пределах 2-15 мк; 3,05; 3,19; 6,35; 7,47; 8,75, 9,8; 12,3 и 12,95 мк.

Показатель удельного вращени тетра-ацетил производного тенебримицина Vj в 1%-ном водном растворе составл ет около+95° при определении пр 25С.

Соли, вл ющиес продуктами присоединени кислот к тенебримицину ил отдельным компонентам, вход щим в состав антибиотика, можно получить с помощью обычных методов. Дл образовани соли примен ют или органические или неорганические кислоты. Удобный метод получени таких солей заключаетс в добавлении раствора, кислоты, служащей дл образовани соли к водному раствору антибиотика. В случае нерастворимых солей, вл ющихс продуктами присоединени кислоты , соль осаждаетс из раствора и легко отдел етс с помощью обычных те снических приемов, таких как фильтрование или центрифугирование. В том случае, когда желаема соль, вл юща с продуктом присоединени кислоты , быстро не осаждаетс , то процессу осаждени можно способствовать ил концешгриру раствор до меньшего объема или добавл к воде смешиваю щийс с ней растворитель, такой как ацетон или подобный ему. Соль, вл к да с продуктом присоединени кислоты, можно перевести в форму св бодного основани путем пропускани водного раствора соли над анионообменной смолой в гидроксильном цикле Различные факторы, образующие те небримициновый комплекс можно отлич |0дин от другого,а также от других анти биотиков, обладающих сходными свойс вами с помощью технических приемов мажной хроматографии. Хроматографию Провод т по обычному нисход щему методу при температуре 22,8tO,. С 73Ф+1Ф; , на бумаге фирмы Ватман № 1, имеющей размеры 19,,3 см. Антибиотический комплекс тенебри мицина, а также индивидуальные, образующие упом нутый комплекс, обладают ингибирующим действием по отношению к росту микроорганизмов, патогенных дл жизнеде тельности жи вотных и растений. Концентраци ком плекса и индивидуальных тенебримицинов , при которых про вл етс тормоз щее действие в части развити р да организмов, показано в табл.1. Минимальные ингибирующие концентрации определ ют по методу разбавлени агара. Остра токсичность тенебримицион ного комплекса и сравнительно менее распространенных его составных частей определ ют на мышах. Значени доз вызывающих гибель подопытных животных в 50% случаев дл тенебримидинсульфата, составл ют около 300 мг/кг дл случа внутреннего введени , и около 350 мг/кг при введении в брюшную полость. Все мыши выживают в случае дозировок при под кожном введении в количестве 750 мг/кг или при скармливании 5600 мг/кг. Не отмечаетс значительного раздражени при внесении в один глаз каждой из четырех крыс одной капли 50%-нрго водного раствора суль фата тенебримицина по три разав день в течение 5 дней. Получгшзт следующие значени 1050 выраженные в мг/кг свободного основани дл ИНдивидуальных тенебримицинов при внут ривенном введении дл мышей; тенебримицин И около 385, тенебримицин l3f около 220, тенебримицин Y около 140 и тенебримицин YJ около 120. Новый антибиотический комплекс получают в результате культивировани подход щего штамма антиномицетного организма при аэробных услови х на пригодной дл культивировани ере де до тех пор, пока така среда не будет обладать значительной активностью , характерной дл антибиоти|Ка . Тенебримицин можно извлечь, примен дл этой цели различные методы вьаделени и очистки, известьые в производстве антибиотиков, Комплекс антибиотика может примен тьс , как таковой или же его можно поавергать дополнительным операци м дл очистки с целью выделени различных его индивидуальных компонентов с более высокой степенью чистоты. Штамм представл ет собой образующую спираль, устойчивые к воздействию тепла, аэробные по отношению к микроаэрофильным S t г ер t оту се s споры, имеющие продолговатые глащкие стенки, они ингибируютс при искусственном освещении сравнительно небольшой интенсивности. Штамм Stгерtomyces tепеЬгаг(us внаделен из образца почвы посредством суспендировани отдельных порций почвы в стерильной дистиллированной воде с последующим переносом суспензий на питательную среду, образованную агаром. Засе нные пластинки с питаю1дей средой в виде агара инкубируют при 25-35°С до тех пор, пока не обеспечивалс рост. К концу периода инкубировани колонии организмов, вырабатывающих антибиотик, перенос т с помощью стерильной платиновой петли на скошенный агар, затем инкубируют с целью обеспечени достаточных количеств прививочного материала дл производства антибиотика. Штамм организма , примен емого дл производства комплексного антибиотика, помещена на посто нное хранение Б коллекцию культур американского типа в Вашингтоне (Федеративный округ Колумби США, культуре присвоен № АТСС 17920. Морфологи о При выращивании на пептоновом агаре по Чапеку разветвленные формы спор образуютс в виде беспор дочных пучков и гроздьев на воздушном мицелии. Изолированные споры наблюдаютс редко . Мицелий в целом, неповра сденном виде, легко отдел етс от субстрата. Цепочки созревших спор обычно образуют 5-6 открытых спиралей. Споры имеют продолговатую форму, доход щую до цилиндрической. При исследовании под электронным микроскопом споры кажутс гладкими, имеют размеры от 0,7 до 1,3 и от 2,О до 2,1 мк. На среде по Беннату наблюдаютс утолщени . Агар Чапека: характеристика роста; редкий,разбросанный; воздушный мицеллий .редкий; светлый, оранжевожелтый; спорообразование удовлетворительное; субстратный., мицелий; светлый , оранжево-желтый, растворимый пигмент слегка розовый. Пептон по Чапеку: обильный рост; возушный мицелий обильный, светлый, елтовато-коричневый с белыми участками обильное спорулирование; субстатный мицелий светлый, красноватосерый , растворимый пигмент; сероватородовый .

Агар, содержащий кальциевую соль, блочной кислоты; рост умеренный, воздушный мицелий умеренный, светлый оранжево-желтый, спорообразование умеренное , субстратный серовато-розовый растворимый пигмент серовато-розовый Агар тирозиновый: рост ограниченный , скудный, воздушный мицелий скудный ,светлый оранжево-желтый, сзпорулирование незначительное; субстратный мицелий светлый, оранжево-желтый, растворимый пигмеНт отсутствует. I Агар, содержащий неорганическ ие соли и крахмал: рост умеренный, воздушный мицелий умеренный, коричневато-розовый с белыми участками, спорообразование обильное; противоположный цвет светло-желтый, растворимый пигмент светло-желтый.

Агар, содержащий глюкозу и аспарагин , рост умеренный, воздушный мице ,лий умеренный, светло-желтый с белыми участками, спорообразование умеренное субстратный мицелий светло-желтый рас воримый пигмент отсутствует.

Томатна паста - овс на мука: рост обильный, воздушный мицелий обильный,светлый желтовато-коричневый , спорообразование обильное, субстратный мицелий темно-серый, красновато-коричневый растворимый пигмент темный, пурпурно-красный.

Дрожжевой экстракт: рост обильный воздушный мицелий обильный, светлый, оранжево-желтый с белыми участками,спорообразование обильное, субстратный мицелий умеренно-желтый растворимый пигмент отсутствует.

Питательный агар: рост редкий, разбросанный, воздушный мицелий редкий , белый, спорообразование редкое , субстратный мицелий сероватозеленовато-желтый , растворимый пигмент отсутствует.

Агар по Беннету: рост умеренный, воздушный мицелийумеренный белый, спорулирование умеренное, субстратньай мицелий светло-желтый, раство ..римый пигмент отсутствует.

Действие на молоко: толстое желтое кольцо роста на поверхности. Наблюдаетс коагул ци и пептонизаци . Нитраты восстанавливает, сероводород не образует, желатин полностью разжижает через 14 дней.

Требовани в отношении температуры при выращивании на пептоновом агаре по Чапеку:

20° - рост отсутствует;

26 рост, удовлетворительный, воздушный мицелий отсутствует;

30 рост и образование воздушного мицели умеренные, однако спорообразование отсутствует)

37 рост, образование воздушного мицели и спорообразование все обильное)

43 рост, образование воздушного мицели и спорулирование обильно ;

50 рост, образование воздушного мицели и спорулирование - все обильное;

55 рост скудный, ограниченный;

60 рост отсутствует.

Споры, образованные из суспензии спор, нагреваемой при 75°С в течение 15 мин остаютс жизнеспособными. В случае нагревани суспензии спор до в течение 15 мин жизнеспособных спор -не остаетс .

Красный растворимый пигмент вырабатываетс лишь в присутствии иона трехвалентного железа, причем интенсивность пигментации пропорциональна концентрации иона трехвалентного железа в заданных пределах, Физиологические свойства: усваивает рибозу, фруктозу, маннозу, глюкозу , мальтозу, сукрозу, трегалозу, инозитол, салицин. Не усваивает арабинозу , рамнозу, ксилозу, лактозу, раффинозу, целлюлозу, инсулин, маннитол , oL -сорбитол.

Штамм Streptomyces tenebrarius АТСС 1720 культивируют с помощью обыных приемов в услови х погруженной аэробной культуры в среде, содержащей ассимилируемые источники углерода , азота и неорганических солей.

Штамм растет хорошо при темпера туре рт 30 до . Оптимгшьнбй вл етс температура 37-43°С. Организмы .чувствительны к действию света и пло; ,Хо растут при освещении. Через среду дл выращивани культуры продувают стерильный воздух. Объем воздуха, используемый в процессе ферментации в резервуарах составл ет свыше 0,1 об/мин на 1 объем средь: дл выращивани культуры.

Концентраци , характеризующа активность антибиотика в ферментационной среде может быть легко прослежена по мере хода ферментации посредством отбора и испытани проб ореды дл выращивани на их активность в отношении ингибировани роста организмов , которые должны тормозитьс в своем развитии в присутствии тенебримицина. Дл этой цели примен ютс два организма: Klebsiella pneumoniae и Мicobacter1um butyг i cum.

Максимальный уровень производства активности антибиотика достигает примерно через 4-7 дней после иноКу лировани среды дл выращивани культур в случа х применени культур,выращиваемых в аэробных услови х погружени или же в стекл ннрй посуде, содержимое которой перемешиваетс при встр хивании . Несколько более длительное врем затрачиваетс при использовании поверхности культуры. Мицелий и нерастворившиес остат ки удал ют из ферментационного буль на с помощью обычных средств, таки как фильтрование или центрифугирова ние. Характеризующее антибиотик активное начало содержитс в профиль рованном бульоне и может быть извле чено из него путем применени адсор ционной техники. К числу абсорбенто которые могут быть применены с наибольшим успехом относ тс катионнообменные смолы, например IRC-50. Извлекают тенебримицин и фермен тационного бульона следующим образом Бульон отфильтровывают с применение средства, способствующего фильтрова нию, после того, как показатель кон центрации водородных ионов рН смеси снижен приблизительно до рН 2 посредс вом добавлени кислоты, такой каксерна кислота, фосфорна кислота, хлористоводородна кислота и подобные им. После этого значение рН фильтрата довод т примерно до рН 5, путем добавлени концентрированной щелочи и смесь снова фильтруют. Пол ченный фильтрат пропускают через ионообменную колонку, заполненную ионообменной смолой, такой как IRC 50 в аммонийном цикле. Затем колонку промывают дистиллированной водой и активное действующее начгшо, характеризующее антибиотик, извлекают с сшсорбента посредством вьиншвани разбавленной кислотой.. Фракции, содержащие активное действук дее начало , объедин ют и концентрируют приблизительно до 1/20 от первоначального объема. Значение показател рН концентрата повышают примерно до рН 11 путем добавлени концентрированной щелочи, после чего щелочный концентрат выливают примерно в шестикратный объем ацетона, хорошо перемешивают и охлаждают. Выдел ющийс осадок, не обладающий активностью в микробиологическом отношении, устран ют с помощью фильтровани . Значение показател рН фильтрата понижают приблизительно до рН 3,5 путем добавлени 20%-Ной серной кислоты при тщательном перемешивании. Тенебримицин в виде комплекса осаждаетс в форме сернокислой соли, в то врем как керуломицин, попутно образующийс в процессе ферментации, остаетс во всплывающем слое, который отбрасываетс . Сернокислую соль тенебримицина раствор ют в минимальном количестве воды и водный раствор пропускают через колонку с Доуэксом 1x1. Водный раствор сульфата тенебримицина довод т в колонке дистиллированной водой, после чего жидкость, вытекающую из коло.нки, собирают в виде отдельных фракций. Активные фракции объедин ют и концентрируют до консистенции густого сиропа, заteM высушивают с целью получени тенебримицина в виде срободного основани . Основные факторы, образующие комплекс тенебримицина можно получить, если это желательно, в. виде раздельных антибиотиков посредством дополнительного фракционировани на колонках , заполненных ионообменной смолой тенебримицина. Дл проведени фракционировани тенебримицин примен ют в виде соли, вл ющейс продуктом присоединени кислоты. Пригодной солью вл етс в данном случае сульфат Раствор сульфата тенебримицина удобно получать посредством приготовлени 20%-ного водного раствора тенебримицина с последующей установкой показател рН раствора приблизительно до рН 4,5 путем добавлени серной кислоты. Окрашенные примеси можно удалить с помощью перемешивани приготовленного раствора примерно с 5% (весовое количество по отношению к объемному активированного угл , например Дарко G-60. Эффективное обеспечение обычно достигают в результате перемешивани смеси , содержащей автивированный уголь в течение приблизительно часа. После этого смесь фильтруют и фильтрат, который содержит сульфат тенебримицина помещают в колонку, заполненную ионообменной смолой марки IRC-50 в аммонийном цикле. Колонку промывают водой, после чего индивидуальные антибиотики , образующие комплекс тенебримицина фракционировано отмывают с адсорбента с помощью 0,1-н. раствора гидрата окиси аммони . Процесс элюировани происходит медленно, и дл получени необходимого эффекта фракционировани комплекса обычно необходимо очень большое число фракций. Так, например, полное и законченное фракционирование примерно 250 г тенебримицина требует получени около 700 фракций, кажда из которых содержитс примерно в 900 мл жидкости, .отмываемой с адсорбента. Первые из числа полученных активных фракций содержат тенебримицин 1,1 и l . За ними следуют серии активных фракций, в которых содержитс в качестве единственного антибиотика тенебримицин U Прежде чем будут открыты фракции, содержащие тенебримицин 3 , вслед за элюированием тенебримицина ц отходит р д фракций, не обладающих активностью. Первые фракции , содержащие тенебри цин JV , содержат следы, тенебримицина ш . Тенебримицин 7 получают из колонки в составе активных фракций, за которыми следует тенебримицин 1 . Дл получени тенебримицина W колонку дополнительно элюируют более концентрированным раствором гидрата окиси аммони , после того как весь тенебримицин V извлечен из колонки. По ход щей жидкостью дл отмывки с аб бента тенебримицина V/ служит 0,3 раствор гидрата окиси аммони . Пример. Ферментаци S.te brarius штамма АТСС 17920. Спорулированную культуру S.tene brarius АТСС 17920 получают посред ством выращивани организма на модифицированной среде Беннета в виде скошенного агара, имеющего след щий состав, г: Декстрин 10 Дрожжевой экстракт (Дифко) 1 Гидролизованный казеин 2 Экстракт из м са крупного рогат го скота(Дифко) 1 0,01 агар 20 Деионизированна вода в количестве , необходимом дл до-ведени объема смеси до 1000 мл Значение показател концентраци водородных ионов рН довод т до рН до автоклавировани . Скошенную среду засевают спорам St, tenebrarius АТСС № 17920 и кул тивируют в отсутствии видимого све та в течение п ти дней при 37 С, Культуру, выращенную на скошенной де покрывают водой и наклонную по верхность осторожно соскабливают, удал споры с целью получени вод ной суспензии, содержащей споры,По лученную указанным образом суспенз спор примен ют дл инокулировани среды, имеющей такой состав, %: Декстроза 0,05 Питательна соева мука, содержаща 35-45% диспергирующегос протеина 1,5 Декстрин 700 (картофельный) Декстрин с низким содержанием хлоридов 1 Хлористый калий 0,1 N Z-амин А О , 3 КН2.РО 0,05 MgSO.. 0,5 СтС1|2 -2Н О 0,025 Деионизированна вода 100 мл Инокулированную вегетативную ср ду инкубирурт при температуре окол 37°С в течение 16 ч на аппарате дл перемешивани путем встр хивани одновременном вращении со скорост 250 об/мин при размахе колебаний мм. Дл инокулировани резервуара д посева емкостью 44 л, содержащего ную среду следующего состава: Декстроза 1 Соева крупа 1,5 ,05 MgSO 0,5 Хлористый 0,1 СаС1;2 -2H-j O 0,025 Средство против вспенивани 0, примен ют порцию вегетативной кул туры объемом 50 мл. Среду, наход уюс в резервуаре дл посева стериизуют при 120С в течение 30 мин. нокулированную среду в резервуаре л посева инкубируют при 37°С в ечение 12 ч. Перемешивание со скоостью 370 об/мин начинают немедленно после инокулировани . В продолжении всего периода инкубировани осуществл ют аэрацию при скорости подачи воздуха 0,22 . К концу периода инкубации содержимое резервуара дл посева используют дл инокулировани ферментатора емкостью 1,14 0,95 м, содержащего среду следующего состава,%: Декстроза 4 Соевое масло рафинированное 3 Соева мука 3 Хлористый аммоний 0,5 Хлористый кальций О,3 Сернокислый магний 0,2 Азотнокислый аммоний 0,1 NZ-амин-А О,5 Средство против образовани - пены 0,2% Депонизированна вода До инокулировани ферментационную среду стерилизуют 30 мин при . Ферментацию провод т при З7с. Аэрацию осуществл ют при скорости подачи воздуха 0,48 в течение го периода выращивани , начина от инокулировани и конча сбором выращенной культурыо Перемешивание начинают при скорости вращени мешалки 120 об/мин. Через 12 ч число оборотов мешалки увеличивают до 180. Процесс ферментации продолжают5 дней. Бульон, содержащий культуру,, после проведени ферментации фильтруют дл удалени мицели и других нерастворившихС .Я твердых веществ . Профильтрованный бульон содержит активность антибиотика при концентрации около 680 ед. в мл, П р и м е р 2. Изолирование комплекса тейебримицина. Значение показател концентрации водородных ионов у 880 л ферментационного бульона, содержащего антибиотик и полученного, как указано в примере 1, понижают приблизительно до рН 2 путем добавлени приблизительно 10-15 л 20%-ного водного раствора серной кислоты. К подкисленному бульону добавл ют 45 кг средства , способствующего фильтрованию, тщательно перемешивают смесь и фильтруют . Отжатый осадок, оставшийс на фильтре промывгиот водой и промывные воды добавл ют к фильтрату. Значение показател рН фильтрата довод т до рН 5,5 посредством добавлени 50%-ного водного раствора гидрата натри . Добавл ют примерно 4 кг средства, способствующего фильтрованию, смесь тщательно перемешивают и фильтруют. Полученный фильтр пропускают: через колонку, имеющую размеры 10,2 cMxIjB м, заполненную ионообменной смолой марки IRC-50 . Колонка имеет слой смолы высотой 111,7-114,3 см и действует по аммонийному циклу. После того, как весь фильтрат пропуст т через колонку, е последнюю промывают дистиллированной водой в количестве около 200 л. Активно действующее начало, характеризуемое свойствами антибиотика затем отМывают с адсорбента в течение 12-15 ч «л примерно л и 0,1 н. раствора серной кислоты. Элюат собирают в виде фракций по 10 л кажда . Присуща антибиотику активность в составе элюата становитс распознаваемой в случае снижени величины водородного по- казател рН до 4 или несколько менее. По мере продолжени отмывки, водородный показатель элюата продолжает-снижатьс до тех пор, пока его значение не достигнет уровн около рН 1,5. 20 Фракции, содержащие активное начало антибиотика объедин ют и концентрируют при уменьшенном давлении приблизительно до 1/20 от первоначального объема .. 25

Значение водородного показател рН концентрированного элюата довод т до рН 11 посредством добавлени 50%-ного водного раствора гидрата окиси натри , после чего подщелоченный кон- п центрат добавл ют к 6 объемам ацетона . Полученную смесь охлаждают и отставл ют в сторону дл TOiO, чтобы дать отделитьс осадку, лишенному активности, свойственной антибиотику, jc Затем смесь фильтруют и плотную массу отжатую на фильтре, и состо щую из неактивного осадка, отбрасывают.

Значение водородного показател рН устанавливают до 3,5 посредством добавлени ,при тщательном перемешивании, 0 20%-ного водного раствора серной Кислоты . Во врем такой обработки комп,лекс тенебримицина осаждаетс в виде сульфата. Практически полное осаждение достигаетс , когда рН раствора 45 достигнет значени около 4 или несколько менее. Смесь фильтруют и фильтрат , содержащий церуломицин, попутно образующийс в процессе ферментации, отбрасывают.50

Отжатый на фильтре осгщок, вл юийс сульфатом тенебримицина, раствор ют в минимальном количестве воды и охлаждают. Все твердые вещества, раствор ющиес более или менее трудно, г отбрасывают, нар ду со всеми твердыи веществами, выпадающими в виде осадка или кристаллизующимис при охлаждении, прозрачный раствор сульфата тенебримицина пропускают через насадку из ионообменной смолы марки 60 Доуэкс 1x1 размером 10,2смх2,1 м. Раствор антибиотика вывод т из колонны с применением 40-50 л дистиллиованной воды. Жидкость, выход щую з колонны собирают отдельными фрак- 65

ци ми по 10 л. Активные фракции объедин ют, концентрируют в вакууме до консистенции густого сиропа, который .после высушивани на противне дает сухой тенебримицин.

Примерз. Сульфат тенебримицина получают путем добавлени концентрированной серной кислоты к 20%-ному водному раствору, содержащему 258 г комплекса тенебримицина в виде свободного основани с таким расчетом, чтобы значение водородного показател рН среды стало равным 4,5. Полученный таким путем раствор сульфата тенебримицина обесцвечивают , перемешива его примерно один час с 5% (весовое количество по отношению к объемному активировного угл марки Дарко 6-60. Затем раствор фильтруют и фильтрат пропускают через колонку размером 9х х105 см заполненную примерно 7 л ионообменной смолы марки IRC-50 и работающую в аммонийном цикле. После того, как фильтрат, содержащий соль антибиотика, пропуст т через колонку, ее прошзвают приблизительн 17 л деионизированной воды. Въ1мава ние активной части антибиотика, задержанной в колонке начинают с помощью 0,1 н. раствора гидрата окиси аммони , подаваемого со скоростью около 20 мл в мин. Элюат собирают отдельными фракци ми приблизительно по 900 мл, причем каждую фракцию провер ют на микробиологическую активность . Фракции, содержащие одина ковый фактор антибиотика объедин ют и высушивают из замороженного состо ни с . ;целью получени индивидуальных высушенных тенебримицинов. Индивидуальные тенебримнцины распредел ютс , в зависимости от активности фракций йледующим образом (табл.2).

П р и м е р 4.;Получение гелиантатов тенебримицинов.

Готовый раствор 2 г тенебримицина U в 22 мл воды и водородный показатель раствора довод т до значени рН 5 посредством добавлени 50%-ной серной кислоты. Затем к раствору антибиотика добавл ют гор чий 10%-ный водный раствор метил-оранжа. Гелиантат тенебримицина il выдел ют в виде осг1дка -и отдел ют фильтрованием . Твердую соль тщательно промывают гор чей водой и высушивают в вакууме. В итоге получают 3,5 г тенебримицин М гелиантата.

П р и м е р 5. Окончательна очиска факторов тенебримицина.

Готов т гелиантат тенебримицина в соответствии с методикой, аналогичной описаннойв примере 4. Четыре грамма приготовленной таким путем соли суспендируют приблизительJHO в 200 мл воды, значение водородiHoro показател которой доведено до

ipH 2 за счет добавлени серной кислоты . Смесь перемешивают около 4 ч, после чего фильтруют ее через воронку с фильтрующей пористой стекл нной пластинкой средней степени пористости с целью удален{| гелиантовой кислоты. Фильтрат обесцвечивгиот путем пропускани через тонкий слой активированного угл , после чего пропускают через колонку размером 1x32 см, наполненную ионообменной смолой Доуэкс 1x2 и работающую в гидроксильном цикле. Фильтрат замещают в колонке с помс цью дистиллированной воды с целью завершени отмывки активного действующего начала антибиотика. Выход щую из колонки жидкость собирают отдельными фракци ми , объедин вместе активные фракции

В заключение производ т высушивание в замороженном состо нии. Полученный остаток представл ет сухой антибиотик. Остаток, раствор ют приблизительно в 15 мл воды и полученный раствор пропускают через колонку размером 1х х25 см, заполненную ионообменной смолой , Био Рад смола Аб 11А8. Это смола задерживающего действи . Активную составную часть, обладающую свойствами антибиотика, вымывают из колонки дистилированной водой. Активные фракции снова объедин ют и высушивают в замороженном состо нии. Вы )ход тенебримицина высшей степени очистки - около ТОО мг.

Предлагаемый способ позвол ет получить новый антибиотический комплекс, который найдет применение в медицинеJ

«3

а s

R Ю

Id ЕЧ

Таблица 2

Фракци

1-34 35-53 54-77 78-153

154-172

173-249

250-256

257-634

635-668

669-698

л;

с этого момента элюат изменен до р,3-н. гидрата окиси аммони .

Claims

Формула изобретени Способ получени антибиотичесого комплекса,содержащего тенебримицин И, Ш , , и Vi и их солей заключающийс в том, что штамМ Streptomyces tenebrarius АТСС 17920 культивируют в глубинных услови х аэробно в питательной среде, содерПрисутствующий антибиотик

Не активны

Тенебримицин I Д

Тенебримицин П

Не активны

Тенебримицин l

Тенебримицина Ш

Тенебримицин ij

Не активны

Тенебримицин V

Не активны

Тенебримицин

жащей источники углерода, азота и минеральные соли при температуре 3743°С в течение 4-7 дней, затем выдел ют целевой продукт в свободном ви30 Яе или в виде его солей, при необходи-мости раздел ют комплекс на составные антибиотические компоненты П , iTl , ij , V и VJ и перевод т их в соли.