SU929015A3 - Способ получени полисахарида - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к технике лучени  полисахаридов путем культив ровани  продуцирующих его микроорга низмов и может быть использовано в качестве добавки в корма, носител  дл  лекарств и косметических вещест или промышленных химикатов, предпочтительно смазок дл  бурени . Известен способ получени  полиса харида путем культивировани  продуцирующих его микроорганизмов рода Pseudomonas на питательной среде в УСЛОВИЯХ аэрации, содержащей метанол в качестве единственного источн ка углерода, источники азота, фосфора и другие необходимые минеральные соли, с последующим выделением полисахарида ГП Однако получаемый по известному способу полисахарид недостаточно активен. Цель изобретени  - увеличение активности полисахарида. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  полисахарида путем культивировани  продуцирующих его микррорганизмов рода Pseudomonas на питательной среде в услови х аэрации , содержащей метанол в качестве единственного источника углерода, источники азота, фосфора и другие необходимые минеральные соли, с последующим выделением полисахарида, из рода Pseudomonas используют штамм Pseudomonas pclysaccharogenes М-30, при этом культивирование ведут при рН 6,5-7,5 и 28-30 С в течение А8-72 ч. Способ осуществл ют следующим бразом. Штамм Pseudomonas polysaccharoenes М-30 культивируют на питаельной среде в услови х аэрации, одержащей метанол в качестве единственного источника углерода, источ39 НИКИ азота, фосфора и другие необходимые минеральные соли. I Новый штамм Pseudonranas polysaccharogenes М-30выделен из образцов почвы в районе Шитосума, префектуры Ибараки, в Японии 1 ма  1975 г. Штамм хранитс  в техническом исследовательском институте микробиологической промышленности (Агенство промышленной науки и технологии Министерства международной торговли и промышленности Японии) в коллекции микроорганизмов под № , этот новый штамм хранитс  также в американской типовой коллекции культур США под неизвестным номером . Морфологические свойства нового штамма Pseudonranas polysaccharogenes М-30. Рассматривают неподвижный культуральный бульон в среде метано ьного бульона (О,5% по объему) при kQ ч. Форма и размер клетки - бациллиформа 0,,5 X 1,0-2,5 мкм. Колони  обычно одиночна , частич но сдвоенна . Неподвижный с одним побегом, спо не имеетс , грамм/окраска отрицател на , кислотна  прочность отрицатель на  . Характеристика роста в различных средах. В бульонной культуре развиваетс  В бульонной жидкой неподвижной культ ре при 30°С в течение 5 дней сильно развитие, образовани  пленки не име етс , осадок образуетс , мутность образуетс . На бульон-агаровой культуре при 30°С в течение 10 дней сильное раз витие, форма волокниста , поверхнос гладка , перифери  волокниста , про зрачность мутна , окраска оранжева . На пластичной культуре бульонагара при .в течение 21 дн  форма неправильна , перифери  волок ниста , поверхность плоска , гладка На бульон-агаровой колотой культуре при 30° в течение 7 дней разви тие по поверхности и вдоль верхнего надреза. На бульон-метанольнрй (0,5 по объему) агаровой пластинчатой культуре при 30 в течение 30 дней форма кругла , перифери  волокниста . форма поднимающейс  поверхности плоска , поверхность гладка , окраска оранжева . На метанольной синтетической жидкой среде, содержащей 0,5 г нитрита кали ,1 г кислого фосфата кали , 0,5 г семигйдрата сульфата ма1- ни , 10 мг семигйдрата сульфата железа, 0,1 г дрожжевого экстракта и 1 об. метанола, растворенного в 1 л чистой воды, рН 7.0 при в течение 5 дней развитие обильное , имеетс  осадок, мутность, образовани  пленки не наблюдаетс . Физиологические свойства. Восстановление нитрата положительное, денитрификаци  отрицательна . Опыт на метил-красный МР отрицательный, опыт на Р (Фогс-Проскауер) отрицательный , индол не образует, сероводород не образует, крахмал не гидролизует . Утилизирует аммониевые соли и нитраты, пигмент не образует. Уреаза, оксидаза, каталаза - положительно . Поглощение кислорода аэробное. Желатину не окисл ет. Лакмусовое молоко окрашивает в красный цвет, пептонизирует. Температура развити  10-37 0, оптимальна  температура роста 26-31 0, рН развити  , оптимально 6-8. Метиламин не утилизи-рует. Не образует газообразной кислоты из Сахаров - арабинозы, адонитола , инозитола, галактозы, ксилозы, клюкозы, сахарозы, дульцитола, сорбитала , трегалозы, мальтозы, маннитола , маннозы, лактозы, рамнозы, раффинозы , фруктозы, крахмала и глицерина . Не утилизирует сахара - арабинозу , инозитал, галактозу, ксилозу, сахарозу, сорбитал, трегалозу, мальтозу , маннитол, маннозу, лактозу рамнозу, раффинозу, фруктозу, крахмал , декстрин, инулин, метилглюкозид , рибозу, сорбозу, фукозу, целлобиозу , мелебиозу и глицерин. Утилизирует глюкозу. Утилизирует метанол. Не утилизирует метан. Не утилизирует спирты - этанол, проланол, изопропанол, бутанол, амиловый спирт, изоамиловый спирт; 1, 2-пропандиол; 1,3 бутандиол-, 1,4-бутандиол; 2,3-бутандиол; 1,5пентандиол , 1,6-гександиол, 2,5-гександиол; этиленгликоль, диэтиленгликоль} 4-метилциклогексан. 5 Не утилизирует органические кис лоты - муравьиную, уксусную, фумаровую , лимонную, молочную, пировиноградную , изолимонную, кетоглутаровую , коричную,  блочную, оксиуксусную , гликолевую, глиоксиловую и глюконовую. Количество метанола в питательной среде не должно быть выше 4% объема среды, а в случае непрерывной подачи метанола в среду его содержание не должно быть выше % по объему. В качестве неорганических источ ников азота используют нитрат аммо ни , кали , сульфат аммони  и т.п. и дрожжевой экстракт, пептон и т.п. в качестве природного источ ника азота. В качестве минеральных солей используют кислый фосфат кали , двухкалийный фосфат кали , сульфат магни , сульфат железа, хлорис тый кальций, сульфат марганца, хло рид натри  и т.п. В среду ввод т также биотин, тиамины, дрожжевой экстракт, кукурузную барду в случа необходимости. Культивирование провод т при 10-37 С, предпочтительно при 28-32 при встр хивании или перемешивании воздухом, рН среды 5-10. предпочти Ь-ельно 6-8 или 6,5-7,5, продолжительность культивировани  2 ч, пр почтительно ч. По окончании культивировани  вы ращенный бульон разбавл ют в 1020 раз по объему, мицелий и другие твердые вещества удал ют непрерывным центрифугированием при 1500 х X 60 мин и скорости обработки 20 л/ или периодическим центрифугированием при 1000 X 60 мин. Затем к отдел ному бульону добавл ют органический растворитель, например метанол, эта нол или ацетон в удвоенном объеме, или соль четвертичного аммони  дл  фракционировани  осаждени  бело го волокнистого сырого полисахарида I Полученный полисахарид раствор ют в 5-15 ратном объеме воды и полученный раствор подвергают депротеинизации , например, нагревание при 70-100°С, обрабатывают смесью хлороформа и эмилового спирта (3-2) или обрабатывают трихлоруксусной кислотой. Затем непрерывно или периодически центрифугируют так же как сырой полисахарид дл  удалени  56 протеинов. К полученному верхнему слою добавл ют двойной объем метанола , этанола или ацетона. Отделенный осадок тщательно промывают эфиром или этанолом, снова раствор ют в 5-15-кратном объеме воды и деминерализуют диализом в проточной воде, обрабатывают ионообменной смолой и фильтруют через гуль, сушат вымораживанием и получают полисахарид в виде белой губки. Физико-механические свойства полисахарида. Оптическое вращение (ct) , ± 3(3(О, II по объему водный раствор ) . Средний молекул рный вес 2,0 х X 10 - 2,0 X 10 (зависит от длительности ферментации). Элементарный анализ, %: С 37,7+ ± 3,0} Н 5,8 ± 0,5. Цветна  реакци  положительна в антроновой реакции и фенол-сернокислотной реакции. Полисахарид представл ет собой кислотный элемент . ИК-спектр - характерные полосы поглощени , см -при (S), (М), 1620 (М), (М), (S) и 890 (W). Растворим в воде, 1н. НС1, 1 н. серной кислоте и 1 н. водном аммиаке . Нерастворим в этаноле, эфире, ацетоне, хлороформе и диметилсульфоксиде . В зкость 1000-3000 сП измере+на в его 1 вес. растворе при с помощью вискозиметра типа 81 (фирмы Токио Тейки, Япони ). Сахарные единицы - п тна глюкозы и маннозы бумажной хроматографией после гидролиза, отношение сахарных единиц глюкозы к маннозе 3 :2 по газовой хроматографии. Полисахарид белого цвета, аморфный и бесцветный в водном растворе. Из указанных свойств можно сделать вывод, что полисахарид, выделенный из бульона нового штамма М-30, обладает высокой в зкостью в водных растворах, котора  не снижаетс  даже в присутствии соли, например, КС1, MgClij, AlClo,, ()/2.S04 или aCl. В зкость водного раствора полисахарида незначительно измен етс  при изменении рН среды. Поэому он пригоден в качестве добавки в корм, носител  дл  лекарств и косетических веществ, или промышлен7

ных химикатов, Например смазок дл  бурени .

В медицине полисахарид М-30 - С пригоден в качестве вещества, снижающего уровень холестерина.

Ниже более полно дано объ снение снижени  холестерина полисахаридом М-ЗО-С на различных опытных данных.

Величина Делполисахарида М-ЗО-С не мене 5 г/кг в штамма 1СР - С дл  самок и Самцов мышей и штамма бистер дл  самок и самцов крыс при пероральном введении, в то врем  как величина ЕД оПодавл ющего действи  на рост уровн  холестерина в крови не более 5 мг/кг в случае гиперлипемии, вызванной Тритоном

Таким образом безопасна  зона (LD5Q(ED5j) полисахарида составл ет 1000 раз и больше. Подостра  токсичность в течение 1 мес ца введени  показывает, что нет никаких ненормальностей в веса тела, крови и органов при непрерывном введении 500 мг/кг день; максимальна  безопасна  доза составл ет 500 мг/кг.

Полисахариды показывают высокую безопасность, как лекарство и примен ютс  в медицине дл  улучшени  обмена липидов и предотвращени  атергеноза .

Полисахариды можно вводить перорально , внутривенно, прд  зык, внутримышечно или интраректально, предпочтительно перорально, обычно одинарными дозами 10-1000 мг 1-6 раз в день дл  взрослых.

В некоторых случа х полисахариды можно давать после соответствующего расщеплени  или сульфировани . J Полисахарид Н-ЗО-С можно давать, как лекарство дл  улучшени  липидного обмена и предотвращени  атеросклероза , инфаркта миокарда, грудной жабы, разм гчени  мозга, мозгового кровотечени , гипертонии или гиперхолестермии , св занной с диабетом.

Дл  перорального применени  обычно используют капсулы, таблетки или гранулы, в некоторых-случа х порошки сиропы или водные растворы, причем полисахарид М-ЗО-С дает эффект в менших дозах по сравнению с известными противохолестерическими веществами, обладает безопасным пределом, не вызывает гепатотоксичности, обычной дл  побочного действи .

158.

Пример. Получают питательную среду, содержащую в 1 л чистой воды следующие ингредиенты, г: кислый фосфат кали  1; нитрат кали  1, семигидрат.сульфата магни  0,5; хлорид кали  0,5, дрожжевой экстракт 0,1-, метанол 32 и в мг: семигидрат сульфата железа 10, дигидрат хлорида кальци  2 и хлорид натри  2. 7 литров- среды помещают в ферментер с рН 7.0, стерилизуют 10 мин при 120С.

В среде такого же состава выращивют штамм Pseudomonas polysaccharogenes М-30 в колбе Сакагуси, инокулируют в указанный ферментер, вед  культивацию при 30°С и аэрации 0,5 объема/мин в течение 72 ч. Далее к бульону добавл ют 100 л воды, мицелий отдел ют непрерывным центрифугированием при 2000 об/мин и 7 л/ч Затем отделенный фугат нагревают до 80°С 15 мин. рН довод т до 3,5-,5 сол ной кислотой дл  осаждени  .протеинов в изоэлектрической точке, затем протеины отдел ют центрифугированием , рН слива довод т до 7,0 выпаривают до 25 л, обрабатывают смесью хлороформ-амиловым спиртом (3:2) дл  депротеинизации и-добавл ют 50 л ацетона, при этом образуетс  в зкое вещество волокнистой структуры . Это вещество отфильтровывают, тщательно промывают затем этанолом, снова раствор ют в воде и подвергают диализу.

Дл  отделени  полисахаридов добавл ют двойной объем ацетона. Полисахарид раствор ют в 2 л чистой вода затем сушат вымораживанием и получают 98 г очищенного полисахарида М-ЗО-С, Его продуктивность составл ет 1 г/л культурального бульона.

Физико-механические свойства полученного полисахарида.

Средний молекул рный вес 18 х 10 по фильтрации гел  и 12 х 10 по рассеиванию света. Элементарный анализ, %: С 37,7. Н 5,8.

Цветна  реакци  положительна в реакции антрона и фенолсерной кислоты .

Полисахарид М-ЗО-С  вл етс  кислотным полисахаридом.

ИК-спектр поглощени . Характерные полосы поглощени  выражены волновым номером, (S), 2940 (М) , 1620 (М), 1400 (М), 1040 (3)и 890 ОЛ S I где S - показывает сильное поглощение , м - среднее поглощение, и W - слабое поглощение. Полисахарид растворим в воде, в 1н. сол ной кислоте, 1н. серной кис лоте и 1 н.водном аммиаке. Нерастворим в этаноле, эфире, ацетоне, хл роформе и диметилсульфоксиде. В зкость 1000-3000 сП в U-HOM водном растворе при 20°С и 60 об/ми на вискозиметре типа В (фирмы Токи Тейки, Япони ). Изменение в зкости водного раств ра в зависимости от рН в диапазоне рН 2-М; несколько больша  в зкост при нейтральном рН (при рН 2 в зкость 930 сП-, при рН 7-1250 сП и при рН 11-1100 сП на вискозиметре типа BL с адаптером НМ-3 дл  неболь шого количества при услови х 20°С, 0, водный раствор, и 60 об/мин В зависимости от температуры в зкос измен етс  следующим образом. В диапазоне 20-80°С в зкость уменьшаетс  при увеличении температуры: при 20°С - 13500 сП, при 80°С - 11100 сП на том же самом вискозиметре. Изменение в зкости водного раствора в зависимости от концентрации от 0,2 до % вес/объем : чем выше концентраци  раствора, тем выше его в зкость, при Q,2% - 500 сП и при П - 13500 сП и 20С. Снижение в зкости водного раствора полисахарида не наблюдаетс  в растворе хлорида кали , магни , алюмини , сульфата аммони  или в насыщенном вод-ном растворе хлорида натри . Полисахарид М-ЗО-С гидролизуетс  2н. серной кислотой в герметичной трубке при в течение 9 ч Продукт реакции обрабатывают гидроокисью бари  дл  удалени  серной кислоты, затем пропускают через колонку с ионообменной смолой Довёк 50 (Н форма) дл  удалени  избытка ионов бари  и тонких частиц сульфата бари . Промывные жидкости выпаривают в вакууме. Концентрат хроматографируют на бумаге, примен  .в качестве про вл ющей жидкости сме бутанола, уксусной кислоты и воды (1:5),и получают п тна глюкозы и маннозы. Концентрат далее выпаривают досуха и превращают в соответствующее триметилсилильное производное , газова  хроматографи  котор 510 го показывает отношение глюкозы к маннозе 3:2. Полисахарид М-ЗО-С аморфный, белый , где водный раствор бесцветный. Полисахарид и его водный раствор не имеют вкуса и запаза. Полисахарид более в зок, чем ксантанова  смола, при 20°С, 1|-ном водном растворе , 60 об/мин и на таком же вискозиметре , в зкость полисахарида 2100 сП, у ксантановой смолы 1000 сП. Полисахарид М-ЗО-С показывает тиксотропное свойство в его водном растворе. Наблюдаетс  слабое ультрафиолетовое поглощение около 280 мкм. Температура плавлени  полисахарида неопределенна , он разлагаетс  при нагревании, переход  в науглероженное состо ние. П р и м е р 2. Культивирование провод т , как описано в примере 1, получа  культивированный бульон, содержащий полисахарид М-ЗО-С. Бульон разбавл ют смесью воды и метанола 1:1 до 100 л и нагревают при 15 мин. Затем мицелий удал ют непрерывным центрифугированием при скорости 7 л/час.„ рН слива довод т до 3, ,5 сол ной кислотой дл  осаждени  протеинов в изоэлектрической точке и затем протеины отдел ют центрифугированием . Снова рН слива довод т до 7,0 и добавл ют водный раствор хлорида кальци  до концентрации 0,02 %. При дальнейшем центрифугировании получают пастообразный полисахарид , который обрабатывают 20 л метанола при осторожном перемешивании дл  удалени  солей, фильтруют, отгон ют метанол и получают полиса харид в виде пасты. Пасту раствор ют в 2 л чистой воды, сушат вымораживанием , получа  84 г очищенного полисахарида М-ЗО-С. Производительность равна 12 г/л бульона. Фармакологические свойства полисахарида Н-ЗО-С по сн ютс  следующим образом. Опыт 1. Берут самцов мышей штамма 1CR-JCL группами по 10 мышей, каждой из них внутривенно ввод т по 800 мг/кг Тритона. Через ч после введени  в крови образуетс  пиковый уровень липидов крови, затем гиперликемию поддерживают более 2 ч, готов  таким образом опытных животых . Затем опытную пробу полисахаида М-ЗО-.С раствор ют в дистиллироn ванной воде и дважды перорально вво д т животным, а именно сразу после дачи Тритона и через 20-2А ч. Через 2k ч после последнего введени  определ ют уровень холестерина в сывооотке. Опыт 2. Берут самцов мышей, как в опыте 1 по 6 штук в группе, и каж дой мыши ввод т внутривенно стрепто озотоцин 200 мг/кг. Чеоез 7 ч после введени  поддерживают гиперлипемию в течение I дней и более дл  получени  животных с гиперлипемией, вызванной стрептоозотоцином. Пробу полисахарида М-ЗО-С раство р ют в дистиллированной воде и перо рально ввод т животным одиночными дневными дозами 50 мг/кг в течение 5 дней после 7 дней с момента введе ни  стрептоозотоцина. Через 2 ч после последнего введени  определ ют уровень холестерина. Опыт 3. Берут самцов крыс штамма Вистар 3 группы по 10 животных. В группе нор марный контроль наход тс  животные, которым дают обычную порошкообразную пищу. Подопытным животным группы холестериновый контроль дают пищу с добавлением 0,5% холестерина и 0,5% желчной кислоты. В группе М-ЗО-С животным дают пищу, содержащую компоненты из группы холестериновый контроль и испытываемый полисахарид М-ЗО-С, приготовленный таким образом, что животные получают дневную дозу 50 мг/кг. Одновременно во всех группах поднимают холестерин в плазме: пищу дают в количестве 10 г на 100 г веса тела в день. После кормлени  1 дней определ ют уровень холестерина в сыворотке. 5 В опытах 1-3 примен ют также гипохолестериновый агент (СР1В) дл  сравнени . Результаты опытов 1-3 приведены в табл.1. Опыт Ц. Берут самцов кроликов штамма новозеландские-белые группами по 10-1 животных. Животных, которым дают обычную пищу называют нормальный контроль, пищу, содержащую 0,67 холестерина - холестериновый контроль, пищу с добавлением испытуемой пробы М-ЗО-С - группа, получивша  испытуемое соединение , Уровень холестерина в плазме во всех группах одновременно повышают ежедневной дачей пищи 40 г/кг веса тела в течение 20 недель, За этот период определ ют уровень липидов в сыворотке. Через 20 недель всех животных забивают, вырезают дорсальную аорту и изучают  вление атеро клероза . Результаты приведены в табл.2 Из данных табл.2 видно, что полисахарид М-ЗО-С значительно подавл ет рост липидов в сыворотке (общий свободный холестерин, триглицериды, фосфолипиды, липопротзин, свободные жирные кислоты), 65,9% атеросклероза обнаруживают в дорсальной аорте в группе холестеринового контрол  и в то же врем  подавлени  атеросклероза наблюдаетс  в группе животных, которым давали полисахарид М-ЗО-С. Снижающее действие на липиды в сыворотке М-ЗО-С происходит, видимо, за счет эффекта подавлени  поглощени  и биосинтеза холестерина. Таким образом, полисахарид М-ЗО-Т можно считать пригодным в качестве практического вещества, снижающего липиды в сыворотке и предотвращающего развитие атеросклероза.

та

гг

S

q lO

та

03

J s ц ю

OJ

1792901518

Claims (1)

1. Формула изобретени отличающийс  тем, что,

   Способ получени  полисахарида пу- сахарида, из рода Pseudomonas испольтем культивировани  продуцирующих зуют штамм PseixioiTOnas polysaccharoего микроорганизмов рода Pseudonronas 5 genes М-30, при этом культивирование на питательной среде в услови х аэ- ведут при рН 6,5-7,5 и 2В-30с в течерации , содержащей метанол в качестве ние 8-72 ч. единственного источника углерода.Источники информации,

   источники азота, фосфора и другие прин тые во внимание при экспертизе необходимые минеральные соли, с по- Ю 1. За вка Франции № 22317 8, следующим выделением полисахарида, кл. С 12 D iS/OH, опублик. 1975.

   с целью увеличени  активности поли