TH13931U - กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาคทองคำ - Google Patents

Abstract

แก้ไข 1 ก.ย. 2560 กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำ โดยเริ่มจากการออกแบบไพร์เมอร์ 4 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซ ไนอะซิด (isoniazid) ที่ตำแหน่ง 315 (G(สัญลักษณ์)C) ของยีนแคทจี (KatG) ซึ่งในระบบนี้ดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่ม ปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ด้วยปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) หลังจากนั้นเติมตัว ตรวจจับที่ติดฉลากไทอัล (thiol) ที่ปลายด้าน 5’ ลงไป แล้วปล่อยไว้ที่อุณหภูมิเดิมเป็นเวลาอีก 5 นาที เมื่อนำไป ตรวจสอบกับผลผลิตแลมป์ (LAMP) ตัวตรวจสอบดีเอ็นเอจะเข้าไปจับบริเวณที่จำเพาะเจาะจงต่อผลผลิตของ แลมป์ (LAMP) ที่เกิดขึ้น เมื่อมีการเติมเกลือโซเดียมคลอไรด์ (NaCl) หรือแมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) ลงไปใน ปริมาณที่เหมาะสม จะทำให้ผลผลิตของแลมป์ (LAMP) ดังกล่าวทำให้เชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ที่มีเบสกลายพันธุ์ตำแหน่ง 315 (G(สัญลักษณ์) C) จะเห็นอนุภาคทองคำเป็นสีชมพูแดงอยู่ในสารละลาย ในขณะที่ถ้าไม่มีลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 315 (G(สัญลักษณ์)C) จะทำให้เห็นอนุภาคทองคำเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสี ม่วง ---------------------------------------------------------------------------------------------------- แก้ไขบทสรุปการประดิษฐ์ 10/03/2559 กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำ โดยเริ่มจากออกแบบไพร์เมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซ ไนอะซิด (isoniazid) ที่ตำแหน่ง 315 (G?C) ของยีนแคทจี (KatG) ซึ่งในระบบนี้ดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่ม ปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ด้วยปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) หลังจากนั้นเติมตัว จรวจจับที่ติดฉลากไทอัล (thiol) ที่ปลายด้าน 5’ ลงไป แล้วปล่อยไว้ที่อุณหภูมิเดิมเป็นเวลาอีก 5 นาที เมื่อนำไป ตรวจสอบกับผลผลิตแลมป์ (LAMP) ตัวตรวจสอบดีเอ็นเอจะเข้าไปจับบริเวณที่จำเพาะเจาะจงต่อผลผลิตของ แลมป์ (LAMP) ที่เกิดขึ้น เมื่อมีการเติมเกลือโซเดียมคลอไรด์ (NaCl) หรือแมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) ลงไปใน ปริมาณที่เหมาะสม จะทำให้ผลผลิตของแลมป์ (LAMP) ดังกล่าวทำให้เชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ที่มีเบสกลายพันธุ์ตำแหน่ง 315 (G?C) จะเห็นอนุภาคทองคำเป้นสีชมพูแดงอยู่ในสารละลาย ในขณะที่ถ้าไม่มีลำดับเบสกลายพันธุ์ตำแหน่ง 315 (G?C) จะทำให้เห็นอนุภาคทองคำเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสี ม่วง ------------------------------------------------------------ คำขอใหม่ปรับปรุง การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับการป้องกันการกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ที่ เป็นปัญหาสำคัญของประเทศ โดยเริ่มจากการออกแบบ primers 4 ตัว ที่ออกแบบจากลำดับเบสในส่วนยีนเชื้อวัณ โรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ที่ออกแบบจำนวน 2 ชุด โดยมีการกำหนดให้เบสตัวที่ 2 ที่ปลาย 5’ ของ สาย BIP-KatG1 เปลี่ยนเป็นเบส T หรือ A และ BIP-KatG2 ไม่มีการเปลี่ยนเบส ที่ในระบบนี้ DNA เป้าหมายจะ ถูกเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ผลการตรวจพบว่าเทคนิค LAMP มี ความจำเพาะในการตรวจสอบเชื้อวัณโรคกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) เทียบเท่า กับการตรวจสอบด้วยเทคนิค PCR แบบ real time ต่อจากนั้นทำการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ที่จำเพาะต่อ ลำดับเบสของผลผลิต LAMP ที่ได้ แล้วทดสอบสภาวะที่เหมาะสม ในการตรวจสอบผลผลิตของ LAMP ด้วยการ เปลี่ยนแปลงสีของอนุภาคทองคำแล้วอ่านผลการตรวจ เมื่อมีเบสคู่ผสมกับดีเอ็นเอเป้าหมายจำทำให้มีการเปลี่ยน จากสีแดงเป็นสีชมพูม่วง แทนการตรวจสอบด้วยวิธี gel eletrophoresis ซึ่งจะใช้เวลาอีกเพียง 5-15 นาที เท่านั้น

Claims (8)

แก้ไข 1 ก.ย. 2560 1. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำ ประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้อนุภาคทองคำ ภายในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร มีการใช้ไพรเมอร์ 2 ชุดด้วยการทำปฏิกิริยาครั้งเดียว ชุด 1 ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และ ไพรเมอร์ 4 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 2.5U และ สารละลายบัฟเฟอร์ (supplied buffer 1x) และชุด 2 ประกอบด้วยไพรเมอร์ 5 และไพรเมอร์ 6 อย่างละ 2 ไม โครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วย สารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4.8 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 3.5-5.0 U และสารละลายบัฟเฟอร์ (supplied buffer 1x) สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ตำแหน่ง 315 (G(สัญลักษณ์) C) ของยีนแคทจี (katG) ของเชื้อวัณโรค การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ในการตรวจเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ที่มีเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 315 (G(สัญลักษณ์) C) ของยีนแคท จี (katG) ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลาย พันธุ์ที่ตำแหน่ง 315 (G(สัญลักษณ์) C) ของยีนแคทจี (katG) ของเชื้อวัณโรค โดยกำหนดให้เบสตัวที่ 2 ของปลาย 5’ ไพร เมอร์ 4 เปลี่ยนเป็นเบสที (T) หรือเบสเอ (A) และ ไพรเมอร์ 6 ไม่มีการเปลี่ยนเบส ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5’-3’) gAAACAgCggCgCTgATC ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5’-3’) CgAggAAACTgTTgTCCCAT ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5’-3’) gTggTgATCgCgTCCTTACCTTTTAgAgCTCgTATggCACCggAA ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5’-3’) CIggCATCgAggTCgTATTTTTTCgTCggggTgTTCgTCC ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5’-3’) CAAgCCCATCTgCTCCAgCggTTTTTTCggTAAgACCCATggCg ไพรเมอร์ 6 ลำดับเบส (5’-3’) CCggCATCgAggTCgTATTTTTTCgTCggggTgTTCgTCC 2. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) ผนวกกับอนุภาคทองคำ มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมงแล้วเติมตัว ตรวจจับที่ติดด้วยอนุภาคทองคำ ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที หลังจากนั้นเมื่อมีการเติมเกลือ โซเดียมคลอไรด์ (NaCL) หรือแมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) ลงไปในปริมาณที่เหมาะสม จะทำให้ผลผลิตของแลมป์ (LAMP) ดังกล่าวยังคงเห็นเป็นสีชมพูแดงอยู่ในสารละลาย ในขณะที่ถ้าไม่มีลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 315 จะ ทำให้เห็นอนุภาคทองคำเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีม่วง 3. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรค ดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ตำแหน่ง 315 (G(สัญลักษณ์) C) ของยีนแคทจี (KatG) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่ เปลี่ยนแปลง มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติดฉลากไทอัล (thiol;-SH) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจาก แลมป์ (LAMP) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง มีลำดับเบสดังนี้ ชุดที่ 1 5’-SH-CGACCTCgATgCCgg-3’ สำหรับไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 ชุดที่ 2 5’-SH-TggCACCggAACCggTAAggACgCg-3’ สำหรับไพรเมอร์ 5 และไพรเมอร์ 6 4. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรค ดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ตำแหน่ง 315 (G (สัญลักษณ์) C) ของยีนแคทจี (katG) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส 5. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วย กระแสไฟฟ้า 6. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งใช้ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของ วัณโรคดื้อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ---------------------------------------------------------------------------------------------------- แก้ไข 10/03/2559 1. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อสัณโรคดื้อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำเป็นเทคนิคที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้อนุภาคทองคำ ภายใน ปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร มีการใช้ไพรเมอร์ 2 ชุดด้วยการทำปฏิกิริยาครั้งเดียว ชุด 1 ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 3 และ 4 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดี เอ็นทีพี (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 2.5U และสารละลายบัฟเฟอร์ (supplied buffer 1x) และชุด 2 ประกอบด้วยไพรเมอร์ 5 และไพรเมอร์ 6 อย่าง ละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4.8 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ดีเอ็นเอ 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 3.5-5.0U และสารละลาย บัฟเฟอร์ (supplied buffer 1x) สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ตำแหน่ง 315 (G(สูตร)C) ของยีนแคทจี (katG) ของเชื้อวัณโรค การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิค แลมป์ (LAMP) ในการตรวจเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ที่มีเบสกลายพันธุ์ตำแหน่ง 315 (G(สูตร)C) ของยีนแคทจี (katG) ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะ ต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 315 (G(สูตร)C) ของยีนแคทจี (katG) ของเชื้อวัณโรค โดยกำหนดให้เบสตัวที่ 2 ของปลาย 5 ’ไพรเมอร์ 3 เปลี่ยนเป็นเบสที (T) หรือเบสเอ (A) และ ไพรเมอร์ 6 ไม่มีการเปลี่ยนเบส ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5’ – 3’) gAAACAgCggCgCTgATC ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5’ – 3’) CgAggAAACTgTTgTCCCAT ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5’ – 3’) gTggTgATCgCgTCCTTACCTTTTAgAgCTCgTATggCACCggAA ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5’ – 3’) CIggCATCAggTCgTATTTTTTCgTCggggTgTTCgTCC ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5’ – 3’) CAAgCCCATCTgCTCCAgCggTTTTTTCggTAAgACCCATggCg ไพรเมอร์ 6 ลำดับเบส (5’ – 3’) CCggCATCgAggTCgTATTTTTTCgTCggggTgTTCgTCC 2. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) ผนวกกับอนุภาคทองคำ มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วเติมตัว ตรวจจับที่ติดด้วยอนุภาคทองคำ ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที หลังจากนั้นเมื่อมีการเติมเกลือ โซเดียมคลอไรด์ (NaCL) หรือแมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) ลงไปในปริมาณที่เหมาะสม จะทำให้ผลผลิตของแลมป์ (LAMP) ดังกล่าวยังคงเห็นเป็นสีชมพูแดงอยู่ในสารละลาย ในขณะที่ถ้าไม่มีลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 315 จะ ทำให้เห็นอนุภาคทองคำเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีม่วง 3. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรค ดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ตำแหน่ง 315 (G(สูตร)C) ของยีนแคทจี (KatG)ด้วยสีอนุภาคทองคำที่ เปลี่ยนแปลง มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติดฉลากไทอัล (thiol;-SH) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิต จากแลมป์ (LAMP) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง มีลำดับเบสดังนี้ ชุด 1 5’ – SH-CGACCTCGATGCCGG -3’ สำหรับไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 ชุด 2 5’ – SH-TGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCG-3’ สำหรับไพรเมอร์ 5 และไพรเมอร์ 6 4. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรค ดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ตำแหน่ง 315 (G (สูตร) C) ของยีนแคทจี (katG) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส 5. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วย กระแสไฟฟ้า 6. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งใช้ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของ วัณโรคดื้อยาไอโซอะซิด (isoniazid) ------------------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง

1. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วย ด้วยอนุภาคทองคำเป็นเทคนิคใหม่ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้อนุภาคทองคำ

2. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วย อนุภาคทองคำ ด้วยเทคนิคใหม่ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจาก LAMP ผนวกกับ อนุภาคทองคำ มีลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยา LAMP ที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง แล้วเติมตัวตรวจจับที่ติดด้วยอนุภาคทองคำ ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 5 นาที หลังจากนั้นทำการเติมเกลือแล้วอ่านผล

3. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วย อนุภาคทองคำ ด้วยเทคนิคใหม่ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบ เบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ตำแหน่ง 315 (GC) ของยีน KatG ด้วยสี อนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติดฉลาก thiol (-SH) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจ ผลผลิตจาก LAMP ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง มีลำดับเบสดังนี้ ชุดที่ 1 5’-SH-CGACCTCGATGCCGG -3’ สำหรับคู่ FIP-KatG1 และ BIP-KatG1 ชุดที่ 2 5’-SH-TGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCG-3’ สำหรับคู่ FIP-KatG2 และ BIP-KatG2

4. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ในยีน inhA ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) มีข้อตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซ ไนอะซิด (isoniazid) ตำแหน่ง 315 (GC) ของยีน KatG เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส

5. กรรมวิธีในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วย ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) จะต้องใช้เวลาในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซ ไนอะซิด (isoniazid) ที่มีเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 315 (GC) ของยีน KatG เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมงที่ อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส และภายในปฏิกิริยา LAMP 25 ไมโครลิตร มีการใช้ ไพรเมอร์ 2 ชุดด้วยกัน ชุดที่ 1 ประกอบด้วย inner primers FIP-KatG1 และ BIP-KatG1 อย่างละ 2 ?M, outer primers F3-KatG และ B3-KatG อย่างละ 0.2 ?M, dNTPs 1.6 mM ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 M, สารแมกนีเซียมซัล เฟส (MgSO4) 4 mM, 2.5U Bst 2.0 warm start DNA polymerase และ supplied buffer 1x ชุดที่ 2 ประกอบด้วย inner primers FIP-KatG2 และ BIP-KatG2 อย่างละ 2 ?M, outer primers F3- KatG และ B3-KatG อย่างละ 0.2 ?M, dNTPs 1.6 mM ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 M, สาร แมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 mM, 2.5U Bst 2.0 warm start DNA polymerase และ supplied buffer 1x

6. ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยา LAMP ในข้อถือสิทธิที่ 5 การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิค LAMP ในการ ตรวจเชื้อ ที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยา LAMP ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะ ต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งของยีน โดยกำหนดให้เบสตัวที่ 2 ของปลาย 5’ BIP-KatG1 เปลี่ยนเป็นเบส T หรือ A และ BIP-KatG2 ไม่มีการเปลี่ยนเบส ดังนี้ ไพรเมอร์ F3-KatG ลำดับเบส (5’-3’) GAAACAGCGGCGCTGATC ไพรเมอร์ B3-KatG ลำดับเบส (5’-3’) CGAGGAAACTGTTGTCCCAT ไพรเมอร์ FIP-KatG1 ลำดับเบส (5’-3’) GTGGTGATCGCGTCCTTACCTTTTAGAGCTCGCTATGGCACCGGAA ไพรเมอร์ BIP-KatG1 ลำดับเบส (5’-3’) CTGGCATCGAGGTCGTATTTTTTCGTCGGGGTGTTCGTCC ไพรเมอร์ FIP-KatG2 ลำดับเบส (5’-3’) CAAGCCCATCTGCTCCAGCGGTTTTTTCGGTAAGACCCATGGCG ไพรเมอร์ BIP-KatG2 ลำดับเบส (5’-3’) CCGGCATCGAGGTCGTATTTTTTCGTCGGGGTGTTCGTCC

7. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ใน ตำแหน่ง 315 (GC) ของยีน KatG ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ในข้อถือสิทธิที่ 1 มีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่อง PCR และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า

8. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ใน ตำแหน่ง 315(GC) ของยีน KatG ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลงด้วยเทคนิคใหม่ สำหรับการตรวจสอบ เบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ในผู้ป่วยที่ สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกันการระบาดของวัณโรคดื้อต่อยาไอโซไนอะซิด (isoniazid)