TH13932Y - กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยอนุภาคทองคำ - Google Patents

Abstract

แก้ไข 1 ก.ย. 2560 กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำ โดยเริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์ 4 เส้น ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยา ไรแฟมพิซิน (rifampicin) ซึ่งในระบบนี้ดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็น เวลา 1 ชั่วโมง ด้วยปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) หลังจากนั้นเติมตัวตรวจจับที่ติดฉลากไทอัล (thiol) ที่ปลายด้าน 5’ ลง ไปแล้วปล่อยไว้ที่อุณหภูมิเดิมเป็นเวลาอีก 5 นาที จากนั้นเมื่อมีการเติบเกลือโซเดียมคลอไรด์ (NaCL) หรือ แมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) ลงไปในปริมาณที่เหมาะสม จะทำให้ผลผลิตของแลมป์ (LAMP) ดังกล่าวทำให้เชื้อวัณ โรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ที่มีเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) ของ เชื้อวัณโรคจะเห็นอนุภาคทองคำเป็นสีชมพูแดงอยู่ในสารละลาย ในขณะที่ถ้าไม่มีลำดับเบสกลายพันธุ์นั้นจะทำให้ เห็นอนุภาคทองคำเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีม่วง ---------------------------------------------------------------------------------------------------- แก้ไขบทสรุปการประดิษฐ์ 10/03/2559 1503001077 กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรค ดื้อต่อยาแฟมพิซิน (rifam[icin) ด้วยอนุภาค ทองคำ โดยเริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยา ไรแฟมิซืน (rifampicin) ซึ่งในระบบนี้ดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็น เวลา 1 ชั่วโมง ด้วยปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) หลังจากนั้นเติมตัวตรวจจับที่ติดฉลากไทอัล (thiol) ที่ปลายด้าน 5’ ลง ไป แล้วปล่อยไว้ที่อุณหภูมิเดิมเป็นเวลาอีก 5 นาที จากนั้นเมื่อมีการเติบเกลือโซเดียมคลอไรด์ (NaCL) หรือ แมกนีเซียมซัลเฟต (NgSO4) ลงไปในปริมาณที่เหมาะสม จะทำให้ผลผลิตของแลมป์ (LAMP) ดังกล่าวทำให้เชื้อวัณ โรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ที่มีเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) ของ เชื้อวัณโรคจะเห็นอนุภาคทองคำเป็นสีชมพูแดงอยู่ในสารละลาย ในขณะที่ถ้าไม่มีลำดับเบสกลายพันธุ์นั้นจะทำให้ เห็นอนุภาคทองคำเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีม่วง -------------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับการป้องกันการกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ที่เป็นปัญหาสำคัญของประเทศ โดยเริ่มจากการออกแบบ primers 4 ตัว ที่ออกแบบจากลำดับเบสในส่วนยีนเชื้อ วัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ที่ออกแบบจำนวน 2 ชุด โดยชุดที่ 1 สำหรับการตรวจหาลำดับเบสกลาย พันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 บนยีน rpoB และ ชุดที่ 2 สำหรับตรวจหาลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 526 บนยีน rpoB ในระบบนี้ DNA เป้าหมายจะถูกเพิ่มปริมาณภายใต้อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ผลการตรวจ พบว่าเทคนิค LAMP มีความจำเพาะในการตรวจสอบเชื้อวัณโรคกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) เทียบเท่ากับการตรวจสอบด้วยเทคนิค PCR แบบ real time ต่อจากนั้นทำการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ที่จำเพาะต่อลำดับเบสของผลผลิต LAMP ที่ได้ แล้วทดสอบสภาวะมี่เหมาะสม ในการตรวจสอบผลผลิต ของ LAMP ที่ได้บนแผ่น Dipstick แทนการตรวจสอบด้วยวิธี gel eletrophoresis ซึ่งจะใช้เวลาอีกเพียง 5-15 นาทีเท่านั้น

Claims (8)

แก้ไข 1 ก.ย. 2560 1. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำ ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้ด้วยอนุภาคทองคำ ภายใน ปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร มีการใช้ไพรเมอร์ 2 ชุดด้วยการทำปฏิกิริยา 2 ครั้ง ชุดที่ 1 ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดี เอ็นทีพีส์ (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 2.5U และสารละลายบัฟเฟอร์ ใช้ในการตรวจลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 ของยีนอาร์โฟบี (rpoB) ของ เชื้อวัณโรค ชุดที่ 2 ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพี (dNTP) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สาร แมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเทสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 2.5 U และสารละลายบัฟเฟอร์ สำหรับการตรวจลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 526 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ในการตรวจเชื้อ ที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 เส้น ที่จำเพาะ ต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โพบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5’-3’) CCgCAgACgTTgATCAACAT ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5’-3’) CAggggTTTCgATTgggC ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5’-3’) ggTgCTgAAgAACTCCTTgATTTTgCCggTggTCgCCgCg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5’-3’) AgCgCTTggggCCCgTTTTAgTgCgACgggTgCA ไพรเมอร์ 5 ลำดับเบส (5’-3’) HACAAgCgCCgACTgTCTTTTAgTgCgACgggTgCA H = A/C/T 2. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) ผนวกกับอนุภาคทองคำ มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมงแล้วเติมตัว ตรวจจับที่ติดด้วยอนุภาคทองคำ ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที หลังจากนั้นเมื่อมีการเติมเกลือ โซเดียมคลอไรด์ (NaCl) หรือแมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) ลงไปในปริมาณที่เหมาะสม จะทำให้ผลผลิตของแลมป์ (LAMP) ดังกล่าวยังคงเห็นเป็นสีชมพูแดงอยู่ในสารละลาย ในขณะที่ถ้าไม่มีลำดับเบสกลายพันธุ์ จะทำให้เห็น อนุภาคทองคำเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีม่วง 3. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อ วัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติด ฉลากไทอัล (thiol;-SH) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่ เปลี่ยนแปลง มีลำดับเบสดังนี้ 5’- SH-CATggACCAgAACAAC-3’ 4. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรค ดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส 5. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสารพันธุกรรมด้วย กระแสไฟฟ้า 6. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งใช้สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกัน การระบาดของวัณโรคดื้อยาไรแฟมพิซิน (Rifampicin) ---------------------------------------------------------------------------------------------------- แก้ไข 10/03/2559 1. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำ ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้ด้วยอนุภาคทองคำ ภายใน ปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) 25 ไมโครลิตร มีการใช้โพรเมอร์ 2 ชุดด้วยการทำปฏิกิริยา 2 ครั้ง ชุดที่ 1 ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 4 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดี เอ็นทีพีส์ (dNTPs) 1.6 มิลลิโมลาร์ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเอสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 2.5U และสารละลายบัฟเฟอร์ ใช้ในการตรวจลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค ชุดที่ 2 ประกอบด้วยไพรเมอร์ 3 และไพรเมอร์ 5 อย่างละ 2 ไมโครโมลาร์, ไพรเมอร์ 1 และไพรเมอร์ 2 อย่างละ 0.2 ไมโครโมลาร์, ดีเอ็นทีพีส์ (dNTPs) 1.6 มิลลิโมลาร์ ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 โมลาร์, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4.8 มิลลิโมลาร์, เอนไซม์ บีเทสที 2.0 วอร์ม สตาร์ท ดีเอ็นเอ โพลี เมอเรส (Bst 2.0 warm start DNA polymerase) 3.5-5.0 U และสารละลายบัฟเฟอร์ สำหรับการตรวจลำดับ เบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 526 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) ของเชื้อวัณโรค การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิคแลมป์ (LAMP) ในการตรวจเชื้อ ที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ประกอบด้วย ไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 ของยีนอาร์โบบี (rpoB) ของเชื้อวัณ โรค ดังนี้ ไพรเมอร์ 1 ลำดับเบส (5’-3’) CCgCAgACgTTgATCAACAT ไพรเมอร์ 2 ลำดับเบส (5’-3’) CAggggTTTCgATTgggC ไพรเมอร์ 3 ลำดับเบส (5’-3’) ggTgCTgAAgAACTCCTTgATTTTgCCggTggTCgCCgCg ไพรเมอร์ 4 ลำดับเบส (5’-3’) HACAAgCgCCgACTgTCTTTTAgTgCgACgggTgCA H = A/C/T 2. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) ผนวกกับอนุภาคทองคำ มี ลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมงแล้วเติมตัว ตรวจจับที่ติดด้วยอนุภาคทองคำ ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที หลังจากนั้นเมื่อมีการเติมเกลือ โซเดียมคลอไรด์ (NaCl) หรือแมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) ลงไปในปริมาณที่เหมาะสม จะทำให้ผลผลิตของแลมป์ (LAMP) ดังกล่าวยังคงเห็นเป็นสีชมพูแดงอยู่ในสารละลาย ในขณะที่ถ้าไม่มีลำดับเบสกลายพันธุ์ จะทำให้เห็น อนุภาคทองคำเปลี่ยนจากสีแดงเป็นสีม่วง 3. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อ วัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง มีลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติด ฉลากไทอัล (thiol;-SH) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจากแลมป์ (LAMP) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่ เปลี่ยนแปลง มีลำดับเบสดังนี้ 5’- SH-CATggACCAgAACAAC-3’ 4. กรรมวิธีการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยอนุภาค ทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยาแลมป์ (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรค ดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส 5. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วย อนุภาคทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่องพีซีอาร์ (PCR) และเครื่องแยกสาร พันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า 6. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วย อนุภาคทองคำตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งใช้สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อนี้ เพื่อการตรวจวินิจฉัยและป้องกัน การระบาดของวัณโรคดื้อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin) ------------------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง

1. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วยการ เปลี่ยนแปลงสีของอนุภาคทองคำ เป็นเทคนิคใหม่ที่ซึ่งประกอบด้วยการทำปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ร่วมกับการประยุกต์ใช้อนุภาคทองคำ

2. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วย อนุภาคทองคำ ด้วยเทคนิคใหม่ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจผลผลิตจาก LAMP ด้วยการ เปลี่ยนแปลงสีของอนุภาคทองคำ มีลักษณะเฉพาะคือ ทำปฏิกิริยา LAMP ที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง แลวเติมตัวตรวจจับ ที่อุณหภูมิ 61 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 5 นาที หลังจาก นั้นทำการเติมเกลือ แล้วอ่านผล

3. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วย อนุภาคทองคำ ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งกรรมวิธีการออกแบบตัวตรวจจับ (probe) ในการตรวจสอบ เบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง มี ลักษณะเฉพาะคือ ตัวตรวจจับติดฉลาก thiol (-SH) ที่ปลายด้าน 5’ เพื่อการตรวจผลผลิตจาก LAMP ด้วยสี อนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลงมีลำดับเบสดังนี้ 5’–SH-CATGGACCAGAACAAC-3’

4. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วยสี อนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) มีขั้นตอนดังนี้ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิประมาณ 61 องศาเซลเซียส

5. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วยสี อนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ด้วยเทคนิคใหม่ ในข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งปฏิกิริยา Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) จะต้องใช้เวลาในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ที่มีเบสกลายพันธ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 บนยืน rpoB เป็นเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ ประมาณ 61 องศาเซลเซียส และ ภายในปฏิกิริยา LAMP 25 ไมโครลิตร มีการใช้ไพรเมอร์ 2 ชุดด้วยกัน ชุดที่ 1 สำหรับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 บนยีน rpoB ประกอบด้วย inner primers FIP-rpoB และ BIP-rpoB531 อย่างละ 2 ?M, outer primers F3-rpoB และ B3-rpoB อย่างละ 0.2 ?M, dNTPs 1.6 mM ผสมด้วยสารเบตา อีน (betaine) 0.6 M, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 mM, 2.5U Bst 2.0 warm start DNA polymerase และ supplied buffer 1x ชุดที่ 2 สำหรับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 523 บนยีน rpoB ประกอบด้วย inner primers FIP-rpoB และ BIP-rpoB526 อย่างละ 2 ?M, outer primers F3-rpoB และ B3-rpoB อย่างละ 0.2 ?M, dNTPs 1.6 mM ผสมด้วยสารเบตาอีน (betaine) 0.6 M, สารแมกนีเซียมซัลเฟส (MgSO4) 4 mM, 2.5U Bst 2.0 warm start DNA polymerase และ supplied buffer 1x

6. ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยา LAMP ในข้อถือสิทธิที่ 5 การออกแบบไพรเมอร์สำหรับเทคนิค LAMP ในการ ตรวจเชื้อ ที่มีเบสกลายพันธุ์เพียงหนึ่งเบส ไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยา LAMP ประกอบด้วยไพรเมอร์ 4 ตัว ที่จำเพาะ ต่อลำดับเบสกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 531 และ 526 บนยีน rpoB ของเชื้อวัณโรคดังนี้ ไพรเมอร์ F3-KatG ลำดับเบส (5’-3’) CCGCAGACGTTGATCAACAT ไพรเมอร์ B3-KatG ลำดับเบส (5’-3’) CAGGGGTTTCGATTGGGC ไพรเมอร์ FIP-KatG1 ลำดับเบส (5’-3’) GGTGCTGAAGAACTCCTTGATTTTGCCGGTGGTGGTCGCCGCG ไพรเมอร์ BIP-rpoB531 ลำดับเบส (5’-3’) CTGGCATCGAGGTCGTATTTTTTCGTCGGGGTGTTCGTCC ไพรเมอร์ BIP-rpoB526 ลำดับเบส (5’-3’) AGCGCTTGGGGCCCGTTTTAGTGCGACGGGTGCA

7. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วยสี อนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ในข้อถือสิทธิที่ 1 มีลักษณะเฉพาะคือ ไม่ต้องใช้เครื่อง PCR และเครื่องแยกสาร พันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้า

8. กรรมวิธีใหม่ในการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วยสี อนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ด้วยเทคนิคใหม่ สำหรับการตรวจสอบเบสกลายพันธุ์ของเชื้อวัณโรคดื้อต่อยา ไรแฟนพิซิม (Rifampicin) ด้วยสีอนุภาคทองคำที่เปลี่ยนแปลง ในผู้ป่วยที่สงสัยการติดเชื้อดื้อยานี้ เพื่อการตรวจ วินิจฉัยและป้องกันการระบาดของโรค