TR201713643A2 - Koaservasyon yöntemi̇ i̇le koaservat üreti̇mi̇ yöntemi̇ ve bu üreti̇m yöntemi̇ i̇le elde edi̇len koaservatlar ve bunlarin doku i̇skelesi̇ olarak kullanimi - Google Patents

Abstract

Bu buluş, kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA) polimerleri ile kompleks koaservasyon tekniği kullanılarak doku mühendisliğine yönelik hücre enkapsüle edebilme (makro-enkapsülasyon) kapasitesine sahip doku iskelesi üretimi ile ilgilidir. Buluşun amacı, biyobozunur, biyouyumlu ve elastik özelliklere sahip, tamamen doğal polimerlerden oluşan ve hiçbir çapraz bağlayıcı veya organik solvent kullanılmadığı için toksik etkisi bulunmayan ve hücre yaşamasına, çoğalmasına ve eğer ki kök hücre kullanılıyor ise arzu edilen hücre tipine özelleşmesine elverişli bir ortam sağlayacak gözenekli yüzeye sahip olan doku iskelelerinin oluşturulmasını sağlayan bir üretim gerçekleştirmektir (Şekil 7).

Description

TARIFNAME KOASERVASYON YÖNTEMI ILE KOASERVAT ÜRETIMI YÖNTEMI VE BU ÜRETIM YÖNTEMI ILE ELDE EDILEN KOASERVATLAR VE BUNLARIN DOKU ISKELESI OLARAK KULLANIMI Teknik Alan Bu bulus, kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (hiyalüronat, hiyalüronan, HA) polimerleri ile kompleks koaservasyon teknigi kullanilarak doku mühendisligine yönelik hücre enkapsüle edebilme kapasitesine sahip doku iskelesi üretimini saglayan bir doku iskelesi üretim yöntemi ile ilgilidir. Önceki Teknik Doku mühendisligi, organ ve dokularin hastalara nakledilmek üzere laboratuvar kosullarinda olusturulmasiyla ugrasan bir bilim dalidir. Doku mühendisliginde, hücreler, materyaller ve büyüme faktörleri ile biyolojik doku olusturulmasi amaçlanmaktadir. Teknigin bilinen durumunda kullanilan doku iskelelerinde genellikle karsilasilan sorunlar; yüzey alani/hacim oraninin yeterince arttirilamamasi, yeterli gözenekliligin saglanamamasi, bozunma hizinin düsük olmasi ve mekanik özellikleri bakimindan dayanikli yapilarin olusturulamamasidir.

Kikirdak doku mühendisliginde siklikla doku iskelesi kullanilmaktadir. Eklem kikirdaginin iyilesme kapasitesi sinirlidir. Bu sebeple kikirdak doku mühendisligi en çok çalisilan alanlardan biridir. Hücre rejenerasyonu ile birlikte fenotipinin de korunmasi için çesitli hücre iskeleleri kullanilmaktadir. En çok kullanilanlar dogal ve sentetik polimerlerdir. Sentetik polimerlerden özellikle poli a-hidroksi asitler (polilaktik asit, poliglikolik asit) Amerikan gida ve ilaç dairesi (FDA) tarafindan onaylidir ve degisik türleri patentlenmistir.

Fakat, sentetik polimer kullaniminda ortaya çikan yikim ürünleri asidiktir ve olusan atik birikimine karsi immün reaksiyon olusumu siklikla görülmektedir.

Ayrica kullanilan yöntemlerde degradasyon hizi ayarlanmasi, iskelenin dogal elastiklik sorunlari nedeniyle uyumsuzlugu ve sutür kullanilarak sabitlenmesi, kullanilan hücrenin dogru fenotipe farklilastirilamamasi gibi eksikler ve kisitlamalar mevcuttur.

Normal dokuya olan yapi benzerligi ve bozunan maddelerin biyolojik uyumu dolayisi ile dogal polimerler de siklikla doku mühendisligi alaninda kullanilmaktadir. En popüler olanlarin basinda ise kitosan ve hiyalüronik asit gelmektedir. Bu polimerlerin çesitli kombinasyonlari ve farkli üretim teknikleri ile hazirlananlari biyouyumluluk, biyobozunurluk, adezyon gibi özellikleri bakimindan pozitif sonuçlar vermektedir. Ancak dogal polimerlerin doku mühendisliginde uygulamalariyla ilgili bazi sorunlar da vardir. Bu sorunlardan bazilari, hazirlama yönteminde kullanilabilen dogal polimerlerin çapraz baglanmalari sonucu biyouyumluluklannin etkilenmesi ve üretilen doku iskelesi üzerine ekilen hücrelerde fenotip bozulmasidir.

Kompleks koaservasyon, kolloidal bir sulu çözeltide zit yüklü makroiyonlar arasindaki sivi-sivi faz ayrimina dayanan bir yöntemdir. Yöntemin gerçeklesmesine neden olan baslica etkenler; karsit yüklü makroiyonlar arasindaki elektrostatik çekim ve ortama salinan küçük karsit yükler ile iliskili entropi kazanimidir. Makroiyon solüsyonlarinin karistirilmasi sonucu olusan bulanik fazda mikrometre büyüklügünde küre seklinde damlaciklar bulunur. Bu damlaciklarin birlesip iki farkli yogunlukta sivi fazin olusmasi santrifuj uygulanmasiyla hizlandirilarak ya da kendi kendine çökmeye birakilarak yavas yavas gerçeklesebilir. Olusan iki sivi fazdan alttaki; yogunlugu ve viskozitesi yüksek, makroiyonca zengin akiskan bir faz olup, koaservat olarak anilir.

Yukaridaki faz (süpernatant) ise, karisimdan önceki makroiyon konsantrasyonlarinda bile az bir konsantrasyona sahip ve yogunluk bakimindan suya benzeyen bir sividir. Koaservat fazinin olusumuna etki eden degisik faktörleri (polimer molekül agirligi, yük yogunlugu, esnekligi, ortam pH`i ve iyonik siddeti, sicakligi, karisimdaki karsit yüklü makroiyonlannin birbirine orani) degistirerek jel-benzeri akiskanlar elde edilip doku mühendisliginde kullanilabilir.

Literatürde zit yüklü makroiyonlar kullanilarak gerçeklestirilen birçok yöntem vardir ancak bunlar kompleks koaservasyon ile karistirilmamalidir. Bunlarin baslicalari; çökelti, flokül, hidrojel ve tabaka-tabaka olusumlaridir. Koaservatlar çökelti ve floküllerden makroskopik olarak farklidir: Çöktürme, kati-sivi faz ayrimidir ve buradaki yogun faz, kristal özellik gösterir. Floküller de kati-sivi faz aynmiyla olusur ancak daha az yogundur ve solüsyonda floküller daha uzun süre gözle görülebilir sekilde asili kalirlar.

Tabaka-tabaka gerçeklestirilen olusumlarin kendi kendine birlesen polielektrolitlerden (koaservat) farki; koaservasyonda ayni solüsyon içerisinde kisa-mesafeli Coulomb çekme ve uzun-mesafeli Coulomb itme kuvvetleri bulunmasindan dolayi saliverilen karsit iyonlar sayesinde makromoleküllerin tekrardan yapisal bir düzenlemeye girerek çoklu tabakalardan farkli reolojik ve dinamik özellikler kazanmalaridir.

Hidrojel üretiminde jel olusumu en az %5 (agirlikça) polimer gerektirirken, koaservatlar % 0.1 (agirlikça) konsantrasyonlarda bile olusabilirler. Hidrojel yapiminda organik solventler veya jellesmeyi saglamak için toksik kimyasal baglayicilar veya baslaticilar kullanilmaktadir. Bunlar hücre enkapsülasyonu asamasinda hücre canliligini olumsuz yönde etkilemektedir. Kompleks koaservasyon yöntemi ile kimyasal çapraz baglayici ajanlarin kullanimina gerek kalmaz ve böylece reaktiflerin muhtemel toksisitesi ve diger istenmeyen etkileri azaltilir. Bu özellikleri, koaservatlari diger polielektrolit sistemlerden daha avantajli hale getirmektedir.

Bulusun Kisa Açiklamasi Bulusun amaci biyobozunur, biyouyumlu ve elastik özelliklere sahip doku iskelesi olarak kullanilan koaservatlarin üretim yöntemi gerçeklestirmektir.

Bulusun diger amaci, tamamen dogal polimerlerden olustugu ve hiçbir organik çözücü veya çapraz baglayici kullanilmadigi için toksik etkisi bulunmayan doku iskelesi olarak kullanilan koaservatlarin üretim yöntemi gerçeklestirmektir.

Bulusun bir diger amaci, hücre yasamasina olanak saglayacak kadar geçirgen olup (besinlerin, oksijenin, karbondioksitin ve hücre atiklarinin difüzyonuna olanak saglayacak yapiya sahip) hücrelerin rahatlikla tutunabilecegi hücre yüzeyi reseptörlerine (CD44 ve RHAMM) baglanabilen bilesenlere sahip (örnegin, hiyalüronik asit), yogun ve viskoz bir yapi içerisinde yüksek miktarlarda hücre hapsetme kapasitesi olan doku iskelesi olarak kullanilan koaservatlarin üretim yöntemi gerçeklestirmektir.

Ayrica enkapsüle edilen hücrelerin çogalmasina ve eger ki kök hücre kullaniliyor ise arzu edilen hücre tipine özellesmesine elverisli bir alan saglayacak gözenekli yüzeye sahip, yüksek su miktari içeren, (> agirlikça %90) doku iskelesi olarak kullanilan koaservatlarin üretim yöntemi gerçeklestirmektir.

Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen “Koaservasyon Yöntemi Ile Koaservat Üretimi Yöntemi ve Bu Üretim Yöntemi ile Elde Edilen Koaservatlar ve Bunlarin Doku Iskelesi Olarak Kullanimi” ekli sekillerde gösterilmis olup; bu sekillerden: Sekil 1- Hiyalüronik asit (HA) solüsyonunun kitosan (KT) solüsyonunun üzerine farkli hacimlerde eklenmesi sonrasi olusan koaservat süspansiyonlarinin absorpsiyon ile ölçülen bulanikliklarinin grafiksel ve fotografik olarak gösterimidir (HA ve KT solüsyonlari, 300 mM iyonik siddete sahip (A) NaCl çözeltisinde; (B) CaClz çözeltisinde hazirlanmislardir). (Fotograflarda koaservat süspansiyonlarinin görsel bulanikligi gözlenebilmektedir. Hacimsel olarak HA solüsyonunun KT solüsyonuna ekleme oranlari, her bir küvetin üzerinde verilmistir).

Seki12- Katyonik olan KT polielektrolitinin anyonik olan olan HA polielektroliti ile titre edilmesi ile elde edilen Z ortalama çaplarinin (isik siddeti agirlikli ortalama hidrodinamik çap) grafiksel gösterimidir.

(Ortamin CaClz tuzu kullanilarak ayarlanmistir.) Sekil3- HA solüsyonunun KT solüsyonu üzerine eklenmesi sonrasi olusan koaservat süspansiyonunun optik mikroskopi görüntüleridir. ((A) Koaservat süspansiyonu içindeki damlaciklar (B) Çökelti sonucu olusan yumak seklinde olusumlar (Iloklar); Ölçek çubuklari 20 um'yi temsil Sekil 4 - Faz ayrimi sonrasi olusan koaservatlann liyofilizasyon sonrasi taramali elektron mikroskobu (SEM) görüntüleridir. ((A) NaCl tuzu kullanilarak hazirlanan hücre enkapsüle edilmemis (bos) numune, (B) CaClz tuzu kullanilarak hazirlanan hücre enkapsüle edilmemis (bos) numune, (C) NaCl tuzu kullanilarak hazirlanan hücre enkapsüle edilmis numune, (D) CaClz tuzu kullanilarak hazirlanan hücre enkapsüle edilmis numune) (Oklar, hücre ve hücresel uzantilari göstermektedir) Sekil 5- Hazirlanan HA/KT koaservatlarinin içine enkapsüle edilen hücrelerin canliliginin, 1, 7, 14 ve 21 günlük inkübasyonlar sonunda canli/ölü boyamasi ile tayin edilmesi ve hücre canliligini degerlendirilmesi için olusturulan grafiksel gösterimdir. (Canli hücrelerin sayisinin toplam hücre sayisina orani, hücre canliligi yüzdesini vermistir.) Sekilö- HA/KT koaservatlarin içine enkapsüle edilmis olan hücrelerin morfolojik görüntüleridir. (3 günlük inkübasyondan sonra çekilen görüntüler) ((A) NaCl tuz çözeltisi kullanilarak hazirlanmistir, (B) CaC12 tuz çözeltisi kullanilarak hazirlanmistir; on dört günlük inkübasyondan sonra çekilen görüntüler (C) NaCl tuz çözeltisi kullanilarak hazirlanmistir, (D) CaClz tuz çözeltisi kullanilarak hazirlanmistir) (Aktin filamentler yana dönük ok ile hücre çekirdekleri ise asagi dönük ok ile gösterilmistir.) (Ölçek çubuklari üst resimlerde mm, alt resimlerde 5 um'yi temsil eder.) Sekil 7 - Kompleks koaservasyon yönteminin sematik gösterimidir.

Sekillerdeki parçalar numaralandirilmis olup karsiliklari asagida verilmistir KT. Kitosan polimeri HA. Hiyalüronik asit polimeri SN. Süpernatant K0. Koaservat Bulus konusu Koaservasyon yöntemi ile bir doku iskelesinin olusturulmasinda kullanilacak koaservat üretim yöntemi, kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (sodyum hiyalüronat, hiyalüronan) (HA) polimerleri ile, özellikle bag dokusu yaralanmalarinda, doku rejenerasyonunu desteklemek üzere tasarlanmis doku iskelesi olusturulmasinda kullanilan ve hücre enkapsüle edilebilinen dogal polimer sisteminin üretimi olup, kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA),nin, sulu tuz çözeltisi içerisinde çözülmesi, hücre tasiyan koaservatlari hazirlamak için hücrelerin üzerine HA çözeltisi eklenip karistirilmasi, sonrasinda, HA/hücre süspansiyonunun, manyetik karistiricida karistirilmakta olan ve tuz içeren KT çözeltisi üzerine damlatilarak ilave edilerek karistirilmasi, karisim içerisinde karsit yüklü makroiyonlar (kitosan ve hiyaluronik asit) arasindaki elektrostatik çekim ve ortama salinan küçük karsit yükler (Na+, Ca2+, Cl`) ile iliskili entropi kazanimi sayesinde (kompleks koaservasyon) olusan bu bulanik faza santrifüj uygulanip, bu fazda bulunan koaservat damlaciklarinin birlesmesini takiben sivi-sivi faz aynminin gerçeklestirilmesi, - içerigindeki makroiyon konsantrasyonu baslangiçtaki makroiyon konsantrasyonlarindan bir hayli yüksek olan alt koaservat fazinin ek bir isleme tabii tutulmadan santrifüj yapilarak toplanmasi, - dogrudan doku iskelesi olarak kullanilacak olan koasevatlarin elde edilmesi adimlarindan olusmaktadir.

Bulus konusu, kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA) polimerleri ile kompleks koaservasyon teknigi kullanarak doku mühendisligine yönelik hücre enkapsüle edebilme kapasitesine sahip doku iskelesi üretimi gerçeklestirmektir. Bulus, özellikle bag doku yaralanmalarinda, doku rejenerasyonunu desteklemek üzere tasarlanmis, hücre enkapsüle edebilen dogal polimer sistemlerini içerir.

Biyomühendislik ve Malzeme Mühendisligi alanlari kapsamindadir.

Biyoteknoloji sektörüne dahildir.

Bulus kapsaminda elde edilen koasevat ürünleri dogrudan doku iskelelerinin elde edilmesinde kullanilmaktadir. Birden çok polimer kullanildigi kompleks koaservasyon yöntemi ile gerçeklestirilen koaservat olusumu sonrasinda hiçbir ek islem yapilmadan dogrudan kuyucuklu tabaklara alinarak hücre kültürü uygulamalari (in vitro) gerçeklestirilmektedir. “Koaservat” terimi; kompleks koaservasyon yöntemi sonucu olusan bulanik faz karisimina santrifüj uygulanmasi sayesinde olusan iki fazdan alttaki yogun fazi ifade etmektedir. Üretilen koaservatlarin hacmine hücre sayisi oranlandiginda, 1 m1 koaservat içerisinde 1 milyon hücre bulunmaktadir. Koaservatlar içerisinde hapsedilen hücre sayisi binlerden baslayip 10 milyonlara kadar degisiklik gösterebilmektedir.

Bulus kapsaminda öncelikle, 0.09 % (agirlikça) konsantrasyonuna sahip olacak sekilde Kitosan (KT) ve 0.07 % (agirlikça) konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hiyalüronik asit (HA) biyopolimerlerinin, oda sicakliginda, toplam iyonik siddet tuzunun sulu çözeltisi veya kalsiyum klorür (CaClz) tuzunun sulu çözeltisi içerisinde 24 saat boyunca manyetik karistirici vasitasiyla sabit hizda karistirilarak çözülmesi gerçeklestirilmektedir. Bu islem sirasinda, her iki polimer solüsyonunun pH'i, 1 M (Molar),lik sodyum hidroksit veya hidroklorik asit çözeltisi eklenerek 6.25 olarak ayarlanmakta ve her solüsyon, 0.45 mikrometre gözenek boyutlu filtre kullanarak laminer kabin içerisinde steril edilmektedir. Koaservasyon olusumunda kullanilan HA/KT karisiminin pH degeri, hücre canliligini (koaservasyon metodu hücre koaservatin içerisindeyken gerçeklestigi için) koruyacak sekilde olmalidir (optimum 7.4). Ancak kitosan polimerinden kaynaklanabilecek yüksek pH degerlerindeki çözünmezlik problemi sebebi ile KT`nin farkli deasetilasyon dereceleri göz önüne alinarak optimize edilebilir. Hücre enkapsülasyonu gerçeklestirilecek ise pH 5.5-7 araliginda, hücresiz örneklerde ise pH 2-7 araliginda HA/KT polimerleri kullanilarak koaservasyon gerçeklestirilmesi mümkündür.

Koaservasyonda kullanilacak polimerlerin çözülmesi, sadece ultra saf su kullanilarak veya farkli konsantrasyonlarda tuz veya tampon çözeltiler ile gerçeklestirilebilir ancak olusan koaservatin özellikleri (koaservatin içerdigi su miktari, mekanik özellikleri vb.) kullanilan çözücüye bagli olarak degiskenlik gösterecektir. Ayrica hücre canliligi saglanmasi için HA/KT koaservatlarinin avantaji fizyolojik kosullara yakin birçok deneysel kosulda (iyonik siddet, sicaklik ve pH`ta) çalismaya elverisli olmasidir.

Hücreli örneklerle kiyaslamada kullanilacak olan bos koaservatlarin (kontrol örnekleri) hazirlamak için sadece HA`yi içeren çözelti KT`yi içeren çözeltiye damla damla eklenmektedir. Bu ekleme sirasinda HA/KT karisimi sürekli olarak manyetik karistirici ile karistinlmaya devam etmektedir. Koaservati hazirlamak için kullanilan hem HA hem KT ayni iyonik tuz türünde çözülmesi gerekmektedir. Yani, bir çalismada hem HA hem KT solüsyonlari NaCl çözeltisinde çözülürken, diger bir çalismada hem HA hem KT solüsyonlari CaC12,de çözülmektedir. Polimerlerin tuz çözeltisinde çözülmesi sonrasi, bos örnekler (kontrol örnekleri) için sadece HA çözeltisinin; hücreli örnekler için ise HA çözeltisinde süspanse edilmis hücreler, karistirici üzerindeki KT çözeltisi üzerine damlatilarak ilave edilmektedir. Hücre tasiyan koaservatlari hazirlamak üzerine HA çözeltisi eklenip karistirilmaktadir. Sonrasinda, HA/hücre süspansiyonu, manyetik karistiricida karistirilmakta olan ve ayni tuzu içeren KT çözeltisi üzerine damlatilarak ilave edilmektedir. Bu damlatma islemi, literatürün genelinden farki, mikrokapsül olusturmak için kullanilan ve belirli bir çapa sahip (genel olarak <2 mm igne ucu dis çapi) siringa ignesi ile ekleme yöntemi ile degil; pipetör (pipet) gibi bir dagitici/akitaç kullanilmasiyla gerçeklestirilmektedir.

Böylelikle, herhangi bir hava sikismasi yaratmadan olusturulan damlalarin, kitosan solüsyonuna eklenmesiyle, homojen sekilde dagilmis, 0.5-1 mikrometre çapa sahip küresel damlaciklar içeren bulanik bir faz olusumu (koaservat süspansiyonu) saglanmaktadir. Bu asamada bulus konusu yöntemde 1-100 mm boyutlarindaki mikrokapsüllerin olusumu yerine, içerisinde 0.5-1 mikrometre çapa sahip küresel damlaciklar bulunan bulanik ve kolloidal bir dispersiyon olusmaktadir. Bu bulanik faz, karsit yüklü makroiyonlar (kitosan ve hiyaluronik asit) arasindaki elektrostatik çekim ve ortama salinan küçük karsit yükler (Na+, Ca2+, C1") ile iliskili entropi kazanimi sayesinde olusmaktadir (kompleks koaservasyon fenomeni). Kompleks koaservasyon metoduyla olusan bulanik faza santrifüj uygulanmasi sonrasinda, bu fazda bulunan koaservat damlaciklarinin birlesmesini takiben sivi-sivi faz ayrimi gerçeklestirilmektedir. Sivi-sivi faz ayrimini hizlandirmak için kullanilan santrifüjleme yönteminde santrifüj süresi ve siddeti, koaservat içindeki hücrenin dayanikliligina ve uygulamanin amacina göre degistirilebilir. Santrifüj kullanma adimi yerine, koaservasyon süspansiyonunu birkaç gün kendi kendine bekletmek de sadece yer çekimi etkisiyle sivi-sivi faz ayrimi olarak sonuçlanir.

Olusan iki fazdan, üstteki süpernatant (içerigindeki makroiyon konsantrasyonu baslangiçtaki polimer konsantrasyonlarindan düsük), alttaki koaservat (içerigindeki makroiyon konsantrasyonu baslangiçtaki makroiyon konsantrasyonlarindan bir hayli yüksek) olarak adlandirilir. Alt fazda biriktirilen hücreli veya hücresiz (bos) koaservatlarin hiçbir ek isleme tabi tutulmadan (sonikasyon, liyofilizasyon, organik solvent uçurma, solvent dökme Vb.) dogrudan doku iskelesi olarak kullanilmak üzere santrifüj ile merkez kaç kuvveti yaratilarak makroiyonlar asagi toplanmaktadir. Hücre içeren koaservatlarda, literatürden farkli olarak, koaservat doku iskelesine sonradan hücre ekim islemi yerine; koaservati olusturma asamasinda, hücrelerin önce polimerlerden birinde süspanse edilerek bu hücre/polimer karisimi, karsit yüklü olan polimer solüsyonuna damla damla eklenmek suretiyle hazirlanmaktadir. Yani, mikroenkapsülasyon yerine makroenkapsülasyon yapilarak hücreler dogrudan doku iskelesinin içerisine hapsedilmektedir.

Kitosan ve hiyalüronik asit polimerlerinin farkli tuz (NaCl veya CaClg) çözeltilerinde çözülmesi ve bunlarin karistirilmasi sonucunda elde edilen ve ayri küvetlerde hazirlanan (hacimce) farkli HA/KT ekleme oranlarina sahip karisimlarin, (santrifuj kullanilarak veya birkaç gün bekletilerek faz ayrimina ugramalarindan önce) karakterizasyonu, UV-Vis spektrometreyle bulaniklik ölçümü, dinamik isik saçilimi (DLS) ve optik mikroskopi teknikleri ile gerçeklestirilmistir. Kompleks koaservasyon yöntemi ile santrifüj sonrasi faz ayrimi gerçeklestirilmektedir. Faz aynmi sonrasi elde edilen ve doku iskeleleri olarak kullanilacak koaservatlarin, gözeneklilik ve yüzey analizleri taramali elektron mikroskobu (SEM) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Karakterizasyon sonrasi ayni yöntem ile hazirlanan doku iskelelerinde hücre enkapsülasyonu gerçeklestirilmistir. Bu hücrelerin canlilik, morfoloji ve yüzey özellikleri bu asamada kontrol edilmistir.

Hazirlanan koaservatlarin mevcut literatürdeki hidrojellerden farki; agirlikça solvent kullanilmamasidir. Farkli polimer konsantrasyonlarinda da kompleks koaservasyon metodu uygulanabilir. Yalniz, polimerlerin konsantrasyonlan, polimer örtüsme (overlap) konsantrasyonlarindan (ki bu degerler polimerin molekül agirligina göre degisecektir) düsük olacak sekilde seçilmelidir. Ayrica fiziksel hidrojel hazirlanmasi için asagi yukari %1 (agirlikça) polimer konsantrasyonu gerekirken, koaservatlari hazirlamak için gereken polimer konsantrasyonu % 0.0l`e kadar düsürülebilir. Koaservasyon teknigi, doku mühendisligi amaci ile hücre içeren doku iskelesi üretiminde simdiye kadar kullanilmamis olan bir tekniktir. Bu yöntem literatürde çesitli moleküllerin (protein, büyüme faktörü vb.) enkapsülasyonu için (mikro-enkapsülasyon) siklikla kullanilmaktadir ancak bir doku iskelesi olusturarak içerisinde hücre hapsetmek (makro-enkapsülasyon) gibi bir örnek literatürde yoktur. Ayrica bu patentte tarifi yapilan yöntem, hücre içeren ticari bir doku iskelesinin, kompleks koaservasyon yöntemi ile makro-enkapsüle edilmesinden de farklidir. Bu yöntemde olusturulan koaservat, hücre içeren ticari doku iskelesinin alt ve üst kisimlarina tabaka olarak kaplanmistir. Bizim yöntemimizde ise ticari bir doku iskelesi yerine kendi yöntemimizle ürettigimiz koaservatlar, hücre makro-enkapsüle edilen doku iskelesi olarak kullanilmistir. Çapraz bag ve organik solvent kullanimi sonucu biyouyumlulugun etkilenmesi ve polimer üzerine ekilen hücrelerde fenotip bozulmasi sorunlarinin hücrelerin makro-enkapsülasyonu sayesinde önüne geçilmesi amaciyla, bulus kapsaminda, doku mühendisliginde doku iskele üretimi için kompleks koaservasyon tekniginin kullanimi gerçeklestirilmektedir. Bulus konusu ile, gelecek vaat eden kitosan ve hiyalüronik asit polimerlerinin, hücre enkapsüle edebilen özgün bir yöntem olan kompleks koaservasyon teknigi ile olusturulacak olan doku iskelelerinin bag doku mühendisligine kazandirilmasi saglanmaktadir.

Polimer solüsyonlarinin hazirlanmasi ve kompleks koaservasyon yapimi: Agirlikça % 0.09 konsantrasyona sahip kitosan (KT) ve agirlikça % 0.07 konsantrasyona sahip hiyalüronik asit (HA) polimerleri, oda sicakliginda ayri ayri sodyum klorür (NaCl) çözeltisi veya kalsiyum klorür (CaClg) çözeltisi içerisinde çözülmüstür.

Her iki polimerin de tamamen çözülmesi, 24 saat manyetik karistirici vasitasiyla sabit karistirma ile elde edilmistir. Her bir polimer solüsyonunun pH'i 6.25 olarak ayarlanmis ve her solüsyon, 0.45 mikrometre gözenek boyutlu filtre kullanarak laminer kabin içerisinde steril edilmistir. Daha sonra HA polimer çözeltisi karistirici üzerindeki kitosan (KT) polimer çözeltisinin üzerine damlatilarak ilave edilmistir. Bu çalismada olusturulacak olan doku iskelesinin kompleks koaservasyon özelliklerini saglayacak (çökelti, film, süngersi yapi vb. farkli polielektrolit komplekslerine veya fazlarina dönüsmeden) hacimce en yüksek verimde doku iskelesini verecek olan polimer miktarlarinin tespit edilmesi için ayri ayri küvetlerde hazirlanan HA/KT karisimlari, bulaniklik ölçümü, dinamik isik saçilimi (DLS) ve optik mikroskopi ile karakterize edilmistir.

KT solüsyonu üzerine HA eklenmesi yerine HA solüsyonu üzerine KT eklenmesi ile de karistirma islemi gerçeklesir. Bunun için, polimerlerin moleküler agirlik ve konsantrasyonlari, kitosan polimerinin asetilasyon derecesi, sicaklik, pH, iyonik Siddet, HA ve KT solüsyonlarinin hacimlerinin birbirine orani optimize edilmelidir. HA ve KT solüsyonlarinin birbirine eklenmesi, pipetör (makro, mikro), pastör pipet, otomatik pipet, büret gibi dis çapi 2 mmiden büyük akitaçlar yardimi ile damlatilabilir. 2 mm,den küçük damlatilmalar sonucunda (örnegin, 16-23 kalinligindaki (gauge) siringa ucu kullanilarak yapilan akitmalarla) mikrokapsül olusumlari literatürde gözlemlenmistir. Bizim yöntemimizdeki fark, siringa ucundan çikan polimer solüsyonunun (ör: HA solüsyonu) herhangi bir hava sikismasina (air entrainment) meydan vermeden karsit yüklü polimerin çözeltisine (ör: KT solüsyonu) eklenmesidir. Aksi takdirde, içerisinde hava hapsolan HA solüsyonunun olusturdugu damlalari, KT solüsyonuna eklendiginde literatürdeki gibi mikrokapsüller olusur (literatürdeki bu tür sistemlerde, koaservasyon, mikrokapsüllerin arayüzeyinde meydana gelir). Bizim metodumuzda kapsül olusumu yerine, tek bir bulanik faz meydana gelmektedir.

Olusan bu faz, yikama veya çözme (tuzla, organik solventle veya asitle) gibi ek bir isleme tabi tutulmaz.

Bulaniklik ölçümü: Bulaniklik ölçümleri polielektrolit komplekslerinin özelliklerini arastirmak için yaygin olarak kullanilan bir yöntemdir. HA'nin KT ile etkilesime girdigi zaman olusan koaservat süspansiyonundaki yüklü veya nötr damlaciklarindan kaynaklanan solüsyon bulanikligindaki degisimler bu yöntem ile ölçülerek koaservasyon olusturan karistirma oranlari tespit edilmistir.

Hacimce HA/KT karistirma oraninin (ki bu hacimsel oran, HA°deki iyonlasmis karboksillerin (COO`) KT,deki iyonlasmis aminlere (NH3+) oranina çevrilerek eksi yüklerin arti yüklere oranina dönüstürülebilir) koaservasyon derecesine etkisi, bulaniklik ölçümü ile arastirilmistir. Bulaniklik ölçümleri UV spektrofotometre kullanilarak ve HA/KT karisimlari manyetik bir karistirici kullanilarak karistirilmakta iken yapilmistir. Bulaniklik, oda sicakliginda, 630 nm dalga boyunda ölçülmüstür (Polimerlerin hiçbiri bu dalga boyunda isigi absorbe etmemektedir). Bulaniklik absorpsiyon birimleri (a.u.) cinsinden ölçülmüstür.

Tüm numunelerde, kendi içerisinde kullanilan tuz çözeltisi referans alinmistir.

Ayni ölçümler, absorpsiyon birimi yerine “100 - yüzde geçirgenlik” (100 - % T) olarak da kaydedilebilir. Bu ölçüm için UV spektrofotometre yerine kolon'metre de kullanilabilir. Bu deneylerdeki genel amaç, HA/KT karisiminin hangi hacimsel oranlarda (ya da yük oranlarinda) bir komplekslesme veya faz ayrimina gittigini bulmaktir. Bulaniklik deney sonuçlarini, karisimlarin geçirdigi gözle görülebilir veya mikroskopla izlenebilir (mikroskopi deneylerinin ayrintisi asagida yazmaktadir) degisimlerle birlestirerek hangi hacimsel oranlarda (ya da yük oranlarinda) sivi-sivi faz ayrimi, hangi oranlarda sivi-kati (çökelti, floklasma, vb.), hangi oranlarda sadece nanoboyutta kompleks olusturduklari ve hangi oranlarda etkilesime girmeden durduklari bilgisi edinilmektedir. Bu kadar kapsamli ve sistematik bir analiz literatürdeki az sayida çalismada ancak mevcuttur.

Düsük HA/KT karistirma oranlarindaki çözeltiler saydam görünürken, artan HA ilavesi ile çözeltiler bulaniklasmistir (Sekil lA-B alt resimler). HA/KT karisimlari, koaservat damlaciklari içermeleri sebebiyle bulanik görünmüstür.

Bahsi geçen koaservat süspansiyonundan bir isik demeti geçtiginde koaservat damlaciklarindan her yöne dogru isigin saçilimi artar. Ölçülen bu artis iki polielektrolit arasindaki etkilesiminin kuvvetlenmesi sonucu ile artan sayida veya daha büyük koaservat damlaciklarinin olusumu sebebi ile olabilir. Bununla birlikte, asiri miktarda HA eklenmesi, koaservat (sivi-sivi faz ayrimi) yerine çökelti (kati-sivi faz ayrimi) olusturmus ve olusan partiküllerin çökmesi sonucunda bulanikligi azaltmistir (Sekil lA-B üst resimler). Bulaniklik degerleri ölçümlerine bakilarak hacimce 0.8/ 1 (HA/KT) hacimsel karisma oranina kadar olan HA/KT karisiminin, koaservat süspansiyonu olarak kaldigi, daha yüksek oranlarda çökelti olusturdugu gözlenmistir.

Dinamik Isik Saçilimi (DLS) ölçümleri: DLS ölçümleri (foton korelasyon spektroskopisi ya da quasi-elastik isik saçilimi olarak da bilinir) isigin partiküllerden belli bir açida saçilimindaki rasgele degisimleri kaydeden bir yöntemdir. Literatürde bu yöntem, polielektrolit komplekslerinin veya koaservat damlaciklarinin hidrodinamik parçacik boyutlarini ölçmek için de yaygin olarak kullanilmaktadir. HA'nin KT ile etkilesime girdigi zaman olusan yüklü veya nötr damlaciklardan olusan koaservat süspansiyonu içerisindeki parçacik boyutlari DLS ölçümleri ile tespit edilerek koaservasyon olusumundaki karakteristik damlacik boyutlarini saglayan karistirma oranlari tespit edilmistir.

DLS ölçümleri için, HA/KT koaservat komplekslerinin hacimce artan HA eklenme oranlari ile hazirlanan süspansiyonlar ölçülmüs ve Z ortalama çaplari (isik siddeti agirlikli ortalama hidrodinamik çap) Sekil 2'de gösterilmistir.

Koaservat komplekslerinin Z ortalama çaplari (1 m1 kitosan için 0.1 ile 1 m1 arasinda HA eklenme sonrasi). 0.5-1 um arasinda ölçülmüs ve neredeyse sabit polidispersite indeksine sahip oldugu görülmüstür (Pdl <0.3). Polidispersite indeksi, ölçülen parçacik boyutlarinin dagilimini gösteren bir denklem sonucunda elde edilir. Ölçüm yapan cihaz tarafindan, ölçülen parça boyutuna ek olarak verilir. Pdl degeri 0.1-0.3 arasinda ise dar bir dagilim, 0.5 ten büyük ise genis bir dagilim içerisinde yer alir.

Bu ölçülen damlacik (“sivi agregat”) boyutlari, koaservat damlaciklarini gösteren optik mikroskopi görüntüleriyle de tutarlidir (Sekil 3). Ayrica, çökelme gözlenen HA/KT komplekslerinin Z ortalama boyutlarinda (yaklasik 5 um) keskin bir artis meydana gelmistir (PdI> 0.5). Bu artisin sebebi, olusan komplekslerin koaservat damlaciklari degil, çesitli çökeltiler oldugunu göstermektedir.

Pdl degerinin 0.3,ten küçük olmasi damlaciklarin yaklasik ayni boyutlarda oldugunu ve koaservasyon kriterlerini sagladigi anlatmaktadir. Koaservat damlaciklarinin, literatürde sözü geçen ve boyutlari milimetre mertebesindeki mikrokapsüllerden farkli oldugu bu ölçümlcrlc de ispat edilmistir. Daha yüksek HA/KT hacimsel karisma oranlarinda gözlenen keskin artis ise artik olusan damlaciklarin koaservat degil, içeriklerindeki su yüzdelerini kaybetmis çesitli türde çökeltilere (örnegin, floklar) dönüstügünü göstermektedir. 0.5,tcn yüksek PdI degeri olan süspansiyonlarda büyüklü küçüklü birçok parçacik olusumu gözlemlenmesi kati-sivi faz ayriminin gerçeklestigini göstermektedir.

Optik Mikroskopi: Bulaniklik ölçümü ve DLS ile tespit edilen koaservat damlaciklari ayni zamanda optik mikroskopi yöntemi ile de kontrol edilmis ve kullanilacak olan karisimin koaservasyon kriterinc uydugu görsel resimler ile ispat edilmistir.

Optik mikroskopi, hazirlanan karsit yüklü polielektrolit karisimlarindaki sivi koaservat damlaciklarinin varligini onaylamak için kullanilmistir. Elde edilen polielektrolit karisimina HA ilavesi, çökelti elde edilinceye kadar sürdürülmüstür.

Koaservat süspansiyonlari, damlaciklari gözlemlemek için cam slaytlarin üzerine yerlestirilmistir. Çökelti ya da kompleks koaservat gibi her türlü polielektrolit kompleks olusumu bu yöntem ile kontrol edilebilmektedir.

Koaservat sivilarinda 0.5-1 um civarinda küçük, küresel damlaciklar Sekil 3A,daki gibi görünürken, sivi-kati faz ayrimi görünen, diger bir deyisle çökelti olusan Örneklerde seklen asimetrik yapilar veya yumak seklinde olusumlar Sekil 3B'deki gibi görüntülenmistir. Koaservat sivilarinin karakterizasyonu sonrasi, HA/KT karisim orani 0.4/1 (hacim/hacim) olan örneklerin doku iskelesi yapiminda kullanilmasina karar verilmistir. Doku iskelesi olusturmak için koaservat süspansiyonuna faz ayrimi gerçeklestirilmis ve bu islemi kolaylastirmak için, hazirlanan örnekler 23 dakika boyunca 4.000 dev/dak' da santrifüje tabi tutulmustur. Santrifüjden sonra süpernatanlar (koaservat fazinin üzerinde kalan makroiyon-fakiri sivi faz), koaservatlara zarar vermeden dikkatli bir sekilde bosaltilmistir. Hazirlanan koaservatlarin kolay sekillendirilebilme özelligi (elastiklik) mevcuttur.

Taramali Elektron Mikroskopi (SEM): Faz ayrimi sonrasi elde edilmis olan koaservat numunesine (liyofilizasyon islemi sadece bu asamada Örneklerin SEM görüntelemesine uygun hale getirilmesi amaci ile uygulanmistir), gözeneklilik ve hücre-koaservat iskeleleri arasindaki etkilesimleri arastirmak için taramali elektron mikroskop (SEM) analizi uygulanmistir. Numunelerin tüm yüzeyleri SEM analizinden hemen önce 10 nm altin ile kaplanmistir. SEM uygulamasi 10 kV'de ve farkli büyütmelerde uygulanmistir.

Elde edilen bütün koaservatlar gözenekli yapi sergilemistir. SEM görüntüleri, koaservatlarin hücre yüklenmesi için uygun ve oldukça gözenekli bir iç yapi ile pürüzsüz bir yüzeye sahip oldugunu ortaya koymustur (Sekil 4 A-B). Ayrica, hücre içeren örneklerde enkapsüle edilmis olan hücreler, ekstrasellüler matriksleri sayesinde hem birbirleriyle hem de doku iskelesiyle temas halindedir (Sekil 4 C- D). Bu asamada olusturulan koaservat doku iskelelerinin, film, sünger veya lif (fiber) benzeri yapilar olusturmadigi da gösterilmistir.

Canli/Ölü boyamasi: Hazirlanan farkli koaservatlarin biyouyumluluklarini belirlemek ve karsilastirmak üzere siçan kemik iligi kök hücreleri (rBMSCs) (500,000 hücre/koaservat, ya da 1,000,000 hücre/ml), içeren örneklere canli/ölü boyamasi uygulanmistir. Canli/ölü boyamasi, plazma zari bütünlügü tayini ve hücre içi estraz aktivitesi sayesinde malzeme içerisinde yasayabilen canli ve ölü hücrelerin belirlenmesi için kullanilan bir yöntemdir. Eger hücreler canli ise yesil, ölü ise kirmizi renk boyanirlar. Hücre canliligini degerlendirmek için Image] yazilimi kullanildi. Her örnek için üç farkli bölge, yesil ve kirmizi boyanan hücrelerinin sayisini hesaplamak için seçildi. Canli hücrelerin sayisinin toplam hücre sayisina orani (hücre canliligi yüzdesi) hesaplandi (Sekil 5). Enkapsülasyondan bir gün sonra gerçeklestirilen canli/ölü boyamalarinda hem NaCl hem de CaClz tuz çözeltileri kullanilarak hazirlanan iki çesit koaservatta da enkapsüle edilmis hücrelerin büyük çogunlugu yesil olarak gözlenmistir. Bu sonuca dayanarak koaservat hazirlama ve enkapsüle etme yönteminin hücrelere herhangi bir zarar vermedigi gözlenmistir. Ayrica, inkübasyondan 21 gün sonraki örneklerde de hemen hemen tüm hücrelerin hala canli oldugu tespit edilmistir. Bu bulgulara dayanarak hazirlanan koaservatlarin toksik bir etki yaratmadigi görülmüstür.

Morfoloji Analizi: Koaservatlara enkapsüle edilmis hücrelerin morfolojisini analiz etmek için, aktin filament ve çekirdek boyamalari uygulanmistir. Aktin filamentleri için, kirmizi floresans boya ile konjuge edilmis bir F-aktin probu; çekirdek için ise mavi floresans boya (DAPI) kullanilmistir. Sekil 6'da gözlenen hücrelerin düzgün sekilleri, zarar görmemis plazma zarina sahip olduklarini göstermektedir. Bu da ayni zamanda canli/ölü boyamasindaki sonuçlari desteklemistir. 3 günlük inkübasyon sonrasinda, boyanan hücrelerin enkapsülasyondan ötürü küresel bir hücre morfolojisine sahip oldugu görülmüstür (Sekil 6 A ve B). 14 günlük inkübasyon sonrasi yapilan boyamalarda ise hücreler yayilmaya yönelik bir morfoloji sergilemis ve birbirleri ile ekstrasellüler matrikslerini kullanarak temas kurmaya basladiklari gözlenmistir (Sekil 6 C ve D). Koaservatlann hazirlanmasi asamasinda farkli tuz çözeltileri kullanilmasi, hücreler arasinda canlilik ve morfoloji özellikleri açisindan büyük farkliliklar yaratmamistir. Sonuç olarak 3 boyutlu olarak hazirlanan koaservatlarin hücre büyümesi ve çogalmasini destekledikleri görülmüstür. Bu bulgulardan, hazirlanan koaservatlarin biouyumlu ve gelecek vaad eden doku iskeleleri olarak kullanilabilecegi tespit edilmistir.

Bulus kapsaminda, kitosan ve hiyalüronik asit polimerleri, kompleks koaservasyon yöntemi kullanilarak özgün bir doku iskelesi haline getirilmektedir.

Bu yöntem daha önce gida, tarim, kozmetik ve farmasötik alanlarinda yogunlukla kullanilmaktadir ancak doku mühendisligi amaci ile kompleks koaservasyon teknigi kullanilarak olusturulan doku iskelesi içerisinde hücre enkapsüle etme (makro-enkapsülasyon) özelligi bakimindan ilktir. Hücre kullanilan çalismalarda, literatürde karsit yüklü polimerlerden olusturulan kompleksler (filmler, süngerler, tabaka tabaka polimer kaplamalar, lifler, nanopartiküller, mikro-kapsüller, koaservatlar vs.) çesitli islemlere (sonikasyon, liyofilizasyon, polimer içine batirma, organik solvent uçurma, solvent dökme vb.) tabi tutulduktan sonra hücre ekimi gerçeklestirilmistir. Bunun disinda hücre ekilmis kuyucuklu tabaklar üzerine, hazirlanmis olan koaservatlar konularak da hücre canliligi, sitotoksisite, morfoloji vb. testler de yapilmistir. Hatta bu çalismalarda koaservatlara önceden büyüme faktörü vb. moleküller enkapsüle edilerek, hücrelerin çogalmasi ve farklilasmasi saglanmistir. Bizim çalismamizin sözü geçen literatürdeki çalismalardan en büyük farki, hücrelerin, koaservat olusturulmadan önce polielektrolit solüsyonlarindan birinin içinde çözülüp karsit yüklü polimere eklenmesi ve sonrasinda oda sicakliginda sadece santrifüj islemine tabi tutularak hücre içeren koaservat fazinin elde edilmesidir.

Hazirlanan doku iskeleleri biyobozunur, biyouyumlu ve elastik özelliklere sahiptir. Tamamen dogal polimerlerden olustugu ve hiçbir çapraz baglayici veya organik solvent kullanilmadigi için toksik etkisi yoktur. Gözenekli yüzey, hücre yasamasina, çogalmasina ve eger ki kök hücre kullaniliyor ise arzu edilen hücre tipine özellesmesine elverisli bir ortam saglayacak ve özellikle makro- enkapsülasyon teknigi kullanimi ile bag doku mühendisligi uygulamalarinda umut verici sonuçlar elde edilebilecektir.

Claims (3)

ISTEMLER

1. Kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA) polimerleri ile, özellikle bag doku yaralanmalarinda, doku rejenerasyonunu desteklemek üzere tasarlanmis doku iskelesi olusturulmasinda kullanilan ve hücre enkapsüle edebilen dogal polimer sisteminin üretimi olup, kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA),n1n; yalnizca su, tuz çözeltisi veya tampon çözeltisi içerisinde çözülmesi, hücre tasiyan koaservatlari hazirlamak için hücrelerin üzerine HA çözeltisi eklenip karistirilmasi, sonrasinda, HA/hücre süspansiyonunun, manyetik karistiricida karistirilmakta olan ve tuz içeren KT çözeltisi üzerine damlatilarak ilave edilmesi, karisim içerisinde karsit yüklü makroiyonlar (kitosan ve hiyaluronik asit) arasindaki elektrostatik çekim ve ortama salinan küçük karsit yükler ile iliskili entropi kazanimi sayesinde (kompleks koaservasyon) olusan bu bulanik faza santrifüj uygulanip, bu fazda bulunan koaservat damlaciklarinin birlesmesini takiben sivi-sivi faz ayriminin gerçeklestirilmesi, içerigindeki makroiyon konsantrasyonu baslangiçtaki makroiyon konsantrasyonlarindan bir hayli yüksek olan alt koaservat fazinin ek bir isleme tabii tutulmadan santrifüj yapilarak toplanmasi, dogrudan doku iskelesi olarak kullanilacak olan koasevatlarin elde edilmesi adimlari ile karakterize edilen koaservat üretim yöntemi.

2. Kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA),nin, tuz çözeltileri içerisinde çözülmesi adiminda, tuz çözeltisinin sodyum klorür (NaCl) tuzu çözeltisi olmasi ile karakterize edilen istem lideki gibi koaservat üretim yöntemi.

3. Kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA)°nin, tuz çözeltileri içerisinde çözülmesi adiminda, tuz çözeltisinin kalsiyum klorür (CaClz) tuzu çözeltisi olmasi ile karakterize edilen istem l,deki gibi koaservat üretim yöntemi. . Kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA)”nin, tuz çözeltileri içerisinde çözülmesi adiminda, 0.09 % (agirlikça) konsantrasyonuna sahip olacak sekilde Kitosan (KT) ve 0.07 % (agirlikça) konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hiyalüronik asit (HA) biyopolimerlerinin, oda sicakliginda, toplam iyonik siddet tuzunun çözeltisi veya kalsiyum klorür (CaCl2) tuzunun çözeltisi içerisinde 24 saat boyunca manyetik karistirici vasitasiyla sabit hizda karistirilarak çözülmesi ile karakterize edilen istem 2 ve 3,deki gibi koaservat üretim yöntemi. . KT çözeltisi üzerine HA çözeltisinin eklenmesi yerine HA çözeltisi üzerine KT çözeltisinin eklenmesi ile karakterize edilen istem 1,deki gibi koaservat üretim yöntemi. . HA ve KT çözeltilerinin birbirine eklenmesinde, herhangi bir hava sikismasina (air entrainment) meydan vermeden karsit yüklü polimerin çözeltisine (ör: KT solüsyonu) pipetör (makro, mikro), pastör pipet, otomatik pipet, büret gibi dis çapi 2 mmSden büyük akitaçlar yardimi ile damlatilmasi ile karakterize edilen istem l,deki gibi koaservat üretim yöntemi. . Kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA),nin, tuz çözeltileri içerisinde çözülmesi adiminda, polimerilerin tuz çözeltileri içerisinde 24 saat boyunca manyetik karistirici vasitasiyla sabit hizda karistirilarak çözülmesi ile karakterize edilen istem l,deki gibi koaservat üretim yöntemi. Kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA),nin, tuz çözeltileri içerisinde çözülmesi adiminda, her iki polimer solüsyonunun pH degerinin 1 molarlik sodyum hidroksit veya hidroklorik asit çözeltisi eklenerek 6.25 degerinde ayarlanmasi ile karakterize edilen istem lideki gibi koaservat üretim yöntemi. Hücre içermeyen (bos) Koaservat olusumunda kullanilan HA/KT karisiminin pH degerinin, 2-7 araliginda olacak sekilde ayarlanmasi ile karakterize edilen istem l,deki gibi koaservat üretim yöntemi. Hücre içeren Koaservat olusumunda kullanilan HA/KT karisiminin pH degerinin, 5.5-7 araliginda olacak sekilde ayarlanmasi ile karakterize edilen istem 1 veya 9°daki gibi koaservat üretim yöntemi. Kitosan (KT) ve hiyalüronik asit (HA) polimerlerinin sodyum klorür (NaCl) çözeltisi veya kalsiyum klorür (CaClz) çözeltisi içerisinde çözülmesi isleminde, her iki polimer solüsyonunun, 0.45 mikrometre gözenek boyutlu filtre kullanarak laminer kabin içerisinde steril edilmesi ile karakterize edilen istem l,deki gibi koaservat üretim yöntemi. Yukaridaki istemlerden herhangi birindeki gibi bir yöntem ile üretilen ve hacimce oranlandiginda l ml,lik hacmi içerisinde hapsedilen hücre sayisi 500,000-10 milyon oldugu koaservat. Istem 12,deki gibi bir koaservat, hiçbir ek isleme tabi tutulmadan (sonikasyon, liyofilizasyon, organik solvent uçurma, solvent dökme Vb.) dogrudan doku iskelesi için kullanilmaktadir.