TARIFNAME CD70 ANTIKORLARI Teknik Alan Mevcut bulus, insan CD70 proteinine yüksek afiniteyle baglanan ve tümör hücresi büyümesini kuvvetli sekilde inhibe eden antikorlara ve bunlarin antijen baglayici fragmanlarina iliskindir. Bulusa Iliskin Bilinen Hususlar Sitokin reseptörü CD27 tümör nekroz faktörü reseptörü (TFNR) üst familyasinin, hücre büyümesi ve farklilasmasiyla birlikte apoptozda da rol oynayan bir üyesidir. CD27 ligandi, ligandlarin tümör nekroz faktörü familyasina ait CD707tir. CD70, 20 amino asitli bir hidrofilik N terminal domene (özel islevli antikor alani) ve 2 potansiyel N baglantili glikozilasyon alani içeren bir C terminal domene sahip 193 amino asitlik bir polipeptittir bir transmembran protein oldugu belirlenmistir. CD70 kisa süreligine etkinlesmis T ve B lenfositlerde ve dendritik hücrelerde bulunur hücrelerde ekspresyona ilaveten, renal hücre karsinomlari, metastatik meme kanserleri, beyin tümörleri, lösemiler, lenfomalar ve nazofarenks karsinomlari dahil olmak üzere farkli kanser türlerinde de CD70 ekspresyonunun oldugu bildirilmistir (Junker ve digerleri, (2005) J Urol. aracili otoimmün hastalikta ve TNF -alfa üretiminin inhibisyonunda da bir rol oynadigi Öne Dolayisiyla, CD70 kanserin, otoimmün bozukluklarin ve CD70 ekspresyonu ile kendini gösteren bir dizi baska hastaligin tedavisi için bir hedef olusturur. açiklanmakta olup, söz konusu antikorlar ADCC, ADCP, CDC veya ADC9den birine veya daha fazlasina aracilik edebilmekte ve CD70 eksprese eden bir kanserde sitostatik veya sitotoksik bir etki sergileyebilmekte veya sitostatik veya sitotoksik bir maddeye konjugasyon olmadan CD70 eksprese eden bir immünolojik bozuklukta immünosüpresif bir etki sergileyebilmektedirler. Burada örnek verilen antikorlar 1F6 ve 2F2 isimli iki monoklonal insanlastirilmis anti-CD70 antikorlari, özel olarak belirtmek gerekirse insanlastirilmis 1F6 ve insanlastirilmis 2F2 açiklanmaktadir. açiklanmaktadir. Bu antikorlarin özelligi insan CD703e 1x10'7 M veya daha az bir KD ile baglanmalaridir. Antikorlar CD70 eksprese eden, örnegin 786-0 gibi renal hücre karsinomu tümör hücresi hatlarina da baglanir ve bunlar tarafindan internalize edilirler. Bulusun Özeti Bulusa uygun olarak insan CD70,e baglanan bir antikor veya bunun antijen baglayici bir fragmani saglanmakta olup, söz konusu antikor veya antijen baglayici fragman bir degisken agir zincir CDR3, bir degisken agir zincir CDR2 ve bir degisken agir zincir CDRl içeren en az bir agir zincir degisken domeni (VH) ve bir degisken hafif zincir CDR3, bir degisken hafif zincir CDR2 ve bir degisken hafif zincir CDRl içeren en az bir hafif zincir degisken domeni (VL) içerir; burada degisken agir zincir CDR3 DIZI ID. NO:50'yi (DAGYSNHVPIFDS) içerir veya bundan olusur; degisken agir zincir CDR2 DIZI ID. NO: içerir veya bundan olusur; degisken agir zincir CDRl DIZI ID. N02] 1 'i (VYYMN) içerir veya bundan olusur; degisken hafif zincir CDR3 DIZI ID. NO: içerir veya bundan olusur; degisken hafif zincir CDR2 DIZI lD. NO: içerir veya bundan olusur; ve degisken hafif zincir CDRl DIZI ID. NO: içerir veya bundan Burada insan CD70 proteinine baglanan ve önceki teknikte tarif edilen CD70 antikorlarindan farkli ve genel olarak daha üstün özellikler sergileyen antikorlar veya bunlarin antij en baglayici fragmanlari (burada CD70 antikorlari olarak geçer) saglanmaktadir. Bu antikorlarin üstün özellikleri insan tedavisinde; bilhassa CD70 eksprese eden kanserlerin ve ayrica immünolojik bozukluklarin tedavisinde kullanim bakimindan avantajlar saglamaktadir. Burada açiklanan CD70 antikorlarinin özelligi insan CD70 için olaganüstü yüksek baglanma afinitesi göstermeleridir. Burada açiklanan tercih edilen tüm düzenlemeler, rekoinbinant insan CD70 için insan tedavisinde önerilen önceki teknige ait en kuvvetli CD70 antikorlarindan, örnegin önceki teknige ait "tamamen insan" kökenli CD70 antikorlarindan anlamli ölçüde daha yüksek bir baglanma afinitesi (burada açiklanan sekilde BiacoreTM yüzey plazmon rezonansi ile ölçülen) sergilerler. Ilaveten, burada açiklanan CD70 antikorlarinin tercih edilen tüm düzenlemeleri, insan tedavisi için önerilen önceki teknige ait CD70 antikorlari ile karsilastirildiginda insan hücre hatlarinin, özel olarak belirtmek gerekirse insan kanser hücresi hatlarinin yüzeyinde eksprese olan CD70°e üstün (yani yüksek afiniteli) baglanma sergiler. Hücre yüzeyindeki CD70"e yönelik bu üstün baglanma özellikle CD70°i "düsük kopya sayisinda" eksprese eden insan kanser hücresi hatlari bakimindan belirgindir ve antikorlarin insan tedavisinde kullanimi ile dogrudan baglantilidir. Yine ayrica, burada açiklanan CD70 antikorlarinin tercih edilen düzenlemeleri, insanda terapötik kullanim için önerilen önceki teknige ait CD70 antikorlari ile karsilastirildiklarindbir insan hastalardan izole edilen kanser hücrelerine, bilhassa kronik lenfositik lösemisi (CLL) olan hastalardan izole edilen kanser hücrelerine önemli ölçüde gelismis baglanma sergilerler. Burada insan CD70le baglanan bir antikor veya bunun antijen baglayici bir fragmani açiklaninakta olup, söz konusu antikor veya antijen baglayici fragman en az bir agir zincir degisken domeni (VH) ve en az bir hafif zincir degisken domeni (VL) içerir, burada söz konusu VH ve VL domeni yine burada açiklanan standart BiacoreTM protokolünü kullanarak bir Fab fragmani olarak test edildiginde insan CD70 için 7 x 10'4 s'hden daha az bir ayrisina hizi (BiacoreTM ile ölçülen kon) sergiler. Antikor veya antijen baglayici fragman en az bir agir zincir degisken domeni (VH) ve en az bir hafif zincir degisken domeni (VL) içerebilmekte olup, burada söz konusu VH ve VL s`i veya daha az bir ayrisma hizi sergiler . En fazla tercihen CD70 antikoru bir Fab fragmani sergileyecektir. Söz konusu antikorun iki Fab bölgesi içerdigi insan CD70"e baglanan bir antikor da açiklanmakta da olup, burada Fab bölgelerinin her biri insan CD70"e baglanir ve bir Fab bir ayrisma hizi sergiler. Iki Fab bölgesi özdes olabilir veya baglanma özellikleri, örnegin insan CD70 için atinite bakimindan farklilik gösterebilir. Iki Fab bölgesi insan CD70"te ayni epitopa veya örtüsen epitoplara baglanabilir veya insan CD70,te ayri, örtüsmeyen epitoplara baglanabilir. Iki Fab bölgesi VH ve VL domenlerinin birindeki veya her ikisindeki amino asit dizisi bakimindan birbirinden farkli olabilir. Burada sunulan CDO antikorlarinin tercih edilen düzenlemeleri CD70 için olaganüstü yüksek baglanma afinitesine ilaveten, CD70 ve ligandi CD27 arasindaki etkilesimde kuvvetli blokaj veya inhibisyon sergileyebilir. Hem CD70,e yüksek atiniteyle baglanma, hem CD70/CD27 etkilesiminde kuvvetli blokaj sergileyen tercih edilen CD70 antikorlari, CD70/CD27 sinyallesmesindeki blokajin terapötik etkinligi güçlendirdigi (örnegin CD70 antikorunun efektör islevleri araciligiyla olusan hücre ölümüne ilaveten) örnegin CD70 ve CD27°nin birlikte eksprese oldugu otoimmün hastaliklar ve kanserler gibi hastaliklarda hastalik endikasyonlarinin tedavisine yönelik terapötik maddeler olarak özellikle avantaj lidirlar. Burada açiklanan CD70 antikorlarinin tamami CD70,e yüksek afîniteyle baglanmaya ilaveten CD70/CD27 etkilesiminde kuvvetli blokaj sergilemez. Burada CD709e çok yüksek afiniteyle baglanma sergileyen ancak CD70/CD27 etkilesiminde anlamli ölçüde blokaj göstermeyen bazi CD70 antikorlari da açiklanmaktadir. Bu antikorlarin özellikleri burada baska bir yerde açiklanmaktadir. Yüksek afiniteli blokaj yapmayan CD70 antikorlarinin mevcudiyeti terapötik olasilik çesitliligini artirabilir/genisletebilir. Insan CD70 için çok yüksek baglanma afinitesi sergileyen burada açiklanan CD70 antikorlarinin tercih edilen düzenlemeleri insanda terapötik kullanim için önerilen önceki teknige ait CD70 antikorlarinin sergilemedigi bir baglanma özellikleri kombinasyonuna sahip olma özelligini de gösterirler. Dolayisiyla, burada açiklanan tercih edilen CD70 antikorlari asagidaki özelliklere sahiptir: (a) insan CD70ite amino asit dizisi HlQVTLAlCSS (DIZI ID. NO:342) ile baglanma; (b) al yanakli makak (Macaca mulatta) ve sinomolgus maymunu (Macaca cynomolgus) CD70 homologlari ile çapraz reaktiflik; (c) hem dogal insan CD70,e, hem isiyla denatüre edilmis rekombinant insan CD70,e baglanma. Insanda terapötik kullanim için önerilen önceki teknige ait antikorlarin sergilemedigi bu baglanma özellikleri kombinasyonu CD70"te önceki teknige ait CD70 antikorlarinin baglandigi epitoplardan farkli yeni bir epitopa baglanmaya isaret eder. Tercih edilen CD70 antikorlarinin sergiledigi baglanma özellikleri kombinasyonu insana yönelik ilaç gelistirme açisindan avantajlidir. Özellikle, maymun CD70 homologlari ile çapraz reaktiflik insanda terapötik kullanim için öne sürülen CD70 antikorlarina iliskin toksikoloji çalismalarinin primat modellerinde gerçeklestirilmesini müinkün kilar. Burada açiklanan tercih edilen CD70 antikorlari yine ayrica bir terapötik antikor ürün olarak ticari imalatla baglantili olumlu Özellikler sergilerler. Burada bir baska yerde açiklandigi üzere, burada sunulan tercih edilen CD70 antikorlari klinik kullanima uygun terapötik antikor ürünlerin ticari imalatinda kullanilan rekombinant ekspresyon sistemlerinde olaganüstü yüksek seviyede ekspresyon sergiler. Tercih edilen CD70 antikorlari ile elde edilebilen ekspresyon seviyeleri, "tamamen insan" terapötik antikor ürünlerle tipik olarak elde edilen seviyelerin bile çok daha üstüne geçer. Ilaveten, tercih edilen CD70 antikoru ürünleri (insanda terapötik kullanim için uygun bir formatta rekombinant ekspresyonla üretilir) tipik terapötik antikor ürünlerinden daha üstün olaganüstü bir isil stabilite sergilerler. Insan CD70 için üstün baglanma afinitesine ve yukarida siralanan baska avantajli özelliklere sahip burada sunulan CD70 antikorlari devegillerden elde edilir (örnegin lamadan elde edilir). Devegillerden elde edilen CD70 antikorlari izole edilmis veya rekombinant eksprese edilmis monoklonal antikorlar olabilir. Tercih edilen düzenlemeler insanlastirilmis (veya germ hatti isleini yapilmis ("germlined")) bir monoklonal antikor (örnegin devegillerden elde edilen bir antikorun insanlastirilmis bir varyanti), bir kimerik antikor (örnegin bir devegil-insan kimerik antikoru) veya insanlastirilmis bir kimerik antikor (örnegin devegil VH ve VL domenlerinin insanlastirilmis varyantlarini ve bir insan antikorunun sabit domenlerini içeren bir kimerik antikor) olabilir. Devegillerden elde edilen CD70 antikorlari bir agir zincir degisken domeni (VH) ve hafif zincir degisken domeni (VL) içerebilir, burada VH ve VL domenleri devegillerden elde edilir. Özel düzenlemelerde antikor veya antijen baglayici fragmani lama VH ve VL domenlerini veya lama VH ve VL domenlerinin insan gerrn hatti islemi yapilmis varyantlarini içerebilir. Bu antikor veya antij en baglayici fragman burada açiklanan sekilde "yüksek insan homoloji"si sergileyebilir. Burada açiklanan devegillerden elde edilen CD70 antikorlari tipik olarak en yakin eslesen sergiler. Bulusun tercih edilen diger düzenlemeleri devegillerden elde edilen CD70 antikorlarinin insanlastirilmis (veya insan germ hatti islemi yapilmis) varyantlarini içerir. Özellikle, bulus burada açiklanan lamadan elde edilen CD70 antikorlarinin insanlastirilmis veya insan germ hatti islemi yapilmis varyantlarini içerir. Bulusun bir diger yönü itibariyla insan CD70"e baglanan bir kimerik devegil-insan antikoru saglanmakta olup, burada antikorun antijen baglayici kisimlari (örnegin VH ve/veya VL domenleri veya bunlarin CDR"leri) devegillerden elde edilir ve antikorun sabit bölgeleri bir insan antikorundan elde edilir. Özellikle, bulusta insan CD70,e baglanan bir kimerik lama- Bulusun bir diger yönü itibariyla insan CD707e baglanan bir kimerik devegil-insan antikorunun insanlastirilmis bir varyanti saglanmakta olup, burada antikorun antijen baglayici kisimlari (örnegin VH ve/Veya VL domenleri veya bunlarin CDRileri) devegillerden elde edilen dizilerin insanlastirilmis varyantlaridir ve antikorun sabit bölgeleri bir insan antikorundan elde edilir. Özellikle, bulusta insan CD705e baglanan bir kimerik lama-insan antikorunun insanlastirilmis bir varyanti saglanmaktadir. Burada asagida spesifik yapisal özelliklere, yani CDR"lere (DIZI ID: NO: 49-59, 262 veya DIZI ID: NO: biri veya daha fazlasi veya CDRl) seklinde gösterilen CDR dizilerinden biri) veya degisken domenlerin tamamina (DIZI veya 277,den (VL) biri veya daha fazlasi) ait belirtilen amino asit dizilerine gönderme ile tanimlanan CD70 antikorlari veya bunlarin antij en baglayici fragmanlari açiklanmaktadir. Bu antikorlarin tamami insan CD70"e yüksek afiniteyle baglanir, bir F ab fragmani olarak test '4 s`l araliginda bir ayrisma hizi sergilerler. Burada özel olarak devegillerden elde edilen VH ve VL domenlerini veya bunlarin insan antikorlarinin, bilhassa insan IgGl, IgG2, IgG3 veya IgG47ün sabit domenlerine kaynastirilmis insan germ hatti islemi yapilmis varyantlarini içeren kimerik antikorlar saglanmaktadir. Yukarida tanimlanan agir zincir degisken domenleri tek domenli antikorlar olarak kullanilabilirler veya konvansiyonel dört zincirli bir antikorun veya diger antijen baglayici proteinlerin, örnegin Fab, Fab', F(ab')2, bi-spesifik Fab'ler ve FV fragmanlari, di- antikorlar, dogrusal antikorlar, tek Zincirli antikor molekülleri, tek Zincirli bir degisken fragman (scFv) ve mültispesifik antikorlar içine dahil edilebilirler. Herhangi bir verili CD70 antikoru veya bunun CD70 antijeni için bir baglanma alani olusturmak üzere bir VL domeni ile eslesen bir VH domenini içeren antij en baglayici fragmani 6 CDR,nin bir kombinasyonunu içerir: degisken agir zincir CDR3 (HCDR3), degisken agir zincir CDR2 (HCDR2), degisken agir zincir CDRl (HCDRl), degisken hafif zincir CDR3 (LCDRS), degisken hafif zincir CDR2 (LCDR2) ve degisken hafif zincir CDRl Tercih edilen 6 CDR kombinasyonlari asagidakileri içerir : (i) DIZI ID. NO:50"yi içeren HCDR3, DIZI ID. NO:27"yi içeren HCDRZ, DIZI ID. içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:250"yi içeren LCDRl; Burada degisken agir zincir CDR3 (HCDR3), degisken agir zincir CDR2 (HCDRZ), degisken agir zincir CDRl (HCDRl), degisken hafif zincir CDR3 (LCDR3), degisken hafif zincir CDR2 (LCDR2) ve degisken hafif zincir CDR] (LCDRl) kombinasyonlari da açiklanmakta olup, bunlar asagidakilerden olusan gruptan seçilir: (ii) DIZI ID. NO:49,u içeren HCDR3, DIZI ID. NO:265yi içeren HCDRZ, DIZI ID. içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:77°yi içeren LCDRl; (iii) DIZI ID. NO:50'yi içeren HCDR3, DIZI ID. No:27'yi içeren HCDRZ, DIZI ID. No:1 1'i içeren HCDRI, DIZI ID. No:199,u içeren LCDR3, DIZI ID. NO:1 10,u içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:78"i içeren LCDRI; (iv) DIZI ID. NO:50'yi içeren HCDR3, DIZI ID. No:28& içeren HCDRZ, DIZI ID. NO: 1 1 ,i içeren HCDRl, DIZI ID. NO:150°yi içeren LCDR3, DIZI ID. NO] 1 1 "i içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:797u içeren LCDRl ; (v) DIZI ID. NO:50,yi içeren HCDR3, DIZI ID. NO:28,i içeren HCDR2, DIZI ID. NO:11"i içeren HCDRl, DIZI ID. NO: 15 1 'i içeren LCDR3, DIZI ID. NO:110°u içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:80°i içeren LCDRl; (Vi) DIZI ID. NO:51'i içeren HCDR35 DIZI ID. NO:29,u içeren HCDRZ, DIZI ID. NO:12'yi içeren HCDRI, DIZI ID. NO: 152°yi içeren LCDR3, DIZI ID. NO:110'u içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:80'i içeren LCDRI; (Vii) DIZI ID. NO:52"yi içeren HCDR3, DIZI ID. NO:30'u içeren HCDR2, DIZI ID. NO:13'ü içeren HCDRI, DIZI ID. NO:153›ü içeren LCDR3, DIZI ID. NO:I 12,yi içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:81 ,i içeren LCDRI; (viii) DIZI ID. NO:53,ü içeren HCDR3, DIZI ID. NO:31°i içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 14,ü içeren HCDRl, DIZI ID. NO: 154,ü içeren LCDR3, DIZI ID. NO:l 13°ü içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:82,yi içeren LCDRl; (ix) DIZI ID. NO:54,ü içeren HCDR3, DIZI ID. NO:32syi içeren HCDR2, DIZI ID. içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:83°ü içeren LCDRI; (x) DIZI ID. NO:55"i içeren HCDR3, DIZI ID. No:3311 içeren HCDR2, DIZI ID. içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:84"ü içeren LCDRI; (xi) DIZI ID. N0:56*yi içeren HCDR3, DIZI ID. No:3411 içeren HCDR2, DIZI ID. NO:17,yi içeren HCDRl, DIZI ID. NO: 157*yi içeren LCDR3, DIZI ID. No:116°yi içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:85,i içeren LCDRl; (xii) DIZI ID. NO:57,yi içeren HCDR3, DIZI ID. NO:35,i içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 18,i içeren HCDRl, DIZI ID. NO:158`i içeren LCDR3, DIZI ID. NO:117,yi içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:84,ü içeren LCDRl; (xiii) DIZI ID. No:583 içeren HCDR3, DIZI ID. No:36iyi içeren HCDR2, DIZI ID. NO:19'u içeren HCDRI, DIZI ID. NO: 159"u içeren LCDR3, DIZI ID. NO:118"i içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:86'yi içeren LCDRl; (xiV) DIZI ID. NO: 50"yi içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 27syi içeren HCDR2, DIZI içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:88"i içeren LCDRl; (xv) DIZI ID. NO: 50,yi içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 27,yi içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 11,i içeren HCDRI, DIZI ID. NO:162,yi içeren LCDR3, DIZI ID. NO: 121,i içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO:89,u içeren LCDRI; (xvi) DIZI ID. NO: 50,yi içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 277yi içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 11,I içeren HCDRI, DIZI ID. NO: 163,ü içeren LCDR3, DIZI ID. NO: 122°yi içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 9071 içeren LCDRI; (xvii) DIZI ID. NO: 51i içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 297u içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 12iyi içeren HCDRl , DIZI ID. NO: 164`ü içeren LCDR3, DIZI ID. NO: 123"ü içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 91 "i içeren LCDRl; (xviii) DIZI 1D. NO: 517i içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 29°u içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 129yi içeren HCDRl, DIZI ID. NO: 164'ü içeren LCDR3, DIZI ID. NO: l24"ü içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 91 ,i içeren LCDRl; (xix) DIZI ID. NO: 59,u içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 373yi içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 12iyi içeren HCDRl, DIZI ID. NO: 165,i içeren LCDR3, DIZI ID. NO: 125,i içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 92*yi içeren LCDRl; (xx) DIZI ID. NO: 59°u içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 377yi içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 20°yi içeren HCDRl, DIZI ID. NO: 165°i içeren LCDR3, DIZI ID. NO: 126"yi içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 93"ü içeren LCDRI; (xxi) DIZI ID. NO: 59"u içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 37"yi içeren HCDR2, DIZI ID. içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 92"yi içeren LCDRl; (xxii) DIZI ID. NO: 59,u içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 37°yi içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 207yi içeren HCDRl, DIZI ID. NO: 167,yi içeren LCDR3, DIZI ID. NO: 128'i içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 94,ü içeren LCDRl; (xxiii) DIZI ID. NO: 59,u içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 377yi içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 20"yi içeren HCDRI, DIZI ID. NO: 168"i içeren LCDR3, DIZI ID. NO: 110"u içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 951 içeren LCDRl; (xxiV) DIZI ID. NO: 262,yi içeren HCDRS, DIZI ID. NO: 258% içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 2563y1 içeren HCDRI, DIZI ID. NO: 271,i içeren LCDR3, DIZI ID. NO: (xxv) DIZI ID. NO: 263°ü içeren HCDR3, DIZI ID. NO: 259,u içeren HCDR2, DIZI ID. NO: 257'yi içeren HCDRl, DIZI ID. NO: 2733ü içeren LCDR3, DIZI ID. NO: 270,i içeren LCDR2 ve DIZI ID. NO: 268'i içeren LCDRl. Burada insan CD70"e yüksek afiniteyle baglanma sergileyen, izole edilmis antikorlari veya bunlarin antijen baglayici fragmanlarini içeren ve DIZI ID. NO: 177, DIZI ID. No:178, DIZI ait amino asit dizilerinden ve bahsedilen dizilerden birine en az %90, %95, %97, %98 veya dizisine sahip bir agir zincir degisken domeni içeren ve istege bagli olarak DIZI ID. NO:21 i, DIZI ID. No:240, DIZI lD NO:276 ve DIZI ID. NO:277°ye ait amino asit özdesligi sergileyen ainino asit dizilerinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisine sahip bir hafif zincir degisken domeni içeren CD70 antikorlari da açiklanmaktadir. VH domenlerinin ve VL domenlerinin yukarida siralanan VH ve VL domeni dizi gruplarindan seçilen tüm olasi eslesmeleri mümkün olabilse de, bazi VH ve VL kombinasyonlari özellikle tercih edilmektedir; bunlar insan CD70,e yüksek afiniteyle baglanma sergileyen tek bir Fab dahilindeki "dogal" kombinasyonlardir. Dolayisiyla, yüksek afiniteyle CD70 baglanmasi sergileyen tercih edilen CD70 antikorlari veya bunlarin antijen baglayici fragmanlari bir agir zincir degisken domeni (VH) ve bir hafif zincir degisken domeni (VL) kombinasyonunu içerenler olup, burada kombinasyon asagida belirtilen sekildedir: (i) DIZI ID. NO:223'e ait ainino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:241"e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; Burada bir agir zincir degisken domeni (VH) ve bir hafif zincir degisken domeni (VL) kombinasyonunu içeren ve kombinasyonun asagida siralananlardan olusan gruptan seçildigi yüksek afiniteyle CD70 baglanmasi sergileyen CD70 antikorlari veya bunlarin antijen baglayici fragmanlari da açiklanmaktadir: (ii) DIZI ID. NO:177'ye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 1 89,a ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (iii) DIZI ID. NO: 178"e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 19021 ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (iv) DIZI ID. NO: 1793 ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 191 ,e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (v) DIZI ID. NO: 17921 ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken doineni ve DIZI ID. NO: 192"ye ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (vi) DIZI ID. NO: 180'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:193'e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (Vii) DIZI ID. NO:18] 'ye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 1 94,e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (viii) DIZI 1D. NO: 182'ye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 195"e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (ix) DIZI ID. NO: 1 83'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 1961ya ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (x) DIZI ID. NO:184'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 197aye ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xi) DIZI ID. No:185"e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 1 98'e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xii) DIZI ID. NO: 1 86"ya ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI 1D. NO: 199`a ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xiii) DIZI ID. NO: 187,ye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. No:200,e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xiv) DIZI ID. NO:178,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:201'e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (XV) DIZI ID. NO: 1 78'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:202lye ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xvi) DIZI ID. NO:178'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. No:203? ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xvii) DIZI ID. NO: 178,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:204,e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xviii) DIZI ID. NO: 180,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:205°e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (Xix) DIZI ID. NO: 180'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. No:206"ya ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xx) DIZI ID. NO: 1 88le ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken doineni ve DIZI ID. NO:20Tye ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xxi) DIZI ID. NO:188"e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. No:208? ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xxii) DIZI ID. NO: 188,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:209"a ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xxiii) DIZI ID. NO: 188,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:210,a ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xxiv) DIZI ID. NO: 18876 ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:21 l 'e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (XXV) DIZI ID. NO:274"e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:276'ya ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xxvi) DIZI ID. NO:275,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:277iye ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni. Yukarida siralanan spesifik VHN L kombinasyonlarinin her birinde bahsedilen VH domeni amino asit dizisine sahip bir VL domeniyle kombine edilmesi de mümkündür. Önceki paragrafta ve burada baska bir yerde, antikorlarin/antijen baglayici fragmanlarin yapisi bahsedilen referans diziyle (verili bir DIZI ID. NOisu olan) dizi özdesligi %,si bazinda tanimlanmaktadir. Bu baglamda, iki amino asit dizisi arasindaki dizi özdesligi %"si optimum bir tarzda hizalanmis bu iki dizinin karsilastirilmasiyla hesaplanabilir ve burada karsilastirilacak amino asit dizisi bu iki dizi arasinda optimum bir hizalama saglamak için referans diziye göre eklentiler veya silinmeler içerebilir. Özdeslik yüzdesi iki dizi arasinda amino asit kalintisinin özdes oldugu özdes konumlarin sayisinin belirlenmesi, bu özdes konumlar sayisinin karsilastirina penceresindeki konumlarin toplam sayisina bölünmesi ve elde edilen sonucun 100,1e çarpilmasi ve bu sekilde bu iki dizi arasinda özdeslik yüzdesinin elde edilmesiyle hesaplanir. Tipik olarak, karsilastirma penceresi karsilastirilan dizinin tani boyuna karsilik gelir. Örnegin, http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/b12.html internet sayfasinda mevcut BLAST programinin, "BLAST 2 dizileri"nin (Tatusova ve digerleri, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol olarak verilenlerdir (özellikle "bosluk açma cezasi": 5 ve "bosluk uzatma cezasi": 2 parametreleri için; seçilen matris, örnegin programin önerdigi "BLOSUM 62" matrisidir), bu sekilde karsilastirilan iki dizi arasindaki özdeslik yüzdesi dogrudan programla hesaplanir. Insan CD70"e olaganüstü yüksek afiniteyle baglanma dahil olinak üzere özellikle avantajli bir özellikler kombinasyonu sergileyen burada sunulan en fazla tercih edilen CD70 antikorlari, ilisikteki örneklerde 27B3 olarak isimlendirilen lamadan elde edilen Fab'nin antijen baglayici kismina, arti 27B3iün insan germ hatti islemi yapilmis varyantlarina, örnegin ilisikteki örneklerde tanimlanan germ hatti islemi yapilmis varyantlara dayanan antikorlardir. 27B3 ve bunun germ hatti islemi yapilmis varyantlari, özellikle varyant 4ID12inin CDRilerine veya degisken domenlerinin tamamina dayanan varyantlar, olaganüstü avantajli bir özellikler kombinasyonu sergilemekte olup, bunlar su sekilde özetlenmektedir: rekombinant insan CD70`e yüksek afiniteyle baglanma, hücre yüzeyinde CD70"e kuvvetli baglanma, spesifik olarak kanser hücresi hatlarinda, bilhassa "düsük kopya sayisi"nda CD70 eksprese eden hücre hatlarinda eksprese olan CD70`e baglanma ve hasta numunelerinden izole edilmis kanser hücrelerine (CLL) kuvvetli baglanma, CD70/CD27 etkilesiminin güçlü sekilde bloke edilmesi, güçlü efektör islevi - özellikle insan IgGl sabit bölgeleriyle bir kimera seklinde eksprese oldugunda ve bilhassa fukozillenmemis bir IgGl olarak eksprese oldugunda, al yanakli (Rhesus) makak ve sinomolgus maymunu CD70 homologlariyla primat türlerinde toksikoloji çalismalarinin yapilmasini mümkün kilan çapraz reaktiflik, hem dogal (yani hücre yüzeyinde), hem isiyla denatüre edilmis CD70"e baglanma, bazi kanser hücresi hatlarinda kismi veya düsük seviyelerde intemalizasyon. Kombinasyondaki bu özelliklerin tamami 41 Dl 2'yi ve aslinda diger 27B3 varyantlarini ve benzer özellikler sergileyen burada açiklanan diger CD70 antikorlarini, CD70 ile baglantili hastaliklarin, spesifik olarak CD70 eksprese eden kanserlerin ve immünolojik bozukluklarin tedavisinde terapötik kullanim açisindan cazip bir aday haline getirir. olarak gösterilen agir zincir degisken CDR3 dizisinin mevcut olmasidir. Burada 27B3 veya insan germ hatti islemi yapilmis 27B3 varyantlari ile ayni agir zincir CDR7leri kombinasyonunu içeren antikorlar veya bunlarin antijen baglayici fragmanlari açiklanmaktadir. Antikor veya antijen baglayici fragmani asagidakilerin söz konusu oldugu bir agir zincir degisken domenini içerebilir: degisken agir zincir CDR3 DIZI ID. NO:50"ye veya bunun bir dizi varyantina ait amino asit dizisini içerir veya bundan olusur; degisken agir zincir CDR2 DIZI ID. NO:27, DIZI ID. No:249 ve bunlarin dizi varyantlarindan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içerir veya bundan olusur; ve degisken agir zincir CDR] DIZI ID. NO:11, DIZI ID. No:248 ve bunlarin dizi varyantlarindan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içerir veya bundan olusur, burada dizi varyantlari bahsedilen dizide bir, iki veya üç amino asit sübstitüsyonu (örnegin, koruyucu sübstitüsyonlar, insanlastirici sübstitüsyonlar veya afinite varyantlari) içerir. Antij en veya antijen baglayici fragman HCDR3, HCDR2 ve HCDRl koinbinasyonunun asagidakilerden seçildigi bir agir zincir degisken doineni içerebilir: (a) DlZl ID. NO:50lyi (DAGYSNHVPIFDS) veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDR3; DIZI ID. NO: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDR2; ve DIZI ID. NO: 1 "i (VYYMN) veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDRl , burada dizi varyantlari bahsedilen dizide bir, iki veya üç amino asit sübstitüsyonu (örnegin, koruyucu sübstitüsyonlar, insanlastirici sübstitüsyonlar veya afinite varyantlari) içerir; (b) DIZI ID. NO: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDR3; DIZI ID. No: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDRZ; ve DIZI ID. NO:11SI (VYYMN) veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDRl, burada dizi varyantlari bahsedilen dizide bir, iki veya üç amino asit sübstitüsyonu (örnegin, koruyucu sübstitüsyonlar, insanlastirici sübstitüsyonlar veya afinite varyantlari) içerir. (0) DIZI ID. NO: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDR3; DIZI ID. NO:27"yi (DINNEGGTTYYADSVKG) veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDRZ; ve DIZI ID. NO: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken agir zincir CDRl, burada dizi varyantlari bahsedilen dizide bir, iki veya üç amino asit sübstitüsyonu (örnegin, koruyucu sübstitüsyonlar, insanlastirici sübstitüsyonlar veya afinite varyantlari) içerir. Antikor veya antij en baglayici fragmani agir zincir degisken domeni ile eslesen bir hafif zincir degisken domeni (VL) de içerir. Tercih edilen hafif zincir degisken domenlerinde, degisken hafif zincir CDR3 DIZI ID. NO: 160,1 veya bunun bir dizi varyantini içerir veya bunlardan degisken hafif zincir CDRZ DIZI ID. N02] 19, DIZI ID. NO:l 10 ve bahsedilen dizilerin dizi varyantlarindan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içerir veya bundan olusur; ve degisken hafif zincir CDRl DIZI ID. NO:87, DIZI ID. NO:250, DIZI ID. No:251, DIZI ID. NO:252, DIZI ID. No:253 ve ve bahsedilen dizilerin dizi varyantlarindan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içerir veya bundan olusur; burada dizi varyantlari bahsedilen dizilerde bir, iki veya üç amino asit sübstitüsyonu (örnegin, koruyucu sübstitüsyonlar, insanlastirici sübstitüsyonlar veya afinite varyantlari) içerir. Antij en veya antijen baglayici fragmani bir hafif zincir degisken domenini içerebilmekte olup, burada LCDR3, LCDR2 ve LCDRl kombinasyonu asagida belirtilenlerden seçilir: (a) DIZI ID. NO: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken hafif zincir CDR3; DIZI ID. No: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken hafif zincir CDR2; ve DIZI ID. NO: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken hafif zincir CDRl, burada dizi varyantlari bahsedilen dizide bir, iki veya üç amino asit sübstitüsyonu (Örnegin, koruyucu sübstitüsyonlar, insanlastirici sübstitüsyonlar veya afinite varyantlari) içerir; (b) degisken hafif zincir CDR3 içerir veya olusur DIZI ID. NO: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken hafif zincir DIZI ID. NO: veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken hafif zincir CDR2; ve DIZI ID. NO:87°yi (GLKSGSVTSTNFPT) veya bunun bir dizi varyantini içeren veya bunlardan olusan degisken hafif zincir CDRl, burada dizi varyantlari bahsedilen dizide bir, iki veya üç amino asit sübstitüsyonu (örnegin, koruyucu sübstitüsyonlar, insanlastirici sübstitüsyonlar veya afinite varyantlari) içerir. 27B37ün insan "gerrn hatti islemi yapilmis" varyantlarinin diger hafif zincir CDR kombinasyonlari Tablo lSA"da verilmektedir. CD70 antikorunun veya bunun antijen baglayici fragmaninin en fazla tercih edilen düzenlemesi bir agir zincir degisken domeni (VH) ve bir hafif zincir degisken domeni (VL) içermekte olup, burada insan CD70 için baglanma alanini olusturan 6 CDRinin kombinasyonunda asagida belirtilenler söz konusudur: degisken agir zincir CDR3 DIZI ID. NO: içerir veya bundan olusur; degisken agir zincir CDR2 DIZI ID. NO:27lyi (DINNEGGTTYYADSVKG) içerir veya bundan olusur; degisken agir zincir CDRl DIZI ID. N02] 1 ,i (VYYMN) içerir veya bundan olusur; degisken hafif zincir CDR3 DIZI ID. NO: içerir veya bundan degisken hafif zincir CDR2 DIZI ID. NO: içerir veya bundan olusur; ve degisken hafif zincir CDRl DIZI ID. NO: içerir veya bundan olusur. 6 CDR'ye iliskin diger açiklanan kombinasyonlar 27B3 °ün Tablo 14A (agir zincirler) ve 15A'da (haIif zincirler) siralanan insan germ hatti islemi yapilmis varyantlarinda olusan 27B3'ye ve bunun germ hatti islemi yapilmis varyantlarina dayanan yukarida geçen tercih edilen düzenlemelerde, antikor tercihen bir insan antikoruna, özellikle belirtinek gerekirse insan lgGl, IgG2, lgG3 veya lgG4"e ait CHl domenini, mentese bölgesini, CHZ domenini ve CH3 domenini içerir. En fazla tercih edilen düzenleme bir insan lgGl "din Daha da fazla tercih edilen insan lgGl ,in antikora bagli hücresel sitotoksisite (ADCC), tamamlayiciya bagli sitotoksisite (CDC) veya antikora bagli hücresel fagositozun (ADCP) birinde veya daha fazlasindaki efektör islevini maksimuma çikaracak sekilde tasarlanmasidir. Özellikle tercih edilen fukozillenmemis bir insan lgGl, örnegin BioWa Inc."ye ait PotelligentTM teknolojisini kullanarak üretilen fukozillenmemis bir IgG17dir. Burada ayrica açiklanan 27B3 isimli Fab"ye ve 27B3,nin insan gemi hatti islemi yapilmis varyantlarina dayanan insan CD70"e yüksek afiniteyle baglanma sergileyen CD70 antikorlari ve DIZI ID. NO:275 amino asit dizilerinden ve bahsedilen dizilerden biriyle en az %90, %95, bir amino asit dizisine sahip bir agir zincir degisken domeni içeren ve istege bagli olarak DIZI ID. No:276 ve DIZI ID. No:277 amino asit dizilerinden ve bahsedilen dizilerden biriyle en gruptan seçilen bir amino asit dizisine sahip bir hafif zincir degisken domeni içeren izole edilmis antikorlari veya bunlarin antij en baglayici fragmanlarini içerir. VH domenlerinin ve VL domenlerinin yukarida siralanan VH ve VL domeni dizi gruplarindan seçilen tüm olasi eslesmeleri mükmün olsa bile, bazi VH ve VL kombinasyonlari özellikle tercih edilmektedir; bunlar insan CD70°e yüksek afiniteyle baglanma sergileyen tek bir Fab içindeki "dogal" kombinasyonlardir. 27B3'ün Tablo 14B ve 15B'de bahsedilen germ hatti islemi yapilmis varyantlari söz konusu oldugunda, özgün VH/VL eslesmesinin kornumasi tercih edilebilir. Dolayisiyla, yüksek afiniteyle CD70 baglanmasi sergileyen tercih edilen CD70 antikorlari veya bunlarin antijen baglayici fragmanlari bir agir zincir degisken domeni ve bir hafif zincir degisken domeni kombinasyonunu içerenler olup, burada kombinasyon asagida belirtilen sekildedir: (i) DIZI ID. No:223,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO:241 'e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; Ayrica yüksek aIiniteyle CD70 baglanmasi sergileyen ve bir agir zincir degisken domeni ve bir hafif zincir degisken domeni kombinasyonunu içeren CD70 antikorlari veya bunlarin antij en baglayici fragmanlari da açiklanmakta olup, burada kombinasyon asagidakilerden olusan gruptan seçilir: (ii) DIZI ID. NO: 178'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: l90,a ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (iii) DIZI ID. NO:212iye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 230,a ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (iv) DIZI ID. No:213? ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 23 l ,e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (v) DIZI ID. NO:2147e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 232,ye ait ainino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (vi) DIZI ID. NO:215'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 235"e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (Vii) DIZI ID. NO:216'ya ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni10 ve DIZI ID. NO: 234,6 ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (Viii) DIZI ID. NO:217"ye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 235`e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (ix) DIZI ID. No:218? ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 236,ya ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (x) DIZI ID. NO:219'a ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 237°ye ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xi) DIZI ID. NO:220"ye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 238°e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xii) DIZI ID. NO:22] 'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 23921 ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xiii) DIZI ID. NO:222"ye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 24021 ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xiv) DIZI ID. No:224,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 242,ye ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xv) DIZI ID. NO:225"e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 243 ,e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xvi) DIZI ID. NO:226'ya ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 244"e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xvii) DIZI ID. NO:227iye ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 245'e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xviii) DIZI ID. NO:228,e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 2463ya ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xix) DIZI ID. NO:229`a ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 247,ye ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xx) DIZI ID. NO:223'e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni10 ve DIZI ID. NO: 244,6 ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni; (xxi) DIZI ID. NO:223"e ait amino asit dizisini içeren bir agir zincir degisken domeni ve DIZI ID. NO: 245,e ait amino asit dizisini içeren bir hafif zincir degisken domeni. Yukarida siralanan her spesifik VH/VL kombinasyonu için bahsedilen VH domeni dizisiyle dizisine sahip bir VL domeniyle kombine edilmesi de mümkündür ve bulusun kapsamina dahildir. En fazla tercih edilen düzenleme 41Dl2 isimli insan genn hatti islemi yapilmis varyantin dogal VH/VL kombinasyonuna dayanan bir CD70 antikoru veya bunun antijen baglayici fragmanidir. Dolayisiyla, burada DIZI ID. NO:223 olarak gösterilen amino asit dizisinden, bunun gerrn hatti islemi yapilmis varyantlarindan ve afinite varyantlarindan ve bunlarla en az amino asit dizisini içeren veya bundan olusan bir agir zincir degisken domeni (VH) ve DIZI ID. NO:24l olarak gösterilen amino asit dizisinden, bunun germ hatti islemi yapilmis özdes amino asit dizilerinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içeren veya bundan olusan bir hafif zincir degisken domeni (VL) içeren bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani da saglanmaktadir. VH domeni amino asit dizisinin DIZI ID. NO: 223 olarak gösterilen diziyle %100,den daha az dizi özdesligi sergiledigi düzenlemeler yine de çerceve bölgeleri içinde amino asit dizisi varyasyonlari sergileyerek DIZI ID. No:223,ün HCDR] , HCDR2 ve HCDR3"üne (sirasiyla DIZI ID: N02] 1, 27 ve 50) özdes olan agir zincir CDR"lerini içerebilirler. Ayni sekilde, VL domeni amino asit dizisinin DIZI lD. NO: 241 olarak gösterilen diziyle %100"den daha az dizi özdesligi sergiledigi düzenlemeler yine de çerçeve bölgeleri içinde amino asit dizisi varyasyonlari sergileyerek DIZI ID. NO:241 'in LCDRl, LCDR2 ve LCDR3iüne (sirasiyla DIZI ID: No:250, 116 ve 160) özdes olan agir zincir CDR,lerini içerebilirler. 41D12,nin VH ve VL domenlerine veya bunlarin varyantlarina dayanan yukarida bahsedilen tercih edilen düzenlemelerde, antikor tercihen bir insan antikoruna, özellikle belirtmek gerekirse insan IgGl, IgGZ, IgG3 veya IgG4"e ait CH] domenini, mentese bölgesini, CH2 domenini ve CH3 domenini içerir. En fazla tercih edilen düzenleme bir insan IgGl ,dir, Daha da fazla tercih edilen insan lgGl "in ADCC, CDC veya ADCP,den birindeki veya daha fazlasindaki efektör islevini maksimuma çikartacak sekilde tasarlanmasidir. Özellikle tercih edilen, tercihen PotelligentTM ekspresyon sistemini kullanarak hazirlanan fukozilden arindirilmis bir insan lgGl "dir. Ayrica DIZI ID. No:225 ile gösterilen amino asit dizisinden, bunun germ hatti islemi yapilmis varyantlarindan ve afinite varyantlarindan ve bunlarla en az %90, %95, %97, %98 veya %99 özdes amino asit dizilerinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içeren veya bundan olusan bir agir zincir degisken domeni (VH) ve DIZI ID. No:243 ile gösterilen amino asit dizisinden, bunun germ hatti islemi yapilmis varyantlarindan ve afinite dizilerinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içeren veya bundan olusan bir hafif zincir degisken domeni (VL) içeren bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani da açiklanmaktadir; veya Ayrica DIZI ID. NO:226 ile gösterilen amino asit dizisinden, bunun gemi hatti islemi yapilmis varyantlarindan ve afinite varyantlarindan ve bunlarla en az %90, %95, %97, %98 veya %99 özdes amino asit dizilerinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içeren veya bundan olusan bir agir zincir degisken domeni (VH) ve DIZI ID. No:244 ile gösterilen amino asit dizisinden, bunun gerrn hatti islemi yapilmis varyantlarindan ve afinite dizilerinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içeren veya bundan olusan bir hafif zincir degisken domeni (VL) içeren bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani da açiklanmaktadir. CD70 Antikorlarina Iliskin Hususlar/Özellikler Yukarida bahsedilen yönlerde ve düzenlemelerde, CD70 antikorlarinin veya bunlarin antijen baglayici fragmanlarinin her biri asagidaki özelliklerden veya hususlardan birini veya daha fazlasini veya bunlarin bir kombinasyonunu sergileyebilir: Antikor veya antijen baglayici fragman, bir Fab fragmani olarak test edildiginde insan yüksek afiniteyle baglanabilir. Antikor veya antijen baglayici fragman insan CD70'e yüksek afiniteyle baglanabilir ve CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi inhibe edebilir. Alternatif olarak, antikor veya antijen baglayici fragman insan CD70,e baglanabilir ancak CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi inhibe ctmeyebilir. Antikor veya antijen baglayici fragman CD70 eksprese eden hücrelerin yüzeyinde insan CD703e yüksek afiniteyle baglanabilir. Antikor veya antijen baglayici fragman CD70 eksprese eden hücrelerin yüzeyinde insan CD70`e baglanabilir ve yavas yavas veya sadece kismen intemalize edilebilir. Bulusun önemli bir yönü CD70 antikorlarinin CD70 eksprese eden birçok kanser hücresi hatti dahil CD70 eksprese eden çok sayida hücre hattinda aslinda çok az intemalize edildiginin gözlemlenmesidir. Bu gözlem CD70 antikorlarinin renal hücre karsinomu hücre hatlarina baglanmayi takiben hizla intemalize edildiklerine dair daha önceleri yayinlanan bildirilerle iliskin dogrudan sonuçlari vardir. CD70 antikorlarinm kanser hücrelerine baglanmayi takiben çok az intemalize edildiklerine iliskin gözlem, CD70 eksprese eden birçok kanserin ve aslinda CD70 ile baglantili immünoloj ik hastaliklarin tedavisine dair terapötik stratejilerin, CD70 antikorunun bir terapötik maddeye, örnegin sitotoksik veya sitostatik bir ilaç parçasina baglandigi immünokonjugatlarin kullanimina degil özellikle ADCC, CDC veya ADCP,den herhangi birindeki veya daha fazlasindaki antikor efektör isleviyle birlikte CD70"e olaganüstü yüksek afiniteyle baglanmaya dayandirilmasi gerektigi sonucunu kuvvetli sekilde desteklemektedir. Antikor veya antijen baglayici fragman insan CD70°te amino asit dizisi HIQVTLAICSS (DIZI ID. No:342) içinde baglanabilir; Antikor veya antijen baglayici fragman maymun kökenli CD70 ile, özel olarak al yanakli makak (Macaca mulatta) ve sinomolgus maymunu (Macaca cynomolgus) CD70 homologlariyla çapraz reaktiflik sergileyebilir. Antikor veya antij en baglayici fragman hem dogal insan CD70,e (örnegin bir hücrenin, örnegin bir hücre hattinin veya bir insan hastadan izole edilen CD70 eksprese eden bir hücrenin yüzeyinde ekspre olan CD70), hem isiyla denatüre edilmis rekombinant insan CD70'e baglanabilir. Antikor veya antij en baglayici fragman rekombinant antikor ekspresyonu sistemlerinde, örnegin CHKl SV hücre hattinda (BioWa/Lonza,ya tescilli) terapötik antikor ürünlere iliskin 1-2 g/L'lik eski ortalama ile karsilastirildiginda çok yüksek üretim verimleri (4 g/L) saglayabilir, ki bu da üretim maliyetlerinde önemli ölçüde bir azalmaya yol açar.10 Antikor veya antijen baglayici fragman 37°C°nin altinda depolama kosullarinda ve dondurma- çözme çevrimlerinde oldukça stabil olabilir, ki bu da maliyet azaltan önemli bir faktördür. Antikor hücre yüzeyinde insan CD70 proteinini eksprese eden hücrelere yönelik antikora bagli hücre aracili sitotoksisite (ADCC), tamamlayiciya bagli sitotoksisite (CDC) ve antikora bagli hücre aracili fagositozdan (ADCP) seçilen bir veya daha fazla efektör islev sergileyebilir. Antikor CD70 eksprese eden hücrelere, örnegin kanser hücrelerine veya diger kötü huylu hücrelere veya iininün hücrelere yönelik ADCC sergileyebilir. Antikor bir dogal insan FC domeni içeren esdeger bir antikor olan bir referans antikorla karsilastirildiginda güçlenmis ADCC islevi sergileyebilir. Sinirlayici olmayan bir düzenlemede, ADCC islevi bir dogal insan Fc domeni içeren referans antikorla karsilastirildiginda en az on kat güçlenmis olabilir. Bu baglamda "esdeger", güçlenmis ADCC islevi olan antikorun ADCCinin güçlendirilmesi amaciyla yapilan modifikasyonlar hariç (dogal insan F c*ye iliskin) referans antikorla önemli ölçüde özdes antijen baglama spesifikligi gösterdigi ve/veya özdes amino asit dizisi paylastigi anlaminda ele alinabilir. Antikor veya antij en baglayici fragman, sitotoksik veya sitostatik bir maddeye konj ugasyon olmadan bir in vivo tüinör ksenogreft modelinde tümör büyümesini inhibe edebilir. Sinirlayici olmayan bir düzenlemede, tümör büyümesi islevinin inhibisyonu referans antikor SGN70 ile karsilastirildiginda en az 10 kat artabilir. Antikor veya antijen baglayici fragman CD70 ekSprese eden hücrelerde apoptozu indükleyebilir. Antikor bir insan lgGsye, en fazla tercihen insan lgGl , lgG2, IgG3 veya lgG49e ait mentese bölgesini, CH2 domenini ve CH3 domenini içerebilir. Antikor F c bölgesinde modifikasyonlar, örnegin burada baska yerde açiklanan sekilde antikor efektör islevini artiran modifikasyonlar içerebilir. Özellikle, antikor fukozillenmemis bir lgG olabilir. Baska yönleri itibariyla, bulusta yukarida siralanan CD70 antikorlarini ve bunlarin antijen baglayici fragmanlarini kodlayan polinükleotit molekülleri, ilaveten polinükleotitleri içeren ekspresyon vektörleri, vektörleri içeren konakçi hücreler ve CD70 antikorlarinin rekombinant ekspresyonuna/üretimine iliskin usuller de saglanmaktadir. Yine bir baska yönü itibariyla bulusta yukarida açiklanan CD70 antikorlarmdan herhangi10 birini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya eksipiyan içeren bir farmasötik bilesim saglanmaktadir. Bulusun yine bir baska yönü bilhassa kanser tedavisinde olmak üzere yukarida siralanan CD70 antikorlarinin kullanildigi tibbi tedavi usullerine iliskindir. Sekillere Yönelik Kisa Açiklama Bulus asagidaki deneysel örneklere ve ilisikteki Sekillere basvurarak daha ayrintili anlasilacaktir: Sekil 1: 786-0 hücreleriyle (üst) ve Raji hücreleriyle (alt) asilanmis lainalara iliskin rekombinant CD70 üzerinde gerçeklestirilen ELISA,da elde edilen immün yanit gösterilmektedir. Sekil 2: lamadan elde edilen CD70 Fab"ler ve referans CD70 Fab°lerle ELISA ile ölçülen CD27'nin CD70,e baglanmasinin inhibisyonu gösterilmektedir. Sekil 3: bir baglanma ELISAisinda (siyah) veya bir inhibisyon ELlSA"sinda (beyaz) test edilen lamadan elde edilen F ab"lere iliskin sinyalin grafik seklinde bir sunumudur. Sekil 4: kimerik lama-insan CD70 mAb"leriyle ve referans CD70 mAb°leriyle ELISA ile ölçülen CD27,nin insan CD70,ine (A&B') veya al yanakli maymun CD70°ine (C) baglanmasinin inhibisyonu gösterilmektedir. Sekil 5: FACS analizi ile kanitlanan kimerik lama-insan CD70 mAb71erinin 786-0 hücrelerine (A) veya MHH-PREB-l hücrelerine (B) baglanmasi gösterilmektedir. Sekil 6: Raj i hücresi bazli bir ortak kültür etki gücü analizinde CD70°e spesifik kimerik lama-insan mAb'lerinin inhibisyonu gösterilmektedir. Sekil 7: 786-0 hücrelerinde gerçeklestirilen standart Cr51 salimli ADCC analizinin sonuçlari gösterilmektedir. Sekil 8: %9 insan serumu mevcudiyetinde U266 hücrelerinde gerçeklestirilen CDC analizinin sonuçlari gösterilmektedir. Sekil 9: 786-0 hücrelerinde gerçeklestirilen bir ADCP analizinde kimerik lama-insan CD70 mAb,lerinin etkinligi gösterilmektedir. Sekil 10: iki bagimsiz deneyde 786-0 hücrelerinde bir zaman fonksiyonu olarak farkli kimerik lama-insan CD70 mAb'leri için MFI DISARDA olarak degerlendirilen antikor internalizasyonu gösterilmektedir.10 Sekil 1 1: bir Raji Ksenogreft modelinde kimerik lama-insan CD70 mAb 4lD12, izotip kontrol ve Fc-ölü kontrol ile tedavi sonrasinda farelerin sagkalimi gösterilmektedir. Sekil 12: sirasiyla VH3-38 ve VL8-6l insan germ hatti gen kesitlerinin amino asit dizileriyle birlikte 27B3 klonunun VH ve VL amino asit dizilerine iliskin hizalamalar gösterilmektedir. Sekil 13: 37°C7de 5 hafta inkübasyon sonrasinda alinan germ hatti islemi yapilmis 27B3 mAb varyantlarina iliskin numunelerin jel Iiltrasyonu analizi gösterilmektedir. Sekil 14: çesitli sicakliklarda inkübasyon sonrasinda çesitli zaman noktalarinda alinan gemi hatti islemi yapilmis CD70 mAb numunelerine iliskin Biacore kullanarak ölçülen CD70 baglanmasindaki etki gücü gösterilmektedir. Sekil 15: CD70 mAb"lerin CD70 eksprese eden kanser hücre hatlarina iliskin baglanma afinitesi gösterilmektedir. Sekil 16: CD70 mAbWerinin CD70 eksprese eden CLL hastasi hücrelerine iliskin afinitesi gösterilmektedir. Sekil 17: CD70 mAb"1eriyle baglanmis SU-DHL-6 hücrelerinin lizizi gösterilmektedir. Sekil 18: CD70 mAbileriyle ELISAlda ölçülen CD27,nin CD70"e baglanmasinin inhibisyonu gösterilmektedir. Sekil 19: farkli türlere ait CD70 dizilerine iliskin bir hizalama gösterilmektedir. hücrelerine ve sinomolgus maymunu HSC-F hücrelerine iliskin baglanma afinitesi gösterilmektedir. Sekil 21: CD70 mAbilerle ELISASda belirlenen CD27"nin insan, al yanakli maymun ve sinomolgus maymunu CD70"ine baglanmasinin inhibisyonu gösterilmektedir. Sekil 22: ELISA ile degerlendirilen CD70 mAb*lerinin denatüre rekombinant CD70"e baglanmasi gösterilmektedir. Sekil 23: epitop haritalamasi için kulllanilan CD70 kimerik dizileri gösterilmektedir. Sekil 24: 786-0 hücrelerinde bir zaman fonksiyonu olarak CD70 mAbilere iliskin antikor internalizasyonu gösterilmektedir. Tanimlar terimi herhangi bir spesifik immünoreaktiflige sahip olsun ya da olmasin iki agir ve iki hafif zincirin bir kombinasyonuna sahip bir polipeptidi içerir. "Antikorlar" bir ilgili antij ene (örnegin insan CD70) yönelik bilinen anlamli spesifik immünoreaktif etkinlige sahip gruplara karsilik gelir. Burada "CD70 antikorlari" terimi insan CD70 proteini için immünolojik spesifiklik sergileyen antikorlara karsilik gelecek sekilde kullanilir. Burada baska bir yerde açiklandigi gibi, insan CD70 için "spesifiklik" CD70 homologlari olan türlerle çapraz reaksiyonu hariç tutmaz. Antikorlar ve immünoglobulinler aralarinda zincirler arasi bir kovalent baglanti olan veya olmayan hafif ve agir zincirleri içerir. Omurgali sistemlerdeki temel immünoglobulin yapilari görece iyi bilinmektedir. Genel "immünoglobulin" terimi biyokimyasal olarak ayirt edilebilecek bes ayri antikor sinifini içerir. Bes antikor sinifinin tamami mevcut bulusun kapsami dahilinde olup, asagidaki açiklama genel olarak immünoglobulin moleküllerinin IgG sinifina yöneliktir. IgGlye iliskin olarak, immünoglobulinler yaklasik olarak 23,000 Dalton molekül agirliginda iki özdes hafif bir "Y" konfigürasyonunda disülfür baglarla birlesmis olup, burada hafif zincirler "Y"nin agzinda baslayarak ve degisken bölge boyunca devam ederek agir zincirleri destekler. Bir antikorun hafif zincirleri kappa veya lambda (K, l) seklinde siniflandirilir. Her agir zincir sinifi gerek kappa, gerek lambda bir hafif zincirlebaglanmis olabilir. Genel olarak, hafif ve agir zincirler kovalent sekilde birbirine baglanir ve iki agir zincirin "kuyruk" kisimlari birbirine kovalent disülfîir baglantilarla veya immünoglobulinler hibridomlar, B hücreleri veya genetik mühendisligi ile yapilmis konakçi hücreler ile olusturuldugunda kovalent olmayan baglantilarla baglanir. Agir zincirde, amino asit dizileri Y konfigürasyonunun çatalli uçlarindaki bir N terminalden her zincirin altindaki C terminale dogru uzanir. Teknikte uzman olanlar agir zincirlerin gamma, mü, alfa, delta veya epsilon, (y, u, oi, ö, 8) seklinde siniflandirildigini ve bunlarin arasinda bazi alt siniflarin (örnegin, 71 - y 4) bulundugunu bilecektir. Sirasiyla IgG, IgM, IgA, IgD veya IgE seklindeki antikor "sinifi"n1 belirleyen bu zincirin yapisidir. Immünoglobulin alt siniflarinin (izotipler), örnegin IgGl, IgG2, IgG3, sagladiklari bilinmektedir. Bu siniflarin ve izotiplerin her birinin modifiye edilmis çesitleri mevcut açiklamayi dikkate alarak uzman kisilerce kolaylikla ayirt edilebilir ve dolayisiyla mevcut bulusun kapsamina girmektedir.10 Yukarida belirtildigi üzere, bir antikorun degisken bölgesi antikorun antijenlerdeki epitoplari selektif olarak tanimasini ve spesifik olarak bunlara baglanmasini saglar. Yani, bir antikorun VL domeni ve VH domeni birleserek üç boyutlu bir antijen baglayici alani tanimlayan degisken bölgeyi olusturur. Bu dörtlü antikor yapisi Yanin her kolunun ucunda bulunan antij en baglanma alanini olusturur. Daha özel belirtmek gerekirse, antijen baglanma alani VH ve VL zincirlerinin her birindeki üç tamamlayiciligi belirleme bölgesi (CDR"ler) ile tanimlanir. veya "CD70 antijeni" veya "CD70" terimleri birbirinin yerine kullanilabilir ve TNFRSF27/CD27 için bir ligand olan TNF ligand ailesinin bir üyesine karsilik gelir. "Insan CD70 proteini" veya "insan CD70 antijeni" veya "insan CD70" terimleri birbirinin yerine kullanilabilmekte olup, spesifik olarak insan homologuna karsilik gelir ve dogal olarak insan vücudunda ve/Veya kültür edilen insan hücresi hatlarinin yüzeyinde eksprese olan dogal insan CD70 proteinini ayrica bunlarin rekombinant formlarini ve fragmanlarini içerir. Insan CD70`in spesifik örnekleri Erisim No. NP_001243 NCBl Referans Dizisi altinda gösterilen amino asit dizisine sahip polipeptidi veya bunun hücre disi domenini içerir. bir ilgili hedef antij ene (örnegin insan CD70) selektif baglaninaktan sorumlu bir bölgesini içerir. Baglanma domenleri en az bir baglanma alani içerir. Örnek baglanma domenleri bir antikor degisken domenini içerir. Bulusa ait antikor molekülleri tek bir baglanma alani veya çok sayida (örnegin, iki, üç veya dört) baglanma alani içerebilir. bir CD70 antikoru veya bunun antijen baglayici fragmani) "elde edilmis" terimi polipeptidin kökenine karsilik gelir. Bir düzenlemede, bir özel baslangiç polipeptidinden elde edilmis polipeptit veya amino asit dizisi bir CDR dizisi veya bununla baglantili bir dizidir. Bir düzenlemede, bir özel baslangiç polipeptidinden elde edilmis amino asit dizisi bitisik degildir. Örnegin, bir düzenlemede bir, iki, üç, dört, bes veya alti CDR bir baslangiç antikorundan elde edilir. Bir düzenleinede, bir özel baslangiç polipeptit veya amino asit dizisinden elde edilen polipeptit veya amino asit dizisi baslangiç dizisine veya bunun bir kismina ait olanla esas itibariyla özdes bir amino asit dizisine sahip olup, burada kisim en az 3-5 amino asitten, 5-10 asitten olusur ya da kökeninin baslangiç dizisinde olmasiyla teknikte genel bilgi sahibi bir kisi tarafindan belirlenebilir. Bir düzenlemede, baslangiç antikorundan elde edilen bir veya daha10 fazla CDR dizisi degistirilerek varyant CDR dizileri, örnegin afinite varyantlari üretilmekte olup, burada varyant CDR dizileri CD70 baglanma etkinligini korur. antikoru molekülleri bir devegilin CD70 antijeniyle aktif bagisiklanmasiyla ortaya çikartilan bir devegil konvansiyonel antikorundan elde edilen çerçeve amino asit dizilerini ve/veya CDR amino asit dizilerini içerir. Bununla birlikte, devegillerden elde edilen amino asit dizilerini içeren CD70 antikorlari bir insan amino asit dizisinden (yani bir insan antikoru) veya devegil olmayan bir baska memeli türünden elde edilen çerçeve ve/veya sabit bölge dizilerini içerecek sekilde tasarlanabilir. Örnegin, söz konusu CD70 antikorlarina bir insan veya insan disi primatin çerçeve bölgesi, agir zincir kismi ve/Veya mentese kismi dahil edilebilir. Bir düzenlemede, devegile ait olmayan bir veya daha fazla amino asit "devegillerden elde edilen" bir CD70 antikorunun çerçeve bölgesinde mevcut olabilir, örnegin, bir devegil çerçeve amino asit dizisi içinde karsilik gelen insan veya insan disi primat amino asit kalintisinin mevcut oldugu bir veya daha fazla amino asit mutasyonunu içerebilir. Ayrica, devegillerden elde edilen VH ve VL domenleri veya bunlarin insanlastirilmis varyantlari insan antikorlarinin sabit domenlerine baglanarak burada baska bir yerde ayrintili olarak açiklanan sekilde bir kimerik molekül elde edilebilir. kalintisinin benzer bir yan zincire sahip bir amino asit kalintisi ile degistirildigi bir sübstitüsyondur. Benzer yan zincirlere sahip amino asit kalintisi aileleri teknikte tanimlanmis olup, bunlar bazik yan Zincirleri (örnegin, lizin, arginin, histidin), asidik yan zincirleri (örnegin, aspartik asit, glutamik asit), yüksüz kutuplu yan zincirleri (örnegin, glisin, asparajin, glutamin, serin, treonin, tirozin, sistein), kutupsuz yan zincirleri (örnegin, alanin, valin, lösin, izolösin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta dalli yan zincirleri (örnegin, treonin, valin, izolösin) ve aromatik yan zincirleri (örnegin, tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin) içerir. Dolayisiyla, bir immünoglobulin polipeptitteki esansiyel olmayan bir amino asit kalintisi ayni yan zincir ailesinden bir baska amino asit kalintisi ile degistirilebilir. Bir baska düzenlemede, bir amino asit sirasi yan zincir ailesi üyelerinin sirasi ve/veya bilesimi bakimindan farklilik gösteren yapisal olarak benzer bir sira ile degistirilebilir. immünoglobulin agir zincirinin sabit domenlerinden elde edilen amino asit dizilerini içerir. Bir agir zincir kismi içeren bir polipeptit bir CHl domeni, bir mentese (örnegin, üst, orta ve/veya alt mentese bölgesi) domeni, bir CH2 domeni, bir CH3 domeni veya bunlarin bir10 varyanti veya fragmanindan en az birini içerir. Bir düzenlemede, bulusa ait bir antikor veya antijen baglayici fragman bir immünoglobulin agir zincirinin Fe kismini (örnegin, bir mentese kismi, bir CH2 domeni ve bir CH3 domeni) içerebilir. Bir baska düzenlemede, bulusa ait bir antikor veya antijen baglayici fragman bir sabit domenin en az bir kismini (örnegin, bir CH2 domeninin tamami veya bir kismi) bulundurmayabilir. Bazi düzenlemelerde, sabit domenlerin en az biri ve tercihen tamami bir insan immünoglobulin agir zincirinden elde edilir. Örnegin, tercih edilen bir düzenlemede, agir zincir kismi tamamen insan bir mentese domenini içerir. Tercih edilen diger düzenlemelerde, agir zincir kismi tamamen insan bir PC kismi (örnegin, bir insan immünoglobulinine ait mentese, CH2 ve CH3 domeni dizileri) içerir. Bazi düzenlemelerde, agir zincir kisminin kurucu sabit domenleri farkli immünoglobulin moleküllerindendir. Örnegin, bir polipeptidin agir zincir kismi bir IgGl molekülünden elde edilen bir CH2 doineni ve bir IgG3 veya lgG4 inolekülünden elde edilen bir mentese bölgesi içerebilir. Baska düzenlemelerde, sabit domenler farkli immünoglobulin moleküllerine ait kisimlar içeren kimerik domenlerdir. Örnegin, bir mentese bir lgGl molekülünden bir ilk kisim ve bir IgG3 veya lgG4 molekülünden bir ikinci kisim içerebilir. Yukarida belirtildigi gibi, teknikte genel bilgi sahibi bir kisi agir zincir kismina ait sabit domenlerin amino asit dizisi bakimindan dogal olusumlu (yabani tip) immünoglobulin molekülünden farklilik gösterecekleri sekilde modifiye edilebileceklerini bilecektir. Yani, burada açiklanan bulusa ait polipeptitler agir zincir sabit domenlerinin birinde veya daha fazlasinda (CHl, mentese, CH2 veya CH3) ve/veya hafif zincir sabit bölge domeninde (CL) degisiklikler veya modifikasyonlar içerebilir. Örnek modifikasyonlar bir veya daha fazla doinende bir veya daha fazla amino asitteki eklentileri, silinmeleri veya sübstitüsyonlari içerir. dizisine baglanmis bir ilk amino asit dizisini içerir. Amino asit dizileri normal olarak Iîizyon polipeptidinde biraraya getirilen ayri proteinlerde mevcut olabilirler veya normal olarak ayni proteinde mevcut olabilir ancak füzyon polipeptidinde yeni bir düzenlemede konulmus olabilirler. Bir kimerik protein, örnegin kimyasal sentez yoluyla veya peptit bölgeleri istenilen iliskide kodlanmis bir polinükleotit yaratarak ve translasyon uygulayarak olusturulabilir. Örnek kimerik CD70 antikorlari bir insan antikorunun, örnegin insan IgGl, IgG2, IgG3 veya veya bunlarin insanlastirilmis varyantlarini bulunduran füzyon proteinlerini içerir. terimleri burada birbirinin yerine geçecek sekilde kullanilir ve esdeger anlamlara sahiptirler.10 bakimindan yogun farklilik göstermesi ve her özel antikorun kendi hedef antijenine yönelik baglanmasinda ve spsefikliginde kullanilmasi durumuna karsilik gelir. Bununla birlikte, degiskenlik antikorlarin degisken domenlerinde esit sekilde dagilmaz. Antijen baglanma alanini olusturan VL domeninin ve VH domeninin her birinde "asiri degisken ilmikler" denilen üç parçada yogunlasir. VLambda hafif zincir domeninin birinci, ikinci ve üçüncü asiri degisken ilmigi burada L1(7\.), L2(›\.) ve L3(›\.) olarak geçer ve VL domeninde kalinti 24-33 ,ü 90-96"y1 (5 kalintidan olusan L30t)) içerdikleri belirtilebilir (Morea ve digerleri, Methods kalintidan olusan L3(K)) içerdikleri belirtilebilir (Morea ve digerleri, Methods 20:267-279 (2000)). VH domeninin birinci, ikinci ve üçüncü asiri degisken ilmikleri burada Hl, HZ ve H3 veya 4 kalintidan olusan H2) ve 91-1057i (H3, uzunluk açisindan oldukça degisken) Aksi belirtilmedigi sürece, L1, L2 ve L3 terimleri sirasiyla bir VL domeninin birinci, ikinci ve üçüncü asiri degisken ilmiklerine karsilik gelir ve Vkappa ve Vlambda izotiplerinin her ikisinden elde edilen asiri degisken ilmikleri kapsar. HI, H2 ve H3 terimleri sirasiyla VH domeninin birinci, ikinci ve üçüncü asiri degisken ilmiklerine karsilik gelir ve y, 8, 8, (1 veya p dahil bilinen agir zincir izotiplerinin herhangi birinden elde edilen asiri degisken ilmikleri Asiri degisken ilmikler L1, L2, L3, Hl, H2 ve H3°ün her biri asagida tanimlanan sekilde bir tanimlanmasi, tamamlayiciligi belirleme bölgelerinin (CDR,ler) ise dizi degiskenligine dayanarak tanimlanmasi (Kabat ve digerleri, Sequences of Proteins of Immunological nedeniyle tam olarak esanlamli degildir ve HV'lerin ve CDR,lerin sinirlari bazi VH ve VL domenlerinde farkli olabilmektedir. VL ve VH domenlerine ait CDR"lerin tipik olarak asagidaki amino asitleri içerdikleri belirtilebilir: hafif zincir degisken domeninde kalinti ve 89-10 97 (CDRLS) ve agir zincir degisken domeninde kalinti , ; (Kabat ve digerleri, Sequences of Proteins of Immunological Dolayisiyla, HV"ler karsilik gelen CDR°lerin içinde bulunabilir ve burada VH ve VL domenlerinin "asiri degisken ilmikleri"ne yapilan göndermeler aksi belirtilmedigi sürece karsilik gelen CDR,leri ve tersini kapsayacak sekilde de yorumlanmalidir. Degisken domenlerin daha yüksek derecede korunmus kisimlari asagida tanimlandigi üzere çerçeve bölgesi (FR) olarak isiinlendirilir. Dogal agir ve hafif zincirlere ait degisken domenlerin her biri dört FR (sirasiyla FRl, FR2, FR3 ve FR4) içermekte olup, bunlar büyük ölçüde üç asiri degisken ilmikle birlesen bir [3 yaprak konfigürasyonunu alir. Her zincirdeki asiri degisken ilmikler FR"lerle birbirlerine çok yakin tutulur ve diger zincire ait asiri degisken ilmiklerle birlikte antikorlarin antijen baglayici alaninin olusmasina katkida bulunurlar. Antikorlarin yapisal analizi tamamlayiciligi belirleme bölgeleri tarafindan olusturulan baglanma alaninin dizisi ve sekli arasindaki iliskiyi ortaya çikartmistir (Chothia ve 182 (1990)). Gösterdikleri yüksek dizi degiskenligine ragmen, alti ilmigin besi ana zincir konformasyonlarindan, "kanonik yapilar" denilen sadece küçük bir repertuvari edinir. Bu konformasyonlar öncelikle ilmiklerin uzunluguyla ve ikinci olarak ilmiklerde ve çerçeve bölgelerinde bazi kalintilarda paketlenmeleri, hidroj enle baglanmalari veya alisilmadik ana zincir konformasyonlarini alabilmeleri ile konformasyonu belirleyen önemli kalintilarin mevcudiyetiyle tanimlanirlar. terimi hem agir, hem hafif zincir polipeptitlerinin degisken bölgesinde bulunan bitisik olmayan antijen birlestirici alanlar anlamina gelir. Bu özel bölgeler Kabat ve digerleri, J. Biol. birbirleriyle karsilastirildiginda örtüsen veya alt küme amino asit kalintilarini içermektedir. Yukarida belirtilen referanslarin her birinde tanimlandigi sekilde CDR,leri kapsayan amino asit kalintilari karsilastirma amaciyla belirtilmektedir. Tercihen, "CDR" terimi dizi karsilastirmalarina dayanarak Kabat tarafindan tanimlanan sekilde bir CDR,dir. Tablo 1: CDR Tanimlari CDR Tanimlari Kabat] Chothia2 MacCallum3 lKalinti numalandirmasi Kabat ve digerlerine ait (bkz. yukarisi) terimlendirmeye göredir 2Kalinti nuinalandirrnasi Chothia ve digerlerine ait (bkz. yukarisi) terimlendirrneye göredir 3Kalinti numalandirinasi MacCallum ve digerlerine ait (bkz. yukarisi) terimlendirmeye göredir degisken bölgenin parçasi olan ancak CDR"lerin parçasi olmayan (örnegin, CDR°1ere iliskin Kabat tanimini kullanarak) amino asit kalintilarini içerir. Dolayisiyla, bir degisken bölge çerçevesi uzunluk açisindan yaklasik 100-120 amino asit arasindadir ancak sadece CDR,lerin disinda olan amino asitleri içerir. Kabat ve digerlerinin tanimlamasina göre bir agir zincir degisken domenine ve CDR"lere iliskin özel örnekte çerçeve bölgesi 1 amino asit 1-30"u kapsayan degisken bölge domenine karsilik gelir; çerçeve bölgesi 2 amino asit 36-49°u kapsayan degisken bölge domenine karsilik gelir; çerçeve bölgesi 3 amino asit 66-94"u kapsayan degisken bölge domenine karsilik gelir ve çerçeve bölgesi 4 103°ten degisken bölgenin sonuna dek olan amino asitleri kapsayan degisken bölge domenine karsilik gelir. Hafif zincir çerçeve bölgeleri ayni sekilde hafif zincir degisken bölge CDR"lerinin her biriyle ayrilir. Ayni sekilde, Chothia ve digerlerinin veya McCallum ve digerlerinin CDR7lere iliskin tanimi kullanildiginda çerçeve bölge sinirlari yukarida açiklanan sekilde ilgili CDR terininalleri ile ayrilir. Tercih edilen düzenlemelerde CDR,ler Kabat tarafindan tanimlanan sekildedir. Dogal olusumlu antikorlarda, her monomerik antikorda bulunan alti CDR kisa, bitisik olmayan ainino asit dizileri olup, bunlar antikor sulu bir ortamda üç boyutlu konfigürasyonunu alirken antijen baglanma alanini olusturmak üzere spesifik olarak konumlanmaktadir. Agir ve hafif degisken domenlerin geri kalani ainino asit dizisi açisindan moleküller arasi daha az degiskenlik gösterir ve çerçeve bölgeleri olarak ifade edilirler. Çerçeve bölgeleri büyük ölçüde bir [3 yaprak konformasyonunu alir ve CDR,ler [3 yaprak yapisina birlesen ve bazi durumlarda bunun bir parçasini olusturan ilmikleri olusturur. Dolayisiyla, bu çerçeve bölgeleri alti CDRinin zincirler arasi, kovalent olinayan etkilesimlerle dogru yönelimde konumlanmasini saglayan bir iskele olusturmasi islevini görür. Konumlanan CDR'lerin olusturdugu antij en baglanma alani immünoreaktif antijendeki epitopa tamamlayici bir yüzeyi tanimlar. Bu tamamlayici yüzey antikorun immünoreaktif antij en epitopuna kovalent olmayan baglanmasini tesvik eder. CDR,lerin konumu teknikte genel bilgi sahibi bir kisi tarafindan kolaylikla tanimlanabilir. molekülünün CHl domenini CH2 domenine birlestiren kismini içerir. Bu mentese bölgesi yaklasik olarak 25 kalinti içerir ve esnektir, dolayisiyla iki N terminal antijen baglayici bölgenin bagimsiz hareket etmesini saglar. Mentese bölgeleri üst, orta ve alt mentese domeni mentese bölgesi dizilerinden birini içerebilir. Tablo 2: Insan Mentese Dizileri lgG Üst Mentese Orta Mentese Alt Mentese lgG42 ERK CCVECPPPCP APPVAGP numaralandirma semalari kullanildiginda (kalinti 244 ila 360, Kabat numaralandirma sistemi; ve kalinti 231-340, EU numaralandirma sistemi, Kabat EA ve digerleri, Sequences of Proteins of lmmunological Interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH. 1991) bir agir zincir molekülünün, örnegin bir antikorun yaklasik kalinti 244"ünden kalinti 360,1na uzanan kismini içerir. CH2 domeni bir baska domenle yakindan eslesmemesi bakimindan özeldir. Daha ziyade, bir intakt dogal lgG molekülünün iki CH2 domeni arasinda iki N baglantili dalli karbonhidrat zinciri bulunur. CH3 domeninin IgG molekülünün CH210 domeninden C terrninaline uzandigi ve yaklasik olarak 108 kalinti içerdigi de oldukça iyi belgelenmistir. antikora veya antikor zincirine göre daha az amino asit kalintisi içeren bir parçasina veya kismina karsilik gelir. "Antijen baglayici fragman'i terimi bir immünoglobulinin veya antikorun antij eni baglayan veya intakt antikorla (yani, elde edilmis oldugu intakt antikorla) antij ene baglanmak (yani, insan CD70'e spesifik baglanma) için rekabet eden bir polipeptit fragmanina karsilik gelir. Burada kullanildigi sekliyle bir antikor molekülünün "fragman"i terimi antikorlarin antij en baglayici fragmanlarini, örnegin bir antikor hafif zincir degisken domenini (VL), bir antikor agir zincir degisken domenini (VH), tek Zincirli bir antikoru (SCFV), bir F(ab')2 fragmanini, bir Fab fragmanini, bir Fd fragmanini, bir FV fragmanini ve tek domenli bir antikor fragmanini (DAb) içerir. Fragmanlar, örnegin intakt veya bütün bir antikorun veya antikor zincirinin kimyasal veya enzimatik isleme tabi tutulinasiyla veya rekombinant yollarla elde edilebilirler. baglanma alanlarinin sayisina karsilik gelir. Her hedef baglanma alani spesifik olarak bir hedef moleküle veya bir hedef inoleküldeki spesifik alana baglanir. Bir polipeptit birden fazla hedef baglanma alani içerdiginde, her hedef baglanma alani spesifik olarak ayni veya farkli molekülleri baglar (örnegin, farkli ligandlara veya farkli antijenlere veya ayni antij ende farkli epit0plara baglanabilir). Söz konusu baglayici moleküller bir insan CD7O molekülüne spesifik en az bir baglanma alanina sahiptir. bununla immünoreaktif olma) kapasitesine karsilik gelir. Bir polipeptit monospesifik olabilir ve spesifik olarak bir hedefi baglayan bir veya daha fazla baglanma alani içerebilir veya bir polipeptit mültispesifik olabilir ve spesifik olarak ayni veya farkli hedefleri baglayan iki veya daha fazla baglanma alani içerebilir. Bir düzenlemede, bulusa ait bir antikor birden fazla hedef için spesifiktir. Örnegin, bir düzenlemede, bulusa ait bir mültispesifik baglayici molekül CD70'e ve bir tümör hücresinde eksprese olan bir ikinci moleküle baglanir. Tümör hücrelerinde eksprese olan antijenlere baglanan antijen baglayici alanlari içeren örnek antikorlar teknikte bilinmektedir ve bu tür antikorlara ait bir veya daha fazla CDR bulusa ait bir antikora dahil edilebilirler. olarak olusmamis bir amino asit dizisini içeren polipeptitleri içerir. Örnegin, dogal olarak olusmamis polipeptitler dogal olusumlu polipeptitlerin modifiye forrnlaridir (örnegin, eklenti, sübstitüsyon veya silinme gibi bir mutasyon içeren) veya amino asitlerden bir dogrusal dizide dogada dogal olarak bagli olmadigi bir ikinci amino asit dizisine (dogal olarak olusmus veya olusmamis olabilecek) baglanmis bir ilk amino asit dizisini (dogal olarak olusmus veya olusmamis olabilecek) içerirler. polipeptit moleküllerinin sentetik yollarla manipülasyonunu (örnegin rekombinant teknikler, in vitro peptit sentezi, peptitlerin enzimatik veya kimyasal yolla kenetlenmesi veya bu tekniklerin bazi kombinasyonlari ile) içerir. Tercihen, bulusa ait antikorlar tasarlanmis, örnegin insanlastirilmis ve/Veya kimerik antikorlar ve bir veya daha fazla özelligin, örnegin antijen baglayicilik, stabilite/yarilanma ömrü veya efektör islevin gelistirilmesi için tasarlanmis olan antikorlardir. dogal olarak olusmamis olacaklari sekilde degistirilmis sentetik formlarini, örnegin en az iki agir zincir kismi içeren ancak iki tam agir zincir içermeyen antikorlari (örnegin, domeni silinmis antikorlar veya mini-antikorlar); antikorlarin iki veya daha fazla farkli antijene veya tek bir antij ende farkli epitoplara baglanacak sekilde degistirilmis mültispesifik formlarini (örnegin, bispesifik, trispesifik, vb.); scFv molekülleriyle birlesen agir zincir moleküllerini ve benzerini içerir. ScFv molekülleri teknikte bilinmekte ve örnegin 5,892,019 sayili ABD patent belgesinde açiklanmaktadirlar. Ilaveten, "modifiye antikor" terimi antikorlarin çok degerlikli formlarini (örnegin, ayni antijenin üç veya daha fazla kopyasina baglanan üç degerlikli, dört degerlikli, Vb. antikorlar) içerir. Bir baska düzenlemede bulusa ait bir modifiye antikor bir füzyon proteini olup, bir CH2 domeni olmayan en az bir agir zincir kismini içerir ve bir reseptör ligand çiftinin bir üyesinin baglanma kismini bulunduran bir polipeptidin bir baglanma alanini içerir. Burada "modifiye antikor" terimi bir CD70 antikorunun amino asit dizisi varyantlarina karsilik olarak da kullanilabilir. Teknikte genel bilgi sahibi bir kisi bir CD70 antikorunun, kendisinden türetilmis oldugu CD70 antikoru ile karsilastirildiginda amino asit dizisi bakimindan çesitlilik gösteren bir varyant CD70 antikorunu üretecek sekilde modifiye edilebilecegini bilecektir. Örnegin, "esansiyel olmayan" amino asit kalintilarinda koruyucu sübstitüsyonlara veya degisikliklere yol açan nükleotit veya amino asit sübstitüsyonlari yapilabilir (örnegin, CDR"de ve/veya çerçeve kalintilarinda). Amino asit sübstitüsyonlari bir10 veya daha fazla amino asidin dogal olusumlu veya dogal olusuinlu olmayan bir amino asitle degistirilmesini içerebilir. sübstitüsyonlar" terimi, bir CD70 antikorunun (örnegin devegillerden elde edilen bir CD70 antikoru) VH veya VL domeninde özel bir konuinda mevcut olan amino asit kalintisinin bir referans insan VH veya VL domeninde esdeger bir konumda olusan bir amino asit kalintisi ile degistirilmis oldugu amino asit sübstitüsyonlarina karsilik gelir. Referans insan VH veya VL domeni insan germ hatti tarafindan kodlanan bir VH veya VL domeni olabilir. Insanlastirici sübstitüsyonlar burada tanimlanan bir CD70 antikorunun çerçeve bölgelerinde ve/veya CDR7lerinde yapilabilir. terimi bir referans CD70 antikoruyla karsilastirildiginda bir veya daha fazla "insanlastirici sübstitüsyon" içeren bir varyant antikora karsilik gelmekte olup, burada referans antikorun bir kismi (örnegin VH domeni ve/veya VL domeni veya bunlarin en az bir CDR içeren parçalari) insan disi bir türden elde edilen bir amino aside sahiptir ve "insanlastirici sübstitüsyonlar" insan disi bir türden elde edilen amino asit dizisinde olusur. terimi spesifik olarak "insanlastirilmis varyantlara" karsilik olarak kullanilmakta olup, burada CD70 antikoru) VH veya VL domeninde özel bir konumda(k0numlarda) mevcut olan bir veya daha fazla amino asit kalintisinin, insan germ hatti tarafindan kodlanan bir referans insan VH veya VL domeninde esdeger bir konumda olusan bir ainino asit kalintisi ile degismesi sonucunu verir. Verili bir "germ hatti islemi yapilmis varyant" için tipik durum germ hatti islemi yapilmis varyanta sübstitüe edilmis ikame amino asit kalintilarinin sadece veya agirlikli olarak tek bir insan germ hattinin kodladigi VH veya VL domeninden alinmasidir. Burada yerine geçecek sekilde kullanilir. Bir veya daha fazla "insanlastirici sübstitüsyon"un devegillerden elde edilen (örnegin lamadan elde edilen) bir VH veya VL domenine yerlestirilmesi devegillerden (lama) elde edilen VH veya VL domeninin "insanlastirilmis varyanti"nin üretilmesi sonucunu verir. Eger sübstitüe edilen amino asit kalintilari agirlikli olarak veya sadece tek bir insan germ hattinin kodladigi VH veya VL domeni dizisinden elde edilirse, bu durumda sonuç devegillerden (lama) elde edilen VH veya VL domeninin "insan germ hatti islemi yapilmis varyanti" olabilir.10 CD70 antikoru ile karsilastirildiginda amino asit dizisinde bir veya daha fazla degisiklik sergileyen bir varyant antikora karsilik gelmekte olup, burada afmite varyanti referans antikorla karsilastirildiginda insan CD70 proteini için degismis bir afinite sergiler. Tipik olarak, afinite varyantlari referans CD70 antikoru ile karsilastirildiginda insan CD70 için degismis bir afinite sergiler. Tercihen afinite varyanti referans CD70 antikoru ile karsilastirildiginda insan CD70 için gelismis afinite sergiler. Gelisme insan CD70 için daha düsük bir KD veya insan CD70 için daha yavas bir ayrisma hizi veya insan olmayan CD70 homologlariyla çapraz reaktiflik modelinde bir farklilasma olmasiyla bariz olabilir. Afinite varyantlari referans CD70 antikoru ile karsilastirildiginda tipik olarak CDR7lerdeki amino asit dizisinde bir veya daha fazla degisiklik sergiler. Bu sübstitüsyonlar CDR°lerde belli bir konumda bulunan orijinal amino asidin, dogal olusumlu bir amino asit kalintisi veya dogal olusumlu olmayan bir amino asit kalintisi olabilecek farkli bir amino asit kalintisiyla degismesine yol açabilir. Amino asit sübstitüsyonlari koruyucu olabilir veya koruyucu olmayabilir. degisken domeni (VL) içeren bir antikor, eger VH domenleri ve VL domenleri birlikte ele alindiklarinda en yakin eslesen insan germ hatti VH ve VL dizileriyle en az %90 amino asit dizisi özdesligi sergiliyorsa yüksek insan homolojine sahip kabul edilir. Yüksek insan homolojisine sahip antikorlar, insan germ hatti dizileriyle yeterince yüksek dizi özdesligi %"si sergileyen dogal insan olmayan antikorlarin VH ve VL domenlerini içeren antikorlari içerebilir, örnegin konvansiyonel devegil antikorlarinin VH ve VL doinenlerini içeren antikorlari ve ayni zamanda bu tür antikorlarin tasarlanmis, özellikle insanlastirilmis veya germ hatti islemi yapilmis varyantlarini ve ayrica "tamamen insan" antikorlari içerir. Bir düzenlemede antikorun yüksek insan homolojisi olan VH domeni F R1, F R2, F R3 ve F R4 çerçeve bölgelerinde bir veya daha fazla insan VH domeniyle %80 veya daha fazla bir amino asit dizisi özdesligi veya dizi homolojisi sergileyebilir. Baska düzenlemelerde bulusa ait polipeptidin VH domeni ve en yakin eslesen insan germ hatti VH domeni dizisi arasindaki amino asit dizisi özdesligi veya dizi homolojisi %85 veya daha büyük, %90 veya daha büyük, Bir düzenlemede antikorun yüksek insan homolojisi olan VH domeni, en yakin eslesmis insan VH dizisi ile karsilastirildiginda çerçeve bölgesi FRl, FR2, FR3 ve FR4 boyunca bir veya daha fazla (örnegin 1 ila 10) amino asit dizisi yanlis eslesmesi içerebilir.10 Bir baska düzenlemede antikorun yüksek insan homolojisi olan VL domeni çerçeve bölgesi FRl, FR2, FR3 ve FR4 boyunca bir veya daha fazla insan VL domeniyle %80 veya daha büyük bir dizi özdesligi veya dizi homolojisi sergileyebilir. Baska düzenlemelerde bulusa ait polipeptidin VL domeni ve en yakin eslesen insan germ hatti VL domeni dizisi arasindaki amino asit dizisi özdesligi veya dizi homolojisi %85 veya daha büyük, %90 veya daha büyük, Bir düzenlemede antikorun yüksek insan homolojisi olan VL domeni, en yakin eslesmis insan VL dizisi ile karsilastirildiginda çerçeve bölgesi FRl, F R2, FR3 ve FR4 boyunca bir veya daha fazla (örnegin 1 ila 10) amino asit dizisi yanlis eslesmesi içerebilir. Yüksek insan homolojisi olan antikor ve insan germ hatti VH ve VL arasindaki dizi özdesligi yüzdesinin analiz edilmesinden önce kanonik katlanmalar belirlenebilir ve bu sekilde H] ve H2 veya L] ve L2 (ve L3) için özdes kanonik katlanma kombinasyonu olan insan germ hatti kesitleri ailesinin tanimlanmasi saglanir. Bunu takiben ilgili antikorun degisken bölgesi ile en yüksek derecede dizi homolojisine sahip insan germ hatti ailesi üyesi dizi homolojisinin derecelendirilmesi için seçilir. L1, L2, L3, Hl ve H2 asiri degisken ilmiklerinin Chothia kanonik siniflarinin belirlenmesi www.bi0inf.0rg.uk/abs/chothia.html.page internet sayfasinda kamuya açik biyoenformatik araçlarla gerçeklestirilebilir. Programin çiktisi bir veri dosyasinda kilit kalinti gerekliliklerini gösterir. Bu veri dosyalarinda, kilit kalinti konumlari her konumda izin verilen amino asitlerle birlikte gösterilir. Ilgili antikorun degisken bölge dizisi girdi olarak verilir ve önce bir konsensüs antikor dizisi ile hizalanarak Kabat numaralandirma semasi tayin edilir. Kanonik katlanmalar analizinde Martin ve Thomton usulle elde edilen bir grup kilit kalinti sablonu kullanilir. H] ve H2 veya L1 ve L2 (ve L3) için ayni kanonik katlanma kombinasyonunu kullanan bilinen özel insan germ hatti V kesitiyle dizi homolojisi baglaminda en iyi eslesen aile üyesi belirlenebilir. Ilgili antikorun VH ve VL domeni çerçeve amino asit dizileri ve insan germ hatti tarafindan kodlanan karsilik gelen diziler arasindaki dizi özdesligi yüzdesi biyoenforrnatik araçlarla hesaplanabilir ama aslinda dizilerin elle hizalanmasina da basvurulabilir. Insan immünoglobulin dizileri, örnegin VBase (httpz//vbasemrc- cpe.cam.ac.uk/) veya Pluckthun/Honegger veri tabani (http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines gibi çesitli protein veri tabanlarindan tanimlanabilir. Insan dizilerinin bir ilgili antikorun VH veya VL domenlerinin V bölgeleri ile karsilastirilmasi için bir dizi hizalama algoritmasi, örnegin10 WWW.expasy.ch/t001s/#align gibi internet sayfalarinda sunulanlar kullanilabilir ayrica sinirli dizi grubuyla elle hizalama da gerçeklestirilebilir. Her zincirin çerçeve bölgesi l, 2 ve 3 ile ayni kanonik katlanma kombinasyonlarina ve en yüksek homoloji derecesine sahip ailelere ait insan germ hatti hafif ve agir zincir dizileri seçilir ve ilgili degisken bölge ile karsilastirilir; ayrica FR4 de insan germ hatti JH ve JK veya J L bölgeleriyle karsilastirilir. Toplam dizi homolojisi yüzdesi hesaplamasinda FRl, FR2 ve FR3 kalintilarinin insan germ hatti ailesinden özdes kanonik katlanmalar kombinasyonu olan en yakin eslesen dizinin kullanilmasiyla incelendigi bilinmelidir. Sadece en yakin eslesmeden farkli kalintilar veya ayni ailenin ayni kanonik katlanmalar kombinasyonu olan diger üyeleri puanlanir (Not - primerin kodladigi farkliliklar hariç). Bununla birlikte, insanlastirma amaciyla, ayni kanonik katlanmalar kombinasyonuna sahip olmayan diger insan germ hatti ailelerinin üyeleri ile özdes olan çerçeve bölgeleri kalintilari, yukarida açiklanan zorunlu kosullara göre "negatif" puanlanmalarina ragmen "insan" kabul edilebilmektedir. Bu varsayim insanlastirmaya iliskin biri ayri olarak en yakin eslesen insan germ hatti dizisiyle karsilastirilir ve dolayisiyla insanlastirilmis molekül farkli FR"lerin bir kombinasyonunu içerir. Chothia numaralandirma semasinin bir uyarlamasi olan IMGT numaralandirma semasini kullanarak ayri ayri her çerçeve bölgesinin sinirlari belirlenebilir (Lefranc ve digerleri, NAR 27: 209-212 (1999); imgt.cines.fr). Yüksek insan homolojisi olan antikorlar asagida daha ayrintili açiklandigi gibi insan veya insan benzeri kanonik katlanmalara sahip asiri degisken ilmikleri veya CDR,leri içerebilir. Bir düzenlemede yüksek insan homolojisi olan antikorun gerek VH domeninde, gerek VL domeninde bulunan en az bir asiri degisken ilmik veya CDR insan olmayan bir antikora, örnegin devegiller türünden bir konvansiyonel antikora ait bir VH veya VL domeninden elde edilebilir veya türetilebilir, yine de insan antikorlarinda olusan bir kanonik katlanma yapisi ile büyük ölçüde özdes bir tahmini veya gerçek kanonik katlanma yapisi sergiler. Insan germ hatti tarafindan kodlanan VH domenlerinin ve VL domenlerinin her ikisinde de bulunan asiri degisken ilmiklerin primer amino asit dizileri tanim geregi oldukça degisken olsalar da, VH domenine ait CDR H3 hariç tüm asiri degisken ilmiklerin sadece kanonik katlanmalar denilen birkaç ayri yapisal konformasyonu aldigi teknikte gayet iyi bilinmekte asit kalintilari denilen kalintilarin mevcudiyetine dayanmaktadir (Chothia ve digerleri, J. Mol. kanonik yapilari yapisal analizle (örnegin X isini kristalografisi) belirlenebilir ancak kanonik yapinin belli bir yapinin özelligi olan kilit amino asit kalintilarina dayanarak öngörülmesi de mümkündür (asagida daha ayrintili açiklanmaktadir). Esas olarak, kalintilarin her kanonik yapiyi belirleyen spesifik modeli bir "imza" olusturur, bu sekilde bir VH veya VL domeninin bilinmeyen bir yapidaki asiri degisken ilmiklerinde kanonik yapinin tanininasi saglanir; dolayisiyla kanonik yapilar sadece primer amino asit dizisine dayanarak öngörülebilir. Yüksek insan homolojisi olan bir antikorun verili herhangi bir VH veya VL dizisinin asiri degisken ilmiklerine iliskin öngörülen kanonik katlanma yapilari WWW.bi0inf.0rg.uk/abs/ch0thia.html, WWW.biochem.ucl.ac.uk/~martin/antib0dies.html ve WWW.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html internet sayfalarinda kamuya açik algoritmalari kullanarak analiz edilebilir. Bu araçlar sorgulanan VH veya VL dizilerinin bilinen kanonik yapili insan VH veya VL domeni dizilerine göre hizalanmasini mümkün kilar ve sorgulanan dizinin asiri degisken ilmikleri için bir kanonik yapi öngörüsü yapilir. VH domeni söz konusu oldugunda, eger asagidaki kriterlerden en azindan ilki ve tercihen her ikisi karsilanirsa H] ve H2 ilmikleri insan antikorlarinda olustugu bilinen kanonik katlanma yapisi ile "büyük ölçüde Özdes" bir kanonik katlanma yapisina sahip olarak puanlanabilir: 1. En yakin eslesen insan kanonik yapisal sinifina, kalintilarin sayisi ile belirlenen özdes bir uzunlugun olmasi. 2. Karsilik gelen insan Hl ve H2 kanonik yapisal siniflari için açiklanan kilit amino asit kalintilari ile en az %33 özdesligin, tercihen en az %50 özdesligin olmasi. (yukaridaki analizin amaçlari bakimindan Hl ve HZ ilmikleri ayri ayri isleme tabi tutulur ve her biri en yakin eslesen insan kanonik yapisal sinifiyla karsilastirilir) Yukarida geçen analiz ilgili antikorun Hl ve HZ ilmiklerinin kanonik yapisinin öngörülmesine dayanir. Ilgili antikordaki Hl ve H2 ilmiklerinin gerçek yapilarinin, örnegin X isini kristallografisine dayanarak bilinmesi söz konusu ise ve eger ilmik uzunlugu en yakin eslesen insan kanonik yapisal sinifininkinden farklilik gösteriyor (tipik olarak ±l veya ±2 amino asit) ancak ilgili antikordaki Hl ve HZ ilmiklerinin gerçek yapisi bir insan kanonik katlanma yapisi ile eslesiyorsa, bu durumda ilgili antikordaki H] ve H2 ilmikleri de insan10 antikorlarinda olustugu bilinen bir kanonik katlanma yapisi ile "büyük ölçüde özdes" bir kanonik katlanma yapisina sahip olarak puanlanabilir. Insan VH domenlerinin birinci ve ikinci asiri degisken ilmiklerine (HI ve H2) iliskin insan kanonik yapisal siniflarinda bulunan kilit amino asit kalintilari Chothia ve digerleri, J. Mol. dahil edilmis Chothia ve digerlerine ait referansin sayfa 802lsindeki Tablo 3°te insan germ hattinda bulunan Hl kanonik yapilarina iliskin kilit alanlardaki tercih edilen amino asit kalintilari siralanmakta, yine isbu metine özel olarak dahil edilmis sayfa 803°teki Tablo 4,te ise insan germ hattinda bulunan CDR H2 kanonik yapilarina iliskin kilit alanlardaki tercih edilen amino asit kalintilari siralanmaktadir. Bir düzenlemede, yüksek insan homolojisi olan antikorun VH domenindeki Hl ve H2"nin her ikisi de insan antikorlarinda olusan bir kanonik katlanma yapisiyla büyük ölçüde özdes bir öngörülen veya gerçek kanonik katlanma yapisi sergiler. Yüksek insan homolojisi olan antikorlar, asiri degisken H] ve HZ ilmiklerinin en az bir insan germ hatti VH domeninde olustugu bilinen bir kanonik yapilar kombinasyonuna özdes bir kanonik katlanma yapilari kombinasyonu olusturdugu bir VH domenini içerir. Insan germ hatti tarafindan kodlanan VH domenlerinde aslinda H] ve H2"deki kanonik katlanma yapilarinin sadece bazi kombinasyonlarinin olustugu gözlemlenmistir. Bir düzenlemede yüksek insan homolojisi olan antikorun VH domenindeki Hl ve H2 insan disi bir türe, örnegin devegillerden bir türe ait bir VH domeninden elde edilebilir ama yine de bir insan germ hattinda veya somatik inutasyona tabi tutulmus VH domeninde olustugu bilinen bir kanonik katlanma yapilari kombinasyonu ile özdes bir öngörülen veya gerçek kanonik katlanma yapilari kombinasyonunu olusturur. Sinirlayici olmayan düzenlemelerde yüksek insan homolojisi olan antikorun VH domenindeki H] ve H2 insan disi bir türe, örnegin ve 3-5 kanonik katlanma kombinasyonlarindan birini olusturur. Yüksek insan hoinolojisi olan bir antikor insan VH ile yüksek dizi özdesligi/dizi homolojisi sergileyen ve insan VH ile yapisal homoloji sergileyen asiri degisken ilmikler içeren bir VH domeni içerebilir. Yüksek insan homolojisi olan bir antikorun VI-I domenindeki Hl ve H2,de mevcut olan katlanmalarin ve bunlarin kombinasyonunun, yüksek insan homolojisi olan antikorun VH domeni ile en yakin eslesmeyi temsil eden insan VH germ hatti dizisi için toplam primer amino asit dizisi özdesligi bakimindan "dogru" olmasi avantajli olabilir. Örnegin, eger en yakin dizi eslesmesi bir insan germ hatti VH3 domeni ile ise, bu durumda H] ve H2"nin dogal olarak bir insan VH3 domeninde de olusan bir kanonik katlanmalar kombinasyonu olusturmalari avantajli olabilir. Bu durum insan disi türlerden elde edilmis yüksek insan homolojisi olan antikorlar, örnegin devegillere ait konvansiyonel antikorlardan elde edilmis VH ve VL domenlerini içeren antikorlar, bilhassa insanlastirilmis devegil VH ve VL domenlerini içeren antikorlar söz konusu oldugunda özellikle Önemli olabilir. Dolayisiyla, bir düzenlemede yüksek insan homolojisi olan CD70 antikorunun VH domeni FRl, FR2, FR3 ve FR4 çerçeve bölgelerinde bir insan VH domeniyle %80 veya daha fazla, dek veya hatta %100 bir dizi özdesligi veya dizi homoloji sergileyebilir ve ilaveten ayni antikordaki H] ve H2 insan olmayan bir VH domeninden elde edilir (örnegin bir devegil türünden elde edilir) ama dogal olarak ayni insan VH domeninde olustugu bilinen bir kanonik katlanma kombinasyonu ile ayni olan bir öngörülen veya gerçek kanonik katlanma yapilari kombinasyonunu olusturur. Baska düzenlemelerde, yüksek insan homolojisi olan antikorun V1 domenindeki L1 ve L2"nin her biri insan disi bir türe ait bir VL domeninden (örnegin devegillerden elde edilen bir VL domeni) elde edilir ve her biri insan antikorlarinda olusan bir kanonik katlanma yapisiyla büyük ölçüde özdes olan bir öngörülen veya gerçek kanonik katlanma yapisi sergiler. Tipki VH domenleriyle oldugu gibi, hem Vlambda, hem VKappa tiplerindeki VL domenlerinin asiri degisken ilmikleri sinirli bir sayida konformasyon veya kanonik yapi alabilmekte olup, bu kismen uzunlukla ve ayrica bazi kanonik konumlarda kilit amino asit kalintilarinin mevcudiyeti ile belirlenir. Yüksek insan homolojisi olan bir ilgili antikorda, insan disi bir türe ait, örnegin bir Devegiller (Camelidae) türüne ait VL domeninden elde edilen L1, L2 ve L3 ilmikleri eger asagidaki kriterlerden en azindan ilki ve tercihen her ikisi karsilanirsa insan antikorlarinda olustugu bilinen bir kanonik katlanma yapisi ile "büyük ölçüde Özdes" bir kanonik katlanma yapisina sahip olarak puanlanabilir: 1. En yakin eslesen insan yapisal sinifina, kalintilarin sayisi ile belirlenen özdes bir uzunlugun olmasi. 2. Gerek Vlambda, gerek VKappa repertuvarindan karsilik gelen insan L1 ve L2 kanonik yapisal siniflari için açiklanan kilit amino asit kalintilari ile en az %3310 özdesligin, tercihen en az %50 özdesligin olmasi. (yukaridaki analizin amaçlari bakimindan L1 ve L2 ilmikleri ayri ayri isleme tabi tutulur ve her biri en yakin eslesen insan kanonik yapisal sinifiyla karsilastirilir) Yukarida geçen analiz ilgili antikorun VL domenindeki L1, L2 ve L3 ilmiklerinin kanonik yapisinin öngörülmesine dayanir. L1, L2 ve L3 ilmiklerinin gerçek yapisinin, örnegin X isini kristallografisine dayanarak bilinmesi söz konusu ise ve eger ilmik uzunlugu en yakin eslesen insan kanonik yapisal sinifininkinden farklilik gösteriyor (tipik olarak ±l veya ±2 amino asit) ancak Devegillere (Cameli'dae) ait ilmiklerin gerçek yapisi bir insan kanonik katlanmasi ile eslesiyorsa, bu durumda ilgili antikordan elde edilen L1, L2 ve L3 ilmikleri de insan antikorlarinda olustugu bilinen bir kanonik katlanma yapisi ile "büyük ölçüde özdes" bir kanonik katlanma yapisina sahip olarak puanlanabilir. Insan VLambda ve VKappa domenlerinin CDR"lerine iliskin insan kanonik yapisal siniflarinda bulunan kilit amino asit kalintilari Morea ve digerleri, Methods, 20: 267-279 açiklanmaktadir. Ayrica insan VKappa domeninin yapisal repertuvari Tomlinson ve digerleri, olan bir antikorun VL domenindeki L1 ve L2, bir insan germ hatti VL domeninde olustugu bilinen bir kanonik katlanma yapilari kombinasyonuna özdes bir öngörülen veya gerçek kanonik katlanma yapilari kombinasyonu olusturabilir. Sinirlayici olmayan düzenlemelerde yüksek insan homolojisi olan bir antikorun (örnegin devegillerden elde edilen bir VL domeni veya bunun insanlastirilmis bir varyantini içeren bir antikorun) VLambda doinenindeki L1 ve kombinasyonlarindan birini olusturabilir (Williams ve digerleri, J. Mol. Biol. 2642220 -32 (1996) referansinda açiklanan sekilde ve http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/V Base_hVL.htm1 internet sayfasinda gösterilen sekilde). Sinirlayici olmayan düzenlemelerde Vkappa domenindeki L1 ve L2 2-1, 3-1, 4-1 ve 6-1 kanonik katlanma kombinasyonlarindan birini olusturabilir (Tomlinson ve httpz//Www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Geimlines/VBase_h VKhtml internet sayfasinda gösterilen sekilde). Bir baska düzenlemede, yüksek insan homolojisi olan bir antikorun VL domenindeki L1, L2 ve L3'ün tamami önemli ölçüde insan yapisi sergileyebilir. Yüksek insan homolojisi olan antikorun VL domeninin insan VL ile yüksek dizi özdesligi/dizi homolojisi sergilemesi ve ayrica VL domenindeki asiri degisken ilmiklerin insan VL ile yapisal homoloji sergilemesi tercih edilir. Bir düzenlemede, yüksek insan homolojisi olan bir CD70 antikorunun VL domeni F R1, F R2 , FR3 ve FR4 çerçeve bölgelerinde bir insan VL domeniyle %80 veya daha fazla, %85 veya daha fazla, %90 veya daha fazla, %95 veya daha fazla, %97 veya daha fazla %99"a dek veya hatta %100 bir dizi özdesligi sergileyebilir ve ilaveten asiri degisken ilmik L1 ve asiri degisken ilmik L2 dogal olarak ayni insan VL domeninde olustugu bilinen bir kanonik katlanma kombinasyonuyla ayni olan bir öngörülen veya gerçek kanonik katlanma yapilari kombinasyonu olusturabilir. Hiç süphesiz, insan VH ile yüksek dizi özdesligi/dizi homolojisi ve ayrica insan VH asiri degisken ilmikleriyle yapisal homoloji sergileyen VH domenlerinin, insan VL ile yüksek dizi özdesligi/dizi homolojisi ve ayrica insan VL"nin asiri degisken ilmikleriyle yapisal homoloji sergileyen VL domenleriyle birlestirilmesi, bu sekilde insan tarafindan kodlanan VH/VL çiftleriyle maksium dizi homolojisi ve yapisal homoloji gösteren VH/VL çiftlerini (örnegin devegillerden elde edilen VH/Vl çiftleri) içeren yüksek insan homoloj isi olan antikorlarin saglanmasi öngörülmüstür. Yukarida özetlendigi gibi, bulus en azindan kismen insan CD707e yüksek afiniteyle baglanan antikorlara ve bunlarin antijen baglayici fragmanlarina iliskindir. Bulusa uygun CD70 antikorlarinin ve antikor fragmanlarinin özellikleri ve nitelikleri simdi daha ayrintili açiklanacaktir. CD70 Baglanmasi ve Afinite Bazi yönleri itibariyla, burada saglanan antikorlar ve bunlarin antijen baglayici fragmanlari insan CD703e yüksek afiniteyle baglanir. Insan CD70"e yüksek afiniteyle baglanan antikorlar veya bunlarin antij en baglayici fragmanlari insan CD70 için ve daha özellikle insan CD70°in hücre disi domeni için yaklasik IOnM veya daha az veya lnM veya daha az veya 0.1nM veya daha az veya 10pM veya daha az bir baglanma afinitesi (KD) sergileyebilir. CD70 antikoru (veya antij en baglayici fragman) VH ve VL domenlerinin bir Fab formunda eksprese olmasi durumunda, insan CD70 baglanmasina iliskin 7 x 10'4s`l,den daha az, ayrisma hizi sergileyen VH ve VL doinenleri içerebilir. Tipik olarak ayrisina hizi 0.4 X 10`4s`10 1 ila 4.8 x 1045'1 araliginda olacaktir. Baglanma atinitesi (KD) ve ayrisma hizi (Koff) teknikte uzman kisilerce gayet iyi bilinen standart teknikleri, örnegin ilisikteki örneklerde açiklanan yüzey plazmon rezonansini (BIAcore) kullanarak ölçülebilir. Kisaca, test edilecek 50 pl numune + 195 u] HBS-EP+ seklinde seyreltilir. Biacore analizi oda sicakliginda yüksek ölçüde CD70 kapli CMS çipi ( ile imalatçi firrnanin sagladigi protokolü kullanarak gerçeklestirilir. Bu hususta, ayrisma hizinin Fab'ler formunda VH ve VL kombinasyonlari için ölçülmesine ragmen, bunun VH ve VL domenlerinin CD70 baglanmasina esit sekilde katildigi anlamina gelmedigi belirtilmelidir. Birçok VH/VL kombinasyonunda CD70 baglanmasina esas katkiyi yapan VH domenidir, VL domeni ise VH/VL eslesmesinin çözünürlügüne ve/veya Burada açiklanan CD70 antikorlarinin veya bunlarin Fab fragmanlarinin rekombinant insan CD70"e baglanmasi ELlSA ile de incelenebilir. Burada açiklanan CD70 antikorlari ayrica intakt hücrelerin, örnegin 786-0 renal karsinom hücrelerinin ve diger kanser hücresi hatlarinin yüzeyinde eksprese olan CD70°e baglanma sergileyebilir. CD70 antikorlarinin CD70 eksprese eden hücrelere baglanmasi akis sitometresi ile incelenebilir. Ilisikteki örneklerde sunulan sonuçlarda, varyant 41D12 (fukozillenmemis yüzeyindeki CD70"e çok kuvvetli baglanma sergiledikleri gösterilmektedir. Gerçekten, birçok hücre hattinda ARGX-l 10 önceki teknige ait karsilastirma antikoru SGN70"e göre daha kuvvetli baglanma sergiler. ARGX-l lO'un CD70? düsük kopya sayisinda eksprese eden hücre hatlarina, örnegin digerleri arasinda Raji, SU-DHL-6, MHHPREBI, Mino, Mec 1, J VM-2, HH ve EBC-l hücre hatlarina ve ayrica hastalardan (örnegin CLL hastalari) izole edilmis kanser hücrelerine kuvvetli baglanma sergilemesi özellikle dikkate deger olup, her iki durumda da ARGX-l 10 baglanmasi SGN70`e göre bariz ölçüde daha kuvvetlidir. Düsük kopya sayili hücre hatlarina ve CLL hastasi materyallerine "gelismis" baglanma genis ölçüde rekombinant CD70 için ARGX-l 107ün olaganüstü yüksek atinitesini yansitabilir. Bu baglanma özellikleri ARGX-l 10 (41D12,ye dayanir) ve benzer özelliklere sahip burada açiklanan diger CD70 antikorlarinin, bilhassa sitotoksik veya sitostatik bir parçaya baglanmis bir immünokonjugat seklinde degil de, güçlü efektör islev sergileyen bir IgG (örnegin fukozillenmemis IgGl) seklinde kullanilmalari durulunda kanser tedavisinde özel bir kullanimlarinin oldugunu destekleyici yapidadir. Rekombinant CD70'e ve hücre yüzeyindeki CD70°e yüksek afiniteyle baglanmanin (yani önceki teknige ait CD70 antikorlariyla elde edilebilenden daha yüksek afiniteyle) antikorlarin klinikte kullanilabilirlikleri bakimindan anlami ilisikteki Örneklerde deneylerle gösterilmekte olup, burada PBMC numunelerine kanser hücresi hatlari ile yapilan tedavi, karsilastirma amaçli MDXl4ll ve SGN70 CD70 antikorlarina göre hedef kanser hücrelerinde anlamli ölçüde daha fazla liziz ortaya çikardi . Burada açiklanan CD70 antikorlari insan CD70,e ve daha özel olarak belirtmek gerekirse insan CD70'in hücre disi domenine yüksek afiniteyle baglanma sergilerler ancak insan olmayan CD70 homologlariyla çapraz reaktiflik bunun disinda degildir. Aslinda, 27B3 ve bunun gerrn hatti islemi yapilmis varyantlari, bilhassa 4lD12 dahil olmak üzere burada açiklanan birçok CD70 antikorunun avantajli bir özelligi, insan CD70,e yüksek afiniteyle baglanmaya ilaveten ayrica maymun CD70 homologlariyla, özel olarak belirtmek gerekirse al yanakli makak ve sinomolgus maymunu CD70 homloglariyla çapraz reaksiyona girmeleridir. Bu bakimdan, örnegin ilisikteki örnek 20.2,deki gibi bir CD70-CD27 inhibisyonu ELISA7sinda, maymun (al yanakli maymun veya sinomolgus maymunu) CD70,e göre insan CD70`e iliskin IC50 farki 5 kattan daha az, tercihen 3 kattan daha az veya 2 kattan daha az olur ise bir CD70 antikorunun bir maymun CD70 homologu, örnegin al yanakli makak ve sinomolgus maymunu CD70 homloglariyla çapraz reaktiflik sergiledigi kabul edilebilir. Insan ve mayinun CD70"e iliskin baglanma afinitesi ve dolayisiyla bloke etme gücü genis ölçüde karsilastirilabilir olmalidir. CD70 ve CD27 Arasindaki Etkilesim Bazi yönleri itibariyla, burada saglanan CD70 antikorlari veya bunlarin antijen baglayici fragmanlari insan CD70"e yüksek afiniteyle baglanabilmekte ve CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi bloke edebilmektedirler. CD70 antikorlarinin veya bunlarin antijen baglayici fragmanlarinin CD7O7in CD27,ye baglaninasini bloke etme becerisi gerek yakalanmis rekombinant CD70 (Flag-TNC-CD70), gerek dogrudan kapli CD70 ve rekombinant CD27-FC kullanarak ELISA ile degerlendirilebilir. Burada açiklanan CD70 antikorlari CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi ng/ml veya daha az veya 50 ng/ml veya daha az bir IC50 ile inhibe edebilir. CD70 antikorlarinin veya bunlarin antijen baglayici fragmanlarinin CD70,in CD27"ye baglanmasini bloke etme becerisi, ilisikteki örneklerde açiklanan sekilde Raji hücrelerinin (insan B hücreli lenfoma) ve HT1080-CD27 hücrelerinin (CD27 ile transfekte edilmis insan epitelyal hücre hatti) birlikte kültür edilmesine dayanan bir analiz de de degerlendirilebilir. CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi inhibe eden açiklanan CD70 antikorlari bu ortak kültür analizinde 500 ng/ml veya daha az veya 300 ng/ml veya daha az veya 100 ng/ml veya daha az veya 50 ng/ml veya daha az veya 30 ng/ml veya daha az bir IC50 sergileyebilir. dayanan tercih edilen CD70 antikorlari ELISA sisteminde CD70/CD27 etkilesimininde güçlü blokaj sergiledi. Aslinda, ARGX-l 10 CD70/CD27 etkilesimlerini bloke etmekte SGN70 ve MDX141 1 karsilastirma antikorlarina göre anlamli ölçüde daha güçlüdür. CD70 ve CD27 arasindaki etkilesim tümör mikro ortaminda tümör hücresi sagkalimi, proliferasyon ve/veya immün baskilama ile iliskili olabilir. Dolayisiyla, CD70'e yüksek afiniteyle baglanmaya ilaveten CD70/CD27 etkilesiminin güçlü inhibisyonu CD70 eksprese eden bazi kanserlerin veya immünolojik bozukluklarin, örnegin CD70 ve CD27"yi birlikte eksprese eden otoimmün hastaliklarin ve kanserlerin tedavisinde klinik sonlanimin iyilesmesine katki saglayabilir . Baska düzenlemelerde, CD70 antikorlari veya bunlarin antijen baglayici fragmanlari insan CD70`e baglanabilir ama CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi inhibe etmeyebilirler. CD70°e baglanan ama CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi inhibe etmeyen CD70 antikorlari gerek yakalanmis rekombinant CD70 (Flag-TNC-CD70), gerek dogrudan kapli CD70 ve rekombinant CD27-FC kullanarak ELISA ile degerlendirilebilir. Ilisikteki örneklerde gösterildigi gibi CD70'i baglayan ancak CD70/CD27 etkilesimini anlamli bir boyutta inhibe etmeyen birkaç Fab tanimlanmistir. Özellikle, burada 59Dl 0 olarak tanimlanan Fab klonu Biacore ile ölçüldügünde rekombinant CD70"e kuvvetli baglanma sergiler ancak ELISA ile degerlendirildiginde CD70/CD27 etkilesimini anlamli bir boyutta bloke etmez. CD70*e baglanan ancak CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi inhibe etmeyen burada açiklanan CD70 antikorlari yine de intakt antikor efektör islevlerine, yani ADCC, CDC, ADCP veya ADC`den birine veya daha fazlasina sahip olabilir ve in vivo tümör hücresi büyümesini inhibe edebilirler. CD70'i yüksek afinite ile baglayan ancak bloke edici olmayan CD70 antikorlari hücre ile siki bir tek degerli etkilesim saglayan herhangi bir baska antikor formatinda avantajli olarak kullanilabilirler. CD70 Epitoplari10 Bazi yönleri itibariyla, burada açiklanan CD70 antikorlari insan CD70"in hücre disi domenindeki epitoplara baglanir. kismina(kisimlar1na) karsilik gelir. Epitoplar dogrusal, yani tek bir amino asit dizisine baglanmayi içerir sekilde veya konformasyonal, yani antij enin çesitli bölgelerinde bitisik olmalari sart olmayan iki veya daha fazla amino asit dizisine baglanmayi içerir sekilde olabilirler. Burada açiklanan CD70 antikorlari insan CD70 proteininin hücre disi domeni içinde farkli (örtüsen veya örtüsmeyen) epitoplara baglanabilirler. Örnegin, ilisikteki örneklerde 1C2 ve 9E1 olarak isimlendirilen Fab71er insan CD70,te açik sekilde farkli, örtüsmeyen epitoplara baglanmaktadir. Burada baska bir yerde belirtildigi gibi, tercih edilen CD70 antikoru Önceki teknige ait bilinen hiçbir CD70 antikorunun sergilemedigi özellikle kullanisli bir baglanma özellikleri kombinasyonu sergilemekte olup, bunlar asagida siralanmaktadir: (a) amino asit dizisi HIQVTLAICSS (DIZI ID. NO:342) içinde insan CD70°e baglanma; (b) al yanakli makak (Macaca mulatta) ve sinomolgus maymunu (Macaca cynomolgus) CD70 homologlariyla çapraz reaktiflik; (c) dogal insan CD70"e ve isiyla denatüre edilmis rekombinant insan CD70,e baglanma. Verili herhangi bir CD70 antikoru için amino asit dizisi HIQVTLAICSS (DIZI ID. No:342) içinde insan CD70*i baglama kapasitesi, örnegin ilisikteki örnek 20.4"te açiklanan fare-insan kimerik CD70 baglanma analizini kullanarak teknikte genel bilgi sahibi bir kisi tarafindan kolaylikla belirlenebilir. Maymun CD70 homologlariyla çapraz reaktiflik de, örnegin FACS analizi, yüzey plazmon rezonansi ile (BiacoreTM) veya CD70-CD27 inhibisyonu için bir ELISA kullanarak teknikte genel bilgi sahibi bir kisi tarafindan kolaylikla belirlenebilir. Bu bakimdan, örnegin ilisikteki örnek 20.2,de açiklanan sekilde bir CD70-CD27 inhibisyonu ELISA°sinda, maymun (al yanakli maymun veya sinomolgus maymunu) CD707e göre insan CD707e iliskin ICSO farki 5 kattan daha az, tercihen 3 kattan daha az veya 2 kattan daha az olur ise bir CD70 antikorunun bir maymun CD70 homologu, örnegin al yanakli makak ve sinomolgus maymunu CD70 homloglariyla çapraz reaktiflik sergiledigi kabul edilebilir. Burada açiklanan CD70 antikorlari hem dogal insan CD70,e, hem isiyla denatüre edilmis rekombinant insan CD70"e baglanma kapasitesi de gösterebilir. Bu baglamda, "dogal" insan CD70`e baglanma CD70 eksprese eden bir hücrenin, örnegin ilisikteki örneklerde açiklanan CD70+ hücre hatlarindan herhangi birinin veya hatta hasta inateryalinden izole edilmis dogal CD70 eksprese eden hücrelerin (örnegin ilisikteki örneklerde oldugu gibi CLL hastalarindan izole edilmis hücrelerin), etkinlesmis T hücrelerinin ve benzerinin yüzeyinde eksprese olan CD707e baglanmayla gösterilir. Sonuç olarak "dogal" insan CD70'e baglanma teknikte genel bilgi sahibi bir kisi tarafindan kolaylikla test edilebilecektir. sekilde test edilebilir. Isiyla denatüre edilmis rekombinant insan CD70'e anlamli baglanmasoldugunu göstermek için bu analizde CD70 antikorunun 620 nm,de 0.6 veya daha büyük bir OD göstermesi tercih edilir. Kismi veva Yavas Internalizasvon Tercih edilen CD70 antikoru 4lDl2 (ARGX-l 10) dahil burada açiklanan CD70 antikorlari renal karsinom hücre hatlarinda kismi intemalizasyon sergilemekte olup, bunun anlami 786-0 renal karsinom hücrelerinde antikor intemalizasyonu test edildiginde baglanmis olan sonrasinda bile disarda kalmasidir. Ilaveten, CD70 antikorlari yavas bir intemalizasyon hizi da sergileyebilir. Bu bakimdan, eger bir referans CD70 antikoru 9D19den (VH DIZI ID. NO: 178; VL DIZI ID. NO: 190) daha yavas bir hizda intemalize ediliyorsa bir CD70 antikorunun yavas intemalizasyon gösterdigi kabul edilir. Ilisikteki örneklerde gösterildigi gibi, farkli kanser hücresi hatlari CD70 antikorlarinin intemalizasyon derecesi bakimindan anlamli farkliliklar sergiler. Kanser hücresi hatlarinin çogunlugunun ARGX-l 10 ile 6 saat inkübasyon sonrasinda bile baglanmis CD70 antikoruna iliskin %30,dan daha az ve hatta %lOidan daha az intemalizasyon sergilemesi özellikle anlamlidir. Bu sonuçlar güçlü efektör islevi olan CD70 antikorlarinin (güçlenmis efektör islev için tasarlanmis varyantlar dahil) CD70 eksprese eden kanserlerin tedavisinde kullanisliliklarini açik sekilde desteklemektedir. Daha önceleri bilimsel literatürde CD70lin immünolojik hastaliklarin tedavisi için CD70 antikoru-ilaç immünokonjugatlarinin gelistirilmesi önerilmistir. Dolayisiyla, hücre yüzeyine baglanan CD70 antikorlarinin intemalizasyonunun nadir bir olay oldugunu ve CD70 eksprese eden hücre hatlarinin çogunun baglanmis CD70 antikorunu anlamli bir boyutta intemalize ettigini kesin olarak olarak kanitlayan burada sunulan sonuçlar olaganüstü sasirticidir. Devegillerden Elde Edilen CD70 Antikorlari Yine baska yönleri itibariyla, burada açiklanan antikorlar veya bunlarin antijen baglayici fragmanlari Devegiller familyasindan bir türe ait bir VH domeninden veya VL domeninden elde edilen en az bir asiri degisken ilmik veya tamamlayiciligi belirleme bölgesi içerebilir. Özellikle, antikor veya antijen baglayici fraginan, farkli soydan üretilmis devegillerin, örnegin lamalarin bir insan CD70 antijeniyle etkin bagisiklanmasiyla elde edilen VH ve/veya VL domenlerini veya bunlarin CDR'lerini içerebilir. asiri degisken ilmik veya tamamlayiciligi belirleme bölgesi" asiri degisken ilmik (HV) veya CDRinin devegillere ait bir immünoglobulin geni tarafindan kodlanan bir asiri degisken ilmigin veya CDRinin amino asit dizisi ile özdes veya büyük ölçüde Özdes bir amino asit dizisine sahip oldugu anlamina gelir. Bu baglamda "immünoglobulin geni" germ hatti genlerini, yeniden düzenlenmeye tabi olmus immünoglobulin genlerini ve ayrica somatik mutasyona tabi olmus genleri içerir. Sonuç olarak, bir devegil türünün VH veya VL domeninden elde edilen HV veya CDR,nin amino asit dizisi olgun devegil konvansiyonel antikorunda bulunan bir HV veya CDRinin amino asit dizisine özdes olabilir. Bu baglamda devegil immünoglobulin geni tarafindan kodlanmis bir amino asit dizisini (veya bunun küçük varyantlarini) kapsamasi bakimindan yapisal bir iliskiyi belirtir. Bununla birlikte bunun CD70 antikorunun hazirlanmasinda kullanilan üretim islemi baglaminda özel bir iliskiyi belirtmesi sart degildir. Devegillerden elde edilen CD70 antikorlari baskalarinin yani sira lama, hecin devesi, alpaka, vikunya, guanako veya deve dahil herhangi bir devegil türünden elde edilebilir. Devegillerden elde edilen VH ve VL domenlerini veya bunlarin CDR"lerini içeren CD70 antikorlari tipik olarak rekombinant eksprese edilmis polipeptitlerdir ve kimerik polipeptitler olabilirler. "Kimerik polipeptit" terimi aslinda bitisik olusmayan iki veya daha fazla peptit fragmaninin bitistirilmesiyle yaratilmis bir yapay (dogal olarak olusmayan) polipeptide karsilik gelir. Iki veya daha fazla türün, örnegin devegil ve insanin kodladigi peptit fragmanlarinin bitistirilmesiyle yaratilan "tür"e kimerik polipeptitler bu tanimin içine girmektedir. zincir CDR3) veya DIZI ID: NO: veya DIZI ID: NO: olarak gösterilen CDR dizilerinden birini CDRl) olarak gösterilen CDR dizilerinden birini içerebilir. Bir düzenlemede VH domeninin tamami ve/veya VL domeninin tamami devegiller familyasindan bir türden elde edilebilir. Özel düzenlemelerde, devegillerden elde edilen VH olarak gösterilen amino asit dizisini içerebilir. Devegillerden elde edilen VH domeni ve/Veya devegillerden elde edilen VL domeni protein tasarimina tabi tutulabilir ve burada devegil amino asit dizisi içinde bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu, eklentisi veya silinmesi yapilir. Bu tasaralanmis degisiklikler tercihen devegil dizisine iliskin amino asit sübstitüsyonlarini içerir. Bu degisimler "insanlastirma"y1 veya "germ hatti islemi"ni içermekte olup, burada bir devegil tarafindan kodlanan VH veya VL domenindeki bir veya daha fazla amino asit kalintisi insan tarafindan kodlanan bir homolog VH veya VL domenine ait esdeger kalintilarla degistirilir. Bir devegilin (örnegin lama) bir insan CD70 antijeniyle aktif bagisiklanmasiyla elde edilen izole edilmis devegil VH ve VL domenleri bulusa uygun antijen baglayici polipeptitlerin tasarlanmasinda bir baz olarak kullanilabilir. Intakt devegil VH ve VL domenlerinden baslayarak, baslangiç devegil dizisinden uzaklasan bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonunun, eklentisinin veya silinmesinin tasarlanmasi mümkündür. Bazi düzenlemelerde, bu tür sübstitüsyonlar, eklentiler veya silinmeler VH domeninin ve/veya VL domeninin çerçeve bölgelerinde mevcut olabilir. Primer amino asit dizisinde bu tür degisikliklerin amaci olumsuz olmasi olasi özelliklerin (örnegin bir insan konakçida (insanlastirma denilen) immünoj enisite, potansiyel ürün heteroj enligi ve/veya instabilitesi alanlari (glikozilasyon, deamidasyon, izomerizasyon, vb.) azaltilmasi veya molekülün bazi baska olumlu özelliklerinin (örnegin çözünürlük, stabilite, biyoyararlanim, Vb.) güçlendirilmesi olabilir. Baska düzenlemelerde, primer amino asit dizisindeki degisiklikler aktif bagisiklama ile elde edilen bir devegil Vl-l ve/Veya VL domeninin asiri degisken ilmiklerinin (veya CDR91erinin) birinde veya daha fazlasinda tasarlanabilir. Bu degisiklikler10 antijen baglama afinitesinin ve/Veya spesifikligin güçlendirilmesi veya olumsuz olmasi olasi Özelliklerin, örnegin bir insan konakçida (insanlastirma denilen) immünojenisitenin, potansiyel ürün heterojenligi ve/Veya instabilitesi alanlarinin, glikozilasyon, deamidasyon, izomerizasyon ve benzerinin azaltilmasi veya molekülün bazi baska olumlu özelliklerinin, örnegin çözünürlük, stabilite, biyoyararlanim ve benzerinin güçlendirilmesi için yapilabilir. Dolayisiyla, bir düzenlemede, bulus örnekleri bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla DIZI ID. dizilerini içeren devegil VL domenlerine sahip devegillerden elde edilen bir VH veya VL domeniyle karsilastirildiginda gerek VH domeninin, gerek VL domeninin en az bir çerçeve veya CDR bölgesinde en az bir amino asit sübstitüsyonu içeren bir varyant CD70 antikoru saglamaktadir. Baska düzenlemelerde, devegillerden elde edilen VH ve VL domenlerini (veya bunlarin tasarlanmis varyantlari) ve devegillere ait olmayan bir antikorun bir veya daha fazla sabit domenini, örnegin insan kodlamali sabit domenleri (veya bunlarin tasarlanmis varyantlari) içeren "kimerik" antikor molekülleri saglanmaktadir. Bu tür düzenlemelerde hem VH domeninin, hem VL domeninin ayni devegil türünden elde edilmesi tercih edilir, örnegin hem VH, hem VL Lama glamadan olabilir veya hem VH, hem VL Lama pakostan (tasarlanan amino asit dizisi varyasyonunun eklenmesi öncesinde) olabilir. Bu tür düzenlemelerde hem VH, hem VL domeni tek bir hayvandan, özellikle bir insan CD70 antijeniyle aktif bagisiklama yapilmis tek bir hayvandan elde edilebilir. Devegillere ait VH ve/veya VL domenlerinin primer amino asit dizisinde degisikliklerin tasarlanmasina bir alternatif olarak, ayri ayri devegillerden elde edilen asiri degisken ilmikler veya CDR,ler veya bunlarin kombinasyonlari devegil VH/VL domenlerinden izole edilebilir ve bir alternatif (yani devegil olmayan) çerçeveye, örnegin bir insan VH/VL çerçevesine CDR greftlemesiyle aktarilabilir. Devegillerden elde edilen VH ve VL domenlerini veya bunlarin CDR"lerini içeren CD70 antikorlari içinde hem bir VH domeninin, hem bir VL domeninin mevcut oldugu çesitli farkli düzenlemelerde olabilir. Burada "antikor" terimi en genis anlamda kullanilmakta ve bir insan CD70 proteini için uygun immünolojik spesifikligi sergiledikleri sürece bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla monoklonal antikorlari (tam boy monoklonal antikorlar dahil), poliklonal antikorlari, mültispesifik antikorlari (örnegin, bispesifik antikorlari) kapsamaktadir. Burada kullanildigi sekliyle "monoklonal antikor" terimi büyük Ölçüde homojen antikorlardan olusan bir popülasyondan elde edilen bir antikora karsilik gelir, yani popülasyonu içeren ayri ayri antikorlar önemsiz miktarlarda mevcut olabilecek dogal olarak olusan olasi inutasyonlar hariç özdestir. Monoklonal antikorlar, tek bir antij enik alana yönelik oldukça spesifik antikorlardir. Ayrica, tipik olarak antijende farkli determinantlara (epitoplar) yönelik farkli antikorlari içeren konvansiyonel (poliklonal) antikor preparasyonlarinin tersine her monoklonal antikor antij ende tek bir determinanta veya epitopa yöneliktir. degisken domenini içerir. Antikor fragmanlarinin örnekleri Fab, Fab', F(ab')2, bi-spesifik Fab"leri ve FV fragmanlarini, di-antikorlari, dogrusal antikorlari, tek Zincirli antikor moleküllerini, tek Zincirli bir degisken fragmani (SCFV) ve antikor fragmanlarindan olusturulan mültispesifik antikorlari içerir (bakiniz içerikleri isbu metine referansla dahil Sinirlayici olmayan düzenlemelerde, devegillerden elde edilen VH ve VL doinenlerini veya bunlarin CDR"lerini içeren CD70 antikorlari amino asit dizisi tamamen veya büyük ölçüde insan olan CHl domenlerini ve/veya CL domenlerini içerebilir. Bulusa ait antijen baglayici polipeptit insanda terapötik kullanima yönelik bir antikor oldugunda, tipik durum antikorun tüm sabit bölgesinin veya bunun en az bir parçasinin tamamen veya büyük ölçüde insan amino asit dizisine sahip olmasidir. Dolayisiyla, CHl domeni, mentese bölgesi, CH2 domeni, CH3 domeni ve CL domeninden (ve eger varsa CH4 domeni) biri veya daha fazlasi veya bunlarin bir kombinasyonu amino asit dizisi bakimindan tamamen veya büyük ölçüde insan olabilir. Avantajli olan CHl domeni, mentese bölgesi, CH2 domeni, CH3 domeni ve CL domeninin (ve eger varsa CH4 domeni) tamaminin tamamen veya büyük ölçüde insan amino asit dizisine sahip olabilmesidir. Insanlastirilmis veya kimerik bir antikorun veya bir antikor fragmaninin sabit bölgesi baglaminda, "büyük ölçüde insan" terimi bir insan sabit bölgesiyle en az %90 veya en az %92 veya en az %95 veya en az %97 veya en az %99 bir amino asit dizisi özdesligine karsilik gelir. Bu baglamda "insan amino asit dizisi" terimi, germ hattini, yeniden düzenlenmis ve somatik mutasyona tabi tutulmus genleri içeren bir insan immünoglobulin geni tarafindan kodlanmis bir amino asit dizisine karsilik gelir. Bulusta "tamamen insan" bir mentese bölgesi mevcudiyetinin kesinlikle sart oldugu düzenlemeler hariç insan dizisine göre bir veya daha fazla amino asit eklentisi, silinmesi veya sübstitüsyonu ile degistirilmis "insan" dizisi sabit domenlerini içeren polipeptitler de tasarlanmaktadir.10 Bulusa ait CD70 antikorlarinda "tamamen insan" bir mentese bölgesinin mevcudiyeti hem immünojenisitenin minimumda tutulmasi, hem antikorun stabilitesinin optimum olmasi için faydali olabilir. Burada bir baska yerde açiklandigi üzere, agir ve/veya hafif zincirin sabit bölgesinde, bilhassa Fc bölgesinde bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu, eklentisi veya silinmesinin yapilabilmesi düsünülmüstür. Amino asit sübstitüsyonlari sübstitüe edilmis amino asidin farkli dogal olusumlu bir amino asitle veya dogal olusumlu olmayan veya modifiye bir amino asitle degistirilmesine yol açabilir. Diger yapisal modifikasyonlarin, örnegin glikozilasyon modelinde degisikliklerin (örnegin N veya 0 baglantili glikozilasyon alanlarinin eklenmesi veya silinmesi yoluyla) yapilmasi da mümkündür. Antikorun amaçlanan kullanimina bagli olarak, bulusa ait antikorun baglanma özellikleri bakimindan örnegin efektör islevi modüle etmek için FC reseptörlerine modifiye edilmesi arzu edilebilir. Örnegin Fe bölgesine sistein kalintisi(kalintilari) yerlestirilebilir, bu sekilde bu bölgede zincirler arasi disülfür bag olusumu saglanabilir. Bu sekilde olusan homodimerik antikor gelismis internalizasyon kapasitesine ve/veya artmis tamamlayici aracili hücre ölümüne ve antikora bagli hücresel sitotoksisiteye olan ve dolayisiyla güçlenmis tamamlayici lizizi ve ADCC kapasitelerine sahip olabilecek bir CD70 antikoru tasarlanabilir. Bakiniz, Stevenson ve digerleri, Anti-Cancer Ilaç Design 32219- 230 (1989) referansi. Bulusta bir sitotoksik maddeye, örnegin bir kemoterapötik maddeye, toksine (örnegin, bakteriyal, fungal, bitki veya hayvan kökenli enzimatik olarak etkin bir toksin veya bunun fragmanlari) veya bir radyoaktif izotopa (yani, bir radyokonjugat) konjuge edilmis burada açiklanan sekilde bir antikor içeren immünokonjugatlar da tasarlanmaktadir. açiklanan sekilde yarilanma ömrünün uzatilmasi için Pc bölgeleri de tasarlanabilir. Yine bir baska düzenlemede, Fc bölgesi antikorun antikora bagli hücresel sitotoksisiteye (ADCC) aracilik etme kapasitesini artirmak ve/veya bir veya daha fazla amino asidi modifiye etmek suretiyle antikorun bir Fcy reseptörüne afinitesini artirmak için modifiye edilebilir. Yine bir baska düzenlemede, bir antikorun glikozilasyonu modifiye edilir. Örnegin, glikozilasyonun olmadigi bir antikor yapilabilir (yani, antikorda glikozilasyon yoktur). Glikozilasyon, örnegin antikorun CD70 hedef antijenine afinitesini artirmak için degistirilebilir. Bu tür karbonhidrat modifikasyonlari, örnegin antikor dizisi içindeki bir veya daha fazla glikozilasyon alanini degistirerek gerçeklestirilebilir. Örnegin, bir veya daha fazla10 degisken bölge çerçeve glikozilasyon alaninin ortadan kalkmasi, bu sekilde bu alandaki glikozilasyonun yok edilmesi sonucunu veren bir veya daha fazla ainino asit sübstitüsyonu yapilabilir. Bu tür bir glikozilasyon giderme antikorun antijen için afinitesini artirabilir. Degismis bir glikozilasyon türüne sahip varyant CD70 antikorlari, örnegin düsük miktarlarda fukozil kalintisina sahip hipofukozillenmis bir antikor veya fukozillenmemis bir antikor (Natsume ve digerleri, Drug Design Development and Therapy, Cilt 3, s. 7-16, 2009 referansinda açiklanan sekilde) veya artmis ikiye ayirici GlcNac yapilarina sahip bir antikor da tasarlanmaktadir. Bu tür degistirilmis glikozilasyon modellerinin antikorlarin ADCC etkinligini artirarak bir "dogal" insan FC domeni içeren esdeger bir antikora göre tipik olarak kat daha güçlü ADCC ürettigi kanitlanmistir. Bu tür karbonhidrat modifikasyonlari, örnegin antikorun degistirilmis glikozilasyon enzimatik düzenegi olan bir konakçi hücre içinde eksprese edilmesiyle gerçeklestirilebilir (Yamane-Ohnuki ve Satoh, mAbs l:3_, 230- 236, 2009 referansinda açiklanan sekilde). Güçlenmis ADCC islevi olan fukozillenmemis antikorlarin örnekleri BioWa lncfye ait PotelligentTM teknolojisini kullanarak üretilenlerdir. Bulus, bazi düzenlemelerde kimerik devegil/insan antikorlarini ve bilhassa VH ve VL domenlerinin tamamen devegil dizisinden (örnegin lama veya alpaka) oldugu ve antikorun geri kalaninin tamamen insan dizisinden oldugu kimerik antikorlari kapsayabilir. CD70 antikorlari devegillerden elde edilen VH ve VL domenlerinin veya bunlarin CDRilerinin VL domenlerinin bir devegilin bir insan CD70 antijeniyle aktif bagisiklanmasiyla elde edilen devegil VH ve VL domenleriyle karsilastirildiginda çerçeve bölgelerinde bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu içerdigi devegil/insan kimerik antikorlarini içerebilir. Bu kalintilarinin bir insan germ hatti tarafindan kodlanan VH veya VL doineninde bulunan esdeger kalinti ile degistirilmesiyle insan germ hatti VH veya VL domenleriyle dizi özdesligi CD70 antikorlari CDR greftli antikorlar da olabilirler; burada bir devegil antikorundan, örnegin insan CD70 proteini ile aktif bagisiklama yaparak olusturulan veya bir devegil geni tarafindan kodlanan bir devegil CD70 antikorundan elde edilen CDRller (veya asiri degisken ilmikler) bir insan VH ve VL çerçevesine greftlenir, antikorun geri kalani da tamamen insan kökenlidir. Yukarida açiklanan insanlastirilmis, kimerik ve CDR greftli CD70 antikorlari, özellikle devegillerin bir insan CD70 antijeniyle aktif bagisiklanmasiyla elde edilen asiri degisken ilmikler veya CDR°ler içeren antikorlar, bir kismi burada açiklanan sekilde olan ve ilisikteki örneklerde açiklanan, ilgili polipeptidi içerecek sekilde tasarlanmis ve bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla bakteriyal hücreleri, maya hücrelerini, memeli hücrelerini, böcek hücrelerini, bitki hücrelerini içeren prokaryotik ve ökaryotik konakçi hücrelerden faydalanarak konvansiyonel rekombinant DNA manipülasyonu ve ekspresyonu tekniklerini kullanarak kolaylikla hazirlanabilir. Devegillerden elde edilen CD70 antikorlari varyantlar içermekte olup, burada VH domenine ve/veya VL domenine ait asiri degisken ilmik(ilmikler) veya CDR(CDR,ler) insan CD707e yönelik olusturulmus bir konvansiyonel devegil antikorundan elde edilmistir ancak burada söz konusu (devegillerden elde edilen) asiri degisken ilmiklerin veya CDR"lerin en az biri devegilin kodladigi diziye göre bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu, eklentisi veya silinmesi içerecek sekilde tasarlanmistir. Bu degisiklikler asiri degisken ilmiklerin/CDR31erin yine de devegil tarafindan kodlanan bir HV/CDRlnin amino asit dizisine "büyük ölçüde özdes" olan bir amino asit dizisi sergileyebilir. Bu baglamda, "büyük ölçüde özdeslik" devegil tarafindan kodlanan HV/CDR ile en fazla bir veya en fazla iki amino asit dizisi yanlis eslesmesi mümkün olabilir. Burada saglanan devegillerden elde edilen CD70 antikorlari herhangi bir izotipten olabilir. Insanda terapötik kullanimi amaçlanan antikorlar tipik olarak IgA, IgD, IgE IgG, IgM tipinden, siklikla IgG tipindendirler, IgG tipinden olmalari durumunda IgGl, IgGZa ve b, biri dahilinde Fc kismi içinde bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonunun, eklentisinin veya silinmesinin yapilmasi veya örnegin F c°ye bagli islevselliklerin güçlendirilmesi veya azaltilmasi için baska yapisal modifikasyonlarin yapilmasi mümkün olabilir. Devegillerden Elde Edilen VH ve VL Domenlerinin Insanlastirilmasi Konvansiyonel devegil antikorlari, US 12/497,239 sayili belgede açiklanan asagidaki faktörler nedeniyle beseri terapötik maddeler olarak kullanisliligi olan antikorlarin hazirlanmasinda avantajli bir baslangiç noktasi saglarlar: 1) Devegil VH ve VL domenleri ve bunlarin insan emsalleri arasinda yüksek dizi homoloji %,Sinin olmasi; 2) Devegil VH ve VL domenlerinin CDR`leri ve bunlarin insan emsalleri arasinda10 yüksek derecede yapisal homolojinin (yani insan benzeri kanonik katlanma yapilari ve insan benzeri kanonik katlanma kombinasyonlari) olmasi. Devegil (örnegin lama) platformu elde edilebilecek CD70 antikorlari islevsel çesitliligi baglaminda da anlamli bir avantaj sergiler. Devegil VH ve/veya devegil VL domenlerini içeren CD70 antikorlarinin insan tedavisinde kullanisliligi, örnegin bir insan konakçida daha az immünojenik kilinmalari için dogal devegil VH ve VL domenlerinin "insanlastirilma"s1yla daha da gelistirilebilir. Insanlastirmanin genel amaci VH ve VL domenlerinin bir insan denege yerlestirildiklerinde minimal immünojenisite sergiledikleri, parental VH ve VL domenleri tarafindan olusturulan antijen baglanma alanina iliskin spesifikligi ve afiniteyi ise koruduklari bir molekül üretmektir. domeninin amino asit dizisinde bir insan VH veya VL domeni germ hatti dizisine daha yakin hale getirilmesi için degisimlerin tasarlanmasini içerir. Bir devegil VH (veya VL) domeni ve insan VH (veya VL) domenleri arasindaki homolojinin belirlenmesi hem degistirilecek devegil amino asit kalintilarinin seçilmesi (belli bir VH veya VL domeninde), hem degistirilecek uygun amino asit kalintisinin(kalintilarinin) seçilmesi açisindan insanlastirma isleminde önemli bir asamadir. Konvansiyonel devegil antikorlarinin insanlastirilmasina iliskin bir yaklasim gelistirilmis olup, söz konusu yaklasim çok sayida yeni devegil VH (ve VL) domeni dizilerinin, tipik olarak bir hedef antijene baglandigi bilinen somatik mutasyona tabi tutulmus VH (veya VL) domenlerinin insan germ hatti VH (veya VL) dizileri, insan VH (ve VL) konsensüs dizileri ile hizalanmasina ve ayrica lama pakos için mevcut germ hatti dizisi bilgisine dayanmaktadir. Asagidaki paragraflarda (i) devegillerden elde edilen bir VH veya VL domeninde veya bunlara ait bir CDR"de ikame etmek için "devegil" amino asit kalintilarinin seçilmesinde ve (ii) verili bir devegil VH (veya VL) domeninin insanlastirilmasi durumunda sübstitüe etmek için ikame edilecek "insan" amino asit kalintilarinin seçilmesinde uygulanabilecek prensipler açiklanmaktadir. Bu yaklasim DIZI ID: NO: veya seklinde gösterilen amino asit dizilerine sahip devegillerden elde edilen CDR"1erin veya DIZI ID: NO: veya olarak gösterilen CDR dizilerinden birinin insanlastirilmis olarak gösterilen dizilere sahip devegillerden elde edilen VH doinenlerinin ve DIZI ID: NO: insanlastirilmasi için kullanilabilir. Asama 1. Insanlastirilacak matür devegil dizisi ile en yüksek homolojiyi/özdesligi gösteren insan (germ hatti) ailesi ve bu ailenin üyesi seçilir. Verili bir devegil VH (veya VL) domenine iliskin en yakin eslesen insan germ hattinin tanimlanmasi için genel bir usul asagida ana hatlariyla verilmektedir. Asama 2. Germ hatti isleminde kullanilacak spesifik insan germ hatti ailesi üyesi seçilir. Tercihen bu en yüksek homoloj iyi gösteren germ hatti veya ayni aileden bir baska germ hatti ailesi üyesidir. Asama 3. Seçilen insan germ hattina en yakin devegil germ hatti için amino asit kullanimi tablosuna dayanarak germ hatti islemi için düsünülen tercih edilen konumlar tanimlanir. Asama 4. Devegil germ hattinda en yakin insan germ hattindan sapma gösteren amino asitlerin degistirilmesine çalisilir; Germ hatti isleminin CDR kalintilarindansa FR kalintilarinda yapilmasi tercih edilir. a. Tercih edilenler germ hatti isleminde kullanim için seçilen ve devegil dizisinde bulunan amino asidin seçilen germ hatti ile eslesmedigi ve ayni alt sinifa ait diger germ hatlarinda bulunmadigi (hem V, hem J tarafindan kodlanan FR amino asitleri) insan germ hattindan sapma gösteren konumlardir. b. Germ hatti isleminde seçilen insan germ hatti ailesi üyesinden sapma gösteren ancak ayni aileden baska germ hatlarinda kullanilan konumlar da ele alinabilir. c. Seçilen insan germ hattina yönelik ilave yanlis eslesmeler de (örnegin ilave somatik mutasyonlara bagli) ele alinabilir. Asagida belirtilen yaklasim verili bir devegil VH (veya VL) domeni için en yakin eslesen insan germ hattinin belirlenmesinde kullanilabilir: Devegil ve insan germ hatti VH ve VL,si arasinda dizi özdesligi yüzdesinin analiz edilmesinden önce ilk olarak kanonik katlanmalar belirlenebilir, bu sekilde Hl ve H2 veya L1 ve L2 (ve L3) için özdes kanonik katlanma kombinasyonuna sahip insan germ hatti kesitleri ailesinin tanimlanmasi saglanir. Bunun ardindan dizi homolojinin derecelendirilmesi için ilgili devegil degisken bölgesiyle en yüksek dizi homolojisi derecesine sahip insan germ hatti ailesi üyesi seçilebilir. L1, L2, L3, H] ve H2 asiri degisken ilmiklerinin Chothia kanonik siniflarinin belirlenmesi WWW.bi0inf.0rg.uk/abs/chothia.html.page internet sayfasinda kamuya açik biyoenformatik araçlarla gerçeklestirilebilir. Programin çiktisi bir veri dosyasinda kilit kalinti gerekliliklerini gösterir. Bu veri dosyalarinda, kilit kalinti konumlari her konumda izin verilen amino asitlerle gösterilir. Antikorun degisken bölge dizisi girdi olarak verilir ve önce bir konsensüs antikor dizisi ile hizalanarak Kabat numaralandirrna semasi tayin edilir. Kanonik katlanmalar analizinde Martin ve Thomton (Martin ve digerleri, J . Mol. Biol. 263:800-815 (1996)) tarafindan gelistirilen bir otomatik usulle elde edilen bir grup anahtar kalinti sablonu kullanilir. Chothia numaralandirma semasinin bir uyarlamasi olan IMGT numaralandimia semasini kullanarak ayri ayri her çerçeve bölgesinin sinirlari belirlenebilir (Lefranc ve H] ve 112 veya L1 ve L2 (ve L3) için ayni kanonik katlanma kombinasyonunu kullanan bilinen özel insan germ hatti V kesitiyle dizi homolojisi baglaminda en iyi eslesen aile üyesi belirlenebilir. Devegil VH ve VL domeni çerçeve amino asit dizileri ve insan germ hatti tarafindan kodlanan karsilik gelen diziler arasindaki dizi özdesligi yüzdesi biyoenformatik araçlarla hesaplanabilir ama dizilerin elle hizalanmasina da basvurulabilir. Insan immünoglobulin dizileri, örnegin VBase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) veya Pluckthun/Honegger veri tabani (http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Gennlines gibi çesitli protein veri tabanlarindan tanimlanabilir. Insan dizilerinin devegillere ait VH veya VL domenlerinin V bölgeleri ile karsilastirilmasi için bir dizi hizalama algoritmasi, örnegin WWW.expasy.ch/t001s/#align gibi internet sayfalarinda sunulanlar kullanilabilir ayrica sinirli sayida bir dizi grubuyla elle hizalama da gerçeklestirilebilir. Her zincirin çerçeve bölgesi 1, 2 ve 3 ile ayni kanonik katlanma kombinasyonlarina ve en yüksek homoloji derecesine sahip ailelere ait insan germ hatti hafif ve agir zincir dizileri seçilebilir ve ilgili devegil degisken bölgesi ile karsilastirilabilir; ayrica FR4 de insan germ hatti JH ve JK veya JL bölgeleriyle karsilastirilir. Toplam dizi homolojisi yüzdesi hesaplamasinda F R1, FR2 ve FR3 kalintilarinin özdes kanonik katlanmalar kombinasyonu olan insan germ hatti ailesinden en yakin eslesen dizinin kullanilmasiyla incelendigi bilinmelidir. Sadece en yakin eslesmeden farkli kalintilar veya ayni kanonik katlanmalar kombinasyonu olan ayni ailenin diger üyeleri puanlanir (Not - primerin kodladigi farkliliklar hariç). Bununla birlikte, insanlastirma amaciyla, ayni kanonik katlanmalar kombinasyonuna sahip olmayan diger insan germ hatti ailelerinin üyeleri ile özdes çerçeve bölgelerindeki kalintilar, yukarida açiklanan zorunlu kosullara göre "negatif" puanlanmalarina ragmen "insanlastirma" için kabul edilebilmektedir. Bu varsayim insanlastirmaya iliskin "karistir ve eslestir" yaklasimina dayanmakta olup, burada Qu ve FRl, FR2, FR3 ve FR4,ün her biri ayri olarak en yakin eslesen insan germ hatti dizisiyle karsilastirilir ve dolayisiyla insanlastirilmis molekül farkli FRllerin bir kombinasyonunu Çapraz Rekabet Gösteren Antikorlar Burada açiklanan moleküllerle "çapraz rekabet gösteren" monoklonal antikorlar veya bunlarin antij en baglayici fragmanlari mevcut CD70 antikorlarinin baglandigi alanla(alanlarla) özdes veya örtüsen alanda(alanlarda) insan CD70"e baglananlardir. Rekabet eden inonoklonal antikorlar veya bunlarin antij en baglayici fragmanlari örnegin bir antikor rekabet analiziyle belirlenebilir. Örnegin, saflastirilmis veya kismen satlastirilmis bir insan CD70 numunesi kati bir destege baglanabilir. Ardindan, mevcut bulusa ait bir antikor bilesigi veya bunun antijen baglayici fragmani ve bulusa ait bu antikor bilesigi ile rekabet edebilecegi düsünülen bir monoklonal antikor veya bunun antijen baglayici fragmani eklenir. Iki molekülden biri isaretlenir. Eger isaretlenmis bilesik ve isaretlenmemis bilesik CD70"te ayri ve farkli alanlara baglanirsa, rekabetçi oldugu düsünülen bilesik mevcut olsun ya da olmasin isaretlenmis bilesik ayni seviyeye baglanacaktir. Bununla birlikte, eger etkilesim alanlari özdes veya örtüsür ise, isaretlenmemis bilesik rekabet edecek ve antij ene baglanan isaretlenmis bilesik miktari azalacaktir. Eger isaretlenmemis bilesik fazladan mevcut ise, yok denecek kadar az isaretlenmis bilesik baglanacaktir. Mevcut bulusun amaçlari dahilinde, rekabet eden monoklonal antikorlar veya bunlarin antij en baglayici fragmanlari mevcut antikor bilesiklerinin CD70,e baglanmasini yaklasik %50, yaklasik %60, yaklasik %70, yaklasik rekabet analizlerinin gerçeklestirilinesine iliskin usullerin ayrintilari teknikte gayet iyi bilinmektedir ve örnegin Harlow ve Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, sayfa 567-569, ISBN 0- 87969-314-2 referansinda bulunabilir. Bu tür analizler saflastirilmis antikorlari kullanarak kantitatif yapilabilir. Bir antikoru kendisiyle titre ederek, yani hem isaret, hem rakip için ayni antikoru kullanarak bir standrat egrisi olusturulur. Isaretlenmemis rekabetçi bir monoklonal antikorun veya bunun antijen baglayici fragmaninin isaretlenmis molekülün plakaya baglanmasini inhibe etme kapasitesi titre edilir. Sonuçlar isaretlenir ve istenen baglanma inhibisyonu derecesini elde etmek için gereken konsantrasyonlar karsilastirilir. Tercih edilen düzenlemeler insan CD70°e baglanmak için lamadan elde edilen F ab 2783 ve bunun germ hatti islemi yapilmis varyantlarini, özellikle içeren antikorlarla çapraz rekabet eden ve ayni baglanma Özellikleri kombinasyonunu sergileyen antikorlar olup, söz konusu baglanma özellikleri asagida belirtilmektedir: (a) insan CD70,te amino asit dizisi HIQVTLAICSS (DIZI ID. NO:342) ile baglanma; (b) al yanakli makak (Macaca mulazta) ve sinomolgus maymunu (Macaca cynomolgus) CD70 homologlari ile çapraz reaktiflik; (c) hem dogal, hem isiyla denatüre edilmis rekombinant insan CD70"e baglanma. CD70 Antikorlarini Kodlavan Polinükleotitler Bulusta bulusa ait CD70 antikorlarini kodlayan polinükleotit molekülleri, ayrica antijen baglayici polipeptidin bir konakçi hücre veya hücresiz ekspresyon sistemininde ve bu ekspresyon vektörünü içeren bir konakçi hücre veya hücresiz ekspresyon sistemi içinde ekspresyonunu mümkün kilan düzenleyici dizilere islevsel baglanmis bulusa ait CD70 antikorlarini kodlayan nükleotit dizilerini içeren ekspresyon vektörleri de saglanmaktadir. Bulusa ait CD70 antikorlarini kodlayan polinükleotit molekülleri, örnegin rekombinant DNA moleküllerini içerir. Burada "nükleik asit", "polinükleotit" veya bir "polinükleotit molekülü" terimleri birbirinin yerini tutacak sekilde kullanilmakta ve gerek tek, gerek iki iplikli herhangi bir DNA veya RNA molekülüne ve eger tek iplikli ise tamamlayici dizisinin molekülüne karsilik gelmektedir. Burada nükleik asit molekülleri açiklanirken belli bir nükleik asit molekülüne ait bir dizi veya yapi dizinin 5' ila 3' yönünde saglandigi normal kurala göre açiklanabilir. Bulusun bazi düzenlemelerinde, nükleik asitler veya polinükleotitler "izole edilmis"tir. Bir nükleik asit molekülüne uygulandiginda bu terim, içinden kaynaklandigi organizmanin dogal olusumlu genomunda hemen bitisik oldugu dizilerden ayrilmis bir nükleik asit molekülüne karsilik gelir. Örnegin, "izole edilmis bir nükleik asit" bir vektör, örnegin bir plazmit veya virüs vektörü içine eklenmis veya prokaryotik veya ökaryotik bir hücrenin veya insan olmayan bir konakçi organizmanin genomik DNAisina entegre edilmis bir DNA molekülünü içerebilir. RNA,ya uygulandiginda, "izole edilmis polinükleotit" terimi esas olarak yukarida tanimlanan sekilde izole edilmis bir DNA molekülü tarafindan kodlanan bir RNA molekülüne karsilik gelir. Alternatif olarak, terim dogal durumundayken (yani, hücrelerde veya dokularda) birlesik olacagi diger nükleik asitlerden saflastirilmis/ayrilmis olan bir RNA molekülüne karsilik gelebilir. Izole edilmis bir polinükleotit (gerek DNA, gerek RNA) ayrica dogrudan biyolojik veya sentetik yollarla üretilmis ve üretimi sirasinda mevcut olan diger bilesenlerden ayrilmis bir molekülü temsil edebilir. Bir düzenlemede, bulusta burada 4lD12 olarak ifade edilen germ hatti islemi yapilmis lamadan elde edilen Fabinin VH doinenini ve VL domenini kodlayan nükleotit dizileri saglanmakta olup, burada VH doineni DIZI ID. No:223 olarak gösterilen amino asit dizisine sahiptir ve VH domeni DIZI ID. NO:241 olarak gösterilen amino asit dizisine sahiptir. Tercih edilen bir düzenlemede DIZI ID. NO:223 olarak gösterilen amino asit dizisine sahip VH domenini kodlayan nükleotit dizisi DIZI ID. No:344 olarak gösterilen nükleotit dizisini içerir ve DIZI ID. NO:24] olarak gösterilen amino asit dizisine sahip VL domenini kodlayan nükleotit dizisi DIZI ID. NO:345 olarak gösterilen nükleotit dizisini içerir. Burada 57B6 olarak ifade edilen germ hatti islemi yapilmis lamadan elde edilen F abinin VH domenini ve VL domenini kodlayan nükleotit dizileri de açiklanmakta olup, burada VH domeni DIZI ID. NO:274 olarak gösterilen amino asit dizisine sahiptir ve VH domeni DIZI ID. No:276 olarak gösterilen amino asit dizisine sahiptir. Tercih edilen bir düzenlemede DIZI ID. NO:274 olarak gösterilen amino asit dizisine sahip VH domenini kodlayan nükleotit dizisi DIZI ID. No:346 olarak gösterilen nükleotit dizisini içerir ve DIZI ID. No:276 olarak gösterilen amino asit dizisine sahip VL domenini kodlayan nükleotit dizisi DIZI ID. No:347 olarak gösterilen nükleotit dizisini içerir. Burada 59Dl 0 olarak ifade edilen germ hatti islemi yapilmis lamadan elde edilen Fabinin VH domenini ve VL domenini kodlayan nükleotit dizileri de açiklanmakta olup, burada VH domeni DIZI ID. No:275 olarak gösterilen amino asit dizisine sahiptir ve VH domeni DIZI ID. NO:277 olarak gösterilen amino asit dizisine sahiptir. Tercih edilen bir düzenlemede DIZI ID. NO:275 olarak gösterilen amino asit dizisine sahip VH domenini kodlayan nükleotit dizisi DIZI ID. No:348 olarak gösterilen nükleotit dizisini içerir ve DIZI ID. NO:277 olarak gösterilen amino asit dizisine sahip VL domenini kodlayan nükleotit dizisi DIZI ID. No:349 olarak gösterilen nükleotit dizisini içerir. Bulusa uygun bir CD7O antikorunun rekombinant üretimi için bunu kodlayan bir rekombinant polinükleotit hazirlanabilir (standart moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak) ve seçilen bir konakçi hücrede veya hücresiz bir ekspresyon sisteminde ekspresyon için çogaltilabilir bir vektör içine eklenir. Uygun konakçi hücreler prokaryot, maya veya yüksek ökaryot hücreler, özellikle belirtmek gerekirse memeli hücreleri olabilir. Kullanisli memeli konakçi hücre hatlarinin örnekleri SV40 ile transforme edilmis maymun böbrek CVl hatti (CCS-7, ATCC CRL 1651); insan embriyonik böbrek hatti (süspansiyon kültüründe büyütmek için alt yavru hamster böbrek hücreleri (BHK, ATCC CCL 10); Çin hamsteri over hücreleri/-DHFR maymun böbrek hücreleri (CVl ATCC CCL 70); Afrika yesil maymunu böbrek hücreleri (VERO-76, ATCC CRL-; köpek böbrek hücreleri (MDCK, ATCC CCL 34); sigir/ siçan karaciger hücreleri (BRL 3A, ATCC CRL ; insan karaciger hücreleri (Hep G2, HB ; TRl hücreleri hücreleri; ve insan hepatom hatti (Hep 02) ve ayrica DSM's PERC-6 hücre hattidir. Bu konakçi hücrelerin her birinde kullanimi uygun ekspresyon vektörleri de genel olarak teknikte bilinmektedir. belirtilmelidir. Içine bulusa uygun bir antijen baglayici polipeptidi kodlayan bir ekspresyon vektörünün yerlestirilmis oldugu bütün insan "konakçi hücre" taniminin kesin olarak disinda tutulmaktadir. Antikor Üretimi Önemli bir yönü itibariyla bulusta bulusa ait bir CD70 antikorunun üretilmesine iliskin bir usul de saglanmakta olup, söz konusu usul CD70 antikorunu kodlayan polinükleotidi içeren (örnegin bir ekspresyon vektörü) bir konakçi hücreye (veya hücresiz ekspresyon sistemi) CD70 antikorunun ekspresyonunu mümkün kilan kosullar altinda kültür yapilmasini ve eksprese edilen CD70 antikorunun geri kazanilmasini içerir. Bu rekombinant ekspresyon islemi insanda terapötik kullanimi amaçlanan monoklonal antikorlar dahil olmak üzere bulusa uygun CD70 antikorlarinin büyük ölçekte üretiminde kullanilabilir. In vivo terapötik kullanim için uygun rekombinant antikorlarin büyük ölçekte imalatina iliskin uygun vektörler, hücre hatlari ve üretim islemleri genel olarak teknikte mevcuttur ve uzman kisilerce bilinmektedir. Baska bir yerde belirtildigi gibi, bilhassa burada saglanan CD70 antikorlari, bilhassa Fab dayanan antikorlar büyük ölçekte ticari imalat açisindan özel olarak faydali özellikler sergiler. Özel olarak belirtmek gerekirse, ticari ölçekte bir rekombinant ekspresyon sisteminde elde edilebilen olaganüstü yüksek üretim verimi (4g/L) üretim maliyetlerini çarpici ölçüde azaltacaktir. Tercih edilen düzenlemeler 37°C°de ve ayrica çesitli dondurma-çözme çevriminde test edildiginde, bir klinik ürünün ticari imalati ve depolanmasi açilarindan yine olaganüstü de içeren insan germ hatti islemi yapilmis çesitli varyantlari 27B3'ün kendisi ile karsilastirildiginda gelismis isil stabilite sergiler. Burada insan CD70,e baglanan izole edilmis bir antikor veya bunun antijen baglayici fragmani da açiklanmakta olup, söz konusu antikor veya fragman H6, HI 8, H24, H3 l, H56, seçilen bir Kabat konumundaki en az bir amino asidin bir baska amino asitle sübstitüe edilmis olmasi kaydiyla DIZI ID. NO: 1783de belirtilen amino asit dizisine karsilik gelen bir agir zincir degisken domenini içerir. Bu antikor veya bunun antijen baglayici fragmani, DIZI ID. NO:178"de belirtilen amino asit dizisine sahip bir agir zincir degisken domenini içeren bir antikora veya bunun antij en baglayici fragmanina göre daha yüksek isil stabilite sergileyebilir. L879den olusan gruptan seçilen bir Kabat konumundaki en az bir amino asidin bir baska amino asitle sübstitüe edilmis olmasi kaydiyla DIZI ID. NO:20] ,de belirtilen amino asit dizisine karsilik gelen bir hafif zincir degisken domenini içeren bir CD70 antikoru veya bunun antij en baglayici fragmani da açiklanmaktadir. Bu antikor veya bunun antijen baglayici fragmani DIZI ID. No:2013de belirtilen amino asit dizisine sahip bir agir zincir degisken domenini içeren bir antikora veya bunun antij en baglayici fragmanina göre daha yüksek isil stabilite sergileyebilir. CD70 antikoru veya bunun antij en baglayici fragmani asagidakileri içerebilir: H] 10 ve Hl 12'den olusan gruptan seçilen Kabat konumlarinda bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu içeren DIZI ID. NO:178ide belirtilen amino asit dizisine sahip bir agir zincir degisken domeni; ve ve L87"den olusan gruptan seçilen Kabat konumlarinda bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu içeren DIZI ID. No:201 ,de belirtilen amino asit dizisine sahip bir hafif zincir degisken domeni. Bu antikor veya bunun antijen baglayici fragmani, DIZI ID. NO:178°de belirtilen amino asit dizisine sahip bir agir zincir degisken domenini ve DIZI ID. NO:201°de belirtilen amino asit dizisine sahip bir hafif zincir degisken domenini içeren bir antikora veya bunun antij en baglayici fragmanina göre daha büyük isil stabilite sergileyebilir. CD70 Antikorlarinin Terapötik Kullanisliligi Burada saglanan CD70 antikorlari veya bunlarin antijen baglayici fragmanlari kanserli tüinör hücrelerinin in vi'vo büyümesinin inhibe edilmesinde kullanilabilirler ve dolayisiyla CD70 eksprese eden kanserlerin tedavisinde kullanislidirlar. Dolayisiyla, bulusun diger yönleri bir insan hastada tümör hücresi büyümesinin inhibe edilmesi usullerine ve ayrica kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesi usullerine iliskin olup, buna ihtiyaç duyan bir hastaya burada açiklanan sekilde bir CD70 antikorunun veya antijen baglayici fragmanin terapötik açidan etkili bir miktarinin verilmesini içerir. Bulusun bir baska yönü itibariyla bir insan hastada CD70 eksprese eden tümör hücrelerinin büyümesinin inhibe edilmesinde kullanim için burada açiklanan sekilde bir CD70 antikoru veya antij en baglayici fragman saglanmaktadir. Bulusun yine bir baska yönü itibariyla bir insan hastada kanserin tedavi edilmesinde veya önlenmesinde kullanim için burada açiklanan sekilde bir CD70 antikoru veya antijen baglayici fragman saglanmaktadir. Burada açiklanan CD70 antikorlarini kullanarak büyümesi inhibe edilebilecek tercih edilen kanserler renal kanser (örnegin, renal hücre karsinomu), meme kanseri, beyin tümörleri, kronik veya akut lösemiler, örnegin akut miyeloid lösemi, kronik miyeloid lösemi, akut lenfoblastik lösemi, kronik lenfositik lösemi, lenfomalar (örnegin, Hodgkin ve Hodgkin disi lenfoma, lenfositik lenfoma, primer CNS lenfomasi, T hücreli lenfoma), nazofarenks karsinomlari, melanom (örnegin, metastatik habis melanom), prostat kanseri, kolon kanseri, akciger kanseri, kemik kanseri, pankreas kanseri, cilt kanseri, bas ve boyun kanseri, kutane veya intraoküler habis melanom, rahim kanseri, over kanseri, rektal kanser, anal bölge kanseri, mide kanseri, testis kanseri, rahim kanseri, fallop tüpleri karsinomu, endometriyum karsinomu, serviks karsinomu, vajina karsinomu, vulva karsinomu, özofagus kanseri, ince bagirsak kanseri, endokrin sistem kanseri, tiroid bezi kanseri, paratiroid bezi kanseri, adrenal bezi kanseri, yumusak doku sarkomu, üretra kanseri, penis kanseri, çocukluk çagi kati tümörleri, mesane kanseri, böbrek veya üretra kanseri, renal pelvis karsinomu, merkezi sinir sistemi (CNS) neoplazmasi, tümör anjiyojenezi, omurga eksenli tümör, beyin sapi gliyomu, hipofiz bezi adenomu, Kaposi sarkomu, epidermoid kanser, skuamöz hücreli kanser ve mezotelyomu içerir. Burada açiklanan CD70 antikorlari, CD70 ekSprese eden tümör hücrelerinin mevcudiyeti ile kendini gösteren tümör olusturan bir bozuklugun, örnegin renal hücre karsinomlari (RCC), örnegin berrak hücreli RCC, gliyoblastom, meme kanseri, beyin tümörleri, nazofarinjeal karsinomlar, Hodgkin disi lenfoma (NHL), akut lenfositik lösemi (ALL), kronik Ienfositik lösemi (CLL), Burkitt lenfomasi, anaplastik büyük hücreli lenfomalar (ALCL), mültipl miyelom, kutane T hücreli lenfomalar, nodüler küçük ayrik hücreli lenfomalar, lenfositik lenfomalar, periferik T hücreli lenfomalar, Lennert lenfomalari, immünoblastik lenfomalar, T hücreli lösemi/lenfomalar (ATLL), T hücreli yetiskin lösemisi (T-ALL), entroblastik/sentrositik (cb/cc) foliküler lenfoma kanserleri, B kökenli diffüz büyük hücreli lenfomalar, anjiyoimmünoblastik lenfadenopati (AILD) benzeri T hücreli lenfoma, HIV baglantili karin bosluguna dayanan lenfomalar, embriyonal karsinomlar, rino-farenksin farklilasmamis karsinomlari (örnegin, Schmincke tümörü), Castleman hastaligi, Kaposi sarkomu, mültipl miyelom, Waldenstrom makroglobülinemisi, Manto hücreli lenfoma ve diger B hücreli lenfomalarm görüldügü bir denegin tedavi edilmesinde de kullanilabilir. Özel düzenlemeler yukarida siralanan kanserlerden herhangi birinin lamadan elde edilen F ab dahil germ hatti islemi yapilmis varyantlarindan birini içeren bir antikorla tedavisine iliskindir. Özellikle belirtmek gerekirse, yukarida siralanan kanserlerden herhangi biri insan IgGl ,in sabit bölgeleri ile kaynastirilmis 41D12,nin (27B3'ün germ hatti islemi yapilmis varyanti) Fab bölgelerini içeren bir antikorla tedavi edilebilir. Son bahsedilen düzenlemede, insan IgGl sabit bölgesi antikor efektör islevlerini maksimuma çikartmak için ayrica tasarlanabilir (örnegin nokta mutasyonlar ekleyerek) veya 41D12-IgG1 antikoru yine antikorun efektör islevini güçlendirmek amaciyla fukozillenmemis olabilir. Baska bir yerde belirtildigi gibi, burada açiklanan CD70 antikorlari, bilhassa 27B3 ve bunun10 gerrn hatti islemi yapilmis varyantlari hücre yüzeyinde düsük kopya sayisinda CD70 eksprese eden insan kanser hücresi hatlarina, örnegin büyük B hücreli lenfoma hücre hatti SU-DHL-6, kronik lenfositik lösemi hücre hatti JVM-Z, kutane T hücreli lenfoma hücre hatti HH, gastrik karsinom hücre hatti MKN-45, akciger karsinomu hücre hatlari A549 ve EBC-l, melanom hücre hatlari WM852 ve WM793, gliyoblastom hücre hatti GaMG ve over karsinomu hücre hatlari OAW-42, SKOV3 ve OVCAR37e özellikle kuvvetli baglanma sergiler. Gerçekten, bu düsük kopya sayili kanser hücresi hatlari için afinitesi SGN70 ve MDX1411 gibi önceki teknige ait karsilastirma antikorlarina göre anlamli ölçüde daha yüksektir. Düsük kopya sayili kanser hücre hatlari için "gelismis" afinite ilisikteki örneklerde hücre yükleme deneyleri ile gösterildigi gibi karsilik gelen kanserlerin klinik tedavisi ile dogrudan iliskilidir . Düsük kopya sayili bir hücre hattina (örnegin diffüz büyük B hücreli lenfoma hücre hatti SU-DHL-ö) ait hücreler saglikli donörlerden yeni izole edilmis PBMC"lere yüklendiginde, kanser hücresi hatti hücreleri örnek CD70 antikoru ARGX-l 10 tarafindan tercihe bagli olarak tüketilir. Dolayisiyla, bulusun bir baska yönü kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesi için buna ihtiyaç duyan bir hastaya burada açiklanan sekilde bir CD70 antikorunun veya antijen baglayici fragmanin terapötik açidan etkili bir iniktarinin verilmesini içeren bir usule iliskin olup, burada kanser düsük kopya sayisinda CD70 ekspresyonu gösteren bir kanserdir. Bulusta ayrica bir insan hastada kanserin tedavi edilmesinde veya önlenmesinde kullanim için burada açiklanan sekilde bir CD70 antikoru veya antijen baglayici fragman saglanmakta olup, burada kanser düsük kopya sayisinda CD70 ekspresyonu gösteren bir kanserdir. Bu yönlerin her birinde düsük kopya sayili kanser tercihen büyük B hücreli lenfoma, kronik lenfositik lösemi, kutane T hücreli lenfoma, gastrik kanser, akciger kanseri, melanom, gliyoblastom ve over kanserinden olusan gruptan seçilir. Özel düzenlemeler düsük kopya sayili kanserlerin lamadan elde edilen Fab 27B3'ü veya bunun germ hatti islemi yapilmis varyantlarindan birini, bilhassa 4lD12°yi (ARGX-l 10) içeren bir antikorla tedavi edilmesine iliskindir. Özel olarak belirtmek gerekirse, yukarida siralanan düsük kopya sayili kanserlerden herhangi biri insan IgG1"in sabit bölgeleri ile kaynastirilmis 41D12"nin (27B3iün germ hatti islemi yapilmis varyanti) Fab bölgelerini içeren bir antikorla tedavi edilebilir. Burada açiklanan CD70 antikorlari CD70 ekspresyonu ile kendini gösteren immünolojik10 bozukluklarin tedavisinde de kullanislidir. Bu tür immünolojik bozukluklarin belli basli Örnekleri sunlari içerir: romatoid artrit, otoimmün deiniyelinizan hastaliklar (örnegin, inültipl skleroz, alerjik ensefalomiyelit), endokrin oftalmopatisi, üveoretinit, sistemik lupus eritematoz, miyastenia gravis, Grave hastaligi, glomerülonefrit, otoimmün hepatolojik bozukluk, enflamatuar bagirsak hastaligi (örnegin, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, Çölyak hastaligi), anafilaksi, alerjik reaksiyon, Sjogren sendromu, tip I diabetes mellitus (diyabet), primer biliyer siroz, Wegener granülomatozisi, fibromiyalj i, polimiyozit, dermatomiyozit, çoklu endokrin yetmezligi, Schinidt sendromu, otoimmün üveit, Addison hastaligi, adrenalit, tiroidit, Hashimoto tiroiditi, otoimmün tiroid hastaligi, pernisyöz anemi, gastrik atrofi, kronik hepatit, lupoid hepatit, ateroskleroz, subakut kutane lupus eritematoz, hipoparatiroidizm, Dressier sendromu, otoimmün trombositopeni, idyopatik trombositopenik purpura, hemolitik anemi, pemtigus vulgaris, pemtigus, dermatit herpetiformis, saçkiran, pemfigoid, skleroderma, progresif sistemik skleroz, CREST sendromu (kalsinozis, Raynaud fenomeni, Özofagus motilite bozuklugu, sklerodaktili ve telanjiyektazi), erkek ve kadin otoimmün infertilitesi, ankilozan spondilit, ülseratif kolit, karisik bag dokusu hastaligi, poliarterit nodoza, sistemik nekrotizan vaskülit, atopik dermatit, atopik rinit, Goodpasture sendromu, Chagas hastaligi, sarkoidoz, romatizma atesi, astim, tekrarlayan düsük, fosfolipit, çiftçi akcigeri, eritema multiform, post kardiyotoini sendromu, Gushing sendromu, otoimmün kronik aktif hepatit, kus besleyicisi akcigeri, toksik epidermal nekroliz, Alport sendromu, alveoliti, alerjik alveolit, fibrozis olusturan alveolit, interstisyel akciger hastaligi, eritema nodozum, piyoderma gangrenozum, transiîizyon reaksiyonu, Takayasu arteriti, romatizmal polimiyalji, temporal arterit, sistozoiniyaz, dev hücreli arterit, akariyazis, aspergilloz, Sampter sendromu, egzema, lenfomatoid granülomatoz, Behçet hastaligi, Caplan sendromu, Kawasaki hastaligi, dang, ensefalomiyelit, endokardit, endomiyokardiyal tibroz, endoftalmit, eritema elevatum et diutinum, psöriyazis, eritroblastozis fetalis, eozinofilik fasiitis, Shulman sendromu, Felty sendromu, filaryaz, siklitis, kronik siklitis, heterokronik siklitis, Fuch siklitisi, IgA nefropatisi, Henoch-Schonlein purpurasi, greft versus konakçi hastaligi, transplantasyon reddi, kardiyomiyopati, Eaton-Lambert sendromu, tekrarlayici polikondrit, kriyoglobülinemi, Evan sendromu ve otoimmün gonadal yetmezlik, B lenfosit bozukluklari (örnegin, sistemik lupus eritematoz, Goodpasture sendromu, romatoid artrit ve tip I diyabet), Thl - lenfositler (örnegin, romatoid artrit, mültipl skleroz, psöriyazis, Sjorgren sendromu, Hashimoto tiroiditi, Grave hastaligi, primer biliyer siroz, Wegener granülomatozisi, tüberküloz veya greft versus konakçi hastaligi) veya Th2- lenfositler (örnegin, atopik derrnatit, sistemik lupus eritematoz, atopik astim, rinokonjonktivit, alerjik rinit, Omenn sendromu, sistemik skleroz veya kronik greft versus konakçi hastaligi), Churg Strauss sendromu, mikroskopik polianjeit ve Takayasu arteriti. Özel düzenlemeler yukarida siralanan immünolojik bozukluklardan herhangi birinin lamadan elde edilen F ab dahil germ hatti islemi yapilmis varyantlarindan birini içeren bir antikorla tedavisine iliskindir. Özellikle belirtmek gerekirse, yukarida siralanan kanserlerden herhangi biri insan IgGl `in sabit bölgeleri ile kaynastirilmis 4lD123nin (27B3"ün germ hatti islemi yapilmis varyanti) Fab bölgelerini içeren bir antikorla tedavi edilebilir. Son bahsedilen düzenlemede, insan IgGl sabit bölgesi antikor efektör islevlerini maksimuma çikartmak için ayrica tasarlanabilir (örnegin nokta mutasyonlar ekleyerek) veya 41D12-IgG1 antikoru yine antikorun efektör islevini güçlendirmek amaciyla fukozillenmemis olabilir. Burada kullanildigi sekliyle, "tedavi etme" veya "tedavi" terimi bir semptomun, bozuklugun, rahatsizligin veya hastaligin yavaslatilmasi, kesintiye ugratilmasi, durdurulmasi, kontrol altina alinmasi, iyilestirilmesi, sonlandirilmasi, ciddiyetinin azaltilmasi anlamina gelir ancak hastalikla baglantili tüm semptomlarin, rahatsizliklarin veya bozukluklarin topluca yok edilmesini içermesi sart degildir. Insanda terapötik kullanim söz konusu oldugunda burada açiklanan CD70 antikorlari tedaviye ihtiyaç duyan bir insan denege "etkili bir miktar"da verilebilir. "Etkili miktar" terimi bir CD70 antikorunun, bir insan hastaya tek veya çoklu dozda verildiginde hastaligin tedavisinde terapötik etkinlik saglayan miktarina veya dozuna karsilik gelir. CD70 antikorunun terapötik açidan etkili miktarlari her tek doz için yaklasik 0.1 mg/kg ila yaklasik 20 mg/kg araliginda bir miktari içerebilir. Ayri ayri her hasta için terapötik olarak etkili bir miktari CD70 antikorunun bir biyomarkör, örnegin tümörlü dokularda hücre yüzeyi CD70,i veya bir semptom, örnegin tümör regresyonu, vb. üzerindeki etkisini izleyerek saglik uzmanlari belirleyebilir. Belli bir zaman noktasinda verilen antikor miktari ister tek basina, ister bir baska terapötik madde ile kombinasyon halinde kullanilsin tedavi süreci boyunca CD70 antikorunun optimal miktarlarda verilmesini saglayacak sekilde çesitlendirilebilir. Burada açiklanan CD70 antikorlarinin veya bu antikorlari içeren farinasötik bilesimlerin, herhangi bir baska kanser tedavisi ile kombinasyon halinde bir kombinasyon tedavisi olarak verilmesi de düsünülmüstür. CD70 Eksprese Eden Hücreleri Tüketmek Için Çok Az Internalize Olan Antikorlarin Kullanilmasi Burada açiklanan sasirtici bir bulgu kanser hücresi hatlarinin yüzeyinde eksprese olan CD70ie baglanmis CD70 antikorlarinin çok az internalize olmasidir. Daha önceleri önceki teknikte CD70°in "internalize olan hedef" olarak tanimlanmis olmasi nedeniyle bu sasirtici bir sonuçtur. Her ne kadar farkli kanser hücresi türleri arasinda baglanan CD70 antikorlarinin tam internalizasyon derecesi bakimindan çesitlilik olsa da, hiçbir kanser hücresi türünün baglanan CD70 antikorunu "tamamen internalize" ettigi gözlemlenmemistir. Örnegin, daha önce hizla internalize eden renal kanser hücresi hatlarinin aslinda baglanmis antikor ARGX-110°un maksimum yaklasik %70iini internalize ettikleri gösterilmistir. Diger birçok kanser hücresi azini internalize eder. Farkli kanser hücresi hatlari arasinda internalizasyon derecesinde görülen çesitlilik büyük Ölçüde hastalik endikasyonuna baglidir ve farkli CD70 antikorlari kullanildiginda benzer sonuçlar gözlemlenmistir. Bununla birlikte, antikor ARGX-l 10 kullanildiginda bazi hücre hatlarinda çok az internalizasyon oldugu özel olarak gözlemlenmistir. Birçok kanser hücresinde gözlemlenen düsük internalizasyon derecesi kanser hücrelerinin in vi'vo tüketilmesi (örnegin öldürülmesi veya büyümelerinin inhibe edilmesi) için kuvvetli efektör islevi olan CD70 antikorlarinin kullanimina gerekçe saglar. Baglanan CD70 antikorlarinin birçok kanser hücresinde görece zayif internalize olmalari nedeniyle antikor hücre yüzeyine bagli kalacak ve bu sayede bir insan hastanin immün sistemiyle gerçeklesen etkilesimlerle efektör islevleri (ADCC, CDC, ADCP) tetikleyebilecektir. Buna bagli olarak, burada bir insan hastada CD70 eksprese eden hücrelerin tüketilmesine yönelik bir usul açiklanmakta olup, bu usul söz konusu hastaya insan CD703e baglanan bir antikorun etkili bir miktarinin verilmesini içerir, burada söz konusu CD70 eksprese eden hücreler 6 saatlik bir süre sonrasinda söz konusu antikora iliskin %30 veya daha az, %25 veya internalizasyon sergiler ve burada söz konusu antikor ADCC, CDC ve ADCPîden olusan gruptan seçilen en az bir efektör islev sergiler. Bu usulde, CD70 antikoru (etkin efektör islevleri olan) CD70 eksprese eden hücrelerin tüketilmesi'nde kullanilir. CD70 eksprese eden hücrelerin bu sekilde tüketilmesi terapötik veya profilaktik tedavi, örnegin CD70 eksprese eden kanserlerin tedavisi veya önlenmesi veya CD70 ile baglantili immünolojik bozukluklarin tedavisi veya önlenmesi için temel olusturabilir. CD70 eksprese eden antikorlarin tüketilmesine iliskin kesin mekanizma CD70 antikorunun sergiledigi efektör islevlerin türüne bagli olabilir ancak baglanan antikorun zayif internalizasyonu ile birlikte CD70 antikorunun hücre yüzeyinde CD70,e kuvvetli (yüksek afiniteli) baglanmasina da bagli olacaktir. Bazi düzenlemelerde CD70 eksprese eden hücreler CD70 eksprese eden kanser hücreleridir. Özellikle belirtmek gerekirse, CD70 eksprese eden kanser hücreleri Burkitt lenfomasi, büyük B hücreli lenfoma, Hodgkin lenfomasi, Hodgkin disi lenfoma, manto hücreli lenfoma, kronik lenfositik lösemi, pankreas karsinomu, gastrik karsinom, gliyoblastom ve akciger karsinomundan olusan gruptan seçilen bir kanser türü olabilir. Bu kanserlerin her birinden elde edilen hücre hatlarinin 6 saatlik bir süre içinde baglanmis CD70 antikorunun %30°unu veya daha azini intemalize ettigi kanitlanmistir. Bir baska düzenlemede CD70 eksprese eden kanser hücreleri Burkitt lenfomasi, büyük B hücreli lenfoma, Hodgkin lenfomasi, Hodgkin disi lenfoma, manto hücreli lenfoma, kronik lenfositik lösemi, gastrik karsinom, gliyoblastom ve akciger karsinomundan olusan gruptan seçilen bir kanser türü olabilir. Bu kanserlerin her birinden elde edilen hücre hatlarinin 6 saatlik bir süre içinde baglanmis CD70 antikorunun eksprese eden kanser hücreleri Burkitt lenfomasi, büyük B hücreli lenfoma, manto hücreli lenfoma, kronik lenfositik lösemi, gastrik karsinom ve akciger karsinomundan olusan gruptan seçilen bir kanser türü olabilir. Bu kanserlerin her birinden elde edilen hücre hatlarinin 6 saatlik bir süre içinde baglanmis CD70 antikorunun %10,unu veya daha azini intemalize ettigi kanitlanmistir.. Baska düzenlemelerde CD70 eksprese eden hücreler baglanmis CD70 antikorlarina iliskin tespit edilebilir bir intemalizasyon sergilemeyen (özellikle belirtmek gerekirse 6 saatlik bir sürede ARGX-l 10 internalizasyonu gözlemlenmemistir) CD70 eksprese eden etkinlesmis T hücreleri olabilir. Baglanmis CD70 antikorlarinin CD70+ etkinlesmis T hücreleri tarafindan internalize edilmedi'kleri'ne iliskin bu gözlem, kuvvetli efektör islevi (ADCC, CDC veya ADCP) olan CD70 antikorlarinin, örnegin bununla sinirli olmamak kaydiyla ARGX-l lOlun örnegin romatoid artrit, psöriyazis, SLE, vb. gibi otoiminün bozukluklari içeren CD70+ etkinlesmis T hücreleri araciligiyla olusan immünolojik hastaliklarin tedavisinde kullanimini güçlü sekilde desteklemektedir. Yukarida siralanan düzenlemelerde esas itibariyla herhangi bir CD70 antikoru kullanilabilir. Özel düzenlemelerde antikor Raji, SU-DHL-ö, MHHPREBl, Mino, Mecl , JVM-Z, MKN-45, seçilen CD70 eksprese eden bir kanser hücresi hattinda 6 saatlik bir süre sonrasinda %30 veya veya daha az intemalizasyon sergiledigi deneysel olarak gösterilmis herhangi bir CD70 antikoru olabilir. Aslinda, ilisikteki örneklerde açiklanan hücre hatti internalizasyon analizi, kuvvetli efektör isleve sahip CD70 antikorlariyla veya CD70 antikoru-ilaç konjugatlariyla (asagida açiklanan) belli hastalik endikasyonlarinin hedeflenip hedeflenemeyeceginin belirlenmesinde ve ayrica belli hastalik endikasyonlarinin tedavi edilmesi için uygun CD70 antikorlarinin tanimlaninasinda bir tarama olarak kullanilabilir. Dolayisiyla, burada bir insan hastada CD70 eksprese eden kanser hücrelerinin tüketilmesine iliskin olarak söz konusu hastaya insan CD70"e baglanan bir antikorun etkili bir miktarda verilmesini içeren bir usul de açiklanmakta olupi burada SÖZ konusu antikor Raji, SU-DHL-6, Granta 519, Rec-l ve EBC-l ,den olusan gruptan seçilen CD70 eksprese eden bir kanser hücresi hattinda 6 saat bir sürenin ardindan %30 veya daha az internalizasyon sergiler ve burada söz konusu antikor ADCC, CDC ve ADCP"den olusan gruptan seçilen en az bir efektör islev sergiler. Bir düzenlemede bir insan hastada CD70 eksprese eden kanser hücrelerinin tüketilmesinde kullanilacak antikor Raji, SU-DHL-ö, Granta 519, Rec-l, Mecl, JVM-2, MKN-45, A549 ve EBC-l 'den olusan gruptan seçilen CD70 eksprese eden bir kanser hücresi hattinda 6 saatlik bir sürenin ardindan %10 veya daha az intemalizasyon sergileyen ve ayrica ADCC, CDC ve ADCP'den olusan gruptan seçilen en az bir efektör islev sergileyen bir antikor olabilir. Özel düzenlemelerde insan CD70"e olaganüstü yüksek afîniteyle baglanan burada açiklanan CD70 antikorlarindan herhangi biri kullanilabilir. Tercih edilen düzenlemelerde lainadan elde edilen F ab 27B3,ü veya bunun germ hatti islemi yapilmis varyantlarindan birini, özellikle içeren bir antikor kullanilabilir. Özellikle tercih edilen düzenlemelerde insan IgG1°in sabit bölgeleri ile kaynastirilmis 41D12 (27B33ün gerrn hatti islemi yapilmis varyanti) Fab bölgelerini içeren bir antikor kullanilir. Son bahsedilen düzenlemede, insan (örnegin nokta mutasyonlar ekleyerek) veya 41Dl2-IgGl antikoru yine antikorun efektör islevini güçlendirmek amaciyla ûikozillenmemis olabilir CD70 eksprese eden hücrelerin tüketilmesinde çok az intemalize olan CD70 antikorlarinin kullanilmasinin arkasinda yatan mantik antikorun efektör islevlerine dayandigi için bu usulde kullanilan antikorlarin, CD70 antikorunun bir farmasötik maddeye, sitotoksik maddeye,10 sitostatik maddeye, ilaç parçasina ve benzerine baglanmis oldugu immünokonjugatlar olmamasl tercih edilir. Aslinda, bu usulün sagladigi özel bir avantaj antikor-ilaç konjugatlarinin kullanilmasina ihtiyaç duyulmamasidir, ki bu hem hasta güvenligi açisindan (potansiyel toksik maddelerin verilmesinden kaçinilmasi), hem ekonomik açidan (antikor-ilaç konjugatlarinin maliyetli sentezinden kaçinilmasi) arzu edilen bir durumdur. Anlamli CD70 Antikoru Internalizasvonu Olan Hücrelerin Öldürülmesinde Antikor- Ilaç Koniugatlarmin Kullanimi Mevcut örneklerde CD70 antikorlarinin intemalizasyon derecesinde hücreden hücreye anlamli farkliliklar oldugu ve bu farkliliklarin büyük oranda CD70 antikorunun yapisindan ziyade hücre türüne bagli oldugu (her ne kadar ARGX-l 10 antikoru kullanildiginda farkliliklar özellikle belirgin olsa da) gösterilmektedir. Baglanmis CD70 antikoru için anlamll l bir intemalizasyon derecesi, yani 6 saat sonra %30 veya daha fazla, tercihen %40 veya daha fazla, daha tercihen %50 veya daha fazla veya hatta %60 veya daha fazla intemalizasyon sergileyen hücre türleri söz konusu oldugunda, alternatif bir terapötik strateji CD70 antikoru- ilaç konjugatlarinin kullanilmasina dayandlîlÜIabilir.. Dolayisiyla, burada bir insan hastada CD70 eksprese eden hücrelerin tüketilmesi için söz konusu hastaya insan CD70,e baglanan bir antikor ve bir sitotoksik veya sitostatik ilaç parçasi içeren bir antikor-ilaç konjugatinin etkili bir miktarinin verilmesini içeren bir usul açiklanmakta olup, burada CD70 eksprese eden söz konusu hücreler 6 saat bir süre sonrasinda insan CD70"e baglanan söz konusu antikor için %30 veya daha fazla, %40 veya daha fazla, Özel düzenlemelerde CD70 eksprese eden hücreler 6 saatlik bir süre içinde antikor-ilaç Bu usulde, CD70 antikoru-ilaç konjugati CD70 eksprese eden hücrelerin tüketilmesinde kullanilir. CD70 eksprese eden hücrelerin bu sekilde tüketilmesi terapötik veya profilaktik tedavi, örnegin CD70 eksprese eden kanserlerin tedavisi veya önlenmesi veya CD70 ile baglantili iinmünolojik bozukluklarin tedavisi veya önlenmesi için temel olusturabilir. CD70 eksprese eden antikorlarin tüketilmesine iliskin kesin mekanizma, antikor-ilaç konjugatinin yapisina, yani "ilaç" parçasinin sitotoksik veya sitostatik olup olmadigina bagli olabilir ancak baglanan antikorun kuvvetli intemalizasyonu ile birlikte CD70 antikorunun hücre yüzeyinde CD70'e kuvvetli (yüksek afiniteli) baglanmasina da bagli olacaktir. Bazi düzenlemelerde CD70 eksprese eden hücreler CD70 eksprese eden kanser hücreleridir. Özellikle belirtmek gerekirse, CD70 eksprese eden kanser hücreleri kutane T hücreli lenfoma, mültipl miyelom, renal hücre karsinomu, astrositom, melanom ve over karsinomundan olusan gruptan seçilen bir kanser türünden olabilir. Bu kanserlerin her birinden elde edilen hücre hatlarinin 6 saatlik bir süre içinde baglanmis CD70 antikorunun %30sundan fazlasini internalize ettigi kanitlanmistir. Bir baska düzenlemede, CD70 eksprese eden kanser hücreleri renal hücre karsinomu, astrositom, melanom ve over karsinomundan olusan gruptan seçilen bir kanser türünden olabilir. Bu kanserlerin her birinden elde edilen hücre hatlarinin 6 saatlik bir süre içinde baglanmis CD70 antikorunun %507sinden fazlasini internalize ettigi kanitlanmistir. Bulusun bu yönüne iliskin özel düzenlemelerde, antikor-ilaç konjugati insan CD70,e olaganüstü yüksek afiniteyle baglanan burada açiklanan CD70 antikorlarindan herhangi birine dayanabilir. Tercih edilen düzenlemelerde antikor-ilaç konjugati lamadan elde edilen Fab 27B3`ü veya bunun germ hatti islemi yapilmis varyantlarindan birini, özellikle 41D12°yi içeren bir antikora dayanabilir. Insanda terapötik kullanimi amaçlanan antikor-ilaç konj ugatlarinin özellikleri, bilhassa "ilaç" parçasinin yapisi, örnegin sitotoksik veya sitostatik bir madde olmasina ve ilaç parçasinin CD70 antikoru parçasina konjugasyonuna iliskin özellikler genel olarak teknikte bilinmektedir. CD70 antikoru-ilaç konjugatlarinin örnekleri, Farmasötik Bilesimler Bulusun kapsami, bulusa ait CD70 antikorlarindan veya bunlarin antijen baglayici fragmanlarindan birini veya bunlarin bir kombinasyonunu içeren ve bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici veya eksipiyanla birlikte formüle edilen farinasötik bilesimleri içermektedir. Bu bilesimler CD70 antikorlarininin birini veya bir kombinasyonunu (örnegin, iki veya daha farkli) içerebilir. Insanda terapötik kullanima yönelik antikorlari formüle etme teknikleri teknikte gayet iyi bilinmektedir ve örnegin Wang ve digerleri, Journal of Phannaceutical Sciences, Cilt 96, s. 1- 26, 2007 referansinda incelenmektedir. Örnekler Bulus asagida verilen sinirlayici olmayan deneysel örneklere gönderme yaparak daha iyi anlasilacaktir. Örnek 1: Lamalarin Bagisiklanmasi Lamalarin bagisiklanmasi ve periferik kan lenfositlerinin (PBL) toplanmasi ve ayrica ardindan RNA özütlemesi ve antikor fragmanlarinin amplifikasyonu De Haard ve sekilde gerçeklestirildi. Iki lama CD70 eksprese eden ve iki lama CD70 eksprese eden Raji hücreleriyle (ATCC-CCL-86) bagisiklandi. Hücreler her bagisiklama için yeni hazirlandi ve FACS analiziyle CD70 ekspresyonu teyit edildi. Lamalar alti hafta boyunca haftada bir intramüsküler yoldan boyna enjekte edilen yaklasik olarak 107 canli hücreyle bagisiklandi. Hücresel bagisiklama alanindan birkaç santimetre ötede boyun kaslarina Tam Olmayan Freund Adjuvanti enjekte edildi. Immün yaniti arastirmak için bagisiklama öncesinde ve sonrasinda 10 ml"lik kan numuneleri toplandi. Lama serumlari bagisiklama öncesinde (0. gün) ve sonrasinda (55. veya 69. gün) ELlSA ile rekombinant CD70 antikorlarinin (Flag-TNC-CD70) mevcudiyeti açisindan test edildi. Tespit antikoru olarak konvansiyonel ve agir zincir antikorlari arasinda ayrim yapmayan, yani ölçülen CD70 yanitinin total IgG'ye ait oldugu anlamina gelen keçi anti- llama IgGl/Z (Bethyl, A160-100P) kullanildigi belirtilmelidir. Sonuçlar Sekil 1'de gösterilmektedir. Son bagisiklamadan üç ila dört gün sonra PBL"leri izole etmek için bir Ficoll-Paque gradientini ve RNA°y1 hazirlamak için Chomczynski P ve digerleri, Anal. Biochem. 162: 156- ml kan toplandi. Ortalama olarak, 450 ug RNA verimi elde edilmis olup, bunun 80 ug71ik bir temsili miktari rastgele CDNA sentezi ve ardindan VHCH] , VÄCÄ ve VKCK gen kesitlerinin amplifikasyonu için kullanildi. Örnek 2: Kütüphane Olusturma Bagimsiz VKCK ve VKCK kütüphaneleri isaretlenmemis primerlerle 25 çevrimin ve ardindan bu primerlerin isaretlenmis çesidi ile 10 çevirimin yapildigi iki asamali bir PCR kullanarak olusturuldu (De Haard H ve digerleri, Biol. Chem. 274, 1999). VHCHl kütüphaneleri ayni yaklasimi kullanarak parelel sekilde yapildi. Ayri ayri her kütüphanenin boyutlari 107 ve 10[0 cfu arasinda oldu. Bunun ardindan, VKCK ve VKCK kütüphanelerine ait hafif zincirler ayri olarak VHCHl eksprese eden vektöre yeniden klonlanarak sirasiyla "Lambda" ve "Kappa" lama Fab-kütüphanesi yaratildi. Alternatif olarak sindirilmis VHCHl amplikonlar ayri bir VHCHl kütüphanesi olusturrnaktan kaçinarak dogrudan VKCK ve VÄCÄ kütüphanelerine klonlandi. Hafif zincir karilmasi genel olarak agir zincir karilmasinin sagladigina göre daha iyi afinite varyantlari sagladigi için önceden klonlanmis hafif zincir kütüphaneleri olusturmayi ve agir zincir amplikonlarini dogrudan bu primer repertuvarlarina klonlainayi tercih ettik. Nihai faj gösterimi kütüphaneleri 5X108 ve 2)(109 cfu arasinda oldu. PCR kullanarak kütüphanelerde klonlari içeren tam boy F ab yüzdesinin analiz edilmesiyle rutin sekilde kalite kontrolü gerçeklestirildi. Örnek 3: Seçimler ve Tarama Yakalanmis rekombinant CD70 (Flag-TNC-CD70) veya dogrudan kaplanmis CD70 üzerinde standart protokolleri kullanarak iki ila üç tur faj seçimi yapildi. Baglanmis faj elüsyonu tripsinle yapildi. TGl "e transfekte edilmis seçilen faj dan 96 kuyueuklu plakalarda büyütmek üzere rastgele ayri koloniler seçildi. Standart protokollere göre IPTG indüksiyonu sonrasinda Fab içeren periplazmik fraksiyonlar (peris) hazirlandi. Tüm seçimlerde ve dört lamanin tamami için inhibisyon ELISA*si ile belirlendigi üzere CD27 ve CD70 arasindaki etkilesimi inhibe edebilen F abileri eksprese etme kapasitesine sahip çesitli klonlar oldugu bulundu (Sekil 2 ve 3). Bu analizde, Flag-TNC-CD70 bir anti-Flag mAb ile yakalandi ve CD27-Fe baglanmasi CD70 Fab,lerin (Sekil 2 ve 3) veya CD70 mAb,lerin (Sekil 4) yoklugunda veya mevcudiyetinde biyotinleninis bir anti-CD27 mAb ve strep-HRP vasitasiyla tespit edildi. Sekil 2B"de 9D] ile özdes bir VH°ye sahip ancak belli ölçüde farkli bir hafif zincir içeren 27B3'ün CD27°nin CD70°e baglanmasini daha etkili bloke eder gibi durdugu görülebilmektedir, ki bu Biacore ile ölçüldügünde (veri gösterilmiyor) bu Fab,nin daha iyi ayrisma hizina sahip olmasiyla paralellik gösterir. Tablo 3"te CD70 inhibisyonu ELlSA,sinda test edilen çesitli lama-insan kimerik mAbilerine iliskin bloke etme gücü (lC50 olarak ifade lama-insan lgGl olarak düzenlendiginde daha da iyilesip 0.25 nM bir IC50 verir, diger hafif zincire sahip mAb 9D] ise 3 kat daha az güçlüdür (. Sekil 3 lama CD70 Fabllerinin blokaj etkinligi (inhibisyon ELISA"sinda, bakiniz beyaz çubuklar) ve CD70 baglanmasi (baglayici ELISA, siyah çubuklar) açisindan test edildigi bir deneyin bileskesidir. Baglayici ELISAida, Flag-TNC-CD70 bir anti-F lag mAb ile yakalanir ve Fab7lerin baglanmasi Fd fragmaninin C terminaline kaynastirilmis MYC isaretini taniyan bir anti-myc-HRP mAb kullanarak tespit edilir. Karsilastirma amaciyla CD70,e yönelik bilinen monoklonal antikorlar belgede Sekil 5A ve SB,de açiklanan MDX69A7) paralel test edildi. ELlSA,da saf baglanma gösteren ve bloke edici olmayan lainadan elde edilmis çesitli Fab klonlarl tanimlandi (bakiniz ilgi çekici olan F ab olarak bloke edici etkinligi olmayan ancak bir kimerik 1gG9ye dönüstürüldügünde antagonistik olan 59D10 klonudur (bakiniz Tablo 3). Lamadan elde edilen baglayici ve bloke edici Fab klonlarinin VH ve VL domenlerine ait amino asit dizileri burada baska bir yerde gösterilmektedir (Tablo 6 - 9). Tablo 3: Münferit SIMPLE antikorlarina (mAbiler) ve Karsilastirma SGN70 ve MDX69A7,ye Iliskin Rekombinant Insan CD70 Kullanarak CD70 Inhibisyonu ELISA,sinda Ölçülen ve [C50 (ng/ml) Olarak Ifade Edilen Bloke Etme Gücü mAb IC50 (ng/ml) 9D] 109 5F4 296 9E1 1400 902 40 9B2 126 4D2 254 24D4 34 24B6 420 27B3 38 19G10 75 57B6 154 59D10 107 mAb 27B3 ve 57B6 da al yanakli maymun rekombinant CD70 (FLAG-TNC-al yanakli maymun CD70) ve CD27 arasindaki etkilesimi inhibe etme kapasiteleri bakimindan test edildi. Yukarida açiklanan inhibisyon ELISA"si ile hesaplanan IC50 degeri sirasiyla 150 ve 135 ng/ml oldu. Örnek 4: Insan ve Al Yanakll Maymun CD70,ine Iliskin Aflnite Lamadan elde edilen anti-CD70 bloke edici saflastirilmis Fab`lerin ayrisma hizlari Biacore kullanarak hesaplandi. Rekombinant insan CD70 bir CMS Biacore çipi üzerinde sabitlendi. Sabitleme Biacore tarafindan saglanan bir usule göre ve NHS/EDC kitini (Biacore AB) kullanarak gerçeklestirildi: çipin etkinlestirilmesinden sonra pH,1 5 olan 10 mM asetat tampon içinde 50 tig/ml bir rekoinbinant CD70 çözeltisi hazirlandi ve bu çözeltinin lulisi (50 ng) enjekte edilerek yaklasik olarak 1000 RU bir yüzey yogunlugu ortaya çikartildi. CD70 mAb"leri ARGX-l 10, MDX2H5 ve SGN70'e iliskin Fab"ler tripsin sindirimiyle hazirlandi (SGN70 ve MDX69A7 burada baska yerde açiklanmaktadir, MDX1411 olarak da Yaklasik olarak 100-400 tig/ml bir konsantrasyondaki Fab Hepes-tamponlu salin (0.1M Hepes, içinde 6 kat seyreltildi. Enjekte edildiler (30 al) ve 30 ul/dk bir akis hizinda akis hücrelerinden geçirildiler. Fabsnin CD70'e baglanmasindan sonra ayrisma hizi 10 dakika bir süre izlendi. Ayrisma sonrasinda akan hücre yüzeyleri 5 ;41 10 mM NaOH enjekte ederek yenilendi. Bazen Fabilerin afinitesine bagli olarak yüzeylerin yenilenmesi için çok sayida NaOH enjeksiyonuna ihtiyaç duyulur. Ayrisma hizi analizi BlAevaluation yazilimina basvurarak yapildi. Önce bos akislar sensogrami kaplanmis akis hücresiyle elde edilenlerden çikartildi. Daha sonra Fit Kinetics uygulamasini kullanarak 10 dakikalik bir zaman araliginda ayrisma hizi belirlendi ve Kd degeri hesaplandi. Ayrica CD70 için CD27,nin ayrisma hizi da belirlendi. Ayrisma hizlari Tablo 4,te özetlenmektedir. Lamadan elde edilmis test edilen tüm Fab,ler 0.4-4.8 X 10'4 s1 araliginda Biacore ayrisma hizlarina bakildiginda insan rekombinant CD70,e ve al yanakli maymun rekombinant CD70°e bariz ölçüde çok düsük ayrisma hizlariyla (yani yüksek afiniteyle) baglanmistir. Lamadan elde edilen Fabllerin insan CD70 için ayrisma hizlari referans mAb"den elde edilen Fab°ler için olandan (7-30 X 10'4 s") çok daha iyidir. En iyi ayrisma hizlarina sahip lamadan elde edilen Fab51erin CD70 ile etkilesimi açisindan CD27'ninkilerle karsilastirilabilir ayrisma hizlarina (0.8 X 10*4 sil) sahip olduklari gösterilmistir. Biacore kullanarak yapilan ayrisma hizlari ölçümüne iliskin alt sinirin 0.4 X 10'4 s'1 civarinda oldugu belirtilmelidir. Dolayisiyla Biacore ile degerlendirildiginde bu sinira yakin ayrisma hizlari olan lamadan elde edilen Fab,ler aslinda CD70 için daha da yüksek bir afinite sergileyebilir. Tablo 4: Lamadan Elde Edilen Fab,lerin ve Referans Fab,lerin Insan veya Al Yanakli Maymun CD70 Için Ayrisma Hizlari Test Edilen Fab km (s`i) x E`4 insan CD70 km (5") X E`4 al yanakli maymun CD70 SGN70-F ab 7.0 MDXZHS-F ab 17 Baglanma yok MDX69A7-Fab 30 Test Edilen F ab koff (s'l) X E'4 insan CD70 koff (5") x E'4 al yanakli maymun CD70 CD27 0.8 1C2 0.4 3.2 9D] 4.8 2.0 902 1.8 1.8 5F4 0.8 5.0 9151 1.9 2.0 9B2 2.8 6.1 4D2 3.3 2.9 27B3 0.8 24133 0.8 33D8 4.5 24F2 1.6 24B6 1.0 19010 0.8 8812 3.6 45Bl2 2.1 45D9 2.1 45F8 2.0 57B6 1.0 0.4 59D10 13.9 Baglanma yok Örnek 5: Kimerik Lama-Insan CD70 mAb,lerin CD70 Pozitif Hücrelere Baglanmasi Söz konusu lamadan elde edilen Fab klonlarina ait VH ve VL insan lgGl sabit bölgelerine ve insan Cklya (degisken hafif zincir bölgelerinin tamami lambda kökenli) kaynastirildi ve WO antikorlar seklinde üretildi. Kimerik lama-insan mAb'leri Protein A'da saflastirildi, ardindan jel filtrasyonu yapildi. 786-0 hücreleri 1/5 seyreltme serilerinde kimerik lama-insan CD70 inhibe edici mAbilerle (20 ng/ml - 0.25 ng/ml) inkübe edildi ve mAb°lerin hücrelere baglanmasi bir anti-insan Fc- FITC antikoru (Binding Site firmasindan 1/500 seyreltilmis konjugat AF006) kullanarak tespit edildi. 10,000 hücre/kosul Iloresansi bir akis sitometresi kullanarak ölçüldü ve ortalama floresans isaretlendi. Sonuçlar Sekil 5'te gösterilmektedir. mAb71erin çogu yüksek afiniteyle 786-0 hücrelerine baglandi . Tipki Fab gibi en iyi ayrisma hizina ve bloke etme gücüne sahip oldugu gösterilmis SIMPLE antikoru 1C2 hücre yüzeyinde eksprese olan CD70*i taniyamadi (veri gösterilmiyor) ve dolayisiyla daha fazla incelenmedi. SIMPLE antikoru 2783 0.24 nM bir EC50 ile hücreye bagli reseptör için en iyi atîniteye sahiptir. Bir baska deneyde, NHL1den elde edilen MHH-PREB-l hücreleri (105 hücre) kimerik lama- insan CD70 inhibe edici mAbilerden bir konsantrasyon gradienti ile (20 ng/ml- 0.25 ng/ml) inkübe edildi ve mAb,lerin hücrelere baglanmasi anti-insan IgG-FITC antikorunu kullanarak Örnek 6: Kimerik Lama-Insan CD70 mAb°lerivle Ortak Kültür Denevlerinde lnhibisyon Hücre bazli bir analizde bloke etme gücünün belirlenmesi için Wyzgol ve meslektaslari transfekte edilen fibrosarkom hücre hatti HT1080 trimerik rekombinant CD70 ile baglandiginda 1L-8 salgilar ve bu etkilesimin nötralize edici bir mAb ile bloke edilmesi düsük sitokin seviyeleriyle ölçülebilir. Analizin, molekülün hücre yüzeyinde eksprese olmasina ve dolayisiyla çözünür CD70,ten daha uygun olmasina ragmen B hücreli lenfoma Raj i hücre hattinin CD70 kaynagi islevini gördügü modifiye bir çesitlemesi kullanilmistir. Raji hücreler kültür edildi ve FACS analiziyle CD70 ekspresyonu kontrol edildi. Daha sonra hücreler 96 kuyucuklu bir doku kültürü plakasinda (50,000 hücre/kuyucuk) anti-CD70 mAb71erle karistirildi ve 1 saat oda sicakliginda inkübe edildi. HT1080-CD27 hücreleri eklendi (10,000 hücre/kuyucuk) ve iyice karistirildi. Ortak kültürler inkübatöre aktarildi ve gece boyunca 37°Cide büyütüldü. Üst fazlar toplandi ve ELISA ile IL-8 içerikleri analiz edildi. SIMPLE antikorlarina iliskin sonuçlar Sekil 6'da gösterilmekte ve referans CD70 mAb"1erle karsilastirilmaktadir. Kimerik lama-insan CD70 mAb`lere iliskin lC50 degerleri, arasinda olmustur (Bakiniz Tablo 5). SIMPLE antikorlari ve 902 (20 pM karsilastirma MDX69A7"den (1 nM) 3 kat daha güçlüdür. Dolayisiyla kimerik lama-insan mAb°lerin CD27 ve CD70 arasindaki etkilesimi bloke etmek açisindan olaganüstü güçlü olduklari ve konuya oldukça uygun bu biyoanalizde karsilastirma antikorlarindan daha üstün olduklari sonuçu çikartilabilecektir. Tablo 5: Raji Bazli Ortak Kültür Analizinde Test Edilen Kimerik Lama-Insan CD7010 mAb"lerin ve Referans mAb,lerin IC50 Degeri (ng/ml) Olarak Ifade Edilen Nötralize Edici Gücü mAb IC50 (ng/ml) 9D1 29 5F4 32 9B2 213 4D2 54 9E1 517 582 19 27B3 5 19G10 16 59D10 10 Örnek 7: Antil_<0ra Bagli Hücresel Sitotoksisite Etkinligi Antikora Bagli Hücresel Sitotoksisite (ADCC) McEarchem ve digerleri (Blood (2007) 109: periferik kan mononüklecr hücreleri (PBMC) standart Ficoll ayirrnasi i1e heparinize tam kandan saflastirildi ve NK hücreler (yani efektör hücreler) kaynagi olarak kullanildi. Birkaç bagimsiz donörün kani kullanildi. Hücreler 200 U/ml insan lL-2 (NK hücrelerin uyarilmasi için) içeren besi ortaminda 2x106 /ml süspanse edildi ve gece boyunca 37°C`de inkübe edildi. Ertesi gün yapisan ve yapismayan hücreler toplandi ve bir kere kültür besi ortaminda yikandi. Hedef hücreler oldu ve Cr5 ' ile isaretlendi. Hedef/efektör hücre orani 1:20 oldu ve kültür besi ortaminda farkli konsantrasyonlarda antikor mevcudiyetiyle 2 saat inkübasyon gerçeklestirildi. Kimerik lama-insan mAb"leri ve karsilastirma antikorlari farkli konsantrasyonlarda 786-0 hücreleri üzerinde ADCC etkinligi açisindan test edildi. Liziz yüzdesi asagidaki denklemle belirlendi: Liziz % isi' = (numune CPM-spontcm sal Eh CPM)/(maksimum sal @1 CPM-Spontan sal @1 Sonuçlar kimerik lama-insan mAb°1erinin tamaminin ADCC etkinligi yoluyla hedef10 hücrelerin lizizini indüklediklerini göstermektedir (Sekil 7). SIMPLE mAb 27B3 l ug/ml civarinda bir güce sahiptir ve dolayisiyla karsilastirma SGN70 ile karsilastirilabilir bir lC50"ye sahip afinite varyanti 9D] "den 10 kat daha güçlüdür; karsilastirma SGN70 ise ADCC acisindan karsilastirma MDX69A7°den 2.5 kat daha güçlüdür. SIMPLE antikor 27B3 sinifinin en iyisi reseptör-ligand bloke etme gücünü üstün ADCC gücü ile birlestirir ve dolayisiyla olumlu bir terapötik profile sahiptir. Örnek 8: CD70,e Spesifik mAb,lerin Tamamlayiciva Bagli Sitotoksisite Gücü Antikorlarin Tainamlayiciya Bagli Sitotoksisite (CDC) özellikleri McEarchern ve digerleri kontrol deneyinde, U hücreleri FACS analiziyle CD70 antijeninin mevcudiyeti açisindan test edildi. Bir sonraki bir deneyde, bir kimerik lama-insan CD70 mAb 3 farkli konsantrasyonda ve %3, %6 veya %9 insan serumu (insan tamamlayici kaynagi olarak) mevcudiyetinde her iki hücre hatti üzerinde CDC etkinligi açisindan test edildi. U266 hücrelerinin %9 serum mevcudiyetinde en iyi sinyal/ gürültü oranini verdigi sonucuna varildi. Bir sonraki bir deneyde, U266 hücreleri %9 insan serumu yoklugunda veya mevcudiyetinde 0.001-20 ug/ml"de kimerik lama-insan mAbîeriyle (Sekil 8, üst panel) veya referans CD70 mAb,leriyle (Sekil 8, alt panel) karistirildi ve 2 saat 37°C"de inkübe edildi. Hücreler santrifüjlendi ve Propidyum Iyodür eklenerek ölen hücrelerin sayisi belirlendi. Hücre lizizi FACS"de ölçüldü. Tüm kimerik lama-insan mAb91erin %9 insan serumu mevcudiyetinde U266 hücreleri üzerinde CDC etkinligi oldugu gösterildi. SIMPLE antikoru 27B3 karsilastirma SGN70 ile benzer bir IC50`ye sahiptir, yine MDX69A7 10 kat daha az güçlüdür. Örnek 9: Antikora Bagli Hücresel F agositoz Gücü SIMPLE mAb"lerinin Antikora Bagli Hücresel F agositoz (ADCP) özelliklerini analiz etmek gerçeklestirildi. Bu analizde insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) standart Ficoll ayirrnasi ile heparinize tam kandan saflastirildi. Farkli donörlere ait kan kullanildi. Hücreler doku kültürü sisesinde %10 FCS içeren RPMFda gece boyunca 37°C"de inkübe edildi. Yapismayan hücreler çikartildi ve yapisan hücrelere 15 gün 500 U/ml rhGM-CSF (7.5 ug/ 75ml) içeren 75 mlX-VIVO 15 besi ortaminda kültür yapildi. 15 gün sonra yapisan hücreler toplandi (monosit türevi makrofajlar (MDM). Kirmizi boya PKH26 yüklenmis 8.0 x mAb ile inkübe edildi. Bunun ardindan 2.0 X104 MDM hücresi eklendi (411 hedef/efektör ( ve 37°C3de 1 saat inkübasyon sonrasinda hücreler santrifüjlendi, resuspended in 100 ul PBS %1 BSA içinde yeniden süspanse edildi ve V tabanli 96 kuyucuklu bir plakaya aktarildi. Plakalari buz üzerinde tutarak 30 dakika makrofajlarin boyanmasi için anti-CDI lb monoklonal antikoru (FITC konjugasyonlu) eklendi, ardindan hücreler iki kere PBS ile yikandi ve %1 paraformaldehitle (PBS içinde) sabitlendi. Numuneler fagositozun çift boyanmis hücrelerde puanlandigi FACS ile analiz edildi. Sonuçlar Sekil 9°da gösterilmektedir ve bu sonuçlar test edilen kimerik lama-insan mAb"lerin tamaminin ADCP indüklemek açisindan güçlü olduklarini göstermektedir. SIMPLE antikoru 27B3 100 ng/ml ( civarinda bir IC50 ile 1 tig/ml konsantrasyonlarda makrofaj larla isaretlenmis tümör hücrelerinin %50'sine dek fagositoz indükledi. Örnek 10: Tümör Hücre Hatti 786-O,da Anti-CD70 mAb91erin Internalizasvonu CD70 antikorlarinin renal karsinomdan elde edilen hücre hatti 786-O"ya baglanmasinin antikor-reseptör kompleksinin hizla (1 saat içinde) internalizasyonuna yol açtigi kanitlanmistir antikorlarinin ve karsilastirma mAb"lerinin intemalizasyonunu test etmek amaciyla, 786-0 hücreleri 96 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plakasinda kültür edildi ve gece boyunca 37°C'de inkübe edildi. 2.5 ug/ml mAb eklendi ve hücrelerle 0-24 saat 37°C,de inkübe edildi. Plakalar intemalize olan mAb miktarini temsil eden "IÇERDE" kodu verildi) veya PBS ("DISARDA" kodlu ve reseptöre hücrenin disinda baglanan mAb miktarini temsil eder) ile yikandi. Bunun ardindan, hücreler %4 paraformaldehitle 30 dakika oda sicakliginda sabitlendi, PBS ile yikandi ve 5 dakika %02 Triton-X-l 00 ("IÇERDE") veya PBS ("DISARDA") ile inkübe edildi. Ardindan hücreler iki kere yikandi ve oda sicakliginda 10 dakika 100 mM glisin ile yikandi, bunu takiben PBS+%1 BSA ile 30 dakikalik bir inkübasyon yapildi. Son olarak Li- Cor Odyssey kizilötesi tarayicida analiz öncesinde hücreler keçi anti-insan Fc (Jackson Immunoresearch ile boyandi. Hücrenin disinda kalan, yani intemalize olinamis antikor Sekil 10,da ortalama MFI DISARDA olarak puanlandi. Sonuçlar bazi mAb'lerin diger mAb,1ere göre hücrelerin yüzeyinde daha uzun kaldiklarini göstermektedir (daha yüksek sinyal). Bununla birlikte, mAb°lerin hiçbiri tam olarak intemalize olmaz: baslangiçta (0 ve 2 saat arasi) mAb intemalizasyonu çok hizli gider ancak mAb'nin %30-40Hnin 37°Clde 24 saat inkübasyon sonrasinda bile hücrenin disinda kaldigi bir sabit duruma ulasilmis gibi durmaktadir. SIMPLE10 antikoru 27B3 karsilastirma antikorlari SGN70 ve MDX69A7 ile ayni hizda intemalize olur. SIMPLE antikorlari 9El ve l9G10'un ve ayrica digerlerinin 24 saat inkübasyon sonrasinda bile hücrelerin disinda yüksek seviyelerde kaldiginin gözlemlenmesi ilginçtir (alt panel, Sekil ). ADCC, CDC ve ADCP etkilerinin etkili sekilde indüklenmesi için yüksek seviyelerde CD70*e spesifik antikorun hücre ölümünden sorumlu efektör immün hücrelerin toplanmasi amaciyla hedeflenen kanser hücreleri disinda kalmasi önemlidir. Öte yandan hizla internalize olan antikorlarin Antikor Ilaç Konjugatlari (ADC) olarak potansiyeli vardir. Örnek 11: Kimerik Lama-Insan mAbilerinin Bir Tümör Ksenogreft Modelinde In Vivo Etkinligi Yayilmis hastalik olusturmak için 0.2 mL PBS içindeki 106 Raji hücresi C.B.-17 ciddi kombine immün yetmezlik (SCID) farelerinin (Harlan, Indianapolis, IN) lateral kuyruk damarina enjekte edildi. Enjeksiyon sonrasinda farelerin tamami toplandi ve sonra grup basina 9 fare seklinde rastgele çesitli tedavi gruplarina ayrildi. Antikorlar intraperitonal enjeksiyonla hücre implantasyonundan 1, 4, 8, 11, 15 gün sonra 0.5 ml seklinde verildi. Fareler haftada en az iki kere izlendi ve %15 ila %20 agirlik kaybi, kambur durus, letarji, kranial sisme veya dehidratasyon dahil hastalik belirtileri gösterdiklerinde öldürüldü. Fareler test edildi. Bu Fc-ölü çesidi daha önce literatürde açiklanmistir ve ADCC ve CDC etkinligi yoktur ve çok daha düsük ADCP etkinligi vardir (McEarchem ve digerleri, Clin Cancer Res veriler kontrol fareleri için ortalama sagkalim süresinin 27 gün oldugu gösterir. 0.1 mg/kg 4lD12'ye esit veya daha yüksek dozlar verildiginde ortalama sagkalim süresi en az 67 güne uzamistir. Yine de 0.01 mg/kgtlik doz etkilidir. 4lD12,nin Fc-ölü çesidinin in vi'vo etki gücü yoktur, ki bu da bu modelde ADCC, CDC ve ADCPinin önemini gösterir. Örnek 12: Fukozillenmemis mAb31erin Ekspresvonu Düsük miktarlarda fukozil kalintilari olan antikorlarin ADCCiyi 10-1000 kat yükselttikleri Fukoziltransferaz geni olmayan CHO hücre hatti Ms kimerik lama-insan CD70 mAbilerin agir ve hafif zincirini kodlayan bir ökaryotik ekspresyon vektörüyle elektroporasyona tabi tutuldu. Ilaç direnci klonlari Excel] 325-PF CHO besi yerinde büyümeyle seçildi. Klonlar standart bir CD70 baglayici ELISA,si ile IgG üretimi açisindan tarandi. Tablo 6: CD709e Spesifik Lamadan Elde Edilen VH Dizisi 1C2 ELQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLS 1 NYWMH 10 9D] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11 8312 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11 8012 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11 9131 EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFD 3 DYAMS 12 534 EVQVQESGGGLVHPGGSLKLSCAASGFTFD 4 TYAMS 13 532 QVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTVS 5 NPAMS 14 6D5 EVQLVQPGAELRKPGASVKVSCKASGYTFT 6 SYYID 15 4D2 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLACTVSGGSIT 7 TSYYYWS 16 9A] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 SYAMS 17 9G2 QVQLVESGGGLMQPGGSLRLSCAASGFTFS 8 SSAMS 18 932 QLQVVESGGGLMQPGGSLRLSCAASGFTFS 9 GSAMS 19 2733 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11 24E3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11 Fab ÇERÇEVE 1 DIZI CDRl DIZI 13. 13. 33D8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11 24F2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11 2436 EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFD 3 DYAMS 12 19010 EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFD 3 DYAMS 12 45312 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20 4539 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20 45F8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20 45Ai2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20 4536 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20 1C2 WVRQAPRKGLEWVS 21 TISTDNSRTYYADSVKG 26 9D1 WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27 8312 WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGDTTYYADSVKG 28 8C12 WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGDTTYYADSVKG 28 931 WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYMYDSSTYYADSVKG 29 5F4 WVRQAPGKGLEWVS 22 AISWSGGETFYAESMKG 30 532 WVRQAPGKGLEWVS 22 EITNYGYNRYYADSVKG 31 6D5 WVRQAPGQGLEWMG 23 RIDPEDGGTKYAQKFQG 32 4D2 WIRQPPGKGLEWMG 24 AIGSRGSTYYSPSLKT 33 9A1 WVRQAPGKGLEWVS 22 DlNSGGGSTKYNDSVKG 34 902 WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYSDSSYTYYADSVKS 35 9B2 WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYSHSMYTYYADSVKS 36 2733 WVRQAPGKGLEWVS 22 DlNNEGGTTYYADSVKG 27 24E3 WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27 33D8 WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27 24F2 WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27 24B6 WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYMYDSSTYYADSVKG 29 i 9G I 0 WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYMYDSSTYYADSVKG 29 45312 WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37 45D9 WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37 45F8 WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37 45A 1 2 WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37 45B6 WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37 59D10 WVRQAPGKGLEWVS 22 GISGVTGGSSTSYADSVKG 259 Fab ÇERÇEVE 3 DIZI CDR3 DIZI RFTlSRDHAKNTLILQMNS lCZ LKSE DTAVYYCIR 38 GSDYEH 49 RFTi SR DNAKNTLTLOMN 9Dl SLKPE DTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50 R FTlSRDNAKNTLTLQM D 8B12 SLKPE DTALYYCVR 40 DAGYSNHVPIFDS 50 R FTlSR DNAKNTLTLQM D 8C 12 SLKPE DTALYYCVR 40 DAGYSNHVPIFDS 50 R FTlSTDNAKNTVYLQMN 9E1 SLKSE DTAVYYCAK 41 DINRSYGSSWSHFGPIFSS 51 R FTlSRNNAKNTLYLQMN 5F4 SLKSE DTAVYYCAR 42 GMGLAEGLTD 52 RFTISTDNAKNTLYLQMNS 5B2 LRSEDSAVYYCTA 43 SLGLEYGYGD 53 RVTFTADASTSTAYVELSS 6D5 LRSEDTAVYYCAS 44 RRRDFDY 54 RTSISRDTSKNOFTLOLSS VTGEITYNSGSYYYTLNLFD 4D2 VTPEDTAVYYCAR 45 Y 55 RFAISRDNAKNTLYLQMN 9Al SLKPEDTAVYYCAK 46 EGGSGRYWTNEYDY 56 RFTISTDNAKNTLYLOMNS 9G2 LKPDDTAVYYCAG 47 SSDYEGSFAS 57 RFTISTDNAKNTLYLOMNS 9B2 LKPDDTAVYYCAA 342 SSDYEGLFVS 58 RFTl SR DNAKNTLTLOMN 27133 SLKPE DTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50 RFTl SRDNAKNTLTLQMN 24E3 SLKPE DTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50 RFTi SRDNAKNTLTLQMN 33D8 SLKPEDTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50 RFTi SR DNAKNTLTLQMN 24F2 SLKPE DTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50 R FTlSTDNAKNTVYLOMN 24B6 SLKSE DTAVYYCAK 41 DINRSYGSSWSHFGPIFSS 51 R FTlSTDNAKNTVYLQMN l9G10 SLKSE DTAVYYCAK 41 DINRSYGSSWSHFGPIFSS 51 R FTlSRDNAKNTLTLQM D 45B12 SLKPEDTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59 R FTlSRDNAKNTLTLQM D 45D9 SLKPE DTARYYCVR 48 DAGY SN HVQIFDS 59 R FTlSRDNAKNTLTLOM D 45F8 SLKPE DTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59 Fab ÇERÇEVE 3 DIZI ID. CDR3 DIZI ID› RFTlSRDNAKNTLTLQMD 45A I 2 SLKPEDTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59 R FTlSRDNAKNTLTLQM D 4536 SLKPE DTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59 RFTISRDNG KNTLYLOMN RFTiSRDNDKNTLYLQMN 59DI 0 SLIPEDTAVYYCAT 261 TSGTYYFIPEYEY 263 Fab ÇERÇEVE 4 DIZI ID. 1 C2 WGQGTQVTVSS 60 9DI WGQGTQVIVAS 61 813 1 2 WGQGTQVIVAS 61 8C12 WGQGTQVIVAS 61 9E1 WGQGTQVTVSS 60 5F4 WGQGTQVTVSS 60 5132 WGQGTQVTVSS 60 6D5 WGQGTQVTVSS 60 4D2 WGQGTQVTVSS 60 9A i WGQGTQVTVSS 60 9G2 WGQGTQVTVSS 60 982 WGQGTQVTVSS 60 27B3 WGQGTQVIVAS 61 24E3 WGQGTQVIVAS 61 33D8 WGQGTQVIVAS 61 24F2 WGQGTQVIVAS 61 24B6 WGQGTQVTVSS 60 19010 WGQGTQVTVSS 60 45312 WGQGTQVIVAS 6i 45D9 WGQGTQVIVAS 61 45F8 WGQGTQVIVAS 61 45A 12 WGQGTQVIVAS 61 WGQGTQVIVAS 61 WGKGTLVTVSS 264 59DIO WGQGTQVTVSS 60 Tablo 7: CD70,e Spesifik Lamadan Elde Edilen VL Dizisi (Kovu Renkli O Amber DUR Kodonu Tarafindan Kodlanir) 1c2 QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 62 GLSSGSVTTTNYPG 77 931 QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLSSGSVTSSHYPG 78 8312 QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 62 GLSSGSVTSSNYPG 79 8C12 QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLTSGSVTSSNYPD 80 931 QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLTSGSVTSSNYPD 80 534 QAVVTHPPSLSASPGSSVRLTC 64 TLISGDNIGGYDIS 81 532 QSALTQPPSVSGTLGKTLTISC 65 AGTSSDVGYGNYVS 82 6D5 QSALTQPSAVSVSLGQTARITC 66 QGGNARFSSFA 83 432 QSVLTQPPSLSASPGSSVRLTC 67 TLSSGNSVGNYDIS 84 9A] QSALTQPSALSVTLGQTAKITC 68 QGGRLGSSYAH 85 9G2 QSVVTQPPSLSASPGSSVRLTC 69 TLSSGNSVGNYDIS 84 932 QAVLTQPPSLSASPGSSVRLTC 70 TLNSANSVGSYDIS 86 2733 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC 71 GLKSGSVTSTNFPT 87 2433 QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLTSGSVTSDNFPV 88 3338 QSALTQPSTVSVSLGQTARITC 72 RGDSLERYGTN 89 2432 QSALTQPSAVSVSLGQTARITC 66 RGDTLRNYHAN 90 2436 QPVLTQPSAVSVSLGQTARITC 73 QGGYYTH 91 19G10 NFMLTQPSAVSVSLGQTARITC 74 QGGYYTH 91 45312 QAVLTQPSSVSVSLGQTAKITC 75 QGGNLGLYGAN 92 4539 QAVLTQPSSVSVSLGQTAKITC 75 QGGNLWLYGAN 93 45F8 QAVLTQPSSVSVSLGQTANITC 76 QGGNLGLYGAN 92 45A12 QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLSSGSATSGNYPE 94 4536 QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLSSGSVTSSNYPD 95 1C2 WFQQTPGQAPRTLIY 96 STSSRHS 109 931 WYQQTPGQAPRLLIF 97 NT'NSRHS 110 8312 WYQQTPGQAPRVLIY _98 NTNNRHS 111 8C 12 WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNSRHS 1 10 Fab Çerçeve 2 DIZI ID. CDR2 DIZI ID. 9El WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNSRHS 1 10 5F4 WYQQKTGSPPRYLLY 100 YYSDSYKHQS S 1 12 5B2 WYQQLPGTAPKLLIY 101 RVSTRAS 1 13 6D5 WYQQKPGQAPVQVIY 102 YNTNRPS 1 14 4D2 WYQQKAGSPPRYLLY 103 YYSDSYKNQGS 1 15 9A1 WYQQKPGQAPVLVIY 104 GNNYRPS 1 16 9G2 WYQQKAGSPPRYLLY 103 YYSDSVKHQGS 117 9B2 WYQQKAGSPPRYLLY 103 YYSDSLSHQGS 118 27B3 WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNTRHS 1 19 33D8 WYQQKPGQAPVLVIY 104 DDDSRPS 121 24F2 WYRQKPGQAPVLVIY 105 GDDIRPS 122 24B6 WYQQKPGQAPVLVIY 104 INNNRPS 123 45D9 WYQQNPGRAPILLIY 106 GDNQRPL 126 45F 8 WYQQNPGRAPILLF Y 107 GDNYMPL 127 45 B6 WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNSRHS 1 10 Fab Çerçeve 3 DIZI ID. CDR3 DIZI ID. GVPSRFSGSISGNKAALTITGAOP 1C2 EDEADYYC 129 ALEEIGSYTYM 148 VP RF | NKAALTIT A P 9D 1 SDEIDYSSS SG G 0 129 ALLNIDDGSTM 149 GVPS RYSGSISGN KAALTITGAE P 8B12 EDEADYYC 130 NLHLGSYTPM 150 GVPSRFSGSISGNKAALTITGAOP 8C12 EDEADYYC 131 ALYWGYGTNVDV 151 GVPSRFSGSISGNKAALTITGAOP GVPSRFSGSKDASANAG LLLISGL 5F4 OSEDEADYYC 132 SAYKSGSYKAPV 153 GMPDRFSGSKSGNTASLTISG LQ 5B2 SEDEADYYC 133 ASYTTNNKPV 154 GIPARFSGSSSGGAATLTISGAQA GVPSRFSGSKDPSANAGLLLISGL 4D2 QAEDEADYYC 135 SVSNSGTYKPV 156 Fab Çerçeve 3 DIZI ID. CDR3 DIZI ID. GIPERFSGSSSGDTATLTISGAQA 9A1 EDEAVYYC 136 QSGSSNTNVM 157 GVPSRFSGSSDASANAGLLLISGL 9G2 QPEDEADYYC 137 SAYKSGSHV 158 GVPSRFSGSTDASANAGLLLISGL 9B2 OPEDEADYYC 138 SAYNRGSHV 159 GVPSRFSGSISENKAALTlTGAQP 27B3 EDEAEYFC 139 ALFISNPSVE 160 GVPSRFSGSITGNKAILTITGAQPE GIPERFSGSSSGATAALTISGAOA 33D8 EDEGDYYC 141 QSADSSGNAV 162 24F2 EDEADYSYGCS GG SG O 142 QSSDSSGYRVV 163 GIPERFSGSISGNTATLTISGAOVE 24B6 DEADYYC 143 QSGSSSTIPV 164 GIPERFSGSSSGNTATLTISGAOA GIPERFTISKSGGTATLTIDGAOAE GIPERFTISKSGGTATLTIDGAOAE 45D9 DESDYYC 145 QSADYSGNSV 165 GVPSRFSGSISGNKAALTITGAOP GVPSRFSGSISGNKAALTITGAOP 57B6 EDEADYYC 129 ALYMGSGSANAM 271 GIADRFSGSKAGNTASLTISGLQS Fab Çerçeve 4 DIZI ID. 1 C2 FGGGTHLTVLG 169 9D 1 FGGGTHLTVLG 169 8B12 FGGGTKLTVLG 170 8C12 FGGGTKLTVLG '170 9E1 FGGGTKLTVLG 170 SP 4 F GGGTHLTVLG 169 5B2 F GGGTHLTVLG 169 6D5 FGGGTTLTVLG 171 4D2 FGGGSKLTVLG 172 9A1 FGGGTHLTVLS 173 9G2 FGGGTKLTVLG 170 Fab Çerçeve 4 DIZI ID. 9B2 FGGGTKLTVLG 170 27B3 FGGGTQLTVLS 174 24E3 FGGGTRLTVLG `175 33D8 FGGGTHLTVLG 169 24F 2 F GGGTKLTVLG 170 24B6 F GGGTKLTVLG 170 19G10 FGGGTKLTVLG 170 45B12 FGGGTKLTVLG 170 45D9 FGGGTKLTVLG 170 45F8 FGGGTKLTVLG 170 45A12 FGGGTKLTVLG 170 45B6 FGGGTELTVLG 176 57B6 FGGGTHLTVLG 169 59D10 FGGGTHLTVLG 169 Tablo 8: Lamadan Elde Edilmis Tam Bov VH Tam Boy VH Domeni Dizisi ELQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYWMHWVRQAPRKG LEWVSTISTDNSRTYYADSVKGRFFISRDHAKNTLILQMNSLKSEDT AVYYCIRGS DYEHWGOGTOVTVSS EVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVROAPG KG LEWVSDINN EGGTTYYADSVKGRFTISR DNAKNTLTLOMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWG OGTQVIVAS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPG KG LEWVSDINN EG DTTYYADSVKGRFTISR DNAKNTLTLOMDSLK PED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTOVIVAS EVOLVESGGGLVO PGG SLR LSCAASGFTFSVYYM NWVROAPG KG LEWVSDINN EG DTTYYADSVKGRFTISR DNAKNTLTLOMDSLK PED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGOGTQVIVAS EVOLOESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVROAPGKG LEWVSSIYMYDSSTYYADSVKG RFTISTDNAKNTVYLOMNSLKSED TAVYYCAKDIN RSYGSSWSH FG PIFSSWGOGTOVTVSS EVOVOESGGGLVHPGGSLKLSCAASGFTFDTYAMSWVRQAPGKG LEWVSAISWSGG ETFYAESMKGRFTISHN NAKNTLY LOM NS LKSED TAVYYCARGMGLAEGLTDWGQGTOVTVSS QVQLVESGGDLVOPGGSLRLSCAASG FTVSN PAMSWVROAPG KG LEWVSE[TNYGYNRYYADSVKGRFTlSTDNAKNTLYLQMNSLRSED SAVYYCTASLGLEYGYG DWGOGTOVTVSS EVQLVQPGAELRKPGASVKVSCKASGYTFTSYYl DWVROAPG OGL EWMG RlDPEDGGTKYAQKFOGHVTFTADASTSTAYVELSSLRSED TAVYYCASRRRDFDYWGQGTQVTVSS QVQLOESG PGLVKPSQTLSLACTVSGGSITTSYYYWSWIROP PGK GLEW MGAlGSRGSTYYSPSLKTRTSISRDTSKNOFTLOLSSVTPED TAVYYCARVTG EITYNSGSYYYT LN LF DYWGOGTQVTVSS Tam Boy VH Domeni Dizisi EVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKG LEWVSDl NSGGGSTKYNDSVKG R FAISR DNAKNTLYLQM NS LKF'ED TAVYYCAKEGGSG RYWTN EYDYWGQGTOVTVSS QVQLVESGGGLMQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKG LEWVSSIYSDSSYTYYADSVKSRFTlSTDNAKNTLYLOMNSLKPDDT AVYYCAGSSDYEGSFASWGOGTOVTVSS OLOVVESGGGLMOPGGSLRLSCAASG FTFSGSAMSWVRQAPGK GLEWVSSIYSHSMYTYYADSVKSRFTISTDNAKNTLYLQMNSLKPD DTAVYYCAASSDYEGLFVSWGOGTOVTVSS EVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVROAPGKG LEWVSDINN EGGTTYYADSVKGRFTISH DNAKNTLTLOMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWG OGTQVIVAS 24133 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVROAPGKG LEWVSDINN EGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLOMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGOGTOVIVAS EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVROAPG KG LEWVSDINN EGGTTYYADSVKGR FTISH DNAKNTLTLOMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGOGTQVIVAS EVOLVESGGGLVOPGGSLHLSCAASGFTFSVYYMNWVROAPG KG LEWVSDINN EGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLOMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWG OGTQVIVAS EVQLOESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKG LEWVSSIYMYDSSTYYADSVKG RFTISTDNAKNTVYLOMNSLKSED TAVYYCAKDIN RSYGSSWSH FG PIFSSWGOGTQVTVSS 19G10 EVQLOESGGGVVOPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKG LEWVSSIYMYDSSTYYADSVKG RFTISTDNAKNTVYLOMNSLKSED TAVYYCAKDIN RSYGSSWSH FG PIFSSWGOGTOVTVSS 45812 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVROAPG KG LEW ISDI NN EGYETYYADSVKG RFTISRDNAKNTLTLOM DSLKPE DT ARYYCVRDAGYSNHVOIFDSWGOGTOVIVAS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVRQAPG KG LEW ISDl NN EGYETYYADSVKG RFTISRDNAKNTLTLOM DSLKPE DT ARYYCVRDAGYSNHVOIFDSWGOGTQVIVAS EVOLVESGGG LVOPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVROAPG KG LEW lSDl NNEGYETYYADSVKG RFTISRDNAKNTLTLQM DSLKPE DT ARYYCVRDAGYSNHVOIFDSWGOGTOVIVAS 45A12 EVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVROAPG KG LEWlSDINNEGYETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLOM DSLKPE DT ARYYCVRDAGYSNHVQIFDSWGQGTQVIVAS EVQLVESGGG LVOPGGSLRLSCAASG FTFSAYYMNWVROAPG KG LEWISDINNEGYETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLOMDSLKPE DT ARYYCVRDAGYSNHVOIFDSWGOGTOVIVAS QLOLVESGGG LVOPGGSLRLSCAASGFSFSHYAMSWVROAPGKG LEWVSGDNTYDGGTRYODSVKGRFTISRDNGKNTLYLQMNSLKPE DTAVYYCAKDTGRGIMGEYG MDYWG KGTLVTVSS 59D10 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASELS FSlSEMTWVRQAPGKGL EWVSGISGVTGGSSTSYADSVKGR FTIS R DNDKNTLYLOMNSLIPE DTAVYYCATTSGTYYF I PEYEYWGOGTOVTVSS Tablo 9: Tam Boy Lamadan Elde Edilmis VL (Kovu Renkli Q Amber DUR Kodonu Tarafindan Kodlanirg Tam Boy Dizi Tam Boy Dizi QTVVTQE PSLSVSPGGTVTLTCG LSSGSVTTTNYPGWFOOTPGQA PRTLIYSTSSRHSGVPSR FSGSISGNKAALTITGAOPEDEADYYCAL EEIGSYTYMFGGGTHLTVLG QAVVTOE PSLSVSPGGTVTLTCGLSSGSVTSSHYPGWYQQTPGO APR LLIFNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCA LLNIDDGSTMFGGGTHLTVLG QTVVTOEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSG SVTSSNYPGWYOOTPGQA PRVLIYNTNN RHSGVPSRYSGSISGNKAALTITGAE PEDEADYYCNL HLGSYTPMFGGGTKLTVLG OAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCG LTSGSVTSSNYPDWYOOTPGOA PRLLIYNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAOPE DEADYYCAL YWGYGTNVDVFGG GTKLTVLG QAVVTQE PSLSVS PGGTVTLTCG LTSGSVTSSNY P DWYQOT PGOA PRLLlYNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAOPE DEADYYCNL YMG SGGSKVFGGGTKLTVLG QAVVTH PPSLSASPGSSVRLTCTLISG DN IGGYDISWYOOKTGSPP RYLLYYYSDSYKHOSSGVPSRFSGSKDASANAGLLLISG LOSEDEA DYYCSAYKSGSYKAPVFGGGTHLTVLG QSALTOPPSVSGTLGKTLTISCAGTSSDVGYG NYVSWYOOLPGTA PKLLlYRVSTRASGMPDRFSGSKSGNTASLTlSGLQSEDEADYYCA SYTTNNKPVFGGGTHLTVLG OSALTOPSAVSVSLGOTAR lTCOGGNARFSSFAWYOOKPGOAPV QVIYYNTNRPSG I PARFSGSSSGGAATLTISGAQAE DEADYYCQSY ESGNYVFGGGTTLTVLG OSVLTOPPSLSASPGSSVRLTCTLSSGNSVG NYDlSWYOQKAG SP PRYLLYYYSDSYKNOGSGVPSRFSGSKDPSANAGLLLISGLOAEDE ADYYCSVSNSGTYKPVFGGGSKLTVLG OSALTOPSALSVTLGOTAKITCOGGRLGSSYAHWYQQKPGOAPVL VlYGN NYRPSGl PERFSGSSSG DTATLTISGAQAED EAVYYCQSGS SNTNVMFGGGTHLTVLS QSVVTOPPSLSASPGSSVRLTCTLSSGNSVGNYDISWYOQKAGSP PRYLLYYYSDSVKHQGSGVPSRFSGSSDASANAGLLLISGLQPEDE ADYYCSAYKSGSHVFGGGTKLTVLG OAVLTOPPSLSASPGSSVF1LTCTLNSANSVGSYDISWYOQKAGSP PRYLLYYYSDSLSHOGSGVPSRFSGSTDASANAGLLLISGLOPEDE ADYYCSAYN RGSHVFGGGTKLTVLG QAVVTQE PSLTVS PGGTVTLTCGLKSG SVTSTNFPTWYOQTPGOA PRLLIYNTNTRHSGVPSRFSGSISENKAALTITGAOPEDEAEYFCAL FISNPSVEFGGGTOLTVLS 24133 QAVVTOEPSLSVSPGGTVTLTCGLTSGSVTSDN FPVWYOOTPGQA PRLLlYTl NSRHSGVPSRFSGSITGNKAI LTITGAOPEDEADYYCALY LEN FAN EFGGGTRLTVLG OSALTOPSTVSVSLGOTARITCRGDSLERYGTNWYQQKPGQAPVL VIYDDDSR PSGIPERFSGSSSGATAALTISGAQAEDEG DYYCOSAD SSGNAVFGGGTHLTVLG OSALTOPSAVSVSLGOTARlTCRGDTLRNYHANWYROKPGOAPVL VlYGDDIRPSGlPERFSGSRLGGTATLTVSGAOAEDEADYYCOSSD SSGYRVVFGGGTKLTVLG QPVLTOPSAVSVSLGQTAR ITCQG GYYTHWYQQKPGOAPVLVIYIN NNHPSGIPERFSGSISG NTATLTlSGAOVEDEADYYCQSGSSSTIPV FGGGTKLTVLG 19G10 NFMLTQPSAVSVSLGOTARlTCOGGYYTHWYOOKPGOAPVLVIYV NNNR PSGlPERFSGSSSGNTATLTISGAQAEDEAAYYCQSGSSSTI PVFGGGTKLTVLG Fab Tam Boy Dizi DIZI ID. QAVLTOPSSVSVSLGOTAKITCOGGNLGLYGANWYQONPGRAPIL LIYGDNYRPLGlPERFTISKSGGTATLTIDGAOAEDESDYYCOSADY 45812 SGNSVFGGGTKLTVLG 207 OAVLTQPSSVSVSLGQTAKITCQGGNLWLYGANWYQONPGRAPIL LIYGDNORPLGIPERFTISKSGGTATLTlDGAOAEDESDYYCOSADY 45D9 SGNSVFGGGTKLTVLG 203 QAVLTOPSSVSVSLGOTANlTCOGGNLGLYGANWYOONPGRAPIL LFYGDNYMPLGIPERFTlSKSGGTATLTIDGAQAEN ESDYYCOSSDY 45F8 PGNSVFGGGTKLTVLG 209 OAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCG LSSGSATSGNYPEWYOOTPGQ APRLl lYNTASRHSGVPGR FSGSlSGNKAALTITGAQPEDEADYYCL 45A12 LYMGGSDFNFVFGGGTKLTVLG 210 QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGSVTSSNYPDWYQOTPGQA PRLLlYNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCAL 45B6 YMGSGSNNVVFGGGTELTVLG 21 1 OTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSSNYPAWYOOTPGOA PRLLlYNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAOPEDEADYYCAL OSVLTQPPSVSGSPGKTVTISCAGTSSDVG YGYYVSWYQOFPG MA PKLLIYDVNKRASG lADFl FSGSKAG NTASLTISG LOSEDEADYYCAS 59D10 YRSSANAVFGGGTHLTVLG 277 Örnek 13: Anti-CD70 mAb 27B3 Germ Hatti Islemi mAb 27B3 ,ün VH ve VL bölgeleriyle ayni kanonik katlanma yapisina ve en yüksek amino asit dizisi özdesligine sahip insan germ hatti genlerinin kesitleri bilinen insan germ hatti geni dizileriyle karsilastirarak tanimlandi. mAb 27 B3°e en yakin insan VH ve VL bölgeleri sirasiyla insan VH3-48 (% oldu. En yakin insan gerrn hatti JH ve JL insan germ hatti geni kesiti dizileri sirasiyla JHS ve JL7 oldu. mAb 27B3 VH ve VL bölgelerinin en yakin insan germ hatti VH ve VL dizileriyle dizi hizalamasi Sekil 123de gösterilmektedir. SIMPLE antikoru 2783 ve insan germ hatti dizilerinin V bölgelerinin karsilastirilmasi VH bölgesinde 12 ve VL bölgesinde 13 (CDRl ,de 2 ve CDR25de 1) aday insanlastirici mutasyon tanimladi. 27B3 'ün VH ve VL dizilerindeki insanlastirici mutasyonlara ve beraberinde eklenen çesitliligi kapsamak için gereken kütüphane boyutlarina iliskin bir genel açiklama Tablo 10 ve ll°de verilmektedir. Tablo 10: 27B3 VH Amino Asit Dizisinde Hedeflenen Mutasyonlar Olasi Tüm Mutantlari Kapsamak Için Gereken Kütüphane Boyutunu Gösterir Kütüphanede Bulunan Mutasyonlar Kabat Devegil aa Insan Germ Hatti Insan Germ Hatti Insan Germ Hatti Olasilik Konumu aa Opsiyon l aa Opsiyon 2 aa Opsiyon 3 46 E V 050 Kütüphanede Bulunan Mutasyonlar Kabat Devegil aa Insan Germ Hatti Insan Germ Hatti Insan Germ Hatti Olasilik Konumu aa Opsiyon l aa Opsiyon 2 aa Opsiyon 3 74 A S 0.50 77 T S 0.50 79 T Y 0.50 83/84 KP KT RA 0.33 89 L V 0.50 93/94 AR AK VR 0.33 108 Q L T M 0.25 110 1 0.50 112 A S 0.50 Tablo 11: 27B3 VL Amino Asit Dizisinde Hedeflenen Mutasyonlar Olasi Tüm Mutantlari Kapsamak Için Gereken Kütüphane Boyutunu Gösterir. * CDR] veya CDR2 Bölgelerindeki Mutasyonlari Gösterir. Kabat Devegil aa Insan Germ Hatti Insan Germ Hatti Insan Germ Hatti Olasilik Konumu aa Opsiyon 1 aa Opsiyon 2 aa Opsiyon 3 2 A T 0.50 1 1-12 LT FS 0.50 26* K T 0.50 * T D 0.50 46 L T 0.50 53* T S 0.50 60 S D 0.50 61 R C 0.50 67/68 SE LG 0.50 87 F Y 0.50 VH_27B3 ve VL_27B3 ,ün tüm insanlastirici mutasyon kombinasyonlarini kapsayan germ hatti islemi yapilmis kütüphaneleri PCR bazli birlestirineyle yaratildi (bakiniz mutasyonlarla örtüsen oligonükleotitler PCR ile birlestirildi. Kütüphane, yüksek afiniteyle baglanma için yabani tip lama kalintisinin kritik oldugu durumda baglanmanm tamamen kaybolmasini önlemek için mutasyonun oldugu her konumda hem insan, hem lama amino yaklasik 1 x 10lo klon ve VL kütüphanesi yaklasik 8 x 109 klon içerdi. VH ve VL kütüphaneleri birlestirildi ve faj gösterimi taramasi için uygun 1 x 1010 klon bir boyutta (tam boy F ab eklentisiyle %91 ) tek bir F ab kütüphanesi seklinde yeniden formatlandi. Tablo 10 ve lee bahsedilen olasi tüm mutasyonlari kapsayacak gerekli çesitlilik primer agir zincir ve hafif zincir kütüphanelerinde asildi ancak birlesik Fab kütüphanesi de tüm olasi permütasyonlari kapsamak için yeterince büyük oldu (1.89 x 107). Örnek 14: Yüksek Insan FR Özdesligi Olan Germ Hatti Islemi vanilmis 27B3 Fab'lerin Segilmesi Hem CD70 için yüksek bir atinitesi, hem yüksek insan FR özdesligi olan germ hatti islemi yapilmis 27B3 Fab*lerin seçilmesinde faj gösterimi kullanildi. Tain olarak belirtmek gerekirse, Flag-TNC-CD70 biyotinlendi ve çesitli konsantrasyonlarda farkli miktarlarda Fab eksprese eden fajla inkübe edildi. Daha sonra faj ve F lag-TNC-CD70 kompleksleri streptavidin kapli bir mikrotitrasyon plakasinda yakalandi ve biyotinleninemis F lag-TNC- CD70 ile 37°C"de yikandi. Faj Tripsin ile ayristirildi ve TGl hücrelerinin enfeksiyonunda kullanildi. Her turda yikama kosullarinin zorlugunu artirarak bes seçme turu gerçeklestirildi. Her seçme turunda kullanilan kosullarin ayrintilari Tablo 12"de verilmektedir. Tablo 12: Germ Hatti Islemi yapilmis 27B3 Fab,lerin Seçilme Kosullari Tur Faj Girdisi (nl) Antijen [pM] Yikama Süresi Yikama Sicakligi Yikayici Antijen 3., 4. ve 5. seçme turunda ayristirilan faj TG1,e transfekte edildi ve klon seklinde kaplandi; tekrar analiz etmek için rastgele münferit klonlar seçildi. F ablleri içeren periplazmik fraksiyonlar IPTG indüklü küçük ölçekli kültürlerden hazirlandi. Her Fab*nin ayrisma hizi bir Biacore baglanma analizinde CD70 kapli bir CMS çipi kullanarak belirlendi. 27B3`ünküne benzer ayrisina hizlarina sahip Fab'si olan klonlar dizildi. %94`ün üzerinde bir toplam insan FR dizisi özdesligi olan klonlara iliskin ayrisma hizlari, ayri ayri klonlarin insan FR'si özdesligi (VH, VL ve toplam) ile birlikte Tablo 13 ,te verilmektedir,, Dizilen Fab klonlarinin tam amino asit dizileri Tablo 14 ve 15% verilmekte ve 27B39ün CDR amino asit dizisi varyantlari Tablo 161da verilmektedir. Bu dizilerin incelenmesi hafif zincirin çerçeve l'inin siklikla amino asit 29nin primer bölgesinde fazladan (insan olmayan) mutasyonlara sahip oldugunu gösterir (T yerine A). 35G3, 40F1 ve 39C3 klonlarinin varyantlari (sirasiyla klon 53Cl, 53B1 ve 53El) yapilmis olup, bunlar konum 2,de karsilik hatti islemi yapildi. Tablo 13: %947ten Daha Fazla T0plam Insan FR Özdesligi Olan Germ Hatti Islemi Yapilmis 27B3 Fab Klonlarinin Ayrisma Hizi Fab VL Için FR VH Için FR Toplam FR izolasyon Ayr. Hizi Klonu Özdesligi %,si Özdesligi %"si Özdesligi %"si Sikligi [10454] Tablo 14A: FR ve CDR ile bozulmus dizi tanimlayicilarla %947ten fazla toplam insan özdesligi olan germ hatti islemi yapilmis 27B3 klonlarinin VH amino asit dizileri. Insanlastirici mutasyonlar soluk renkli, primer ekli mutasyonlar ise koyu renklidir. AGIR ÇERÇEVE i CDR] ÇERÇEVE 2 27B3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI lD. NO:2 NO:22 36A9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 53F1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. No:11 WVRQAPGKGLEWVS Dizi ID. DIZI ID. No:2 NO:22 36D6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 53Gl EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 3503 EYQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 53C1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 35F6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:274 NO:22 36G2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 39D5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS GYYMN DIZI ID. No:248 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID› DIZI IDA No:2 NO:22 42D12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 3501 EVQLVESGGGLVQPGGSVRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. 41D12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI IDV No:2 NO:22 41H8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 3502 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. 40F1 EyQEVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFs VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 5331 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:2 NO:22 3903 EVQLVASGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:275 NO:22 53151 EVQLVASGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. DIZI ID. No:275 NO:22 53H1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID› DIZI ID. No:2 NO:22 53A2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VYYMN DIZI ID. NO:11 WVRQAPGKGLEWVS DIZI ID. ZINCIR 27133 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPEDTALYYCVR DAGYSNHVPIFDS WGQGTQVIVAS 36A9 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 REUPRDHSKIITLTLQNNSLKPEDTAWYCVR DAGYSNHVPIFDS @GQGTQVIVSS 53F1 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RETISRDNAKNTLTLQMUSLKPEDTAWYCVR DAGYSNHVPIFDS Wçqsmvms 36D6 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 R??IFRDIIAKIJSLYLQMIBLKPEDTALYW DAGYSNHVPIFDS V'FGQGTTIVWSS 53G1 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 REUSRDNAKUTLYLQNNSLKPEDTAVYYCVR DAGYSNHVPIFDS WQGI'WIWIS 3503 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RET.I.SRDN'êKusLTLQMHSLKPEDTAWYCAR DAGYSNHVPIFDS Wçqsnamss 53Cl DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RETISRDN'SKI'SLTLQNHSLKPEDTAWYCAR DAGYSNHVPIFDS WGQGTLVIWG 35F6 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 REUSRDNSKUTLYLQNNSLRAEDTAVYYCVR DAGYSNHVPIFDS V'EÇQGITX7îR7AS 39D5 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 asagoumqmmimsmmmm DAGYSNHVPIFDS Wçqsmrwss 42D12 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RETISRDIISKUTLYLQBINGLRAEDTAVYYCVR DAGYSNHVPIFDS V'EFQGIQY'T'VGS 35Gl DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RET;SRDNAKQTLYLQ›INSLKPEDTAWYCAR DAGYSNHVPIFDS WEQGITLWAS 411312 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RET1_SP-DNSWSLYLQNI'SLRAEDTA""'YCAR DAGYSNHVPIFDS V'UPQGIEVTVGS 41H8 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RFTISRDNGKUTLYLQBIHSLRAEDTAVYYCAR DAGYSNHVPIFDS WGQGTQVWAS 35G2 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 Rsr;;mummg»nimpgmmym DAGYSNHVPIFDS @QGTMVZSS 40F1 DINNEGGATYYADSVKG DIZI ID. No:249 RETFSvalsKljsLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DAGYSNHVPIFDS i-:çggmmss 53Bi DINNEGGATYYADSVKG DIZI ID. No:249 RSTAIISRDIIISIKNSLYLQMUSLRAEDTAVYYCAR DAGYSNHVPIFDS ç-;çggmvms 39C3 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RülêRDHSKI'TLYLQHHSLRAEDTAWYCAR DAGYSNHVPIFDS DIZI ID, NO: 286 DIZI ID N050 5351 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RsrpmisKurmgmismsmmm DAGYSNHVPIFDS . 53H1 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RÜIFRWSKI'SLYLQWLRREDTAVHCAR DAGYSNHVPIFDS Wçessmîviw 53A2 DINNEGGTTYYADSVKG DIZI ID. NO:27 RFTISFDNSKusLYLQNNSLMEDTAWYCAR DAGYSNHVPIFDS WGQGTIVWS DIZI iD, NO: 285 DIZI iD. NO:50 Tablo 14B: Tam VH amino asit dizileri için dizi tanimlayicilarla %94"[en fazla toplam insan özdesligi olan germ hatti islemi yapilmis 27B3 klonlarinin VH amino asit dizileri DIZI AGIR TAM VH DIZISI 178 27B3 EL'QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYHHWVRQAPGKGLEWVSDII'vlllEGGTTYYADSVKG EFTI SRDIJAKI ITLTLQMIISLI( PEDTALYYCVRDAGYSUHVP IFDSWGQGTQV I 'GAS 212 3 6A9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMIIWVRQAPGKGLEWVSDI I'IIJEIGGTTY YÂDSVKG 213 5 3 F1 EX'QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMIIWVRQAPGKGLE'A ISDI I'IIJEGGTTY YADSVKG RFTI SRDI'JÄKNTLTLQD'II ISLKPEDTPNYYCVRDPßYSlTHVPIFDSWGQGTQVIVÃS 214 3 ÖDÖ E1\-"QLVE3GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYY[VIIIWVRQAPGKGLE'ATVSDII-llJEGGTTY YADSVKG RFTISRDNAKI ITLYLQMIISLKPEDTALYYCVRDAGY SIIHVP IFDSWGQGTIVT !5.3 215 53G1 EUQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVY`i'MlIWJRQAPGKGLE'ATUSDIlllJEGGITYYADSVKG RFII SRDI'JAKI'ITLYLQMI ISLKPEDTAYYYCVRDAGYSlIHVPIFDSWGQGTEIVIVSS 216 3 5G3 BVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYl'IIIEFNRQAPGKGLE'JWSDIIllJEGGTTY YADSVKG RFTISRDNSKIISLTLQMIISLKPEDTAVYY CARDAGYSIIHVPIFDSWGQGTLVTVS S 217 53C1 B`r'QLVE3GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS'JYYl"llllüIRQAPGKGLEWVSDIHIJEGGTTY YADSVKG RFTISRDNSKHSLTLQMIISLI'ÄPBDTAVYYCARDAGYSIIl-lVPIFDSWGQGTL\7_'I\›'SS 218 3 5F6 BVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSGFTE`SVYY[VIIIWVRQAPGKGLEW SDIHIJEGGTTYYADSVKG RE'T I 5 RDN'S KHTLYLQMNS LRLÃLBDTAVYYCVRDAGYS [IHVP IFDSWGQGTTVIVA S 219 3 6G2 EE'QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMI'vIWJRQAPGKGLEWVSDII-IllEGGTTY YADSVKG RFTI SRDI'JAKI'ISLTLQMIISLRjAEDTAVYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVTVSS 220 39135 Eîi'QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAC GFTFSGYYl»ll']l'u"JRQAPGl(GLEW SDIl-JNEGGTTYYADSVKG RFT I S RDNAKNTLYLQMIISLR'ABDTAVYYCVRDAGYS l-IHVP IFDSWGQGTTVTVAS 221 42D12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMIIWVRQAPGKGLEWVSDII'lIlEIGGTTY YADSVKG RFTI SRDIJSKNTLYLQMIISLRÄEDTAVYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVTVSS 222 3 5G1 BVQLVESGGGLVQPGGSVRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDIlJIJEGGTTYYÄDSVKG RFT I SRDIJAKNTLYLQMI'IS LKPBDTAVYYCARDPSYSUHVPIFDSWGQGTLVT-VAS 223 41D12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMHWVRQAPGKGLEWVSDI I-HJEGGTTY YADSVKG RFTI SRDN'SKUSLXLQMI ISLRAEDTAVYYCÄRDAGYSlTHVPIFDSWGQGTLVIVS S 224 41H8 E3\-"QLVECGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYY[VIIIWVRQAPGKGLEWVSDIlllJEGGITY YADSVKG RFTISRDNSKI ITLYLQMIISLRAEDTAVYY CARDAGY .SlIHVPIFDCWGQGTQVTVAS RFTISRDNAKNTLILQMIISLKPEDTAYYYCARDAGYSIIIHVPIFDSWGQGTLVIVSS RFT I SRDIISKNSLYLQMI IS LRAEIDTAVYY CARDAGY SNHVP IFDEWGQGTQVTVS S 227 5313] Bî-'QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYY[~'llll^NRQAPGl RE'T I 5 RDNS KNSL-YL QMIJS LRABDTAVYYCÄRDAGYS [vIHVP IFDSWGQGTQVTVS S 228 3 9c3 EVQLVASGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMI'WNRQAPGKGLEWVSDIl-IIJEZGGTTYYADSVKG RFT I 5 RDN'SKl-JTLYLQMIIS LRAEDTAVYY CARDAGYS [JHVP IFDEEVGQGTTuTVS S 229 53151 EVQLVASGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMI'JWX-'RQAPGKGLEWVSDINIJEGGTTYYADSVKG 223 53H1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMIll"f\."RQAPGKGLElru`\."SDIHNEGGTTY YADSVKG RFTI SRDNSKNSLYLQMI ISIRÄEIDTAVYYCARDAGYSI'THVPIFDSWGQGTLVT-VSS 223 53A2 E\-"QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYIVII'IWVRQAPGKGLEIWVSDII-UJEGGTTY YZ-.DSVKG RFTISRDNSKIISLYLQNIISLRAEDTAVYYCARDAGYSUHVPIFDSWGQGTLYTVS S Tablo 15A : FR ve CDR ile bozulmus dizi tanimlayicilarla %94"ten fazla toplam insan özdesligi olan germ hatti islemi yapilmis 27B3 klonlarinin VH amino asit dizileri. Insanlastirici mutasvonlar soluk renkli. nrimer ekli mutasvonlar ise kovu renklidir. HAFIF ÇERÇEVE 1 CM! ÇERÇEVE 2 1:," ›-. ç:r.-I-i'çcpi'.r5':: :ax-sut.- -3yipat'nrmirpr werWQEPEILW at i @sasîtairsr:vspxnntc ;'.ssx'nm ini* m-;qncouaui i' 3505 tanju& sirasi :omur: :113:: 'nc 'n IFPT nççrwiimmm'i' i. m tir-"ri'iccp-:uzmez-.run r: :3 't'n'n'mnr ::s-:mami: RLLTY sc-i; 3 magma:matem-nn:: 6.1.›:772'4'7: :um rqr-;qrmmnuu :.: : 01'::r;i:i~:.r:;'.~:iusI-›JI L:: i'..'..1'.›'..:'.'1':.1'ufî'l ..w-;iguwamui i' .iiu i : war-.- i-.izi ; `5'.'35';I'v.' I Liv: :.;.-x;›'..~|.i~1~.~ ii isi-i niçulivßl'iiiil ; DIZI iD. No:295 Dizi iD. NO:251 DIZI in. NO:99 um .' uavx1çcv-;L rs? :ci-vr::: :::savunan n-;uzramvciun ama usa-'a ::u ;E'z' "JC'yJI'a'ILî-'I 'aL/.::1; IIIIVI n'i-;uiiviaimui : 32':: '31""v"l'ÇCP'LFS'-'SPCYJI'›'ILIC asi; ;::n'z: IIIFPI ::i ;QIPOEAFF 1.1.1: i ur i canin-ou› 1 :vs: asrin:: :49:22:: ne in'î uzman n. i *i' ?al in 2;.: r-:c i- ar:: '. * L pm 1-. . 1 L :r: -i;_'.›; ;:;L'fl _ m inii ..vi-4.341 many. i LI i DIZI lD. No:. NO:99 :, ' iß'i'fYiÇCFTJ'S'E'GF'R'RI'V'TLTE -SLIZ'JSS'IT'JGHFF'I ivf." :QXPGSÂP :14.13 9 :u inv- ::u array-suru L 5 : i-;-›::,i;i.rr; mmii Namazini-511.1› HAFIF cm: iÇERÇEVE 3 m) ÇERÇEVE 4 _ DlZl 1D. NO: 110 D1211D.NO: _r- DIZI lD. NO: qui DIZl 1D. NO: ama i !rl uyur; +45 :-jvsps r-:›r›t.iz.eii~.uin maçmcçso'iri- .Kisi CliP'i'i'E. ' WT-JLT-'W S :'31 :man: ?'PSPrr-snImemnunTxacûncçzo'nrr airiziirzvr. nuke-i.: -iß DIZIID.NO: iivn DIZIID.NO: '"78 DIZI ID.N():I(›Ü DIZI ID.NO:309 THS* :misin: s'vwsr; ;ILülhJiALTIl'lRÜADEGAEi&'12 .urizirrz'cs Fuciitç--Lîum DIZI ID. NO: ii-:i DIZI ID.NO: sivi DIZI ID.N():I(›0 DiziiD.N0:309 ?El tavsan: C›'~_'P_[I_F rc m2. nam› .nL 1' 1 :::kizima :5 'm- m Uzun'un DECT-:1,746 niziin NO: iia [)IZII[).NO: :im DIZIID.NO:160 DIZ_l ID. No:309 39113 iiriimn: ;~-rni~.r:-:;xLmimamniauntczowc ;unun-:i: ?misra-i.?- in DIZI ID.NO: mi Dizi'ipiNo; ;in DIZI ID4N01160 DIZI ID. No:309 nm: umran-_3 51-551". ;ILGIFMLII TUA'JADEhAL'LI'V. ALE'ILHPSUL !maçinin DIZIIDÂNO: iiu DIZIID.NO: ,iis DIZI ID. No:160 DIZI ID. No:309 DIZI ID. NO: 110 DIZIID.NO; ::in DIZI ID. No:160 DIZI iD No:309 ama unun::. ;ürün ;-:.:..1 uzman." ::Argi'ticizuunu ALt'JLlIl'L'i`L !Mugla-LI`- m Diziini NO: 'im DIZIID.NO: '-.iui DiziiD.N0;i60 DIZI ini No:309 :] : uyusma s-*Pnr- r-.scimiith II Iawmcew'ifi: Al. m ; lif-'JKL mesru-Lt'w l)lZ_11[)lNO: H., DIZllD.N0: -:,[iç DijiirgiNpgisp DiziiipiNozsos) ni: "T'ITF H: ?jppiprîzziLoibuLnTziicimceasi'ri' &LEICHP'F'SE nj-rçri:- '316 Tablo 15B: Tam VL dizisi için dizi tanimlayicilarla %94,ten fazla toplam insan özdesligi olan germ hatti islemi yapilmis 27B3 klonlarinin VL amino asit dizileri. Insanlastirici mutasvonlar soluk renkli. nrimer ekli mutasvonlar ise kovu renklidir. . HAFIF TAM VL DIZISI ; I' '- 14.3 CANI.' I'JCI'LJLI`~.~;:F'iiL'l 'JI'LICGUISGL'J'I LIIIIFE' WH' UUI i'CUfJ'kLLl 'i'llIllI M1:: 62'!' CüPL-Zg. IU.] ll'iAÄL'II ICMJADÜESEHE'CA LI' I :ICS'LJUEFD'JQI 0117140 GVF EGP::: ILGTEÄÂLTII :AQNJDE SDYFCWI 3 IIPCI'EE'GSGTQLT~'IG C'T'J'I'T OCPS LIVS?EST-'TLTCGUSGSI'TSTHFF TK!' ÜO'YPGWRLL 1 'i l ITIISPMS 33'. &Fri .`32 3605 u.' 'sam-i.: lu.: IFRALTI î mumussz'u. L? 1 ;ini-;KJEPLLÇI ULI'.'1A 234 350] çdi'i'i;Jüil'bPâi.i;['L:I'.'lLl'iuUZLLLi. ILuLFE'I'ni'IJUIii'GIJAI'RLLI .::means .' Jti Jfit'li 'ZT'Ü'TQEP :FIE'JPGETI .'.TCGLTJG :'"rswss'rn'ocincoapaunimum: G-'P :RTS-&S [W IRAN.? l 7 &OPIDCSC'YFCA L!' 2 :IIPZYEPGSGT OLT-'LG 2 3" 3662 GRI-"sTQEPJLF.'JPGST'-'TLICGLHJG CI'TZRIFP IWYQQIPGÇMRLLI'XIIIIITRHC (TFF I'RFI-SS I LG? TFT.? LT l T` i'iQFCDE :DYYCF LFI T. "PT VE'E'Ü'FGTQlTi'LG C-'F DEF ;GE I LC! lP'AÄL'II IMQFSÜESDYYCA LPI Z NF'L'i'EPGZIJYÇIL T-"LG GVF'DGFC '33 !DRTE'îPJL'IIIGAQPBUE SUYFCFNLF I 'J II? :-'x'EE'GSGTQLTVLG G`~'F nar: 33 !MYFJJLTIIIÄHQPIDE :DYFCILLFI : II?C'L'EFOEGTQLT~`LG C-'F Kil-"F .I 33 I LG TFAAL'J'I IGÄLIADU!. &DYFCh LE`I S ICP'Â'- 'EF'GZIGTQLT'J W CUP DRTIT'R'. I 1;:: WiFi-.LT l TE& ÜWCP.! ?ICE L!' 1 .'iIIPIi't'EI'DI'î'iTC'l T~'LG 24-› 35k] Ç&'i'-.'JQEI'bFS'.';;F"L';T'i'I'LIClLU ;Cin ISLILFS'I'.\'i'UUIiC'GI.p`J'Rl.LI illIIlI RH: C-'P :PET-33 !Kalli/MIX T'JQÄDDE CDYICMPI S IIPCYEFGCIJIQLT'ILG 2'i_ SILL Ç'I'~'°i"IQEPSFSYSFGFI'-TLICGUIGGF-"IJINII'FIWXQQ'IFUÇUJ'RLLITITIIITEKS Ci'F-IIRV'Z'TG I LG Wii-17 l TGÃOWÜE FGYYC& L!' I IIIIPSI'EFD'ZITOLT-"LG 14; zilik: Oki".-IUî.I'IiP31r.-.F'L}Z.T'JTIJCLßUQÇLE' liiulFL' l'o x'UUIF'GUo'd'RLLI illIllI EH: 0-1" DGFC-GJ I mtamn :IRÜMDEAZ'SFCJLLPI î IIPZ'I'EP GDSTÇLT-'m Örnek 15: Germ Hatti Islemi Yapilmis 27B3 mAb,lerin Sicaklik Stabilitesi Germ hatti islemi yapilmis çesitli 27B3 mAb varyantlari tam boy insan lgGl molekülleri seklinde HEK293 hücrelerinde eksprese edildi. Protein A saflastirmasi sonrasinda genn hatti islemi yapilmis 27B3 mAb klonlarinin sicaklik stabilitesi degerlendirildi. Daha ayrintili açiklamak gerekirse, her mAh çesitli sicakliklarda (birbirinden 2 veya SCC aralikli) 1 saat PBS tamponda 100 tig/ml bir konsantrasyonda inkübe edildi. Ardindan kontrollü bir tarzda mAb"lerin sicakligi düsürüldü (2 saat içinde 25°C°ye düsürüldü, ardindan gece boyunca 4°C,de inkübasyon yapildi) ve agregalarin atilmasi için santritîijleme kullanildi. Üst fazdaki etkin mAb miktari (toplam mAb konsantrasyonu yüzdesi olarak) Biacore ile Sonuçlar (Tablo l7"de gösterilmektedir) klonlarin çogunun yabani tip 27B3°ün sahip oldugu ile benzer bir erime sicakligina (Tm) sahip oldugunu göstermektedir. Beklenmedik sahip oldugu görülmektedir. Tablo 17: Germ Hatti Islemi Yapilmis 27B3 mAb°lerin Sicaklik Stabilitesi mAb Klonu Tm [OC] 64.7 64.6 35Gl 63.7 35G3 61.7 53A2 62.2 62.2 35G2 65.6 66.0 40Fl 63.5 53H1 64.1 stabilitesi çesitli teknikleri kullanarak ayrica incelendi. %0.02 Tween içeren Delbucco PBS içinde test mAbîerinden 100 tig/ml bir konsantrasyonda temsili miktarlar (1 m1) hazirlandi. Sadece tampondan olusan (% bir negatif kontrol temsili miktari ve %002 Tween içeren Delbucco PBS içinde mAb,den olusan bir pozitif kontrol temsili miktari da hazirlandi. Her mAb preparasyonunun temsili miktarlari 56. ve 92. günde temsili miktarlardan analiz için 50 ul'lik numuneler alindi. Bir numune -20°C°de depolandi ve referans olarak kullanildi. .1 Numunelerde J el F iltrasvonu Analizi Her zaman noktasinda alinan numuneler bir Superdex200 10/300 GL kolonu kullanarak jel eklendi. Bir numune (125 ul) jel filtrasyonu analiz için alindi. Analiz öncesinde numuneler büyük agregalarin atilmasi için santrifi'ijlendi. Monomerik pik yüzdesi ve monomerik pik alani ve ayrica alikonma hacmi ölçüldü. Sonuçlar Tablo 19, 20 ve 21 "de gösterilmektedir. Tablo 19: PBS Stabilitesi Çalismasinin Sonuçlari - Monomerik Pik %,si Tablo 20: PES Stabilitesi Çalismasinin Sonuçlari - Monomerik Pik Egrisi Altindaki Alan (mAU*ml) Tablo 21: PES Stabilitesi Çalismasinin Sonuçlari - Alikonma Hacmi (ml) filtrasyonu analizi sonuçlari Sekil 137te gösterilmektedir. Daha yüksek bir alikonma süresinde (biraz agreganin bulundugunu gösterir) ve daha düsük bir alikonma süresinde (biraz bozunma ürünü oldugunu gösterir) iki küçük pik oldugu görülmektedir. Sonuçlar proteinlerin çogunun intakt oldugunu ve agrega olusturmadigini göstermektedir. Numunelerin BlACORE ile Analizi Belli zaman noktalarindan alinan numuneler Biacore kullanarak CD70 baglanmasina iliskin etki gücü bakimindan test edildi. 50 nl numune 200 u] PBS + %002 Tween,e eklendi ve 5 al numune (1 mg/m1)+ seklinde 1/400 seyreltildi, ardindan 10 u] + 90 nl HV,ler-EP+ = 2.5 tig/ml seklinde tekrar seyreltildi. Biacore analizi yüksek oranda CD70 kapli bir CMS çipi ( kullanarak gösterilmektedir. Referans numunesi %100 numunedir. Sonuçlar 37°C7de inkübe edildiklerinde zaman içinde mAb`lerin etki güçlerini (antijen CD70 için afinite) biraz kaybettiklerini göstermektedir. 41D12 için hem egim, hem maksimum sinyal (R0) isaretlenmistir (bakiniz Sekil 16C ve D). donma-çözülme stabilitesi incelendi. Bu amaçla mAb31erden (5 mg/ml) 0.7 ml"lik bir temsili miktar en az 6 saat -20°C,de donduruldu ve 1 saat oda sicakliginda çözüldü. Bu çevrim 9 kere (bu sekilde toplam 10 donma-çözülme çevriini) tekrarlandi ve numuneler yukaridaki sekilde jel filtrasyonuyla analiz edildi. Sonuçlar mAb°lerin 10 çevrim için dondurma çözülme sirasinda stabil kaldiklarini göstermektedir: jel filtrasyonunda bozunina ürünleri veya agregalar gözlemleninedi. Tablo 22: PES Jel Filtrasyonlu Stabilite Çalismasinin Sonuçlari (sol: 10 D/Ç çevrimi sonrasindaki deger, sag: referans numunesi için deger) Numuneler yukarida açiklanan sekilde Biacore ile etki gücü bakiinindan da test edildi. Sonuçlar 10 donma-çözülme çevrimi sonrasinda mAbanin hala etki gücünün %971sine sahip oldugunu (test edilen üç mAb,nin tainami için) göstermektedir. Tablo 23: Biacoreida 10 Donma-Çözülme Çevrimi Ile Etki Gücü (%) 35G2 40Fl 41D12 Referans 100 100 100 Örnek 16: Germ Hatti Islemi Yapilmis 27B3 mAb71eriniii ADCC Etkisi Gücü Germ hatti islemi yapilmis çesitli 27B3 varyantlari tam boy insan IgGl molekülleri olarak HEK293 hücrelerinde eksprese edildi. Protein A saflastirmasi sonrasinda germ hatti islemi yapilmis 27B3 mAb"1erin ADCC etki gücü degerlendirildi. yukarida Örnek 7"de açiklanan sekilde ölçüldü. Germ hatti islemi yapilmis 27B3 mAbSIerin göreceli ICSOSleri Raji ortak kültür analizinde (Örnek 6,da açiklanan sekilde) ADCC etki gücü ve CD70/CD27 bloke etme gücü açisindan parental 2783 ile karsilastirilarak Tablo 18,de verilmektedir. < 1.0 bir sayi parental 27B3,e göre germ hatti islemi yapilmis varyantin gelismis IC50"sini belirtir. Bu verilerden yola çikarak germ hatti islemi yapilmis varyant 41D12°nin ADCC etki gücünü ve bunun yani sira en iyi Tm ile birlikte CD70/CD27 bloke etme gücünü korudugu sonucu çikartilabilir. Tablo 18: Parental mAb Klonu ile Karsilastirarak 786-0 Bazli ADCC Analizinde Germ Hatti Islemi Yapilmis 27B3 Varyantlarinin Göreceli IC50'si ve Raji Bazli Biyoanalizde Nötralizasyon mAb Raji Ortak Kültür Analizinde 27B3,ye Göre Germ Hatti Islemi Yapilmis Klon 27B3,ye Göre IC50 mAbSye Iliskin ADCC ICSÜSSI mAh Raji Ortak Kültür Analizinde 27B3"ye Göre Çerm Hatti Islemi Yapilmis Klon 27B39ye Göre IC50 mAb°ye lliskin ADCC 1C50,si Örnek 17: Fukozillenmemis CD70 mAh, ARGX-110 Eksprese Eden Hücre Hatlarinin Yapilmasi ve Seçilmesi Gerrn hatti islemi yapilmis 27B3 klonu 41D127nin VH ve VL amino asit dizilerini kodlayan bir ikili gen vektörü üretildi (za allotip). 41D12jnin agir zincirini (DIZI ID. No:344) ve hafif zincirini (DIZI ID. No:345) kodlayan nükleotit dizileri asagida Tablo ,da verilmektedir. Potelligent® CHOK] SV hücreleri elektroporasyonla ikili gen vektörüyle stabil sekilde transfekte edildi. Alti transfeksiyon turu gerçeklestirildi. Her turda her elektroporasyona ait hücreler besi ortami CM633e eklendi ve 96 kuyucuklu kirk plakaya kuyucuk basina 50 "L seklinde kaplandi. Transfeksiyondan sonraki gün her kuyucuga seçici madde L-metionin sülfoksimin (MSX) içeren `150 iiL CM63 besi ortami eklenerek 50 irM bir nihai MSX konsantrasyonu elde edildi. Yaklasik 3, 4 ve 5 hafta inkübasyon sonrasinda bir klonlama aynasi kullanarak plakalar kolonilerin mevcudiyeti açisindan tarandi. Tanimlanan her koloni, koloninin tek bir hücreden mi, yoksa çok sayida hücreden mi kaynaklandigini degerlendirmek için bir mikroskop kullanarak ayrica incelendi. Octet esasli bir usul kullanarak iki yüz kirk bes koloni tanimlandi ve antikor üretimi açisindan tarandi. Antikor konsantrasyonlari 0 ila 172 pg/mL araliginda oldu. Taranan 245 hücre hattinin 214,ü antikor üretimi açisindan pozitif oldu. Hücre hatlari üretkenlige göre derecelendirildi ve ilk 70 hücre hatti seçildi. Bu 70 hücre hattinin kültürleri statik kültürde çogaltildi ve ardindan süspansiyon kültürü yapildi. Kabul edilebilir büyüme sergilemis otuz hücre hatti seçildi ve kesikli çalkalama siseli kültürle yapilan üretkenlik taramasinda daha ayrintili incelendi. Kültürlere 4., 6., 8. ve 10. günde gaz verildi ve 12. günde toplama yapildi. Toplanan üst faz numunesindeki antikor konsantrasyonu Protein A içeren kolon kullanarak HPLC"de belirlendi. 30 hücre hattina ait numunelerdeki antikor konsantrasyonlari 109 ila 877 mg/L araliginda oldu. Kesikli çalkalama siseli degerlendirme sonuçlari hücre hatlarinin üretkenlik bazinda derecelendirilinesinde kullanildi. Ilk 20 hücre hatti ayrintili degerlendirme için seçildi. ARGX-l 10 antikoiu eksprese eden seçilinis bu 20 hücre hattina iliskin büyüme ve üretkenlik verileri CDACF besi ortami kullanarak kesikli beslenen çalkalama siseli kültürlerde incelendi ve sonuçlar Tablo 24lte gösterildi. Protein A HPLC kolonunda belirlenen toplama anindaki antikor konsantrasyonlari 857 ila 3922 mg/L araliginda oldu. F13 hücre hatti tek kullanimlik 10 L bir Cellbag biyoreaktörün asilanmasi için seçildi. Toplama aninda 4327 mg/L bir antikor konsantrasyonu elde edildi. Bu hücre hatti kesikli beslenen çalkalaina siseli kültürde toplama aninda 271 1 mg/L bir antikor konsantrasyonu elde etti ve incelenen 6 hücre hattinin (B1, D4, D5, F1, F13 ve F18) tamami arasinda ikinci en yüksek spesifik üretim hizina (2.22 pg/hücre/s) sahip oldu. Bu hücre hatti kabul edilebilir büyüme Özellikleri de sergiledi. Tablo 24: CDACF Kesikli Beslemeli Çalkalama Sisesi Kültürlerinde Büyütülmüs ARGX- l 10 Antikorunu Sergileyen 20 Seçili Hücre Hattina Iliskin Büyüme ve Üretkinlik Verileri .. Maksimum Toplama Toplama Toplama Aninda .. Spesifik Hucre Canli Hucre Aninda IV Cm Aninda Antikor (2) Uretim(3I)-Iizi Hatti Konsantrasyonu 9 .. Canlilik Konsantrasyonu (qp) (106/mL) (10 "ucre'S/L) (%) (mg/L) (pg/hücre/s) Maksimum To [ama Toplama Toplama Aninda .. Spesifik Hücre Canli Hücre A p (1) Aninda Antikor Uretim Hizi ninda IVC (2) (3) Hatti Konsantrasyonu (109hücre s/L) Canlilik Konsantrasyonu (qp) (106/mL) ' (%) (mg/L) (pg/hücre/s) (1) Toplama aninda canli hücre konsantrasyonu zaman entegrali. (2) Protein A HPLC7si ile belirlenir. (3) Canli hücre konsantrasyonu zaman entegraline göre antikor konsantrasyonunun dogrusal baglanim analizi ile hesaplanir. Örnek 18: CD70 mAb,lerin Alînitesi 18.1 CD70 Eksprese Eden Kanser Hücresi Hatlari Için Afinite Çesitli kanser hücresi hatlari doygun mAb konsantrasyonlarinda (en az 2 ug/ml) ARGX- açiklanmaktadir) ile test edildi. Analiz 4°C,de (hücrelerin mAb°lerle 1 saat inkübasyonu) veya 37°C°de (hücrelerin mAb"lerle 15 dakika inkübasyonu) yapildi. Baglanma anti- hIgGl-Fc-FITC (AFOOÖ, Binding Site) veya anti-hlgGl-Fc-PE antikoru (eBioscience, 12- 4998) kullanarak tespit edildi. Floresans bir akis sitometresi kullanarak ölçüldü. Sonuçlar Tablo 25,te özetlenmektedir. Tablonun üçüncü sütununda ARGX-110"un test edilen çesitli hücre hatlarina düsük (+), orta (++) veya yüksek (+++) afiniteyle baglanip baglanmadigi gösterilmektedir. Sagdaki sütunda, 37°C,de gerçeklestirilen deneye iliskin olarak ARGX-l 10 için F ACS sinyali (MFI) SGN70 için F ACS sinyaline (MFI)bö1ünmüstür. Bu sonuçlar, bilhassa bir antikorun yüksek afiniteyle baglanmasinin daha kolay seçilebilecek olmasinin beklenebilecegi düsük kopya sayili hücre hatlari söz konusu oldugunda ARGX-110°un SGN70"e göre hücrelere daha yüksek atiniteyle baglandigini göstermektedir. Tablo 25: CD70 mAb°leri ARGX-l 10 ve SGN703in Kanser Hücresi Hatlarina Baglanmasi ARGX-llÜ FACS,inde Tip Hücre Hatti ARGX-110 sinyal/SGN70 F ACS3inde sinyal Büyük B hücreli lenfoma SU-DHL-6 + 2.4 Hodgkin disi lenfoma MHHPREBI +++ 1.2 Manto hücreli Lenfoma Kronik lenfositik lösemi JVM-3 ++ ARGX-l 10 FACS"inde Tip Hücre Hatti ARGX-l 10 sinyal/SGN70 F ACS"inde sinyal Kutane T hücreli lenfoma U266 +++ 0.8 Mültipl miyelom MM1.S ++ KMSIZMB +++ 786-0 +++ 2.1 Renal hücre karsinomu Caki-l ++ 1.9 A498 ++ 1.0 Astrositom U251 +++ Akciger karsinomu A549 + 3.8 WM1205-Lu +++ WM852 + Melanom WM3248 +++ WM793 + WM1552C ++ WM115 +++ Gliyoblastom U87M G ++ 2-0 U343 ++ Over karsinomu SK OV 3 Pankreas karsinomu PANC'I ++ 2.9 Bir baska deneyde, farkli hücre hatlari için CD70 mAbsleri, ARGX-l lO, SGN70 ve MDXl4l lsin [bakiniz yukarisi] çesitli konsantrasyonlarda bariz baglanina afinitesi belirlendi. Hücreler 1 saat at 4°C`de CD70 baglayici mAbderin bir seyrelti seri ile inkübe edildi ve anti-hIgGl-Fc-FITC veya anti-hIgG-Fc-PE antikoru kullanarak baglanma tespit edildi. Floresans bir akis sitometresi kullanarak ölçüldü ve ortalama tloresans isaretlendi. Sonuçlar Sekil 15,te gösterilmektedir. Sonuçlar hücrelerde üç farkli mAb'nin CD70 için afinitesinin karsilastirilabilir oldugunu göstermektedir ancak SU-DHL-6, A549 ve MKN45 gibi bazi hücre hatlarinda MDXl4ll ve SGN70 ile karsilastirildiginda ARGX-l lOaun baglanmasi daha üstün oldu. SU-DHL-6, A549 ve MKN45,e baglanma ECSOlsi, U266 ve birçok baskasi gibi baska hücre hatlarindaki ECSO ile karsilastirildiginda tüm mAb°ler için daha yüksek olmustur, ki bu da muhtemelen mAbinin sadece bir kolla (F ab) baglandigini, artik avidite (baglanma gücü) saglamadigini ve dolayisiyla daha düsük atiniteler ortaya çikarttigini gösterir. Aslinda, Biacore"da test edildiginde, SGN70 ve MDXl4l ile göre ARGX-l 10 Fab"sinin afinitesi çok daha yüksektir (bakiniz asagisi). 18.2 CD70 Eksprese Eden Hasta Hücreleri Için Afmite Kronik lenfositik lösemi (CLL) hastalarindan (2 yüksek riskli hasta, 1 düsük riskli hasta) alinan primer hücreler RPMI 1640 + %10 PES içinde yuvarlak tabanli 96 kuyucuklu plakalara 250,000 hücre/kuyucuk seklinde yayildi ve RPMI + %10 PES içinde 5 tig/ml bir konsantrasyonda mAb91er eklendi. 5 saate dek 37°C'de inkübasyondan sonra hücreler iki kere buz soguklugunda PBS ile yikandi. Alexa Fluor 647 ile isaretlenmis keçi Anti-Insan inkübe edildi. Plaka iki kere buz soguklugunda PBS ile yikandi ve 15 dakika oda sicakliginda %4 paraformaldehit eklenerek hücreler sabitlendi. FACS ile sinyaller ölçüldü. Sonuçlar Sekil 167da gösterilmektedir. Sonuçlar ARGX-110"un CLL hastalarina ait hücrelere iyi baglandigini, SGN70°in ise neredeyse hiç baglanma sinyali vermedigini göstermektedir. 18.3 Biacore°da CD70 F abderinin Rekombinant CD70 Için Afinitesi Rekombinant insan CD70 bir CMS Biacore çipinde sabitlendi. Sabitleme Biacore tarafindan saglanan bir usule göre ve NHS/EDC kitini (Biacore AB) kullanarak gerçeklestirildi: çipin etkinlestirilmesinden sonra pH,i 5 olan 10 mM asetat tamponda 50 ug/ml bir rekombinant CD70 çözeltisi hazirlandi ve bu çözeltinin (50 ng) l u1,si enjekte edilerek yaklasik olarak 1000 RU bir yüzey yogunlugu elde edildi. Papain sindirimi yoluyla CD70 mAb7leri ARGX-l 10, MDXl4ll ve SGN70 için F ab,ler hazirlandi. Yaklasik olarak [00-400 tig/ml bir konsantrasyondaki bu F ab"ler HEPES- tamponlu salin (0.1 M HEPES, 1.5 M NaCl, 30 mM EDTA, %0.5 h/h yüzey aktif madde P20) içinde 6 kat seyreltildi. Enjekte edildiler (30ul) ve 30 ul/dk bir akis hizinda akis hücrelerinden geçirildiler. Fabanin CD70°e baglanmasindan sonra 10 dakika bir süre ayrisma hizi izlendi. Ayrismanin ardindan akis hücresi yüzeyleri 5 pl 10 mM NaOH enjekte ederek yenilendi. Bazen Fabalerin afinitesine bagli olarak yüzeylerin yenilenmesi için birden fazla NaOH enjeksiyonu gerekli oldu. Ayrisma hizi analizi BlAevaluation yaziliinina basvurarak yapildi. Önce bos akislar sensogrami kaplanmis akis hücresiyle elde edilenlerden çikartildi. Daha sonra Fit Kinetics uygulamasini kullanarak 10 dakikalik bir zaman araliginda ayrisma hizi belirlendi ve Kd degeri hesaplandi. Ayrisma hizlari Tablo 26,da özetlenmektedir. Tablo 26: Insan CD70°e Baglanmak Için Fab"lerin "Ayrisma Hizi" Ayrisma Hizi [10'4 s"] Ayrisma Hizi [10'4 s"] 18.4 CD70 mAb"leri Ile Baglanan SU-DHL-6 Hücrelerinde Liziz Degerlendirmesi Için Yükleme Deneleri SU-DHL-6 hücreleri (diffüz büyük B hücreli bir lenfoma hücre hatti) 50,000 hücre/kuyucuk seklinde kuyucuklara pipetlendi, ardindan saglikli dönerlere ait 300,000 yeni izole edilmis PBMC/kuyucuk içine yüklendi ve farkli konsantrasyonlarda nuÄb71er eklendi. Numuneler 2 gün inkübe edildive FACS ile hücre hatti tükenmesi açisindan (anti- bakimindan en iyi etki gücü en yüksek liziz %7sini de veren ARGX-l 10 ile elde edildi. Sonuçlar Sekil 17°de gösterilmektedir. Örnek 19: CD70 mAb"lerin CD27-CD70"i Bloke Etme Etkinligi CD70 ve CD27 arasindaki etkilesim tümör hücresi sagkalimi, proliferasyonu ve/veya tümör mikroortaminda immün baskilanma ile iliskili olabilir. Bu nedenle ELISA ile CD70 mAbilerin CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi bloke etme kapasitesi incelendi. Bu analizde, bir mikrotitrasyon plakasi (Nunc Maxisorb) önce PBS içinde 1250 kat seyreltilmis (yaklasik olarak 3.5 tig/ml bir nihai konsantrasyon elde etmek için) 100 111 anti-FLAG M2 monoklonal antikoruyla (Sigma Aldrich, F3165) gece boyunca 4°C`de kaplandi. Plaka bir kere PBS-Tween ile yikandi ve oda sicakliginda 2 saat 300 ul PBS-%1 kazein ile inkübe edildi. Plaka tekrar üç kere PBS-Tween ile yikandi. PBS-%0.] kazein edildi. Plaka bes kere PBS-Tween ile yikandi. Test edilen CD70 mAb plakaya eklendi; stok antikor çözeltisinin PBS-%0.] kazein içinde seyreltilmesiyle çesitli konsantrasyonlar elde edildi. Bunun hemen ardindan, 50 pl 1 tig/m1 ( rekombinant insan CD27 Fc kimera (R&D Systems 382-CD, MA = eklendi ve çalkalayarak oda sicakliginda 1 saat inkübe edildi. Plaka bes kere PBS-Tween ile yikandi. 13-0271) eklendi ve plaka çalkalayarak oda sicakliginda bir saat daha inkübe edildi. Plaka bes kere PBS-Tween ile yikandi. PBS-%0.1 kazein içinde 5000 kat seyreltilmis 100 ul Strep-HRP (Jackson Immunoresearch 016-030-084) eklendi ve plaka çalkalayarak oda sicakliginda bir saat daha inkübe edildi. Plaka bes kere PBS-Tween ile yikandi. 100 u] TMB plakaya eklendi ve 620 nm°de OD ölçüldü. Bu analizi kullanarak ARGX-110"un bloke etme gücü SGN70 ve MDX141 1 ,in gücü ile karsilastirildi. Sekil 18"de gösterildigi gibi ARGX-l 10 CD70 ve CD27 arasindaki etkilesimi bloke etmekte iki karsilastirma mAb°sine göre çok daha (yaklasik 100 kat) güçlüdür (IC50 ARGX-. Örnek 20: CD70 mAbHerin Baglanma Özellikleri .1 Insan Disi Türlere Ait CD70 ile Çapraz Reaktitîik CD70 mAbilerinin hayvan çapraz reaktifliginin belirlenmesi in vi'vo kavram kanitlama çalismalarinda hangi hayvan modellerinin kullanilabilecegini ve toksikoloji çalismalari için en uygun türlerin hangileri oldugunu degerlendirmek amaciyla kullanislidir. A1 yanakli maymun CD70"i insan CD70"e %94 özdes, Sinomolgus maymunu CD709i ise insan CD70,e %95 özdestir. Farkli türlerin dizilerine ait bir hizalama Sekil 19,da gösterilmektedir. Insan dizisi ile karsilastirildiginda farkliliklari vurgulamak için fare ve siçan CD70 dizileri de dahil edilmistir. baslayan bir seyreltme serisiyle U266iya (insan mültipl miyelom hücre hatti), LCL8664 hücrelerine (al yanakli maymun B hücreli lenfoma hücre hatti, ATCC-CRL-1805) ve HSC- F hücrelerine (sinomolgus maymunu T hücresi hatti, fetal dalak türevi lenfositler, Japon Saglik Bilimi Vakfi) baglanma bakimindan test edildi. Tespit keçi anti insan IgGl FITC kullanarak gerçeklestirildi. Numuneler FACS ile analiz edildi. Sonuçlar Sekil 20ide gösterilmektedir. CD70"in her iki maymun hücre hattindaki kopya sayisi çok düsüktür (FACS,de düsük sinyaller). Bununla birlikte, ARGX-l 10 sinomolgus ve al yanakli maymun CD70"i için SGN70 ve MDX141 l"in bu türlerin CD70°ine gösterdikleri atinite ile karsilastirildiginda yüksek bir afiniteye sahiptir. .2 CD70 mAb,lerin Blake Etme Gücü etkilesimi bloke etme kapasitesi yukarida Örnek 197da açiklanan bloke edici ELISA"yi kullanarak test edildi. Analiz insan. al yanakli maymun ve sinomolgus maymunu Flag- TNC-CD70 için her antikorun bloke etme gücünü ölçecek sekilde uyarlandi (Wyzgol ve ELISAida, farkli türler arasindaki IC50 degerlerinin dogrudan karsilastirilabilinesini saglamak için söz konusu farkli türlere ait CD70 için tam olarak ayni kosullar kullanildi. Sonuçlar Sekil 21 ,de gösterilmekte ve insanlara, al yanakli mayinunlara ve sinomolgus maymunlarina ait hücreler kullanildiginda görülen sonuçlari desteklemektedir. ARGX-l 10 degismemis bir etki gücüne ve dolayisiyla insanla karsilastirildiginda mayinunlarin CD70°i için degismemis bir afiniteye sahiptir, SGN70 ve bilhassa MDX1411 maymun CD70°i için insan CD707ine nispeten daha düsük bir afiniteye sahiptir. IC50 degerleri Tablo 277de özetlenmektedir. Tablo 27: Farkli Türlere Ait CD70 Için ELISAtda CD27-CD70 Etkilesiminin Blake Edilmesine Iliskin 1C50 ._ Inhibisyon ELISA,sinda IC50 [ng/ml] Hucreler . .3 Denatüre CD70,e Baglanma CD70 mAb,lerin denatüre rekombinant CD70,e baglanmasi ELISA ile incelendi. Rekombinant CD70 5 dakika 95°C,de isitarak, ardindan hemen 5 dakika buz üzerinde sogutarak denatüre edildi. Bir mikrotitrasyon plakasi denatürasyonlu veya denatürasyonsuz tig/ml CD70 ile kaplandi. Plaka bloke edildi ve test edilecek CD70 mAb,ler 10 tig/ml seklinde uygulandi. Yikama sonrasinda anti-insan IgG-HRP kullanarak mAbalerin baglanmasi tespit edildi. Kaplama için bir pozitif kontrol olarak, CD70 mAb°lerini kullanmak yerine anti-F lag fareden elde edilen bir mAb uygulandi ve tespit anti-fare-HRP ile yapildi. TMB substrat olarak kullanildi ve 620 nm'de OD ölçüldü. Bu ELISA7nin CD70,e baglanirken diger mAb°lerin baglanmadigini göstermektedir. Diger mAb71er arasinda bazilari da denatüre CD70"e baglanmaktadir (fe 5F4, 9G2, 57B6). .4 F are-Insan Kimeralarini Kullanarak Epitop Haritalama mAb,lerin domen tanimasini haritalamak için insan ve fare CD70 domenlerini degistirerek insan-fare CD70 ECD füzyon proteinleri olusturuldu. Olusturma standart rekombinant DNA ve PCR metodolojilerini kullanarak yapildi. F are ve insan kimeralari ELISA7da yakalamak için bir Flag isareti ve proteinin trimerizasyonu için bir TNC (F lag-TNC-CD70) ile bir ökaryot ekspresyon vektörüne klonlandi. Proteinler HEK293 hücrelerinde çözünür proteinler seklinde eksprese edildi. Farkli kimeralarin dizisi Sekil 23°te gösterilmektedir. Bir Maxisorb (Nunc) mikrotitrasyon plakasi 3.5 tig/ml fare M2 anti-Flag mAb (Sigma Aldrich, F3165) ile kaplandi ve farkli kimeralar yakalandi. Test edilecek CD70 mAb'lerin bir seyrelti serisi 10 tig/ml bir konsantrasyondan baslayarak ve 3 kat seyrelti yaparak uygulandi. 2 saat sonra baglanma 16000 kat seyreltide anti-insan-Fc-HRP kullanarak tespit edildi. Boyaina ABTS ile yapildi ve 405 nmide OD ölçüldü. Pozitif kontrol olarak hem insan, hem fare CD70,ine iyi afiniteyle ve ayrica kimerik insan-fare CD70 varyantlarina baglanabilen CD27-Fe uygulandi. Baglanmaya iliskin ECSO degerleri Tablo 28lde özetleninektedir. Tablo 28: ARGX-l lOiun Sekil 23°te gösterilen Insan-F are CD70 Kimeralarina Baglanmasi EC50 [ng/ml] ARGX-llO CD27 fare NB 41 NB: baglanma yok baglanabildigini ancak 2, 3 ve 4 kimeralarina ve fare F'lag-TNC-CD70"e baglanamadigini götermektedir. Bu durum ARGX-l 10"a iliskin epitopun HIQVTLAICSS (DIZI ID. NO:342) ainino asit dizisi içinde oldugunu gösterir. Örnek 21 : Farkli Tümör Hücresi Hatlarina ve Primer Tümör Hücrelerine Iliskin CD70 Internalizasyonu CD70 antikorlarinin renal karsinomdan elde edilen 786-0 ve A498 hücre hatlarina baglanmasinin antikor-reseptör kompleksinin hizla (1 saat içinde) intemalizasyonuna yol kuyucuklu bir mikrotitrasyon plakasinda kültür edildi ve gece boyunca 37°C,de inkübe edildi. 2.5 tig/m1 mAb eklendi ve hücrelerle birlikte 0-24 saat 37°C,de inkübe edildi. ile intemalize olan mAb miktarini temsil eden "IÇERDE" kodu verildi) veya PBS ("DISARDA" kodlu ve reseptöre hücrenin disinda baglanan mAb miktarini temsil eder) ile yikandi. Bunun ardindan, hücreler %4 paraformaldehitle 30 dakika oda sicakliginda sabitlendi, PBS ile yikandi ve 5 dakika %02 Triton-X-IOO ("IÇERDE") veya PBS ("DISARDA") ile inkübe edildi. Ardindan hücreler iki kere yikandi ve oda sicakliginda 10 dakika 100 mM glisin ile yikandi, bunu takiben PBS+%l BSA ile 30 dakikalik bir inkübasyon yapildi. Son olarak Li-Cor Odyssey kizilötesi tarayicida analiz öncesinde hücreler keçi anti-insan FC (Jackson Immunoresearch 109-005-098) ve anti-keçi Sonuçlar tüm mAbilere iliskin intemalizasyonun karsilastirilabilir oldugunu ve mAbîerden hiçbirinin tam olarak intemalize olmadigini göstermektedir. Baslangiçta, yani 0 ve 2 saat arasinda mAb internalizasyonu çok hizli gider ancak daha sonra bir sabit duruina ulasilinis gibi durmakta olup, burada 37°C9de 24 saat inkübasyon sonrasinda bile yaklasik %30 mAb hücrenin disinda kalir. CD70 ile baglanan mAbilerin internalizasyonu baska hücre hatlarini kullanarak da incelendi. Bu deneylerde, asagida açiklanan protokole göre FACS analizini kullanarak bir zaman islevi olarak sadece hücre disindaki mAb sinyali ölçüldü. Bu alternatif protokolün yukarida açiklanan usul ile karsilastirildiginda güvenilir bir okuma oldugu belirlendi Süspansiyon hücreleri için hücreler santrifüjlendi, sayildi ve pelet besi ortaminda 5 x 105 hücre/m1 bir yogunluga yeniden süspanse edildi ve bu süspansiyonun 100 ulssi 96 kuyucuklu V tabanli bir plakanin her kuyucuguna eklendi. Yapisan hücreler için hücreler 96 kuyucuklu bir plakaya ekildi ve 37°C"de ve %5 COfde hücreler tamamen yapisana dek büyütüldü. Hücreler ilaveten 48 saatlik bir süre için dogrusal hücre büyüinesini saglayan bir yogunlukta yayildi. dakika, 5 dakika, 0 dakika (= mAb olmadan) gibi çesitli zamanlarda 37°C7de, %5 COfde hücrelerle birlikte inkübe edildi. Inkübasyonu takiben plakalar soguk FACS tamponuyla buz üzerinde yikanarak intemalizasyon reaksiyonu sonlandirildi . Bu asamada yapisan hücreler hücre ayirma çözeltisi (Sigma) kullanarak plakadan ayrildi ve V tabanli 96 kuyucuklu bir plakaya aktarildi. Bunun ardindan hücreler 4°C"de döndürüldü. Üst faz plakayi dikkatlice ters çevirerek atildi. Hücreler hücre peletini 100 ul soguk FACS tamponu içinde dikkatlice yeniden süspanse ederek iki kere yikandi. Yikamanin ardindan yeniden süspanse edildi. Plaka çalkalanarak 30 dakika 4°C,de inkübe edildi ve hücreler üç kere daha FACS tamponuyla yikandi. Hücreler 100 ul F ACS tamponunda yeniden süspanse edildi ve hemen floresans ölçüldü. Orta degerli/ortalama Iloresans yogunlugu Deneylerin bir kismi iki kere veya daha fazla tekrarlandi. Iki deneyin sonuçlari oldukça karsilastirilabilir oldu. Bazi deneylerde, U266, SU-DHL-6 ve Raji hücrelerini kullanarak, mAb konsantrasyonunun intemalizasyon hizi üzerinde bir etkisinin olup olmadi gini görmek için bir konsantrasyon araligi (20 ng/ml - 5 ug/ml) kullanildi. Bu tür bir etki gözlemlenmedi (veri gösterilmiyor). Test edilen farkli hücre hatlarina iliskin sonuçlar Tablo 29,da gösterilmektedir ve bu sonuçlar internalizasyonun yaygin bir olay olmadigini, aslinda oldukça nadir görülen bir olay oldugunu kanitlamaktadir. Tablo 29"da farkli hücre hatlari için 6 saat sonra görülen intemalizasyon yüzdesi özetlenmektedir. Bu sonuçlar ARGX-l 10sun çogunun hücrelerin disina bagli kaldigini göstermektedir, ki bu da hücreleri ADCC, CDC ve ADCP°ye daha egilimli kilmaktadir. Tablo 29: 6 Saat Sonra Farkli Hücre Hatlarinda CD70 mAb7lerin Internalizasyon %,si HH H Ham InteînîîîgaîSEgîwsi Herâîtîî'gîîîzlçm Burkitt lenfomasi Raji 2 2 Büyük B hücreli SU-DHL-6 3 3 lenfoma Hodgkin lenfomasi L428 15 15 Hodgkin disi MHHPREBI 19 19 lenfoma Manto hücreli Mino 12 Le"fOma Granta 519 7 7 Kronik lenfositik Mecl 3 lösemi JVM-2 8 Hasta LR Kutane T hücreli HUT78 35 lenfoma HH 31 33 Mültipl miyelom U266 38 MM1.S 35 Renal hücre 786-0 58 karsinomu C aki-l 37 5 4 A498 66 Astrositom U251 52 52 Gastrik karsinom MKN-45 0 Akciger karsinomu A549 3 Melanom WM1205-Lu 45 44 THr H Heeer InteînîîîgaISîgîm H"Gîtîîîîîîzlçi" WM3248 34 Gliyoblastom U87MG 10 21 U343 32 Over karsinomu SKOV3 51 51 Pankreas PANC-l 29 karsinomu P ANC-89 20 25 Tablo 30: Seçili CD70 Antikorlarini Kodlayan Nükleotit Dizileri 41D12 Agir zincir WGÂGGYGCAOCTOGTGO AOICTOOG CGCCßiGGC'I' OCABGG MOGGCTCGAGTGGOT C1' CAGA'I'A'I'TA CAAAAOGTCCAAGTGIGTTCCCICTTGCTCCCTCAICCAAGAGTA AAGGTGGATAAGAAAGTGGAACCMAATCATGTGACAAGACßCAC CGIOTTCCIGYTTCCTCCIAMCCCMAGACACTCTGAIGATIAGT CCGCTCCTAIAGAGMAACAATATCCMAGCCAAAGGTCMCXZTC GMCAACTACAAAACCACCCCTOCTGTTCTGGATTCTGACGGATC TTTCTTCCTTTATTCTAAACTCACCGTGGAIAAAAGCAGGTGGCAG IAACCATTATAOOCAGAAGTCTTTGTCCCICAGîOCAGGAAAGTG DEGISKEN BÖLGE LAMBDA SABIT BÖLGESI GCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGT ACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAA CACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGAT CCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCA GGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTA ATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTA TCAGAGGAACTGCAGGCCAATAAAGCCACACTCGTCTGCCTCAT CAGTGACTTCTACCCAGGAGCCGTGACCGTGGCCTGGAAAGCCG ACAGTAGCCCCGTGAAGGCCGGGGTGGAGACAACAACTCCTAGT AAACAGAGTAATAACAAATATGCCGCTAGTAGTTATCTCTCCCTCA CTCCCGAGCAGTGGAAGTCTCACAGAAGTTACTCTFGTCAGGTTA CTCACGAGGGTTCCACAGTGGAAAAGACTGTGGCCCCTACTGAA DEGISKEN BÖLGE LAMBDA SABIT BÖLGESI CCAGGAAAGGGGCTAGAGTGGGTCTCAGGTGATAATACCTACGA CAAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGG CTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTA GGTAGAGGCATTATGGGGGAGTACGGCATGGACTACTGGGGCAA Hafif Zincir CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCGTCCCTGTCAGTGTCTCCAGG ACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAACACAAACAGC CCCAGTCGCTTCTCCGGATCCATCTCTGGGAACAAAGCCGCCCT CAGCCCGAGGACGAGGCCGACTATTACTGTGCTCTGTACATGGG GCTATGTTCGGCGGAGGGACCCATCTGACCGTCCTGGGTCA 59D10 Agir zincir GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTG TCCTGTGCAGCGTCCGAATTGTCCTTCAGTATTTCTGAGATGACC CCAGGAAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGGTGTAAC AGTTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGA TTGTATCTACAAATGAACAGCCTGATACCCGAGGACACGGCCGTA ACTAGTGGTACTTACTACTTCATCCCCGAGTATGAGTACTGGGGC Hafif Zincir CAGTCTGTGCTGACCCAGCCTCCCTCCGTGTCTGGGTCTCCAGG TCCTGTGCAGGAACCAGCAGTGATGTTGGGTATGGATACTATGTC TTCCCAGGAATGGCCCCCAAACTCCTGATATATGACGTCAATAAA GCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGGCCGGCAACACTGCCTCCCT CAGTCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGTGCCTCATATAGAAGT TTCGGCGGAGGGACCCATCTGACCGTCCTGGGT DIZI LISTESI <1 10 arGEN-X BV <120 CD70 Antikorlari <130 NLW/P116378WOOO <160 351 <170 PatentIn sürüm 3.5 <2101 <211 30 <212PRT <213 Lama glama <400 1 Glu Lou Gln Val Vol Glu Sir Gly Gly Gly Lou Vol Gln Pro Gly Gly l 5 10 15 25 30 <210 2 <211 30 <212 PRT <213 Lama glama <400 2 Glu Vai Gln Lou Vil Glu Sir Gly Gly Gly Lou Val Gln ?ro Gly 611 1 5 10 15 8.: Lou irq hu sor Cyi ni A1& 80: Gly Db. Th: Ph. 80: 25 30 <210 3 <211 30 <212 PRT <213 Lama glama <400 3 1 5 10 is 50: m &:9 bu 30: en AJ.. ani :0: Giy Db. rh: PM up 25 30 <2104 <211 30 <212PRT <213 Lama glama <400 4 Glu Val Gln Val Gin Glu Sir Gly Gly Gly Lou Val li. Pro Gly Gly 1 5 1 0 15 : m by. Lou :o: en AJ.. Mi 80: Giy Ph. rh: Ph. up 25 30 <2105 <211 30 <212PRT <213 Lama glama <400 5 Gln Vai Gln !Au Val Glu Sir Gly Gly Mp Iiiu !lal 6111 Pro Gly 611 l 5 10 15 80: hu uç Im› sor Cy- Aii 11& S.: aiy Db. rh: vii 80: 25 30 <210 6 <211 30 <212 PRT <213 Lama glama <400 6 Giu Vai Gin Ian Vai Gln Pro Gly Ala Giu ncu m Lyi Pro 61)' Ala 1 5 10 15 50: Vol Lyi Vii 30: Oya iyi A1; 80: Giy Ty: rh: Ph. m 25 30 <2107 <211 30 <212PRT <213 Lama glama <400 7 Sin ?al Gin Mu Gin Glu sir Giy Pro Giy mu vai iyi Pro 8.: Gin 1 5 10 15 th: Lou 8.!' Ian All Cyi I'br Yil 8.: Gly Oly B.: II.. rh: 25 30 <2108 <211 30 <212PRT <213 Lama glama <400 8 Gln Val Gln !au Val Glu sir Gly Giy Gly Inn m (Sin ?:0 Gly Gly 1 5 10 15 80: Lou Azg un 8.: Cyi Ala :mi Son: Giy Db. ?hr Ph. Bu: 25 30 <210 9 <211 30 <212 PRT <213 Lama glama <400 9 Gln im Gln ni Vai Glu Sir Gly Gly Gly Lou m Gln Pro ciy si, 50: m m Lou :o: en Mo Mi 80: Giy vb. rh: PM 80: <210 10 <2115 <212PRT <213 Lama glama <400 10 <21011 <2115 <212PRT <213 Lama glama <400 11 <210 12 <2115 <212 PRT <213 Lama glama <400 12 <210 13 <2115 <212PRT <213 Lama glama <400 13 <210 14 <2115 <212PRT <213 Lama glama <400 14 <210 15 <2115 <212PRT <213 Lama glama <400 l 5 <210 16 <2ll7 <212 PRT <213 Lama glama <400 16 <210 17 <2115 <212 PRT <213 Lama glama <400 17 <210 18 <2115 <212 PRT <213 Lama glama <400 18 <210 19 <2115 <212 PRT <213 Lama glama <400 19 <210 20 <21 1 5 <212 PRT <213 Lama glama <400 20 <210 21 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 21 Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser <210 22 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 22 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser <210 23 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 23 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Giy Leu Glu Trp Met Gly <210 24 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 24 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly <21025 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 25 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser <210 26 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 26 rh: ni 5.: rh:: Asp un si: &:9 th: ry: w: Al.. !up 50: vii iyi 1 s 10 15 <210 27 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 27 Asp 11. "n "n Giu Giy Giy 'rhr rh:: :y: 1ryi:- m Asp Sir vii Lyi 1 5 1.0 15 <210 28 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 28 hp Iio un nn Glu Gly up 'nu 'l'hr :yi: :yy :da np sir vii Lys 1 5 10 15 <210 29 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 29 si: ni ryr Ilit !yt up Su' si: th: ryr 'l'yr Al.. Asp Sor Vil iyi 1 5 10 15 <210 30 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 30 Ala 11. :or 'rrp Su' 61:( 6.13( Ghz 'rhr Ph. tyr ni Glu s.: Int. iyi 1 5 10 15 <21031 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 31 Giu ni rh: Ani ?yt Giy 'ryr nn An; !yi- fyr ni Asp Sor vii iyi 1 5 10 15 <210 32 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 32 ..:9 !1. tip Pro Glu Mp Gly Gly 'rhr Lyi Ty: AJ.: 6.111 Lyi PM 61:: 1 5 10 15 <210 33 <211 16 <212 PRT <213 Lama glama <400 33 Ala ne 01)' Se: Axq Gly Sor 'mx' 'ryr 'ryr Set ?to 891' Mu Lys 'rhr 1 5 10 is <210 34 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 34 Asp ni nn Sor Giy Giy Giy sir 'rhr iyi ryr m Asp 5.: 11.1 Lyi 1 5 10 15 <210 35 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 35 Sir !1. Ty: Sir Alp Sir Sir !yt m !yt !yt Ala Asp Sir Va). iyi l 5 10 15 <210 36 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 36 8.: !1. Tv: 8.:: Ilii 8.: Hat !yt th: !yi- Yyr Ala Asp Sor Va). iyi l 5 1.0 15 <210 37 <211 17 <212 PRT <213 Lama glama <400 37 Asp ni un un Giu Giy !yt Giu rh: !yt !yt Al.. Asp si: '1.1 by: 1 5 10 15 <210 38 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 38 1 5 10 15 in nn Sor ncu iyi Sor ulu Mp !hr na vii Ty: !yt Cyi Il. m 25 30 <210 39 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 39 Am Ph. mi- n. Sir Ata Mp Ann Ala Lyi Ain rh: hu m hu Sin 1 5 10 15 25 30 <210 40 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 40 Arq Ph. 'rhr Il. Sir 1:; Mp nn Ala by. nin 'l'hr !Au m !Au Sin 1 5 10 15 m up 801' !on by. ?:0 ulu hp 'nu- n. Lou Ty:: !yt Cyi vii. m 25 30 <21041 <211 32 <212PRT <213 Lama glama <400 41 irq Ph. 'nu' Ilo sir rh: Mp Ann Ala Lyi Ain !hr Vol 17!' Lou Sin 1 5 10 15 Hot un 30: Lou :iyi Bu' ali: up 'nur ila vii !yt 'ryi' ey. ili iyi 25 30 <21042 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 42 m Ph. Tht 110 8.: uç un m Ala by. nin TI:: un !yi- m 61:: 1 5 10 15 25 30 <210 43 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 43 1 5 10 is 25 30 <210 44 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 44 Arq Va). '1112 the rh: Ala Mp Ala Sir 111: 8.: rh: Ala ryr Val Glu 1 5 10 15 25 30 <210 45 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 45 1 5 10 15 25 30 <210 46 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 46 Arq PM Ala !1. 80: Ana Mp m Ala Lyi iin !hr m ?yt im.: 61.0 1 5 10 15 HM: un 80: bu Lyi Pro 611: hp 'rhr Ala vii ?yt !yt 0,. Al. iyi 25 30 <210 47 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 47 An) PM 'hu' :1. Sir i'm- Aip m Ala Lyi Ain ni: m 17:' hu 610 1 5 10 15 Mt un 8.: Lou :iyi ?:0 lap up 'Hu' Ala Vii ?yi !yt q. Ala Gly 25 30 <210 48 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 48 Arq Ph. 'mi' 110 Sir Arg Mp nn Ala by. nin 'l'hr !nu !hr hu Sin 1 5 10 15 25 30 <21049 <2116 <212PRT <213 Lama glama <400 49 <210 50 <211 13 <212 PRT <213 Lama glama <400 50 Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Val Pro Ile Phe Asp Ser <210 51 <211 19 <212 PRT <213 Lama glama <400 51 Asp 11. &in irq 80: tv: Giy 80: 80: ?tp si: ait Ph. Gly Pro Il. 1 5 10 15 <210 52 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 52 Giy Met Gly Leu Ala Giu Gly Leu Thr Asp <210 53 <2ll 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 53 Ser Leu Gly Leu Glu Tyr Gly Tyr Giy Asp <210 54 <2117 <212PRT <213 Lama glama <400 54 <210 55 <211 21 <212 PRT <213 Lama glama <400 55 vii Thr 617 610 Il. ru: Ty: Ann Sor Gly Sir ?yt !yt Ty: !hr Lou l 5 10 15 <210 56 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 56 Glu Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Trp Thr Asn Glu Tyr Asp Tyr <210 57 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 57 Ser Ser Asp Tyr Glu Gly Ser Phe Ala Ser <210 58 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 58 Ser Ser Asp Tyr Giu Gly Leu Phe Vai Ser <210 59 <211 13 <212 PRT <213 Lama glama <400 59 Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Val Gln Ile Phe Asp Ser <210 60 <211 11 <212 PRT <213 Lama glama <400 60 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser <210 61 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 61 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Ile Val Ala Ser <210 62 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 62 Gln !tur Val vai ni: Gln Giu Pro :o: mu sir vu :n- ?:0 Gly 61, i 5 10 15 <210 63 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 63 Gln &la Val Vol Thr Gln Gln Pro 8.: Lou Sir Val 3.: Pro Giy Giy 1 5 10 15 <210 64 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 64 cm Ala Vai Vai 'nar uii Pro Pro 8.: Lou Sir iia 5.: Pro Giy Sir 1 5 10 is <210 65 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 65 Gln Sor Ala hu !hr Gln Pro Pro Sor ?lal Sor Gly 'l'hr Lou Giy Lyi 1 5 1.0 15 <210 66 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 66 Gta 8.:: Ala !nu ni: Gin Pro si: Ala Ve). si: Vol 80: m Gly Gin l 5 10 15 rh: mi &:9 II.. 'I'hr Oy. <210 67 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 67 Gln 80:: Yil m 'l'ht Gin Pro ?to 80: Lou 80: &li s.: ?ro Sir 80: l 5 10 !5 Sir vu Arq !du 'Bu' Cyi <210 68 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 68 Gln Sor: Ala Mu 'rhr Gln Pro Sir Ala mu Sir Val fb.: im Gly 610 1 S 10 !5 mi: n. !iyi no 'mu Cy- <210 69 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 69 cm sir Vai Vai 'l'hr Gin Pro Pro Sor mu Sir iia sir Pro Gly :or 1 5 10 is 802 Vil irq m '11:: Cyi <210 70 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 70 su ua Va). !au 'l'hr 61.11 Pro Pro 80: !su Sir &1: Sor Pro Gly :or 1 5 10 15 s.: vii uç un 11:: Oy. <210 71 <21122 <212PRT <213 Lama glama <400 71 Gin na vii vii 'nu- Gln Glu Pro 30: ncu 'l'hr Val si: Pro Gly 61' 1 s 10 15 th: Vii nu' Mu 'nar Cy- <210 72 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 72 Gin s.: Ala Ian 'rht Gln Pro 8.: th: Val Sir Vai s.:- hu 61)' 6111 1 5 10 15 <210 73 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 73 Gin Pro Va). Mu rh: Gin Pro si: Ala Vol 8.:: Vol 80: hu Gly (Sin 1 5 10 15 th: Ala kg Il. 'nu' Oy. <210 74 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 74 m Ph. Not !nu rh: Gln Pro 8.: Ala Val si: Vol 3.: :Lou Gly Gln 1 5 10 15 th: Ala Arq IL. 'l'hr Cyi <210 75 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 75 Gin Ala Val !nu 'rhr Gln Pro si: 8.: Val Sir Vai Sir !Au Glyi Gin 1 5 10 15 th: ni Lyi IJ.. ni: cy. <210 76 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 76 cm Ala Vai !au 'i'hr Gin Pro si: Sor Vai Sir Val sir :au Gly Gin 1 5 10 15 <210 77 <211 14 <212PRT <213 Lama glama <400 77 Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr Thr Asn Tyr Pro Gly <210 78 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 78 Gly Leu Ser Ser Gly Ser Vai Thr Ser Ser His Tyr Pro Gly <210 79 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 79 Gly Leu Ser Ser Gly Ser Vai Thr Ser Ser Asn Tyr Pro Gly <210 80 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 80 Gly Leu Thr Ser Gly Ser Vai Thr Ser Ser Asn Ty: Pro Asp <210 81 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 81 Thr Leu Ile Ser Gly Asp Asn Ile Gly Gly Tyr Asp Iie Ser <210 82 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 82 Ala Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Ser <210 83 <211 ll <212 PRT <213 Lama glama <400 83 Gln Gly Gly Asn Ala Arg Phe Ser Ser Phe Ala <210 84 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 84 Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ser Val Gly Asn Tyr Asp Ile Ser <210 85 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 85 Gln Gly Gly Arg Leu Gly Ser Ser Tyr Ala His <210 86 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 86 Thr Leu Asn Ser Ala Asn Ser Vai Gly Ser Tyr Asp Ile Ser <210 87 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 87 Gly Leu Lys Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Asn Phe Pro Thr <210 88 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 88 Gly Leu Thr Ser Gly Ser Val Thr Ser Asp Asn Phe Pro Val <210 89 <21111 <212 PRT <213 Lama glaina <400 89 Arg Gly Asp Ser Leu Glu Arg Tyr Gly Thr Asn <210 90 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 90 Arg Gly Asp Thr Leu Arg Asn Tyr His Ala Asn <210 91 <2117 <212PRT <213 Lama glama <400 91 <210 92 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 92 Gln Gly Gly Asn Leu Gly Leu Tyr Gly Ala Asn <210 93 <211 ll <212 PRT <213 Lama glama <400 93 Gln Gly Gly Asn Leu Trp Leu Tyr Gly Ala Asn <210 94 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 94 Gly Leu Ser Ser Gly Ser Ala Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Glu <210 95 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 95 Gly Leu Ser Ser Gly Ser Vai Thr Ser Ser Asn Tyr Pro Asp <210 96 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 96 Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210 97 <211 15 <212PRT <213 Lama glama <400 97 Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Phe 1 5 10 15 <210 98 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 98 Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210 99 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 99 Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210 100 <211 15 <212PRT <213 Lama glama <400 100 Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Giy Ser Pro Pro Arg Tyr Leu Leu Tyr 1 5 10 15 <210 101 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 1 01 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210 102 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 102 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Gln Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210103 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 103 Trp Tyr Gin Gln Lys Ala Giy Ser Pro Pro Arg Tyr Leu Leu Tyr 1 5 10 15 <210 104 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 104 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Giy Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210 105 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 105 Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210 106 <211 15 <212PRT <213 Lama glama <400 106 Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Arg Ala Pro Ile Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210 107 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 107 Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Arg Ala Pro Ile Leu Leu Phe Tyr 1 5 10 15 <210 108 <211 15 <212 PRT <213 Lama glama <400 108 Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Ile Tyr 1 5 10 15 <210 109 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 109 <210 110 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 1 10 <210 111 <2117 <212PRT <213 Lama glama <400 111 <210 112 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 1 12 Tyr Tyr Ser Asp Ser Tyr Lys His Gln Ser Ser <210 113 <211 7 <212 PRT <213 Lama glama <400 1 13 <210 114 <2117 <212PRT <213 Lama glama <400 1 14 <210 115 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 1 15 Tyr Tyr Ser Asp Ser Tyr Lys Asn Gin Gly Ser <210 116 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 1 16 <210 117 <21111 <212 PRT <213 Lama glaina <400 1 17 Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys His Gln Gly Ser <210 118 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 1 1 8 Tyr Tyr Ser Asp Ser Leu Ser His Gln Gly Ser <210 119 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 1 19 <210 120 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 120 <210 121 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 121 <210 122 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 122 <210 123 <211 7 <212 PRT <213 Lama glama <400 123 <210 124 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 124 Vai Asn A511 A511 Arg Pro Ser <210 125 <2117 <212PRT <213 Lama glama <400 125 <210 126 <2117 <212PRT <213 Lama glama <400 126 <210127 <211 7 <212 PRT <213 Lama glama <400 127 <210 128 <2117 <212PRT <213 Lama glama <400 128 <210 129 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 129 Gly Vil. !to Sir Mg Ph. 8.: My S.: 110 50: 01;( Ana Uye Ala Alti 1 5 10 15 ton !hr ilc !hr Gly ali Gln Pro Gln !ip olu hi. Asp Ty: !yi Cyo 25 30 <210 130 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 130 Gly Val Pro Sir &:9 ?yt Sir Gly 8.: II. 8.: Gly Ana by' Ala All Lou th: :1. th: aiy Al.. Cin ?:0 Sin np oiu Ala up ?yi- ryi: Oya 25 30 <210131 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 131 Giy Val ?:0 Sir Arq Ph. Sir Giy 80: !1. Sir Giy Ana iyi Ala Al. 1 5 10 15 hu rh: !:10 th: Oly A1: Ola Pro Giu Asp en 111 hp ryr !yi Oy: 25 30 <210 132 <211 34 <212 PRT <213 Lama glama <400 132 Giy vii Pro :0: Ara Ph. Sor Giy 3.: by. Asp hic 8.: Al: Am Ala l 5 10 15 en m m Lou ne Ser ciy m Gin Ser Gln Mp Giu Ala Mp Ty: 25 30 <210133 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 133 Gly Int Pro Asp Mg Ph. Su: Gly 80: by. 8.: Giy un ni: Ala 80: l 5 10 15 Lou !lu- n. Sor aiy Lou Cin 80: 611: hp Ola iii up !yi- iyi: Oy. 25 30 <210 134 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 134 Giy !1. Pro Ala Mg Ph. Sir Gly 8.: Sor Sir Giy Giy Ala Ala 'rhr 1 5 10 15 Lou !hi- ria Sor Oiy Ala Oln ni Glu Asp Olu Ala up !yi- ryr Oy. 25 30 <210 135 <211 34 <212 PRT <213 Lama glama <400 135 Giy vii Pro :0: Arc Ph. Sor Giy 8.: by. &ip Pro 80: A1: Am Ala l 5 ID 15 Giy hu Mu ben 110 80: Giy Liu Gln Aii Glu Asp Giu Ala np 'bir 25 30 <210 136 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 136 Giy !lo Pro Glu uç mi. 5.: Gly :o: :o: si: Gly Mp m im n:: 1 s 10 15 ben th: no 80: Giy ali @in AJ.. Ola Mp 010 iii Vol 'Iyi' fy: Can 25 30 <210 137 <211 34 <212 PRT <213 Lama glama <400 137 Gly vai ?:0 :o: Mo Ph. Sir: Gly 801' 80: &ip &in 8.: Ala Am Al. 1 5 10 15 Gly m m m n. sir Gly nu Gln !:0 Sin np Glu ua up Ty: 25 30 <210 138 <211 34 <212 PRT <213 Lama glama <400 138 Giy vai Pro Sor Ara Ph. Sor Gly 3.: rh: &ip Ala 80: Ala nin Al. 1 5 10 15 su m m hu ne 89: en Lan Gin Pro Glii Asp ciu mi Mp Ty: 25 30 <210 139 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 139 Giy Vai Pro Sor Arg Ph. Sir Gly 8.: 11. :or Giu Ana Lyi Ala Al: 1 5 10 15 25 30 <210 140 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 140 Gly Vil Pro Sir Arq Ph. Sir Gly 80: 21. th: Gly Ann by. Ala !li 1 5 10 15 Lou 'rbr n. rh: Giy ni Cin Pro mu up olu Mi up 'ryr 'ryr Cyi 25 30 <210 141 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 141 GI., !1. Pro Giu Arg Ph. Sor Giy 80: 8.: Sir Giy Ala nu: Aia Ala 1 5 10 is Lou !hr ne 80: (ay Al. cin ni Glu Asp Ola Gly up !yi- ryr Cyi 25 30 <210 142 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 142 Gly !1. Pro Glu Arg Ph. Sir Gly 80: Arq Mu Gly Giy nu: Ala 'Bir 1 5 10 15 Lou th: vii s.: Oly ali alti A1: 61:: Asp Ola Ala Mp Yy: 'I'yr Oy. 25 30 <210143 <211 32 <212PRT <21 3 Lama glama <400 143 Gly no Pro Giu m ?ha 8.: Gly 80:' 11. s.: Giy m th: Ala '11): l 5 10 15 Lan rh: 1:10 80: aiy Ala (nn Va!. Giu Asp Giu Aii up !yi- ryi: Oy. 25 30 <210 144 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 144 Gly 110 Pro Glu Mg ?bu 8.:: Gly 80: :or 8.: Giy m m Ala 'rhr l 5 10 15 hu !hr n. 80: aiy Ala oin ni Giu Asp aiu Ala n. !yi- !yr Oy. 25 30 <210 145 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 145 617 !1. Pro Glu Mg ?hi ?hr !10 80:' Lyi Sir Gly Gly Hu' Ala 'Hit 1 S 10 15 hu !hr ti. Asp Oiy MJ Gin ua Giu Asp Ola 80: hp !yt !yt Oy. 25 30 <210 146 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 146 Giy !1. Pro Glu Arc Ph. rbr !10 80: by. Sir Gly Giy nu: Ala 'max 1 5 10 15 Lou rh: :1. kp aiy ni Oin ni Giu nn Giu sir up ryr ryr Oy. 25 30 <210 147 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 147 Giy Vai Pro Giy Arg the sir Gly 80: 11. 8.: Gly Ana by. Ala Ala 1 5 10 15 Ldu th: Il. !tr Oly A1. olu Pro Glu Asp Ola Ala up ryr 'l'yx' Oy. 25 30 <210 148 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 148 Ala Leu Glu Glu Ile Gly Ser Tyr Thr Tyr Met <210 149 <211 ll <212PRT <213 Lama glama <400 149 Ala Leu Leu Asn Ile Asp Asp Gly Ser Thr Met <210 150 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 150 Asn Leu His Leu Gly Ser Tyr Thr Pro Met <210 151 <211 12 <212 PRT <213 Lama glama <400 15 1 Ala Leu Tyr Trp Gly Tyr Gly Thr Asn val Asp Val <210 152 <211 11 <212PRT <213 Lama glama <400 152 Asn Leu Tyr Met Gly Ser Gly Gly Ser Lys Val <210 153 <211 12 <212 PRT <213 Lama glama <400 153 Ser Ala Tyr Lys Ser Gly Ser Tyr Lys Ala Pro Val <210 154 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 154 Ala Ser Tyr Thr Thr Asn Asn Lys Pro Val <210 155 <2119 <212PRT <213 Lama glama <400 155 Gin Ser Tyr Giu Ser Giy Asn Tyr Vai <210 156 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 156 Ser Val Ser Asn Ser Gly Thr Tyr Lys Pro Val <210 157 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 157 Gln Ser Gly Ser Ser Asn Thr Asn Val Met <210 158 <2119 <212 PRT <213 Lama glaina <400 l 5 8 Ser Ala Tyr Lys Ser Gly Ser His Vai <210 159 <2119 <212 PRT <213 Lama glama <400 159 Ser Ala Tyr Asn Arg Gly Ser His Val <210 160 <21110 <212 PRT <213 Lama glama <400 160 Ala Leu Phe Ile Ser Asn Pro Ser Val Glu <210 161 <211 10 <212PRT <213 Lama glama <400 161 Ala Leu Tyr Leu Giu Asn Phe Ala Asn Glu <210 162 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 162 Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Asn Ala Val <210 163 <211 ll <212PRT <213 Lama glama <400 163 Gln Ser Ser Asp Ser Ser Gly Tyr Arg Val Val <210 164 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 164 Gln Ser Gly Ser Ser Ser Thr Ile Pro Val <210 165 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 165 Gln Ser Ala Asp Tyr Ser Giy Asn Ser Val <210 166 <211 10 <212PRT <213 Lama glama <400 166 Gln Ser Ala Asp Tyr Ser Giy Asn Ser Val <210 167 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 167 Gln Ser Ser Asp Tyr Pro Gly Asn Ser Val <210 168 <211 12 <212 PRT <213 Lama glama <400 168 Leu Leu Tyr Met Gly Gly Ser Asp Phe Asn Phe Vai <210 169 <211 ll <212PRT <213 Lama glama <400 169 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Vai Leu Gly <210 170 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 170 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly <210 171 <211 ll <212PRT <213 Lama glama <400 171 Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly <210172 <21111 <212 PRT <213 Lama glaina <400 172 Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Thr Val Leu Gly <210 173 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 173 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Ser <210 174 <21111 <212 PRT <213 Lama glama <400 174 Phe Gly Gly Gly Thr Gin Leu Thr Val Leu Ser <210 175 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 175 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr vai Leu Gly <210 176 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 176 Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly <210 177 <211 115 <212 PRT <213 Lama glama <400 177 Glu 14.0 (Sin Lou Oin Itir. 11. am; 01, <210 178 <211 122 <212PRT 3.: en : ben <213 Lama glama <400 178 6130 611 M9 ini 61.!! 8.: &ip 11. va). m Asp <210 179 <211 122 <212PRT <213 Lama glama <400 179 80: Giy the Giunpfh: M. 308 80: Trp Glu vii Gln iau ni Glu Sor Gly Gly Gly mu Val Gln Pro Gly Gly : m m Lou 30: cn u. mi :o: aiy vb. ru: mi. :o: vu. Ty: tyr Hut Atti 14: Biy Arg <210 180 <211 128 <212 PRT <213 Lama glama <400 180 8.: I 1. GLi'i !lot <210181 <211 119 110 Yil. 3.: Giy 611 A1 i Sor Mp 8.: Sir 3.: "If 8.: Gly 1'i:: 101.! <212 PRT <213 Lama glama <400 181 8.: Al; 11. <210 182 <211 119 <212 PRT <213 Lama glama <400 182 9.1 Ty: 80: Lou Ana 80: Bin 110 <210 183 <211 116 <212 PRT <213 Lama glama <400 183 611 Aip 611 Gly Giu vii Gln Lou vii. Gln Pro 80: vu Lyi vu So: Cyi iyi alti aiy m vu rh:: Ph. m Vdßluuusir Sirmlng 110 Sor Ara Arq Arq Mp Ph. <210184 <211 131 <212PRT <213 Lama glama <400 184 80: 01)› Ty: !hz 617 'rhr iyi !yt Giu Mp 1):: Al. Gin Vol Gln Lou @in Giu Ser Giy !to Gly Lou vii bu ne 80: @in tin-Mus.: rrpuicaiy <210185 <211123 <212 PRT <213 Lama glama <400 185 Gln Va). Sin 8.: tip I!.. En 81.& lü& 1'11» Ala iyi Glu Gly Giy Sir Gly Aug ?yt ?tp Tht Ain 610 !yt Asp Ty: <210 186 <211 119 <212 PRT <213 Lama glama <400 186 <210187 <211119 <212PRT : Oy. .: tip <213 Lama glama <400 187 : My ne 611 Gly 80: 50: <210 188 <211 122 <212 PRT 589 ?yt <213 Lama glama <400 1 8 8 Ty: 'l'hr 'ryi- <210189 <211 112 <212PRT <213 Lama glama <400 189 <210 190 <211 112 <212 PRT <213 Lama glama <400 1 90 <210 191 <211 111 <212PRT <213 Lama glama <400 191 Gin rh: Vai Vai rh: Gln Glu Pro so: Lou si: Vol 8.: Pro Gly Giy 40 45 m Il. Ty: Alo fb: Mo un m it:: 3.: Oly vu Pro 80: M0 Ty: 65 70 75 00 Bin ?to Olu Asp Oiu li; lap ty: Ty: Cyi !in Lan Rii Lou aly :o: 85 90 95 Ty: !hr !:0 Hit Ph. Oly Giy Giy rh: Lyi Lou !hr Vii Ldu Bir 100 105 110 <210 192 <211 113 <212 PRT <213 Lama glama <400 192 1 5 10 15 m vii 'mx nu rh: Cyi Gly uu -nu: sor Gly Sir vu nu.- :o: 30: Ain Tv: ?:0 lap ?29 ?yt nin Gin fb: !to Giy Gin Ala Pro Arc Lou co is Lou Ile Ty: non ?hr aan Sor Atv "to Set Gly Vol Pro 50: Ata Ph. 50 55 60 Sor ciy Sor !10 Sor Giy Aon iyi A1; 110 Lou The !1. Tur Gly A1. 65 70 75 50 Gin ?:0 Sin Asp Glu ala Asp !yt !yt Cys nin &en 2:: tip Gly Ty: 05 90 95 dir th: !in VII &ip vii Ph. Gly Giy Gly Tbr iyi ncu !hr Vil Lou <210 193 <211 112 <212 PRT <213 Lama glama <400 1 93 80: Giy 30: <210 194 <211 119 <212 PRT <213 Lama glama <400 194 aiii ini %1 Ve). rh: im Sir Vaiirq 92° 80:' Ana 80: ua ryr <210195 <211 111 <212PRT 3.: Oiy <213 Lama glama <400 195 mi ben 'i'hr ile Se: Cyo <210 196 11:.! <211 107 <212 PRT <213 Lama glama <400 196 A1. frp 'ryr Gin Gin by. hp ulu Ala Aip 'ryr ?yi- <210 197 <211 118 <212PRT <213 Lama glama <400 197 Gin sir Va). Mu 'l'hr 6111 m 1.00 Ty: ?yi- 'ryr Sor 11.. Pro M9 Pro 811 Gin 80: PM 613! V.! Lou Lou ne :o: 617 hu Gin Ala Glu Asp Giu ala Asp !yt Ty: Oya 85 90 95 100 105 110 <210 198 <211 108 <212 PRT <213 Lama glama <400 198 l 5 10 15 25 30 40 45 :5 60 65 70 15 80 Hp 0111 A1: Va). Ty: 'l'yr Cyi Cin 8.: Giy Boz Bu Mu nu' un Va!. 85 90 95 iht Ph. Gly Gly Gly th: Bii !Au ni: VI). Lou si: 100 105 <210 199 <211 116 <212 PRT <213 Lama glama <400 199 Gln si: Val Va). rh: Gln Pro Pro 8.: Lou Sir Ala Sir ?:0 Gly Sir 1 5 10 15 25 30 <210 200 <211 116 <212 PRT <213 Lama glama <400 200 Gln Ala Yil. 14`:th sir na !yi- <210201 <211 111 .1." <212 PRT <213 Lama glama <400 201 6111 Ala Va). sor ciy 80:' <210202 <211 111 <212PRT Va). ?hr (Sin 110 301' CN <213 Lama glama <400 202 6111 110 Vai Va). rhr Gin Vol frp 'l'yr 119 t'hr Gly Phe Ala Asn Glu Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly <210203 <211 108 <212 PRT <213 Lama glama <400 203 <210 204 <211 109 <212 PRT <213 Lama glama <400 204 6111 8.: Ala !nu rh: m Ala An; 1:.. rh: 11. ?:0 1115 Pro 8.:: Val Gly 'Hiz 511 610 65 70 75 80 Mp Ola Mi Asp Ty: Ty:: Cyi Ola 30: :0: tip 50: 30:' &y !yi- m 85 90 95 Va). Va). Ph. Gly Oiy Oly !tir iyi bu 'l'hr Val Lou Oiy 100 105 <210 205 <211 104 <212 PRT <213 Lama glama <400 205 1 s 10 15 25 30 en by: Pro Giy Gin Mi Pro 931 ben vii !10 !ye ne Ma na un 40 is m ne :o: Oiy no ?:0 en uç PM :0: ay :0: no :o: m, M0 55 60 m M.: '111: ben rh: ne 80: &y ua Gin vii Otu up Giu M.. asp 65 70 15 80 nm Ty: Cyi Ola si: my Bu 80:' s.: 'rhr II. ?:0 Va!. PM Oly 01.3 85 90 95 Gly Bu: Lyi hu th: V1). Lou Giy <210 206 <211104 <212 PRT <213 Lama glama <400 206 Ann Ph. Not !nu rh: Gln Pro 8.: Ala Val Sir Vai Sir !Au Gly Gin l 5 10 15 th: Ala W 11. Thr Oy. 012: Gly Oly 'l'yr Ty: !hz an 711:› !yt Gln 25 30 6111 by. ?:0 th: iia 'rhx 611( Bu' Lyi <210 207 <211 108 <212 PRT Sor Gly 80:' <213 Lama glama <400 207 6111 iiii Va). un ri-p ay: 013( hp un van. Gly <210 208 <211 108 <212 PRT A::: Pro Lou Gly 'Hu' iyi <213 Lama glama <400 208 ÄIJ'I Ãll'l M0 80: Gly Mu Glu Ala AJ.. no 80: 6131 An: 5.: 80:' 019 <210 209 <211 108 <212 PRT <213 Lama glama <400 209 80: alg <210210 <211 113 1111' <212 PRT <213 Lama glama <400 210 80: Gly :o: <210 211 <211 113 <212PRT 110 80: <213 Lama glama <400 21 1 3.: &mg 65 70 75 00 01:› ?:0 0.111 up ulu ni Mp ?yt l'yr Cyi ni Lou ?yt Int Giy 30: Oiy 8.: "n un Vai Va.! Ph. my Giy Giy 'mu' Oiu Lou mr vil. ben 100 105 110 <210 212 <211122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 212 1 5 10 15 25 30 iyi- )Iit un Trp vii An; mn Ala Pro Giy iyi Oiy Ian Glu frp vu 00 45 8.:- tip ni Ma Ana Glu Gly Gly 'rhr 'rhr ?vr ?yt Ala Asp Sor Va). 50 55 60 by. Gly Arg PM 'l'hr rlo 60: Ara up kon 50: by: Ma !'hr !ou 'I'hr 65 70 75 80 hu Oin !hi nin 80: un iyi !to Giu Aip rh: ni vii ryr !yt Cyi 85 90 95 Va). m Asp nlu Gly ryr 8.: m mi Va). Pro :1. Ph. Aip Sor 'ri-p 100 105 110 115 120 <210 213 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 213 Glu Va). 6111 hu 801' Lou Au; Lou Ty: !lot m 'rrp 01;: Bu: aiy 'rhr <210 214 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 Mi 30: Giy ?ho AJ.- Pto Ily iyi Gly 'rhr 'rhr Ty: m "9 Ani A1. un nin Va). Pro <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 214 611 611 Sor 'ti-p 8.: &ip Iic <210 215 <2ll 122 <212 PRT <2 13 Yapay <220 80: Gly <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 215 50: Tip 80!' bu 8.: &ip 6130 @In <210 216 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 Val Ari; 8.: Lou 611 617 80:' Gly 86!' :er <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 2 1 6 611 Gly 611: vii Gln Lou Vil. Gln si: Gly Gly Gly ben 80: Im› m Lou So: Cyi Al.. A1. 80: 01)› the 8.: &ip 11. lan bu Glu Gly Gly 'rhr 'rhr 'ryr 65 10 75 mahmut. Sirmiyil'ro Giunpfh: na m Asp Ala Gly ryr 80: m mi vii Pro 100 105 Oiy mi› 017 rh: Lou vii m vii :o: :o: 115 120 <210 217 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 217 Glu Vai Gin !au Val Glu sir Gly 613! 61°/ ben 89: m Atv hu 80: Oya Ala Mi 80: Giy Ph. ryr Int nn ?tp vii M'q Cin Ala Pro Giy Ly- 8.2 Mp Il. un &in GLu Oiy my ni: ?hr Ty: iyi Gly im ?hi rh: 11.. Su: An; "9 Mi: si: 611 Gly 80:' 'Hp 80:' V::. 65 70 75 00 85 90 95 AJ.: m Mp Ah Oiy ryr 80: m lu.. Vii no no Ph. up 30: Tip 100 105 110 613( (:10 Giy 'I'hr m Vol ?m- 901 Sor sir 115 120 <210 218 <211122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 218 Glu vii Gin !nu vii Glu Sir Gly 617 611( Lou vu Gln Pro Gly Gly 1 5 10 is Sor !Au &to hu Sor Cyi Mi 80: 80:* su Ph. 'Itir Ph. Sor vii Ty: 25 30 13:: Dk: un 'ti-p Yil An; Gln Al: !:0 Giy iyi aiy Ian Glu frp V.! 40 45 80: "p 11. nn un 610 Gly Giy 'rhr 'i'hr Ty: !yt Alo Aq› Sor vii 50 55 60 by. Gly AN PM 'I'hr No Sir Are np han :0: by. Ma ni: bu 'Iyi' 65 70 75 80 Lou mn In "a sor Lou Arg mi 310 Aip ?hz ni vu !yi- !yr Cyi 85 90 95 Va). m Asp Ala Gly ?yt 5.: m ilin Va). Pro !1. Ph. 1.09 8.: 'ri-p 100 105 110 115 120 <210 219 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 219 Glu Va). Gln hu 801' Lou Au; Lou Ty: !lot m 'rrp 01;: Bu: aiy 'rhr <210 220 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 : Cyi AJ.. Yil. Arc Oin Giy 'Pvr Sir 611 Gly !mu : Giy the nin Va). Pro 80: :o: <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 220 611 611 Sor 'ti-p 80: hp ne <210 221 <211 122 <212 PRT <2 13 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 221 80!' bu 8.: &ip 6130 @In <210 222 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 Val Ari; 8.: Lou 611 617 80:' Gly 86!' :er <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 222 611 Gly 611: vii Gln Lou Vil. Gln si: Gly Gly Gly ben 80: vu m Lou So: Cyi Al.. A1. 80: 01)› the 8.: &ip 11. lan bu Glu Gly Gly 'rhr 'rhr 'ryr 65 10 75 mahmut. Sirmiyil'ro Giunpfh: na m Asp Ala Gly ryr 80: m mi vii Pro 100 105 Oiy mi› 017 rh: Lou vii m vii Jun :0: <210 223 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 223 Glu Vai Gin !au Val Glu sir Gly 613! 61°/ ben 89: m Atv hu 80: Oya Ala Mi 80: Giy Ph. ryr Int nn ?tp vii M'q Cin Ala Pro Giy Ly- 8.2 Mp Il. un &in GLu Oiy my ni: ?hr Ty: iyi Gly im ?hi rh: 11.. Su: An; "9 Mi: si: 611 Gly 80:' 'Hp 80:' V::. 65 70 75 00 85 90 95 AJ.: m Mp Ah Oiy ryr 80: m lu.. Vii no no Ph. up 30: Tip 100 105 110 613( (:10 Giy 'I'hr m Vol ?m- 901 Sor sir 115 120 <210 224 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 224 1 5 10 is Sor !Au &to hu Sor Cyi Ma Mi Sor Giy Ph. 'Itir Ph. Sor vii Ty: 25 30 13:: Dk: un 'ti-p Yil An; Gln Al: !:0 Giy iyi aiy Ian Glu frp V.! 40 45 80: "p 11. nn un 610 Gly Giy 'rhr 'i'hr Ty: !yt Alo Aq› Sor vii 50 55 60 by. Gly AN PM 'I'hr No Sir Are np han :0: by. Ma ni: bu 'Iyi' 65 70 75 80 Lou mn In "a sor Lou Arg mi 310 Aip ?hz ni vu !yi- !yr Cyi 85 90 95 Ala m Asp Ala Gly ?yt 5.: m ilin Va). Pro !1. Ph. 1.09 8.: 'ri-p 100 105 110 115 120 <210 225 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 225 Glu Va). Gln hu 801' Lou Au; Lou Ty: !lot m 'rrp 01;: Bu: aiy 'rhr <210 226 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 Mi 30: Giy ?ho AJ.- Pto Ily iyi Gly 'rhr 'rhr Ty: m "9 Ani A1. un nin Va). Pro <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 226 611 611 Sor 'ti-p 8.: &ip Iic <210 227 <2ll 122 <212 PRT <2 13 Yapay <220 80: Gly <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 227 50: Tip 80!' bu 8.: &ip 6130 @In <210 228 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 Val Ari; 8.: Lou 611 617 80:' Gly 86!' :er <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 228 611 Gly 80: Im› m Lou So: Cyi Al.. A1. 80: 01)› the 8.: &ip 11. lan bu Glu Gly Gly 'rhr 'rhr 'ryr 65 10 75 mmmunsirmmniaiunprh: na m Asp Ala Gly ryr 80: m mi vii Pro 100 105 115 izo <210 229 <211 122 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 229 Glu Vai Gin !au !ml II.: 8.1' Gly 613! 61°/ ben 89: m Atv hu 80: Oya Ala Mi 80: Giy Ph. ryr Int nn ?tp vii M'q Cin Ala Pro Giy Ly- 8.2 Mp Il. un &in GLu Oiy my ni: ?hr Ty: iyi Gly im ?hi rh: 11.. Su: An; "9 Mi: si: 611 Gly 80:' 'Hp Val 6111 Pro Gly 617 iyi un 'mr m 'ryr 65 70 75 00 85 90 95 AJ.: m Mp Ah Oiy ryr 80: m lu.. Vii no no Ph. up 30: Tip 100 105 110 613( (:10 Giy 'I'hr 'I'm- Vol ?m- 901 Sor sir 115 120 <210230 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 230 Gin nu' Va). Va). rh: Gln Glu Pro 8.: rh. Sor Val 8.: Pro Gly Gly 1 5 10 15 m vii 'mr Lou rh: Cyo Giy m !iyi :o: Giy Se: Vei nu- Se: m 25 30 M0 PM Pro TM' frp ?yt Ol!! 61:! 'I'm- Pro Giy @In A!. Pro hcg Lou nn no Ty: nn fl:: im: m m mi 80: aiy voi im› up Mg PM 55 60 65 70 75 80 Bin Ala np Aip Oiu Su' Mp ?yt PM Cyi ua Lou an. 11.. 8.: "n 85 90 95 100 105 110 <210231 <211 111 <212PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 231 m Va] '17:: ben <210 232 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 232 611 611 80: Ana 8.: vii <210233 <211 lll <212 PRT <213 Yapay <220 11:: un Su: am 80: up 91:. (ay 011( 141.! Sat Lan 'l'hr ilin Sor Giy <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 233 80: ?to Gly Giy vai Bu: Sir 'rhr Pro Asp Ari; ?ho 61:: Bu.' Va). Va). rh: m Yil n: Lou rh:: Ma PM Pro 'l'hr frp 110 ben <210 234 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 M0 80: m 013/ un Lyo 8.: tip !yt <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 234 Gin Ala vii Va). 'Mar m 9.1 '111: Lou Thr 110 !yt Mu ?hr s.: Giy 8..: :li nin Oya 81:( neu A1. Glu ?yt 3.: ?:0 en 110 'Bu Gly Ph. Il.. Bot vii :Lou Giy 8.2 Pro 611 ni 920 M4: 11. &:9 31:( Vil. ben Gly <210 235 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti lslemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 235 Gln l'hr Va). vii rh: Gin 6111 Pro 8.: rh. sir Vol 8.: Pro Gly Gly 1 5 10 15 m:- vii 'rhr Iiou 'l'hr Cyi Gly !ou Lyi Sor Giy Sor vol 'I'hir Sor Mp 25 30 Ana PM Pro 'I'hr 'l'rp ?yi- Gln Gln 'I'hr Pro Giy Gin A1. Pro M'g Lou 00 45 Lou no Ty: Ana fb: MA 30: m im :o: Oiy Vol Pro Asp Mg PM 50 55 60 65 10 75 00 nin Ala up Asp Giu ua mu ryr 'ryr Cyi ni un Ph. 1:10 80: un 05 90 95 100 105 1.10 <210 236 <21 l lll <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 236 Gln nu: Va). <210237 <211 111 <212PRT <213 Yapay <220 rh:: Cyi Gly 91:. Gly Gly 80: Gly Ser : Gly V" <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 237 Gln Ala Va). Va). ?hr Gln Glu Pro Sir Lou 'rhr Vai hu 'I'hr Oy. Gly Lou by: unrbrunmirqnii Asp Giu s.: Asp iyi: 'l'yr <210 238 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti lslemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 23 8 Gln !hr Val vii rhr Gin Giu ?to a.: Lou rh: Vol 8.: Pro Gly Gly 1 5 10 15 th: vii ?hr Lou fhr Cyi Giy Vol ?hr Sor Giy Sor vol !hr Sor hap 25 30 han ?ho Pro Thr frp Ty: Gln Gln ?ni Pro Giy Gln A1. Pro Irc Lou Lou Il. Ty: Ana fb: han th: Inc 8:: :o: Oiy Vol Pro Aip Atq vb. 50 5: 60 : Giy So: Iio Lan Giy &sn ;ya aia ala ben th: Ile rh: Giy ni: 65 10 75 00 Bin Pro Ulu Alp Cin 8.: lap Ty: Tyr Cyl Ala Lan Ph. II. 8.! Ana 85 90 95 100 105 110 <210 239 <2l l 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 239 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro 8.: Ph. Sir Vol 8.: Pro 611 Sir 1 5 10 [5 rh: VII !hr neu ?hr Cys Giy Lou rh: Ser Gly Se: vai rh: Ser Thr 25 30 00 45 ben 110 !yt un 'l'ht Ata rh:: m ini 80( Giy Vol 50 55 60 S.: Giy 8.:: 11. Inn Giy un Lyi Ala Ala Liii :rh: 65 70 75 en ni Asp Asp Giu nin en îy: Ph. Oyu Ala hu 100 105 <210 240 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 240 6111 Bu Vai Va). rbr Gln 611.: Pro Sor Ph. Sir ?al m: Vii 'mr Lou 'l'hr Oy. 613 Lou by: Sor Giy 80: Mn PM Pro 'I'hr frp fyr Gin Gin 'Nu' Pro Giy Gin Mu Il.. Ty: nin 11:: Lu› 80: Am mi :o: Oiy mu 55 60 : My Se: ne Lou uy un Lys ni mi Lou ni: 65 70 75 Cin Ali Mp Alp Giu Sir Mp 'l'yr Ph. Cyi Ala bu Pro 8.: vii Glu Ph- Oiy Oiy Giy 'rhr Iln mn !hz 100 105 <210 241 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 8.: "n 611 611 80: nn <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 241 6121 &li Va). <210242 <211111 <212PRT <213 Yapay <220 i'br Gln Glu i'm- Cyo Gly frp ?yi- Gin 1.00 Oiy un <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 242 ne 9.1 ?hr Su 61:; Set 0.1!! Fm 310 Pro Ser val Glu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly <210 243 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 243 Gln Hu' Va). Va). i'br mi- Vii 'Bu' Lou 'i'm- un PM Pro 'I'br frp 80: Giy 80: ne Lou Pro 8.1' V1). Glu ?bu <210 244 <2l l 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Genn Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 244 <210 245 <211111 <212PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 245 8.: Giy 5.: 80: Asp 8.: ..o 611 611 8.: Asu <210 246 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti lslemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 246 Gln Ala Vol vii rh: Gin Giu ?to a.: Ph. sir Vol 8.: Pro Gly Gly 1 5 10 15 th: vii ?hr Lou fhr Cyi Gly !au Lyi Sor Giy Sor vol !hr Sor hap 25 30 han Pho Pro ?hr frp Ty: Gln Gln !hr Pro Giy Gin A1. Pro Arc Lou to 45 Lou Il. Ty: Ana fb: han ra: Ang HL: :o: Oiy Vol Pro 3.: Atq vb. 50 5: 60 : Giy So: Iio Lan Giy &sn &ya aia ala ben th: Ile rh: Giy hi: 65 10 75 00 Bin li: Asp Alp Cin 8.: lap Ty: Tyr Cyl Ala Lan Ph. II. 8.! Ana 85 90 95 100 105 110 <210 247 <21 l lll <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 247 Gin !hr vii vii rh: Gln Glu Pro 8.: Ph. si: Vol 8.: Pro Gly Gly 1 s 10 is 25 30 un Ph. Pro 'rhr rrp I'yr mn Gin 'rhi' Pro Oly Oin Ala Pro Arq Lou 40 45 un 11: !yilin rhrnnthtizqnii BirGlyVnJ. ?to ScruqPhi 50 55 60 Sar Gly Sex 113 &en Gly !um by; Ala Ala ben rh: Ile Bu' Giy A1. 65 70 75 IIO nin &li up Aip Oiu Sir Mp 'I'yr 'ryz Cyi Ala Inn PM› 110 80: M0 85 90 95 Pro Ser val Glu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr val Leu Gly 100 105 110 <210 248 <211 5 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 248 <210 249 <211 17 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 249 lap 11. Ana Ann Glu Gly Gly ala rh: !yt ty: &1.3 isi› Sor Va). by: 1 5 10 15 <210 250 <211 14 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 250 Gly Leu Lys Ser Gly Ser Val Thr Ser Asp Asn Phe Pro Thr <210 251 <211 14 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 251 Gly Leu Thr Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Asn Phe Pro Thr <210 252 <211 14 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Genn Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 252 Gly Leu Thr Ser Gly Ser Val Thr Ser Asp Asn Phe Pro Thr <210 253 <21 l 14 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 253 Gly Val Thr Ser Gly Ser Val Thr Ser Asp Asn Phe Pro Thr <210 254 <211 30 <212 PRT <213 Lama glama <400 254 61:: im Gin nu vii Giu su- Gly Gly Gly mu ni 61:: ?to Giy 61; 1 5 10 is Sat Lou &:9 m 80:: Oy. ni Mi 80: Gly vb. 50: Ph. 80: 25 30 <210 255 <211 30 <212 PRT <213 Lama glama <400 255 Glu Val 6111 !nu Vol Glu Sir Gly Gly Gly Liu Val Gln ?to Gly Bir 1 5 10 !5 Sir Lou &:9 !au 80: Oy. ni in 3.:: Glu Lou Sor Ph. Bu: 25 30 <210 256 <2115 <212 PRT <213 Lama glama <400 256 <210 257 <2115 <212 PRT <213 Lama glama <400 257 <210258 <211 17 <212PRT <213 Lama glama <400 25 8 Giy np nn rh:: !yt np Giy Giy !hr km 'hiz Gin Asp s.: Vii iyi 1 5 10 15 <210 259 <211 19 <212 PRT <213 Lama glama <400 259 Giy Il. :o: Gly Yil. m Gly Gly 80: S.: 'I'bt Sir ty: Ala Asp Set 1 5 10 15 <210 260 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 260 l 5 10 15 25 30 <210 261 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 261 Arq Ph. ?hr !1. Sir Atv Alp Ann Alp by. Ain !hr Ian :y: iiu 610 1 5 10 15 lik Ain 80: Lou ti. Pro olu Aip ?hr Ala vii ?yt !yt Cyi Ala rh: 25 30 <210 262 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 262 Asp Thr Gly Arg Gly Ile Met Gly Glu Tyr Gly Met Asp Tyr <210 263 <211 13 <212 PRT <213 Lama glama <400 263 Thr Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Ile Pro Glu Tyr Glu Tyr <210264 <21111 <212PRT <213 Lama glama <400 264 Trp Giy Lys Gly Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser <210 265 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 265 Gln !hr val Vai ?hr Gln Gln ?to :o: ben 8.: Vol si: Pro Gly Gly l 5 10 15 rh: Val !hr !du 'Bir Cyi <210 266 <211 22 <212 PRT <213 Lama glama <400 266 Gln Sir Val nin ?hr Gln Pro Pro Sor 911 Sir Gly Sor Pro Gly Lyt 1 5 10 15 <210 267 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 267 Giy Leu Lys Ser Gly Ser Vai Thr Ser Ser Asn Tyr Pro Ala <210 268 <211 14 <212 PRT <213 Lama glama <400 268 Ala Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Ser <210269 <211 15 <212PRT <213 Lama glama <400 269 Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210 270 <2117 <212 PRT <213 Lama glama <400 270 <210 271 <211 12 <212 PRT <213 Lama glama <400 271 Ala Leu Tyr Met Gly Ser Gly Ser Ala Asn Ala Met <210 272 <211 32 <212 PRT <21 3 Lama glama <400 272 Gly !lo Ala Asp Arq ?ha 5.: Gly 80: by' Ala Giy Ana th: Ala &or 1 5 10 15 Lou th: 1:10 8.: aly un 01:: 80:: @lu Mp olu Ala up !yt !7: Oy. 25 30 <210 273 <211 10 <212 PRT <213 Lama glama <400 273 Ala Ser Tyr Arg Ser Ser Ala Asn Ala Val <210274 <211 123 <212PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 274 619 hp Atti 619' m Phe <210 275 <211 124 <212 PRT <213 Yapay <220 3.: Oya 11:: Ala 019 ?yt <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 275 s.: Ilii Ty: <210276 <211113 <212PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 276 6111 nu: Val Vol rh: Gln Glu m Vol 'm2 Lou rh: Cyi 01.3 Bin Pro 811: Asp ulu Ala Mp <210 277 <211 111 <212 PRT <213 Yapay <220 Ala hu ?yt !Int Oly 50: <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 27 7 ben 110 no:- Mp vu nn iyi 6111 Ph. Pro Sir Mp V1). Giy ?yt Giy Gly Ile! no 920 Lyi ben su 110 Alo Mp Arc PM Gin 80: 610 Asp Gin Ala Mp 'ryi' 'ryt Cyi ala si: ?yt m 8.: 80: 85 90 95 mi "n A1. Va). Ph. Gly Bly Gly 'rhr ini Lou rh: vii hu aiy 100 105 110 <210 278 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 278 1 5 10 1.5 im: un Sor Lou iyi Pro ali› np nu- Ala Ian 'ryz !yt Cyi vu. m 25 30 <210 279 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 279 Arq Ph. 'mi' 110 Su: uç Mp m Ala Lyi Ain TI:: un !yt Inn Sin 1 5 1.0 15 not Ann 80:' Lou iyi Pro 01:› hp Bu' &1. Lou Ty: !yt Cyi vu m 25 30 <210 280 <21 1 32 <212 PRT <2l3 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 280 Arq PM 'Bu' !1. 80: Ara Mp m 80: by. &in Sir m m m 61:: 1 5 10 is 25 30 <210 281 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 281 1 5 10 15 im: un Sor ncu uç ni ali› Asp nu- ua vii 'ryz !yt Cyi vu. m 25 30 <210 282 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 282 Arq Ph. 'mi' 110 Su: uç Mp m Ala Lyi &in 3-: !aci nu- biu Sin 1 5 10 15 not Ann 80:' Lou kg iii 01:› hp Bu' &1. vii Ty: !yt Cyi vu m 25 30 <210 283 <21 1 32 <212 PRT <2l3 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 283 Arq PM 'Bu' !1. 80: Ara Mp m Ala by. &in TI:: m !yt m 61:: l 5 10 15 25 30 <210 284 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 284 1 5 10 1.5 im: un Sor Lou iyi Pro ali› np nu- Ala vii 'ryz !yt Cyi ni m 25 30 <210 285 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 285 Arq Ph. 'mi' 110 Su: uç Mp m 80:' Lyi &in 3-: !aci !yt Inn Sin 1 5 1.0 15 not Ann 80:' Lou kg iii 01:› hp Bu' &1. vii Ty: !yt Cyi ni m 25 30 <210 286 <21 1 32 <212 PRT <2l3 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 286 1 5 10 is 25 30 <210 287 <211 11 <212 PRT <2l3 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 287 Trp Gly Gln Gly Thr Gln vai Ile Val Ser Ser <210 288 <211 ll <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Genn Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 288 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ala Ser <210 289 <21 l ll <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 289 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser <210 290 <211 11 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 290 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser <210 291 <211 11 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Gemi Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 291 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser <210 292 <211 ll <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 292 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser <210 293 <211 I I <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 293 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser <210 294 <21 1 22 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 294 Gln nu: Val vii rh: Gln (Sin ?:0 :o: ini sir Val si: Pro Giy sir i s 10 15 rh: Vii th: !au 'Bu' Cy- <210 295 <21 1 22 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 295 Gin :ua vii vii ni: Gln Glu Pro 8.: mi.. :o: Val sir Pro Gly Giy 1 s 10 15 rh:: ViJ. !hr Mu 'Hiz Oy. <210 296 <21 1 22 <212 PRT <21 3 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 296 Gln !hr val Va). 'l'ht Gin Giu ?to 80: Lou TI:: Vol Sir ?:0 Sir Giy l 5 10 !5 11:: V" m Ian :rh: C3!. <210 297 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 297 Giy Vai Pro Asp &9 rh. Sir Gly S.: 11. !nu Giy nn by. Ala Ala 1 5 10 15 Lou th: n. 'nu- Giy Aii Oiii A1; up up 010 :o: Mp ry: DM Oya 25 30 <210 298 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 298 Gly Val Pro si: Arc Ph. sir Gly 80:: !li Lou Oiy m iyi Ala Al. 1 5 1.0 15 Lou th: n. n:: Giy M.. Oin iui up up 010 50: Mp ry: DM Oya 25 30 <210 299 <21 1 32 <212 PRT <2l3 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 299 Gly Vol Pro Aq› Mg ?bu 8.:: Gly :o: Il. Lou Giy m by: Ala Ala l 5 10 15 1.00 th: Il. Arc Oly A1. Ola Mi Au: MP 010 A1.. Ola !yt Ty: Oy. 25 30 <210 300 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 300 Giy Vai Pro Asp &9 rh. Sir Gly S.: 11. !nu Giy nn by. Ala Ala 1 5 10 15 Lou rh:: n. m: 01)› ni Cin Pro Glu Asp Giu 80: hp ryr Ph. Oy. 25 30 <210 301 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 301 Gly Val Pro Asp Arc Ph. sir Gly 80:: !li Lou Oiy m iyi Ala Al. 1 5 1.0 15 Lan th: ::1. rh: an 11.. 01:: ?:0 Cin np olu 50: hp !yi- ryi: Oy. 25 30 <210 302 <21 1 32 <212 PRT <2l3 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 302 Gly Vol Pro 8.: Mg ?bu 8.:: Gly :o: Il. Lou Giy m by: Ala Ala l 5 10 15 hu !hr :1. rh: aiy Ala oin ni up Asp aiu Ala Giu !yi- Mn Oy. 25 30 <210 303 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 303 Giy Vai Pro Asp &9 rh. Sir Gly S.: 11. !nu Giy nn by. Ala Ala 1 5 10 15 Lou th: n. 'nu- Giy Aii Oiii A1; up up 010 Mi olu fy: DM Oya 25 30 <210 304 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 304 Gly Val Pro Asp Arc Ph. sir Gly 80:: !li Lou Oiy m iyi Ala Al. 1 5 1.0 15 Lou th: n. n:: Giy M.. Oin iui Mp up 010 im Mp ry: DM Oya 25 30 <210 305 <21 1 32 <212 PRT <2l3 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 305 Gly vii Pro 8.: Arg ?bu 8.: Gly 80: 11. ben Giy Asu iyi Ala Alo l 5 10 15 Lou th: IJ.. Hu' Oly Mi Ola Mi Mp Mp Otu 50:' hp ?yt Ty: Oy. 25 30 <210 306 <211 17 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (1)..(1) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen D, T, S veya E,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (2)..(2) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen I"dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (3)..(3) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N, S, T veya Y,dir <220 <221 ÇESITLIIÖZELLIK <222 (4)..(4) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N, M, S veya T,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (5)..(5) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen E, D, Y veya H'dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (6)..(6) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen G, D, S veya N,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (7)..(7) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen G, Y, S, D veya M5dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (8)..(8) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen T, E, S, N, Y veya R7dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (9)..(9) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen T, A veya R,dir <220 <221 ÇESITLIIÖZELLIK <222 (17)..(17) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen G veya S,dir <400 306 xnmmmmnnmuaniiyrwriiamsirwiiyi 1 5 10 15 <210 307 <211 5 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (1)..(1) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen V, G veya A'dir <400 307 <210 308 <211 5 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLIIÖZELLIK <222 (1)..(1) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen D, T, S, N veya G"dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (2)..(2) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen Y, S veya P*dir <400 308 <210 309 <211 11 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 309 Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly <210 310 <2117 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Isleini Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (1)..(1) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N veya S`dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (3)..(3) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N, S veya A"dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (4)..(4) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen S, N veya Tdir <400 310 <210 311 <211 ll <212PRT <213Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (6)..(6) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen Y, V veya L"dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (7)..(7) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen K veya S,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (8)..(8) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen H veya N,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (10)..(10) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen G veya S`dir <400 31 1 Tyr Tyr Ser Asp Ser Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser <210 312 <2117 <212PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (1)..(1) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen V, 1 veya Y'dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (3)..(3) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N veya T,dir <400 312 <210313 <2117 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (4)..(4) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen Yldir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (5)..(5) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen R veya M'dir <400 313 <210 314 <2117 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (1)..(1) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen D veya G,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (4)..(4) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen S veya Pdir <400 3 14 <210 315 <211 14 <212PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (3)..(3) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen S veya Tsdir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (7)..(7) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen V veya A,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (9)..(9) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen S veya T"dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (10)..(10) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen S, T veya G,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (11)..(11) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N veya H"dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (14)..(14) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen G, D veya E"dir <400 3 15 Gly Leu Xaa Ser Gly Ser Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Tyr Pro Xaa <210 316 <211 14 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (3)..(3) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen S, N veya I'dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (5)..(5) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen G veya A,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (6)..(6) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N veya D,dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (7)..(7) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N veya S`dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (8)..(8) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen V veya I'dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (10)..(10) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen N veya S,dir <400 316 Thr Leu xaa Ser xaa xaa xaa xaa Gly xaa Tyr Asp Iie Ser <210 317 <21111 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Geim Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (6)..(6) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen G veya W,dur <400 317 Gln Gly Gly Asn Leu Xaa Leu Tyr Gly Ala Asn <210 318 <211 ll <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLIIÖZELLIK <222 (4)..(4) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen S veya Tadir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (6)..(6) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen E veya Rsdir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (7)..(7) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen R veya N"dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (9)..(9) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen G veya H7dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (10)..(10) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen T veya A"d1r <400 318 Arg Gly Asp Xaa Leu Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Asn <210 319 <211 14 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (2)..(2) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen V veya L`dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (3)..(3) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen K veya T'dir <220 <221 ÇESITLI_ÖZELLIK <222 (10)..(10) <223 X herhangi bir amino asit, tercihen T veya D"dir <400 319 Giy xaa xaa Ser Gly Ser Vai Thr Ser xaa Asn Phe Pro Thr <210 320 <211 10 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 320 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr <210 321 <2115 <212PRT <213 Homo sapiens <400 321 <210 322 <2118 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 322 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro <210 323 <211 12 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 323 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr <210 324 <211 50 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 324 Oy. ?:0 Arc Cyi Pro Gln Pro iyi So: Cyi &ip rh: ?:0 Pro ?:0 Cyo l 5 l 0 15 25 30 40 4& <210 325 <211 8 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 325 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro <210 326 <2117 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 326 <210 327 <21 1 5 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 327 <210 328 <2118 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 328 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro <210 329 <2113 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 329 <210 330 <211 10 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 330 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Pro Cys Pro <210 331 <2117 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 331 <210 332 <211 142 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 332 1 5 10 15 Gin 610 Rep Pro Arq m ?yt frp Gin Gly Giy Pro Ala !Ana Gly Arc 25 30 Son: DM Inn ini aiy Pro olu Ldu Mp Lyi aiy ain hu :::9 11. !lu to (5 Lag up Gly ne 'ryr xit vii &is 11. am vii rh: nu m 11.. Cyi 50 55 60 Sex- Sex- 'mr 'l'hr !ua Sar Atv His Ilii Pro 'l'hr TI:: neu Ala Va). 613; 65 70 75 80 110 Cyi 8.: Pro Ala Sir An; 8.: n. Sor hu Lou kg 140 s.: Ph. 85 90 95 100 105 110 Biy Asp 'nu' uu Cyi 'l'hr un nu 'Hu' Giy TI:: Lou Lou Pro 8.: m 115 120 125 mmriipclurhrrbivhiûiyvi).Gia'rrpvilngvm 130 135 140 <210 333 <211 142 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Kimerik Dizi <400 333 His Pro aiu Pro Il'u m Ah mu Lou Ola Im: Mu ncu 'mr Vil Pro 1 5 10 15 m by. Asp ?:0 'tür 8.: sir 'mr rh:: Ala asi 6.1.0 Üly Cyi ?hr Jun nu- Asp Giu 'i'm <210 334 <211 142 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Kimerik Dizi <400 334 nn Pro Glu Pro Ilii An; Lyi &ip Pro 'i'hi' 80!' PM 'Bu' ini Oiy 01:: Lou 110 Oy. 80: ?to Ala <210 335 <211 142 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Kimerik Dizi <400 335 80: Dua ?hr xii aiy 11. Cyi 8.: Pro 11: <210 336 <211 142 8.( ben 80: Liu <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Kimerik DiZi <400 336 <210 337 <211 142 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Kimerik Dizi <400 337 013 haç 110 lt: 80: Arc m 14: up vro rh: 1-00 kg 'up Giy hic Oiy Pro ua Lou Giy m 25 30 <210 338 <211 142 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Kimerik Dizi <400 338 3.: !hi !hr Bi. Giy 8.: Sir rh: rh: nin 110 Cyi 80: !to ki. 81. Bin Giy Cyi Thr 3.: At' 119 Lou 80: &:9 Giy Mp 'Bu' Mu Cyi 'l'hr Ana hu th: Giy ?hr hu Lou ?to 8.: m <210 339 <211 142 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Kimerik Dizi <400 339 <210 340 <211 142 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Kimerik Dizi <400 340 Arc by. Rep Pro 'I'hr m 8.: Sir Pro Gly Sir th: Giy Gin Mp eye i'm- vii m `I'hr Asp Glu Thr Ph. <210 341 <211 142 <212 PRT <213 Mus musculus <400 341 ini Pro Glu Pro Ili. Thr m Lyii np Pro rh: nin 611: Asp Gly Lou 'ryr Arc 611.: 611.1 611 Arc 80:' m 613( Nm 65 70 75 80 11. Cy- sir Pro Ala Al: 8:.: Giy 11. 5.: Ian Lan Ari; My Arq !hi 85 90 95 613( mn Mp Oy. 'rhr vu ua Ian Gin Ari; Lou TI:: !yt mi› vii. mi 100 105 110 my up Va). Lou Cyi 'l'hr un Ian 'I'hr Lou Pro Lou !su !'20 Sor May 11: 120 125 m ni- Asp Glu fb: Ph. Phe Gly V.] 6111 frp ne Cys ?to 130 135 130 <210 342 <211 ll <212 PRT <213 Yapay <220 <223 CD70 Epitopu <400 342 His Ile Gln val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser <210 343 <211 32 <212 PRT <213 Lama glama <400 343 1 5 10 15 25 30 <210 344 <211 1425 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Geim Hatti Islemi Yapilmis Nükleotit Dizisi <400 344 tactitgciq iaiqtggiic giaciqtiii otqiitqqca .900909009 ccitccqaui <210 345 <211 717 gtocaoecic ÇUIIÇUÜÜCt iutqaacaq citqgaactc qtoqactcti ttwaqtcvi ccciqaagtc <212 DNA <213 Yapay <220 cqqegocttq caqcatoiot tgiciiqm 3:99919919 açgtcucct 90.600.900 ctqtttctqq tOICCICÜVC C'CÜQUOOCC esmer-:99 tac-acemi metne Oaqûaclcüû aciictqgtq ucaoctqcc uttcaciaoq açtgttctqi aqouoim 090%th UUUVOCIUQU CIOtOOGOIO qcciqqtbia ctgiqiacia <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Nükleotit Dizisi <400 345 ete-ucan tctqotgitt toctitaoiq qqgqtictat cicoqtggit ogoociqcit. aaqctcioat ottqagttcq aqtigttatc <210 346 <211 369 Clqtqütglc <212 DNA <213 Yapay <220 icoccgittq cciictqaco aqtiiiciqo cqgiaqtctc Aiqccqcoct tgttcatiiq aciqiagtti <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Nükleotit Dizisi <400 346 cciqoiiioq oqctiqCth egzotcicqt altili-cet icqitoqteo CCC".CILÇC MCMO.. iccwiqqic .MMOC ittictqtqo <210347 <211341 <212 DNA <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Nükleotit Dizisi igqgieoqtc oicttqqtac <400 347 motomcc !Mein qtctqtooct <210 348 <211 372 <212 DNA <213 Yapay <220 tooaqtuct accctqcttq otiocmaq tacucicii iciqccqtci ctctqmtc <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Nükleotit Dizisi <400 348 OWN tmm: :maçini: tcctotqcaq amcamin qtocttciot cem-um MW? mctcwqt mtatqciq ictocqtçui mccqittc tutucu: intqaiciiq ::wanna .coqtctece ci <210 349 <211 333 <212 DNA <213 Yapay <220 ttwtgcigc ctmgwtc tctqiqictc atttctqm tqaoctmt ccqccaooct matctoci qiqacaaoga :::yamaç qmwim mutat?.. cinema atamaz& mumu qioccawtc <223 Genn Hatti Islemi Yapilmis Nükleotit Dizisi <400 349 tcctotociq cani-.wow tqitqttm tutusu-.act itqtctcctq qtatcucnq 120 <210 350 <21 1 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Geim Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 350 Am ?hi 'mr ne Sir ::0 Mp m 8.: by: &an 'rhr Mu m :nu Sin 1 5 10 1.5 25 30 <210 351 <211 32 <212 PRT <213 Yapay <220 <223 Germ Hatti Islemi Yapilmis Antikor Dizisi <400 351 TR