TR201807363T4 - Hedefleyici nqo1 i içeren kanser tedavi yöntemleri. - Google Patents

Hedefleyici nqo1 i içeren kanser tedavi yöntemleri. Download PDF

Info

Publication number
TR201807363T4
TR201807363T4 TR2018/07363T TR201807363T TR201807363T4 TR 201807363 T4 TR201807363 T4 TR 201807363T4 TR 2018/07363 T TR2018/07363 T TR 2018/07363T TR 201807363 T TR201807363 T TR 201807363T TR 201807363 T4 TR201807363 T4 TR 201807363T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
cells
iap
catalase
nqo1
cancer
Prior art date
Application number
TR2018/07363T
Other languages
English (en)
Inventor
Boothman David
Gao Jinming
Bey Erik
Dong Ying
Original Assignee
Univ Texas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Texas filed Critical Univ Texas
Publication of TR201807363T4 publication Critical patent/TR201807363T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/423—Oxazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/538—1,4-Oxazines, e.g. morpholine ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Burada bir kanserli bireyin, bir NQO1 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedavi için uygun bir aday olup olmadığının belirlenmesine, kanserli bir bireyin, bir NQO1 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla bir tedaviye duyarlı olmasının öngörülmesine ve kanserli bir bireyin, bir NQO1 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç bileşimi ile tedavi edilmesine yönelik yöntemler tarif edilmektedir.

Description

TEKNIK ALAN Mevcut bulus, kanserli bir bireyin, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedavi için uygun bir aday olup olmad @II belirlenmesine, kanserli bir hastanlEl, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla bir tedaviye duyarllîrblmasII öngörülmesine ve kanserli bir bireyin, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç bilesimi ile tedavi edilmesine yönelik yöntemleri saglamaktadlB ÖNCEKI TEKNIK Malignan tümörlerin formunda olan kanserler, kalp hastalgûdan sonra Amerika Birlesik Devletleri'nde ölümün ikinci önde gelen sebebidir (ABD SagllEI ve Insan Hizmetleri Bölümü, dokudan kaynaklanan, daha sonraleda bir tümör kitlesini olusturacak sekilde yayllân bir dizi neoplastik hücrede bir artlgl ile karakterize edilmektedir. Malignan tümörlerle, neoplastik hücreler, lan veya Ienfatik sistem vasißsüa lenf bezlerine yaylIBTalarI yol açan komsu dokularlZlve metastaz olarak adlandlülân bir süreç vasltâslýla orijinal tümör bölgesinden mesafeli diger lokasyonlarIISQal etmektedir. Kanser, çesitli isgalcilik ve agresiflik dereceleriyle karakterize edilen her bir formla genis say. formda kendini açlKça göstermektedir. NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlar, tipik olarak alkilasyon vasßslýla DNA'ya hasara yol açan reaktif oksijen türler (ROS'Ier) veya kuinon bazIEiIaç metabolitleri gibi bir dizi sitotoksik faktörü olusturmak Için umutsuz bir sekilde enzim NQOl ile metabolize edilmektedir. NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç, beta-lapakon (3,4-dihidro-2,2- dimetiI-ZH-naf-tho [1,2-b] piran-5,6-di0n; ß-tur) gibi olan, Orta ve Güney Amerika'ya özgü olan Lapacho agacII (Tabebu/a vel/anadae) kabugundan elde edilen, dogal yollarla olusan bir kuinon'dur. B-lap'I anti kanser aktivitesi, NAD(P)H vasftâslýla yönlendirilen ß-lap'lîil iki elektron azaltllîhasian kaynaklanmaktadlü elektron kaynaklarüalarak NADH veya NAD(P)H kullanan kuinon oksidoredüktaz (NQOl, DT-diyaforaz) (Pardee ve ark., Curr Cancer Drug DNA'nI tek sarmalIa kopmalara, poli(ADP-riboz) polimeraz-l'in (PARP-l) hiperaktivasyonuna, NAD+ ve ATP havuzlarII kaybi ve "programlanmlgl nekroz" veya türlerinin (ROS) olusumu ile sonuçlanan anlamsE bir döngüye tabi olmaktadE(Blanco ve Nekroptoz, apoptozun (örn. pozitif terminal deoksinükleotidil transferaz araclIJEUTP çentikle uç isaretlemesi (TUNEL) ve kromatin ve nükleer yogunlastlîilna) ve nekroz (kaspaz ve enerjiden bag Iislîl özelliklerine sahip olan hücre ölümünün benzersiz bir formudur (Bentle dagllIliiÇIdüsük tümör konsantrasyonlarlîilai ve sistemik toksisiteye yol açabilmektedir (Ough Biyo isaretleyiciler, konsantrasyonu, mevcudiyeti veya yoksunlugunun, bir hastalllîlkosulunun mevcudiyetini veya ciddiligini gösterebildigi bir doku veya spesifik hücre türünde ölçülen gen ekspresyon ürünleridir. Kanser için, tümörle iliskili biyo isaretleyicilerin tannlanmasübazü durumlarda bir kanser hücresi ile eksprese edilen bir veya birden fazla belirgin biyo isaretleyicinin diferansiyel bagllîlekspresyonuna dayalElkanser hücrelerinin spesifik olarak hedeflenmesine izin vermistir. Fakat aynlîlloku türünden kaynaklanan tümörler içerisinde bile, önemli varyasyonlar, bireyler araletlaki veya benzer kanser formlarlEtlan muzdarip bireylerin alt popülasyonlarlZlarasIa gen ekspresyon modelleri içerisinde mevcut olabilmektedir. Asi-a, genom genisliginde gen ekspresyon profili, intertümoral gen ekspresyon çesitliginin moleküler karakterizasyonuna izin vermistir, bu da temel patojenik mekanizmalarEyanleiin spesifik moleküler isaretleri ve tümörlerin bireysel alt türlerinde sagkalIila Iliskili olabilen türün tedavisi için etkili olabilen anti-kanser tedavileri, gen ekspresyon modellerinde varyasyon sonuçlarlEUan dolayüdiger alt türlerin tedavisinde benzer bir sekilde etkili olmayabildikleri için, tümör alt türlerinin tanllanmasEönemli olmaktadlEl Sonuç olarak, aynEl kanser türünde tümörler içerisinde bireysel gen ekspresyonunun çesitliliginin verilmesiyle, ekspresyonunun, ß-Iap gibi belirli bir anti-kanser tedavisine yönelik bireyleri veya bireylerin alt popülasyonlarlßeçmek için kullanllâbildigi ve ölçümünün, sadece belirli bir tümör alt türüne sahip bir bireyin, belirli bir anti kanser tedavisinden faydalanacak olmaslîcblasmlütlegil, aynüamanda ekspresyonunun, anti-kanser tedavisine özgü bireylerin veya bireylerin alt popülasyonlar.. seçilmesi için kullanElEbImasEblasElg'lElEbngörebildigi biyo isaretleyicilere ihtiyaç duyulmaktadlE Bu tarz tanlgl isaretleyiciler, aynüdokudan kaynaklanan malignan tümörlerin belirli alt türlerinden muzdarip olan bir bireyin tedavisinde dahil olan saglllZl bak.i çallgbnlarIEk/önlendirmek için kullanllâbilmektedir. klglalllîta olan tanElaI isaretler aynlîamanda ß-lap gibi NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarla tedavi gibi spesifik bir tedavi ile tedavinin baslatllîhasIan sonra pronozu takip etmek için kullanilâcaktlEI hastalarIan alin tümörlerde yükselmis NAD(P)H:kuinon oksidoredüktaz-l (NQ01) seviyeleri sergilemektedir. Dahasü yazarlar, beta-lapakonun, bir NQ01'e bagIiIElsekilde NSCLC hücrelerini seçici olarak öldürdügünü göstermistir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Burada saglanan bulus, digerler araleUa, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaca tedaviden fayda saglayacak olan kanserli bireyleri veya bireylerin alt popülasyonlarlßeçmek için tümör hücrelerinde NQ01'in ve/veya katalaz. ekspresyon seviyeleri kullanlil yönelik yöntemleri tarif etmektedir. AynEIzamanda burada, bireyden alin tümör hücrelerinde NQ01'in ve/veya katalaz. ekspresyon seviyelerine bagliîölarak bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedaviye kanserli bir bireyin duyarIIHE.. öngörülmesine yönelik yöntemler saglanmaktadlü Bir yönünde, burada, kanserli bir bireyin bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedavisi Için uygun olup olmadlg.. belirlenmesine yönelik olan, bireyde kanser hücrelerinde NQ01 ekspresyon ve katalaz ekspresyon seviyesinin ölçülmesini içeren yöntemler saglanmaktadlü burada bireyden al-n kanser hücrelerindeki katalaz seviyesinin, bir normal doku oran.. en az yaklasllZl 50 katEüzerinde olan NQ01 seviyesinin bir oran übireyin tedavi Için uygun oldugunu göstermektedir. Bir diger yönünde, burada, kanserli bir bireyin bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaca duyarlEIglII öngörülmesine yönelik olan, bireyde kanser hücrelerinde NQ01 ekspresyon ve katalaz ekspresyon seviyesinin ölçülmesini içeren yöntemler saglanmaktadlü burada bireyden alin kanser hücrelerindeki katalaz seviyesinin, bir normal doku orani. en az yaklasim 50 katEüzerinde olan NQ01 seviyesinin bir oranü bireyin tedaviye daha duyarlEl olmasßlaslmjll sahip oldugu göstermektedir. Bir yönünde, burada, kanserli bir bireyin tedavi edilmesine yönelik olan, bir bireye bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilacI etkili bir miktar.. uygulanmasIEIÇeren yöntemler saglanmaktadlB burada bireyden aI-n kanser hücrelerindeki katalaz ekspresyon seviyesinin üzerinde NQ01 ekspresyon seviyesi oranIlEl, bir normal dokuda en az yaklaslK] 50 kat oranIa olmasEflialinde, birey tedavi için seçilmektedir. BazEyapEIândIElnalarda, bireyden aIIElan kanser hücrelerinde katalaz ekspresyon seviyesinin üzerinde olan NQ01 ekspresyon 0ran|,__l bir normal dokunun en az yaklaslla 55 kat, en az yaklasllZJ 60 kat, en az yaklasüZJ 65 kat, en az yaklas[IZJ70 kat, en az yaklaslEl80 kat veya en az yaklaslKl 90 kattlE Bazlîlyapllând lElnaIarda, kanser hücreleri ve normal doku, bireyden aIlErnaktadE Bazlîýapllândlülnalarda, normal doku, birlesik normal dokudur. Burada belirli yapliândEnalarda, kanser tedavisine yönelik olarak ß-Iap gibi NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilacI kullanIi yöntemleri tarif edilmektedir. BazEl yapllândünalarda, kanser bir katEkanseridir. BazEyapllândIElnalarda, kanser, küçük hücreli olmayan akciger, prostat, meme, pankreatik, kolon kanseri veya melanomdur. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, NQ01 ekspresyon seviyesinin, prostat kanserinde, bitisik normal dokunun üzerine yükseldigini göstermektedir. (a). Bir prostat kanseri hastasIdan bir temsili numunede NQ01'in immünohistokimyasal boyamasü Ok basüneoplastik prostat bezini gösterirken, ok, bir bitisik normal bezi göstermektedir. (b). Kansere karslîhormal bitisik dokuda NQ01 ekspresyonunun istatistiksel analizleri. Ekspresyon, NQ01 için 2 %10 hücre boyamasElolarak belirlenmistir. "n", her bir grupta kullanllân vaka say-El göstermektedir. **p <0.05 (Iki taraflü Fisher kesin testi). (c). YarEI kantitatif degerlendirme, boyama yogunluguna göre [0 (negatif) ila 3+ (yüksek yogunluk) derece] degerlendirilmistir. Sekil 2, ß-lap ile indüklenmis, NQ01 aracilîüîiprostat kanseri hücre ölümünün, ROS formasyonu ve DNA kopmalarüile baslatI[g]|EJI:I göstermektedir. (a). 40 uM Dic. mevcudiyetinde veya yoklugunda ß-Iap ile tedavi edilen DU145'in nispi sagkalIiElVeriIer, altEkopyada uygulanan üç bagslîl deney için ortalama ±SE ortalamalarIlEi (b). A'da oldugu gibi tedavi edilen DU geri dönüsüm deneyleri kullanllârak takip edilen ROS formasyonu. Deneyler, her bir kopyada en az üç defa uygulanmlgtlü ve ±SE anlam. geldigi bildirilmistir. (c). Alkalin kometEUeneyleri, DU. NIH Image J yazlI[lîiI|:l kullanarak kometI kuyruk uzunlugunun kantitatif analizleri. (d)'de, DU145 hücreleri kullanIJIEken, (e)'de, LNCaP hücrelerinin yanitibrEgösterilmistir. Veriler, 100 hücreden Sekil 3, ß-Iap ile indüklenmis, NQ01 aracmos formasyonunun ve DNA tek sarmal kopmalarlEllE] (SSB'Ier), ifsa edilmis insan prostat kanser hücrelerinde hücre ölümü için gerekli olmaktadE (a). Dikoumarol (Dic, 40 uM) mevcudiyetinde veya yoklugunda ß-Iap tedavisinden sonra PC-3 hücrelerinin nispi sagkalnüVeriler, altlîkopyada uygulanan üç bag Iislîldeney için ±SE ortalamalarILEI (b). ROS formasyonu, 30 pm Dic mevcudiyetinde veya yoklugunda ß-Iap ile ifsa edilen PC-3 hücrelerinde GSSG geri dönüsüm deneyi kullanliârak dolaylüýoldan takip edilmistir. Grafik sonuçlarEI±SE anlam. gelmekteydi ve kopya halinde uygulanan üç deneyi temsil etmistir. (c). Alkaline karsljhötr kuyruk yIEEI deneyleri, süsüa toplam DNA hasariElü/eya DNA'nI çift sarmaIII kopmasIE(DSB'ler) degerlendirilmistir. (d). NIH Image] yazilmuîlllullanarak DNA hasarlEllEl degerlendirilmesi (komet kuyruk uzunluklarII rastgele birimleri (AU)). Veriler, 100 hücreden hesaplanan ß-Iap (4uM, 2 saat) sonraslTiUa PC-3 hücrelerindeki DNA hasarü (f). NIH Image J yaziIJEIIEkullanarak degerlendirilen komet uzunluklarüAU). Veriler, 100 hücreden ±SE Sekil 4, ß-Iap'lEI, DU145 hücrelerinde PPAR-1'i hiper aktif hale getirdigini göstermektedir. Bu da NAD+ ve ATP'nin tükenmesiyle sonuçlanmaktadß (a). PPNAR-l hiperaktivasyonu, gösterilen sürelerde PAR formasyonu vasßsüla 4 uM [3 -Iap ile tedavi edilen DU145 hücrelerinde belirtilmistir. NQ01 bagilHJgIIlEI, Dic birlikte eklemeleri kullanilârak gösterilmistir. (b). yHzAX seviyeleri, DSB formasyonunu bir ölçümü olarak gösterilen 4 pM gecikmis DSB formasyonunun yay-[giEl belirtilmektedir. DM:DMSO; HZOZ, hidrojen peroksit. (c). Yukar-ki gibi tedavi edilen DU145 hücreleri, NAD+ ve ATP seviyeleri için analiz edilmistir. Sonuçlar, kopyalar halinde üç defa uygulanan deneyler için ±SE olurken, at yIlîlisaretleri ATP için olmaktadlü Sekil 5, NQOl'e bagIilEPPAR-l hiperaktivasyonunun, nükleosit tükenmesinin ve PAR formasyonunun, prostat kanseri hücrelerinde ß-Iap maruziyeti ile uyarIlglIEl göstermektedir. (a). Gösterilen sürelerde Dic mevcudiyetinde veya yoklugunda 4 uM ß-Iap ile tedavi edilen PC-3 hücrelerinde PAR formasyonunun Western blot analizleri. (b). PC-3 hücreleri, A'da yukari açllZJandlg1Egibi tedavi edilmistir ve gösterilen sürelerde aI-n hücreler, NAD+ ve ATP seviyeleri için analiz edilmistir. Sonuçlar, üç kopyada üç defa uygulanan deneyler için ±SE ortalamalarIE (c). DIC (40 uM) mevcudiyetinde veya yoklugunda çesitli ß-Iap dozlarMa tedavi edilen, ß-Iap'a maruz kalan PC-3 hücrelerinde ATP tükenmesi ve nispi sagkalIi. Veriler, üç bagIislZ deneyden altEkopya için ±SE ortalamalarllü Sekil 6, NQ01+ LNCaP hücrelerinde IR ve ß-Iap'I subletal dozlarIlEl, PPAR-l hiperaktivasyon ve dramatik ATP kaybEla yol açtgllîlgöstermektedir. (a). NQOl'i eksprese eden veya NQOl'den yoksun olan LNCaP seviyeleri, IR + ß-Iap ile tedavi edilmis ve PAR formasyonu için takip edilmistir. IT, IR için tedavi edilmemis kontrol; V, vehikül; sadece DMSO. (b). Sineij'ik ATP kaybLÇI tek bas. tekli tedavilere klîlasla IR+ß-lap sonraleda belirtilmistir. Sonuçlar, kopyalar halinde üç defa uygulanan deneyler için ±SE anlam. gelmektedir. Tek ila birlesik tedaviler olarak klýhslanan Student t-testleri. ***p Sekil 7, IR ve ß-Iap arasliîhaki sinerjinin, PPAR-l hiperaktivasyonu ile yönlendirildigini göstermektedir. (a). ß-Iap maruziyeti, PC-3 hücrelerini IR'ye duyarlllâstülnlgtlü Sonuçlar, kopyalar halinde uygulanan üç bagIislZI deney ±SE ortalamalarIlB ß121 (Machado modeli). (b). Çesitli tedavilerden sonra PC-3 hücrelerinde niceliksel PAR formasyonu. (c- f). IR+ ß-Iap kombinasyonlarüdan sonra gözlemlenen sinerjik ATP kaybE(c ve e). DPQ, nüsha halinde üç defa uygulanan deneyler için ±SE anlam. gelmektedir. t-testleri, her bir grafikte tekli tedavilerden alin ilgili veri ile her bir referans noktaslülüdýlaslayarak uygulanmlgtlü Sekil 8, subletal ß-Iap ve IR dozlarII kombinasyonunun, DU145 hücrelerinde PAR ve yHzAX odak noktalarIElgelistirdigini göstermektedir. (b). Ölçülen par formasyonu. Sonuçlar, 60 hücreden ±SE ortalamalar- Student t-testleri, birlesik ila tekli tedaviler klîlaslanarak uygulanmlgtlEl ***p <0.001. (c). Gösterildigi gibi tedavi edilen D1145 hücrelerinde 10 ve 120. dakikada yHzAX odak noktaslîlformasyonunun konfokal görüntülenmesi. Sekil 9, IR ve ß-lap'I subletal dozlarEile Birlesik tedavinin, apoptozu ve atipik PPAR-l bölünmesini arttlîrlilgillîlgöstermektedir. (a). PC-3 hücreleri, 2 saatligine gösterilen tedavilere maruz büküûilgtlü tüm hücre ekstraktlarü72. saatte hazlHlanmlsÇtlElve apoptoz, TUNEL reaksiyonlarliile takip edilmistir. Sonuçlar, üç bagnslîldeneyden ±SE ortalamalarü olmustur. Birlesik ve tekli tedavi rejimi arasIaki istatistiksel farklar, *p <0.05 olarak gösterilmistir. DPQ, tüm kombinasyon tedavilerinde apoptozu bloke etmistir (p<0.01). (b). PC-3 hücreleri, yukar- gösterildigi gibi 2 saatligine A'da oldugu gibi tedavi edilmistir ve Western blot analizleri için 48 saatligine çlElarEIBwlgtlEl 4 i.iM bir ölümcül ß-lap dozu, 60 kDa atipik bölünmüs PPAR-l'i göstermek için pozitif kontrol olarak kullanüBilStB TUNEL deneyi verileri, üç bagIisEdeneyden ±SE ortalamalarmlmustur. UT: tedavi edilmemis. Sekil 10, IR ve ß-lap'I subletal dozlarEile NQ+ LNCaP hücrelerinin tedavisinin, atipik PPAR-l bölünmesini ve apoptozu arttHllglIEgöstermektedir. (a). Gösterildigi gibi çesitli kombinasyon ve tek maddeli tedavilere maruz bßkllân NQ01+ LNCaP hücreleri. Hücreler, gösterildigi gibi 2 saatligine farklEtedaviye maruz bÜkHBrIgIElve tedaviden 48 saat sonra PPAR-l atipik bölünmesi için degerlendirilmistir. Sekil 11, IR ve ß-Iap'lEl, PC-3 tümör ksenogreftlerinde sinerjik antitümör aktivitesine yol açtlglIEgöstermektedir. (a). PC-3 ksenogreftlerinde farklEtedavi rejimi kullanarak anti- tümör verimliligi. Tedaviler, bes tedavi için birinci günden baslayarak gün aslElEbir defa olarak, 350 mm3 tümörlerini taslýlan farelere verilmistir. Sonuçlar, ±SE ortalamalarIlEl KARISIK Model analizler, tedavi edilmemis kontroller dahil olmak üzere birlesige karsüiekli tedaviler için ***p <0.0001 sergilemistir. Kaplan-Meier sagkaIIi egrileri, çesitli tedavi rejimlerini kullanarak gelismis antitümör verimliligini önemli ölçüde yansliîlnaktadß ***p <0.001, **p <0.05. Log-rank p degerleri, her bir tekli tedaviye karsEbirlesik tedavilerin önemli isaretlerini temsil etmektedir. Bitis noktalarlZlzamanla farelerin sagkall %'sini temsil etmektedir. Sekil 12, tekli rejim olarak ß-Iap ile klýhslanan IR sonraleL'la NQ01+ PC-3 ksenogreftleri taslýlan farelerde antitümör verimliligini göstermektedir. Parçalara ayrlli1lgl(gün aslEIEB doz) IR (2 Gy veya 5 Gy) rejimden sonra NQOl + PC-3 ksenogreftlerinde tümör büyümesi. Tedaviler (oklar) gösterildigi gibi uygulanmlgtE Sonuçlar, araçlardß (b). Kaplan-Meier sagkalIi egrileri, tek bas. HCßCD-ß-Iap tedavilerinin toksisitesini degerlendirmistir. HCßCD ve aynüamanda 20 mg/kg ve 30 mg/kg HCßCD-ß-Iap tedavileri toksik olmam lStlEistatistiksel olarak farkllICblmamlgtlE Sekil 13, NSCLC ksenogreftlerinin ß-Lapakon radyoduyarlUâsmasIEgöstermektedir. (a) NSCLC ksenogreftlerini taslýbn atimik fareler, 4 Gy ile radyasyona maruz blîa'ekllü'ilgl ve gösterildigi üzere bir rejimde toplam 5 tedavi için gün aslEIElbir defa iv olarak IR veya [3- lap'a karsEBO mg/kg ß-lap-HPßCD ile tedavi edilmistir. Bir tedavi rejiminden gelen sonuçlar gösterilmektedir. (b) 4 Gy + 30 mg/kg il fare tedavisinin Kaplan-Meyer sagkaIIi Sekil 14, PARP1 hiperaktivasyonu vasEasEla NSCLC hücrelerinin ß-Lapakon radyoduyarl[Iâsmaslüjqöstermektedin (a)'da, NQ01+ A549 hücrelerinin ß-Iap maruziyeti, PAR formasyonu ile görüldügü üzere PARP1'in hiperaktivasyonu ile sonuçlanmaktadB yH2AX ve fosfoSer1981-ATM ile ölçülen DSB formasyonunun, ß-Iap ile tedavi edilen hücrelerde geciktirildigi ve azaltilân PAR formasyonundan sonra olustugu belirtilmektedir. (b)'de, doz ve süre tutumlarlfida ß-Iap sonrasütla Fosfo-Thr2609-DNA-PKcs formasyonu. (c)'de, 25 mM 3-aminobenzamid, bir PARP1 inhibitörünün eklentisi, A549 NSCLC hücrelerinde PAR formasyonunu yedeklemekte ve geciktirmektedir. (d)'de, ß-lap vaslßslîla A'de, maddelerden birisi ile tek bas. tedavi edilen hücrelerde olmayacak sekilde 1 Gy + 2 uM ß-Iap ile tedavi edilen hücrelerde PAR formasyonu. (0'de, NQ01 seviyeleri, A549 NSCLC hücrelerinde IR sonraleUa degistirilmemektedir, bu da NQ01 aktivitesinin (indüksiyon yok), ß-Iap arac[l]]] radyoduyarlilâsma için gerekli oldugunu güçlü bir sekilde göstermektedir. Sekil 15, NQ01 biyoreaktif iIaçlarI kullanIilEb yönelik bireysellestirilmis tedavi taramasII incelemesini göstermektedir. AdIi 1, NSCLC, meme, prostat, kolon veya pankreatik kanser hastalarIa NQ01 polimorûzmini belirlemektedir. Adli 2, PBMC'Ierde sitotoksisite ve CT C'Ierde tümör yanüîllarlîi/e hasta tümörleri ile iliskili olan NQ01:kataIiz ekspresyonunun oranIlZbeIirlemektedir. Tümörlerde proteinlerin spesifik bir kümesinin isaret ekspresyonu (NQ01, PARP-l, katalaz, AIF ve u-kalpain) ve belirgin olarak bu proteinlerin artan ekspresyonu, yari- öngörücüleri için degerlendirilebilmektedir. Son olarak, spesifik eylemlerin ekspresyonundan önce ve sonra (ATM ve H2AX fosforilasyon, PAR formasyonu, NAD+/ATP kaylîilarlîive p53 ve PARP-l proteolitik yanlflhr), NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarla hastalar. tedavisinde tümör yanlflbrlü belirlemek için degerlendirilecektir. Sekil 16, NQ01 seviyelerinin, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir tedavilere yanlîliîl öngördügünü göstermektedir. (a)'da, 2 saatligine ß-Lap ile tedavi edilen ve 7 gün sonra çlEarHân küçük hücreli olmayan akciger kanseri (NSCLC) hücre dizilerinin LD50 yan[t]hrL`_l LD50 Yan[fliarl,__INQ01 enzimatik seviyelerinin bir islevi olarak çizilmistir. *1/*1 ve *2/*2 sembolleri, her bir hücre dizisinin NQ01 durumunu, homozigot sokak türü (*1/ *1) veya homozigot polimorfik (*2/*2) genottipleri olarak temsil etmektedir. Bir sokak türü aIeIi (*1) içeren tüm heterozigot hücrelerinin, sadece homozigot *2/*2 veya 3 /3'ün, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara yanlt3al olmadiglElI görüldügü sekilde NQOl ekspresyonu için fenotipik olarak sokak türü oldugu belirtilmektedir. H596 ve H2862 hücre dizilerinin, ß-Iapakona olan yüksek direncinin, LD50 degerlerini içeren tüm sokak türü *1 /*1 hücrelerine klýlasla 5 mM daha az oldugu belirtilmektedir. AynElzamanda NQOl'de *3/ *3 SNP'nin, NQOl'de *2/ *2 tek noktalErnutasyonIardan çok daha nadir oldugu belirtilmektedir. (b)'de, *1/ *1 A549 hücreleri implante dilen ortotopik akciger tümörlerini taslýbn farelerin Kaplan-Meier sagkalIi egrisi. Fareler, tek bas. ß-Iap-HPß- CD veya vehikül (HPB-CD) ile intravenöz bir sekilde (gün asm doz) tedavi edilmistir. *2/ *2 veya *3/ *3 tümör ile benzer çallglnalar uygulanmlgtlîlve bu tümörler, ß-Iapakon veya diger NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç tedavilerine duyarllîilmamlgtlîl Sekil 17, NQOl polimorfizmine yönelik genomik DNA'nlEl PCR analizini göstermektedir. kodlayan gende bilinen polimortik bölgeleri belirlemek Için belirlenen primer kümeleri ile (metne bakIlî) ile PCR reaksiyonlarEi/asitâslýla güçlendirilmistir. Oklar, *2 (nükleotid 609, üst jel) için pozitif klglflhma bölgelerini veya *3 (nükleotid 465 alt jel) için klglflbma bölgesi yoksunlugunu göstermektedir. Normal ve tümör hasta numuneleri (861, 862, 863, 865 ve 866), hücre dizisi kontrolleri ile aynElsürece tabi tutulmustur. Hasta numunesi için heterozîgottur ve hasta numuneler 861 ve 866, *3 için heterozîgottur. Sekil 18, eslestirilmis tümör (T) ve iliskili normal doku (N) NSCLC hasta numunelerinde NQOl ve katalaz ekspresyonu için Western blot analizlerini göstermektedir. H596 kanser hücreleri, bilinen NQ01*2 polimorrik hücreleridir, burada A549 NSCLC hücreleri, NQOl'in endojen olarak yükselmis seviyelerini eksprese etmektedir. NSCLC tümör (T) ve iliskili kontrolü olarak kullanllân ß-aktine klýlasla degerlendirilmistir. Sekil 19, tek bas. ve aynlZlzamanda bakIi kemoterapilerinin X Sülüveya diger standardDle kombinasyon halinde NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarla tedavi edilebilen düsük NQOlzKataliz oranlar. sahip hastalar. tannlanmasIEl göstermektedir. N, normal doku; T, NSCLC tümör dokusu. Sekil 20, NQOl'in Ientiviral shRNA nakdavn- maruz kalan MiaPaa pankreatik kanser hücrelerini göstermektedir. NQOl seviyelerini çesitlendiren klonlar (kapalElsemboller) izole edilmis ve ß-Iapakon ile tedavi edilmistir. Veriler, NQOl aktivitesinin -90 biriminin, LD50 degerleri ile ölçülen verimli antitümör aktivitesi için gerekli olmaktadlü Aç[lZl semboller, ß-lap'a ölümcüllük için yeterli NQOl seviyelerine sahip olan hasta malzemesinden türetilen bir dizi diger pankreatik kanser hücresi dizilerini temsil etmektedir. Bu hücre dizilerinden bazilârü enzimatik aktivitelerle hasta #2823 ile kiýbslanabilir NQOl aktivitelerine sahip olmustur. Bu sebepten ötürü, mucitler, hasta bulusta öngörüldügü gibi NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarla tedaviye tabi olmasiîiaç-an normal dokuda bir düsük NQ01:KataIaz oran. sahip oldugunu öngörmektedir. Sekil 21, programlanmigl nekroz süslda MDA-MB-231 NQ01+ hücrelerinin, NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir iIaçIariEl (örn. ß-Iapakon) taniîial proteolitik yanitilarIEI göstermektedir. MDA-MB-231 hücreleri, tek bas. NQOl veya vektörü ile transfekte edilmistir. B-Iapakona bu kültür veya tümör dokusu yaniflhriîl(a) atipik PAR-1 ve p53 proteolitik bölünmesi; (b) u-kalpainin büyük ve küçük ait birimlerinin bölünmesi ve aktif kDa u-kalpain formasyonu ve 80 kDa u-kalpainin küçük alt birim kaybiîlve (c) endojen p-kalpain inhibitörünün (kalpastatin) kaybü B-Iapakon ile indüklenen hücre ölümü, hücre döngüsü düzenlenmedigi için, siklin D1 seviyelerinin degistirilmedigi belirtilmektedir. NQOl- 231 tümörleri, ß-Iapakona yaniEivermemistir. Sekil 22, ß-Iap tümör hücresi ölümünün NQOl'e baglilüinekanizmasII bir açilZlamasID göstermektedir. Sekil 23, ß-Iapakon ile yönlendirilen bir isaret hücre ölümü yanifilarII katalaz inhibisyonunu göstermektedir. (a)'da, uzun dönemli sagkalli degerlendirmesi. 48 kuyucuklu kaplarda (2500 hücre/mL) ekilen hücreler, gösterildigi gibi katalazla birlikte tedaviyle veya bu katalazla birlikte tedavi olmadan ß-Iap'I çesitli dozlarlýla tedavi edilmistir. SagkaIIi, 7 gün sonra degerlendirilmistir. (b)'de, ß-Iap 4 M veya ß-lap + katalazla birlikte tedavi (2000 U/mL) ile veya bu tedavi olmadan tedavi edilen hücrelerde PAR ile olusturulan PARPl'in Western-blot analizleri. (c)'de, gösterildigi gibi çesitli inhibitörlerle (katalaz 2000 U/mL) ß-lap veya B-Iap +/- birlikte tedaviye 1 saatlik maruziyetten sonra %NAD+ kaybII analizleri. Kontroller, gösterildigi gibi DMSO, tek bas. dikoumarol ve tek bas. katalazIZIiçermektedir. (d)'de, TUNEL deneyleri ile degerlendirilen apoptoz. Hücre, 2 saatligine ß-Iap veya ß-lap + katalaz (2000 U/mL) ile tedavi edilmistir. Ilaç ortamlargilîarilfhlStiEive hücreler, 24 saat sonra çiEbrilBilgtlEve tek bas. apoptoza karslîl'ehikülle tedavi edilen hücrelerde artigi katüçin analiz edilmistir. Sekil 24, bir NQOl'e bagIiIEisekilde insan prostat kanser hücrelerini öldüren ß-Lap'El göstermektedir. (a) Prostat kanseri hücre dizilerinde NQOl ekspresyonu. (b) tek bas. ß-Lap'a maruz bßkiiân veya bir NQOl inhibitörünü içeren 3 farkliîhücre dizisinin nispi Sekil 25, SC A549 NSCLC ksenogreftlerini taslýlan atimik farelerde ß-lap misellerinin antitümör verimliligini göstermektedir. (a) tümör hacimleri, (b) hayvan sagkaIIi. Sekil 26, HPßCD vasßâslîla ve ß-Iapakon vasLtBisIEa olmadan hemolizi göstermektedir. Insan (gösterilen) veya fare rb'leri, tek bas. HPßCD veya HPßCD-ß-Iap ile veya DMSO'da tek bas. ß-Iap ile inkube edilmistir. Tek bas. sadece HPßCD, önemli hemolizlere sebep olmustur. Sekil 27, NQOl ekspresyonunun ve biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilacüilan ß- hasta numunelerinden iliskili normal dokuda (N) NQOl aktivitesi deneyi (nMoI cyt- c/min/ug protein olarak bildirilmektedir). NQOl aktivitesi, normal akciger dokusunda tespit edilememistir. (b) atimik tüysüz farelerde ß-Lap farmakokinetik (PK) analizleri. Siyah daireler, plazma konsantrasyonlarIüng/mL) belirtmektedir; diger renkler, çesitli organ/tümör konsantrasyonlarIEl (ng/g) belirtmektedir. Akcigerde ilacI yükselmis seviyeleri belirtilmektedir. (c) immünohistokimya (IHC) vaslßslýla NQOl ekspresyonu. Ok basDNQOl + prostat kanser hücrelerini belirtmektedir. Ok, düsük tespit edilebilir NQOl protein seviyelerine sahip olan veya herhangi bir tespit edilebilir NQOl protein seviyelerini sahip olan normal prostat bezi dokusunu belirtmektedir. Sekil 28, ß-lap'I NQOl'e baglilüfaydasiîl döngüsünün, oksijen tüketimini ve ROS formasyonunu indükledigini göstermektedir. (a)'da, önceki veriler, NQOl ile ß-lap'I asagIki metabolizmalelEIgöstermistir: ß-Iap, hidrokuinon formunun stabil olmadigilîl NQOl ile bir faydasEredoks döngüsüne tabi olmaktadE Iki bir-elektron oksidasyon adIIZI vasiüslýla, hidrokinon, ana ß-lap molekülüne spontane bir sekilde geri dönmektedir. Teorik olarak, iki geri reaksiyon, süreçte süperoksidin (02") iki molekülünü olusturarak elektronlarEkabul etmek için oksijeni gerektirmektedir. Bu döngü, ß-Iap'lZbiyoaktif hale getirmektedir, bu da p53 ve PARP-l'in seçici olarak bölündügü bir Ca"-baglilüp-kalpain araciEÜJ1ücre ölümü ile sonuçlanmaktadE (b)'de, 231-NQ+ veya 231-NQ- hücrelerinden hücre ekstraktlarljl, 2 veya 15 pM ß-lap, 6 dikoumarol eklentisi ile bir kapalElsistemde yerlestirilmistir. Oz tüketimi, "Malzemeler ve Yöntemler" bölümünde açilgandiglEgibi bir Ocean Optics 02 sensörü ile ölçülmüstür. Veriler, üç bagllslîl deneyden (*p 5 0.005 (1 ile tedavi edilmis hücre ±SEM'si üzerinde NQOl+ S9'un oksijen tüketiminin katlanma oranEl olarak grafik haline getirilmistir. 02 tüketimi, ROS'u olusturan ß-Iap faydaslZdöngüsüne atfedilmistir. Her bir çubuk, üç kopya halinde uygulanan iki baglsü deneyin ±SEM anlamlEb gelmektedir. (c-d)'de, çesit süreler Için ß-Iap maruziyetlerinden sonra 231-NQ+ ve 231 NQ- hücreleri, gösterilen sürelerde olusturulan ROS türlerini belirlemek için analiz edilmistir. (c)'de (02- formasyonu için) DHE veya (d)'de DCFDA ile boyanan (ROS formasyonu, birincil olarak H202) ß-Iap tedavisinden sonra hücrelerden mikrografiklerin kantifikasyonu, öncesinde ve "Malzemeler ve Yöntemler" bölümünde aç[lZ]and[g]l:lgibi uygulanmEtlE Student t-testi, kopya halinde uygulanan ve 3 defa tekrar edilen bireysel tedavilerin araçlarürasia önemli farklar olus olmadlglIEbelirlemek için uygulanmigtlîl Sekil 29, ß-Iap ile tedavi edilen MCF-7 hücrelerinde dikoumarol ile oksijen tüketiminin inhibisyonunu göstermektedir. (a)'da, polagrafi, ß-Iap ile tedavi edilen MCF-7 hücrelerinde potasyum siyanür uygulamasIan sonra önemli oksijen tüketimi sergilemektedir. (b)'de, bir Clark Elektrotu, çesitli ß-Iap dozlarlýla MCF-7 hücrelerinin tedavisinden sonra kullanilân çözülmüs oksijen mollerini belirlemek için kullanilüjlgtlîl (a) ve (b)'de, dikoumarol (bir NQOl inhibitörü) oksijen tüketimini bloke etmistir, bu da NQOl araclIH] oksijen kullanIiIßl, MCF-7 hücrelerinde ß-Iap uygulamasi yan[t3al olarak olustugunu göstermektedir. Sekil 30, ß-lap'I terapötik dozlarIEI, oksidatif gerilim yanlflhrljle iliskili NQOl'e bagIiID ölümcüllügü indükledigini göstermektedir. (a-b)'de, 231-NQ+ ve 231-NQ- hücreleri, 48 kuyucuklu plakada ekilmistir ve 2 saatligine çesitli ß-lap dozlar. maruz bßkühwlgtü Taze ortam, 2 saatlik ilaç titresiminden sonra eklenmistir ve uzun dönemli sagkalIi (DNA içerigi analizleri) uygulanmiStlB (c-d)'de, 231-NQ+ ve 231-NQ- hücreleri, çesitli süreler için gösterilen ß-Iap dozlar. maruz büklühlgtlîl ve glutatiyon seviyeleri degerlendirilmistir. Student t-testi, aItElkopya (a-b) veya üçlü kopya (c-d) halinde uygulanan ve 3 defa tekrar edilen bireysel tedavilerin araçlarlîlsiraslüha önemli farklarlEl olup olmadlfjlllîlbelirlemek için uygulanmISIlEI Sekil 31, normal memeli epitelyal hücrelerin, ß-lap toksisitesine daha az yan[t3al oldugunu göstermektedir. Normal insan memeli epitelyal hücreleri (HMEC 1585), 48 kuyucuklu kaplarda ekilmistir ve 2 saatligine çesitli ß-Iap dozlarEiIe tedavi edilmistir. Hücreler daha sonraleL'la taze ortama verilmistir ve kontrol haznelerinin, %80-90 oran a birbirine karlgîlhale gelmesine izin verilmistir. DNA içeriginin Hoescht boyamasü nispi sagkaIIiIJiielirlemek için uygulanmlgtlü Sekil 32, artan ß-lap dozajIIEI, NQOl aracÜJJZI nükleotid tükenmesi ve PARP1 hiperaktivasyon ile sonuçlanan DNA onarIEületal hasar esik yaniflhrIIElarttlîc'liglEl göstermektedir. (a)'da, 231-NQ+ hücreleri, gösterilen süreler için çesitli ß-lap dozlarElle tedavi edilmistir ve komet kuyruklarüImageJ yazlIllîliÜkullanilârak analiz edilmistir. Grafik haline getirilen veriler, üç baglisüdeneyden (*p 5 0.01 (6 |JM ß-Iap için)) 50 bireysel olarak analiz eidlmis floresan mikrografiiklerin/tedavi grubunun ±SE'si anlam- gelmektedir. (b)'de, gösterilen süreçler ß-Iap'I (1, 2, 4 veya 6 pM) çesitli dozlarEiIe tedavi edilen 'de, 231-NQ+ hücreleri, gösterilen süreler Için çesitli ß-Iap dozlarEile tedavi edilmis ve Western blot analizleri ile PAR formasyonu için (PARPl hiperaktivasyonunu takip etmek için) analiz edilmistir. Bu blotlarda takip edilen PAR proteini, PAR ile modifiye edilmektedir ve 116-118 kDa bantlarIIZLireten PARP-l'in etkisiz halde formudur. En az üç defa uygulanan deneylerin temsili blotlarügiösterilmektedir. Sekil 33, uzun dönemli sagkalIiI ß-Iap ile indüklenen ROS formasyonunun ve gelisiminin katalaz inhibisyonunu göstermektedir. (a)'d, 231-NQ+ hücreleri, "Malzemeler ve Yöntemler" bölümünde açllîlandlgilîgibi DHE veya DCFDA ile boyanmStB Boyama prosedüründen sonra, hücreler, 1000 U katalaz veya 3000 U SOD yoklugunda veya mevcudiyetinde 20 dakikalfgl- 4 uM ß-lap ile tedavi edilmistir. En az 50 hücre floresan fotomikrografikleri (tedavi edilmis ve tedavi edilmemis), ROS seviyelerini degerlendirmek için NIH image JyazllilîliEkullanllârak klýlaslanmlgtlîleE, süperoksit ile üretilen ROS'yi baskI bir sekilde tespit etmektedir ve DCFDA, H. Minimum 3 defa uygulanan deneylerden bir temsili grafik gösterilmektedir. (b)'de, MCF-7 hücreleri, bir CMV ile harekete geçirilen katalaz ekspresyon vektörü veya bir kontrol vektörü (Open Bio-systems) ile geçici olarak transfekte edilmistir. Transfeksiyon prosedüründen 48 saat sonra, hücreler, 48 kuyucuklu kaplarda tripsinize edilmis, sayilBilS ve plakalanmlgtlîl 24 saat sonra, hücreler, çesitli ß-Iap dozlarEile tedavi edilmistir ve hücre büyüme deneyleri uygulanmlgtE DNA içerigi, Hoescht boyasl] kullanilârak belirlenmistir. (c-d)'de, hücreleri, çesitli katalaz dozlarII yoklugunda veya mevcudiyetinde çesitli ß-Iap dozlarlsîla 2 saatligine tedavi edilmistir. 2 saatlik tedavi sonrasIia, taze ortamlar eklenmistir ve kontrol hazneleri %80-90 oranIa birbirlerine karlgana kadar hücrelerin inkube edilmesine izin verilmistir. DNA içerigi, Hoescht boyasEkullanllârak belirlenmistir. Alt kopya halinde uygulanan ve 3 defa tekrar edilen deneylerin temsili grafikleri gösterilmektedir. (e-f)'de, 231 NQ+ veya 231 NQ- hücreleri, çesitli katalaz dozlarII ve 3000 U SOD'sinin yoklugunda veya mevcudiyetinde çesitli ß-Iap dozlarEiIe 2 saatligine tedavi edilmistir. 2 saatlik tedavi sonrasIa, taze ortamlar eklenmistir ve hücreler, öncesinde (c-d)'de açllZlandlglügiibi analiz edilmistir. Sekil 34, eksojen katalaz eklentisinin, ß-Iap aracllliîl sitotoksisiteyi kaldelgIEl mevcudiyetinde veya yoklugunda 2 saatligin 4 uM ß-Iap ile tedavi edilmistir. Hücreler daha sonraleda alkalin elektroforezi sonraleUa komet formasyonu ile DNA hasarEIçin analiz edilerek çlElarllüilStIE Tedavi edilmis veya tedavi edilmemis grup bas. en az 50 komet kuyrugunun bir temsili grafigi gösterilmektedir. Student t-testleri, önemli farklarI tedavi gruplarürasua mevcut olup olmad [gillîlbelirlemek için uygulanmlgtlü (c)'de, gösterilen süreler için 4 pM ß-lap ile tedavi edilmistir. Lizatlar çlKlarllhilgl ve PAGE'ye tabi tutulmustur. Immobilize kompleksler, PVDF membranlar. aktarllüilgtlîl ve PAR ile olusturulan PARP1 ve gama-HZAX'e yönelik western blotlarüiygulanmlsnrîl (d)'de, 231 NQ+ hücreleri, 1000 U katalaz veya 50 pM dikoumarol mevcudiyetinde veya yoklugunda 2 saatligine 4 pM ß-lap ile tedavi edilmistir. Hücreler daha sonrasIa, NAD+ seviyeleri için analiz edilmistir. Üç kopya halinde uygulanan ve 3 defa tekrar edilen bir temsili deney gösterilmektedir. (e)'de, veya mevcudiyetinde (sag panel) 2 saatligine çesitli ß-lap dozlarElle tedavi edilmistir. 2 saatlik darbeden sonra, baze ortamlar eklenmistir ve hücreler 48 saat sonra çllZlarllÜilgtlEl Lizatlar, (c)'de açlEland[giEgibi çililarllîhlgtßve PARP1 ve p53'e yönelik western blotlarü 231-NQ+ hücreleri, 1000 U katalaz yoklugunda veya mevcudiyetinde 2 saatligine çesitli ß- analiz edilmistir. Veriler, üç baglslZI deneyden kontrol DMSO'su ile tedavi edilen hücre ±SEM üzerinde ß-lap ile tedavi edilen katlanma pozitivitesini olarak grafik haline getirilmistir. Sag panelde, MCF-7 hücreleri, 1000 U katalazII yoklugunda veya mevcudiyetinde 4 |JM ß-Iap ile 2 saatligine tedavi edilmistir. 2 saatlik ilaç darbesinden sonra, taze ortam eklenmis ve hücreler, 24 saatligine ve ilave 24 saat daha inkube edilmistir. Hücre Iizatlarl: Western blotlama prosedürleri kullanilârak PARP1 ve p53 bölünmesi için analiz edilmistir. Sekil 35 ß-lap ile indüklenen atipik PARP1 proteolizinin katalaz önlenmesini göstermektedir. (a) ve (b)'de, MCF-7 hücreleri, 2 saatlik çlKlarma islemi için 4 uM miktara maruz bEkllBilStlEl ve lizatlar, %10 SDS-PAGE jellerinde çözülmüstür. Immobilize proteinler, PARP1 (a) ve p53 DOl (b) antikorlarEile problanmlgtm Sekil 36, ß-Iap ile indüklenmis endonükleaz aktivitelerinin, eksojen katalaz eklentisi ile kald-IlglEl göstermektedir. (a)'da, MCF-7 hücreleri, asaglkileri içeren çesitli inhibitörlerin yoklugunda veya mevcudiyetinde 4 pM ß-lap ile 2 saatligine tedavi edilmistir: 50 ;M dikoumarol veya 5 ;M BAPTA-AM. Kaspaz aracIIlDapoptoza yönelik bir pozitif kontrol olarak, MCF-7 hücreleri, pan-kaspaz inhibitör Z-VAD yoklugunda veya mevcudiyetinde 1 uM storosporin (STA, 24 saat) ile tedavi edilmistir. Tam uzunlukta bölünen PARP1 ve p53 formlar. yönelik Western-biat analizleri uygulanmlSIE (b-d)'de, MCF-7 hücreleri, 4 uM ß-Iap (b) veya ß-Iap ve 5 |JM BAPTA-AM (c) veya ß-Iap ve 1000 katalaz (d) ile çesitli süreler için tedavi edilmistir. Hücreler, gösterilen sürelerde çilZlarllhîlgl ve AIF'ye poliklonal antikorla boyanmlgtE Temsili konfokal mikrografikler, Nikon C1 konfokal mikroskopu kullanllârak 100X büyüme ile allEtnlSIlE (a)'de, MCP-7 hücreleri, AIF'ye 20 pM siRNA ile veya karlStlEllIhlglsiRNA ile transfekte edilmistir. 48 saat sonra hücreler, 48 kuyucuklu plakalarda tripsinize edilmis, sayllîjhlgl ve ekilmistir. Daha sonrasIa hücrelerin gece boyunca yapßmasl izin verilmistir ve daha sonrasIa dikoumarol ile veya dikoumarol olmadan çesitli ß-lap dozlarlýla 2 saatligine tedavi edilmistir. Büyüm deneyleri için kullanmayan hücreler topak haline getirilmis ve çözünmüstür. Lizatlar, AIF ekspresyonuna yönelik (ilave) western-blot analizleri ile analiz edilmistir. (f)'de, MCF-7 hücreleri, 2 saatligine 4 ;M ß-Iap ile tedavi edilmistir. Ilaç darbesinden sonra, taze ortamlar eklenmistir ve hücreler, gösterilen sürelerde çlKlarllÜilgtlEl Hücre ekstraktlarÇl PAGE'ye tabi tutulmustur ve western blot analizleri uygulanmlgtlü Immünoblotlar, PAR1 ve GAPDH'ye antikorlarla boyanmlStE MSH2 boyamasÇlbir iç yükleme kontrolü olarak kullanllIhlStE Sekil 37, ß-Iap'I NQ01 ile yönlendirilen faydaslîldöngünün, bir ROS/PARPl araclIJJIl/e tümöe özgü nekroptotik yolu indükledigini göstermektedir. Tümör hücrelerini aslEID eksprese eden NQOl'de NQ01 aracll]]]toksisiteyi gösteren model. Tümör hücrelerini aslElEl eksprese eden NQ01 ile ana kuinonun (ß-lap) hücresel alIilJNQOl ile yönlendirilen bir hidrokinon formasyonu ile sonuçlanmaktadü Moleküler oksijen mevcudiyetinde, ß-Iap- hidrokinon (ß-IapHQ), NQ01 enzim aktivitesine yönelik elektron donörü olan bir net NAD(P)H kaybi yol açan spontane ve arallElslZldöngüye tabi olmaktadE Esas NAD(P)H havuzlar-I kullanIiEIesasen hücrelerin zorunlu enerji esdeger kaynaklarIEl zapt etmektedir. Bu, NQOl'e baglilüoksidatif gerilim, PARP1 hiperaktivasyonu, nükleotid tükenmesi ve nihai olarak tümör seçici nekroptotik ölümcüllügü içeren ylKIEEhücresel eylemlere yol açmaktadB Yol, asag Ikileri içeren ß-lap araclüDiekroptozun inhibitörleri ile klîlflhnmaktadlE dikoumarol (NQ01), katalaz (ROS) ve 3 amino benzamid (3AB) gibi PARP1 inhibitörleri. Sekil 38, yüksek dozlu NAC'nin, ß-lap toksisitesini kaldlîculglElEgöstermektedir. (a)'da, NQ01+ MDA-MB-231 hücreleri, tek baslEb artan dikoumarol dozlarlEllZiçeren ortamla tedavi edilmistir (düz semboller ve çizgiler) veya ß-lap (4 |JM, düz semboller ve kesik çizgiler) veya NAC 25 mM ile 1 saatlik ön tedavi ile uygulanmlgtlîl bunu birlikte tedavi (açlKJ semboller ve kesik çizgiler) veya her ikisi (açlKl semboller ve katEçizgiler) takip etmistir. Ortam daha sonrasIda çllZlarllEilSl taze ortam eklenmis ve hücreler, nispi sagkaIIia yönelik degisimler için takip edilmistir. Nispi DNA içerigi belirlenmistir. (b)'de, NQ01+ MDA-MB-231 hücreleri, tek bas. çesitli NAC konsantrasyonlarIElldüz semboller ve çizgiler) içeren ortamla tedavi edilmistir veya 2 saatligine ß-Iap (4 pM, düz semboller ve kesik çizgiler) veya menaidon (20 uM, açlEl sembollerve kesik çizgiler) ile birlikte uygulanmlSIIB 2 saatlik tedaviden sonra, taze ortam eklenmistir ve hücrelerin nispi sagkalIilZllakip edilmistir. BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Burada 1) kanser olan bir bireyin, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedavi için uygun bir aday olup olmad[glElI belirlenmesine, 2) kanser olan bir hastanlEl, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla bir tedaviye duyarllîrblmasII öngörülmesine ve 3) kanser olan bir bireyin, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç bilesimi ile tedavi edilmesine yönelik yöntemler saglanmaktadlEl Mucitler, normal dokularda (iliskili normal doku gibi) bu proteinlerin ekspresyonuna göre tümörlerde artan NQ01 ekspresyonunun ve azalan katalaz ekspresyonunun, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilaçla tedaviye daha büyük bir yanü/erme olasEIJEEIIe iliskilendirilmektedir. NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlar, NQOl'in daha büyük ilgili ekspresyonuna veya enzimatik aktivitesine ve NQOl'in azalan seviyelerini eksprese eden tümörleri ve/veya kanser hücreleri ile klýbslanan katalazI daha az ilgili ekspresyon veya enzimaitk aktivitesine ve normal dokuya göre katalazI artan seviyelerine sahip olan tümörlere ve/veya kanser hücrelerine maruz bßklugl daha büyük öldürücülük sergilemektedir. Bu, uygun tedavi için kanserli bireylerin veya kanserleri bireylerin alt popülasyonlarII seçilmesi için kullanlgl- Bu, kanserli bireylerin tedavi edilmesine yönelik olan, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla birincil tümörün lokasyonundan metastasize olan tümör hücrelerini Içeren bir yöntemin bir bölümü olarak kullanlglIlEI Burada kullan-[gllîlüzere, bir "birey" bir memelidir, daha çok tercih edilecek sekilde bir insandE Memeliler, klîlflaylîlîblmayacak sekilde insanlar, primatlar, çiftlik hayvanlarÇlspor hayvanlarÇlkemirgenIer ve evcil hayvanlarllörn. köpekler ve kediler) içermektedir. Burada ve ekteki istemlerde kullanIlgiEüzere, içerik aksini net bir sekilde göstermedikçe, degere veya parametreye yönlendirilen yapllândlEinalarEiçermektedir (ve açllZIamaktadE). Örnegin "yaklasllZlX" terimini Ifade eden açlKIama, "X" ibaresinin açHZIamasIüçermektedir. Burada açiEIanan bulusun yönünün ve varyasyonlarIlEi, yönlerden ve varyasyonlardan Mevcut tarifname boyunca verilen her bir maksimum sayEaI kEifliamanlEl, bu tarz ait saylgial klîlfibmalar burada açiiZça belirtilmis gibi her bir alt sayisal klgifiiamaylîi içermesi amaçlanmaktadlEi Mevcut tarifname boyunca verilen her bir minimum sayigial kiîiüiama, bu tarz yüksek sayiêial klîiHhmalar burada açHîÇa yazHBiiggibi her bir yüksek saylgial kigBbmayEi içerecektir. Mevcut tarifname boyunca verilen her bir saylgial araliKl bu tarz daha dar saylgial araIiEiarI tümünün burada açiEÇa yazIIgiEgibi daha genis saylîal aralilZiiçerisinde kalan her bir daha dar saylîial araliglîiberecektir. Genel T eknikler Mevcut bulusun uygulanmasü aksi belirtilmedigi sürece, teknikte tecrübe sahibi kisiler tarafIan iyi bilinen geleneksel moleküler biyoloji teknikleri, mikrobiyoloji, hücre biyolojisi, biyokimya, nükleik asit kimyasEi/e immünoloji tekniklerini kullanacaktlEi Bu tarz teknikler, literatürde tamamen açilZIanmaktadlÜ örnegin Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook ve ark., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (burada "Sambrook" olarak ifade edilmektedir); Current Protocols in Molecular Bioiogy (F.M. Ausubel ve ark., eds., 1987, including supplements through 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis ve ark., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (burada "Harlow and Lane" olarak ifade edilmektedir), Beaucage ve ark. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000), Handbook of Experimental Immunology, 4th edition (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); ve Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987). Tümör/arda NQOI ve Kata/.9213 Diferansiyel Ekspresyanu NAD(P)H dehidrogenaz [kuinon] 1 (NQOl), insanlarda NQOl geni ile kodlanan bir enzimdir. Bu gen, NAD(P)H dehidrogenaz (kuinon) ailesinin bir elemanIEve sitoplazmik 2-elektr0n redüktazIEikodIamaktadiEI Bu FAD baglaylEEiproteinler, homodimerleri olusturmakta ve kuinonlarEhidrokinonlara azaltmaktadlE Bu proteinin enzimatik aktivitesi, radikal türlerin üretimi ile sonuçlanan kuinonlarI bir elektron indirgemesini önlemektedir. NQOl'in bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaca maruziyetinin, DNA onarIiII inhibisyonuna ve programlanmlg nekrozun indüklenmesine yol açtlg]l:lsekilde poli(ADP-ribozil) polimeraz 1'i (PARPl) spesifik olarak hiper aktif hale getirdigi bir biçimde DNA'ya hasarla sonuçland[glEl düsünülmektedir. Sinerji, p53 durumu, hücre döngüsü durumu ve hipoksiye ve diger direnç mekanizmalar. immünden bagIislîdEI NQOl, normal hücre/doku üzerinde çesitli insan kanserlerinde (örn. prostat, meme, küçük hücreli olmayan akciger, pankreatik ve kolon kanserleri) diferansiyel olarak asiîlEleksprese edilmektedir. Bazüapllândlûnalarda, NQOl, iliskili normal dokuda olandan 5 ila 200 kat daha büyük seviyelerde çök say. tümör türünde eksprese edilmektedir (bkz Sekil 22). Spesiûk olarak, ön arastlîrlnalar, küçük hücreli olmayan kanserin (NSCLC) %80'inin üzerinde 200 kata kadar aslEEl ekspresyon, pankreatik kanserin %80'i üzerinde 100 kat. kadar aslElEl ekspresyon, prostat kanserinin %60'lEUa 10 kata kadar aslîlEékspresyon, meme kanserinin ekspresyon sergilemistir. Diger yapüândlîilnalarda, NQOl ekspresyon seviyesi, bir numune içerisinde mevcut NQOl protein miktarEIölçülerek belirlenmektedir. Numune, bir tümör numunesi olabilmektedir veya normal dokunun bir numunesi olabilmektedir. BazEI yapllândünalarda, NQOl, normal dokuda NQOl ekspresyonundan daha fazla olan bu sayüâr araslîiblaki herhangi bir deger dahil olmak üzere en ainan yaklaslKlS kat, yaklasllîl 10 kat, kat, yaklasllZ|45 kat, yaklaslESO kat, yaklasilZlSS kat, yaklasilZl 60 kat, yaklasilZl 65 yaklasilZ|70 kat, yaklaslEI75 kat, yaklaslKlBO kat, yaklasilZJ 85 kat, yaklasiEI90 kat, yaklasilZJ 95 kat, yaklasllZl veya yaklasik] 200 kat bir seviyede tümör hücrelerde eksprese edilmektedir. Katalaz, oksijene maruz bßkllân, su ve oksijene hidrojen peroksit dekompozisyonunu kataliz ettigi neredeyse tüm canlEIorganizmaIarda bulunan yaygI bir enzimdir. Katalaz, tüm enzimlerin en yüksek dönüsüm sayilârIan birisine sahiptir; bir katalaz molekülü, 40 milyon hidrojen peroksit molekülünü, her saniye suya ve oksijene dönüstürebilmektedir. Hidrojen peroksit, birçok normal metabolik sürecin bir zararllîlran ürünüdür; hasarlîönlemek için, diger, daha az zararlülnaddelere hlîIEbir sekilde dönüstürülmelidir. Sonuç olarak, katalaz, hidrojen peroksit dekompozisiyonunu, daha az reaktif gazlEbksijene ve diger moleküllere hlîIEbir sekilde katalize etmek için hücreler vashâslýla lellKla kullanilmaktadlü NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç direnci belirtilmemesine ragmen, katalaz ekspresyon gibi ROS detoksifikasyonu ile iliskili faktörler, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç verimliligini azaltabilmektedir ve normal dokunun korunmasißha bir detoksifikasyon süreci olarak hareket edebilmektedir (Sekil 23). Mucitler, normal dokunun sagliiZJEliücrelerine göre, NSCLC hücrelerinin, NQOl'i asEiIeksprese eden spesifik kanserlere karsEKÖrnegin klgfiiaylaîblmayacak sekilde, NSCLC, prostat, meme, pankreatik ve kolon) NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç kullanlII terapötik penceresinin artt-[giEi sekilde katalaz ekspresyonunda yetersizdir (bkz. Sekil 4 ve 5). Dolaylîiýla, kanser hücrelerinde katalaz ekspresyonu üzerinde NQ01 ekspresyon oranÇIbir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilaçla tedaviye yönelik bireylerin seçilmesi için kullanllâbilmektedir. Bazijapilândiüinalarda, bir bireyden tümör hücrelerinde katalaz ekspresyon seviyesi üzerinde NQ01 ekspresyon seviyesinin oranünormal dokuda (örnegin klîifliama olmakslZIEi, bir kanserli bireyde bir kansersiz alandan aI-n doku veya bir kanserli bireyde bir kanser içeren dokunun bir hastaliEislîIaIanlEldan aIEian doku) katalaz ekspresyon seviyesine NQ01 oraniîilizerinde bu sayllâr arasIaki herhangi bir deger dahil olmak üzere yaklasllîi 50 kat, yaklasiKl 55 kat, (dahil) arasEtlan herhangi birisinden daha büyüktür. BazElyapilândlEinalarda, NQ01 ve katalaz ekspresyonu seviyesi, bir numune içerisinde mevcut olan NQ01 ve katalaz enzimatik aktivite miktarl] ölçülerek belirlenmektedir. Diger yapilândlEinaIarda, NQ01 ve katalaz ekspresyonu seviyesi, bir numune içerisinde mevcut olan NQ01 ve katalaz protein ve/veya mRNA'nI miktarlîölçülerek belirlenmektedir. NQOI ve Katalazlîi' Ölçümü Normal dokulardaki orana göre tümörlerde katalaz ekspresyonu üzerindeki NQ01 oranÇibir kanserli bireyin, bir kanserli bireyden aI-n bir numunede NQ01 ve katalaz. ekspresyon seviyelerini ölçerek bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedavi için uygun olup olmadigill belirlenmesine yönelik biyo isaretleyiciler olarak kullanilâbilmektedir. "NQ01 ve katalaz ekspresyonu miktarlarmifadesi, NQ01 ve katalaz DNA gen sekansIlEi, mRNA'ya dönüsümünü (örn. ilk birlestirilmemis mRNA transkripti veya olgun islenmis mRNA dahil), dönüstürülen NQ01 ve katalaz proteini ürünlerini (örn. kiîiüiaylîüolmayacak sekilde ubikitinasyon, sumolasyon, asetilizasyon, metilasyon, glikozilasyon ve/veya hidroksilasyon gibi herhangi bir dönüsüm sonrasÜnodifikasyon dahil) ve aynüamanda NQ01 ve katalaz. enzimatik aktiviteleri (0"rn. kuinonlarI hidrokinonlara azaltilüiaslîlve hidrojen peroksidin süsüla suya ve oksijen gaz. dönüsümü dahil) kapsamaktadlEl Burada kullanIlgiEüzere, ekspresyon seviyesi, bir averaj deger, bir medyan degeri, bir ortalama deger ve bir belirli kontrol veya referans degeri ile klýhslanan bir deger olabilmektedir. Ekspresyon seviyesi aynD zamanda bir referans degeri kullanüârak normalIestirilebilmektedir. TÜmör/erden ve normal dokulardan numune/en?? elde edilmesi NQOl ve katalaz ekspresyon seviyelerinin (enzimatik aktivite dahil) saptanmasülçin kullanllân tümörlerden ve normal dokulardan (örnegin iliskili normal doku) aI-n numuneler, çesitli yöntemlerde elde edilebilmektedir. Burada kullanüân "numune" terimi, örnegin fiziksel, biyokimyasal, kimyasal ve/veya fizyolojik özelliklere dayalßlarak karakterize edilecek ve/veya belirlenecek olan bir hücresel ve/veya diger moleküler varl[g]l:lçeren ilgili bir sujeten elde edilen veya türetilen bir bilesimi ifade etmektedir. Bir yapllândlElhada, bir tümörden al-n bir numune, bir subkütanöz olarak erisilebilir tümörden veya biyopsiye veya cerrahi olarak çiKlarlEbilen herhangi bir diger kanserli katEtümör türünden elde edilebilmektedir. Tümör numunesi, klîlflbylîlîlolmayacak sekilde igne biyopsisi, nüve biyopsisi veya ince igne aspirasyonu dahil teknikte bilinen herhangi bir yöntemle elde edilebilmektedir. Normal doku numunelerine gelecek olursak, bunlar, kanserli bir bireyde bir kansersiz alandan, kanserli bir bireyde kanser içeren bir dokunun bir hastaliElslîl alanIan, kanser olmayan bir bireyin dokusundan veya periferik kari mononükleer hücrelerinden (PBMC) aI-bilmektedir. Dahasü numuneler, sabitlenebilmekte, parafin gömülebilmekte, taze olabilmekte veya NQOl ve katalaz. ekspresyon seviyelerini ve/veya enzimatik aktivitesi ölçülmeden önce dondurulabilmektedir. Bir diger yapllândlîilnada, kanser hücre numunesi, bireyin dolasIi veya lenfatik sisteminden dolasan kanser hücrelerinden elde edilebilmektedir. Benzer bir sekilde, bir iliskili normal dokudan bir numune teknikte bilinen herhangi bir yöntemle elde edilebilmektedir. "Normal" dokunun ve bu dokuya tümör infiltrasyonunun yüzdesinin saptanmasÇl bir nitelikli patolog tarafIian belirlenmektedir. "Bir iliskili normal dokudan bir numune" ifadesiyle, kanserli bir bireyin bir hastalilösüalanüldan veya bir kanserli bireyin kanser içeren dokusunun bir hastalllîlslîlalanian hücrelerin, dokunun veya 5-. bir numunesi kast edilmektedir. Iliskili normal doku numunesi aynüamanda bir bireyden aI-n ve kültürde tutulan normal hücreleri içerebilmektedir. Bir iliskili normal dokudan alin numune sabitlenebilmekte, parafin gömülebilmekte, taze olabilmekte veya NQOl ve katalaz. ekspresyon seviyelerini ve/veya enzimatik aktivitesi Ölçülmeden önce dondurulabilmektedir. Taze ve yeterince dondurulmus doku, enzimatik aktivitelerin belirlenmesini gerektirmektedir. Normal dokular, H&E boyamasüle ve standart ölçümler vasüslýla patoloji saptamasljle onaylanabilmektedir. N 01 ve kata/az eks res on sew' e/er/h/'n ve enz/mat/k aktivitesi/im ö/ Ümû NQOl ve katalaz ekspresyonunun ölçümü, protein veya mRNA seviyelerinde olabilmektedir. Gen transkriptlerinin mRNA ekspresyon seviyelerinin ölçümü rutindir ve teknikte iyi bilinmektedir. Örnegin, bir biyolojik numunede mRNA ekspresyon seviyelerinin ölçülmesine yönelik bir kantitatif yöntem, kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) ile veya herhangi bir diger klýlaslanabilir kantitatif PCR tabanIIÄ/öntem ile gerçeklestirilmektedir. NQOl ve katalaz mRNA ekspresyonunun ölçülmesine yönelik ek yöntemler, klglflhylîüolmayacak sekilde Northern blotlamasÇlmikro deneyler, in situ hibridizasyon ve bir dizi gen ekspresyon analizini (SAGE) içermektedir. NQOl ve katalaz protein veya mRNA ekspresyon seviyeleri, kanserli bireylerin tümörlerinden veya normal dokusundan (örnegin iliskili normal doku) elde edilen numunelerden ölçülebilmektedir ve numunede eksprese edilen bir veya birden fazla referans geninin ekspresyon seviyelerine normallestirilebilmektedir. Protein veya mRNA ekspresyonu ile ilgili normallestirme, bir veya birden fazla referans geninin transkriptlerinin/ürünlerinin ortalama seviyelerine göre mRNA transkript seviyelerinin veya ilgili protein ürününün ölçülmesi vaslliislýla tamamlanabilmektedir, burada referans genleri, bireyler, dokular veya tedaviler boyunca minimum varyasyonlarII esaletla seçilmektedir veya test edilen genlerin toplamIlB Sonraki durumda, s[E1[EIa "küresel normallestirme" olarak ifade edilen toplam test edilen gen say-[El, 50'den daha büyük olmasüialinde nispeten büyük olmal- Spesifik olarak, bir belirli mRNA transkriptine göre "normallestirilmis" terimi, bir veya birden fazla referans veya "ekspresyonu degismeyen temel" genlerin transkript seviyelerinin ortalamalela göre transkript ekspresyon seviyesini ifade edebilmektedir. Uygun referans genleri, farklIZI dokular arasIa bir sabit seviyede ideal olarak eksprese edilmektedir ve tedavi veya hastalllZl kosulu taraflEtlan etkilenmemektedir. Genellikle referans genleri olarak kullanilân haberci RNA'Iar (mRNA'Iar), kElt'lhylEEIolmayacak sekilde ubikuitin (Ub), gliseraldehit-3-fosfat- dehidrogenaz (GAPDH) ve sitoskeletal protein ß-aktini içermektedir. Protein ekspresyon seviyelerinin ölçümü aynElzamanda teknikte rutin bir Islemdir. Örnegin protein seviyelerinin ölçülmesine yönelik bir yöntem, antikorlar kullanllârak, NQOl ve/veya katalaza Western blotlamasü/eya immünohistokimya vasüâslsîla gerçeklestirilmektedir. Belirli bir teoriye baglEkalmakslîlEl, NQ01 proteinin ekspresyon seviyesi ve bir bireyin, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedaviye duyarllîtblmaslîcblaslüglljrasia dogrudan bir iliski mevcuttur. Aynüzamanda belirli bir teoriye baglElkalmakslîlEl, katalaz protein ekspresyonunun seviyesi üzerinde NQ01 protein ekspresyonu seviyesinin oranü/e bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedaviye duyarlHJKlolasUJgiÜarasIa dogrudan bir iliski mevcuttur. Sonuç olarak, protein deneyinin duyarlMglEözellikle önemlidir. Bu sekilde, radyoimmüno deney (RIA), enzime baglEbaglgElllZl deneyi (ELISA), aklgl sitometrisi veya NQ01 ve katalaz protein ekspresyonunun ölçülmesine yönelik herhangi bir diger daha duyarlEl kantitatif yöntem, daha az kantitatif yöntemlerin yerine kullanllâbilmektedir. Bazlj/önlerinde, NQ01 ekspresyon seviyesi, bir enzim aktivitesi deneyi ile belirlenmektedir. Tümör hücrelerinde ve iliskili normal dokuda NQOl'in protein seviyesi, hücrelerde mevcut enzimatik aktivite ile ölçülebilmektedir. NQOl'in enzim aktivitesi, taze veya dondurulmus tümör dokusu kullanllârak dogrudan enzim deneyi gibi teknikte bilinen herhangi bir yöntem kullanilârak ölçülebilmektedir. NQ01 enzim aktivitesi aynüamanda bir sitokrom-C indirgeme deneyi kullanilârak ölçülebilmektedir. Bir klîlîllayEEblmayan örnekte, kanser hücresinde ve iliskili normal doku ekstraktlarIa NQ01 enzimatik aktivitesi, bir ara elektron donörü olarak olarak menadion (10 umoI/L) kullanüârak belirlenmektedir. NQOl'in enzim birimleri (U), 550 nm absorbansta ilk degisim oran. dayalEblarak kanser hücresi ekstraktlarlEUan proteinin sitokrom-c'si indirgenmis/dakika/ug'sinin nmol'ü olarak hesaplanmaktadE Burada kullanIlg'lEl üzere, bir "belirli bir seviyede NQ01 enzimatik aktivitesi" (örnegin 250 birim), yukari ve Örnek 11'de açllîlanan yöntemle ölçülen NQ01 enzimatik aktivitesini ifade etmektedir. Diger yöntemler (farklElsübstrat kullanIiEldahil) NQ01 enzimatik aktivitesinin ölçülmesinde kullanllâbilmesine ragmen, ölçülen aktivite, burada açllZlanan yöntemi kullanarak bu seviyeye esdeger odlugunu göstermek için dönüstürülebilmektedir. BazEyönlerinde, katalaz ekspresyon seviyesi, bir enzim aktivitesi deneyi ile belirlenmektedir. Kanser hücrelerinde ve iliskili normal dokuda katalazI protein seviyesi, hücrelerde mevcut enzimatik aktivite ile ölçülebilmektedir. Katalaz. enzim aktivitesi, taze veya dondurulmus tümör dokusu kullanilârak dogrudan enzim deneyi gibi teknikte bilinen herhangi bir yöntem kullanilârak ölçülebilmektedir. Katalaz enzim aktivitesi aynElzamanda bir hidrojen peroksit indirgeme deneyi kullanllârak ölçülebilmektedir. Bir kElîlhylEElolmayan örnekte, kanser hücrelerinde ve iliskili normal doku ekstraktlarIa katalaz enzimatik aktivitesi, bir standart hidrojen peroksit çözeltisinin A240nm'de absorbansta azalma ölçülerek belirlenebilmektedir. Bu deneyde, katalaz. bir enzimatik birimi (U), 25 °C'de pH 7.0'da dakika bas. 1.0 umol kalmaktadß HzOz'In ortadan kalkma oranIÇl240 nm absorbansta azalma oranIÜgjözlemleme BazDyapilândlElnalarda, kanser hücrelerinde katalaz ekspresyon seviyesi üzerinde NQ01 ekspresyon seviyesi oranÇlnormal dokuda (örnegin iliskili normal doku) katalaz ekspresyon seviyesi üzerinde NQ01 ekspresyon seviyesi orani] ile klýhslanmaktadß Bazü yapllândünalarda, kanser hücrelerinde ve normal dokuda NQ01 ekspresyon seviyesinin ölçülmesine yönelik aynEideney yöntemi kullanllfnaktadlEi BainyapllândlEinalarda, kanser hücrelerinde ve normal dokuda katalaz ekspresyon seviyesinin ölçülmesine yönelik ayni] deney yöntemi kullanilIhaktadlB Bazlîlyapliândlünalarda, NQ01 ve katalaz enzimatik aktiviteleri, burada açllZlandfglügiibi kanser hücrelerinde ve normal dokuda ölçülmektedir. N00] biyo/oi/k olarak aktif ha/e aet/ri/eb//ir iYaC tedavisine yöne/ik birey/erin önceden seC/Ymesi' I'C/'n tarama protoko//er/ Burada NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara (örn. NQ01 polimorfizm ekspresyonuna dayaIEbIarak veya bir NQ01/Katalaz oran.) yanEl/ermesi gereken veya vermemesi gereken hastalar. ön seçimine yönelik pratik tarama protokolleri tarif edilmektedir. AynElzamanda burada, tedaviler süsßda NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarI degerlendirilmesine yönelik antitümör veya normal doku sitotoksisitelerini ortaya çiElarmak için farmakokinetik ve farmakodinamik degerlendirmelerle (Sekil 27) baglantilißpesifik biyo isaretleyici degisimlerini degerlendiren deneyler tarif edilmektedir. Burada belirli yapilândlîilnalarda, bu tarz tedavilerin kontra endike oldugu hastalardan NAD(P)H: kinon oksidoredüktaz 1 (NQ01) "biyoaktif" ilaçlar. yan[iîl verdigi öngörülen hastalarlEl degerlendirilmesine yönelik prognostik ve tanlglal biyo isaretleyici ölçme yöntemleri tarif edilmektedir. BazELIapllândlîiinalarda, yöntem, hasta tümörü hücrelerinin, bir yüksek NQ01 ekspresyon seviyesine sahip olmasElhalinde bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarla tedaviye yönelik bir hastanI seçilmesini içermektedir. Bazüyapüândlîilnalarda, bir hasta, NQ01 seviyesinin, normal doku ekspresyonu seviyeleri üzerinde 5-200x büyümesi halinde yüksek bir NQ01 seviyesini eksprese etmektedir. Hastalardan tümör ve normal doku, NQ01 aktivitesi için analiz edilmektedir. Aktivite deneyleri için, S9 ekstraktlarübir proteaz inhibitörü kokteylinin mevcudiyetinde fosfat tampon salininde (PBS, pH: 7.4) doku homojenlestirilerek (buz üzerinde douns homojenizasyonu veya sonikasyonu ile) hazlEllanmaktadE Homojenize ekstraktlar daha sonrasIa 4°C'de 20 dakikallgllEla 10,000 x 9 miktarda santrifüjlenmektedir. Elde edilen süpernatantlar (S9 fraksiyonu), bir sitokrom-C indirgeme deneyi kullanllârak NQ01 aktivitesini belirlemek için kullanllIhaktadIEl 50 NQ01 birim seviyelerine sahip hastalarlül, ß-Iapakon gibi NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç tedavilerine yan lElvermesi öngörülmektedir. Örnegin Sekil 16A'da, mucitler, NQ01 enzimatik seviyelerinin, ß-Iapakon tedavisinden sonra LD50 degerleri ile iyi bir iliski kurdugunu göstermektedir. 250 biri NQ01 enzim aktivitelerini degerlerine sahiptir. Buna karslEl, düsük (<50 enzimatik birimler) NQ01 enzim aktivitelerine veya herhangi bir NQ01 enzim aktivitesine sahip olmayan tümör hücresi dizileri (örn. H2882 ve H596 tümör hücresi dizileri), 20 LD50 degerlerine sahiptir ve NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç tedavileri kullanilârak verimli tedavi için gösterilmeyecektir. Yükselmis NQ01 seviyelerine sahip hastalarlijl, Sekil 168'de gösterilen uzun dönemli ortotopik akciger tümör sagkalIi çallglnalarlEUa (insan A549-akciger tümör ImplantlarEla sahip hayvan modeli) gösterildigi gibi NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç tedavilerine yanlEl verdigi öngörülmektedir. Burada belirli yapllândlElnalarda, tümör dokusunda NQOlzKatalaz aktivite ekspresyonunun düsük bir oran. sahip olan, bunlarüNQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir sübstrat ilaçlar. (örn. ß-Lap, streptonigrin, DNQ) nispeten dirençli hale getiren hastalarlBl/kanserlerin tanIilanmaleb yönelik yöntemler tarif edilmektedir. PBMC'Ierde ve dolasan tümör hücrelerinde (CT C'ler) NQ01:katalaz oranßkspresyonu da incelenecektir. Tedavi öncesinde hastalardan tümör dokusu (taze doku tercih edilmektedir, formalinle sabitlenmistir), 59 fraksiyonlar. santrifüjleme ile islenmektedir. Formalinle sabitlenmis doku için, NQ01 ve katalaz seviyelerinin immünohistokimyasEKIHC) uygulanmaktadlü Her bir protein sitosolik ekspresyonu, ß-aktin veya GAPDH yükleme kontrolleri kullanliârak ilgili boyama yogunlugu ile ölçülmektedir ve NQ01: Katalaz ekspresyon oranlarEl iliskilendirilmektedir. Mucitlerin laboratuvarda yapt[gil:çallgmalar, her bir redoks enzimi için deneyleri ölçülmektedir ve NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara yanlZl verebilmenin öngörücüsü olarak NQ01:katalaz birimlerinin oranEhesaplanmaktadlEl Oran ne kadar yüksek olursa, bu ilaç S.- öngörülen yanlElda 0 kadar büyük olmaktadlü Örnegin NSCLC dokusu, katalazdan mahrum olmaktadlü fakat NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara aslEllIlderecede yanlßal oldugu öngörülen NQ01'In çarplElIbir biçimde yükselmis seviyelerine sahiptir (asagüiakllâ Sekil 18). Buna karslEl, iliskili normal akciger dokusu, NQ01:KataIaz ekspresyonunun düsük bir oran. dönüsen düsük NOQ seviyelerine ve yükselmis katalaz seviyelerine sahiptir ve NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara yanßmkalmaktadß Es zamanllZblarak, kan numuneleri (NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarla tedaviden önce ve sonra 2 ml ölçümler), PBMC'Ierin ve CT C'erin izolasyonu için islenmektedir. Bir mikrogram (1 ug) malzeme daha sonraletla ilaç tedavisinden önce ve sonra bu numunelerde NQ01 ve katalaz seviyelerini ölçmek için kullanilB1aktadlIl(asagübaklü. NQOlzKatalaz oranü tümör kök hücresi yanifllarlîlve toplu tümörlerle iliskili olacak olan tümörlerdeki (CTC'Ier) yanlflhrül'e aynüamanda normal Ienfositlerde ve olaslîiliormal dokuda cevapslîlllîlarlîleya toksisiteyi tekrardan öngörecektir. Örnegin Sekil 18'de, mucitler, bir dizi NSCLC hasta numunesinden normale karslZltümör dokulardaki katalaz ve NQ01 protein seviyelerini göstermektedir. NSCLC hücrelerinden (H596 ve A549) allEbn numuneler, süslýla NQ01'i eksik (NQ01-) ve NQ01'i aslîlEeksprese eden (NQ01+) kontroller olarak kullanilBwaktadE ve NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara yanlßal olmayan ve yanlEIial hücrelerdir. Western blotlamasIan (Sekil 18) ve enzim deneylerinden (AsagElia, Sekil 23) öngörülen NQ01zKatalaz oranlarüsßslîla kimlik bilgileri çliZlnlStB Oran ne kadar yüksek olursa, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara daha fazla yanlElöngörülmektedir. Buna karslEl, oran ne kadar düsü olursa, normal dokuda beklenen yanlEl da (örn., toksisite) 0 kadar düsük olmaktadlE NQ01zKatalaz oranlarII ölçümleri, yukar- açiEIandlglEgibi Western BIotlarlZl sabit dokunun IHC'si veya dogrudan enzim ölçümlerinden olusturulabilmektedir. Burada belirli yapllândlElnalarda, tümör dokusunda düsük katalaz seviyelerine sahip olan hastalarlEl/kanserlerin belirlenmesine yönelik yöntemler tarif edilmektedir - katalazda olan bir eksiklik NQ01 biyolojik olarak aktif halde sübstrat ilaçlarII (örn. ß-Iap, streptonigrin) aktivitesini gelistirmektedir. Normal periferik kari mononükleer hücrelerde (PBMC'Ier) (vekil) katalaz ekspresyonu, terapötik pencere saptamalela olanak saglayarak ilaç toksisitesi ile dogrudan iliskili olacaktlEl Deney 3'de açilZIanan benzer metodoloji, NQOlzkatalaz aktivitelerinin düsük oranlarlEb sahip olan tümör dokularüla sahip hastalarEbeIirlemek için kullanilîhaktadß Bu durumda, normal dokunun, tümör dokusuna klýbsla NQOl:KataIaz aktivitelerin düsük oranlarIElgöstermesi halinde, hala antitümör yanlflbr beklenmektedir, fakat nispeten daha yüksek NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç seviyeleri, esdeger antitümör aktivitesi için beklenecektir. Veya standart bakIi X SIEamasü/eya kemoterapiler gibi maddelerle kombinasyon tedavileri gösterilecektir. NQOl:KataIaz oranII kullanI[gil:lsekiIde, doz arttlüna tedavisi ve/veya iyonize edici radyasyonun veya diger standart bakIi kemoterapilerinin birlikte eklenmesi, bu hastalara uygulanabilmektedir. Örnegin Sekil 19'da #2823 Hasta, düsük, fakat görünür Katalaz seviyeleri ile düsük NQ01 seviyelerine sahip oldugu görülmektedir. Asl a, enzimatik degerlendirmelerle NQOlzkataIaz 0ranEB.0 olmaktadlE Önemi bir biçimde, iliskili normal dokuda NQOl:KataIaz oranütümör dokusununkinden 0.02, 150 defa daha düsük kalmaktadE Bu durumda, tümör NQ01 seviyeleri, diger hastalardan diger NSCLC tümör dokularIa olandan önemli ölçüde daha düsük ç[EinasI ragmen, ß-Iap gibi NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarI faydasüdönüsümü için gerekli 50 birim içerisinde kalmaktadE(Sekil 19). Bu hasta, DNA'ya zarar veren standart bakIi kematerapötigine veya X ElElEtedaviIerine maruziyetten önce fayda saglayacaktlEl Bu sebepten ötürü, bu hastanI Western degerlendirmesi, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarla tedaviden potansiyel bir faydaya isaret edebilmesine ragmen, normal dokulara klýlasla tümörden NQOl:KataIaz oranlarII hesaplanmasEl/e mevcut bulusta açlEIanan bu protokolün incelenme kullanilârak bunlarI onaylanmasÇltek baslEb kullanllârak NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlar ve aynüamanda bu hastalilZl(bu durumda NSCLC) için yaygI olarak kullanilân radyo- ve/veya kemoterapitlerle kombinasyon halinde hastaya saglanan bir faydayEl net bir sekilde göstermektedir. Önemli bir biçimde, bu metodoloji aynüamanda 50 birimden daha az bir genel NQ01 aktivitesine sahip olan hastalarlZbrtaya çilîiarmalllîlve bu hastalar, tek bas- NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç tedavisinden fayda saglamayacaktlü Fakat, çok daha az NQ01 seviyelerinin, PARP-l'i hiperaktif hale getirmesi için gerekli lmasIan dolayÇlX @Elle/veya kemoterapilerle kombinasyon tedavilerinden fayda saglayabilmektedir ve normal dokuda düsük NQ01:Katalaz oranlarÇlnormal doku yaniEIiarIü/e bu sekilde uzun dönemli toksisite komplikasyonlarlgarplîlîliiir sekilde koruyacaktE Burada belirli yapllândlElnalarda, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara tümör yan-El öngören spesifik isaret faktörlerinin ekspresyonunun belirlenmesine yönelik yöntemler tarif edilmektedir. Serumda, klîilnlîlîkan hücrelerinde (RBC'Ier) ve periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) NQ01:kataIaz aktivite oranlarlÇlPBMC'lere ve en az bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç formülasyonunda bir oran klglEhylElJbelirleyici olan rbc hemolizine NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç ile yönlendirilen sitotoksisteye yönelik risk için takip edilmektedir. Isaret proteinlerinin, NQ01 katalazII (yukarElbakIlZj, AIF, PARP-1 ve u-kalpainin tümör seviyeleri, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara yanlfllarlîöngörmesi için belirlenmektedir. Yukarida belirlenen faktörler, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara yaniElhrI öngörülmesi için spesifik olarak kullanllâbilen faktörlerdir. NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir tedavilerden önce tümör ve kan numuneleri izole edilmektedir ve hasta kimliginin arthl çalismam. Bas ArastIElnac-an (PI) ayrEbir sekilde olusturulamamasüçin numunelerin kimligi belirlenmektedir. Kandan, PBMC'ler, CTC'ler ve RBC'Ier, yukari açllZlandiglEIgibi NQOlzkatalaz seviyeleri için izole edilmekte ve analiz edilmektedir. PBMC'lerdeki ve RBC'Ierdeki oranlar, normal doku toksisitesini öngörmek için kullanilB'iaktadIE Kanser kökü benzeri hücreleri içeren CTC'lerden oranlarI PBMC'lerden ve ya RBC'Ierden üç büyüklükte daha yüksek olmasEbeklenmektedir ve asaglElh onaylanan (deney 6) anti-tümör dokusu yanlflhr- yönelik yanlHbrI bir vekili veya yanifllarI görücüsü (tedavi öncesinde) olarak kullanilâbilmektedir. Terapiye baslamadan önce mevcut oldugunda biyopsi yapilân tümör numuneleri (tüm deneyler, 2-10 ug malzeme kullanilârak uygulanabilmektedir), asagIkilerin seviyeleri dahil olmak üzere spesifik protein faktörlerinin ekspresyonu için degerlendirilmektedir: (i) NQ01 ve katalaz; (ii) küçük ve büyük p-kalpain ait birim seviyeleri; (iii) AIF; ve (iv) PARP-l. Bu faktörlerin ekspresyonu, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara tümör dokusu programlanmg nekrotik yanitibr için zorunludur ve bu antitümör maddesi sl- benzersizdir. Bu faktörlerin tedavi analizlerinden önce ve sonraki spesifik örnekler, asaglah deney 6'da açilZlanmaktadlÜ Burada belirli yapllândlünalarda, NQ01 biyolojik olarak aktif halde sübstrat ilaçlarlEb (örn. ß- lap, streptonigrin) yan [Eiveren hastalariEi/kanserlerin belirlenmesine yönelik bir yöntem olarak NQ01 (yukarübakllî) katalazI doku ekspresyonundaki, apoptoz indükleyici faktörde (AIF), u-kalpain ve PARP1 seviyelerindeki degisimleri içeren yöntemler tarif edilmektedir. Antitümöre karslîiormal doku yanifliariZINAD+/ATP tükenmesini, m-kalpainin büyük ve küçük ait birimlerinin proteolizleri ve hastalariEl/kanserlerin, NQ01 biyolojik olarak aktif halde sübstrat ilaçlar. (örn. NQ01 ile indirgemenin, ana kuinona spontane bir sekilde dönüsen ve süreçte oksijen kullanan bir stabil ürüne yol açmad[g]l:B-Iap, streptonigrin ve tüm kuinon ilaçlarDîl yaniEl verip vermediginin belirlenmesine yönelik spesifik p53 ve atipik PARP1 proteolitik eylemleri analiz ederek biyopsi yapilân dokuda ölçülmektedir. Doku yanifllar, CTC'Ierde ilaç tedavisinin erken süreleri süsü-lida NAD+ seviyelerinin formasyonu ile ölçülen ilaç farmakokinetikleri (PK'lar) ve NQ01 farmakodinamik (PD) faydaslîi döngü yaniflhriîlle iliskili olmaktadlB Mevcut oldugunda tedavilerin öncesinde ve tedavilerin sßsirîtla zamanla biyopsi yapilân tümör numuneleri tüm deneyler, 2-10 pg malzeme kullanilârak uygulanabilmektedir), ekspresyon için ve asaglkilerin seviyeleri dahil çesitli protein ve metabolik faktör ekspresyonunda degisimler için degerlendirilmektedir: (i) fosforile H2AX (i:iH2AX) ve ve fosfo- seriri polimeraz-l'in (PAR- PARP1) formasyonu (iii) PARP1 hiperaktivasyonundan dolayEINAD+/ATP kayiülarüûv) NQ01 (hasarla indüklenebilir oldugu bilinmektedir) ve katalazI ekspresyonundaki degisimler; (v) küçük ve büyük p-kalpain ait birimlerinin toplam (inaktif) ve proteolitik bölünme (aktif); ve (vi) NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara maruziyetin ve yan. bir islevi olarak tümör hücresi ölüm yanElhriEliEl bir takibi olarak p53 ve PARP-l'in proteolitik bölünme. Uygulanabilir oldugunda, bu protein ve metabolik faktör degisimleri kullanliârak NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara tümör yanifIlarEl sabi veya taze tümör dokusundan takip edilen apoptotik isaretlerle iliskilendirilmektedir. Apoptotik yan[EIlar, TUNEL reaksiyonlarIZkullanllârak veya aktif halde u-kalpain kullanllârak takip edilmektedir. Aktif halde kaspazlar genellikle NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç maruziyetlerinden dolayEINQOl'e yönelik, hiper aktif halde PARP-l araclIUJprogramlanmEI nekrotik yanElhrEl slüsia belirtilmemektedir. Örnegin ß-lapakon gibi NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara spesifik proteolitik yanhîlhr, ortotopik ve ksenogreft insan 231 üçlü-negatif meme kanseri dokusunda (Sekil 21) in vitro (gösterilmektedir) ve in i/ii/o olarak takip edilmistir. Spesifik proteinlerin ekspresyonu (örn. yukar- i-iv arasIaki faktörlerde olan degisimler), NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara prognostik ve tanlîbl yan[fl]arütakip etmek için tedaviler sßslda incelenmektedir. Dahasütümör dokusundaki spesifik proteolitik yanlflhr ve u-kalpain, p53 ve PARPl'deki CTC'Ier (yukarlElh v ve vi faktörleri), programlanmlgnekrozda gözlemlenen tanlêbl degisimlerdir. NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlar sadece tümör dokusunda, bunlar. bu seçkin proteolitik yanlflbra yol açtlglübilinen ilaçlardlEl NQOI biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlar Burada belirli yapüândünalarda, kanser tedavisine yönelik NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarI kullan! yöntemleri tarif edilmektedir. BazElyapilândlElnalarda, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç, bir ß-Iapakon (ß-Iap) bilesigidir veya bunlari farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzudur. BazEyönlerinde, kanserli bir bireyin, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç (örnegin bir ß-Iap bilesigi) ile tedaviye yönelik bir uygun aday olup olmadlglüyukarlöh açllîlanan yöntemlerle belirlendigi gibi iliskili normal dokuda bu proteinlerin ekspresyon oranlEh karsEltümör hücrelerinde katalaz protein ekspresyonu üzerinde NQ01 enzimatik aktivite miktarElveya NQ01 protein ekspresyonu seviyesinin oranEilIe belirlenmektedir. Diger yönlerinde, bir bireyin, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilacI ilaç (örnegin bir ß-lap bilesigi) ile tedaviye yanü/erme olaslllglll olup olmadiglü yukari açllZIanan yöntemlerle belirlendigi gibi iliskili normal dokuda bu proteinlerin ekspresyon oranIEb karsEltümör hücrelerinde katalaz protein ekspresyonu üzerinde NQ01 enzimatik aktivite miktarEl/eya NQ01 protein ekspresyonu seviyesinin oranEl ile belirlenmektedir. NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlar (örn. ß-lapakon, DNQ ve streptonigrin ve türevleri), tipik olarak alkilasyon vasißslýla DNA'ya hasara yol açan reaktif oksijen türler (ROS'Ier) veya kuinon baleZIIaç metabolitleri gibi bir dizi sitotoksik faktörü olusturmak için faydaslZ bir sekilde enzim NQ01 ile metabolize edilmektedir. "FaydaslZ sekilde" terimi, iki elektron oksidoredüktazlül, NQ01, bu spesifik bilesikleri azaltmak için NAD(P)H'yi kullanmasEl anlam. gelmektedir, fakat bu hidrokinon formlarII stabil olmadigilîlve ana yapllârl spontane bir sekilde geri dönmesi anlamlEla gelmektedir; örnegin her bir mol ß-lap için, 60 mol NAD(P)H, NQOl'in, ilaçlarlZBitotoksik reaktiflere `biyolojik olarak aktif hale getirdigini' gösteren 5 dakikalilZJ sürede kullanilüiaktadlîl BazEyapllândlîrlnalarda, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç, bir ön ilaçtlE Diger yapüândlîilnalarda, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç, siklodekstrinlerle veya misellerle (örnegin klElElhylElZblmayacak sekilde, SPIO-miseller veya kodlanmlglligand (ör/7. avß3) misellerle formüle edilmektedir. Beta-lapakon (ß-Iap), ilaca dirençli hücre dizileri dahil olmak üzere çesitli insan kanseri hücrelerine karslîlantitümör aktivitesi ile önemli bir sitotoksik antikanser maddesidir. ß-Iap, hücre içi enzim NQ01 ile biyolojik olarak aktif hale getirilmektedir. NQ01, normal hücreler üzerinden çesitli insan kanserlerinde diferansiyel olarak aslüßksprese edilmektedir. Optimum konsantrasyonlarda ve hücrelere maruziyet slßslîiba, ß-lap, DNA hasarIlEl, DNA onarlîiiiIEI inhibe etmesine ve programlanmlgl hücre ölümünü indüklemesine neden olmaktadlB ß-lap'lEl, ilk olarak bir DNA onarIi inhibitörü olarak islev gösterdigi düsünülmektedir. Önceki raporlar, ß-Iap'lEl, topoizomeraz 1 (Topo I), hücre döngüsü kontrol noktasEaktivasyonunu ve NF- kappa-B'yi inhibe etmek için hareket etmesini önermistir. Yeni bulgular, ß-lap eyleminin yeni bir mekanizmasIEgöstermistir. Bazüyapüândlîilnalarda, B-Iap, hücre içi hücresel enzim, NAD(P)H: kuinon oksidoredüktaz 1 (NQ01) ile biyolojik olarak aktif hale getirilmektedir. ß-lap'a göre, reaksiyon, yukarlElhki reaksiyonda kullanilan her bir ß-lap molüne yönelik iki oksijen molünü tüketmektedir ve bu, reaktif oksijen türlerini (ROS) olusturmaktadlü bu da (a) nükleusta büyük SBSler seviyesinin olusumu; ve (b) lipid peroksidasyonu vasltliîslýla ER'den kalsiyum salIIiIlZllCa2+) baslatmasEile sonuçlanmaktadlEI Bu sebepten ötürü, küçük miktarda bir ß-Iap, ROS'ye hasar veren büyük DNA seviyelerini olusturmaktadlü ß-Lap bu sekilde bir tümör seçici sekilde kemoterapi gibi diger DNA hasarllîlnaddelerin radyasyon etkilerini büyütmek için hareket etmektedir. ß-Lap ile indükleneni NQ01 ila harekete geçirilen ROS'nin yol açtlglîslElElDNA hasarÇlPARPl hiperaktivasyonunu tetiklemektedir. Küçük miktarlarda aktif PARP1, DNA'yElonarmak için hareket ederken, aktivasyon PARPl'in (veya hiperaktivasyon) büyük seviyelerinde, eylemleri, DNA onarIiIElönlemektedir. Mucitler laboratuvarda, kalsiyumun (Ca2+), tüm enerjiyi (NAD+/ATP) tüketen PARP1 hiperaktivasyonu için gerekli oldugunu kesfetmistir. Hücre enerjisinin kaybÇl bir benzersiz programlanmlgl nekrotik yol vasl'rîi'sslýla hücre ölümüne yol açmaktadlEl Bu veriler, bu tarz NQOl "biyolojik olarak aktif hale getirilebilir" ilaçlarlEl, iliskili normal dokular. üzerinde yüksek NQOl enzimatik aktivite seviyelerini 5 ila 200 kat eksprese eden spesifik tümör türlerinde (örn. küçük hücreli olmayan akciger, meme, prostat ve pankeratik kanserleri) bir Ca2+-bagIilÜARP1 hiperaktivasyon ile indüklenen programlanmlgl nekrotik yolu indükledigini göstermektedir. BazEýapllândlElnalarda, ß-lapakon bilesigi Formül I'de gösterildigi üzere ß-Iapakondur: Burada açlElanan ß-Iapakon bilesigi aynEIzamanda ß-Iapakon olarak benzer anti-kanser aktivitesine sahip olan ß-lapakonun analoglarIlZI ve türevlerini içermektedir. BazEl yapllândlîilnalaria, ß-lapakon bilesigi, ß-Iapakonun bir ön iIacIE Bazürapllând lElnalarda, ß- lapakon bilesigi, beta-lapakonun bir pH'a duyarllZbn ilaçla konjüge bir polimerdir, burada olusturabilmektedir. BazEl yapllândlElnalarIia, ß-Iapakon bilesigi, bir ß-Iapakonun türevidir. BazEl yapllândlîrlnalarda, ß-lapakon türevi, Formülün II'nin bir bilesigidir: burada R1, H, hidroksil, ikame edilmis veya ikame edilmemis alkil, ikame edilmis veya ikame edilmemis alkenil, ikame edilmis veya ikame edilmemis alkoksi, ikame edilmis veya ikame edilmemis alkoksikarbonil, - (CH2)n-amino, -(CH2)n-aril, -(CHz)n-heteroaril, -(CH2)n-heterosikl, say[l]IPatent DokümanlEtla açllZland [gllîrgibi bagslîl bir sekilde H, ikame edilmis veya ikame edilmemis alkil, ikame edilmis veya ikame edilmemis alkenil, ikame edilmis veya ikame edilmemis alkoksi, ikame edilmis veya ikame edilmemis alkoksikarbonil, -(CH2)n-aril, -(CH2)n- heteroaril, -(CH2)n-sikloalkil, (CH2)n-heterosikloalkil, hidroksil, ikame edilmis veya ikame edilmemis tiyol, halojen, nitro veya siyano'dur. Bazü/apllândlElnalarda, beta-Iapakon bilesigi, menadion, 2,2-dimetil-(Z)-6-fenilimino-3,4,5,6- tetrahidro-ZH-nafto[1,2-b]oksin-5-on [fenilimin Iapakon], 2,2-dimetiI-(Z)-6-(4-metil- nafto[1,2-b]0ksin-5-0n [p-nitrofenilimin Iapakon], veya 2,2-dimetil-(Z)-6-(4- bromofenilimin0)-3,4,5,6-tetrahidro-2H-nafto[1,2-b]oksin-5-on[p-bromofenilimin Iapakon]'dur BazEl yapllândlîilnalaria, beta-lapakon bilesigi, beta-Iap'I bir ön ilacIB BazEl yapllândlîilnalarda, beta-Iapakon bilesigi, beta-lapakonun bir pH'a duyarlEön ilacEile konjüge bir polimeri içermektedir, burada bilesik bir miseli olusturmaktadlüve burada pH'a duyarlEön ilaç, bir aril imin ve bir alifatik imin'den olusan gruptan seçilen bir pH'a duyarlEbagIaylEIîLEl içermektedir. BazE] yapllândlîilnalarda, pH'a duyarIlZI baglaylîü bir aril imin'dir. Bazü yapllândlîrlnalarda, aril imin, bir fenil imin'dir. BazElyapüândlîinalarda, fenil, bir ikameyi içermektedir. BazEl yapllândlîilnalarda, ikame, para konumunda bulunmaktadIEI BazIZI yapllândlEinalarda, ikame, -OH, -NHZ, -SH veya maleimid'dir( ). Bazljlrapllândlîilnalarda, ikame maleimid'dir ( ). BazÜ/apllândlîilnalarda, pH'a duyarlEbaglaylElZlbir alifatik imin'dir. BazÜ/apllândlülnalarda, alifatik imin'in Ca'sl,`_len az bir ikameyi içermektedir. BazEl/apllândlülnalarda, alifatik imin'in Ca'sÇl en az iki ikameyi içermektedir. BazElyaplIândlEnalarda, ikameler metildir. Bazü yapHând lîilnalarda, ön ilaç, asaglkilerden olusan gruptan seçilmektedir: burada R8, -H'den baska bir D veya L amino asidinin bir yan zinciridir; R3, -NH2, -OH, -SH'dir veya her bir R4, R5, R6 ve R7, bagllslîlbir sekilde -H, -X, -OCH3 veya -CH3'dür; X, bir halojendir; ve p, 0 ve 20 arasIa bir tamsayIlEI BazEl yapllândlîilnalarda, R8, -CH3'dür. BazEl yapilândlîrlnalarda, R3, asagIki gibidir Bazürapüândünalarda, R3, -OH'dir. Bazlîýapllândünalarda, her bir R4, R5, R5 ve R7, H'dir. BazIZl/apllândlülnalarda, X, Cl, Br, I veya F'dir. BazEl/apllândlünalaria, p, 0-6'dlü Bazi] yapllândlîilnalarda, ön ilaç, asagEIbkiIerden olusan gruptan seçilen bir bagla polimere baglanmaktadlB bir ester bag, bir amid bag, bir disülfür bag veya bir tiyoeter bag. BazEyapiiând [Binalarda, misel formülasyonu, bir nötr pH'da (örn. bir fizyolojik olarak nötr pH) stabil olmaktadlîive bir asidik pH'da (örn. fizyolojik olarak asidik bir pH) beta-lapakonu salmaktadiB BazEyapllândiEinalarda, terapötik madde, ketal, asil hidrazon, alifatik imin, aromatik imin bag veya bunlari bir kombinasyonunun bir baglant- sahip bir ß-Iapakon ön ilacIE BazEyapilândlîiinalarda, ketal, asil hidrazon, alifatik imin veya aromatik imin bag, bir pH'a duyarliîlîiagdlü BazEýapilând Enalarda, ön ilaç, asag-kilerden seçilmektedir: Hyzlap Peiap Arlap Kellap1 Ketlaoî Maloih Maipil2 R1, D veya L amino asitlerinin bir yan zinciridir; R2, bir alkil grup veya bir aromatik gruptur; R3, NHZ, OH veya SH'dir; her bir R4, R5, R6 ve R7, baglEiisIZl bir sekilde H, X, OCH3 veya CHg'dür; X, bir halojendir; ve n, 1 ve 20 arasIa bir tamsayIlEI Baziîyapilândünalarda, X CI, Br, 1 veya F'dir. BainyapiiândIEinalarda, R2, CH3, CHZCH3 veya le'dir. Bulusun ön ilaçlarIiEi kEIfihylEiIrblmayan örnekleri, asaglîi'bkileri içermektedir: ÖN?" MÜNI. ww BW? Bazlîylapllândlîilnalarda, biyouyumlu polimerik ön ilaç miseli, asaglEllaki formüle sahiptir: mPEO- o mPEO- oWB (CHzla (CHzlb (CHZ) (CHgb R1 Ri2 R1 prodrug mPEO-b-P(R1-MAm-ko-R2-MAn) mPEO-b-P(R,MAm-ko-R2-MA(ön ilaç)n) R1= PDMA, PDEA, PDiPA, PDnPA, PDBA, Pc5A, Pc6A, Pc7A, ve benzeri. R2: PDMS, PDBS, PDPS ve benzeri. burada R1 ve R2 bagismbir sekilde asag-kilerden seçilmektedir:Kod(R1 ve R2) YaplZl PC5A O PC6A O PC7A O Bazlîyapilândlîilnalarda, misel, bir nötr pH'da stabil olmaktadIElve bir fizyolojik olarak asidik pH'da beta-Iapakonu salmaktadlEl BazEl yapllândlElnalarIa, beta-Iapakon bilesigi, bir formüldedir (örnegin bir misel formülasyonu). BazlZlyapllândlîrlnalarda, ß-lapakon bilesigi, siklodekstirnler ile formüle edilmektedir. Diger yapllândlElnalarda, ß-lapakon bilesigi, SPIO-miselleri veya ligand kodlu (örn. Ovß3) misellerle formüle edilmektedir. Diger yapllândlülnalarda, Iapakon bilesigi, 11 gibi bir pH'a duyarlüniselde bulunmaktadB Bulasan Yöntemleri Burada bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedaviden fayda saglayacak olan kanserli bireyleri veya bireylerin alt popülasyonlarllîsleçmek için tümör hücrelerinde NQOl'in ve/veya katalazI ekspresyon seviyelerinin kullannlüla yönelik yöntemleri tarif etmektedir. AynElzamanda burada, bireyden allEhn tümör hücrelerinde NQOl'in ve/veya katalazI ekspresyon seviyelerine baglEblarak bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedaviye kanserli bir bireyin duyarlllIgII öngörülmesine yönelik yöntemler saglanmaktadE Ek olarak, burada bireyin kanser hücrelerinde NQ01 enzimatik aktivite seviyesine baglEliedavi için seçilmis olan kanserli bir bireyin tedavi edilmesine yönelik yöntemler saglanmaktadlü Kanser/i' bir bireyin, bir NOOJ biyo/oi/k a/arak aktif ha/e aet/riYeb//i'r i/aC/a tedavi i'C/'n uyaun olup o/madMEbe/ir/enmesme yöne/IY( yöntem/er Burada açiKIanan metodolojiler kullanilârak, teknikte tecrübe sahibi bir kisi, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla anti-kanser tedavisi için uygun bireyleri veya bireylerin alt popülasyonu belirleyebilmekte ve/veya seçebilmektedir. BazlJönlerinde, burada kanserli bir bireyin, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedavi için uygun olup olmadiglll belirlenmesine yönelik yöntemler saglanmaktadlEl BazÜ/apllândlîilnalarda, bireyden alin kanser hücrelerinde katalaz ekspresyonunun, yaklas[lZ| 200 kat, yaklas[lZl 250 kat veya yaklasllZl 300 kat (dahil) (bu sayllâr araleUaki herhangi bir deger dahil) üzerinde olan NQ01 ekspresyon seviyesinin bir oranübireyin, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilaçla tedaviye yanlElvermesinin daha olasEI oldugunu göstermektedir. BazEyapllândlîilnalarda, NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç, bir ß-Iapakon bilesigi bir streptonigrin veya bir deoksinibokuinon'dur (DNQ). Diger yapilândlElnaIarda, kanser, akciger kanseri (örnegin, klîlîllaylîlîlolmayacak sekilde küçük hücreli olmayan akciger kanseri (NSCLC)), prostat kanseri, meme kanseri, kolon kanseri ve melanom'dan olusan gruptan seçilmektedir. BazEyapHândlEilnalarda, birey, bir insandlEl Bir diger yapliândlEnada, normal doku, bir kanser ile iliskili normal dokudur. BazEI yapüândlünalarda, kanser hücreleri, bireyden bir kanser biyopsisinden veya bireyden dolasan kanser hücrelerinden elde edilmektedir. Bir NOOJ bim/0177( olarak aktif ha/e getiri/ebmr bir ilac/a bir tedaviye, kanser/I' bir bireyin yanâÜ verebilmesinin öngörülmesine yöne/ik yöntem/er Bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla bir tedaviye, kanserli bir bireyin yanlEl verebilmesinin öngörülmesi aynüzamanda burada açllZlanan metodolojiler kullanüârak belirlenebilmektedir. BazEyönlerinde, bir NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilaçla bir tedaviye, kanserli bir bireyin yanlüverebilmesinin öngörülmesine yönelik yöntemler saglanmaktadlB BazEl yapllândlülnalarda, bireyden alin kanser hücrelerinde katalaz ekspresyonunun, yaklasilîl 200 kat, yaklaslKl 250 kat veya yaklasüîl 300 kat (dahil) (bu sayllâr arasIaki herhangi bir deger dahil) üzerinde olan NQOl ekspresyon seviyesinin bir oranübireyin, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilaçla tedaviye yanltjvermesinin daha olasD oldugunu göstermektedir. Bazlîýapilând lElnalarda, NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç, bir ß-Iapakon bilesigi bir streptonigrin veya bir deoksinibokuinon'dur (DNQ). Diger yapllândlîrlnalarda, kanser, akciger kanseri (örnegin, kElîlhylEElolmayacak sekilde küçük hücreli olmayan akciger kanseri (NSCLC)), prostat kanseri, meme kanseri, kolon kanseri ve melanom'dan olusan gruptan seçilmektedir. BazEyapllânlenalarda, birey, bir insandlEl Bir diger yapilândlElnada, normal doku, bir kanser ile iliskili normal dokudur veya kanser olmayan bir bireyden kanser hücreleri ile aynEtürde bir normal dokudur. BazElyapllândlElnalarda, kanser hücreleri, bireyden bir kanser biyopsisinden veya bireyden dolasan kanser hücrelerinden elde edilmektedir. Kanserli bir bireyin tedavi edilmesine yönelik Yöntemlerde kullanIia Vönelik bilesikler Bazüönlerde, burada bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla, kanserli bir bireyin tedavi edilmesine yönelik yöntemlerde kullanIia yönelik bilesikler saglanmaktadB "Tedavi etmek" veya "tedavi" terimi, hedeflenen patolojik kosulu veya rahatslîligllîtedavi etmemesi veya kosulun yeniden nüksetmesini önlememesi halinde nesnenin yavaslatII[g]El(azaltlglD] terapötik tedaviyi ifade etmektedir. Bir suje, NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilac terapötik bir miktarllâldllîtan sonra, denegin, bir veya birden fazla kanser isaretinin ve semptomunun gözlemlenebilir ve/veya ölçülebilir azalmaylîleya bunun yoklugunu sergilemesi halinde basarlHDbir sekilde "tedavi edilmektedir". Örnegin, kanser hücresinin say-a önemli azalma veya kanser hücrelerinin yoklugu; tümör boyutunda azalma; tümör metastazII inhibisyonu (örn. belirli bir ölçüye yavaslamakta ve tercihe durmaktadEJ; belirli bir ölçüye tümör büyümesinin inhibisyonu; resmiyon uzunlugunda artlgve/veya belirli bir ölçüde spesifik kanserle iliskili bir veya birden fazla semptomunun giderilmesi; azaltllßîlgl morbidite ve mortalite ve yasam kalitesinin iyilestirilmesi. Bir hastal[g]lEl isaretlerinin veya semptomlar.. azaltüIhasüaynElzamanda hasta tarafütian hissedilebilmektedir. Tedaviye, tüm kanser isaretlerinin ortadan kaybolmasEloIarak belirlenen bir tam yani& veya tümör boyutunun tercihen yüzde 50'den fazlasEile, daha çok tercih edilecek sekilde %75 ile azaltligilîlbir klEini yanltBi ulasabilmektedir. Bir hasta aynElzamanda, hastanI stabil hastallgilîtecrübe etmesi halinde tedavi edilmis olarak görülmektedir. HastallKta basarIIJDtedavinin ve gelismenin ölçülmesine yönelik bu parametreler, teknikte tecrübe sahibi bir hekim tarafian bilinen rutin prosedürlerle hali hazüla ölçülebilmektedir. Bir "etkili miktar" terimi, istenilen terapötik veya profilaktik sonuca ulasmak için gerekli dozajlarda ve süreçlerde etkili bir miktarIZIfade etmektedir. Bir ilacI"terapötik olarak etkili bir miktarlZ] bireyin hastallß kosulu, yasücinsiyeti ve ag Ellgilîgibi faktörlere ve bireyde istenilen bir yanlülîlbilesigin ortaya çllZarabilme kabiliyetine göre degiskenlik gösterebilmektedir. Terapötik olarak etkili bir miktar aynüamanda bilesimin herhangi bir toksik veya kademeli etkilerinin, terapötik olarak faydalEletkilerIe aglEIllglII aIIlg'Elbir miktardlE NQOl ekspresyon seviyesinin oranIlEl, normal bir dokuda olan oranlEI, bireyden alin kanser hücrelerinde katalaz ekspresyon seviyesinin yaklasllZl 50 kat, yaklasIKl 55 kat, yaklasllZl kat (dahil) (bu sayllâr araletlaki herhangi bir deger dahil) üzerinde olmasEhalinde kanserli bir birey, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir iIacI etkili bir miktarElle tedavi edilmektedir. Kanser hücrelerinde ve normal dokuda NQOl ekspresyon seviyesi ve katalaz ekspresyon seviyesi, burada açlKlanan metodolojiler kullanüârak belirlenebilmektedir. BazIZI yapllândünalarda, NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir Ilaç, bir ß-Iapakon bilesigi bir streptonigrin veya bir deoksinibokuinon'dur (DNQ). Diger yaplßndlûlnalarda, kanser, akciger kanseri (örnegin, kElflhylEElolmayacak sekilde küçük hücreli olmayan akciger kanseri (NSCLC)), prostat kanseri, meme kanseri, kolon kanseri ve melanom'dan olusan gruptan seçilmektedir. BazEyapllândlElnalarda, birey, bir insandlEl Bir diger yapllândlülnada, normal doku, bir kanser ile Iliskili normal dokudur veya kanser olmayan bir bireyden kanser hücreleri ile aynthürde bir normal dokudur. BazElyapllândlElnalarda, kanser hücreleri, bireyden bir kanser biyopsisinden veya bireyden dolasan kanser hücrelerinden elde edilmektedir. Diger yapllândlElnalarda, yöntem 1) bireyden kanser hücrelerinde katalaz ekspresyon seviyesi üzerinde NQOl ekspresyon seviyesi oranII belirlenmesini; ve 2) 50 kat, yaklaslEI 55 kat, yaklasik] 200 kat (dahil) (bu sayliâr araleUaki herhangi bir deger dahil) üzerinde olmasü halinde kanserli bir birey, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilacI etkili bir miktarEile tedavi edilmesini içermektedir. Burada tarif edilen tedavi yöntemlerinin bazEyönlerinde, yöntem, tedaviden önce ve sonra bireyden alin kanser hücrelerinde bir veya birden fazla protein seviyelerinin ölçülmesi vasitâslýia bir bireyde bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçla tedavinin takip edilmesini içerebilmektedir, burada ölçülen protein, NQOl, katalaz, küçük p-kalpain ait birimi, büyük iJ-kalpain alt birimi, apoptoz indükleyici faktör (AIF) ve PARP-l'den olusan gruptan seçilmektedir. N 01 bi olo'ik olarak aktif hale etirilebilir ila bile imlerinin örne in -la uygulanmasü Bu mekanizma, özellikle radyasyon ve kemoterapi etkilerinde ß-Iap'I tümör seçici güçlendirici etkisi, optimal klinik fayda için yeni kullanIi yöntemleri saglamaktadE Belirgin olarak, kemoterapinin ve radyasyonun ve bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilacI (örnegin ß-Iap) uygulanmaslîslilßsiîönemli hale gelmektedir. Mevcut olarak, kemoterapi ilaçlar ve radyasyon ve aynüamanda diger standart bakIi ilaçlarügenellikle birlikte ve bir çok durumda, bir rastgele süda veya eylemin ilaç mekanizmaslian baska faktörleri hesaba katan bir sßda uygulanmaktadlî] BazEl/apllândiülnalarda, burada tarif edilen bir yöntem, optimum klinik fayda için DNA hasarIa ß-lap'I tümör seçici güçlendirme etkisinden avantaj saglamak için ilk önce radyasyon ve kemoterapi dahil DNA hasarlünaddelerin uygulanmasIÇl daha sonrasia NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilaci (örnegin ß-Iap) uygulanmas @içermektedir. BazEyaplßndIElnalarda, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaca (örnegin ß-Iap) tümör maruziyeti, 22 saatligine olusmaktadE fakat 12 saati asmamaktadlü Bain yapilândüinalarda, normal hücreler/doku, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaca (örnegin ß-Iap) maruziyetlerde 12 saatten fazla DNA hasar. tabi olmaktadE Bain yapliândlEinalarda, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilaca (örnegin ß-Iap) tümör maruziyet süresi, yaklasilZi4 ve yaklasÜZJ 22 saat araleUadlÜ Bazljrapilândlîiinalarda, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir bir ilaca (örnegin ß-lap) tümör maruziyet süresi, yaklasiKl4 ve yaklaslEl 10 saat arasIadB BazEl/apllândlülnalarda, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç (örnegin ß-Iap), bir tümör öldürücü maddeye maruziyetten sonra ilk saat içerisinde uygulanmaktadlE Belirli durumlarda, bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilacI (örnegin ß-Iap) bir tümör öldürme maddesine maruziyetten sonra 2 saatligine veya bundan fazla bir sürede uygulanmasühücre süresinin, sinerjiyi kaldßrak SSB'Ieri etkili bir sekilde onarmas. olanak saglamaktadlE Belirli durumlarda, bir tümör öldürme maddesine maruziyetten önce NQ01+ kanser hücrelerini/dokusunun NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlarla tedavi edilmesi, hücrelerin, tedavinin (özellikle alt letal dozlar) ve PARPl hiperaktivasyonunu etkili bir sekilde önleyerek NAD+ ve ATP kayülarII yol açtlgESSB'lerden düzelmesinden dolayEl radyoduyarlllâsmtlElna ile sonuçlanmamaktadB BazlZyapllândIEnalarda, bir tümör öldürme maddesi (örn. radyasyon ve kemoterapi), alt esik ve düsük dozlarda uygulanmaktadlB bir NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç (örnegin ß-Iap) takip etmistir. Kemoterapi ve radyasyonun saç kaybü kElrilîEkan hücresi kaybEl/e benzerini içeren hastalarda istenmeyen yan etkilere sahip oldugu bilinmektedir. Tümör öldürme maddeleri ve NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlar arasIaki Sinerji, IR'nin ölümcül olmayan dozlarII kullanlEliÇI/n vitro ve in w'vo önemli bir ölümcül eylemi karsllâmak için NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir IlaçlarI ölümcül olmayan dozlarüla birlestirilmesine olanak saglamaktadlEl Burada açllZlanan NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaç bilesimlerinin etkili bir miktarüherhangi bir uygun yöntem vaslßslsîla, örnegin enjeksiyon veya infüzyon vaslûislsîla kanserin tedavisi için bir bireye uygulanabilmektedir. BazEyapUândHnalarda, bilesim, lokal olarak veya sistematik olarak uygulanmaktadlE BazEl yapüândlünalarda, bilesim, intraperitoneal, intravenöz, subkutan ve intramüsküler enjeksiyon ve oral, mukozal, inhalasyon yoluyla, sublingual olarak ve benzeri gibi diger uygulama formlarEl ile uygulanmaktadE Tedavi için gerekli olan dozaj, uygulama yolunun seçimine, formülasyonun yap-, bireyin hatallglEI yap-, bireyin boyutuna, kilosuna, yüzey alan., yas. ve cinsiyetine baglEblmaktadB diger ilaçlar görevli hekimin yarg- göre uygulanmaktadß BazElsujelerde, birden fazla doz gerekli olabilmektedir. Uygulama slk'llglÇl terapinin seyri boyunca belirlenebilmekte ve düzenlenebilmektedir. Örnegin, uygulama lellgllÇI maddenin, terapötik amaçlar, önceki terapi, hastanlEl klinik geçmisi ve maddeye yanlüi baglEblarak tedavi edilecek olan kanser türüne ve asamasi ve görevli hekimin karar. dayallîblarak belirlenebilmekte veya düzenlenebilmektedir. Bilesimin uygulanmasElarallElslZ veya aralllZIEl olabilmektedir. ÖRNEKLER Örnek 1: ß-Iap, NOOl ile indüklenen ROS formasvonu ve SSB'Ier vasltâslîla prostat kanseri hücre ölümünü indüklemektedir Asag-ki veriler, bir insan prostat kanseri modelini kullanmaktadlE Benzer veriler, NSCLC hücreleri için mevcuttur. Her bir durumda, ilk olarak NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaca (ß-Iap) hücrelerin yanlfliarlîgösterilmektedir, daha sonrasIa özellikle tümör seçici DNA hasar amplifikasyonunun ve PARPl hiperaktivasyonunun eylem mekanizmalelEl açllZllgIla kavusturan çallStnalar olmak üzere IR + ß-Iap kullanarak sinerjik yanlflhr gösterilmektedir. Insan prostat tümörünün ve iliskili normal dokunun immünohistokimyasal (IHC) analizleri, bu kanserlerin r~i%60'I|El, yükselmis NQOl seviyelerine sahip oldugunu ortaya çllZlarmlgtlEl(Sekil 1). Endojen NQOl'in yüksek seviyelerini eksprese eden insan PC-3 prostat kanseri kullanllârak, mucitler, ß-Iap'I sitotoksik etkilerinin, NQ01'e bagnlüildugunu, dikoumarol ile inhibe edildigini göstermistir (Sekil 2). Bu, DU145'de ve NQ01+'ya karsElNQOl- LNCaP hücrelerinde onaylanmgtlîl Önemli bir biçimde, 4 M ß-Iap'a sadece ~120 dakikaIlEI maruziyet, maksimum sitotoksisiteye ulasmak için yeterli olmustur (Sekil 2), burada önemli glutatiyon seviyeleri oksitlenmistir (bkz. 20-30 dakikada GSSG %'sinin hlZIElie yükselmis seviyeleri, Sekil 2), bu da çarplEEROS formasyonunu göstermektedir. SSB'Ierdeki çarpiEEl artlglar, alkalin komet deneylerinde görülmüstür, fakat nötr kornet deneyleri ile ölçüldügü gibi DSB'Ier, Sekil Zfde belirtilmemistir. DU145 ve NQ01+ LNCaP hücreleri kullanllârak benzer sonuçlar bulunmustur. Buna karslEl, NQOl'i yetersiz LNCaP hücreleri, açllaandglîgibi ß-lap'a yan [Evermemistih ß-Iap ile tedavi edilen NQOl eksprese edici PC-3 hücrelerinin DNA hasarüie onarIi yaniElhrlZl lap'a maruziyetten sonra alkalin deneyleri ile 20 Gy'ye esit çllZlan PC-3 hücrelerinde belirtilmistir. Fakat nötr komet deneyleri, IR sonrasIa DSB'Ieri ortaya çlEbrmlStlEl ßlap maruziyetlerinden sonra çllZlarmamlStlEl PC-3 hücrelerinin IR'ye maruziyeti (20 Gy), tedaviden sonra 1 saat içerisinde hlîlübir sekilde tamir edilmis olan DNA hasarEille sonuçlanlElken, 4 ;M ß-lap taraflEldan olusturulan DNA hasarElJnarlIBiamlîstB fakat degerlendirilen 4 saatlik süreç boyunca yükseltilmistir, bu da onarIi inhibisyonunu göstermektedir (Sekil 3). ß-Lap sentezlenmis, 47 mmol/L DMSO'da çözülmüstür ve konsantrasyonlar, spektrofotometrik deneylerle seyrelti sonrasIa dogrulanmlgtlEl Hoechst 33258, hidrojen peroksit (HZOZ), staurosporin, sitokrom c, etoposid, DPQ (3,4-dihidro-5[4-(1- piperindiniI)bütoksi]-1(2H)-izokinolin) ve dikoumarol (50), Sigma-Aldrich'den (St. Louis, MO) satI aIlEmlstE NQOl ekspresyonu, UT GüneybatlJKapsamIDKanser Merkezi Doku Tedarik Paylasllmaynak tarafldan elde edilen ve islenen hasta numuneleri kullanilârak IHC boyasEiIe tümör ve `iliskili normal' dokularda degerlendirilmistir. Klgacasüdoku kesitleri (5 um), sabit parafin gömülü dokulardan hazlEllanmE ve 37°C'de f-anmlgtlü Endojen peroksidaz aktivitesi, 20 dakikallgllEb %3 H202'de kesitler yerlestirilerek, daha sonrasIa gece boyunca 4°C'de bir NQOl antikoru (1:500) ile inkubasyon vasißslýla sonlandlîllüilgtlîl Immünotespit, imalatçII talimatlarliîla göre bir yaban turpu peroksidaz esalelElite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) kullanllârak, ardlEUan hematoksilen ile karsllîl boyama vasiûislîla uygulanmlgtlEl Görüntüler, bir Nikon coolpix 4500 kamera ile bir Nikon E400 mikroskopu kullanllârak allEmIgtlE PC-3, DU145 ve LNCaP insan prostat kanser hücreleri orijinal olarak Dr. George Wilding'den (Wisconsin-Madison Üniversitesi) elde edilmistir. PC-3 ve DU145 hücreleri, %5 fetal s[glEl serumu (FBS) ile RPMI 1640 OrtamIa (Invitrogen, Carlsbad, CA) büyütülmüstür ve LNCaP hücreleri, %10 FBS ile Dulbecco minimum esas ortamda (DMEM, Invitrogen) büyütülmüstür. Hücreler, bir %5 GOZ-%95 havasünemlendirilmis atmosferde 37°C'de kültürlenmistir ve mikoplazma kontaminasyonundan muaf olmustur. Disülfür ve toplam glutatiyon (sßsûla GSH ve GSSG) seviyeleri, bir spektrofotometrik geri dönüsüm deneyi kullanllârak belirlenmistir. Belirtilen tedavilerden sonra, tüm hücre homojenatlarü açllZIandlglElgibi hazlEllanmlStlEI(Reinicke ve ark., 2005, Clin Cancer Res., Chem., 193:265-75) referansElkullanllârak protein içerigine normallestirilmistir. En az üç defa uygulanan deneyler için ±SE anlam. geldigi gösterilmektedir. karsEbitisik normal' dokuda NQOl vakalarERElaslanarak yürütülmüstür. Örnek 2: PARP-l hiperaktivasvonu, lap ile indüklenen programlanmlîl hücre ölümünü yonlendirmektedir PC-3 hücrelerinin ß-lap ile olan maruziyeti, 10-20 dakika içerisinde dikoumarol ile bloke edilmis olan önemli PAR akümülasyonu ile kapsamlElPARP-l hiperaktivasyonuna neden olmustur (Sekil 4, Sekil 5). 40-60 dakika araligiIa bildirilen ß-Iap ile tedavi edilen PC-3 hücrelerinin PAR formasyonu kaybÇlbir NAD+ sübstrat tükenmesinin bir islevi (Sekil 4, Sekil ) ve ayniZl zamanda PARG eylemi olmasEI en olasEl durum olmustur. PARP-l hiperaktivasyonuna, (i) metabolit seviyelerinin, 120 dakikallKl ß-Iap maruziyeti içerisinde tükendigi sürenin (Sekil 5); ve ATP kaybIEl, sitotoksisiteye iyi bir sekilde tekabül ettigi dozun (Sekil 5) bir islevi olarak çarplEENAD* ve ATP kaleiIarEbslik etmistir. Hücre içi nükleotid seviyelerinin kaybI:(NAD+ ve ATP) ve ß-lap ile tedavi edilen PC-3 hücrelerinin ölümcüllügü, dikoumarol (40 M) ile bloke edilmistir. Dikoumarol aynüamanda ß-lap maruziyetinden sonra DU145 hücrelerinde PARP-l hiperaktivasyonunu, NAD+ ve ATP kaylülarIEi/e sitotoksisiteyi Önlemistir (Sekil 4). Tüm hücre ekstraktlarElhazlElianmlStE proteinler SDSPAGE ve SuperSignal® West Pico Kemiluminesant sübstratE(Thermo Scientific, Rockford, IL) kullanilârak gelistirilen Western blotlarIZIiIe ayrllüilgm ve Otoradyografi Filmi (Denville Scientific Inc., Metuchen, NJ) kullanllârak ortaya çkarüßîßtlü PAR (BD Pharmingen, San Jose, CA) ve yHzAX (Upstate, a-tubulin seviyeleri, yükleme kontrolleri olarak kullanllîhlstlü Hücre içi NAD+ seviyelerindeki degisimler ölçülmüstür (Bentle ve ark., 2006, J. Biol. Chem., tedavi edilen yüzde olarak eksprese edilmistir. ATP seviyeleri, imalatçII talimatlarIEtakip ederek CeIlTiter-Glo Luminesant Hücre Canl[[[El Testleri (Promega, Madison, WI) kullanllârak tüm hücre ekstraktlarIan analiz edilmistir. Veriler, üç kopya halinde en az üç bagIisIZl deneyden ortalama ± SE olarak gösterilmistir. Örnek 3: IR ve ß-Iap arasIEtlaki sinerii, PARP-l hiperaktivasyonunun bir esigine ulasan DNA hasarlîile yönlendirilmektedir bildirilmistir, fakat sinerji mekanizmasüçliîlanmamlgtlîl PC-3 hücreleri, tek IR dozlarlsîla (1-3 Gy), daha sonrasIda ß-lap'I ( düsük, toksik olmayan dozlar. maruz kalmasüla tedavi edilmistir. Sinerji, test edilen, birlesik tedavilerden sonra (tekli madde maruziyetlerinden sonra degil) PAR seviyelerinin sinerjik artlglar- tekabül eden tüm IR ve ß-Iap kombinasyonlarEile bildirilmistir. Tablo 1. PC-3 hücrelerinde tekli tedaviyle birlesik tedavileri klýlaslayan ekitoksik dozlar 0 1 0.6 1 2 1.2 2 O 3 1.7 3 1 1 1.7 4.1 1 2 2.1 5.6 1 3 2.7 6.8 2 1 2.6 7.9 2 2 3.1 9.6 2 3 3.6 11.5 3 1 3.7 12.5 3 2 4.1 14.5 3 3 4.6 16 Machado modeli kullanilârak uygulanan ölçüm. Degerler üç baglslZdeneyden üç kopya halindeki deneylere yönelik ortalamalara hesaplanan dolarEiîemsil etmektedir. Tablo 2. [n V/VOJ ß-Iap-HP-ß-CD'si ile olan veya olmayan IR'nin antitümör verimlilik çallginalarII klîâa açiElamasEl HPß-CD-ß-Lap IR2 (Gy) #Test Edilen Ortalama3 Tümör Büyüme #Görünüsteq Tedavi (mg/ kg) Fare Gecikmesi (Günler) Edilmis Fareler (0/0) 0 0 18 0 0 0 5 0 0 0 5 0 0 0 9 4 2 (%22) 0 2 13 26 0 0 3 12 80 8 (%67) 0 4 5 80 4 (%80) 0 5 3 80 2 (%67) HPß-CD-ß- IR2 (Gy) #Test Ortalama3 Tümör Büyüme Gecikmesi #Görünüste4 Tedavi Edilmis Fareler Lap Edilen (Günler) (°/o) (mg/kg) Fareler . 1Gösterildi'gi üzere, tek bas. IR, tek bas. HPP-CD-ß-lap veya HPß-CD-ß-lap tedavili olan veya olmayan IR'IerIe bagIslZl deneyin klîia açlEIamasEl Yukarlki kosullar, toplamda 5 defa günaslEEl/erilen farkIEtedavi rejimlerini temsil etmistir. IR her zaman ilk olarak ß-lap tedavilerini takiben iletilmistir. Yukarlâbki rejimlerden hiç birisi, önemli kilo kayblîila yol açmamlstlB o 2IR, `Malzemeler ve Yöntemler' bölümünde açllîlandlglgibi kolimatörler kullanüârak odaklanmlglbir lglîil kullanilârak 0 3'Ortalama tümör büyüme gecikmesi', kontrol, vehikül ile tedavi edilmis (sadece HPß-CD) farelere klýbsla 1000 mm3 bir ortalamaya ulasacak sekilde tümör büyümesi için gerekli süre (günler) olarak belirlenmistir. 1000 mm3'e kontrol tümör hacimlerinin ulasmasi yönelik ortalama süre, 14-16 gün olmustur. Deneyler genellikle yaklaslEl 80. günde sonlandlîlîhßtlrîi 0 4Bir hayvan, tümörlerin tedaviden sonra tamamen ortadan kaybolmasElieya tüm çaIlSinalarIEl sonlandlElIIhasE süsIa 80 günün üzerinde ve 80 günün sonunda rejimin tamamlanmasIan sonra herhangi bir önemli büyümeye sahip olmayan önemli regresyon sergilemesi halinde, `Görünüste tedavi edilmis' olarak görülmüstür. . 5Tümörlerin, 10-30 mg/kg HPß-CD-ß-lap tarafIan takip edilen IR (2 Gy) ile tedavi edildigi rejim arasIa önemli fark mevcut olmamlSIlEl Örnegin 1 Gy + 3 ;M ß-Iap ile tedavi edilen PC-3 hücrelerinde çarplEIZPAR formasyonu, tek bas. herhangi bir maddeden sonra hücrelerde herhangi bir görünür seviye olmadan 60. dakikada bildirilmistir. Benzer yanEIhr, NQ01 eksprese edici LNCaP ve DU145 hücreleri kullanarak, fakat genetik olarak eslestirilmis NQ01- LNCaP hücreleri kullanmadan bildirilmistir (Sekil 6). Sinerji, NQ01 eksprese edici prostat kanseri hücrelerinde dikoumarol ile önlenmistir ve büyük olasHIEla PARP-l hiperaktivasyonu için gerekli esik seviyelere ulasan DNA lezyonlar. formasyona tekabül etmistir (alkalin komet ve yHZAX odak noktasEliormasyonu ile bildirilmistir) (Sekil 6). PC-3 hücrelerinde IR ve ß-Iap arasIa sinerjiye, çarplEDXTP (bkz. 2 veya 3 Gy ve 3 M ß-lap ve araslüdaki sinerjiye yönelik Sekil 4C-D) NAD+ (gösterilmemistir) kayliîlarlîieslik etmistir. Önemli bir biçimde, 2 veya 3 Gy + 3 uM ß-Iap sonrasIa PC-3 hücrelerinde sinerjik ATP kaylîilarüçesitli endojen olarak aslEEbksprese edici NQ01 kanser hücrelerinde tek bas. ß-lap ile indüklenen hücre ölümünü de önleyen bir spesifik PARP1-1 inhibitörü olan DPQ ile ön ve birlikte tedavi edici hücrelerle önlenmistir (Sekil 7). IR ve ß-Iap arasIaki sineiji, NQOl- LNCaP hücrelerinde gözlemlenmemistir (Sekil 6). Nispi DNA hücresi sagkalIi deneyleri, çesitli tedavilerinden sonra degerlendirilmistir. KEiacasÇI hücreler, 48 kuyucuklu plakalarda hazne baslEla 5 x 103'de ekilmistir ve gece boyunca birlesmesine izin verilmistir. Hüreler daha sonrasIa suni olarak tedavi edilmis veya gösterildigi gibi dikumoral mevcudiyetinde veya yoklugunda çesitli ß-lap dozlarls-Lla (2 saatligine) tedavi edilmistir. Daha sonrasIda ilaç içermeyen ortak eklenmistir ve hücrelerin, kontrol hücreleri ~%100 birlesime ulasana kadar 5-7 günlügüne büyümesine izin verilmistir. Daha sonrasia DNA içerigi, aç[lZland[g]Üg]ibi bir plaka okuyucusu (Perkin-Elmer, Boston, MA) kullanllârak Hoeschst 33258 boya ile boyama ve floresan tespiti ile belirlenmistir. Birlesik tedaviden sonra nispi sagkali deneyleri, açlKlandlglîgibi koloni olusturabilme kabiliyetleri deneyleri ile onaylanmßtß Sonuçlar, en az üç baglislîl deneyinden ortalama ±SE olarak bildirilmistir. Nispi sagkaln verileri için, IR + ß-lap maruziyetlerinin farkllZlkombinasyonlarlZl Windows Version 11.0 için SigmaPlot'da basit çok hedefli modelle uygun olmustur. Sinerji için, sinerjinin istatistiksel bir tannlîd48) kullanüBilStlEve hesaplamalar, R kodu (47) kullanilârak Machado ve Robinson modeli ile deneysel veriler birlestirilerek uygulanmlgtlü Tablo 1'de listelenen ekitoksik dozlar, formda elde dilen Machado ve Robinson modelinin parametreleri ile hesaplanmlgtlü Örnek 4: IR ve ß-Iap maruziyetleri arasIaki sinerii, atipik PARP-l bölünmesini ve TUNEL+pr0ciramIanm Iîlnekrozu icermektedir ß-Iap tedavisinin bir sonucu olarak sagkali kaybÇITUNEL+ apoptotik yanmarla iyi bir iliski kurmaktadlE IR + ß-Iap tedavilerinden sonraki NQOl-eksprese edici PC-3 hücrelerinin sinerjik sitotoksik yanEIhrlîaSekil 7 ve 9), apoptoz analiz edilerek (Sekil 8 ve 9) onaylanmlgtß Her birisi 2 ;M ß-lap ile kombinasyon halinde 1-3 Gy ile PC-3 hücrelerinin tedavisi, 72 saat içerisinde apoptotik hücrelerde (Sekil 9), dogrudan koloni olusturabilme kabiliyetinden kaybi (Sekil 5) tekabül eden önemli artlslarla sonuçlanmlstlEI AslIa ß-Iap (Tablo 1) ile tüm IR'nin tüm kombinasyon tedavileri, her bir maddenin bu düsük dozlarIa sinerjiyi ortaya çlKlarmlStlEl Örnegin, IR (örn. 1 Gy + 1 M4 ß-lap) ile kombinasyon halinde ölümcül olmayan maddelerle (tek bas.) PC-3 hücrelerinin tedavisi, 4 M ß-Iap bir ölümcül dozu içeren tedavi edici hücrelerle aynmllZhiIStB Tedaviden 72 saat sonrasIa apoptoz ve atipik PARP-l blünmeisnin sinerjik seviyelerinin bildirildigi eksojen NQOl'i eksprese eden LNCaP hücrelerinde benzer yan[EI]ar bildirilmistir (Sekil 10). IR ve ß-Iap arasiaki Sinerji, dikoumarol ile önlenmistir ve NQOl-LNCaP hücrelerinde gözlemlenmemistir. Buna karslEl, tek bas. IR'nin farkllZdüsük dozlarüöm. 1-3 Gy) sßasMa sadece %2 ±2, %5 ±3 ve %9 ±3 apoptoza yol açmlStlB Benzer bir sekilde, NQOl-eksprese edici PC-3 hücrelerinde 2 M ß-Iap'I bir düsük subletal dozu, minimum apoptozla sonuçlanmlgtlîlwrn. %5 ±2, Sekil 9). NQ01'in endojenin yükselmesiyle prostat kanseri hücrelerine ß-lap bir ölümcül dozun yol açtlglühücre ölümü, p-kalpain aktivasyonunu ve 4 pM ß-lap tedavisinden sonra bildirildigi gibi PARP-l'in atipik bölünmesini içermektedir (Sekil 98, serit 7). Benzer bir sekilde, IR + ß-lap ile PC-3 hücrelerinin maruziyeti, tek bas. IR veya ß-Iap'I katkülseviyelerinin üzerinde sinerjik apoptotik yanlfllarlîliçermistir. Kombinasyon ile tedavi edilen hücrelerde atipik PAR-l bölünmesi (0"rn. bir -60 kDa PARP-l fragmanIlEl formasyonu) bildirilmistir (Sekil SB), bu da p-kalpainin aktivasyonundan ve nükleer translokasyonundan kaynaklanmaktadlEl Benzer atipik PARP-l bölünme eylemleri, NQ01+ LNCaP hücrelerinde IR + ß-lap sinerjisine eslik etmistir (sekil 10). yHzAX odak noktaslîllormasyonu, 4 °C'de gece boyunca 1:500 oran Ha seyreltiyle bir anti-y- HZAX antikoru (Upstate, Billerica, MA) kullanilârak tespit edilmistir. AlexaFluorTM floresan ikincil antikorlar (Molecular Probes, Carlsbad, CA), oda lebkligllEtla 2 saatligine eklenmistir. Nükleuslar, bir NIKON Konfokal mikroskop kullanliârak toplanan DAPI ve konfokal görüntülerle boyanmlstlü Apoptoz, açlEland[glEgibi BD Pharmingen'den ApoDirectTM (TUNEL) deneyleri kullanilarak ölçülmüstür (Bey ve ark., . Numuneler, FC- 500 aklg sitometrisi (Beckman Coulter Electronics, Brea, CA) ve Elite edinim yaZIIIEJlD kullanilarak analiz edilmistir. Veriler, üç bagIislîl deneyden ortalama ±SE olarak eksprese edilmistir. Örnek 5: IR ve B-lap'I kombinasyonunun i'n w'i/o verimliligi Günümüzde, endojen NQ01'in yükselen seviyelerini eksprese eden insan prostat kanseri ksenogreftlerine karslZB-lap verimliligi gösterilmistir. HidroksipropiI-P-siklodekstrin (HPßCD) formülasyonunda ß-Iap kullanilarak, mucitler, 2 Gy IR fraksiyonu ile kombinasyon halinde 10 veya 20 mg/kg miktarda uygulandlgllda önemli HPßCD-ß-Iap verimliligi sergilemistir (Sekil 11). ~350 mm3 bir ortalama tümör hacmine sahip PC-3 ksenogreftlerini taslýbn fareler (5/grup), 1-9. günler araleUa günaslBEIarak tek bas. IR, tek baslEta HPßCD-ß-lap veya IR + HPßCD-ß-lap kombinasyonunun bes dozuna maruz bBikllüîlstlEl 10 veya 20 mg/kg HPßCD- ß-lap ile farelerin tedavisi, ne antitümör verimliligi ne de morbidite veya mortalite sergilemistir. 2 Gy fraksiyon (gün aslElZlbes tedavi) ile tedavi edilen fareler, önemli tümör büyüme gecikmesi (ortalama 26 gün, Sekil 11, Tablo 1) ile sonuçlanmasi ragmen, 10 veya mg/kg HPßCD-ß-lap ile IR (2 Gy) kombinasyonlarütek baslEa IR veya HPßCD-ß-Iap tedavilerinden eklenebilirligin ötesinde önemli tümör regresyonu ile sonuçlanmlStlE IR + 10 veya 20 mg/kg HPBCD-ß-Iap'a maruz blûküân hayvanlar. yüzde doksanEQ9/10), `görünüste tedavi edilmistir', bu da 150 güne kadar herhangi bir baska tümör büyümesi sergilememektedir (Sekil 11, Tablo 1). Buna karslEl, tek bas. HPßCD-ß-Iap (10 veya 20 mg/kg) ile tedavi edilen, PC-3 taslýbn farelerin %90'Çltek baslEla vehikül (HP(3CD) kontrol farelerine benzer bir sekilde 40 gün içerisinde ölmüstür. IR (2 Gy) ile tedavi edilen fareler, tek bas. tümör büyümesinde açllZl bir gecikmeyi göstermistir (Sekil 11), fakat tüm fareler en nihayetinde ölmüstür (%10 ag Elllgllda tümör hacimleri ile feda edilmistir). Son olarak, 2 Gy + 30 mg/kg HPßCD-ß-lap ile tedavi edilen fareler, istatistiksel olarak esdeger tümör büyüme gecikmesi ve `görünür iyilesmeler' ile sonuçlanmasi ragmen (Tablo 1), mucitler, dozun, -35 mg/kg gibi ilacI maksimum tolere edilen dozuna (MTD) yakI oldugunu bildirmistir. Kolektif olarak, mucitler 15 fareyi (3X 5 fare/grup), tek basi 2 Gy'ye istatistiksel olarak üstün olan (p < 0.001) çarpßEinerjik yanEIhrEbildirerek 2 Gy + 10-30 mg/kg HPPCD- B-Iap veya tek baslEla HPßCD-ß-Iap (10-30 mg/kg) rejimi ile tedavi etmistir (Tablo 1). Bu verilerin bir temsili deneyi, Sekil 11'de sunulmaktadlB Örnek 6: ß-lap ile NSCLC tümörlerinin radvoduvarlllâsmasü PARP1 hiperaktivasyonu ile olusmaktadlîl Prostat kanseri hücrelerini asiEEbksprese eden NQOl'de oldugu gibi, ß-Iap benzeri NQOl biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlar, küçük hücreli olmayan akciger kanseri (NSCLC) hücrelerini ve tümörlerini in vitro ve in vivo olarak radyoduyarlHâstübilmektedir. NSCLC ksenogreftlerini taslîlan atimik fareler, 4 Gy ile radyasyona maruz bßkllîhlgl ve gösterildigi üzere bir rejimde toplam 5 tedavi için gün asElEbir defa iv olarak IR veya ß-Iap'a karsEBO mg/kg ß-Iap-HPBCD ile tedavi edilmistir. Bir tedavi rejiminden aIlElan sonuçlar gösterilmektedir (Sekil 13). Önemli antitümör aktivite ve etkili azalma ve iyilesmeler (hayvanlarlEl ~%40'[Il bildirilmistir. 4 Gy + 30 mg/kg ile bu fare tedavisinin Kaplan-Meyer sagkall egrileri, Sekil 13'de gösterilmektedir. Mekanik olarak, ß-lap-aracIHDradyoduyarlllâsma, insan prostat kanseri hücrelerini aslEIEl eksprese eden NQOl'de belirtildigi gibi PARP1 hiperaktivasyonu vasiûslýla olusmaktadIB NQ01+ A549 hücrelerinin ß-lap maruziyeti, PAR formasyonu ile görüldügü üzere PARPl'in hiperaktivasyonu ile sonuçlanmaktadlîl(SekiI 14). yH2AX ve fosfoSerlgBi-ATM ile ölçülen DSB formasyonunun, ß-lap ile tedavi edilen hücrelerde önemli ölçüde geciktirildigi ve azaltllân PAR formasyonundan sonra olustugu belirtilmektedir. Do ve süre baglamIa ß-lap sonrasla FOSfO-ThFZÖOQ-DNA-PKC formasyonunun analizleri, geciktirilmis DSB formasyonunu sergilemistir. 25 mM 3-aminobenzamid, bir PARPl inhibitörünün eklentisi ile PARP aktivitesinin inhibe edilmesi, A549 NSCLC hücrelerinde PAR formasyonunu korumakta ve radyoduyarlHâsmasEgösterilmektedir (Sekil 14). 1 Gy + 2 ;M ß-lap ile tedavi edilen A549 NSCLC hücrelerinde olan, fakat tek bas. madde ile tedavi edilen hücrelerde olmayan PAR formasyonu bildirilmistir (Sekil 14). NQ01 protein seviyelerinin indüksiyonu, NQ01 seviyelerinin (protein ve enzim seviyeleri), A549 NSCLC hücrelerinin IR maruziyetinden sonra önemli ölçüde degismemesinden dolayü549 NSCLC hücrelerinin radyo duyarlilâstlîißiaslîilçin gerekli olmamIStlü (Sekil 14). Fakat bir NQ01 inhibitörü olan dikoumarol eklentisi A549 hücrelerinin radyoduyarl[IâsmasIEliiorumustur (Sekil 14). Bu sebepten ötürü, NQ01 aktivitesi (fakat indüksiyonu olmadan), ß-Iap-aracÜJJIladyoduyarl[lâsma için gerekli olmaktadlB Tüm hücre ekstraktlarElhazlEiianmStB proteinler SDSPAGE ve SuperSignaI® West Pico Kemiluminesant sübstratüThermo Scientific, Rockford, IL) kullanilârak gelistirilen Western blotlarElile ayrIJBilsIlE] ve Otoradyografi Filmi (Denville Scientific Inc., Metuchen, NJ) kullanilârak ortaya çiElarilBrlStlE Bir anti-insan NQ01 antikoru, Dr. David Ross (Colorado Üniversitesi Saglliîi Bilimleri Merkezi, Denver, CO) tarafIan bize saglanmlgtiîl ve 4 °C'de gece boyunca bir 1:5000 oran [Eda seyreltide kullanliîhlgtiîl Atimik tüysüz fareler, Charles River Laboratories International, Inc'den (Wilmington, MA) satiE allEmlStE Tüm hayvanlar, gIya ve suya 24 saatlik erisime sahip, bir patojensiz tesiste muhafaza edilmektedir. Deneysel protokolleri, Teksas GüneybatElÜniversitesi'ndeki kurumsal Hayvan BakIl ve KullanI Komitesi taraflEblan 0nayland|Z|PC3 hücreleri (5 X 106), atimik tüysüz farelerin sag uyIukIarlEla subkütanöz olarak enjekte edilmistir ve tümör hacimlerinin, ~350 mm3'e ulasmaslîib izin verilmistir. Fareler (5 fare/grup) daha sonrasIa altEigrup arasIia tümör boyutlarIda herhangi bir istatistiksel fark olmadan rastgele bir sekilde gruplanmlgtlB Fareler suni bir sekilde tedavi edilmis veya daha sonraleUa çesitli IR dozlar. maruz bßkilîhlgiü bunun hemen ardIan çesitli HPßCD-ß-Iap veya HPßCD (10-30 mg/kg) dozlarlsîla tedavi gelmistir. KullanIigIIa, çesitli IR dozlarÇlilk olarak tüm vücudu korunmus tümör alanlar. lokal olarak sunulmustur. Fareler, suni veya XRT'den olusan bir tedavi rejimine, bunun hemen arEUan bes IR + ß-Iap maruziyetleri için kuyruk damariEUan enjeksiyonlar vasßslîla uygulanan tek baslEb HPßCD veya çesitli HPßCD-ß-Iap dozlarlEb maruz büküîhlgtiîl Tümör hacimleri, gün asiElDolarak kaliperle (uzunluk x genislik x genislik/2) ölçülmüstür. Tümörler 2 cm3 veya %10 toplam vücut aglEllEgll ulastlglîida, fareler öldürülmüstür. Test edilen altügrupta in w'vo tümör büyüme profillerinin regresyon analizleri, AR kolerasyon yapilârlîile bir karEllö model yaklasnlîlkullanllârak analiz edilmistir. Log-rank testleri, sagkali analizlerine uygulanmlStlE(Kaplan-Meier egrileri). Genelde 50.05 iki tarafllîp degerleri önemli olarak görülmüstür. Tüm istatistiksel analizler, SAS 9.1 Service Pack 4 kullanilârak uygulanmlgtlB Örnek 7: Doku NOOl bovasEI NQOl ekspresyonu, IHC boyasü RT-PCR vaslßslýla ve enzimatik aktiviteler vasißslýla tümörde ve iliskili normal dokuda ölçülmektedir. Klglacasüdoku kesitleri (5 um), sabit parafin gömülü dokulardan hazlHlanmlglve 37 °C'de gece boyunca f-anmlgtlEl Endojen peroksidaz aktivitesi, %3 Hzoz'de kesitler yerlestirilerek, daha sonrasIa gece boyunca 4°C'de anti- insan NQOl antikoru (1:500) ile inkubasyon valeislIla sonlandlElllB1lStlEl Immünotespit, bir yaban turpu peroksidaz esasIIZI Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) kullanllârak, ardIan hematoksilin ile karsllîl boyama vasßslýla uygulanmaktadlB Kesitler, 3,3'-diaminobenzidin ve hematoksilen karsiEl boya ile görsellestirilmektedir. On (10) yüksek güç alanlarEl(x400), bir aralßlû ölçekte bildirilen ortalama NQOl boya yogunlugunu belirlemek için incelenmektedir. IHC deneyleri, iki kopya halinde uygulanmaktadlE ve Simmons Kanser Merkezi Histoloji Merkezi tarafIan degerlendirilmektedir. Toplam temel hasar, DSB'Ier ve SSB'Ier dah dahil DNA lezyonlar. karsEDSB'ler, sßsüla alkalin veya nötr kosullarEQTREVIGEN, Gaithersburg, MD) altlEtla tek hücreli jel elektroforetik komet deneyleri kullanllârak degerlendirilmistir. Lamlar, SYBR Green ile boyanmlStlElve bir Nikon Eclipse TE2000-E floresan mikroskopu (Melville, NY) kullanllâ'rak görsellestirilmistir. Dijital fotomikrografikler allEinlStlEIve komet kuyrugunun uzunluklarüNIH Image J yaz[I]]îlil:I kullanüârak ölçülmüstür. Her bir referans noktasülOO hücre ±SE'nin bir ortalamasIEtemsil etmektedir ve veriler, üç kopya halinde uygulanan deneylerin temsilidir. Ornek 8: PBMC NQOl ve katalaz aktiviteleri 1. Döngüde, Günler 1 ve 15'de, 15 cc kan, asag-ki süre noktalarlEUa Becton Dickinson sodyum heparin polimer jel tüplerinde toplanacaktlîl ön-ARQ 761 infüzyon, infüzyondan 4 saat sonra ve infüzyondan 24 saat sonra. Bu süre noktalarII seçimi, PK çizimleri ile denk düsmektedir (aynEtüp, her iki amaç için kullanllâcaktlE) ve ß-Iap ile NQ01 indüksiyonunun klinik öncesi gözlemlerine dayalEbImaktadlB Tüpler santrifüjlenecektir ve PBMC peleti, iki ependorf tüpüne bölünecek, -70 °C'de depolanacak, yiglI haline getirilecek ve Boothman laboratuvar. iletilecektir. NQ01 ve katalaz enzim deneyleri, açllZlandlgiügiibi uygulanacaktlü5 Klîiacasü Tris-HCI tamponunda sitokrom c ve slgllE serum albumini içeren reaksiyon ortamIa, NQ01 aktiviteleri, ara elektron donörü olarak NADH ve ara elektron allEEZtblarak menadion kullanilârak ölçülmüstür. Deneyler, dikoumarol (DIC) (bir NQ01 inhibitörü) mevcudiyetinde tekrar edilecektir ve DIC ile inhibe edilen aktivite, NQ01'e atfedilecektir. Enzim aktivitesi, 550 nm OD degisiminin ilk oranlarlEla ve 21.2 mM/cm sitokrom Ciçin bir yok olma katsay- dayalEblarak eksprese edilen sitokrom dsi azaltlifnlSIdakika/mg proteinin DIC ile inhibe edilmis nanomolleri olarak hesaplanacaktE Katalaz seviyeleri aynlîtamanda asaglîila açlEland[g]lIr_liibi degerlendirilmektedir. Örnek 9: NOOl polimorfizmleri sekanslarIEUan tespit edilecektir. Genomik DNA, Qiagen döndürme kolonlarEkullanllârak kan PBMC ve tümör dokusundan (elverisli oldugunda) ekstrakte edilmektedir. Kan ve tümör dokusunda NQ01 seviyelerinin degerlendirilmesi, tümörlerde NQ01 seviyelerinde olan degisimlerin, sokak türü hastalarda olusup olusmad[g]Il:l degerlendirmemize olanak saglamaktadß günümüzde bir degerlendirme uygulanmamlgtlEl Öncesinde açElZlanan oligonükleotid primerleri kullanüârak, PCR ürünleri, jel elektroforezine tabi olacaktlü Son genotipleme, *1/*1 (sokak türü) veya polimorfik *2/*2 veya *3/*3 NQ01 polimorfizmleri için tanlglal olan, ayrllîhlglbantlarl boyutuna ve modeline dayallîcblarak belirlenmektedir. Örnek 10: Istatistiksel analizler Doku NQ01 ekspresyonu için, numune skorlarütablolarda ve sekillerde özetlenmektedir. Lojistik regresyon, IHC skoru ve NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir yanEIarasIaki iliskiyi ölçmek Için kullanllBiaktadlB ve bir Cox regresyon modeli, IHC skoru ve sagkalIi (ilerlemesiz ve genel) süreleri araleldaki iliskiyi ölçmek için kullanllfnaktadlü PBMC NQ01 aktivitesi için, referans ve tedavi sonrasEI NQ01 aktivitesi, tablolarda ve sekillerde özetlenmektedir. Dagll]]îli grafikleri, zamanla her bir hastanlEl NQ01 degisimlerini takip etmek için kullanlliiaktadlü Dogrusal (veya genellestirilmis dogrusal) regresyon modeli, NQ01 degisimleri, plazma ilacEteviyeleri ve klinik bitis noktalarEarasIaki iliskiyi degerlendirmek için kullanüü1aktadlü Tüm biyo isaretleyicilerin ekspresyon degisimleri, bir tabloda özetlenmektedir. Bir güç hesaplama analizi, NQOl ekspresyonu ve klinik verimliligi araletlaki iliski için kullanilüiaktadlü Örnegin Pearson korelasyon katsay-I 0.5 oldugu bos hipotezin bir 0.05 iki tarafIElFisher z testi, numune boyutu 30 oldugunda 0.8 bir korelasyon katsay-El tespit etmek için %81 güce sahip olacaktE tümör secici Drociramlanmlglnekroza karsERataIaz korumasEl 1. B-Lapakan ile indüklenen hücre ölümü, NQOI'e baglüillülû oksijen tüketmektedir ve düsük doz NA C'de inhibe edilmemektedir Malzeme/er ve Yöntem/er Kimyasallar, reaktifler ve antikorlar: ß-Lap (3,4-dihidr0-2,2-dimetil-ZH-nafto[1,2- b]piran-5,6-dion), William G. Bornmann (M.D. Anderson) tarafIdan sentezlenmis, NMR ile onaylanmis.] 40 mM DMSO ile çözülmüstür ve konsantrasyonlar, spektrofotometri ile (St. Louis, M0) elde edilmis ve DMSO'da çözülmüstür. Dikoumarol (Sigma-Aldrich) aç[lZ]and[giü gibi kullanlßilgtlü (Pink ve ark., J Biol Chem. (Sigma-Aldrich), açlElandEg'lEgibi 24 saatlik ön tedaviler ve 2 saatlik birlikte tedaviler Için 5 (KH2P04) ve dibazik (K2P04) potasyum fosfat ve sodyum siyanür (NaCN), Fisher Scientific'den (Pittsburgh, PA) elde edilmistir ve açiiZland [gJIZQIbi kullanilBiStElQhao ve ark., Cancer Res. (DETAPAC), katalaz, SOD, s[g]|El serum albümini (BSA), batokuproin disülfonik asit (BCS) disodyum tuz hidrat ve ksantin oksidaz (Sigma-Aldrich) aç[lZland[g]Ügibi kullanilB1lStlEl(Zhao ve Cruz) leilea western blotlarüle IHC için 1:1000 veya 1:100 oran-a seyreltilmistir. Memeli hücre kültürü, tedaviler ve sagkalli'i deneyleri NQOl ve MCF-7:WS8 (MCP-7) hücrelerinden mahrum olan veya bu hücreleri eksprese eden MDA-MB-231, aç[lZland[g]l:gibi inkubatörde 37 °C'de RPMI 1640 ortamlarIa büyütülmüstür. Tüm hücreler, mikoplazma içermemistir. Oksijen tüketim analizleri: Oksijen tüketimi, öncesinde yayIand [gJEgibi (Zhao ve ark., sensörü kullanilârak ölçülmüstür. S9 ekstraktlarü(gösterildigi gibi 50 mM, %10 BSA, pH 7.5, Tris-HCI tamponunu içeren bir 37 °C kapalElsisteme eklenmistir. OOISensors programEI (Ocean Optics, Inc.), her dört okumada ortalamasEhIlIihrak her 512 saniyede 599.62 nm floresanslîlölçmek için kullanilBiIStiEl Veriler (ortalama, ±SEM), her biri üç kopya halinde uygulanan üç bagIisE deneyden 02 tüketiminin X katEbranEblarak gösterilmistir. MCF-7 hücreleri, çözülmüs (Polagraphy) veya tükenmis (Clark elektrodu) oksijen kaybII mollerini belirlemek için kapaIEbir sistemde 2 dakikal[g]lEla çesitli ß-Iap dozlarEiIe tedavi edilmistir. Hidrojen siyanür (HCN), hücresel solunum vasEislîLla oksijen kullaniIElsergiIemek için kapalEisisteme eklenmistir. Bir NQOl inhibitörü olan Dikoumarol (50 i.iM), bu hücrelerde bulunan oksijen tüketiminin NQOl'e bagnllîloldugunu göstermek için ß-lap ve MCF-7 hücrelerini içeren kapalßisteme eklenmistir. ROS, NAD+ ve ATP ölçümleri: Hücresel oksidatif gerilim, GSSG içerigi ile ölçülmüstür defa uygulanmlîstlîl ve veriler, ortalama ±SEM olarak eksprese edilmistir. Hücre içi NAD+ seviyelerine yönelik degisimler açÜZland[g]l:gibi ölçülmüstür (Bentle ve ark., J Biol Chem. tedavi edilmis/kontrol) ortalama ±SEM olarak eksprese edilmistir. referansElile açiElandiglElgibi uygulanmlgtE S9 SüpernatantlarlÇl orta-log ila geç log faz büyümesinde hücrelerden hazlEllanmlStlE Hücreler, tripsinizasyon (%025 tripsin ve 1 mM EDTA) ile ç[lZlar[lBilgl buz soguklugunda, fenol klEinlîlgZHank'in dengeli tuz çözeltisinde iki defa yllZlanmlgtEve daha sonraslîitla 10 ug/uL aprotinin içeren küçük bir PBS hacminde, pH 7.2, yeniden asklýh allEhiigtIE Hücre süspansiyonlarü 10-s darbeler kullanliârak buzda dört defa sonike edilmistir ve daha sonraletla 20 dakikal[g]. 14,000 X g'da santrifüjlenmistir. S9 süpernatantlarü mikrosantrifüj tüplerine bölünmüs ve kullanilâna kadar -80°C'de depolanmlSIlE] Bir 1x proteaz inhibitörü kokteyli, enzim aktivite degradasyonunu önlemek için eklenmistir. NQ01 aktivitesi, dikoumarol mevcudiyetinde veya yoklugunda sitokrom-c absorbanslia degisim takip edilerek tespit edilmistir. Menadion, elektron allEEDolarak kullanianigtlB NADH elektron donörü olarak kullanilBwlStB Elektron alIEEblarak menadion kullanan NQ01 standart enzim deneyi ve aynEl zamanda iki tekelektronlu oksidoredüktaz enzimlerin degerlendirilmesi: Bu degerlendirilmistir. Reaksiyon ortamÇlTris-HCI tamponunda (50 mM, pH 7.5) 77 uM sitokrom 6 (pratik derecesi; Sigma) ve %0.14 s[g]IElserumu albuminin içermistir. NQ01 aktivitesi, ara elektron donörü olarak NADH ( kullanilârak ölçülmüstür. Her bir deney, 10 |JM dikoumarol mevcudiyetinde tekrar edilmistir NQOl'e atfedilen aktivite, dikoumarol tarafIan inhibe edilen aktivite olmustur (Hollander ve donörü olarak NADH ( kullanilârak ölçülmüstür ve NADstitkrom P-450 redüktazübir Beckman DU 640 spektrofotometresinde (Beckman Coulter, Fullerton, CA) elektron donörü (45) olarak NADPH ( kullanilârak ölçülmüstür. Reaksiyonlar 37 °C'de uygulanmßtlîl ve S9 süpernatantlarlEJI eklentisi ile baslatilîhlgtlEI 10 ila 40 pL aral[giIia çesitli süpernatant miktarlarüprotein konsantrasyonu ile oranlarliîl dogrusall[glIEltemin etmek için kullanIJB1IStE Enzim aktiviteleri, sitokrom dsi azaItUBilgldakika/ug proteinin nmol'ü olarak, 550 nm OD'de ilk degisim oranü/e 21.1 mM/cm sitokrom c'sine özgü bir tükenme katsay- dayallîiblarak hesaplanmlgtlEI Gösterilen sonuçlar, üç ayrühücre ekstraksiyonu ± S.D. veya iki kopya halinde deneyden her iki deger için ortalama enzim aktivitesidir. NADH geri dönüsüm deneyleri-Deneyler, MCF-7:W58 veya diger kanser veya normal hücrelerden, saflastlülîhlgl NQ01 veya S9 ekstraktlarElle uygulanmlstlü SaflastlEIIBilgl NQ01 kullanan deneylere yönelik olarak, 1.509 rekombinant insan NQ01, 50 mM potasyum fosfat menadion eklentisi ile baslatiliilStB ve 340 nM absorbansta olan degisim zamanla ölçülmüstür. MCF-7:W58 S9 ekstraktlarEkullanan deneylere yönelik olarak, yaklaslEl olarak lap veya menadion eklentisi ile baslatilîhlgtlîl ve 340 nM abosorbansta degisim, 10 dakikallgll ölçülmüstür. Tüm reaksiyonlar aynthamanda tüm ölçülebilir NQ01 aktivitesini inhibe eden 10 |JM dikoumarol mevcudiyetinde de uygulanmlgtlEl Sonuç/ar ß-Iap'I önerilen NQ01 ile harekete geçirilen faydaslZ döngüsü (Sekil 28A) (Pink ve ark., J Biol Chem. konkomitant üretimi ile oksijen (Oz) tüketiminin hlîlandlîllmlgl bir oranIEöngörmüstür. (231-NQ-) NQOl'i eksprese eden (231-NQ+) veya (231-NQ-) NQOl'den mahrum olan üçlü negatif (Her2-, PR-, ER-) MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri kullanllârak, 02 tüketimi, bir Ocean Optics 02 sensörü ile bir kapalßistemde dogrudan ölçülmüstür (Sekil 28B). KCN ve oligomisin kullanan uygun kontroller uygulanmlgtlîl (Sekil 29). NADH, NQ01 enzimatik aktivitesi ve ß-lap, dikoumarolün, 231-NQ+'da bildirilen, fakat 231-NQ-hücrelerinde bildirilmeyen doza bagIiIü ß-lap ile indüklenmis 02 tüketimini önlemesinden dolaylîlclayanllZllIfaydasE dönüsümü ve sonrasIa Oz tüketimi için gerekli bilesenler olmustur (Sekil 28B; aynüamanda diger meme kanseri hicre dizilerine yönelik Tablo 3). Tablo 3: Meme kanseri hücre dizilerine yönelik NQ01 aktivitesi, sitokrom-c/mg protein/dakika dikoumarol inhibe edilebilir indirgeme olarak ölçülmüstür. ß-Iap +/-1000 U katalaz veya 50 M dikoumarol ile tedavi edilen meme kanseri hücrelerine yönelik LDsmer, asagi açlKIand [glügibi uzun dönemli sagkalIi deneyleri ile elde edilmistir. ND = tespit edilemedi. Hücre dizisi NQ01 aktivitesi LDso ß-Lap LD50 ß-Lap LDso ß-Lap+DIC nMoI/dakika/ug +CAT *231- ND 10 10 10 HMEC 1585 < 10 10 NA NA 231-NQ+'ya karsEl231-NQ- hücre ekstraktlarElkullanIlgIIa, 02 tüketimi, ß-lap ile 4 saatligine ~40-kat artmlgtlEl(Sekil 28B). ß-Lap redoks döngüsü, 15 HM ß-lap mevcudiyetinde bile 231-NQ- hücre ekstraktlarükullanllglükja gözlemlenmemistir. Önemli bir biçimde, dikoumarol mevcudiyetinde NQ01+ ekstraktlarlütla 02 tüketimi, 231-NQ- hücrelerinden bildirilene istatistiksel olarak benzer olmustur (Sekil 288). Bu veriler, ß-lap'lül, herhangi bir enzimatik olmayan, spontane iki tek elektron geriye reaksiyon leisIa 02 tüketen NQOl* hücrelerde redoks döngüsüne tabi oldugu hipotezini desteklemektedir (Sekil 28A). NQOl'e bagIiIEDZ tüketimine, 02" (Sekil 28C) ve Hzoz'de (Sekil 28D) çarpiîlîlartlîslar eslik etmistir. NQOl birincil olarak bir sitosolik protein oldugu için, sitosolik H202 seviyelerindeki çarplîlîl yükselmelerin, ß-Iap'a maruz blBikHân NQ01+ kanser hücrelerinde öncesinde bildirilen DNA baz ve tek sarmal kopma (SSB'Ier) formasyonu için gerekli ana ROS türleri olmasiZl önemli ROS yoklugu, hücrelerin 2 saatligine ß-Iap'a maruziyeti içerisinde, ilacül, bSR ve p450R ile yönlendirilen tek elektron oksidoredüktazlar için nispeten zaylîl bir sübstrat olmustur (Sekil 28A). Buna karslEl, hücrelerin doksirubisine (DOX, 5 uM, 2 saat) veya H202'ye esdeger 02: veya H202 seviyeleri ile sonuçlanmSIlB 2. Ölümcül ß-lap dozlarlJPARPi hiperaktivasyonu için gerekli DNA hasarII esik seviyelerine yol açmaktadlIi Malzeme/er ve Yöntem/er Nispi sagkalmi deneyleri: Hücreler, yukari açiKlandIgiElgibi kültürlenmis ve tedavi edilmistir. 2-4 saatlik ilaç tedavileri ile birlikte veya bu tedaviler olmadan bir 7-10 günlük süreç üzerinde bir Perkin Elmer HTS 7000 Bio Assay Reader mikrotitre plaka okuyucusunda Hoechst floresan ile DNA içerik ölçümleri kullan [lârak nispi sagkaIIi deneyleri aç[Eland [gllgibi edilmistir ve veriler, nispi sagkaIIi (tedavi edilmis/kontrol X %100) ortalama ±SEM olarak eksprese edilmistir. Bu deney kullanilârak elde edilen sonuçlar, dogrudan koloni olusturabilen nispi sagkali egrilerinin seklini aç[lZlamak için kullanllîhlgtlîl Bu modelde, çoklu öldürme eyleminden ve benzer esik (Dq) dozlarIan elde edilen bir nihai egim (Do), egri desteginin boyutunu veya genisligini temsil etmek için kullanilüilgtlü Ekstrapolasyon sayElIn), destek genisliginin bir ölçümüdür. Üç parametre (n, D0 ve Dq), logen : Dq/Do ekspresyonu ile iliskili olmustur. Uzun dönemli sagkalmi deneyleri: Uzun dönemli nispi sagkaIIi deneyleri, öncesinde 7-10 gün süreci boyunca takip edilmistir. Hücreler, 2 saatligine dikoumarol ile ve dikoumarol olmadan ß-Iap ile tedavi edilmistir. DNA içerigi, açlKIandlgJÜgiibi bir Perkin Elmer HTS 7000 Bio Assay mikrotitre plaka okuyucusunda Hoechst floresanEilIe belirlenmistir (Pink ve ark., J Biol edilmistir. Deneyler, en az üç defa tekrar edilmistir ve veriler, ortalama ±SEM olarak eksprese edilmistir. Bu deney kullanüârak elde edilen sonuçlar, dogrudan koloni olusturabilen epitelyal hücreler, insülin, insan epidermal büyüme faktörü ve hidrokortizon ile takviye edilen MGEM/DME:F12'nin 50:50 oranlEUa bir karlglmüçeren büyüme ortamlaria 48 kuyucuklu kaplarda plakalanmlgtß Komet deneyleri: DNA hasarlZl alkalin komet deneyleri ve ölçülen kuyruk migrasyon kuyruklarÇltersine çevrilmis bir Nikon Eclipse TE2000-S floresan mikroskopu (Melville, NY) ve MetaMorph version 6.3 yazll]]îill:l(MoIecular Devices, Downingtown, PA) kullanüârak görsellestirilmistir. Görüntüler, bir QImaging Retiga 2000R dijital kamera (Burnaby, BC, Kanada) kullanllârak yakalanmlîstlElNIH Image] yazilJBJl kullanllârak analiz edilmistir. KometI kuyruk uzunluklarÇlmikronlar ve ortalama uzunluklar olarak ölçülmüstür, ±SEM'In, üç kopya halinde üç bagIislZdeneyden uyguland [glübildirilmistin PARP1 bölünmesine yönelik Western blot analizleri: 10 cm kaplarda ekilen MCF-7 hücreleri, 2 saatligine hepes tamponunda, pH 7.4, çözülen 1000 U katalaz yoklugunda veya mevcudiyetinde 4 M ß-lap ile tedavi edilmistir. Hücreler daha sonrasIa yeni ortamlarda sunulmus ve 24 saatligine 37 °C'de inkube edilmistir. Hücreler daha sonrasIda PARP1 Iizis tamponunda çlKlarllBügtB Lizatlar, %10 SDS-PAGE'de çözülmüs ve PVDF membranlar- immünoblotlanmlgtlîlve bir monoklonal PARP1 antikoru (SC-8007) ile problanmlgtß Sonuç/ar ß-Iap'I artan konsantrasyonlara maruz bßkllân NOQ1+ insan kanser hücrelerinin ölümcüllük yanEIhrlIibldukça keskindir 2-4 saatlik 1-2 uM tedavileri ölümcül olmamlSIlEl fakat 2-3 uM kademeli artlglar, güçlü TUNEL boyasEtarafIan gösterilen %90 hücre ölümü doz yanlflbrllül, ~1OO birim NQOl'i eksprese eden NQ01+ hücrelerde ß-lap'I faydaslîl döngüsünden kaynaklandigiEI'iipotezinde bulunmustur (20). Dolaylglýla, subletal (1 uM, 2 saat) ve ölümcül (2 uM, 2 saat) ß-Iapakon dozlarÇl 231-NQ+ hücrelerinde belirlenirken (Sekil 30A), 231-NQ-hücreleri ve normal insan memeli epitelyal hücreleri (Sekil 308 ve Sekil 31) yanißlîlkalmlgtß ROS olusumu (GSSH oksidasyonunun yüzdesi, % GSSG formasyonu ile takip edilmistir), zamanla 231-NQ+ hücrelerinde olusturulan ROS'de herhangi bir istatistiksel fark göstermemesine (p0.5) ragmen (Sekil 30C), kimyasal ROS radikal temizleyici N-asetil sistein (NAC) ile ön ve birlikte tedaviler, 2 pM ß-Iap'LEl (fakat 3 pM degil) ölümcül etkilerine karslîlkorunmustur. Bu, ROS temizleyicilerinin, NQ01+ hücrelerinin ß-Iap'a olan ölümcül yanlflbria bir önemli sito koruyucu faktörü sunabildigini, fakat bu zaylîltemizleme isleminin kolay bir sekilde üstesinden gelinebildigini göstermistir. 231-NQ- hücrelerinde sadece küçük oksidatif gerilim bildirilmistir (Sekil 30D). Komet deneyleri daha sonrasIa 231-NQ+'ya karslZI231-NQ- hücrelerde çesitli ß-Iap dozlarII yol açtl'gllîl DNA IezyonlarII ölçüsünü (temel hasar, SSB'Ier ve DSB'Ier) degerlendirmek için kullanHBilStlEl(Sekil 32A). 1 iJM ß-Iap'I bir subletal doz, önemli GSSG formasyonunu üretmesine ragmen (Sekil 30C), bu aynEldoz, bir 2 saatligine bir tedavi seyrinde önemli DNA hasarlEb yol açmamßtlEl (Sekil 32A). Buna karslEl, 2 uM ß-lap (bir ~LD70 doz) ve yanüamanda 4 ve 6 |JM ß-Iap'I ölümcül dozlarÇlyükselmis GSSG seviyeleri (Sekil 30C) tutarllZbIarak önemli ve dozu artan DNA hasarIthamanla indüklemistir (Sekil 32A). Çesitli ß-Iap dozlarüile 231-NQ-hücrelerinin benzer tedavileri, ROS ve H202 formasyonunun yoksunlugu ve NQOl-hücrelerinde ölümcüllükle tutarlEbIarak önemli DNA ß-lap tedavisinden sonra NQ01+ hücrelerinde hücre ölümüne, PARPl hiperaktivasyon ve sonraki programlanmlglnekrozdan (REF) dolayliarpEElNAD+ kaylîilarßslik etmistir. Asllîida, 231-NQ+ hücrenin ß-Iap'I (1 (M) ölümcül olmayan dozlara maruziyeti, ölçülebilir PAR formasyonu ile sonuçlanmazken, NAD+ veya DNA lezyonlar.. kaybÇl ß-Iap'I (2 uM) sitotoksik dozlar, dönüsüm sonrasÜAR ile modifiye edilmis ve etkisiz hale getirilmis PARPl'in (PAR, Sekil 32C) hazßkosulda akümülasyonu ile gösterilen PARP-l hiperaktivasyonu (Bentle sonuçlanmlStIEl (Sekil 30A, 328, 32C). Zay[ElPAR formasyonu, artan ß-Iap dozlarIEa zaman olarak (dakika) önceden zirve yapmlgl olan 2 pM ß-Iap'dan (Sekil 32C, 2 ;M ila 6 ;M ß-lap maruziyetlerini klýlaslaylül) 30 dakika sonra bildirilmistir. Daha yüksek ß-Iap dozlar. yanilîl olarak zirve PAR formasyonu için bildirilen azalan süreye, hücre içi NAD+seviyeIerinin çarplEEl olarak düsmesinden dolayDîilîlEiiiazlElkosulda PAR kayliîlar eslik etmistir (Sekil 328). 3. Kata/az, ß-Iap ile indüklenen HZOZ formasyonunu detoksifi'ye etmektedir ve site koruyucudur Ma/zeme/er ve Yöntem/er Hücre kültürü, tedavisi, ROS deneyleri, sagkaIIi deneyleri ve komet deneyleri, yukar- açügandlgiügibi uygulanmlgtiü TUNEL deneyleri: TUNEL, açklandlgiEgibi kontrol veya ß-Iap ile tedavi edilen hücrelerde göre aklgl sitometrisi ile analiz edilmistir (APO-DIRECT kit, Pharmingen, San Diego, CA). Veriler, üç ayrüleneyden ortalama +SEM olarak eksprese edilmistir. Sonuç/ar 02: ve HZOZ, ß-Iap ile tedavi edilmis 231-NQ+ hücrelerinde spesifik olarak olusturuldugu ve önceki kan[El DSB'Ierin formasyonu olmadan NQOl'e bagllEBSB'lerin özel formasyonunu hücrelerde katalaz aktivitelerinin (Hzoz'yi oksijen ve suya dönüstürmektedir) sito koruyucu olmaslîidan süphelenilmistir. Asllîida, 1000 birim katalazIEl eksojen eklentisi, ß-Iap ile tedavi edilmistir 231-NQ+ hücrelerindeki H202 seviyelerini önemli ölçüde azaltlîlken (Sekil 33A, sol panel), eklenti, 02: formasyonunda herhangi bir etkiye sahip olmamlStEl (Sekil 33A, sol panel). Eksojen Mn ya baglilßüperoksit dismutaz (MnSOD) uygulamasÇIHzoz seviyelerini önemli ölçüde arttEElken (Sekil 33A, sag panel), 02= formasyonunu azaltmStEl(Sekil 33A, sag panel). Eksojen SOD ve katalaziEI birlikte eklentisi, HZOZ (Sekil 4A, sol panel) ve 0-7" (Sekil 33A, sag panel) seviyelerinin arttlEliBialetla daha etkili olmustur. Bu sonuçlar, eksojen katalaz uygulamaleIlEi, ß-Iap ile tedavi edilen 231-NQ+ hücrelerinde RSO (spesifik olarak HZOZ) üretimini önemli ölçüde önledigini ve SOD eklentisinin, bu temizleme aktivitesini arttlüiglülîgüçlü bir sekilde göstermistir. Son olarak, MCF-7 hücrelerinde bir CMV ile harekete geçirilen katalaz ekspresyon vektörü (Open Biosystems) kullanüârak katalaz. eksojen aslElEl ekspresyonu (Sekil 33B), 2-4 |JM aral[g]Ia dozlarda ß-Iap ile indüklenen NQ01+ hücrelerini önemli ölçüde korumustur. Eksojen katalaz eklentisi (Sekil 32), NAC tedavilerinden çok daha etkili olmustur (Sekil 30A). Katalaz (2500 birim), 231-NQ+ hücrelerinde ß-lap'I ölümcül etkilerden hücreleri önemli ölçüde korurken (Sekil 33C), ß-lap ile tedavi edilen 231-NQ-hücrelerinin sagkalIiEl etkilenmemis kalmEtlEl(Sekil 33D). MnSOD ile katalazüaksojen olarak birlikte uygulanmaslZl uzun dönemli sagkalli ile ölçülen ß-lap ile indüklenen ölümcüllügün etkili bir sekilde önlenmesi için gerekli kalataz konsantrasyonunu önemli ölçüde azaltmlStlE (Sekil 33E). Örnegin sadece 125 U eksojen katalaz, ortama uygulanmlgtlE(MnSOD, (slfa'sslîla Sekil 33C ve 33E, (p<. Katalaz. benzer gelismis sito korumasü MnSOD ile birlestirildiginde tüm dozlarda bildirilmistir (MnSOD olmadan veya MnSOD ile katalaz tedavilerini klýaslayl (sßslýla Sekil 33C ve 33E (p50.01)). Buna karslEl, eksojen katalaz eklentisi, MnSOD mevcudiyetinde veya yoklugunda ß-lap'a dirençli 231-NQ- hücrelerinin sagkalIiIEtkilememistir (Sekil 33F). DolayElýla, katalaz aynlîamanda komet deneyleri (Sekil 34A), PAR-PARPl formasyonu (Sekil 34C), NAD+ kaybü(SekiI 34D) ile takip edilen NQ01+ 231 hücrelerinde asagElyönde ölümcüllük yanElhrlElEbastlElnlStlB Katalaz uygulamaslîlaynlîtamanda atipik PARP1 ve p53 proteolitik bölünmesini (Sekil 34E ve Sekil 35) ve ß-lap ile indüklenen programlanmlg nekrozla benzersiz bir sekilde iliskili olan apoptotik yanlflarIEönlemistir (TUNEL yanlflhrIEl etkili bir sekilde bloke etmistir, Sekil 34F). Buna karslEl, katalaz, ß-Iap'a dirençli 231-NQ- hücrelerini etkilememistir (Sekil 34A). 4. ß-Lap ile indüklenen pragramlanmgnekroz, nükleusa AIF translakasyonu eslik etmektedir Malzeme/er ve Yöntem/er Hücre kültürü ve islemi yukar- açlEland[g]l3g]ibi uygulanmlSIlEl Western Blotlamasüie antikorlarEl PARP1 bölünmesine yönelik Western blot analizlerine yönelik olarak, 10 cm kaplarda ekilen MCF-7 hücreleri 2 saatligine hepes tamponun, pH 7.4, çözülen 1000 U katalazII yoklugunda veya mevcudiyetinde 4 M B-Iap ile tedavi edilmistir. Hücreler daha sonrasIa yeni ortamlarda sunulmus ve 24 saatligine 37 °C'de inkube edilmistir. Hücreler daha sonraslda PARP1 lizis tamponunda çlKlarllBîlStlEl Lizatlar, %10 SDS- PAGE'de çözülmüs ve PVDF membranlar- immünoblotlanmlgtlîlve bir monoklonal PARP1 antikoru (SC-8007) ile problanmlStlEl Western blot analizleri, aç[lZland[gll:gibi uygulanmlgtlEl kullanllBwlStlEl(Abcam Inc., Cambridge, MA), anti-a-tubulin, 1:10,000 oranlEda bir seyreltide kullanllßilgtlîl (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) ve a-PAR, 1:2000 oranükja bir seyreltide kullanllüilgtlîl (BD-Pharminigen, San Jose, CA). Nispi PAR seviyeleri, PARP1 yükleme kontrolleri kullanHârak NIH ImageJ vasltEislgla densitometrik analizlerle hesaplanmßtß Ölçümler, t = 0 seviyelerine normallestirilmistir. Western blotlarüen az üç defa uygulanan ayrljleneylerin temsilidir. Sonuç/ar ß-Lap araclIDIöIümcüIlük genellikle nekrozun (enerjiye bagIiIlIlve apoptozun (bir 2 saatlik darbe sonrasIa özelliklerini sergiledigi için programlanmlgnekroz olarak ifade edilmektedir. MCF-7 hücrelerin (Sekil 36A) 4 pM ß-Iap'I Zsatlik bir darbesine maruziyeti, PARPl'in öncesinde bildirilen atipik 60 kDa proteolitik bölünme fragmanIElindüklemistir (Pink ve ark., J Biol Chem. fragmanIElsunmustur (N89 kDa, Sekil 36A). Bu benzersiz nekrotik hücre ölümü yolunda kalsiyumun yolunu betimlemek için, MCF-7 hücreleri, [3 maruziyetinden önce kalsiyum selatörü, BAPTA-AM veya pankaspaz inhibitörü, Z-VAD ile önceden yüklenmistir. PARPl'in ß- Lap araclIJJJJroteolizi (ve uzun dönemli ölümcüllük), bir NQ01 inhibitörü olan dikoumarol ile birlikte tedavi edici olan hücrelerin etkilerine benzer olarak BAPTA-AM ile NQ01+ hücrelerin önceden tedavi edilmesi ile önlenmistir. Buna karsiEl, Z-VAD, bir pan-kaspaz inhibitörü ile ön tedavi, ß-Iap ile indüklenen proteoliz veya ölümcüllügün inhibe edilmesinde etkili olmazken (Sekil 36A), önce bildirilere benzer olarak klasik saurosporin araclIJDapoptotik PARP1 Mitokondriden AIF sal."a ß-Iap tedavisinin etkileri, ortaya çllîhrllân NQ01+ hücrelerde takip edilmistir. MCF-7 hücrelerinin maruziyeti, ortaya çllZlarllân hücrelerin nükleuslar- (bkz. tedaviden mitokondriden (DMSO, Sekil 368) AIF aktivasyonuna ve hareketine yol açmlStlÜ ß-Iap ile tedavi edilen NQ01 + 231 meme kanseri hücrelerinde AIF aktivasyonu, ß-Iap maruziyetlerinden sonra u-kalpain aktivasyonunun kinetikleri ile tutarIEl olmustur (Tagliarino ve ark., J Biol Chem. aktivasyonu, BAPTA-AM ile (Sekil 36C) ve aynüamanda 1000 U katalaz ile (Sekil 36D) bloke edilmistir. Fakat siRNA aradHDAIF nakdavnÇl ß-lap ile tedavi edilen MCF-7 hücrelerin ölümcüllügünü sadece klêinen azaltmlgtlîl (Sekil 36E); AIR'nin geçici ve/veya stabil siRNA (veya stabil transfeksiyon için siRNA) nakdavnüaçllîlandglîgjibi uygulanmlgtlîlm ve ark., Clin. modifikasyonu/aktivasyonu dahil (Sekil 36F) diger hücre ölüm aracllârII eszamanIEl aktivasyonundan kaynaklanmasII oldukça muhtemel oldugu, apoptotik benzeri hücre ölümü yanlfibrIElyönlendirebildigi teorisinde bulunduk (Hara ve ark., Nat Cell Biol. (Sekil 37), PARP1 hiperaktivasyonu, ROS üretimi vasltîlilea DNA hasarDndüksiyonu ve ölü hücreleri `temizlemek' için tasarlanan çesitli proteazlarI aktivasyonu kaynaklünetabolizma çarpEJIegisimler dahil bir dizi asagljönde hücre ölümü aracllârEile iliskilendirilmektedir. Kemo dirençli üçlü negatif (ER-, PR-, Her2/Neu-) MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri, ß- faydasi döngüsünü baglamak için kullanilBilgtE ß-lap'a esik seviyesi yanlflbrÇl en olasEl sekilde DNA hasarIEl/e PARP1 hiperaktivasyonunu indükleyen hidrojen peroksit üretiminde çarplEEl yükselmelerle sonuçlanan subletal süperoksit seviyelerinin formasyonu ile yönlendirilen bir doza bagilüietikleyici ile belirtilmistir. Veriler, hidrojen peroksidin, bu maddenin ölümcül etkileri için gerekli ROS türlerini birincil olarak zorunlu hale getirmesi düsünesiyle tutarlEIolarak ve bu tümör-seçici antitümör maddesinin yol açtigElSSB'lerin spesifik indüksiyonu ile tutarllZloIarak eksojen katalaz eklentisinin veya aslEIlZrlakspresyonun, ß-lap ölümcüllügünü önledigini göstermektedir. DahasÇl SOD'nin birlikte eklentisi, katalazIEl, ß-Iap ile indüklenen hücre ölümünü önledigi verimliligi spesifik olarak gelistirdigi gösterilmistir. Bu veriler, kanser hücrelerinin, bu maddenin toksisitesinden seçici bir sekilde korunabildigi yüksek katalaz seviyelerine sahip olan normal dokuyu göstermektedir. Alternatif olarak, katalazElve/veya MnSOD'yi aslEDeksprese eden kanser hücreleri, "subletal terapötik tedavileri" önlemek için daha yüksek ß-Iap dozlarIEI gerektirecektir. NQOl'in katalaz seviyelerine oranÇl bu sekilde NQ01 "biyoaktivasyonu" vaslüslýla çallghn ß-Iapakon ve diger ilaçlar için tümör seçiciliginin bir ana belirleyicisi olabilmektedir. Bu sekilde, katalaz ve aynElzamanda SOD, önlenmesi gereken ve ß-lap kullanan tedavileri hesaba katmaslîgiereken faktörlerdir. Katalaz, hücreleri, membranlar. ve hücresel organellere hasar veren hidrojen peroksitin, lipid peroksidasyonunu indüklemesinden korumaktadü Eksojen katalazü düsük ß-Iap maruziyet dozlarlEUa sagkalilîlgelistirmesine ragmen, ß-Iap ( 6 M) ile asiEElROS formasyonu (muhtemelen ek ROS türleri dahil), tek baslEla katalaz ile inhibe edilememektedir. Tek bas. SOD bosa girmemistir, fakat herhangi bir etkiye sahip olmamlg ve ß-Iap ölümcüllügünde Hzoz'ün zorunlu rolü ile tutarlEblarak hücre ß-Iap ile indüklenen ölümcüllügünü gelistirmistir. Fakat 500 ile katalazI birlestirilmesi, muhtemelen (02+H20)'ya detoksifiye edilebilen H202'ye süperoksidin dönüstürülmesi vasltâsMa dozlarda (6 pM) telaffuz edilen koruma etkisine sahip olmustur. ß-lap ile ortaya konulan benzersiz öldürme mekanizmasü PARP1 hiperaktivasyonu ile baslatllfnaktadlîl SSB onarIiElslüsIa normal bir sekilde aktif hale getirildiginde PARP1, poli-(ADP-ribozil) polimer modifikasyonunu, spesifik DNA onarIi proteinlerine ve en nihayetinde PARPl'i etkisiz hale getiren ve enzimin DNA'dan kopmaleb yol açan kendisine eklemek için NAD+ kullanmaktadB Bu modifikasyon, basllEla ATP olmak üzere hücresel enerji üretimi için gerekli olan esas nükleotid havuzlarIEton olarak tüketen çarplEElbir NAD+ kaybEl ile sonuçlanmaktadlEl Bu sebepten ötürü, PARP1 hiperaktivasyonu, DNA onarIi makinesini etkisiz hale getiren nükleotid havuzundan dolathücresel yia yol açmaktadlü Katalaz eklentisi, PARP1 hiperaktivasyonunu önlemistir ve AIF'nin maruz blßkilân hücrelerin nükleuslar- geçis yapmasIElönlemistir. Fakat AIF nakavdIlZI hücreleri ß-lap'I ölümcül etkilerinden sadece kßnen ve zaylElbir sekilde korumustur. Çoklu hücre ölümü sinyal yollarlZl bu sekilde ß-lap maruziyetine yaniiîl olarak aktif hale getirilebilmektedir. Asik-aha, AIF saIInIEla ek olarak, apoptoz ile iliskili endonükleaz aktivitesinin aktif hale getirilmesini sagladlglîlgösterilen GAPDH'nin spesifik modifikasyonu gözlemlenmistir (muhtemelen bu protein S-nitrosilasyonu vasüslýla). Atipik PARP1 proteolizi, ß-lap ile indüklenen hücre ölümünün bir özelligidir. DahasÇI atipik proteolizin, u-kalpain aktivasyonundan ve translokasyonundan kaynakland@Egösterilmistin Katalaz, hücreleri ROS ile indüklenen DNA hasarlEUan, AIF salinan, PARP1 proteolizinden ve GAPDH dönüsüm sonrasEl modifikasyondan korudugu için, ROS formasyonu net bir sekilde ß-Iap aracHJIölümcüllükte bir temel ve güçlü rol oynamaktadEI Belirgin olarak katalaz gibi ROS temizleme enzimlerinin ekspresyonu, belirli bir kanserde kullanilâcak olan verimli ß-Iap dozlarII belirlenmesinde dikkate allElnalILEl Örnek 12: NOOl cienotipli kanser hücrelerinde ß-Iapakonun etkisi UT GüneybatEISPORE'den en çok bir 5-panel küçük hücreli olmayan akciger kanseri panelinden hücre dizileri, NQ01 polimorfizm durumu için degerlendirilmis ve daha sonrasIa ß-Iapakon veya standart menadion sübstratlarllullanllârak NQ01 enzim deneyleri için takip edilmistir. Daha sonrasiEkla ß-Iapakon maruziyetlerine (uM, 2 saat) hücre dizisi yaniHhrEl degerlendirilmistir ve dikoumarol (40 M) birlikte tedavileri ile veya bu tedaviler olmadan RFLP ile NQ01 *1/*1 sokak türü sekanslarIan tespit edilmistir. Genomik DNA, Qiagen dönen kolonlarElkuIIanUârak hücrelerden çlKiarlßilgtlE Öncesinde açlEJanan oligonükleotid primerleri kullanilârak, PCR ürünleri, jel elektroforezine tabi olmustur. Son genotipleme, *1/*1 (sokak türü) veya polimorfik *2/*2 veya *3/*3 NQ01 polimorfizmleri için tanlgal olan, ayrilBiEbantlarI boyutuna ve modeline dayalüilarak belirlenmistir. Sonuçlar NQ01 *3 polimorfik hücreler, menadion kullanilârak nispeten düsük enzimatik seviyelere, fakat sübstratlar olarak ß-Iapakon kullanilârak daha yüksek seviyelere sahiptir (Tablo 4). Benzer bir sekilde *2 hücrelerin aksine, bu hücrelerin ß-lapakon tedavisine yanlü oldugu görünmektedir. SasIlElJbir sekilde ve önemli bir sekilde, bu hücrelerin, dikoumarol ile bloke edilmedigi görünmektedir, bu da dikoumarolun, NADH taklit edilerek NQ01'in bir inhibitörü olmasIan dolayEl olusturulan enzimin, NAD(P)H'yi münhasßn kullanabildigini göstermektedir. Bu veriler, *3 tümörlerine sahip hastalarlEl, ß-Iapakona ve aynlZlzamanda diger NQ01 biyolojik olarak aktif hale getirilebilir ilaçlara hala yaanerecegini güçlü bir sekilde göstermektedir. Tablo 4: NQ01 genotiplenmis kanser hücrelerinde ß-Iapakon etkisi. SayEl Hücre Dizisi/Türü NQ01 Genotipi NQ01 aktivitesi B-Lap LD50+DIC nMol/dakika/ug Men;ß-Lap ölümcüllügü Mevcut bulusun tercih edilen yapüândlEinalarEgösterilirken ve burada açllZlanlElken, bu tarz yapllândlElnalarlEl, sadece örneklendirme yoluyla saglandfglüteknikte uzman kisiler tarafIan anlasüâcaktlü Çesitli varyasyonlar, degisiklikler ve ikameler, bulusun kapsamIan ayrHIhaks- teknikte tecrübe sahibi kisiler için verilecektir. Burada tarif edilen bulusun yapllândülnalarlîia yapllân çesitli alternatiflerin, bulusun uygulanmaleUa kullanllâbilecegi anlasHIhaIIlEl Asag-ki istemlerin, bulusun kapsamIElaçlKlamasü/e bu istemlerin kapsamEl dahilindeki yöntemlerin ve yapHârlEl ve bunlar. es degerlerinin bu sekilde kapsanmasEl amaçlanmaktad E TR TR TR TR TR
TR2018/07363T 2010-09-22 2011-09-22 Hedefleyici nqo1 i içeren kanser tedavi yöntemleri. TR201807363T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38541110P 2010-09-22 2010-09-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201807363T4 true TR201807363T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=45874170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/07363T TR201807363T4 (tr) 2010-09-22 2011-09-22 Hedefleyici nqo1 i içeren kanser tedavi yöntemleri.

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9469878B2 (tr)
EP (1) EP2619331B1 (tr)
DK (1) DK2619331T3 (tr)
ES (1) ES2671248T3 (tr)
HU (1) HUE037382T2 (tr)
NO (1) NO2619331T3 (tr)
PL (1) PL2619331T3 (tr)
PT (1) PT2619331T (tr)
TR (1) TR201807363T4 (tr)
WO (1) WO2012040492A1 (tr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2768308T (pt) 2011-10-14 2018-07-24 Univ Texas Compostos e substratos anti-tumorais nqo1
EP2984184B1 (en) 2013-04-09 2020-11-25 The Board of Trustees of the University of Illionis Use of dnq or dnq-87 in combination with a parp1 inhibitor for the treatment of cancer
CN103667447A (zh) * 2013-11-04 2014-03-26 武汉艾迪康医学检验所有限公司 用于检测nqo1基因多态性的引物、试剂盒及其在病理检测上的应用
WO2019156684A1 (en) * 2018-02-12 2019-08-15 Solugen, Inc. Hydrogen peroxide production method, system, and apparatus
MX2021011301A (es) * 2019-03-18 2022-01-19 Univ Texas Terapia combinada especifica contra tumores.
US20240197709A1 (en) * 2022-12-20 2024-06-20 The Trustees Of Indiana University Potentiating the tumor-selective effects of nqo1-bioactivatable agent by use of cmet inhibitor

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2273688T3 (es) 1999-04-14 2007-05-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Procedimiento y composicion para el tratamiento de cancer.
EP2060259B1 (en) * 2001-11-01 2010-01-20 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Medical compositions for intravesical treatment of bladder cancer
US6890950B2 (en) * 2002-04-23 2005-05-10 Case Western Reserve University Lapachone delivery systems, compositions and uses related thereto
WO2006020719A2 (en) 2004-08-11 2006-02-23 Arqule, Inc. Aminoacid conjugates of beta - lapachone for tumor targeting
JP5457036B2 (ja) * 2006-02-09 2014-04-02 スペクトラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 腫瘍酵素レベルの決定を含む膀胱癌の処置
US20080248097A1 (en) 2007-02-26 2008-10-09 Kwon Glen S Polymeric micelles for combination drug delivery
WO2012039741A1 (en) 2010-09-22 2012-03-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Novel block copolymer and micelle compositions and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2619331A1 (en) 2013-07-31
EP2619331A4 (en) 2014-03-05
US9469878B2 (en) 2016-10-18
ES2671248T3 (es) 2018-06-05
HUE037382T2 (hu) 2018-08-28
EP2619331B1 (en) 2018-02-28
US20130253046A1 (en) 2013-09-26
DK2619331T3 (en) 2018-06-06
WO2012040492A1 (en) 2012-03-29
PT2619331T (pt) 2018-06-01
NO2619331T3 (tr) 2018-07-28
PL2619331T3 (pl) 2018-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Franqui-Machin et al. Destabilizing NEK2 overcomes resistance to proteasome inhibition in multiple myeloma
Pratt et al. Human carboxylesterase-2 hydrolyzes the prodrug of gemcitabine (LY2334737) and confers prodrug sensitivity to cancer cells
Chartrain et al. Melanoma chemotherapy leads to the selection of ABCB5-expressing cells
Colla et al. Glutathione-mediated antioxidant response and aerobic metabolism: Two crucial factors involved in determining the multi-drug resistance of high-risk neuroblastoma
Wang et al. Synergistic lethality between PARP-trapping and alantolactone-induced oxidative DNA damage in homologous recombination-proficient cancer cells
Daniele et al. RETRACTED ARTICLE: Combined inhibition of AKT/mTOR and MDM2 enhances Glioblastoma Multiforme cell apoptosis and differentiation of cancer stem cells
Wilson et al. Inhibition of dUTPase induces synthetic lethality with thymidylate synthase–targeted therapies in non–small cell lung cancer
Subhi et al. Loss of methylthioadenosine phosphorylase and elevated ornithine decarboxylase is common in pancreatic cancer
Martinez-Outschoorn et al. Hereditary ovarian cancer and two-compartment tumor metabolism: Epithelial loss of BRCA1 induces hydrogen peroxide production, driving oxidative stress and NFκB activation in the tumor stroma
Qiu et al. MEN1 deficiency leads to neuroendocrine differentiation of lung cancer and disrupts the DNA damage response
EP2619331B1 (en) Methods of treating cancer comprising targeting nqo1
Hunter et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer
WO2012009475A1 (en) Methods of treating cancer with inhibition of lysine-specific demethylase 1
Vodenkova et al. Base excision repair capacity as a determinant of prognosis and therapy response in colon cancer patients
Yan et al. Combined treatment with temozolomide and methoxyamine: blocking apurininc/pyrimidinic site repair coupled with targeting topoisomerase IIα
Yan et al. Inhibition of uracil DNA glycosylase sensitizes cancer cells to 5-fluorodeoxyuridine through replication fork collapse-induced DNA damage
Donati et al. Oxidative stress enhances the therapeutic action of a respiratory inhibitor in MYC‐driven lymphoma
Kanakkanthara et al. Repurposing ceritinib induces DNA damage and enhances PARP inhibitor responses in high-grade serous ovarian carcinoma
Kochhar et al. p53 modulates Hsp90 ATPase activity and regulates aryl hydrocarbon receptor signaling
Singh et al. Serine phosphorylation of glutathione S-transferase P1 (GSTP1) by PKCα enhances GSTP1-dependent cisplatin metabolism and resistance in human glioma cells
Boland et al. Targeting the 19S proteasomal subunit, Rpt4, for the treatment of colon cancer
Yang et al. Glutamine synthetase shields triple-negative breast cancer cells from ferroptosis in metastasis triggered by glutamine deprivation
Fimognari et al. Sulforaphane potentiates RNA damage induced by different xenobiotics
Zhan et al. Mechanisms of cisplatin sensitivity and resistance in testicular germ cell tumors and potential therapeutic agents
Tang et al. Expression of glutathione S-transferase M2 in stage I/II non-small cell lung cancer and alleviation of DNA damage exposure to benzo [a] pyrene