TR201809154T4 - Onkojeni̇k hpv vi̇rüsleri̇ni̇n varliğinin beli̇rlenmesi̇ i̇çi̇n tarama testi̇. - Google Patents
Onkojeni̇k hpv vi̇rüsleri̇ni̇n varliğinin beli̇rlenmesi̇ i̇çi̇n tarama testi̇. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201809154T4 TR201809154T4 TR2018/09154T TR201809154T TR201809154T4 TR 201809154 T4 TR201809154 T4 TR 201809154T4 TR 2018/09154 T TR2018/09154 T TR 2018/09154T TR 201809154 T TR201809154 T TR 201809154T TR 201809154 T4 TR201809154 T4 TR 201809154T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- hpv
- seq
- probe
- labeled
- sample
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 244
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 title claims abstract description 81
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 81
- 238000012216 screening Methods 0.000 title abstract description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title abstract description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 287
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 396
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 93
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 80
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 74
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 58
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 58
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 30
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims description 5
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 2
- -1 /or Species 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 abstract description 23
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 23
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 abstract description 23
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 67
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 36
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 21
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 21
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 14
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 13
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 9
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 208000007879 Atypical Squamous Cells of the Cervix Diseases 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 5
- 102100030826 Hemoglobin subunit epsilon Human genes 0.000 description 4
- 101001083591 Homo sapiens Hemoglobin subunit epsilon Proteins 0.000 description 4
- 101100540286 Human papillomavirus type 16 E1 gene Proteins 0.000 description 4
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 3
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 241001061257 Emmelichthyidae Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000364021 Tulsa Species 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 102100025230 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010087522 Aeromonas hydrophilia lipase-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101150070189 CIN3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 190000008236 Carboplatin Chemical compound 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940124957 Cervarix Drugs 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 208000004145 Endometritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229940124897 Gardasil Drugs 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 1
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010062233 Uterine infection Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011360 adjunctive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000002725 brachytherapy Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 101150005988 cin2 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L magnesium;aluminum;dihydroxide;trihydrate Chemical compound O.O.O.[OH-].[OH-].[Mg+2].[Al] ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000008722 morphological abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011470 radical surgery Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical group C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Buluş, rahim ağzı kanserinin önlenmesi ve erken teşhisinde etkili bir araç olarak, özellikle LNA (kilitli nükleik asitler) teknolojisine dayanan, onkojenik HPV virüslerinin varlığını saptamak için tarama testi ve prosesi ile ilgilidir. Gerçek zamanlı PCR ile HPV tespitinde kullanım için problar, onkojenik HPV genomlarının korunmuş bir bölgesini hedefler.
Description
TARIFNAME
ONKOJENIK HPV VIRÜSLERININ VARLIGININ BELIRLENMESI IÇIN TARAMA TESTI
Teknik Alan
Bulus, rahim agzi kanseri tanisal alani ile ve özellikle rahim agzi kanserinin önlenmesi ve
erken teshisinde yeni bir araç olarak, tercihen LNA (kilitli nükleik asitler) teknolojisine
dayanan onkojenik HPV virüsleri için tarama testi ile ilgilidir.
Önceki Teknik
Rahim agzi kanseri dünya çapinda hala önemli bir saglik sorunu ve sosyal sorun olan malign
bir tümördür. Her yil dünyada bu hastalikla ilgili yaklasik 500 ,000 yeni vaka teshis edilmekte
ve kadinlarin yarisindan fazlasi hastaliktan ölmektedir. Bütün kadinlar bu türde bir kansere
karsi savunmasiz olsa da insidans ve mortalite açisindan önemli cografi farkliliklar
kaydedilmistir.
Gelismekte olan ülkelerde rahim agzi kanseri vakalarinin yaklasik % 80'i teshis edilir ki bu
hastalik diger genital kanserler ile karsilastirildiginda kadinlarda en basta gelen ölüm nedeni
olabilir. Bu ülkelerde önümüzdeki yillarda vaka sayisinda bir artis beklenmektedir. Gelismis
ülkelerde rahim agzi kanser insidansindaki asagi yönlü egilimler ve düsük mortalite orani,
genel ve sistematik önleme ve modern saglik hizmetlerine daha iyi erisimin saglanmasiyla
iliskilidir.
Polonya rahim agzi kanseri için nispeten yüksek bir insidans ve mortalite oranina sahip olan
ülkeler sinifindadir. Bu, 45 yasina kadar olan kadinlarda en sik görülen ikinci malign
tümördür. Her yil yaklasik 3,500 Polonyali kadina rahim agzi kanseri teshisi konmakta ve
bunlarin yarisi bu hastaliktan dolayi ölmektedir. Bu tür kanserlerden dolayi ölüm sayisi,
Polonya'yi Avrupa'da en üst siralara yerlestirmektedir.
Rahim agzi kanserinin tedavisi hastaligin evresine baglidir ve hastaligin erken evrelerinde
lokal eksizyon ve radikal cerrahi, ileri evrelerde brakiterapi ve eszamanli kemoterapi ile
birlikte radikal radyoterapi ve metastatik hastalik durumunda palyatif bakimdan olusur.
Kemoterapi tedavisinde en çok karboplatin ve paklitaksel kullanilir. Ek ilaçlar ileri vakalarda
hastalarin sagkalim süresini artirabilir. Yakin zamandaki raporlar bu endikasyon için palyatif
bakimda yasam beklentisi parametrelerini Iyilestiren ek tedavi (bevacizumab) uygulamasinin
mümkün oldugunu göstermektedir ancak bu, bu tür bir tedavinin maliyetini önemli ölçüde
etkiler. Platine direnç durumunda tercih edilen ikinci ilaç topotekandir.
2006 Yilinda rahim agzi kanserinin en önemli nedeni olan HPV enfeksiyonlarini önlemeyi
amaçlayan asilar piyasaya sürülmüstür. Gardasil adli bir asinin ABD'de ve Avrupa Birligi'nde
kullanilmasi onaylanmistir. HPV enfeksiyonlarina karsi bir baska asi Cervarix'dir.
Rahim agzi kanseri az sayida malign neoplazmdan biridir ancak bu, bunun gelismesine yatkin
olan medikal durumlarin (örnegin intraepitelyal neoplazi olarak bilinen prekanseröz
lezyonlar) uygun profilaksisi ve erken teshisi ile etkili bir sekilde önlenebilir. Kadinlarda
düzenli olarak yapilan çok katli skuamöz veya glandüler epitelin anormal hücrelerini tespit
etmeye yönelik rahim agzi smearlerin sitolojik incelemeleri simdiye kadar bu tür profilaksinin
temel ve en etkili yöntemi olmustur. Rahim agzi kanserine yönelik popülasyon temelli bir
taramada sitolojik incelemenin kusku götürmez degerine ragmen bu yöntemin temel
kisitliligi yaklasik olarak % 60'Iik nispeten düsük bir duyarliliktir. Birçok bilimsel çalismaya
göre bazi enfekte olmus kadinlarda (aksi halde yüksek riskli virüsler, yüksek riskli HPV, HR -
HPV olarak adlandirilir) rahim agzi epitelinde karsinojenez sürecine dogrudan neden olan
yüzlerce bilinen HPV tipinden 15'inden olusan bir grup onkojenik türde insan papilloma
virüsü (HPV) için kombine bir dizi sitolojik ve moleküler genetik inceleme, ileri prekanseröz
lezyonlarin (CIN2, CIN3, karsinom olarak adlandirilan in situ) saptanmasinda çok daha
etkilidir. Kombine sitolojik ve HPV incelemesinin (% 100'e kadar) yüksek duyarliligina ek
olarak ve sadece sitolojik incelemeye kiyasla sadece biraz daha düsük özgüllüge ek olarak
yöntem ayni zamanda yüksek bir NPV (negatif öngörü degeri) indeksi ile de karakterize edilir.
Bu tür kombine incelemeler özellikle 30 yas üstü kadinlar için tavsiye edilir. Rahim agzi
kanseri için primer taramada HPV testlerinin kullanilmasinin yaninda sitolojiktaniya ek olarak
onkojenik HPV grubunun neden oldugu viral enfeksiyonlarin belirlenmesi de anormal epitel
hücrelerin varligi tespit edilen kadinlarda, özellikle ASC - US ve LSIL (Polonya Jinekoloji
Dernegi ve uluslararasi kurumlarin önerileri) olarak bilinen tani durumunda gelismis tanilama
olarak adlandirilan asamada önerilmektedir. Sitolojik bir preparatta belli anormallikleri olan
kadinlarda onkojenik HPV tiplerinin varliginin test edilmesi, daha spesifik bir tani ve olasi
tedaviye olanak saglar.
Bu nedenle rahim agzi smearlerin sitolojik incelemelerine dayanan popülasyon tabanli
tarama programlarina ek olarak onkojenik HPV tiplerini saptamak için moleküler genetik
testlerin yaygin kullanimi mantikli görünmektedir. Ne yazik ki teknik nedenlerden dolayi
(düsük genom homolojisine sahip birkaç düzine HPV tipinin tek bir analizde analiz edildigi
testlerin yüksek karmasikligi) ve ticari olarak temin edilebilen HPV testlerinin maliyeti
nedeniyle bu tür kombine önleyici incelemeler hem Polonya'da hem de dünya çapinda
popülasyona dayali tarama programlarinda yaygin degildir ve bunlar sitolojik tarama
testlerinde anormal hücrelerin saptanmasi durumunda yalnizca gelismis tanilama asamasiyla
sinirlidir. Diger bir problem HPV testleri için tek tip bir metodik standart olmamasidir.
Hibrit - Yakalama (Digene) yöntemi HPV tanilamasi için altin standart olarak kabul edilir.
Bununla birlikte bu yöntem nispeten düsük tani duyarliligina sahiptir. Ek olarak test bilinen
onkojenik HPV tiplerinin sadece bazilarinin saptanmasina izin verir. HPV diagnostik pazarinda
mevcut olan testlerin çogu, hem maliyet hem de zaman ve is gücü tüketen analizlerin yani
sira rahim agzinin morfolojik anormalliklerinin saptanmasi için yöntemin özgüllügünü azaltan
genotipleme (bireysel HPV tiplerinin belirlenmesi) yöntemlerine dayanmaktadir. Son yillarda
rahim agzi kanseri gelisiminin (tip ayrimi olmaksizin) yüksek riski ile karakterize edilen grubun
HPV'si ile enfeksiyonlarin saptanmasi için DNA amplifikasyon teknikleri (ör. PCR) kullanilarak,
farkli moleküler genetik yöntemlere dayanan klinik kullanim (CE - IVD - sertifikali) için
piyasaya çikan birkaç test onaylanmistir. Bununla birlikte, bunlar genel olarak onkojenik HPV
tiplerinin bir analizini içermezler ve yüksek fiyatlari Polonya'daki rahim agzi kanseri
popülasyonuna dayali tarama testlerinde yaygin olarak kullanimlarini engeller.
Gerçek zamanli PCR yöntemi (gerçek zamanli PCR) artik viral tanilamada yaygin olarak
kullanilmaktadir ancak arastirilan her mikroorganizma için bireysel bir yaklasimi
gerektirmektedir. Tanilama için bu yöntemi kullanmak için testin en yüksek klinik
güvenilirligini ve özellikle bir patojen saptama ve tanilama Özgüllügünün yeterli bir esigini
saglamak üzere reaksiyon kosullarinin yani sira primerler ve moleküler problar olarak
adlandirilan dizileri yeterli sekilde seçmek gereklidir. Tercihen multipleks reaksiyon çoklu
HPV tiplerinin tek asamali olarak teshis edilmesine izin verir, ancak bu son derece zor bir
görevdir ve yüksek bir duyarlilik ve saptama özgüllügü ile karakterize edilen bir testin elde
edilmesini gerektirir.
asitlerinin tanimlanmasi ve nicelenmesi için bir yöntem tarif etmistir. Yöntem bir örnekte
HPV varligini tanimlamak için bir birinci sira tarama olarak 5 bagimsiz gerçek zamanli PCR
analizini ve en yaygin onkojenik HPV tiplerinin varligini ve viral yükünü belirlemek için pozitif
örnekler üzerinde yapilan TaqMan gerçek zamanli PR analizlerini kullanmistir. Quantitative
Real- Time PCR: Methods and Protocols, Bölüm 8 Methods in Molecular Biology, cilt 1160287
- 97 2014'de, Broccolo rahim agzi numunelerinden onkojenik HPV DNA yükünün hizli tespiti
ve ölçümü için otomatik bir ekstraksiyon yöntemine entegre edilmis multipleks gerçek
- 58'i (tek florofor ile birlikte ölçülen HPV - 18 ve - 45) saptamak ve ölçmek için iki multipleks
qPCR analizi (birinci sira tarama) gerçeklestirilmistir. Ek olarak HPV - 18 ve HPV - 45'e özgü bir
multipleks qPCR analizi iki sustan biri için pozitif bulunan numuneleri kesin olarak yazmak
için kullanilmistir. Micalessi vd. yedi multipleks reaksiyonda 17 HPV genotipinin yüksek
verimli tespiti için TaqMan tabanli bir kantitatif gerçek zamanli PCR analizi tarif etmis ve <100
Uygun tanisal ve terapötik prosedürün uygulanmasi için onkojenik HPV tiplerinin varligina
yönelik bir test yapmak için büyük bir talep vardir. Gerçeklestirilen HPV testlerinin sayisi
yüksek maliyetleri ve piyasadaki sinirli erisilebilirlikleri nedeniyle kesinlikle yeterli degildir.
Onkojenik HPV tiplerinin varligi için ucuz ve klinik olarak güvenilir bir testin gelistirilmesi,
rahim agzi kanserine yatkinlik gösteren medikal durumlarin modern tanilayicilarinin
mevcudiyetini önemli ölçüde arttiracaktir. Bu nedenle bulusun amaci sivi ortam (sivi bazli
sitoloji - LBC) üzerinde toplanan bir rahim agzi smearde onkojenik HPV tiplerinin duyarli,
spesifik ve ucuz bir sekilde tespit edilmesine olanak taniyan bir tanisal test gelistirmektir.
Bulusun Açiklanmasi
Bulus bir numunenin onkojenik insan papilloma virüsü (HPV) için test sonucunun pozitif olup
olmadigini belirlemeye yönelik bir yöntem saglar, yöntem asagidakileri içermekte olup:
onkojenik HPV genomlarinin bir hedef bölgesinin gerçek zamanli polimeraz zincir
reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu için primerler ile numunenin birlestirilmesi ve hedef
bölgenin amplifikasyonu üzerine sinyal gönderebilen etiketli bir pan - HPV probu,
gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasi ve etiketli pan - HPV probundan yayilan
bir sinyalin ölçülmesi, burada sinyalin saptanmasi numunenin onkojenik HPV için
pozitif oldugunu gösterir,
pan - HPV probunun, ACTTTCGTTT dizisini (SEQ ID NO: 25) veya bunun geri
tamamlayicisini içeren bir etiketli kilitli nükleik asit (LNA) molekülü olmasiyla
karakterize edilir.
Tercihen pan - HPV probu ACTTTCGTTT (SEQ ID NO: 25) içeren bir etiketli 10 - nükleotit
molekülü veya bunun geri tamamlayicisidir ve / veya pan - HPV probu 5' ucunda bir florofor
ile ve 3' ucunda söndürücü ile etiketlenir ve burada bir hedef bölgenin amplifikasyonu
üzerine yayilan sinyal flüoresanstir.
hedef bölgesinin amplifikasyonu için primerlerin bir kombinasyonu ile birlestirilmesini içerir.
Primerler asagidaki primer çiftlerinden bir veya daha fazlasini içerebilir:
a) HPV16 için SEQ ID NO: 1 ve SEQ ID NO: 14
b) HPVI8 için SEQ ID NO: 2 ve SEQ ID NO:15
c) HPV33/33n için SEQ ID NO: 3 ve SEQ ID NO: 14
d) HPV31 için SEQ ID NO: 4 ve SEO ID NO: 14
e) HPV35 için SEQ lD NO: 5 ve SEO io NO:14
f) HPV39 için SEQ io NO: 6 ve SEQ ID NO: 14
g) HPV45 için SEQ ID NO: 7 ve SEQ ID NO: 15
li) HPV51 için SEQ ID NO: 8 ve SEQ ID NO: 16
i) HPV52 için SEQ ID NO: 9 ve SEO ID NO: 14
j) HPV56/66 için seo ID NO:10 ve SEO ID NO: 14
k) HPV58 için SEQ IDNO: 11 ve SEO io NO: 14
i) HPV59 için SEQ io NO:12 ve seo ID NO:17
m) HPV68 SEQ ID NO: 13 ve SEQ ID NO:18
ve/veya burada primerler (a) ila (m) primer çiftlerinin tümünü içerebilir.
için primerler ile birlestirilmesini içerebilir, etiketli pan - HPV probundan gelen bir sinyal
saptanir ve
sonucuna varilir.
için primerler ile birlestirilmesini içerebilir, etiketli pan - HPY probundan gelen sinyal
saptanmaz ve
sonucuna varilir.
Bulusa göre bir yöntem ayrica sunlari içermekte olup,
HPV33n'nin bir hedef bölgesinin amplifikasyonu için primerler ile numunenin
birlestirilmesi ve hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine bir sinyal gönderebilen bir
etiketli 33n probu, burada 33n probu ve pan - HPY probu ayni etiketi tasir,
gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasi ve
etiketli 33n probundan ve/ veya pan - HPV probundan yayilan bir sinyalin ölçülmesi,
burada sinyalin saptanmasi numunenin onkojenik HPV için test sonucunun pozitif
oldugunu gösterir,
33n probunun, ACTTTCGTTT dizisini (SEQ ID NO: 26) veya bunun geri tamamlayicisini
içeren bir etiketli kilitli nükleik asit (LNA) molekülü olmasiyla karakterize edilir.
Bu tür yöntemlerde 33n probu ACTTTCGCTT (SEQ ID NO: 26) ya da bunun geri
tamamlayicisindan olusan dizinin bir etiketli 10 - nükleotit molekülü olabilir ve /veya 33n
probu ACTI'TCGCTT (SEQ ID NO: 26) ya da bunun geri tamamlayicisindan olusan dizinin
olusan dizinin bir etiketli 10 - nükleotit molekülüdür.
Bulusa göre bir yöntem numunenin HPV16 veya HPV18 için test sonucunun pozitif olup
olmadigini saptayabilir, yöntem asagidakileri içermekte olup,
HPV16 ve HPV18 genomlarinin bir hedef bölgesinin gerçek zamanli PCR
amplifikasyonu için numunenin primerler ile birlestirilmesi ve hedef bölgenin
amplifikasyonu üzerine bir sinyal yayabilen etiketli bir 16/18 probu,
gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasi ve
etiketli bir 16/18 probundan gelen sinyalin ölçülmesi,
burada bir sinyalin saptanmasi numunenin HPVI6 veya HPV18 için testlerinin pozitif
oldugunu gösterir,
dizisini veya bunun geri
tamamlayicisini içeren bir etiketli kilitli nükleik asit (LNA) molekülü olmasiyla
karakterize edilir.
veya bunun geri
tamamlayicisindan olusan etiketli bir 15 nükleotit moleküllü dizi olabilir.
16/18 probu pan - HPV probundan farkli bir etiket tasiyabilir.
16/18 probu 5' ucunda bir florofor ile ve 3' ucunda bir söndürücü ile etiketlenebilir ve burada
hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine yayilan sinyal flüoresanstir.
16/18 probu pan - HP V probundan farkli bir dalga boyunda bir flüoresans sinyal yayabilir.
Numunenin HPV16 veya HPV18 için test sonucunun pozitif olup olmadigini saptamak için
bulusa göre bir yöntemde kullanim için primerler asagidaki primer çiftlerinden birini veya her
ikisini birden içerebilir:
a) HPV16 için SEQ ID NO:19 ve SEO ID NO: 20
b) HPVI8 için SEQ ID NO:21 ve SEQ ID NO: 22.
Bulusa göre bir yöntem ayrica, gerçek zamanli PCR için bir pozitif kontrolün
gerçeklestirilmesini,
numunenin bir kontrol DNA dizisinin gerçek zamanli PCR amplifikasyonu için primerlerle
birlestirilmesini, tercihen numunede insan DNA'si bulunur ve kontrol DNA dizisinin, tercihen
insan DNA'sinin amplifikasyonu üzerine bir sinyal yayabilen etiketli bir kontrol probu,
gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasini ve kontrol probundan gelen bir
sinyalin ölçülmesini içerebilir,
burada sinyalin saptanmasi gerçek zamanli PCR'nin islevsel oldugunu gösterir.
Bulusa göre bir yöntemde numune bir insan rahim agzi smearindan sivi bazli bir Sitoloji
örnegi olabilir.
Bulus ayrica nükleotit dizisi ACTTFCGTFT (SEQ ID NO: 25) veya bunun geri tamamlayicisini
içeren bir etiketli nükleik asit probu ve algilanabilir bir etiket içeren bir bilesim saglar. Prob,
LNA nükleotitlerini içerebilir. Tercihen prob bir florofor ve bir söndürücü ile etiketlenmis
ACTTFCGTFT (SEQ ID NO: 25) veya bunun geri tamamlayicisindan olusan dizinin bir 10
nükleotit molekülüdür. Prob 5' ucunda bir florofor ile ve 3' ucunda bir söndürücü ile
etiketlenebilir.
Bulus ek olarak bulusa göre bir bilesimin HPV'nin saptanmasi için gerçek zamanli PCR'nin
gerçeklestirilmesinde kullanilmasini saglar.
Sasirtici bir sekilde bulus sahipleri uygulama kolayligi, düsük maliyet, uygun parametreler:
yüksek hassasiyet, klinik etkinlik, özgüllük ve HPV16/18 ve diger onkojenik HPV tipleri için
klinik olarak istenen saptama esigi gibi birçok avantajla karakterize edilen onkojenik
HPV'lerin varligi için bir tanisal testi elde etmek üzere yukaridaki amaci gerçeklestirmistir.
Dahasi asagida gösterildigi gibi bu test büyük bir HR - HPV - negatif kadin popülasyonundaki
sitolojik bir incelemeyi terk etmeye izin verebilir.
HPV genomunun yaklasik 8 bin nükleotiti vardir ve onkojenik tipler arasindaki tam
homolojiye sahip sürekli dizilerin uzunlugu birkaç düzine baz çiftini asmaz. HPV'Ierin
böylesine büyük bir çesitliligi tek bir reaksiyonda tüm onkojenik HPV virüslerinin
saptanmasini mümkün kilan, minimal miktarda hibridizasyon problarinin tasarlanmasina izin
vermemektedir. Bu problem bir moleküler probda modifiye edilmis LNA (kilitli nükleik asitler)
nükleotitleri kullanilarak çözülebilir. LNA nükleotitleri deoksiriboz molekülü içinde ek bir
metilen köprüsü içerir ki bu konformasyonun degismesi ve molekülü katilastirmasi
nedeniyle, bu tür nükleotitlerden olusturulan oligomerlerin erime noktasini ve hibridizasyon
isleminde tamamlayici nükleotitler arasindaki baglarin stabilitesini arttirir. LNA'nin özellikleri
Bulusa göre LNA kullanimi sayesinde avantajli bir sekilde geleneksel olanlara kiyasla, önemli
ölçüde daha kisa TaqMan tipi moleküler problarin bir PCR'de PCR amplifikasyonu ürününe
yüksek bir özgüllükte hibridizasyonla birlikte reaksiyon için en uygun olan sicaklikta
uygulanmasi mümkündür. Önemli ölçüde daha kisa olan 8 - 10 nükleotit uzunlugunda LNA -
TaqMan problarinin (geleneksel problardaki 20 - 30 nükleotite kiyasla) kullanimi, farkli
onkojenik HPV tipleri arasindaki kisa (hatta 10 - 12 baz çifti) homolog bölgelere daha kolay
uydurulmasini ve sonuç olarak yeni bir tanisal testin gelistirilmesini saglar.
Rahim agzi kanserinin önlenmesi ve teshis edilmesi alaninda klinik olarak ilgili uzmanligin
elde edilmesini saglayacak LNA teknolojisini kullanan testler için yüksek bir talep vardir.
Hastalar ayrica son derece hassas ve finansal olarak uygun olabilecek modern önleyici
incelemelere tabi tutulmak isterler.
Buna göre özel olarak biyoinformatik yöntemlerle tasarlanmis TaqMan tipi moleküler problar
kullanilarak, tek bir sizdirmaz test tüpünde gerçeklestirilen bir multipleks real - time PCR
teknigine (multipleks real - time PCR) dayanan HR - HPV denilen bir test gelistirilmistir.
Problar daha önce HPV varligina yönelik testlerde kullanilmamis olan LNA yenilikçi
teknolojisini kullanmislardir.
Tercihen problarin uzunlugunun 8 - 10 nükleotide indirgenmesi, sayilarinin 15 - 16'dan
sadece birkaç (optimal olarak 2 - 3) taneye kadar önemli bir düsüsüne izin vermistir. Tercihen
ayni zamanda birçok test tüpünde gerçeklestirilen, piyasada mevcut olan testlerin çoguna
karsilik, tek bir test tüpünde bir multipleks gerçek zamanli PCR reaksiyonunun
gerçeklestirilmesini saglamistir. Bulusun bir düzenlemesinde LNA problari flüoresans isigin
farkli emisyon spektrumlari ile maksimum 3 farkli evrensel flüoresans boya ile en iyi sekilde
etiketlenmistir ki bu, testlerin sadece belirli bir üreticinin test için tasarlanmis cihazlarinda
degil ticari olarak temin edilebilen PCR cihazlarinin pek çogunda gerçeklestirilmesine izin
Bulusu uygulamak için tüm onkojenik HPV tiplerinde ve tercihen bir iç kontrolde insan
DNA'sinin seçilmis bir dizisi ve / veya sentetik bir DNA parçasi olan, homolog bölgelerin
tanimlanmasini ve amplifikasyonunu saglayan bir primerler ve problar kiti tasarlanmis ve
takilmistir. Bulusun bir düzenlemesinde tercihen reaksiyon tek bir test tüpünde
gerçeklestirilmistir ve tercihen reaksiyonun okunmasi piyasada bulunan gerçek zamanli PCR
cihazlarinin çogunda kullanilan maksimum 4 saptama kanalinda gerçeklestirilmistir.
Bir gerçek zamanli PCR reaksiyonunda yüksek riskli HPV (HR - HPV) ile enfeksiyonlarin
saptanmasina izin veren iki adet 10 nükleotit LNA - TaqMan prob tasarlanmistir. Bunlardan
birincisi HRP (pan - HPV) tüm onkojenik HPV virüslerinin tamamlayicisidir, ikincisi olan
HRP33n probun takildigi yerde bir A/G nükleotitinin polimorfizmini içeren HPV33n'nin
tanimlanmis varyantinin tamamlayicisidir. Tercihen HRP pan - HPV ve HRP33n problarinin 5'
uçlari bir FAM (floresin) flüoresans boyasi ile etiketlenirken, 3' bir BHQl söndürücü (Black
Hole Quencher 1) ile etiketlenir.
HRP pan - HPV ve HRP33n problari için gerçek zamanli bir PCR okumasi, FAM boyasini
okumak için tasarlanmis bir kanalda 530 nm dalga boyunda gerçeklestirilmistir.
Ayrica tercihen PCR testi için bir iç kontrol tasarlanmistir. Sentetik kisa DNA fragmanindan
olusan bir sistem kullanilmis ve 77 baz çifti içeren bir oligonükleotit hedef olarak
tasarlanmistir. Sentetik iç kontrolün amplifikasyonu ve saptanmasi için 4 primer ve 10
nükleotitli bir LNA - TaqMan (ICP) prob sistemi tasarlanmistir. PCR için 2 primerin optimal
kombinasyonu seçilmistir. ICP probu 5 'ucunda ROX boyasi ve 3' ucunda bir BHQZ söndürücü
ile etiketlenmistir. ICP probu için gerçek zamanli PCR'nin okunmasi 610 nm'lik bir dalga
boyunda gerçeklestirilmistir (ROX boyasi kanali).
Bu çalismanin amaci muhtemelen tercihen gerçek zamanli olarak, tercihen birkaç tespit
kanalinda gerçeklestirilen PCR sirasinda olusabilecek herhangi bir yan etki olasiliginin
tamamen ortadan kaldirilmasi ile birlikte yeterli duyarlilik ve özgüllükle klinik numunelerde
tüm onkojenik HPV tiplerinin etkili amplifikasyonunu mümkün kilan küçük bir primerler
setinin tasarlanmasidir.
Yapilan arastirmalar sonucunda yüksek riskli HPV için ortak bir primerler havuzu
gelistirilmistir. Diziler toplam primer sayisi olabildigince küçük olacak sekilde seçilmistir. Bu
56, 58, HPV tipleri için ortak geri primer ("geri") ve 18 ve 45 HPV tipleri için ortak geri primer
("geri") seçilmistir. Ayrica, ortak ileri primerler ("ileri") sirasiyla 56 ve 66 ve 33 ve 33n tipleri
için seçilmistir.
Bulusun düzenlemesine göre tercihen bulusun HR - HPV testinin son karisimi, 15 onkojenik
HPV tipinin saptanmasi için 18 primer (13 ileri primer ve 5 geri primer) ve 2 LNA - TaqMan
probundan, sentetik iç kontrol için 2 primer ve 1 TaqMan probundan olusur.
Daha Önce 24 tip HPV tespit eden iyi bilinen PapilloCheck testi ile incelenen seçilmis klinik
örneklerin kullanilmasiyla (tek bir onkojenik HPV tipinin DNA'sini içeren yaklasik 50 klinik
örnek, onkojenik olmayan HPV tipi DNA içeren 30 klinik örnek, ko - enfeksiyonlar ve 30
negatif örnek içeren 50 klinik örnek (tüm onkojenik tipler de dahil olmak üzere 24 tip HPV'yi
içermez)), bulusa göre olan primerler ve moleküler problarin yeterli bir kombinasyonunun
onkojenik HPV tiplerinin (HPV33n varyanti dahil) spesifik olarak saptanmasina izin verdigi ve
onkojenik olmayan virüs tipi ve negatif klinik örnekleri içeren klinik örneklerde negatif
sonuçlar ürettigi gösterilmistir. Ayrica yukarida belirtilen 24 primer, 3 LNA prob ve bir iç
kontrol (lC) TaqMan Probu kullanilarak yapilan reaksiyon, primer - dimer veya baska spesifik
olmayan PCR amplifikasyon ürünlerinin tiplerini üretmemistir.
Çizimlerin Kisa Açiklamasi
Bu bulusun konusuna ait bir uygulama sekillerde gösterilmistir, burada Sekil 1 pozitif kontrol
örnegi, negatif kontrol örnegi ve negatif klinik örnekle birlikte tüm kontrol grubu onkojenik
HP Vs için gerçek zamanli bir PCR kullanilarak örnek bir testte elde edilen sonuçlari sunar.
530 nm'lik bir saptama kanali kullanilmistir.
Sekil 2 pozitif kontrol örnegi, negatif kontrol örnegi ve negatif klinik örnegi ile 16 ve
18 HPV tipleri için gerçek zamanli bir PCR kullanarak bir testin örnek bir
düzenlemesinde elde edilen sonuçlari göstermektedir. 560 nm'lik bir saptama kanali
kullanilmistir.
Sekil 3 testin iç kontrolü (IC) için bir gerçek zamanli PCR kullanarak, bir pozitif kontrol
örnegi, negatif kontrol örnegi ve negatif klinik örnek ile bir testin örnek bir
düzenlemesinde elde edilen sonuçlari göstermektedir. 610 nm'lik bir saptama kanali
kullanilmistir.
Sekiller 4A - D bulusun çesitli düzenlemelerine göre örnek problar ve primerler ve
bunlarin hibridize olduklari HPV genomunun karsilik gelen bölgelerini göstermektedir.
HR - HPV (pan - HPV) probu (SEQ ID NO: 25) ile amplifiye edilen ve hedeflenen HPV16
El geninin (SEQ ID NO:33) bir bölgesini göstermektedir; probun hibritlestigi hedefdizi
(SEQ ID NO: 34) koyu ve alti çizili olarak gösterilmektedir. Hedef dizinin geri
tamamlayicisi olan HR - HPV (pan - HPV) probu (5' - actttcgttt - 3', SEQ ID NO: 25/29)
dizisi de gösterilmektedir.
Sekil 4B HPV33n'nin saptanmasi için HPV 33n probu ile amplifiye edilen ve
hedeflenen HPV 33n El geninin (SEQ ID NO: 34) bir bölgesini göstermektedir; probun
hibritlestigi hedef dizisi (SEQ ID NO: 36) koyu ve alti çizili olarak gösterilmistir. Hedef
dizinin geri tamamlayicisi olan HR - HPV 33n Probu (5' - actttcgctt - 3 ', SEQ ID NO:
26/30) dizisi de gösterilmektedir.
Sekil 4C HPV16/18 probu ile hedefleme için amplifiye edilen HPV 16 El geninin (SEQ
lD NO: 37) ve HPV 18 El geninin (SEQ ID NO: 40) bölgelerini gösterir. Primer HPV 16 F
HEX (SEQ ID NO: 19) ve Primer HPV 16 R HEX (SEQ ID NO: 20)'nin amplifikasyon için
hibritlestigi hedef dizisi ve HPV hibritlestigi hedef
dizisi (SEQ ID NO: 71) koyu ve alti çizili olarak gösterilmistir. Amplifikasyon için Primer
HPV 18 F HEX (SEQ IDD NO: 21) ve Primer HPVI8 HEX'in (SEQ ID NO: 22) hibritlestigi
hedef diziler ve HPV hibritlestigi hedef dizi koyu ve
alti çizili olarak gösterilir. Gösterilen HPV16/18 probunun (5' - atatctgatgacgag - 3'
(SEQ ID NO: 39) isaretli bir "t" nükleotide sahip olduguna oysaki bu konumda
HPV16/18 probu SEQ ID NO: 38'in bir "a" kalintisina sahip olduguna dikkat ediniz.
Geri primer HPV 18R HEX'in gösterilen yerde bir "a" nükleotidine sahiptir oysaki
gösterilen hedef dizi için tamamlayici normal olarak bir "g" nükleotit olacaktir; dogal
HPV dizisi bu konumda bir "t" nükleotidine sahiptir, dolayisiyla bu diziyi hedeflemek
için kullanilan geri primer bu konumda bir "a"ya sahiptir.
saptanmasi için HR - HPV (pan - HPV) probu ile amplifiye edilen ve hedeflenen HPV16
El geninin (SEQ ID NO: 41) bölgesini de göstermektedir. HPV 16 F (SEQ ID NO: 1) ve
HPV primerlerinin hibritlestigi
hedef dizisi koyu ve alti çizili olarak gösterilir. Pan - HPV probunun (SEQ ID NO: 25)
hibritlestigi hedef dizisi (SEQ ID NO: 34) koyu ve alti çizili olarak gösterilmektedir.
bulusun çesitli düzenlemelerine göre primerler ve problarin dizileriyle ve birinci
algilama kanali 530nm FAM'da saptanmak üzere hibritlestikleri HPV genomunun
karsilik gelen bölgeleriyle yüksek riskli HPV genomu El bölgelerinin dizilerini
göstermektedir. Sekil 5A, HPV 16 (SEQ ID NO: 1) 5' - gcacaggaagcaaaacaacatag - 3'
ileri primerinin konumlarini göstermek için etiketlenmis
agacagcgggtatggcaatac - 3' geri primeri tarafindan hedeflenen HPV 16 El geni (DIZI ID
NO: 45) bölgesini göstermektedir. Ayni zamanda
(SEQ ID NO: 14) de gösterilir ki bu SEQ ID NO: 45'te gösterilen HPV 16 El geni
bölgesinin geri tamamlayicisidir. 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi, SEQ lD NO: 34'ün geri
tamamlayicisi olan 5' - actttcgttt - 3' pan - HPV Probunun (SEQ ID NO: 25)
hibritlesmesi için pan - HPV Prob hedef dizisidir (SEQ ID NO: 34). HPVI6'nin pan - HPV
probu ile saptanmasi için amplifiye edilen hedef bölgesi 1081 ila 1274 nükleotitleridir.
Sekil SB, HPV 18 El geni nükleotitleri
göstermektedir, ileri primer HPV ve
geri primer tarafindan hedeflenen HPVI8 El genomu 5' - tcagatagtggctatggctgtt - 3`
(SEQ ID NO: 47) hedef bölgesinin konumlarini göstermek üzere etiketlenmistir. Geri
primer HPV gösterilmektedir;
bu, SEQ ID NO: 47'de gösterilen HPV18 El genomunun hedef bölgesinin geri
tamamlayicisidir. Ayrica 5' - actttcgttt - 3' (SEQ ID NO: 25) pan - HPV Probunun (SEQ
3' (SEQ ID NO: 34) pan - HPV prob hedef dizisi gösterilmistir. HPV16'nin, pan - HPV
probu kullanilarak saptanmasi için amplifiye edilen hedef bölgesi 1134 ila 1331
nükleotitleridir.
Sekil 5C, HPV için ileri primerini
göstermek üzere etiketlenmis HPV 33 El gen
(SEQ ID NO: 49) geri primeri için hedef baglanma yerini göstermektedir, burada geri
farki a/g mevcuttur, dolayisiyla 5' - gtattgccatatccgctgtct - 3` (SEQ ID NO: 50),
amplifikasyon için kullanilan primer (SEQ ID NO: 14) ile karsilastirildiginda geri
tamamlayicida uyumsuzluk, c/t, gösterir. 5' - aagcgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 36)
HPV 33n Probu tarafindan hedeflenen HR - HPV 33n bölgesidir; bu, pan - HPV
probunun (SEQ ID NO: 25) hedefledigi konsensüs bölgesine kiyasla bir a/g nükleotit
farkina sahiptir. 5' - actttcgctt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 26) pan - HPV probuna (SEQ ID
NO: 25) kiyasla bir t/c nükleotit farkina sahip HR - HPV Probu 33n'dir (SEQ ID NO:
36'nin geri tamamlayicisidir). 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 34), HPV 33'ün
saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef dizidir. 5` - actttcgttt - 3 'dizisi
(SEQ ID NO: 25), HPV 33'ün saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probudur (SEQ ID
NO: 25, SEQ ID NO: 34'ün geri tamamlayicisidir). HPV 33 (ve 33n)'nin pan - HPV probu
kullanilarak saptanmasi Için amplifiye edilen hedef bölgesi 976 ila 1285
nükleotitleridir.
Sekil 5D, HPV 31 El geni nükleotitleri
göstermektedir, ileri primer HPV ve
(SEQ ID NO: 45) için hedef dizinin konumlarini göstermek için etiketlenmistir. 5' -
gtattgccatacccgctgtct - 3' dizisi (SEQ ID NO: 14)
NO: 45'te gösterilen hedef bölgenin geri tamamlayicisidir). 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi
(SEQ ID NO: 34), HPV 31'ün saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef
dizidir. 5' - actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 25), HPV 31'ün saptanmasi için kullanilan
pan - HPV Probudur (SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 34'ün geri tamamlayicisidir). HPV
Sekil 5E, HPV 35 El geni nükleotitleri
gösterir ki bunlar ileri primer HPV
göstermek için etiketlenmistir, genomik dizi 5' - agacagcggttatggcaattc - 3 '(SEQ ID
NO:53), HPV35 hedef dizisi ile geri primerin hedefdizisi arasinda iki nükleotit farki t/g
ve t/a'yi gösterir. SEQ ID NO: 53 için tamamlayici olan 5' - gaattgccataaccgctgtca - 3
a/c'yi gösterir. 5' - agacagcgggtatggcaatac - 3' dizisi (SEQ ID NO: 45), geri primer
3' dizisi (SEQ ID NO: 14), HPV 35'in amplifikasyonu için kullanilan geri primer
geri tamamlayicisidir). 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 34), HPV 35'in
saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef konsensüs dizisidir. 5' -
actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 25), HPV 35'in (SEQ ID NO: 34'ün geri
tamamlayicisidir) saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probudur. Saptama için
bunlar ileri primer 39F 5i - gtgagacagcacaggtacttttac - 3' (SEQ ID NO: 6) konumunu ve
dizisi ile geri primerin hedef dizisi arasindaki nükleotit farki a/g'yi gösterir. 5' -
gtattgccatatccgctgtct - 3'dizisi (SEQ ID NO: 50), SEQ ID NO: 49'un geri
amplifikasyonu için kullanilan geri primeri isaretli
konumda bir "c" nükleotidine sahiptir. 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 34), HPV
39'in saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef konsensüs dizisidir. 5` -
actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO:25), HPV 39'ün saptanmasi için kullanilan pan - HPV
Probudur (SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 34'ün geri tamamlayicisidir). HPV 39'un
saptanmasi için amplifiye edilen hedef 1115 - 1339 nükleotitleridir.
Sekil 5G, HPV 45 El 5 nükleotitleri gösterir ki bunlar
HPV 45 F 5' - ccatgcgagagagagagagagcag - 3' (SEQ ID NO: 7) ileri primerini ve HPV
geri primerinin hedef
bölgesini göstermek üzere etiketlenmistir, bu bölge hem HPV 18 hem de 45 için geri
primer tarfindandan hedeflenmistir. 5' - aacagccaatagccactatctga - 3' dizisi (SEQ ID
aaacgaaagt - 3' dizisi, HPV 45'in saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef
konsensüs dizisidir. 5' - actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 25), HPV 45'ün saptanmasi
için kullanilan pan - HPV Probudur (SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 34'ün geri
nükleotitleridir.
Sekil 5H, HPV51 genini (SEQ ID NO: 57) ihtiva eden HPV51 genomunun bölgesini
gösterir ki bu HPV 51 F 5' - acaaagaggctgtgcatcag - 3' (SEQ ID NO: 8) ve hedef diziyi
ileri primerini ve HPV 51 R 5' - actggacagttatccggacag - 3' (SEQ ID NO: 58) geri
primerini göstermek için etiketlenmistir. 5' - ctgtccggataactgtccagt - 3' dizisi (DIZI ID
NO: 16), HPV 51 R için geri primerdir (SEQ ID NO: 58'in geri tamamlayicisi). 5' -
aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID NO:34), HPV 51'in saptanmasi için kullanilan pan - HPV
Probu için hedef konsensüs dizisidir. 5' - actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 25), HPV
51'ün saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probudur (SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:
34'ün geri tamamlayicisidir). Saptama için amplifiye edilen hedef HPV 51 El bölgesi,
1103 - 1256 nükleotitleridir.
gaaggggaggatgatttacatgc - 3' (SEQ ID NO: 9) Ileri primerinin konumlari ve
60) geri primeri için hedef bölgeyi göstermek üzere etiketlenmistir, HPV52 hedef
dizisi ve geri primerin hedef dizisi arasinda ile gösterildigi gibi g/c ve c/g olmak üzere
iki nükleotit farkliligi vardir. 5'ctattgccatagccgctgtct - 3' dizisi (SEQ ID NO: 61), SEQ ID
NO: 60'in geri tamamlayicisidir, HPV52'nin amplifikasyonu için kullanilan geri
arasinda gösterildigi gibi iki nükleotit farki, c/g ve g/c, vardir. 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi
(SEQ ID NO: 34), HPV 52'in saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef
konsensüs dizisidir. 5` - actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 25), HPV 52'nin saptanmasi
için kullanilan pan - HPV Probudur (SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 34'ün geri
tamamlayicisidir). HPV 52 El geninin saptanmasi için amplifiye edilen hedef bölge
1083 - 1269 nükleotitleridir.
Sekil SJ, HPV 56 El gen nükleotitleri göstermektedir ki
bunlar HPV ileri primerinin
(SEQ ID NO: 45) geri primerinin hedefini göstermek üzere etiketlenmistir. 5' -
gtattgccatacccgctgtct - 3' dizisi (SEQ ID NO: 14), HPV
tamamlayicisi) dizisidir. 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 34), HPV 56'nin
saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef konsensüs dizisidir. 5' -
actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO:25), HPV 52'nin (SEQ ID NO: 34'ün geri tamamlayicisi)
saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probudur. HPV 56/66'nin saptanmasi için
amplifiye edilen hedef, nükleotid 1104 ila 1267'dir.
Sekil SK, HPV66 El geni nükleotitleri
göstermektedir ki bunlar HPV
agacag/gggtatggcaatac - 3' (SEQ ID NO: 64) geri primeri için hedefi göstermek üzere
etiketlenmistir, geri primer için hedef dizisi ve HPV 66 için hedef dizis arasindaki
nükleotit farki c/t'ye dikkat ediniz. 5' - gtattgccataccc «ctgtct - 3' dizisi (SEQ ID NO:
65), HPV 66'nin amplifikasyonu için kullanilan SEQ ID NO: 64'ün geri tamamlayicisi ve
HPV geri primeri arasindaki
nükleotit farki g/a'yi gösterir. 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 34), HPV 66'nin
saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef konsensüs dizisidir. 5' -
actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO:25), HPV 56'nin (SEQ ID NO: 34'ün geri tamamlayicisi)
saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probudur. HPV 56/66 El geninin hedef bölgesi,
nükleotitler 1104 - 1262'dir.
Sekil 5L, HPV 58 El gen nükleotitleri göstermektedir ki
bunlar 58 F 5' - agcccgagcgttgtttaatg - 3' (SEQ ID NO: 11) ileri primeri ve
üzere etiketlenmistir. 5' - agacagcggatatggcaatac - 3' dizisi (SEQ ID NO: 49),
nükleotit farkini gösterir. 5' - gtattgccataiccgctgtct - 3' dizisi (SEQ ID NO: 50), SEQ lD
NO: 49'un geri tamamlayicisi ve HPV 58'i amplifiye etmek için kullanilan
c/t'yi gösterir. 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ lD NO: 34), HPV 58'nin saptanmasi için
kullanilan pan - HPV Probu için hedef konsensüs dizisidir. 5' - actttcgttt - 3' dizisi (SEQ
kullanilan pan - HPV Probudur. HPV 58'in saptanmasi için amplifiye edilen hedef 1077
ila 1289 nükleotitleridir.
Sekil 5M, HPV 59 El geni nükleotitleri göstermektedir
ki bunlar HPV 59 F 5' - ggccttgtttaatgtgcaggaag - 3' (SEQ ID NO: 12) ileri primerinin
konumunu ve HPV 59 R5' - gaaggttamtaacagtgccagaca - 3' (SEQ ID NO: 68) geri
primeri tarafindan hedeflenen bölgeyi göstermek için etiketlenmistir, burada m bir
nükleotit degisimi c/a'yi ifade eder. 5' - tgtctggcactgttaktaaccttc - 3' dizisi (SEQ ID NO:
17), HPV 59'un amplifikasyonu için kullanilan geri primerdir (SEQ ID NO: 68'in geri
tamamlayicisi), k bir nükleotit degisimi g/t'yi belirtir. 5' - aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID
NO: 34), HPV 59'un saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probu için hedef konsensüs
dizisidir. 5' - actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 25), HPV 59'nin (SEQ ID NO: 34'ün geri
tamamlayicisi) saptanmasi için kullanilan pan - HPV Probudur. HPV 59 El geninin
saptanmasi için amplifiye edilen hedef bölge 1172 - 1265 nükleotitleridir.
Sekil SN, HPV 68 El nükleotitleri göstermektedir ki
bunlar HPV 68 F 5' - caaacaggtgacacagtctcag - 3' (SEQ ID NO: 13) ileri primerinin
konumunu ve HPV 68 R5' - agcaaagtcgccattacagga - 3' (SEQ ID NO: 70) geri primeri
için hedef dizisini göstermek üzere etiketlenmistir. 5' - tcctgtaatggcgactttgct - 3' dizisi
(SEQ ID NO: 18), HPV68 için geri primeridir (SEQ ID NO: 70'in geri tamamlayicisi). 5' -
aaacgaaagt - 3' dizisi (SEQ ID NO:34), HPV 68'nin saptanmasi için kullanilan pan - HPV
Probu için hedef konsensüs dizisidir. 5' - actttcgttt - 3' dizisi (SEQ ID NO: 25), HPV
68'nin (SEQ ID NO: 34'ün geri tamamlayicisi) saptanmasi için kullanilan pan - HPV
Probudur. HPV 68 El'in saptanmasi için amplifiye edilen hedef bölge 902 - 1137
nükleotitleridir.
Sekiller 6A ve 68, HPV suslari 16 ve 18 için bulusun çesitli düzenlemelerine göre
primerler ve problarin dizileriyle ve ikinci algilama kanali 560 nm HEX'de saptanmak
üzere hibritlestikleri HPV genomunun karsilik gelen bölgeleriyle yüksek riskli HPV
genomu El bölgelerinin dizilerini göstermektedir.
Sekil 6A, HPV 16 El gen dizisi nükleotitleri
göstermektedir ki bunlar ikinci saptama kanali için HPV16'nin (560nm)
amplifikasyonu için HPV 16 F HEX 5' taatggatggttttatgtagaggct - 3' (SEQ ID NO: 19)
ileri primerinin konumunu ve HPV 16 R HEX 5' - ataatgattatttaacacaggcag - 3 '(SEQ ID
NO: 71) geri primeri için hedef dizisini göstermek için etiketlenmistir. 5' -
ctgcctgtgttaaataatcattat - 3' dizisi (SEQ ID NO: 20), HPV 16R HEX primer dizisidir (SEQ
HEX) HPV 16`nin amplifikasyonu ve saptanmasi için hedef 909 - 1051 nükleotitleridir.
Sekil 6B, HPV 18 El gen nükleotitleri göstermektedir ki
bunlar HPV 18 F HEX 5' - ggctggttttatgtacaagct - 3' (SEQ ID NO: 21) ileri primerinin
konumlarini ve HPV 18R HEX 5' - aaggaacattttgigaacagg - 3' (SEQ ID NO: 72) geri
primeri tarafindan hedeflenen bölgeyi göstermek üzere etiketlenmistir, SEQ ID NO:
46'da gösterilen ilgili HPV 18 El genomik dizisine karsilik gelen bir nükleotit farkliligi,
c/t, olduguna dikkat ediniz.
' - cctgttcacaaaatgttcctt - 3' dizisi geri tamamlayicisi (SEQ ID NO: 22), ikinci saptama
kanalinda ( HPV 18'in amplifikasyonu için kullanilan HPV18R HEX primer dizisidir.
atatcagatgacgag - 3' (SEQ ID NO: 27/31/38) ile karsilastirildiginda nükleotit farki A/T'yi
gösteren HPV 18 dizisidir. Ikinci saptama kanalindaki ( HPV 18 için hedef bölge,
nükleotitler 959 - 1097'dir.
Ayrintili Açiklama
Yukarida tarif edildigi gibi ve ekli örneklerde ve çizimlerde daha ayrintili olarak sunulan
bulusun bir yönü, burada açiklanan HPV için bir nükleik asit probunu içeren bir bilesimdir.
Prob, gerçek zamanli PCR'de kullanim için uygun herhangi bir etiket ile etiketlenebilir. Tipik
etiketler lineer probun karsit uçlarinda bulunan bir florofor ve söndürücüdür, örnegin
florofor probun 5' ucuna ve söndürücü 3' ucuna takilabilir. Prob burada ortaya konan bir
prob dizisini içeren veya bundan olusan bir nükleotit dizisine veya bunun geri tamamlayici
dizisine (probun baglandigi HPV genomunun EI bölgesine ait hedef diziye karsilik gelir) sahip
olabilir. Örnegin nükleotit dizisi burada HR - HPV probu olarak da anilan pan - HPV probu
ACTTFCGTFT (SEQ ID NO: 25) olabilir. Bu dizinin geri tamamlayicisi AAACGAAAGT'dir (SEO` ID
Tercihen probu nükleotit dizisinin LNA nükleotitlerini içerdigi bir LNA prob molekülüdür.
Avantajli olarak LNA içeren problar, hibridizasyonun yüksek özgüllügünü hala verirken, daha
kisa bir dizi uzunlugunun kullanilmasina izin verir. Mevcut bulusa göre HPV problari genellikle
uzunlugunda olabilir ve burada belirtilen bir prob dizisini veya geri tamamlayicisini içerir.
Yukarida isaret edildigi gibi LNA nükleotitleri deoksiriboz molekülü içinde ek bir metilen
köprüsü içerir. Bu ilave metilen köprüleri istege bagli olarak probdaki nükleotitlerin en az 8, 9
veya 10'unda bulunur. Prob içindeki bazi nükleotitlerde metilen köprüler mevcut olmayabilir.
Prob dizilerindeki metilen köprülerin tam konumlarinin örnekleri asagidaki Örnek 1 (d)'de
sunulmaktadir.
Bu bulusun altinda yatan temel bulgulardan biri bu tür kisa LNA problarinin onkojenik HPV
tipleri arasindaki homoloji bölgelerine yönlendirilebilmesi ve yeterli özgüllükte
hibritlenebilmesidir böylece genis bir araliktaki onkojenik HPV suslarinin spesifik olarak tek
bir prob veya 1, 2 veya 3 prob gibi az sayida prob kullanilarak saptanmasina olanak saglarlar.
Böylece mevcut bulusa göre bir prob, bir çok onkojenik HPV'ye hibritlenebilen bir pan - HPV
probu olabilir. Onkojenik HPV suslari arasinda HPV16, HPVl8, HPV31, HPV33, HPV33n,
Tercihen mevcut bulusa göre olan pan - HPV problari örnegin asagida Tablo 1'de gösterildigi
gibi El genindeki HPV genomunun bir bölgesini hedefler.
HPV Amplifikasyon / saptama için HPV El geninin hedef bölgesi (ör. ,
susu birinci saptama kanali
33 / 976 - 1285
68 902- 1137
Tercihen mevcut bulusa göre olan HPV 16/18 problari örnegin asagida Tablo 2'de gösterildigi
gibi El genindeki HPV genomunun bir bölgesini hedefler.
HPV Amplifikasyon/saptama Için HPV El geninin hedef bölgesi (ör. , ikinci
susu algilama kanalinda
16 909 - 1051
18 959 - 1097
Burada tarif edilen problar numunelerde onkojenik HPV'nin varligini saptamak için tani
yöntemlerinin bir parçasi olarak veya bir numunenin onkojenik HPV için test sonucunun
pozitif veya negatif oldugunu spesifik olarak belirlemek için HPV'nin saptanmasinda kullanim
için saglanabilir. Bir numune bir denekten örnegin bir insan hastadan gelen biyolojik
materyal içeren bir numune gibi onkojenik HPV için test edilecek herhangi bir materyal
olabilir. Biyolojik materyal rahim agzi smearden elde edilebilir. Tercihen örnek bir insan
rahim agzi smearinden sivi bazli bir sitoloji örnegidir. Problar gerçek zamanli PCR ile HPV
tespitinde kullanim için optimize edilmistir. Problar ile kombinasyon halinde kullanima uygun
primerler de tarif edilmistir ve bulusun diger yönlerini temsil etmektedir.
Buna göre bulusun bir yönü bir numunenin onkojenik HPV için test sonucunun pozitif olup
olmadigini belirleme yöntemidir, yöntem asagidakileri içerir:
onkojenik HPV genomlarinin bir hedef bölgesinin gerçek zamanli PCR amplifikasyonu
için numunenin primerler ile birlestirilmesi ve hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine
bir sinyal yayabilen etiketli bir pan - HPV probu,
gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasi ve
etiketli pan - HPV probundan çikan bir sinyalin ölçülmesi,
burada sinyalin saptanmasi numunenin onkojenik HPV için test sonucunun pozitif
oldugunu gösterir.
ACTTTCGTTT (SEQ ID NO: 25) veya bunun geri tamamlayicisini içeren etiketli LNA molekülü
gibi burada tarif edilen pan - HPV problarinin örnekleri açiklanmaktadir. Pan - HPV probu,
ACTTTCGTTT'den (SEQ ID NO: 25) olusan dizinin etiketli bir 10 nükleotitli molekülü olabilir.
Burada uygun primerlerin örnekleri de açiklanmaktadir. Tercihen primerler HPV16, HPV18,
HPV68'in herhangi birinin hedef bölgesinin amplifikasyonu içindir. Yöntem bu HPV tiplerinin
hepsinin amplifikasyonu için bir primer kombinasyonu ile numunenin birlestirilmesini
içerebilir böylece örnekte mevcutsa herhangi bir HPV'nin saptanmasina izin verir.
Pan - HPV probu belirli bir onkojenik HPV setine ait herhangi bir HPV'yi (ör. HPV16, HPV18,
HPV68 seti) spesifik olarak saptamak üzere tasarlanan bir prob olabileceginden, bu tür tüm
primerler ile bir analizde etiketli pan - HPV probundan bir sinyalin saptanmasi bu nedenle
örnek onkojenik HPV'lerden en az biri için numunenin test sonucunun pozitif oldugunu
gösterir oysaki bu sartlarda bir sinyalin yoklugu bu onkojenik HPV için numunenin test
sonucunun negatif oldugunu gösterir. Test, asagidaki örneklerde tartisilan analizin saptama
limitleri göz önüne alindiginda mutlak bir kesinlik saglayamayabilir ancak bulusun
yöntemlerinin onkojenik HPV için alternatif test yöntemleri ile mükemmel bir dogruluk ve
tutarlilik sagladigi gösterilmistir. Bulusa ait yöntemler, istenirse, onkojenik HPV'nin varligina
veya yokluguna iliskin ilave güven saglamak için numunede hücrelerin görsel incelemesi gibi
bir veya daha fazla teknikle birlestirilebilir.
Farkli HPV özgüllügünde çok sayida probunun kullanilmasi, saptanan HPV araligini
genisletebilir ve / veya numunede mevcut olan HPV tipi ile ilgili bilgi saglayabilir.
Örnegin SEQ ID NO: 25'in pan - HPV probu, HPV33n'nin hedef bölgesine bu bölgedeki
HPV33n genom dizisindeki farkliliklardan ötürü, diger onkojenik HPV'nin hedef bölgesinden
daha zayif bir sekilde baglanabilir. Buna göre bulus HPV33n'de hedef bölgeyle daha kuvvetli
bir sekilde hibritlesen HPV 33n için bir ek prob temin eder. Burada tarif edilen örnek 33n
problari, ACTTTCGCTT dizisini (SEQ ID NO: 26) veya bunun geri tamamlayicisini içerir. 33n
probu, ACTTTCGCTT'den (SEQ ID NO: 26) olusan dizinin etiketli bir 10 nükleotitli molekülü
olabilir. Bir LNA probu olabilir. HPV33n için bir prob, bulusun yöntemlerinde bir pan - HPV
probu ile birlestirilebilir. Uygun bir sekilde her iki prob da ayni sekilde etiketlenmisse
(örnegin ayni florofor ile), ortak bir sinyal yayarlar (örnegin ayni dalga boyundaki flüoresans).
Bu durumda bu sinyalin algilanmasi pan - HPV probu veya 33n probu ile bagli olan herhangi
varligini gösterebilir.
Dolayisiyla bir numunenin onkojenik HPV için pozitif olup olmadigini belirleme yöntemi ek
olarak HPV33n'nin bir hedef bölgesinin amplifikasyonu için primerler ile numunenin
birlestirilmesini ve hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine bir sinyal gönderebilen bir etiketli
33n probunun ilave edilmesini, burada 33n probu ve pan - HPV probu ayni etiketi tasir,
gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasini ve
etiketli 33n probdan veya pan - HPV probundan çikan bir sinyalin ölçülmesini içerir,
sinyalin saptanmasi numunenin onkojenîk HPV için test sonucunun pozitif oldugunu
gösterir.
Bulusun bir baska yönü HPV16 ve /veya HPV18 için bir örnegi spesifik olarak test etmek için
bir yöntemdir. HPV 16 ve HPV 18'in en yüksek onkojenîk potansiyele sahip olduguna ve
rahim agzi kanserinin en büyük riski ile iliskili olduguna inanildigi için bu HPV suslarinin
saptanmasi özellikle önemlidir. HPV16/18'i saptamak için bir yöntem tek basina
gerçeklestirilebilir ancak numunede bulunan HPV'nin HPV 16 veya HPV tip 18 olup olmadigi
veya virüsün farkli bir türüne ait olup olmadigi hakkinda ek bilgi saglamak için yukaridaki pan
- HPV saptama yöntemi ile birlestirilmesi avantajlidir.
Buna göre bir numunenin onkojenik HPV için test sonucunun pozitif olup olmadigini
belirlemek için yöntem ek olarak numunenin HPV16 veya HPV18 için test sonucunun pozitif
olup olmadiginin belirlenmesini içerebilir ve asagidakileri içerebilir:
HPV16 ve HPV18 genomlarinin bir hedef bölgesinin gerçek zamanli PCR
amplifikasyonu için numunenin primerler ile birlestirilmesi ve hedef bölgenin
amplifikasyonu üzerine bir sinyal yayabilen etiketli bir 16/18 probu,
gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasi ve
etiketli bir 16/18 probundan gelen sinyalin ölçülmesi,
burada bir sinyalin saptanmasi numunenin HPVI6 veya HPV18 için testlerinin pozitif
oldugunu gösterir.
HPVI6 ve HPVI8 için problarin örnekleri burada belirtilmistir ve ATATCWGATGACGAG (SEQ ID
NO: 27) veya bunun geri tamamlayicisini içeren bir LNA molekülünü içerirler.
HPV 16/18 sinyalinin kombine bir algilama yönteminde pan - HPV sinyalinden çözülmesini
kolaylastirmak için 16/18 probu farkli bir sekilde (örnegin farkli bir florofor ile) etiketlenebilir
böylece pan - HPV probundan farkli bir sinyal yayar (örnegin farkli bir dalga boyunda
flüoresans).
Pozitif ve /veya negatif kontroller istendiginde yönteme dahil edilebilir. Tipik olarak gerçek
zamanli PCR için bir pozitif kontrolün gerçeklestirilmesi, numunede mevcut olan bir kontrol
DNA dizisinin (ör. insan DNA'si) gerçek zamanli PCR amplifikasyonu için numunenin primerler
ile birlestirilmesini ve kontrol DNA dizisinin amplifikasyonu üzerine sinyal yayabîlen bir
etiketli kontrol probunu, gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasini ve kontrol
probundan bir sinyalin ölçülmesini içerecektir, burada sinyalin saptanmasi gerçek zamanli
PCR'nin fonksiyonel oldugunu gösterir. Tercihen Örneklerde gösterildigi gibi bulusun
yöntemleri multipleks olarak gerçeklestirilîr. Bu nedenle çoklu problar (herhangi iki veya
daha fazlasi veya hepsi: pan - HPV probu, 33n probu, 16/18 probu ve kontrol probu) ve
bunlarin gerçek zamanli PCR için karsilik gelen primerleri tek bir reaksiyon karisimina dahil
edilebilir. Farkli etiketlerin kullanilmasi ve farkli kanallara sahip sinyallerin saptanmasi
(örnegin farkli dalga boylarindaki flüoresans) farkli problardan gelen sinyallerin ayirt
edilmesini saglar. Reaksiyon karisimi gerçek zamanli PCR için uygun tamponlari ve diger
reaktanlari içerecektir. Reaktanlarin örnekleri ve PCR için reaksiyon kosullari iyi bilinmektedir
ve Örneklerde verilmistir.
Bulusun düzenlemeleri asagida sunulmustur.
Örnek l. Tanisal testin düzenlemesi
Bu düzenlemede, incelenen onkojenik HPV virüslerinin varligi ve 16 ve 18 HPV tiplerinin
varligi bir test örneginde saptanmistir.
Tercihen pozitif kontrol numune bir HPV 16 nükleotit dizisi ve bir insan beta globin dizisinin
bir fragmanindan hazirlanmistir.
Tercihen her bir analiz için bir kontrol pozitif numune ve bir kontrol negatif numune
uygulanmistir. Bu düzenlemede pozitif kontrol numunesi gerçeklestirilen reaksiyonun
dogrulugunu gösterir (pozitif kontrol örneginin bozunmamasi, reaktanlarin uygun aktivitesi,
cihazin dogru termal profili, reaksiyonun inhibisyonunun olmamasi). Negatif kontrol
numunesi DNA elüatinin ve reaktanlarinin DNA izolasyonu ve amplifikasyon reaksiyonunun
hazirlanmasi sirasinda HPV veya amplifiye PCR ürünlerini içeren biyolojik materyal ile
kontaminasyonunun meydana gelip gelmediginin dogrulanmasina izin verir. Negatif kontrol
numunesi için en az bir saptama kanalinda pozitif bir sinyal tespit edilirse, negatif kontrol
numunesi veya reaktanlarin kontaminasyonu meydana gelir.
Ayrica her bir klinik test numunesinin HR HPV'yi tespit etmek için gerekli olan yeterli
miktarda DNA içerip içermedigini teyit etmek için uygulanan bir insan beta globin dizisinin bir
parçasini içeren bir iç kontrol (IC) kullanilmistir. Ayrica iç kontrolden gelen bir sinyal dogru
sekilde gerçeklestirilen DNA izolasyonunu ve reaksiyon inhibitörlerinin bulunmadigini
gösterir. Tercihen pozitif kontrol numunesi iç kontrolün bir dizisini içerir. Negatif kontrol
numunesi üç saptama kanalinda negatif sonuç üretmelidir.
1. Bulusun kullanilan primerlerinin, problarinin ve kontrol örneklerinin dizileri
530 nm'de birinci FAM kanali için primerin oligonükleotit dizisi:
SEQ ID PRIMER YÖNELIM PRIMER DIZI
1 HPV 16 F Ileri 5' - GCACAGGAAGCAAAACAACATAG - 3'
2 HPV 18 F Ileri 5' - AGGT C CACAAT GAT GCACAAG - 3'
3 HPV 33/33n F Ileri 5' - CAGAAGATGAGGATGAAACAGCAG - 3'
4 HPV 31 F Ileri 5' - GAGGAACATGCAGAGGCTGT - 3'
HPV 35 F Ileri 5' - ATGCACAGGAGGAGCAAACA - 3'
6 HPV 39 F Ileri 5' - GTGAGACAGCACAGGTACTTTI'AC - 3'
7 HPV 45 F Ileri 5' - C CAT GC GCAGGAAGTT CAG - 3'
HPV 51 F Ileri 5' - ACAAAGAGGCT GT GCAT CAG - 3'
9 HPV 52 F Ileri 5' - GAAGGGGAGGATGATI'TACATGC - 3'
HPV 56/66 F Ileri 5' - GCAAGTACAAACAGCACAT GC - 3'
11 HPV 58 F Ileri 5' - AGCCCGAGCGTTGTTTAATG - 3'
12 HPV 59 F Ileri 5' - GGCCTI' GTTTAATGTGCAGGAAG - 3'
13 HPV 68 F Ileri 5' - CAAACAGGT GACACAGT CT CAG - 3'
HPV 18/45 R Geri 5' - AACAGC CATAGC CACTAT CT GA - 3'
16 HPV 51 R Geri 5' - CTGTCCGGATAACTGTCCAGT - 3'
17 HPV 59 R Geri 5' - TGTCTGGCACTGTTAKTAACCTTC - 3'
18 HPV 68 R Geri 5' - TCCTGTAATGGCGACTTTGCT - 3`
burada ”K", baz G/'nin bir degisimini gösterir
560 nm'de ikinci HEX kanali için primerin oligonükleotit dizisi:
SEQ ID PRIMER YÖNELIM PRIMER DIZI
19 HPV 16 F HEX Ileri 5' - TAATGGATGGTTTFATGTAGAGGCT - 3'
HPV 16 R HEX Geri 5' - CTGCCTGTGTTAAATAAT CATFAT - 3'
21 HPV 18 F HEX Ileri 5' - GGCTGGTTTTATGTACAAGCT - 3'
22 HPV 18 R HEX Geri 5' - CCTGTTCACAAAATGTTCCTT - 3'
610 nm'de üçüncü ROX kanali Için primer oligonükleotit dizisi - iç kontrol:
SEQ ID PRIMER YÖNELIM PRIMER DIZI
23 HBE1 lC F Ileri 5' - GAGAACTTCAAGGTGAGTTCAGGT - 3 '
24 HBE1 lC R Geri 5' - GAAGTCTGCTGTTCTAACATCAAG - 3'
probun oligonükleotit dizisi:
Prob Probun Dizisi
HR - HPV (pan - HPV) SEQ 5' - 6FAM - A+C+T+T+T+C+G+T+TT - BHQ- 1 - 3'
33n SEQ ID NO. :30 5' - 6FAM - A+C+T+T+T+C+G+C+TT - BHQ - 1 - 3'
16/18 SEQ ID NO. : 31 5' - HEX - AT+AT+CW+GA+T+G+AC+G+AG - BHQ - 1 - 3'
burada, ”+" deoksiriboz içinde ilave bir metilen köprüsü içeren bir LNA nükleotidini gösterir;
”W”, baz A/T'nin bir degisimini gösterir.
2. Bulusun reaksiyon karisiminda uygulanan primerler ve problarin konsantrasyonlari
530 nm'de birinci FAM kanali için reaksiyon karisimindaki primerlerin son konsantrasyonlari
No. PRIMER Karisimdaki nihai Baslangiç
konsantrasyon [pM] konsantrasyonu [pM]
1 HPV 16 F 0 ,22 4
2 HPV 18 F 0 ,22 4
3 HPV 31 F 0 ,22 4
4 HPV 33/33n F 0 ,22 4
HPV 35 F 0 ,22 4
6 HPV 39 F 0 ,22 4
7 HPV 45 F 0 ,22 4
8 HPV 51 F 0 ,22 4
9 HPV 52 F 0 ,22 4
11 HPV 58 F 0 ,22 4
12 HPV 59 F 0,22 4
13 HPV 68 F 0 ,22 4
9/52/56/58/66R
16 HPV 51 R O ,22 4
17 HPV 59 R O ,22 4
18 HPV 68 R O ,22 4
560 nm'de HPV 16/18'in ikinci HEX kanali için reaksiyon karisimindaki primerlerin son
konsantrasyonlari esittir:
No. PRIMER Karisimdaki nihai konsantrasyon [pM] Baslangiç konsantrasyonu [pM]
19 HPV 16 F HEX O ,06 8
HPV 16 R HEX 0,06 8
21 HPV 18 F HEX O ,06 8
22 HPV 18 R HEX 0 ,06 8
610 nm'de üçüncü ROX için reaksiyon karisimindaki primerlerin nihai konsantrasyonlari - iç
kontrol - esittir:
No. PRIMER Karisimdaki nihai konsantrasyon [pM] Baslangiç konsantrasyonu [pM]
23 HBE1 IC F 0 ,2 8
24 HBE1 IC R O ,2 8
Reaksiyon karisimindaki problarin son konsantrasyonlari esittir:
No. PROB Karisimdaki nihai konsantrasyon [}iM] Baslangiç konsantrasyonu [liM]
HR - HPV 0 ,36 8
26 33n 0 ,36 8
28 IC 0 ,2 3 ,6
Yukaridaki konsantrasyonlarda uygun miktarlarda primerler ve problar hazirlanmistir.
Karisim hazirlanmadan önce tüm bilesenler vortekslenmis ve santrifüje tabi tutulmustur.
Daha sonra karisim test tüplerine yerlestirilen uygun kisimlara ayrilmistir.
3. Master MIX MabPROBE analizinin tanimi
Gerçek Zamanli Master Mix MabProb, Gerçek Zamanli PCR için 2,083 x konsantre bir
karisimdir. Bu, bir monoklonal antikor ve gerçek zamanli PCR için gerekli diger bilesenler ile
bloke edilmis bir Taq polimerazi içerir. Karisimin bilesenleri, kullanimi kontaminasyon ve
insan hatasi riskini azaltan nihai karisimla uygun kisimlar halinde birlestirilmistir. Kit
asagidakileri içerir:
Master MIX MabPROBE
Prob ve primerlerin karisimi
Bir pozitif kontrol numunesi
Bir negatif kontrol numunesi
Master MIX MabPROBE karisiminin bilesimi:
Testin tüm bilesenleri karanlik bir yerde
MAb polimeraz 0,104 U/[jl`yi çalistirin
KCl 104 mM MgClz - 10,42 mM
PCR stabilizanlari
,83 mM pH 8,0,
- 20 °C'de saklanmalidir. Bilesenlerin yeniden
çözülmesi ve tekrar dondurulmasi bunlarin aktivitelerinde herhangi bir bozulmaya neden
olmaz. Kuru buz üzerinde tasinmalidirlar.
4. Test protokolü:
a. Tüm malzemeler buz üzerine konulmalidir. Primerler, problar ve Master Mix
MabPROBE karisimi, pozitif kontrol numunesi ve negatif kontrol numunesi
vortekslenmeli ve kisa bir süre santrifüj edilmelidir.
b. Asagidaki tabloda, bir reaksiyon için içeriklerin miktarlari gösterilmistir. Daha fazla
analiz yapabilmek için test numuneleri, pozitif kontrol ve negatif kontrol dikkate
alinarak karisimin bilesimini uygun sekilde yeniden hesaplamak gerekmektedir. Bir
UNG enziminin 1: 200'Iük bir seyreltmede eklenmesi istege baglidir ve su ile
degistirilebilir. Uygun miktarlarda tek tek bilesenler Eppendorf tipinde 1 ,5 ml'lik bir
test tüpünde birlikte karistirilmali ve daha sonra elde edilen karisim vortekslenmeli ve
kisa bir süre santrifüj edilmelidir.
jil içinde tek bir reaksiyon için karisimin bilesimi
Malzemeler 25j_il içindeki bir reaksiyon için
miktar
MASTER MIX MAB 12
PRIMERLER+PROBLAR 6
HZO ya da istege bagli olarak 1lHNTG(1:200) 1
Süre Sicaklik °C Döngü sayisi
Denatürasyon 15 dakika 95°C 1
Amplifikasyon 20 saniye 95°C 40 - 50*
75 saniye 60°C Optimize edilmesi gereken
döngü sayisi
Sogutma 30 saniye 37°C 1
Test asagidaki aygitlarda dogrulanmistir:
LightCycler 2 ,0, LightCycIer Roche 96, LightCycler Roche 480, Biorad CFXTouch. Renk
dengelemesi gerektiren cihazlar test üreticisi tarafindan dogru formatta bir dosya veya
kendiliginden gerçeklestirilen dengeleme için boya kiti ile saglanir.
. Sonuçlarin yorumlanmasi
Bulusa göre spesifik bir örnekte virüsün varligi, spesifik primerler çiftini içeren bir ürünün
amplifikasyonuyla kanitlanir.
1 UNG enzimi kit ile birlikte verilmez. Fermentas sirketi araciligiyla 1 (J ,l/U)
konsantrasyonunda satin alinabilir.
Önerilen DNA matrisi miktari 10 pg - 1 jag'dir. Eklenen DNA elüatinin maksimum hacmi 6
jal'dir. Eklenen DNA elüatinin miktari ve hacmi DNA izolasyonuna baglidir ve optimizasyona
tabi tutulur. Eklenen miktarlarin 6 jal`in altinda olmasi durumunda eksik miktar su ile
degistirilmelidir.
c. 19 [j, I karisimi reaksiyonu yürütmek için kullanilan aygita adanmis test tüplerine
yerlestirin.
d. Ardindan her bir tüpe, bir kaç kez tekrar pipetleyerek, pes pese 6 jal test DNA'si,
pozitif kontrol ve negatif kontrol ekleyin. Bu sekilde hazirlanan karisim kisa bir süre
santrifüj edilmelidir.
e. Örnekleri bir termal döngüleyiciye yerlestirin.
Termal döngüleyici programi:
Mevcut düzenlemede bir HPV virüsünün varligini gösteren reaksiyon ürünü, test numunesi
için flüoresansin gözlenen degisiminin bir sonucu olarak olusturulan bir logaritmik büyüme
egrisinin bir analizi ile tanimlanmistir. Pozitif numuneler, negatif numunelerdeki nispeten
sabit flüoresans seviyesine kiyasla flüoresans seviyesinin logaritmik bir artisi ile karakterize
edilmistir. Tercihen analiz uygun kontroller kullanilarak gerçeklestirilmistir: negatif, pozitif ve
iç kontroller. Ortaya çikan görüntü Sekil 1 - 3'te gösterilmektedir.
Sekil 1'de tercihen bir pozitif kontrol numunesi, bir negatif ve bir pozitif kontrol numunesi ve
bir negatif klinik numunesi kullanilarak, onkojenik test HPV tipleri için gerçek zamanli bir
PCR'nin sonuçlari sunulmustur. Bulusun düzenlemesine göre incelenen numunelerde
onkojenik HPV'nin varligi veya yoklugu 530 nm'lik bir saptama kanalinda okunur. Pozitif klinik
numunede PCR ürününün logaritmik bir artisi, arastirilan tüm onkojenik HPV tipi grubundan
en az birinin varligini gösterir. Negatif klinik örnekte PCR ürününün logaritmik olarak
büyümemesi, onkojenik HPV'Ierin bulunmadigini gösterir. Tercihen 530 nm'de saptama
kanalina bir pozitif ve bir negatif kontrol örnegi uygulanmistir. Sonuçlarin yorumlanmasini
kolaylastirmak için kontrol numunesinin klinik test numuneleri ile karsilastirilmasi tercih
Sekil 2'de tercihen bir pozitif kontrol numunesi, bir negatif ve bir pozitif kontrol numunesi ve
bir negatif klinik numunesi kullanilarak, 16 ve 18 HPV tipleri için gerçek zamanli bir PCR'nin
sonuçlari sunulmustur. Bulusun düzenlemesine göre incelenen numunelerde 16 ve 18 HPV
tiplerinin varligi veya yoklugu 560 nm'lik bir saptama kanalinda okunur. Pozitif klinik
numunede PCR ürününün logaritmik bir artisi, arastirilan onkojenik 16 ve 18 HPV tiplerinden
en az birinin varligini gösterir. Negatif klinik örnekte PCR ürününün logaritmik olarak
büyümemesi, onkojenik 16 ve 18 HPV'Ierin bulunmadigini gösterir. Tercihen 560 nm'de
saptama kanalina bir pozitif ve bir negatif kontrol örnegi uygulanmistir. Sonuçlarin
yorumlanmasini kolaylastirmak için kontrol numunesinin klinik test numuneleri ile
karsilastirilmasi tercih edilir.
Sekil 3'de tercihen bir kontrol numunesi, bir negatif ve bir pozitif kontrol örnegi ve bir negatif
klinik örnek kullanilarak, iç kontrol (IC) için gerçek zamanli bir PCR'nin sonuçlari sunulmustur.
Bulusun düzenlemesine göre incelenen numunelerde iç kontrolün (IC) varligi veya yoklugu
610 nm'lik bir saptama kanalinda okunur. Pozitif kontrol numunesinde ve pozitif ve negatif
klinik numunelerde PCR ürününün logaritmik bir büyümesi, bir insan beta globin fragmaninin
varligini gösterir ve reaksiyonun dogru seyri ve tüm incelenen onkojenik HPV tiplerini tespit
etmek için gereken uygun DNA miktari için kanit saglar. Negatif klinik numunede PCR
ürününün logaritmik büyümesinin yoklugu beklenir, bu da insan DNA'si veya amplifiye PCR
ürünü ile kontaminasyonun mevcut olmadigini gösterir. Sonuçlarin yorumlanmasini
kolaylastirmak için kontrol numunesinin klinik test numuneleri ile karsilastirilmasi tercih
Mevcut uygulama bulusun kapsamini sinirlayan bir örnek degildir. Reaksiyon ürünü teknikte
uzman kisilerce bilinen herhangi bir yöntemle tanimlanabilir.
Tercihen bu, arastirilan örnekte mevcut olan virüsün herhangi bir spesifik dizisini tanimlamak
için dizilenebilir.
bir PCR ürünü asagida sunulmustur (SEQ lD NO:43):
Örnek ll. Onkojenik HPV tiplerinin saptanmasi için primerler ve moleküler problarin farkli
kitlerinin etkinliginin degerlendirilmesi
Birinci asama 16/18 HPV'Ier için ek bir saptama kanalini ayirmak için yukarida açiklanan
primerler ve moleküler problarin bilesiminin bir modifikasyonunu içerir. Epidemiyolojik
verilere göre HPV 16 ve HPV 18, enfekte kadinlarda en yüksek onkojenik potansiyel ve rahim
agzi kanseri gelisme riski ile karakterizedir. Bu nedenle klinik amaçlarla kullanilan HPV
testlerinin ve özellikle popülasyon temelli tarama testlerinin incelenen numunede sadece
onkojenik HPV'Ieri olan bir enfeksiyonun tanimlanmasina degil, ayni zamanda HPV 16/18'in
varliginin belirlenmesine de izin vermesi önerilir. Bu nedenle HPV 16/18'in tek bir
reaksiyonda tüm onkojenik HPV tipleri ve bir iç kontrol grubu için bir sistemle ayrismasina
izin veren bir ilave primer kiti ve bir moleküler prob tasarlanmistir. Yapilan çalismalar
sonucunda 560 nm kanalinda amplikonlarin saptanmasina olanak saglayan HPV 16 ve HPV 18
için 4 primer ve HEX flüoresans boya ile etiketlenmis bir kisa prob TaqMan - LNA elde
edilmistir. Tüm onkojenik HPV tipleri için konsensüs bölgesinden yaklasik 700 bç uzaklikta
bulunan HPV genomunun El bölgesi, primerler ve ortak bir LNA probu için bir hedef dizi
olarak seçilmistir. Bu durumda iç kontrol sistemi gerçek zamanli PCR için uygun sekilde
modifiye edilmistir. Sentetik nükleotit, beta globin için bir referans insan geninin lehine
elimine edilmistir. 2 primer ve ROX boyasi ile etiketlenen bir TaqMan probu (610 nm'de
saptama kanali) bu genin numunede potansiyel olarak mevcut olan HPV partikülleriyle
birlikte tek asamali amplifikasyonu için tasarlanmistir. Sonuç olarak hedef reaksiyon karisimi
26 primer ve 4 moleküler prob içermistir. Testin daha önce genotipli sitolojik numuneler
üzerinde gerçeklestirilmesinin bir sonucu olarak ne primer - dimer tipi ürünler ne de spesifik
olmayan PCR amplifikasyon ürünleri gözlenmistir.
Analizin amaci primerler ve LNA - TaqMan problarinin seçilen konfigürasyonunun, klinik
sitolojik materyaldeki onkojenik HPV tiplerinin saptanmasinda en yüksek verimlilik ile
karakterize olup olmadigini teyit etmektir. Potansiyel olarak bir optimal primerler ve problar
sistemi içeren yeni testin karsilastirmali analizleri, onkojenik HPV tiplerinin saptanmasinin
duyarliligi ve özgüllügü, her bir onkojenik tip dahil ayri ayri HPV tipleri için saptama esigi ve
CE - IVD sertifikasi ile klinik kullanim için onaylanmis olan klinik olarak valide edilmis HPV
PapilloCheck testi (Greiner Bio - One) ile elde edilen sonuçlarin korelasyonu gibi
parametrelerin degerlendirilmesiyle gerçeklestirilmistir.
Analiz, onkojenik HPV tiplerinin (hrHPV) varligi için yeni test sonuçlarinin 1256 çiftini ve
onaylanmis PapilloCheck testini içermektedir. Malzeme, Zachodniopomorskie vilayeti ve
Wielkopolska vilayeti sakinlerinden rutin önleyici sitolojik incelemelerde yer alan, normal
sitolojik sonuçlara sahip 720 (% 57,3) hasta ve sitolojik incelemeleri anormal epitel hücrelerin
varligini ortaya koyan seçilmis 536 (% 42,7) kadin hastayi içeren kadinlardan toplanmistir,
bunlar su tanisal kategorilere aittir: ASC - US (n = , L - SIL
(n = . Arastirilan
kadinlarin yas ortalamasi 33 ,4 ± 9 ,6'a esittir (aralik: 16 - 66 yas). Gerçek zamanli PCR için
DNA, bir Cervex Combi firçasi (Rovers) kullanilarak bir SurePath sivi ortamina (Becton
Dickinson) toplanan sitoloji numunelerden (rahim agzi smear) izole edilmistir. DNA
izolasyonu, bir NucIiSense EasyMAG cihazinda (Biomerieux) manyetik boncuklar kullanilarak
otomatik olarak gerçeklestirilmistir. DNA amplifikasyonu bir Isik Döngüleyici 96 aparatinda
(Roche) gerçeklestirilmistir. PrepStain robotu (Becton Dickinson) kullanilarak hazirlanan ince
tabakali sitolojik slaytlar bilgisayar destekli tarama (Focal Point GS sistemi, Becton Dickinson)
kullanan deneyimli bir sitomorfolog ve patolog ekibi tarafindan degerlendirilmistir. HrHPV ve
PapilloCheck testleri kullanilarak gerçeklestirilen sitolojik ve moleküler genetik incelemelerin
sonuçlari istatistiksel bir analize tabi tutulmustur. Tasarlanan hrHPV testinde seçilen HPV'Ier
için saptama esigi (viral partiküllerin/genomlarin asgari bir sayisi) belirlenmistir. Bu amaçla
adi geçen virüslerin bilinen sayida kopyasina sahip HPV16 ve HPV18 referans malzemeleri
(Insan Papillomavirüsü için 1. WHO Uluslararasi Standardi, Ulusal Biyolojik Standartlar ve
Kontrol Enstitüsü, Ingiltere) satin alinmistir.
Gerçek zamanli PCR kullanilarak asagidaki saptama esiklerini tanimlamak için üç seri tekrarda
standart egrileri belirlemek üzere HPVI6 ve HPVI8 standartlarinin 11 seri seyreltmesi
gerçeklestirilmistir:
virüsün kopyalari
virüsün kopyalari
Ikinci saptama kanalindaki 16/18 HPV'Ier için saptama esiginin, ilk saptama kanalindaki tüm
onkojenik HPV'Iere kiyasla daha düsük olduguna dikkat etmek gerekir ki bu testin klinik
etkinligi (daha yüksek onkojenik potansiyele sahip HPV tiplerini hedeflemek) açisindan
olumlu bir fenomen gibi görünmektedir. Yeni test ve referans PapilloCheck testinin yukarida
açiklanan korelasyon katsayilari dikkate alinarak, onkojenik HPV tiplerinin saptama esiginin
her iki test için de benzer oldugu sonucuna varilabilir.
hrHPV testinin bilesenlerinin diger mikroorganizmalar ile olasi çapraz reaksiyonlari da
degerlendirilmistir. Bu amaçla mevcut literatürün gözden geçirilmesine dayanarak
(asagidakileri içerir: P. Gajer vd. Temporal dynamics of the Human vaginal microbiota,
kadinlarda üreme yolunun tipik fizyolojik sakinleri ve genitoüriner sistemin en yaygin
enfeksiyonlarina neden olan patojenler seçilmistir. Seçilen bakterilerin referans suslari ATCC:
The Global Bioresource Center'dan satin alinmistir ve sunlari içermektedir: Escherichia coli'
Lactobaci/Ius acidophilus ATCC 4356, Candida albi'cans ATCC 10231, Corynebacterium
Gerçeklestirilen deneyler sirasinda, tasarlanan primerler ve problarin sistemi arasinda hiçbir
çapraz reaksiyon elde edilmemistir ve yukarida bahsedilen mikroorganizmalar hrHPV
testinde elde edilmistir.
Sonuç olarak: çalisma onkojenik HPV tiplerinin, HPV 16/18'in ve iç kontrolün üç saptama
kanalinda tek asamali amplifikasyonu için uygun bir primerler seti ve reaksiyon karisiminin
gelistirilmesi ile sonuçlanmistir.
1256 Kadindan olusan grupta yeni testin referans testi (PapilloCheck) ile arasindaki
korelasyonun karsilastirmali çalismalari daha ileri istatistiksel analiz amaciyla yapilmistir.
HPV 16/18 ve referans testine benzer diger onkojenik HPV tipleri için klinik olarak istenen bir
Testin yüksek özgüllügünü kanitlayacak sekilde kadinlarin üreme sistemindeki diger
mikroorganizmalar ile yeni testin çapraz reaksiyonlari gözlenmemistir.
Örnek III. Onkojenik HPV virüslerinin varligini tespit etmek için yeni HR - HPV testinin
etkinligi için sonuç analizi ve istatistik
HR - HPV için yeni testin tanisal degerini saptamak için bunun onaylanmis PapilloCheck
testine (Greiner Bio - One) göre duyarliligi ve özgüllügü ölçülmüstür. Sonraki testin
literatürde iyi bilinen HPV 16/18 dahil olmak üzere HR - HPV enfeksiyonlari için optimal bir
tanisal dogrulukla karakterize edildigi varsayilmistir. Bu nedenle yeni test için referans olarak
kullanilmistir. Ek olarak her iki test için korelasyon katsayilari belirlenmistir. Bu, halihazirda
kullanilan altin standardin yeni bir araçla degistirilip degistirilemeyeceginin belirlenmesine
olanak taniyan niteliksel testlerin geçerliligi durumunda uygulanacak standart bir
prosedürdür. Analiz, NZOZ Meditest tarafindan elde edilen sitolojik ve moleküler genetik
incelemelerin sonuçlari temelinde gerçeklestirilmistir.
Yeni testlerin sonuçlari ile referans testinin sonuçlari arasindaki korelasyon düzeyi Kendall
tau b korelasyon katsayisinin degerine göre degerlendirilmistir. Gerçek pozitiflerin ve gerçek
negatiflerin sonuçlarinin yüzdesi olarak anlasilan referans testine göre yeni testin duyarliligi
ve özgüllügü, ROC analizi temelinde degerlendirilmistir. Tüm istatistiksel hesaplamalar
Statistica 10 yazilim paketi (StatSoft, Tulsa, OK, Amerika Birlesik Devletleri) kullanilarak
gerçeklestirilmistir.
Incelenen tüm grupta HR - HPV'nin saptanmasi
(> % 48 ,5) negatif sonuç üretmistir.
Test/ sonuç Referans test pozitif Referans test negatif Toplam
Yeni testin 18 (% 2 ,9) pozitif sonucu durumunda, referans testi negatif bir sonuç üretmistir.
Yeni testin 35 {> % 5 ,6) negatif sonucu durumunda, referans testi pozitif bir sonuç
üretmistir. Kendall'in tau b korelasyon katsayisi her iki test için de esittir
ROC analizi yeni testin referans testi ile karsilastirildiginda > % 94,6 duyarlilik ve % 97 ,0
özgüllük ile karakterize oldugunu göstermistir.
Incelenen tüm grupta HR - HPV 16/18'in saptanmasi
sonuç ve 1018 (% 81 ,1) negatif sonuç üretmistir.
Test / sonuç Referans test pozitif Referans test negatif Toplam
Yeni test - pozitif sonuç 223 7 230
Yeni testin 7 (% 3 ,0) pozitif sonucu durumunda, referans testi negatif bir sonuç üretmistir.
Yeni testin 15 (% 1 ,5) negatif sonucu durumunda, referans testi pozitif bir sonuç üretmistir.
Kendall'in tau b korelasyon katsayisi her iki test için de esittir:
ROC analizi, yeni testin referans testi ile karsilastirildiginda % 93 ,1 duyarlilik ve % 99 ,3
özgüllük ile karakterize oldugunu göstermistir.
HR - HPV'nin normal sitolojiye sahip grupta saptanmasi
Testlerin toplam 720 çiftinin sonuçlari analiz edilmistir. Yeni test 154 (> % 21 ,4) pozitif sonuç
(> % 77 ,1) negatif sonuç üretmistir.
Test/ sonuç Referans test pozitif Referans test negatif Toplam
Yeni test- pozitif sonuç 145 9 154
Toplam 165 555 720
Yeni testin 9 (> % 5 ,8) pozitif sonucu durumunda, referans testi negatif bir sonuç üretmistir.
Yeni testin 20 {> % 3 ,5) negatif sonucu durumunda, referans testi pozitif bir sonuç
üretmistir. Kendall'in tau b korelasyon katsayisi her iki test için de esittir:
ROC analizi, yeni testin referans testi ile karsilastirildiginda % 87,9 duyarlilik ve % 98,4
özgüllük ile karakterize oldugunu göstermistir.
HR - HPV 16/18'in normal sitolojiye sahip grupta saptanmasi
Testlerin toplam 720 çiftinin sonuçlari analiz edilmistir. Yeni testte 52 (> % 7 ,2) pozitif sonuç
667 (> 92 ,60) negatif sonuç üretmistir.
Test / sonuç Referans test pozitif Referans test negatif Toplam
Yeni test - pozitif 49 3 52
Yeni test - negatif 4 664 668
Toplam 53 667 720
Yeni testin 3 (> % 5 ,8) pozitif sonucu durumunda, referans testi negatif bir sonuç üretmistir.
Yeni testin 4 (> % O ,6) negatif sonucu durumunda, referans testi pozitif bir sonuç üretmistir.
Kendall'in tau b korelasyon katsayisi her iki test için de esittir:
ROC analizi, yeni testin referans testi ile karsilastirildiginda % 92 ,5 duyarlilik ve % 99 ,6
özgüllük ile karakterize oldugunu göstermistir.
Anormal sitolojiye sahip grupta HR - HPV'nin saptanmasi (minimum ASC - US)
Testlerin toplam 536 çiftinin sonuçlari analiz edilmistir. Yeni test 476 (> % 88 ,8) pozitif sonuç
Test/ sonuç Referans test pozitif Referans test negatif Toplam
Yeni test - pozitif 467 9 476
Yeni test - negatif 15 45 60
Toplam 482 54 536
Yeni testin 9 (% 1 ,9) pozitif sonucu durumunda, referans testi negatif bir sonuç üretmistir.
Yeni testin 15 (> % 25 ,0) negatif sonucu durumunda, referans testi pozitif bir sonuç
üretmistir. Kendall'in tau b korelasyon katsayisi her iki test için de esittir:
ROC analizi, yeni testin referans testi ile karsilastirildiginda % 96 ,9 duyarlilik ve % 83 ,3
özgüllük ile karakterize oldugunu göstermistir.
Anormal sitolojiye sahip grupta HR - HPV
Testlerin toplam 536 çiftinin sonuçlari analiz edilmistir. Yeni test 178 (> % 33 ,2) pozitif sonuç
(> % 65 ,5) negatif sonuç üretmistir.
Test/ sonuç Referans test pozitif Referans test negatif Toplam
Yeni test - pozitif 174 4 178
Toplam 185 351 536
Yeni testin 4 (% 2 ,2) pozitif sonucu durumunda, referans testi negatif bir sonuç üretmistir.
Yeni testin 11 {> % 3 ,1) negatif sonucu durumunda, referans testi pozitif bir sonuç
üretmistir. Her iki test için Kendall'in tau b korelasyon katsayisi esittir:
ROC analizi, yeni testin referans testi ile karsilastirildiginda % 94 ,1 duyarlilik ve % 98 ,9
özgüllük ile karakterize oldugunu göstermistir.
Sonuçlar
Kendall tau b katsayilarinin analizi yeni testin sonuçlarinin HR - HPV saptama kapsamindaki
referans PapilloCheck testinin sonuçlari ile % 76 ,6 ila % 91 ,5 arasinda degisen oranda çok
yüksek korelasyon ile karakterize oldugunu göstermistir. Hatta, HPV 16/18'in saptanmasi için
ideal % 95 esik degerine (> % 92 ,8 ila > % 94 ,2) yakin, daha yüksek bir korelasyon seviyesi
elde edilmistir.
Yeni testin yüksek tanisal dogrulugu hr - HPV için yüksek duyarliligi ile (hrHPV için % 87
saptanmasi için yeni testin çok yüksek özgüllügü özellikle dikkati hak etmektedir; elde edilen
degerler testin negatif bir sonucunun neredeyse % 100 olasilikla HPV 16 veya HPV 18
enfeksiyonunun varligini içermedigini kanitlamaktadir. Normal ve anormal sitolojik inceleme
sonuçlari olan hastalarin her iki alt grubunda da yeni testin yüksek düzeyde korelasyon,
duyarlilik ve özgüllügünün gözlenmesi bu aracin çok yönlülügünü dogrulamaktadir.
Sonuç olarak: Yapilan arastirmalar neticesinde bulusa göre hrHPV testinin sonuçlarinin,
dogrulanmis klinik olarak ticari referans testinin (PapilloCheck) sonuçlari ile çok yüksek bir
korelasyonu elde edilmis ve bulusa göre hrHPV testinin duyarliligi ve özgüllügü referans
testine (PapilloCheck) göre dogrulanmistir.
Prekanseröz Iezyonlarin ve rahim agzi kanserinin saptanmasi için yeni HR - HPV testinin
klinik etkinliginin belirlenmesi
Bir SurePath sivi ortami üzerinde toplanan rahim agzindan sitoloji numunelerinde yeni hrHPV
testini kullanarak, bir mikroskop görüntüsü ile korelasyonun ileri istatistik analizleri için ve
yeni testin klinik etkinliginin belirlenmesi için 5000 kadin içeren klinik popülasyon tabanli bir
çalisma yürütülmüstür.
Analiz, önleyici incelemelerde ve prekanseröz Iezyonlarin ve rahim agzi kanserinin teshisinde
yeni hrHPV testinin klinik yararliligini belirlemeyi amaçlamistir. Yeni testin tanisal etkinligini
belirlemek için rahim agzi kanser profilaksisinin bir parçasi olan rutin sitolojik muayeneler
için basvuran büyük bir grup kadin incelenmistir. Elde edilen moleküler genetik sonuçlarin,
Becton Dickinson firmasinin standartlastirilmis SurePath yöntemi kullanilarak hazirlanan ve
2001 yilinda Bethesda siniflandirma sistemine göre kalifiye sitomorfologlar ve patologlar
tarafindan degerlendirilen bir sivi ortamda sitolojik slaytlarin mikroskopik görüntüsü ile
korelasyonu belirlenmistir. Mikroskobik degerlendirmenin daha yüksek bir nesnelestirilmesi
için slaytlar, bilgisayar tarafindan degerlendirilen otomatik tarama (Becton Dickinson
sirketinin FocaIPoint sistemi) kullanilarak degerlendirilmistir.
Analiz, HR - HPV`nin varligina iliskin yeni test sonuçlarinin 5000 çiftini ve sivi ortamdaki
sitolojik incelemelerin sonuçlarini içermistir. Malzeme Zachodniopomorskie vilayetinden ve
Wielkopolska vilayetinden rutin sitolojik inceleme için basvuran ardisik kadinlardan
toplanmistir. HR - HPV varligini kontrol eden doktorlar tarafindan muayene edilen hastalar ve
jinekolojik ve onkolojik anormallikler öyküsü olan hastalar analizden çikarilmistir. Arastirilan
sonuçlari 4825 (% 96 ,5) normal preparat (anormal epitel hücreleri yok), ASC - US'a karsilik
gelen lezyonlara sahip 77 (% 1,55)preparatlar, ASC - H'ye karsilik gelen lezyonlar sahip 6 (%
O ,1) preparatlar, L - SIL'ye karsilik gelen lezyonlara sahip 77 (% 1 ,55) preparatlar ve H - SlL'e
karsilik gelen lezyonlara sahip 15 (% 0 ,3) preparatlari içermektedir.
Yukarida tarif edilene benzer bir sekilde gerçek zamanli PCR için DNA, bir Cervex Combi
firçasi (Rovers) kullanilarak bir SurePath sivi ortamina (Becton Dickinson) toplanan sitoloji
numunelerden (rahim agzi smear) izole edilmistir. DNA izolasyonu, bir NucliSense EasyMAG
cihazinda (Biomerieux) manyetik boncuklar kullanilarak otomatik olarak gerçeklestirilmistir.
PCR, bir PIRO otomatik pipetleme istasyonu (Domier LTF) kullanilarak hazirlanmistir. DNA
amplifikasyonu bir Isik Döngüleyici 96 aparatinda (Roche) gerçeklestirilmistir. Yukarida
bahsedildigi gibi PrepStain robotu (Becton Dickinson) kullanilarak hazirlanan ince tabakali
sitolojik slaytlar bilgisayar destekli tarama (Focal Point GS sistemi, Becton Dickinson)
kullanan deneyimli bir sitomorfolog ve patolog ekibi tarafindan degerlendirilmistir. Sitolojik
ve moleküler genetik incelemelerin sonuçlari istatistiksel bir analize tabi tutulmustur.
Prekanseröz lezyonlari ve rahim agzi kanserini saptamak için yeni HR - HPV testinin klinik
etkinliginin sonuç analizi ve istatistikleri
HR - HPV için yeni testin klinik yararliligini belirlemek amaciyla sivi ortamda (SurePath,
Becton Dickinson) sitolojik incelemede pozitif (PPV) ve negatif (NPV) belirleyicilik degerinin
degerleri kullanilmistir. Bu nedenle yeni testin pozitif sonucuna sahip hastalarda sitolojik
incelemede anormal bir sonuç elde etme ve HR - HPV varligi açisindan testin negatif bir
sonucu ile birlikte sitolojik incelemede normal bir sonuca sahip olma olasiligi belirlenmistir.
Yeni testin yüksek bir negatif tahmin degeri dogrulanirsa, olumsuz sonucu sitolojik bir
incelemeyi terk etmeye izin verir ve bunun olumlu sonucu gerçeklestirilmesi için bir kriter
olabilir.
Yeni hrHPV testinin sonuçlari ile sitolojik inceleme sonuçlari arasindaki korelasyon düzeyi
Kendall tau b korelasyon katsayisinin degerine göre degerlendirilmistir. Pozitif belirleyicilik
degeri (PPV, HR - HPV varligi için testin sonucunun pozitif oldugu bir kiside sitolojik
incelemenin anormal sonucunun olasiligi) ve negatif belirleyicilik degeri (NPV, HR - HPV
varligi için testin negatif sonucu ile birlikte bir bireyde sitolojik bir incelemenin normal bir
sonucunun olasiligi) ROC analizine göre degerlendirilmistir. Tüm istatistiksel hesaplamalar
Statistica 10 yazilim paketi (StatSoft, Tulsa, OK, Amerika Birlesik Devletleri) kullanilarak
gerçeklestirilmistir.
HR - HPV saptamasina karsi sitolojik incelemenin anormal bir sonucu (ASCUS minimum)
Toplam 5000 çift hrHPV testi ve sitolojik inceleme sonuçlari analiz edilmistir. Yeni test 403 (%
8,1) olumlu sonuç ve 4597 (% 91,9) olumsuz sonuç üretmistir. Sitolojik incelemenin sonuçlari
Test/ sonuç Anormal Sitoloji (min. ASCUS) Normal Sitoloji Toplam
Yeni test- pozitif sonuç 168 235 403
Yeni test- negatif sonuç 7 4590 4597
Yeni testin pozitif sonucuna sahip 235 (% 58 ,3) hastada sitolojik incelemede normal bir
sonuç elde edilmistir. Yeni testin negatif sonucuna sahip 7 (% 0 ,2) hastada sitolojik inceleme
anormal bir sonuç vermistir. Kendall'in HR - HPV varligi için testin tau b korelasyon katsayisi
ve sitolojik incelemenin sonucu b = 0 ,6152294'e esittir.
ROC analizi, yeni testin sitolojik bir inceleme sonuçlarina kiyasla % 41 ,7'lik bir pozitif
belirleyicilik degeri (PPV) ve % 99 ,8`lik bir negatif belirleyicilik degeri (NPV) ile karakterize
oldugunu göstermistir.
HR - HPV saptamasina karsi sitolojik incelemenin anormal bir sonucu (H - SIL)
Toplam 5000 çift hrHPV testi ve sitolojik inceleme sonuçlari analiz edilmistir. Yeni test 403 (%
8,1) olumlu sonuç ve 4597 {% 91 ,9) olumsuz sonuç üretmistir. Sitolojik incelemenin
sonuçlari, H - SIL ve 4985 (> % 99 ,7) normal slaytlara veya H - SIL'den daha düsük
yogunluktaki slaytlara karsilik gelen Iezyonlu 15 (% 0 ,3) slayt içermektedir.
Test / sonuç Anormal Sitoloji (H - SIL) Normal Sitoloji Toplam
Yeni test - pozitif sonuç 15 388 403
Yeni test - negatif sonuç 0 4597 4597
Yeni testin pozitif sonucuna sahip 388 (% 96 ,3) hastada sitolojik incelemede H - SIL'e karsilik
gelen lezyon görülmemistir. Yeni testin negatif sonucuna sahip hastalarda sitolojik
incelemede H - SIL'e karsilik gelen lezyon görülmemistir. Kendall'in HR - HPV varligi için testin
tau b korelasyon katsayisi ve sitolojik incelemenin sonucu b = 0 ,1852669`e esittir.
ROC analizi, yeni testin sitolojik bir inceleme sonuçlarina kiyasla % 3 ,7'Iik bir pozitif
belirleyicilik degeri ve % ile karakterize oldugunu
göstermistir.
HR - HPV 16/18 saptamasina karsi sitolojik incelemenin anormal bir sonucu (ASCUS
Toplam 5000 çift test ve sitolojik inceleme sonuçlari analiz edilmistir. Yeni test 169 (% 3 ,4)
(% 3 ,5) anormal slayt ve 4825 (% 96 ,5) normal slayttan olusmustur.
Test/ sonuç Anormal Sitoloji (min. ASCUS) Normal Sitoloji Toplam
Yeni test - pozitif sonuç 71 98 169
Yeni testin pozitif sonucuna sahip 98 (% 58 ,0) hastada sitolojik incelemede normal bir sonuç
elde edilmistir. Yeni testin negatif sonucuna sahip 104 (% 2 ,2) hastada sitolojik inceleme
anormal bir sonuç vermistir. Kendall'in HR - HPV 16/18varligi için testin tau b korelasyon
katsayisi ve sitolojik incelemenin sonucu b = 0 ,3919416'e esittir.
ROC analizi, yeni testin sitolojik bir inceleme sonuçlarina kiyasla % 42'lik bir pozitif
belirleyicilik degeri ve % 97 ,8'Iik bir negatif belirleyicilik degeri (NPV) ile karakterize
oldugunu göstermistir.
Toplam 5000 çift test ve sitolojik inceleme sonuçlari analiz edilmistir. Yeni test 169 (% 3 ,4)
pozitif sonuç ve 4831 (% 96 ,6) negatif sonuç üretmistir. Sitolojik incelemenin sonuçlari, H -
SIL'den daha düsük yogunluktaki Slaytlari içermektedir.
Test/sonuç Anormal Sitoloji (H - Normal Sitoloji ya da H - Toplam
Yeni testin pozitif sonucuna sahip 159 (% 94 ,1) hastada sitolojik incelemede H - SIL'e karsilik
gelen lezyon görülmemistir. Yeni testin negatif sonucuna sahip 5 (% 0 ,1) hastada sitolojik
incelemede H - SIL'e karsilik gelen lezyonlar görülmüstür. Kendall'in HR - HPV varligi için
testin tau b korelasyon katsayisi ve sitolojik incelemenin sonucu b = 0 ,1921027'ye esittir.
ROC analizi, yeni testin sitolojik bir inceleme sonuçlarina kiyasla % S ,9'luk bir pozitif
belirleyicilik degeri ve % 99 ,9'Iukbir negatif belirleyicilik degeri (NPV) ile karakterize
oldugunu göstermistir.
Sonuçlar
Yeni testin klinik degerinin analizi, sivi ortamdaki sitolojik incelemenin sonucuna kiyasla
optimal bir negatif öngörü degeri (% 97 ,8'den% 100'e) ile karakterize oldugunu ortaya
çikarmistir. Prekanseröz Iezyonlara (H - SIL) göre HR - HPV için negatif sonuç için özellikle
Pozitif belirleyicilik degerinin alt seviyesi her sitolojik anormallige, özellikle ASC - US ve ASC -
H tiplerinin sitolojik tanisini alan grupta aktif bir HPV enfeksiyonunun eslik etmesinin
gerekmedigi düsünüldügünde tam olarak anlasilabilir. HrHPV testi için belirleyicilik degerinin
daha uygun katsayilarinin, geleneksel bir sitoloji ile karsilastirildiginda elde edilebilmesi
beklenmektedir ki bu sivi ortamdaki sitolojik yöntemlerle karsilastirildiginda anormal rahim
agzi epitel hücrelerinin saptanmasinda daha az etkinligin kanitlanmis olmasi ile karakterize
edilir (sivi bazli sitoloji, LBC).
Elde edilen sonuçlar yeni testin pozitif bir sonucu durumunda sitolojik incelemeye gerek
olmadigini göstermektedir. Bu nedenle yeni testin kullanilmasi büyük bir HPV - negatif kadin
popülasyonunda sitolojik incelemeyi terk etmeyi saglama potansiyeline sahip olabilir ve bu
da önemli tasarruflar saglayacaktir.
Bununla birlikte testin daha düsük pozitif belirleyicilik degeri nedeniyle her pozitif durum
sitoloji için bir gösterge olmalidir. Bu baglamda yeni testin bir baska avantaji üzerinde
durulmalidir: Bir sivi ortam üzerinde bir sitolojik inceleme için kullanilan ayni malzeme
üzerinde gerçeklestirilmis olmasi. Buna göre hrHPV testinin pozitif bir sonucu durumunda
sitolojik inceleme ayni materyali kullanarak, hastadan ilave smearlarin toplanmasi
gerekmeden gerçeklestirilebilir. Bu, tanisal prosedürün süresini önemli ölçüde kisaltir ve
maliyetini önemli ölçüde azaltir.
Sonuç olarak: Yapilan arastirmalarin sonuçlarina dayanarak bulusa göre olan hrHPV testinin
bir sivi ortam (SurePath) üzerinde bir sitolojik muayene sonucuna kiyasla optimal bir negatif
belirleyicilik degeri (% 97 ,8'den % 100'e kadar) ile karakterize edildigi ve yüksek klinik etkililik
ile yeni hrHPV testinin kullanilmasinin, HR - HPV - negatif kadinlarin büyük bir
popülasyonunda potansiyel olarak sitolojik incelemeyi terk etmeye izin verebilicegi
bulunmustur.
Bulus sitolojik ve HPV incelemelerinin özelliklerini birlestiren bir test olan yenilikçi bir tani
araci saglar. Bulusa uygun testin koruyucu programlara uygulanmasi, rahim agzi kanseri
taramasinin etkinligini önemli ölçüde arttirmali ve daha ileri tani ve tedavi maliyetlerini
rasyonel hale getirmelidir. Ayrica tercihen bir sivi ortam (LBC) üzerindeki sitolojiden gelen
materyaldeki gerçek zamanli PCR teknigine dayanan basit bir HPV testinin kullanilmasi,
önleyici programlara katilan Iaboratuvarlarda tani sürecinin daha büyük bir otomasyonuna
ve kapasitesine imkan verecektir. Testin uygulanmasi rahim agzi kanseri riskinin
belirlenmesini ve yeterli tedavinin seçilmesini saglayacaktir. Ayrica daha önce HPV
tanilamasinda kullanilmamis olan LNA teknolojisinin yenilikçi kullanimi, en yüksek klinik
düzeydeki tanilamaya yaygin bir erisim saglar.
DIZI LISTESI
<110> Centrum Onkologii - Instytut im. Marii Skgodowskiej - Curie
Podolski, Jacek
<120> Onkojenik HPV Virüslerinin Varligini Saptamak için Tarama Testi
<130> PZ/2433/AG
<150> P ,407864
<160> 72
<170> Patentln version 3 ,5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 33/33n F için bir primer
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 5
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 6
<210> 7
<211>19
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 7
<210> 8
<211>20
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 9
<210> 10
<211>21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 56/66 F için bir primer
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 11
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 12
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 13
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 14
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 18/45 R için bir primer
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 16
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 18
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 16 F HEX için bir primer
<400> 19
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 16 R HEX için bir primer
<400> 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 18 F HEX için bir primer
<400> 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 18 R HEX için bir primer
<400> 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HBEl IC F için bir primer
<400> 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HBEl IC R Için bir primer
<400> 24
<210> 25
<211> 10
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HR - HPV için bir dizi
<400> 25
<210> 26
<211> 10
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 33n'nin bir dizisi
<400> 26
<210>27
<211>15
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 16/18'in bir dizisi
<400> 27
<210> 28
<211>3O
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HBEl'nin bir dizisi
<400>28
<210>29
<211> 10
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HR - HPV için bir prob
<220>
<221> muhtelif nitelikler
<222> (1). . (1)
<223> 5' - 6FAM
<220>
<221> muhtelif nitelikler
<222>(10i.(10)
<223>BHQ-1-3'
<400>29
<210>30
<400>30
<210>31
<211>15
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> 16/18 için bir prob
<220>
<221> muhtelif nitelikler
<222> (1). . (1)
<223>5`-HEX
<220>
<221> muhtelif nitelikler
<222>(6)..(6)
<223> "W", A/T bazinin bir degisimini belirtir
<220>
<221> muhtelif nitelikler
<222>(15i-(15)
<223> BHQ - 1 - 3'
<400> 31
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> IC için bir prob
<220>
<221>rnuhtehfnüeHHer
<222> (1). . (1)
<223>5'-ROX
<220>
<221>rnuhtehfnüeHHer
<222> (30). . (30)
<223>BHQ-2-3'
<400>32
<210>33
<211>18O
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<223>HPV16genomununböge9
<400>33
<210>34
<211>10
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<223>pan-HPVFNobuHehedeHenenHPVgenomununkonymwüsbößeý
<400>34
<210>35
<211>240
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<223> HPV 33n genomunun bölgesi
<400> 35
<210> 36
<211> 10
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> 33n probu ile hedeflenen HPV 33n genomunun bölgesi
<400> 36
<210> 37
<211> 240
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 37
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 16 probu
<400> 38
<210>39
<211>15
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 18 probu
<400> 39
<210> 40
<211> 420
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 40
<210> 41
<211>24O
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 41
<210>42
<211> 10
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<223>pan-HPVrwobuHehedeHenenkon$Nßüsbößeýnekmsmkgemngen
tamamhwupan-HM/mobdüm
<400>42
<210> 43
<211> 194
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<223> HPV 16 F primerleri ve ortak geri primer ile elde edilen örnek PCR ürünü
<400> 43
<210>44
<211> 1950
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<400> 44
<210> 45
<211>21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
geninin bölgesi
<400>45
<210> 46
<211> 1974
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 46
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> geri primer HPV 18/45 R ile hedeflenen HPV18 El genomu bölgesi
<400> 47
<210> 48
<211> 2002
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400>48
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 49
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> SEQ ID NO: 49'un geri tamamlayicisi
<400> 50
<210>51
<211> 1891
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400>51
4' -i'qc
.'1' ",'.'|'. I'
<210> 52
<211>1914
tz-aziwri:
.7' . 4.-:
4' -›;--44' i ma” 14--
.2'1' 1' : t'zl :tti'
* 37 -`.›`.i;.
l :1::3::. :'ln: :.
11'..! '.`i".`.'.i}
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 52
t“:q:-:r.c :-::-sl:cü
l::q:u;l.: ::QJ.JL:J:
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213>yapay
<220>
dizisinin bölgesi
<400> 53
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<223> SEQ ID NO: 53'ün geri tamamlayicisi
<400>54
<210> 55
<211> 1943
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400>55
<210> 56
<211> 1931
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400>56
<210> 57
<211>1800
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 57
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 51 için geri primerin hibritlestigi dizi
<400>58
<210>59
<211> 1943
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 59
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> geri primer ile hedeflenen HPV 52'nin bölgesi
<400> 60
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> SEQ ID NO: 60'in geri tamamlayicisi
<400> 61
<210> 62
<211> 1911
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 62
<210> 63
<211> 1893
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 63
<210>64
<211>21
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<400> 64
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> SEQ ID NO: 64'ün geri tamamlayicisi
<400> 65
<210> 66
<211> 1935
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 66
<210> 67
<211> 1934
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<400> 67
<210> 68
<211>24
<212> DNA
<213> yapay
<220>
4 :l: .IJ
<223> HPV 59 için geri primer ile hedeflenen bölge, m bir nükleotit degisimi c/a'yi
belirtir
<400> 68
<210> 69
<211> 1923
<212> DNA
<213>yapay
<220>
<400> 69
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV68 için geri primerin hibritlestigi HPV68'in bölgesi
<400> 70
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV 16 R HEX için hedef dizisi
<400> 71
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> yapay
<220>
<223> HPV18 R HEX için hedef dizisi
<400> 72
Claims (5)
- ISTEMLER
- Bir numunenin onkojenik insan papilloma virüsü (HPV) için test sonucunun pozitif olup olmadigini belirlemeye yönelik bir yöntem, yöntem asagidakileri içermekte olup: onkojenik HPV genomlarinin bir hedef bölgesinin gerçek zamanli polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu için primerler ile numunenin birlestirilmesini ve hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine sinyal gönderebilen etiketli bir pan - HPV probunu, gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasini ve etiketli pan - HPV probundan yayilan bir sinyalin ölçülmesini içerir, burada sinyalin saptanmasi numunenin onkojenik HPV için pozitif oldugunu gösterir, özelligi; pan - HPV probunun ACTTTCGTTT dizisini (SEQ ID NO: 25) veya bunun ters tamamlayicisini içeren bir etiketli kilitli nükleik asit (LNA) molekülü olmasidir. istem 1'e göre bir yöntem olup, özelligi; pan - HPV probunun ACTTTCGTTT'den (SEQ ID
- NO: 25) meydana gelen bir etiketli 10 - nükleotit moleküllü dizisi veya bunun geri tamamlayicisi olmasi ve /veya pan - HPV probun 5' ucunda bir florofor ile ve 3' ucunda söndürücü ile etiketlenmesi ve burada bir hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine yayilan
- Istem 1'e göre bir yöntem olup, özelligi; primerlerin HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, herhangi birinin bir hedef bölgesinin amplifikasyonu için olmasi ve / veya HPV16, HPV18, veya HPV66'nin tamaminin bir hedef bölgesinin amplifikasyonu için numunenin primerlerin bir kombinasyonu ile birlestirilmesini içermesidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; primerlerin asagidaki primer çiftlerinden bir veya daha fazlasini içermesi: a) HPV16 için SEQ ID NO: 1 ve SEQ lD NO: 14 b) HPVI8 için SEQ ID NO: 2 ve SEQ ID NO:15 c) HPV33/33n için SEQ ID NO: 3 ve SEQ ID NO: 14 d) HPV31 için SEQ ID NO: 4 ve SEQ ID NO: 14 e) HPV35 için SEQ io NO: 5 ve 550 ID NO: 14 f) HPV39 için seo ID NO: 6 ve SEO ID NO: 14 g) HPV45 için SEQ lD NO: 7 ve SEQ ID NO:15 h) HPV51 için SEQ ID NO: 8 ve SEO ID NO:16 i) HPV52 için SEQ ID NO: 9 ve SEO ID NO: 14 j) HPV56/66 için SEQ ID NO:10 ve SEO ID NO: 14 k) HPV58 için SEQ lD NO:11 ve SEQ ID NO: 14 i) HPV59 için SEQ io NO:12 ve SEO ID NO: 17 m) HPV68 için SEQ ID NO:13 ve SEQ ID NO:18 ve/veya burada primerlerin (a) ila (m) primer çiftlerinin tümünü içermesidir.
- 5. Önceki istemlerden herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; HPV16, HPV18, HPV68'in bir hedef bölgesinin amplifikasyonu için numunenin primerler ile birlestirilmesini, etiketli pan - HPV probundan bir sinyalin saptanmasini ve HPV58, HPY59, HPV66 veya HPV66 için test sonucunun pozitif oldugu sonucuna varilmasini içermesidir. Istem 1 ila 7'den herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; HPV16, HPY18, HPV31, HPV68'in bir hedef bölgesinin amplifikasyonu için numunenin primerlerle birlestirilmesini, etiketli pan - HPV probundan hiç bir sinyalin saptanmamasini ve varilmasini içermesidir. . Önceki istemlerden herhangi birine göre bir yöntem olup ayrica HPV33n'nin bir hedef bölgesinin amplifikasyonu için numunenin primerler ile birlestirilmesini ve hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine bir sinyal yayabilen bir etiketli 33n probunu, burada 33n probu ve pan - HPV probu ayni etiketi tasir, gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasini ve etiketli 33n probu veya pan - HPV probundan yayilan bir sinyalin ölçülmesini içerir, burada sinyalin saptanmasi numunenin onkojenik HPV için pozitif oldugunu gösterir, özelligi; 33n probunun ACTTTCGCTT (SEQ ID NO: 26) dizisini içeren bir etiketli kilitli nükleik asit (LNA) molekülü veya bunun geri tamamlayicisi olmasi veya /ve 33n probunun ACTTTCGCTT'den (SEQ ID NO: 26) meydana gelen bir etiketli 10 nükleotit moleküllü dizi veya bunun geri tamamlayicisi olmasidir. Istem 10'a göre bir yöntem olup, özelligi; pan - HPV probu ve 33n probunun 5' ucunda bir florofor ile ve 3' ucunda bir söndürücü ile etiketlenmesi ve burada ilgili hedef bölgelerin amplifikasyonu üzerine yayilan sinyalin ayni dalga boyunda flüoresans olmasidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre bir yöntem olup ayrica numunenin HPVI6 veya HPVI8 için test sonucunun pozitif olup olmadiginin saptanmasini içerir, yöntem HPV16 ve HPV18 genomlarinin bir hedef bölgesinin gerçek zamanli PCR amplifikasyonu için numunenin primerler ile birlestirilmesini içerir ve hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine bir sinyal yayabilen etiketli bir 16/18 probu, gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasi ve etiketli 16/18 probundan bir sinyalin ölçülmesini içerir, burada bir sinyalin saptanmasi numunenin HPVl6 veya HPV18 için test sonucunun pozitif oldugunu gösterir, özelligi; dizisini içeren bir etiketli kilitli nükleik asit (LNA) molekülü olmasidir. Bir numunenin onkojenik insan papilloma virüsü (HPV) HPV16 ve /veya HPV18 için pozitif olup olmadigini belirlemeye yönelik bir yöntem olup, yöntem HPV 16 ve HPV 18 genomlarinin bir hedef bölgesinin gerçek zamanli PCR amplifikasyonu için primerler ile numunenin birlestirilmesini ve hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine bir sinyal yayabilen etiketli bir 16/18 probu, gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasi ve etiketli 16/18 probundan bir sinyalin ölçülmesini içerir, burada bir sinyalin saptanmasi numunenin HPVI6 veya HPV18 için test sonucunun pozitif oldugunu gösterir, özelligi; dizisini içeren bir etiketli kilitli nükleik asit (LNA) molekülü veya bunun geri tamamlayicisi olmasidir. Istem 13 veya 14`e göre bir yöntem olup, özelligi; 16/18 probunun ATATCWGATGACGAG`den (SEQ ID NO: 27) meydana gelen bir dizinin 15 nükleotitli bir molekülü veya bunun geri tamamlayicisi olmasidir. Istem 13 veya istem 15'e göre bir yöntem olup, özelligi; 16/18 probunun pan - HPV probundan farkli bir etiket tasimasidir. Istem 13 ila 16'dan herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; 16/18 probunun 5i ucunda bir florofor ile ve 3' ucunda bir söndürücü ile etiketlenmesi ve burada hedef bölgenin amplifikasyonu üzerine yayilan sinyalin flüoresans olmasidir. Istem 16 veya 17'ye göre bir yöntem olup, özelligi; 16/18 probunun pan - HPV probundan farkli bir dalga boyunda bir flüoresans sinyal yaymasidir. Istem 13 ila 18'den herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; primerlerin asagidaki primer çiftlerinden bir veya daha fazlasini içermesidir: a) HPV16 için SEQ ID NO: 19 ve SEO lD NO:20 b) HPVI8 için SEQ ID NO:21 ve SEO ID NO:22 Önceki istemlerden herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; ayrica gerçek zamanli PCR için bir pozitif kontrolün gerçeklestirilmesini, bir kontrol DNA dizisinin tercihen bir insan DNA'sinin gerçek zamanli PCR amplifikasyonu için numunenin primerler ile birlestirilmesini ve kontrol DNA dizisinin tercihen insan DNA'sinin amplifikasyonu üzerine sinyal yayabilen bir etiketli kontrol probunu, gerçek zamanli PCR için kosullarin saglanmasini ve kontrol probundan gelen bir sinyalin ölçülmesini içermesi, burada sinyalin saptanmasinin gerçek zamanli PCR'nin islevsel oldugunu göstermesidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; numunenin bir insan rahim agzi smearinden sivi bazli bir Sitoloji örnegi olmasidir. Bir bilesim olup, özelligi; nükleotit dizisi ACTTTCGTTT (SEQ ID NO: 25) veya bunun geri tamamlayicisini içeren bir etiketli nükleik asit probu ve saptanabilir bir etiket içermesidir. Istem 23'e göre bir bilesim olup, özelligi; probun LNA nükleotitlerini içermesidir. Istem 23 veya istem 24'e göre bir bilesim olup, özelligi; probun bir florofor ve bir söndürücü ile etiketlenmis olan, ACTTTCGTlT'den (SEQ ID NO: 25) meydana gelen 10 - nükleotit moleküllü bir dizi olmasidir. Istem 23 ila 25'den herhangi birine göre bir bilesim olup, özelligi; probun 5' ucunda bir florofor ile ve 3' ucunda bir söndürücü ile etiketlenmesidir. HPV'nin saptanmasi için gerçek zamanli PCR'nin gerçeklestirilmesinde Istem 23 ila 26'dan herhangi birine göre bir bilesimin kullanilmasi.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL407864A PL235847B1 (pl) | 2014-04-11 | 2014-04-11 | Zestaw i sposób do wykrywania obecności onkogennych wirusów HPV |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201809154T4 true TR201809154T4 (tr) | 2018-07-23 |
Family
ID=53177861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/09154T TR201809154T4 (tr) | 2014-04-11 | 2015-04-11 | Onkojeni̇k hpv vi̇rüsleri̇ni̇n varliğinin beli̇rlenmesi̇ i̇çi̇n tarama testi̇. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20170029908A1 (tr) |
| EP (1) | EP3129512B1 (tr) |
| JP (1) | JP2017513522A (tr) |
| AU (1) | AU2015244506A1 (tr) |
| CA (1) | CA2945477A1 (tr) |
| ES (1) | ES2684746T3 (tr) |
| HU (1) | HUE039321T2 (tr) |
| PL (1) | PL235847B1 (tr) |
| TR (1) | TR201809154T4 (tr) |
| WO (1) | WO2015156693A1 (tr) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3279337A1 (en) * | 2016-08-04 | 2018-02-07 | Servizo Galego de Saúde (SERGAS) | Use of short probes between 8 and 9 nucleotides in multiplex assays |
| CN110699472A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-01-17 | 四川大学华西第二医院 | 一种用于鉴定hpv高危人群的标志物及其引物和检测方法 |
| CN112195277B (zh) * | 2020-10-29 | 2022-07-26 | 北京康美天鸿生物科技有限公司 | 基于实时荧光定量pcr检测人乳头瘤病毒的引物探针组以及试剂盒 |
| WO2025057766A1 (ja) * | 2023-09-15 | 2025-03-20 | 株式会社カネカ | 核酸検出方法、試薬及びキット |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2629458B2 (fr) * | 1987-07-31 | 1991-08-09 | Ire Celltarg Sa | Nouvelles sondes d'acides nucleiques specifiques de differents types de virus de papillome humain |
| BE1006179A3 (fr) * | 1992-09-22 | 1994-05-31 | Lambdatech S A | Conjugue destine a la detection et/ou au dosage d'un compose biologique. |
| RU2008141977A (ru) * | 2006-03-24 | 2010-05-27 | Новартис АГ (CH) | КОМПОЗИЦИИ dsPHK И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ HPV-ИНФЕКЦИИ |
| EP1997914A1 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-03 | Università Degli Studi Di Milano - Bicocca | Identification and quantification of oncogenic HPV nucleic acids by means of real-time PCR assays |
| CA2726396C (en) * | 2008-04-17 | 2019-03-19 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Compositions, methods, and kits using synthetic probes for determining the presence of a target nucleic acid |
| JP6103941B2 (ja) * | 2010-01-29 | 2017-03-29 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物 |
| EP2678442B1 (en) * | 2011-02-24 | 2019-01-16 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for detection of hpv nucleic acid |
-
2014
- 2014-04-11 PL PL407864A patent/PL235847B1/pl unknown
-
2015
- 2015-04-11 JP JP2017505038A patent/JP2017513522A/ja active Pending
- 2015-04-11 EP EP15722601.0A patent/EP3129512B1/en not_active Not-in-force
- 2015-04-11 TR TR2018/09154T patent/TR201809154T4/tr unknown
- 2015-04-11 HU HUE15722601A patent/HUE039321T2/hu unknown
- 2015-04-11 WO PCT/PL2015/050007 patent/WO2015156693A1/en not_active Ceased
- 2015-04-11 CA CA2945477A patent/CA2945477A1/en not_active Abandoned
- 2015-04-11 US US15/303,503 patent/US20170029908A1/en not_active Abandoned
- 2015-04-11 ES ES15722601.0T patent/ES2684746T3/es active Active
- 2015-04-11 AU AU2015244506A patent/AU2015244506A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2684746T3 (es) | 2018-10-04 |
| EP3129512A1 (en) | 2017-02-15 |
| HUE039321T2 (hu) | 2018-12-28 |
| WO2015156693A1 (en) | 2015-10-15 |
| CA2945477A1 (en) | 2015-10-15 |
| PL407864A1 (pl) | 2015-10-12 |
| US20170029908A1 (en) | 2017-02-02 |
| AU2015244506A1 (en) | 2016-11-03 |
| PL235847B1 (pl) | 2020-11-02 |
| EP3129512B1 (en) | 2018-03-28 |
| JP2017513522A (ja) | 2017-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2313483C (en) | Assessment of human papilloma virus-related disease | |
| Nam et al. | Factors associated with HPV persistence after conization in patients with negative margins | |
| Eide et al. | HPV detection methods and genotyping techniques in screening for cervical cancer | |
| US10988816B2 (en) | Compositions and methods for detecting human papillomavirus nucleic acid | |
| TR201809154T4 (tr) | Onkojeni̇k hpv vi̇rüsleri̇ni̇n varliğinin beli̇rlenmesi̇ i̇çi̇n tarama testi̇. | |
| Lippert et al. | Targeted next generation sequencing panel for HPV genotyping in cervical cancer | |
| KR100914911B1 (ko) | 실시간 중합효소 연쇄반응과 ｈｐｖ ｄｎａ 칩을 이용한정량 및 정성적 인유두종바이러스 검사 방법 및 이를 위한검사키트 | |
| AU2006314297B2 (en) | Method of detecting pathogens | |
| CN109609696B (zh) | 用于检测人乳头瘤病毒的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 | |
| Oliveira et al. | Human papillomavirus status and cervical abnormalities in women from public and private health care in Rio de Janeiro State, Brazil | |
| ES2525233T3 (es) | Identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénicos por medio de ensayos de PCR en tiempo real | |
| Mudhigeti et al. | Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for detection and typing of human papilloma virus 16 and 18 from endocervical samples | |
| KR101579298B1 (ko) | 개선된 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트 | |
| KR101402204B1 (ko) | 리퀴드 비드 어레이와 다중중합효소연쇄반응법을 이용한 종양원성 인유두종바이러스 검출 방법 | |
| Hamzan et al. | Real-time loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Human Papillomavirus 16 in oral squamous cell carcinoma | |
| WO2012033828A2 (en) | Methods for detecting human papillomavirus-associated cancers | |
| TWI757239B (zh) | 檢測ｈｐｖ之方法、擴增混合物及套組 | |
| Bicskei et al. | A comparison of the linear array and the automated INNO-liPA HPV genotyping systems on pathological specimens | |
| Wang et al. | Analytical performance evaluation of the HPV OncoCheck assay for detection of high-risk HPV infection in liquid-based cervical samples | |
| Lyu et al. | Development and validation of a method for human papillomavirus genotyping based on molecular beacon probes | |
| Stroe et al. | The prevalence of hrHPV in a significant cohort of Romanian women | |
| Weynand et al. | Validation of ThermoFisher's Papspin for human papillomavirus detection in cervicovaginal specimens using PCR with GP5+/GP6+ primers and the Hybrid Capture II assay | |
| US20220205057A1 (en) | Composition of primers for detecting high grade squamous intraepithelial lesion | |
| Toro de Méndez et al. | Detection and Genotyping of Human Papillomavirus DNA Using Polymerase Chain Reaction Short PCR Fragment 10–Line Probe Assay in Abnormal Papanicolaou-Stained Cervicovaginal Smears | |
| M. Garland | HPV DNA detection: clinical applications |