TR201810703T4

TR201810703T4 - Yeni protein saflaştırma yöntemleri.

Info

Publication number: TR201810703T4
Application number: TR2018/10703T
Authority: TR
Inventors: Brown Arick; Ji Junyan; Liu Jun; John Wang Yuchang
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2018-08-27
Also published as: US20140309403A1; HRP20181357T1; ES2685079T3; EP2697369B1; HK1194434A1; MX2013010737A; US10906934B2; CA2830640A1; EP2697369A1; WO2012134987A1; KR20140022845A; PL2697369T3; SG193564A1; EP2697369A4; AU2012237026A1; SI2697369T1; BR112013024521A2; CN103582700B; CN103582700A; IL228438A0

Abstract

Mevcut buluş, filtrasyondan önce sulu çözeltiye bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir madde ekleyerek virüs parçacıklarını ve en az bir proteini içeren sulu çözeltilerden virüs parçacıklarının çıkarıldığı proseslerde ultrafiltrasyon membranlarının kirlenmesinin azaltılması için yöntemler sağlar. Mevcut buluş ayrıca, protein agregatlarını ayrıştırmak veya protein solüsyonuna sürfaktan veya iyonik olmayan bir madde protein agregatlarının oluşumunu azaltmak için yöntemler sağlar.

Description

Tarifnamenin bazi görünümlerinde, filtre performansi, kütle çiktisina karsi transmembran basinci (örnegin inç kare basina pound cinsinden) çizilerek (örnegin, nß'nin membranin kesit alani oldugu g/m?) degerlendirilebilir. Tarifnamenin bazi özelliklerinde, filtre performansi, diferansiyel transmembran basinci (örnegin inç kare basina düsen pound cinsinden) kütle çiktisina karsi (örnegin, g/m2) çizilerek degerlendirilebilir.

Mevcut bulus, ultrafiltrasyon membranlari tarafindan virüsün tutulmasini ölçmek için yöntemler saglar. Virüs parçaciklarini ölçmek için yöntemler teknikte bilinmektedir ve bunlarla sinirli olmamakla birlikte immün testler, Viral nükleik asit hibridizasyonu, PCR, Viral titre testleri ve benzerlerini içerir. Log tutma degeri (LRV), ultrafiltrasyon geçirimindeki virüs miktari ile ultrafiltrasyon öncesi sulu çözelti ham maddedeki Virüs miktari karsilastirilarak ölçülebilir. Bazi uygulamalarda bulus, bir sürfaktan veya bir sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir maddenin sulu bir virüs çözeltisine ve sulu çözeltideki virüsün en az üç logunun ultrafiltrasyon membrani tarafindan tutuldugu en az bir proteine ilave edilmesiyle bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesini azaltmak için yöntemler saglar. Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir madde, virüs ve en az bir protein içeren bir sulu çözeltiye eklenir; burada ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesi azaltilir ve burada ultrafiltrasyon membrani tarafindan viral tutulum esasen degismez.

Protein agregatlarini ayristirma veya protein agregatlarinin olusumunu azaltma yöntemleri Bazi görünümlerde bulus, protein agregatlarini ayirmak ve/veya en az bir protein içeren sulu bir çözelti içeren bir ultrafiltrasyon besleme akisindaki protein agregasyonunu azaltmak için yöntemler saglar. Yöntem sulu çözeltiye bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir maddenin ilave edilmesini içerir. Bazi uygulamalarda protein agregasyonunun ayrismasi veya protein agregatlarinin olusumunda. azalma, 'ultrafiltrasyonl membraninin. kirlenmesini azaltabilir. Bir agregat, bir polipeptidin veya bir polipeptit fragmaninin (örnegin, bir dimer, bir trimer, bir tetramer veya bir tetramerden daha büyük bir multimer) herhangi bir multimeri anlamina gelir.

Mevcut bulusun bazi görünümlerinde, bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir maddenin eklenmesi, protein içeren sulu bir solüsyonda protein agregasyonunu, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde içeren ayni sulu solüsyonda mevcut olan protein agregasyonunun miktari ile karsilastirildiginda en az %10, en az %20, en az en az %90 veya en az %100 azaltabilmektedir. Bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde içeren ve bunun karsisinda bunlari içermeyen sulu çözeltilerdeki protein agregasyonunun miktarinin nicel tespiti ve karsilastirmasi alanda bilinen teknikler kullanilarak yapilabilir.

Bazi görünümlerde mevcut bulusun, bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir maddenin eklenmesi, sulu bir çözelti içindeki ortalama protein agregat sayisini, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde içeren ayni sulu solüsyonda bulunan protein agregatlarinin ortalama azaltabilmektedir. Bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde içeren ve bunun karsisinda bunlari içermeyen sulu çözeltilerdeki protein agregatlarinin ortalama sayisinin nicel tespiti ve karsilastirmasi alandar bilinen teknikler kullanilarak yapilabilir.

Bazi görünümlerde mevcut bulusun, bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir maddenin eklenmesi, sulu bir çözelti içindeki protein agregat boyutunu, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde içeren ayni sulu solüsyonda bulunan protein agregat boyutuna kiyasla, yaklasik herhangi biri oraninda azaltabilmektedir. Bir sürfaktan veya bir sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde içeren ve bunun karsisinda bunlari içermeyen sulu çözeltilerdeki ortalama protein agregat boyutunun nicel tespiti ve karsilastirmasi alanda bilinen teknikler kullanilarak yapilabilir. Bazi yönlerde, ortalama protein agregat boyutu, en azindan yukarida referans verilen miktarlardan herhangi biri ile azaltilir.

Sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin, mevcut protein agregatlarini ayristirmak ve/veya yeni protein agregatlarinin olusumunu önlemek için sulu çözeltiye herhangi bir faydali miktarda eklenebilmesine ragmen, bazi yönlerde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, sulu çözeltiye, yaklasik 1 PPM ila yaklasik 10.000 PPM arasinda degisen bir konsantrasyonda ilave edilir. Açiklamanin bazi yönlerinde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin konsantrasyonu yaklasik 10 PPM ila yaklasik 1000 PPM arasinda degisir. Açiklamanin bazi yönlerinde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin konsantrasyonu yaklasik. 100 PPM ila yaklasik. 1000 PPM arasinda degisir.

Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin konsantrasyonu yaklasik 10 PPM ila yaklasik 200 PPM arasinda degisir. Mevcut bulusun bazi görünümlerinde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin konsantrasyonu yaklasik 10 PPM ila yaklasik 100 PPM arasinda degisir. Mevcut bulusun bazi görünümlerinde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin konsantrasyonu yaklasik 20 PPM ila yaklasik 200 PPM arasinda degisir. Mevcut bulusun bazi görünümlerinde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin konsantrasyonu yaklasik 20 PPM ila yaklasik 100 PPM arasinda degisir. Bazi görünümlerde sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir konsantrasyonda sulu çözeltiye eklenir.

Mevcut bulusun bazi yönlerinde, mevcut protein agregatlarinin ayristirilmasi için kullanilan ve/veya sulu protein içeren çözeltilerde protein agregatlarinin olusumunu önleyen sürfaktanlar, iyonik olmayan, anyonik veya katyonik olabilir.

Mevcut bulusta kullanim için uygun iyonik olmayan sürfaktanlar arasinda sunlar bulunur: örnegin, polioksietilen sorbitan yagli esterleri örnegin polisorbatlar 20, 40, 60, 65, 80 ve benzeri, (Tween®), polioksietilen tert- oktilfenoller örnegin Triton® X-lOO, Triton® X-220, Triton® X-405, ve Triton® X-460, polioksietilen nonilfenol (Igepal®), polioksietilen lauril eterler (Brij® 35, laurilmakrogol), polioksietilen monoheksildesil eter (Cetomakrogol), polioksipropilen-polioksietilen eterler (polioksamerler F 38, 407, ve benzeri dahil), Pluronic® polioller, polioksil 40 veya 50 stearat (Myrj®), polioksil ester laurat, polioksil setostearil eter, PEG 4-8 laurat, PEG 4-8 stearat, hidrojenize kastor yagi, polioksietilen, hidrojenize kastor yagi (Emulphor®) 10, 50 ve 60 gliserol monostearat, oktilglukositler, sorbitan esterler (Span®), sorbitan monolaurat, monopalmitat, mono-oleat, monostearat, seskioleat, trioleat, sükroz yag asidi esterleri, oktilglukositler, gliseril esterler* ve benzerleri bulunur.

Mevcut bulusta kullanim alani bulabilen anyonik sürfaktanlar arasinda, örnegin, sodyum lauril sülfat, sodyum dodesil sülfat, sodyum yagli sulfosuksinat (Aerosol®), dioktil sodyum sülfosüksinat (Aerosol OT®), diheksil sülfosüksinat (Aerosol MA®), sodyum desoksikolat, sodyum kolat, sodyum glikokolat, sodyum kaprilat, sodyum heksilsülfhonat ve benzerleri bulunur. Bu bulusta kullanim alani bulabilen katyonik sürfaktanlar arasinda, örnegin, benzalkonyum klorür, benzetiyumum klorür, setilpiridinyum klorür, setil trimetil amonyum bromür ve benzerlerini bulunur.

Mevcut beyanin bazi yönlerinde, önceden mevcut protein agregatlarini ayirmak ve/veya protein içeren bir Çözeltide protein agregatlarinin olusumunu önlemek için sulu çözeltiye birden fazla sürfaktan eklenir. Bazi görünümlerde, sulu çözeltiye birden fazla iyonik olmayan sürfaktan ilave edilir.

Baska görünümlerde, sulu çözeltiye birden fazla anyonik sürfaktan ilave edilir. Baska görünümlerde, sulu çözeltiye birden fazla katyonik sürfaktan ilave edilir. Diger görünümlerde, herhangi bir sürfaktan kombinasyonu, iyonik olmayan sürfaktanlar, anyonik sürfaktanlar ve katyonik sürfaktanlar; örnegin, bir iyonik olmayan surfaktan ve bir anyonik sürfaktan, bir iyonik olmayan sürfaktan ve bir katyonik sürfaktan veya bir anyonik sürfaktan ve bir katyonik sürfaktandan seçilir.

Mevcut protein agregatlarini ayirmak ve/veya sulu protein içeren çözeltilerde yeni protein agregatlarinin olusumunu önlemek için kullanilan sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddeler arasinda, örnegin, polietilen glikoller (PEG'ler), tercihen yaklasik 400 ila yaklasik 6000 g/mol'lük molekül agirliklarina sahip polietilen glikoller, metilselüloz, karboksimetilselüloz, hidroksietilselüloz, hidroksipropil metilselüloz, arginin (L-arginin, arginin-HCl, ve benzerleri dahil olmak üzere), flavanon glikositleri, naringin, rutin (kersetin rutinosid) ve dekstranlar, tercihen yaklasik 2,000 ila 20,000 Da ve benzerleri moleküler agirliklara sahip dekstranlar bulunur.

Mevcut bulusun bazi yönlerinde, birden fazla sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde sulu çözeltiye eklenir. Diger yönlerde, sürfaktan(lar) ve sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde(ler)in herhangi bir kombinasyonu kullanilabilir.

Bazi uygulamalarda, protein agregasyonunu azaltma veya protein agregatlarinin olusumunu azaltma yöntemleri ayrica, bir ultrafiltrasyon. membrani yoluyla protein. ve sürfaktan veya sürfaktan olmayan iyonik ajan içeren sulu çözeltinin filtrelenmesi asamasini içerir. Bazi uygulamalarda, ultrafiltrasyon membrani bir parvovirüs tutucu membrani veya parvovirüsü çikarabilen bir membrandir. Bazi uygulamalarda, filtreleme normal akis filtrasyonudur. Diger yönlerde, filtrasyon teget akisli filtrasyon ile yapilir. Mevcut bulusun bazi uygulamalarinda, kalan agregatlar ultrafiltrasyon yoluyla sulu çözeltiden çikarilir.

Bazi uygulamalarda protein agregasyonunu azaltma veya protein agregatlarinin olusumunu azaltma yöntemleri ayrica bir ön filtre adimi ve bir ultrafiltrasyon asamasini içerir. Bazi uygulamalarda yöntem su adimlari içermektedir: a) ön filtreden sulu çözeltinin filtrelenmesi; b) protein agregatlarini ayristirmak veya protein agregatlarinin olusumunu önlemek için bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir maddenin sulu çözeltiye eklenmesi; ve c) bir veya daha fazla ultrafiltrasyon membrani üzerinden sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan ajan içeren sulu çözeltinin filtrelenmesi. Mevcut bulusun diger uygulamalarinda yöntem su adimlari içermektedir: a) protein agregatlarini ayristirmak veya protein agregatlarinin olusumunu önlemek için sulu çözeltiye bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan veya iyonik olmayan ajan eklenmesi; b) bir ön filtreden sulu çözeltinin filtrelenmesi; ve o) bir veya daha fazla ultrafiltrasyon membrani içinden sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan ajan içeren sulu çözeltinin filtrelenmesi. Bazi uygulamalarda, ön filtre, bir veya daha fazla yüzerici derinlik filtresi katmani veya bir veya daha fazla yüklü veya yüzeyi degistirilmis mikrogözenekli membran katmanidir.

Protein agregasyonunu ölçmek için yöntemler teknikte bilinmektedir. Örnegin, isik ölçüm. analizini kullanan bir sivi parçacik sayma sistemi, belirli bir boyut araligindaki parçaciklarin sayisini belirlemek için kullanilabilir.

Bulusun bazi görünümlerinde, protein agregasyonunun azaltilmasi, bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan ajan varliginda, sulu bir protein çözeltisindeki toplam parçacik sayisinin, bir sürfaktan ya da sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir maddenin yoklugunda, bir sulu protein çözeltisindeki toplam parçacik sayisi ile karsilastirilmasiyla belirlenir. Bulusun bazi görünümlerinde, protein agregasyonunun azaltilmasi, bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan ajan varliginda, sulu bir protein çözeltisindeki ortalama parçacik boyutunun, bir sürfaktan ya da sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir maddenin yoklugunda, bir sulu protein çözeltisindeki ortalama parçacik boyutu ile karsilastirilmasiyla belirlenir. Örnek yapilanmalar Bir görünümde mevcut bulus, bir islemde ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinin azaltilmasi için Virüs parçaciklarinin, söz konusu virüs parçaciklari ve en az bir protein ihtiva eden bir sulu çözeltiden çikarildigi yöntemler saglar, burada yöntem su adimlari ihtiva eder: a) bahsedilen sulu çözeltiye bir polietilen. glikol, bir selüloz türevi, arginin ve bir dekstrandan olusan gruptan seçilen bir sürfaktan veya bir sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde eklemek ve b) bahsedilen sürfaktan veya bahsedilen sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddeyi ihtiva eden bahsedilen sulu çözeltiyi bahsedilen ultrafiltrasyon membranlari içerisinden filtrelemek, burada bahsedilen sulu çözelti içindeki bahsedilen sürfaktan veya bahsedilen sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde varliginda bahsedilen ultrafiltrasyon Yukaridaki yöntemin bir yönünde, sürfaktan iyonik olmayan bir sürfaktandir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, iyonik olmayan sürfaktan, polisorbat 20, Triton® X- lOO, Triton® X-405, lauromakrogol ve polisorbat 80'den olusan gruptan seçilir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan polisorbat 20 veya Triton® X- Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, 1- l0,000 PPM'lik bir konsantrasyonda söz konusu sulu çözeltiye eklenir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, 10-200 PPM'lik bir konsantrasyonda söz konusu sulu çözeltiye eklenir.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, ultrafiltrasyon membrani bir parvovirüs tutucu membrandir.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, ultrafiltrasyon membrani yaklasik 100 nm veya daha az olan bir gözenek boyutuna sahiptir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, ultrafiltrasyon membrani yaklasik 20 nm veya daha az olan bir gözenek boyutuna sahiptir.

Yukaridaki yöntemlerden herhangi birinin bir uygulamasinda, bahsedilen sulu çözeltinin filtrelenmesi asamasi normal akis filtrelemesidir.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, protein bir antikordur- Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda antikor, bir monoklonal veya hümanize antikordur.

Yukaridaki yöntemin bir uygulamasinda, söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin söz konusu sulu çözeltiye eklenmesi, söz konusu ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %10 arttirir. Yukaridaki yöntemlerinin herhangi birinin bir uygulamasinda, söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin söz konusu sulu Çözeltiye eklenmesi, söz konusu ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %50 arttirir.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, virüs parçaciklari parvovirüs parçaciklaridir.

Yukaridaki yöntemlerden herhangi birinin bir uygulamasinda, yöntem ayrica, söz konusu sulu çözeltinin bahsedilen ultrafiltrasyon membrani içerisinden filtrasyonu öncesinde, bahsedilen sulu çözeltinin bir veya daha fazla yüzerici derinlik filtresi katmani veya bir veya daha fazla yüklü veya yüzeyi degistirilmis mikrogözenekli membran katmani içerisinden filtrelenmesi asamasini içerir.

Baska bir görünümde, mevcut bulus, bir ultrafiltrasyon membrani sürecindeki filtrasyon çikti verimliligini arttirmak için virüs parçaciklarinin, bahsedilen virüs parçaciklari ve en az bir protein ihtiva eden bir sulu çözeltiden çikarildigi yöntemler saglar, bu yöntem, söz konusu sulu çözeltinin ultrafiltrasyon membranlari içerisinden filtrelenmesinden önce, bir polietilen glikol, bir selüloz türevi, arginin ve bir dekstrandan olusan gruptan seçilen bir sürfaktan veya bir sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin söz konusu sulu çözeltiye eklenmesini, burada söz konusu sulu çözelti içindeki söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin varligi, bahsedilen ultrafiltrasyon membrani söz konusu sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin yokluguna kiyasla filtrasyon çikti verimliligini arttirir.

Yukaridaki yöntemin bir yönünde, söz konusu sürfaktan iyonik olmayan bir sürfaktandir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, iyonik olmayan sürfaktan, polisorbat 20, Triton® X-lOO, Triton® X-405, lauromakrogol ve polisorbat 80'den olusan gruptan seçilir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan polisorbat 20 veya Triton® X-lOO'dür.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, 1- l0,000 PPM'lik bir konsantrasyonda söz konusu sulu çözeltiye eklenir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, l0-200 PPM'lik bir konsantrasyonda söz konusu sulu çözeltiye eklenir.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin. bir uygulamasinda, ultrafiltrasyon membrani yaklasik 100 nm veya daha az olan bir gözenek boyutuna sahiptir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, ultrafiltrasyon membrani yaklasik 20 nm veya daha az olan bir gözenek boyutuna sahiptir.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, protein bir antikordur. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda antikor, bir monoklonal veya hümanize antikordur.

Yukaridaki yöntemlerinin herhangi birinin bir uygulamasinda, söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin söz konusu sulu çözeltiye eklenmesi, söz konusu ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %10 arttirir. Yukaridaki yöntemlerinin herhangi birinin bir uygulamasinda, söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin söz konusu sulu çözeltiye eklenmesi, söz konusu ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %50 Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, Virüs parçaciklari parvovirüs parçaciklaridir.

Bir baska görünümde bulus, en az bir protein içeren bir sulu solüsyon içeren bir ultrafiltrasyon besleme akiminda polipeptit agregatlarini ayristiran veya polipeptit agregatlarinin olusumunu azaltmaya yönelik yöntemler saglar, yöntem, bir polietilen glikol, bir selüloz türevi, arginin ve bahsedilen sulu çözeltiye bir dekstrandan olusan gruptan seçilen bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan Yukaridaki yöntemin bir yönünde, sürfaktan iyonik olmayan bir sürfaktandir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, iyonik olmayan sürfaktan, polisorbat 20, Triton® X- 100, Triton® X-405, lauromakrogol ve polisorbat 80'den olusan gruptan seçilir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan polisorbat 20 veya Triton® X- Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, 1- l0,000 PPM'lik bir konsantrasyonda söz konusu sulu çözeltiye eklenir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, 10-200 PPM'lik bir konsantrasyonda söz konusu sulu çözeltiye eklenir.

Yukaridaki yöntemlerden herhangi birinin bir uygulamasinda, yöntem ayrica, söz konusu sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan bir ajan içeren söz konusu sulu çözeltinin bir ultrafiltrasyon membrani içinden süzülmesi adimini içerir.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, ultrafiltrasyon membrani yaklasik 100 nm veya daha az olan bir gözenek boyutuna sahiptir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, ultrafiltrasyon membrani yaklasik 20 nm veya daha az olan bir gözenek boyutuna sahiptir. Yukaridaki yöntemlerden herhangi birinin bir uygulamasinda, bahsedilen sulu çözeltinin filtrelenmesi asamasi normal akis filtrelemesidir.

Yukaridaki yöntemlerinin herhangi birinin bir uygulamasinda, söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin söz konusu sulu çözeltiye eklenmesi, söz konusu ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %10 arttirir: Yukaridaki yöntemlerinin herhangi birinin bir uygulamasinda, söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin söz konusu sulu çözeltiye eklenmesi, söz konusu ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %50 Yukaridaki yöntemlerden herhangi birinin bir uygulamasinda, yöntem ayrica, söz konusu sulu çözeltinin bahsedilen ultrafiltrasyon membrani içerisinden filtrasyonu öncesinde, bahsedilen sulu çözeltinin bir veya daha fazla yüzerici derinlik filtresi katmani veya bir veya daha fazla yüklü veya yüzeyi degistirilmis mikrogözenekli membran katmani içerisinden filtrelenmesi asamasini içerir.

Bir baska görünümde, mevcut bulus, virus parçaciklarinin, bahsedilen Virüs parçaciklari ve en az bir protein içeren bir sulu çözeltiden çikarildigi bir prosesteki bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinin azaltilmasi yöntemlerini saglar, yöntem su adimlari ihtiva eder: a) söz konusu sulu çözeltiyi, bir veya daha fazla yüzerici derinlik filtresi katmani ve bir veya daha fazla yüklü veya yüzeyi degistirilmis mikrogözenekli membran katmanindan olusan gruptan seçilen bir aygit içerisinden filtrelemek; b) söz konusu sulu çözeltiye, bir polietilen. glikol, bir selüloz türevi, arginin ve bir dekstrandan olusan gruptan seçilen bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde eklemek; ve c) bahsedilen sürfaktan veya bahsedilen sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddeyi ihtiva eden söz konusu sulu çözeltiyi bahsedilen ultrafiltrasyon membranlari içerisinden filtrelemek, burada söz konusu sulu çözelti içindeki söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin varligi bahsedilen ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesini azaltir.

Yukaridaki yöntemin bir yönünde, sürfaktan iyonik olmayan bir sürfaktandir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, iyonik olmayan sürfaktan, polisorbat 20, Triton® X- lOO, Triton® X-405, lauromakrogol ve polisorbat 80'den olusan gruptan seçilir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan polisorbat 20 Triton® X-100'dür.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, 1- l0,000 PPM'lik bir konsantrasyonda söz konusu sulu çözeltiye eklenir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde, 10-200 PPM'lik bir konsantrasyonda söz konusu sulu çözeltiye eklenir.

Yukaridaki yöntemlerinin herhangi birinin bir uygulamasinda, söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin söz konusu sulu çözeltiye eklenmesi, söz konusu ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %10 arttirir. Yukaridaki yöntemlerinin herhangi birinin bir uygulamasinda, söz konusu sürfaktan veya söz konusu surfaktan olmayan, iyonik. olmayan, maddenin söz konusu sulu çözeltiye eklenmesi, söz konusu ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %50 Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, virüs parçaciklari parvovirüs parçaciklaridir.

Baska bir görünümde, mevcut bulus, bir prosesteki virüs parçaciklarinin, bahsedilen virüs parçaciklari ve en az bir protein içeren bir sulu çözeltiden çikarildigi bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinin azaltilmasi yöntemlerini saglar, yöntem su adimlari ihtiva eder: a) söz konusu sulu çözeltiye bir polietilen glikol, bir selüloz türevi, arginin ve bir dekstrandan olusan gruptan seçilen bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan madde eklemek, b) söz konusu sulu çözeltiyi bir veya daha fazla yüzerici derinlik filtresi katmani ve bir veya daha fazla yüklü veya yüzeyi degistirilmis mikrogözenekli membran katmanindan olusan gruptan seçilen bir aygit içerisinden filtrelemek; ve c) bahsedilen sürfaktan veya bahsedilen sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddeyi ihtiva eden söz konusu sulu çözeltiyi bahsedilen ultrafiltrasyon membranlari içerisinden filtrelemek, burada söz konusu sulu çözelti içindeki söz konusu sürfaktan veya söz konusu sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddenin varligi bahsedilen ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesini azaltir.

Yukaridaki yöntemin bir yönünde, sürfaktan iyonik olmayan bir sürfaktandir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir yönünde, iyonik olmayan sürfaktan, polisorbat 20, Triton® X- 100, Triton® X-405, lauromakrogol ve polisorbat 80'den olusan gruptan seçilir. Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin bir uygulamasinda, sürfaktan polisorbat 20 Triton® X-lOO'dür.

Yukaridaki yöntemlerin herhangi birinin. bir uygulamasinda, ultrafiltrasyon membrani bir parvovirüs tutucu membrandir.

Bu spesifikasyonda açiklanan özelliklerin tümü herhangi bir kombinasyonda birlestirilebilir. Bu spesifikasyonda açiklanan her özellik, ayni, esdeger veya benzeri bir amaca hizmet eden alternatif bir özellik ile degistirilebilir. Dolayisiyla, aksi açikça belirtilmedigi sürece, açiklanan her özellik, sadece esdeger veya benzer özelliklere sahip bir jenerik seri örnegidir. ÖRNEKLER Mevcut bulusun tamamen örnek olmasi amaçlanan ve dolayisiyla bulusu herhangi bir sekilde sinirlamadigi düsünülmesi gereken örnekler, ayrica yukarida tartisilan bulusun görünümleri ve uygulamalarini açiklamakta ve detaylandirmaktadir. Aksi belirtilmedikçe, sicaklik santigrat derecedir ve basinç, atmosferik veya atmosferige yakindir. Yukaridaki örnekler ve detayli açiklama, sinirlama amaciyla degil, örnekleme maksadiyla sunulmustur. Yukaridaki bulus, tarifnamenin anlasilmasi amaciyla açiklama ve örnekleme yoluyla bazi detaylariyla tarif edilmis olmasina ragmen, bu bulusun ögretileri isiginda, bu alanda siradan bilgiye sahip kisilerce, ekteki istemlerin özünden veya kapsamindan ayrilmadan, bazi degisiklikler ve modifikasyonlarin yapilabilecegi kolayca anlasilacaktir. Örnek 1: Polisorbat 20'nin Ultrafiltrasyon Membran Performansi Üzerine Etkisi Bazi sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan katki maddelerinin, çesitli antikor içerikli sulu çözeltilerin ultrafiltrasyonunun etkinligi üzerindeki etkisini belirlemek amaciyla, asagidaki Tablo 1'de gösterilen sulu besleme çözeltileri asagida tarif edilen deneylerde hazirlanmis ve kullanilmistir.

Antikor pH Tampon Antikor Konsantrasyonu Anti-PDLl 6,0 0,110 M sodyum asetat, 5,56 mg/mL antikoru 0,024 M MES Anti-DRS 6,0 65 mM Tris, 11,82 mg/mL antikoru 38 mM fosforik asit anti-VEGF 5,5 0,086 M asetik asit, 5,05 mg/mL antikoru 0,10 M Tris bazi, 0,019 M sitrik asit Anti-HERZ 5,6 0,25 M HEPES 15,96 mg/mL Anti-MUC16 5,5 0,2 M sodyum asetat 7,02 mg/mL antikoru Ek bir yüzey aktif maddenin bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenme hizi üzerindeki etkisini ölçmek için, Tablo 1'de tarif edilen sulu protein içeren besleme solüsyonlari (bir sürfaktan ajani ilave edilerek veya eklenmeden) bir Viresolve® Pro ultrafiltrasyonu membrani (Millipore Corporation) yoluyla filtrelenmistir. Çesitli proteinleri içeren çözeltilerin ultrafiltrasyon membrani içinden süzülmesi, yaklasik. 10 psi'lik bir baslangiç transmembran basincinda gerçeklestirilmis ve transmembran basincinin yaklasik 50 psi'lik bir transmembran basincina ulasilana kadar (ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinden dolayi) birikmesine izin verilmis, zamani gelince de ultrafiltrasyon islemi dürdurulmustur. Eger ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesi önemli ölçüde meydana gelmemisse, ultrafiltrasyon prosesi yaklasik 50 psi'lik bir transmembran basincina ulasilmadan önce durdurulmustur. Daha sonra antikor* verimi (g/m2 membran yüzey alani ile ölçülmüstür) tayin edilmis ve transmembran basinci karsisinda grafiklenmistir. Filtrasyonun son nokta basinci, not edilmedikçe 40 psi olmustur. Çesitli konsantrasyonlarda polisorbat 20'nin, farkli antikor molekülleri içeren çesitli farkli sulu çözeltilerle ultrafiltrasyon membrani kirlenmesin üzerindeki etkisini ölçen deneylerden elde edilen veriler Sekiller 1_ ila 4'te gösterilmistir. Sekil 1 ila 4'te gösterilen sekilde, sulu bir antikor içeren çözeltiye 20 PPM'lik polisorbat 20 eklenmesi, ultrafiltrasyon prosesi sirasinda ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinin önlenmesi üzerinde faydali ve tekrarlanabilir bir etkiye sahiptir. Polisorbat 20'nin yararli kirlenme karsiti etkisi, çok farkli antikorlar ve test edilen genis bir araliktaki polisorbat 20 konsantrasyonu içeren sulu çözeltilerle gösterilmistir. Bu veriler, polisorbat 20 gibi iyonik olmayan sürfaktanlarin, ultrafiltrasyon islemi sirasinda ultrafiltrasyon membranlarinin kirlenmesini azaltmak veya önlemek için protein içeren besleme akislarinda kullanilabilecek katki maddeleri olarak faydali olabilecegini net olarak göstermektedir. Örnek 2: Triton® X-lOO'ün Ultrafiltrasyon Membrani Performansi Üzerine Etkisi Ikinci bir deney grubunda, Triton® X-lOO'ün eklenmesinin bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenme hizina etkisi, yukaridaki Örnek l'de tarif edilen sekilde belirlenmistir. Çesitli konsantrasyonlarda Triton® X-lOO'ün, farkli antikor molekülleri içeren çesitli farkli sulu çözeltilerle ultrafiltrasyon membrani kirlenmesin üzerindeki etkisini ölçen deneylerden elde edilen veriler Sekiller 4 ila 7'de gösterilmistir. Sekil 4 ila 7'de gösterilen sekilde, sulu bir antikor içeren çözeltiye 20 PPM'lik Triton® X-lOO eklenmesi, ultrafiltrasyon prosesi sirasinda ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinin önlenmesi üzerinde faydali ve tekrarlanabilir bir etkiye sahiptir. Triton® X-lOO'ün yararli kirlenme karsiti etkisi, çok farkli antikorlar ve test edilen genis bir araliktaki polisorbat 20 konsantrasyonu içeren sulu çözeltilerle gösterilmistir. Bu veriler, Triton® X-lOO gibi iyonik olmayan sürfaktanlarin, ultrafiltrasyon islemi sirasinda ultrafiltrasyon membranlarinin kirlenmesini azaltmak veya önlemek için protein içeren besleme akislarinda kullanilabilecek katki maddeleri olarak faydali olabilecegini net olarak göstermektedir. Örnek 3: Ultrafiltrasyon Membrani Performansinda Sürfaktanin Eklenmesi ile Kombinasyonda Ön Filtrasyonun Etkisi Bir baska deney grubunda, bir sürfaktan ilavesi ile birlikte ön filtrelemenin bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenme hizi üzerindeki etkisi arastirilmistir. Spesifik olarak, Tablo 1'de yukarida tarif edilen anti-PDLl ve anti-VEGF antikoru içeren sulu çözeltiler, tercihe göre bir sürfaktan ile muamele edilmis ve daha sonra bir Mustang S® katyon degistirme membrani (Pall Corporation) yoluyla ön filtrelemeye tabi tutulmustur. Mustang S® katyon degisim membrani boyunca önceden süzülmeden sonra, süzüntü/sürfaktan çözeltisi yukarida tarif edilen sekilde ultrafiltrasyona tabi tutulmustur. Bu deneylerden elde edilen veriler, Sekil 8 ve 9'da gösterilmistir.

Sekil 8 ve 9'da gösterilen sekilde, Mustang S® içerisinden basit filtrasyon, bir akis yönlü ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinin önlenmesi veya azaltilmasi üzerinde çok az faydali bir etkiye sahiptir veya faydali bir etkiye sahip degildir. Bunun tersine, sulu antikor içeren çözeltinin önceden süzülmesinin, iyonik olmayan bir sürfaktanin eklenmesiyle birlestirildigi zaman, akis yönlü bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinde güçlü bir azalma gözlemlenmistir. Bu veriler açikça göstermektedir ki, sürfaktan ilavesiyle kombinasyon halinde bir üst akis prefiltrasyon adiminin kullanimi, protein içeren sulu çözeltiler için bir ultrafiltrasyon prosesindeki bir akis yönlü ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesini azaltmak veya önlemek için güçlü, tekrarlanabilir ve faydali bir etki saglamaktadir. Örnek 4: Diger Sürfaktan ve Bazi Sürfaktan Olmayan, Iyonik Olmayan Maddelerin Ultrafiltrasyon Membrani Performansi Üzerine Etkisi Yine bir baska deney grubunda, farkli bir sürfaktan veya sürfaktan olmayan, iyonik olmayan katki maddelerinin, akis yönlü bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenme orani üzerindeki etkisi arastirilmistir. Daha spesifik olarak, çesitli farkli sürfaktan ve sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddeler, farkli antikor içeren sulu çözeltilere (Tablo 1'de tarif edilen sekilde) ilave edilmis, yukarida Örnek l'de tarif edilen sekilde bir Viresolve® Pro ultrafiltrasyon membrani araciligiyla ultrafiltrasyona tabi tutulmustur. Bu deneylerden elde edilen veriler, Sekil 10 ve ll'de gösterilmistir.

Sekil 10 ve ll'de gösterilen sekilde, çesitli farkli sürfaktanlar ve sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddeler ile akis yönlü bir ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinde önemli bir azalma gözlemlenmistir. Çesitli antikor çözeltisi, katki maddesi, ön filtre kombinasyonlari ile üretilen ek veriler Tablo 2'de verilmistir.

Antikor Eksipiyan veya Ön Filtre g/m2 olarak çikti (Elde Edilen Nihai Transmembran Basinç) Anti-PDLl Yok 200 Mustang® 8 ön filtresi 320 Triton® X-lOO > 6000 (28,0) Polisorbat 20 > 6000 (29,5) Oktilß-D-glukopiranosid 200 L-Arginin HCl 400 Triton® X-lOO + Mustang® S ön > 6000 (29,4) filtresi Anti-DRS Yok 400 Triton® X-lOO > 5000 (27,8) Polisorbat 20 > 1750 (32,8) Anti-VEGF Yok 450 Mustang® 8 ön filtresi 4000 Triton® X-lOO 4000 Polisorbat 20 1500 Oktilß-D-glukopiranosid 800 L-Arginin HCl 300 Triton® X-lOO + Mustang&J 5 ön > 7200(18,3) filtresi filtresi Anti-HERZ Yok 500 Mustangß S ön filtresi >12500 (30,1) >10000 (27,6) Triton® X-lOO 5000 Triton® X-lOO + Mustang® 5 ön >23000 (18,6) filtresi >10000 (17,1) filtresi >10000 (21,0) Bu veriler, çok çesitli sürfaktanlarin ve belirli sürfaktan olmayan, iyonik olmayan ajanlarin, ultrafiltrasyon islemi sirasinda ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinin azaltilmasi ve/Veya önlenmesi için protein içeren sulu çözeltilere ilave olarak yararli oldugunu göstermektedir. Bu sürfaktanlar ve sürfaktan olmayan, iyonik olmayan maddeler, sonraki ultrafiltrasyon asamasindan önce bir &M1 filtreleme asamasinin dahil edilmesiyle veya edilmeksizin yararlidir. Örnek 5. Polisorbat 20'nin Viral Açikligi Üzerinde Olumsuz Etki Yoktur Bir sürfaktanin dogrudan bir protein besleme akimina ilave edilmesinin, ultrafiltrasyon membrani parvovirüs filtresi ile Viral temizligi olumsuz etkilemedigini göstermek için bir çalisma gerçeklestirilmistir. Çalisma asagidaki gibi yapilmistir.

Virüs stoklari Murine Minute Virus (MMV), kimyasal inaktivasyona karsi oldukça. dirençli, yaklasik 18-24 Inn boyutlarinda, zarfsiz, tek seritli bir DNA genomlu, parvovirüstür. MMV stogu BioReliance'dan (Rockville, MD) satin alinmistir.

Virüs Filtrasyonu Sürfaktan katki maddeleri içeren ve içermeyen ham maddeler, MMV stoku ile hacimce l/lOO oraninda arttirilmistir. Katkili ham madde, bir 0,22 um filtre ve Viresolve Pro içerisinden filtrelenmistir. Virüs titresi, 0,22 pm filtre ve Viresolve Pro havuzundan sonra Q-PCR ile belirlenmistir.

Virüs Kantifikasyonu Q-PCR testi, Strauss ve digerleri, (2008) Biotechnology and Biologicals, 30:259-70 referansli yayinda daha önce tarif edilmistir. Artik serbest DNA'nin çikarilmasini optimize etmek için nükleaz sindirim asamasina degisiklikler yapilmistir. Numuneler pH 8-9'a ayarlanmis ve 37 °C'de 30 dakika süreyle mikrokokal nükleaz enzim sindirimine tabi tutulmustur. Viral genomik DNA'nin ekstraksiyonu daha sonra EZl virüs mini kitli v EZl Advanced XL kullanilarak gerçeklestirilmistir. Daha önce tarif edilen sekilde Q-PCR tepkimesi yapilmistir.

Virüs Temizligi Virüs temizligi log redüksiyon degeri (LRV) olarak ifade edilir. LRV su sekilde hesaplanmistir: LRV = logm X (yükteki toplam virüs/filtrat havuzundaki toplam virüs) Sonuçlar, asagidaki Tablo 3'te gösterilmektedir.

Antikor Sürfaktan LRV Anti-VEGF O ppm polisorbat 20 4,05 Anti-VEGF lOO ppm polisorbat 20 4,55 Anti-VEGF 1000 ppm polisorbat 20 4,37 Anti-PDLl O ppm polisorbat 20 4,30 Anti-PDLl lOO ppm polisorbat 20 4,59 Anti-PDLl 1000 ppm polisorbat 20 4,67 Bu analizlerden elde edilen sonuçlar, polisorbat 20 sürfaktaninin, protein içeren besleme akisina ilave edilmesinin, ultrafiltrasyon membraninin, virüsten besleme akisindan ayrilma kabiliyetini ters yönde etkilemedigini göstermektedir. Örnek 6: Ultrafiltrasyon Membraninin Sürfaktan ile Ön Muamelesinin Etkisi Ultrafiltrasyondan önce bir sürfaktanin dogrudan bir besleme akimina ilave edilmesinin, ultrafiltrasyon öncesinde membranin bir sürfaktan ile ön muamele edilmesinin etkisiyle karsilastirilmasi için bir çalisma yapilmistir. Sulu bir anti-VEGF antikor çözeltisinin protein besleme akisi, Tablo 1'de gösterilen sekilde hazirlanmistir. Ultrafiltrasyon membrani bir Viresolve® Pro membrani olmustur. Bazi durumlarda, Viresolve® Pro membraninin polisorbat 20 ile ön muamele edilmesi, 1000 ppm polisorbat 20'nin (su içinde çözülmüs) ultrafiltrasyon adimindan önce filtrelenmesiyle hazirlanmistir. Diger durumlarda, polisorbat 20, bir sürfaktan ile önceden muameleye tabi tutulmamis bir zar kullanilarak ultrafiltrasyon öncesinde dogrudan besleme akimina eklenmistir. Bir kontrol olarak, sürfaktan içermeyen üçüncü bir besleme akimi, dogrudan besleme akimina veya membranin bir ön muamelesi seklinde ilave edilir. Bu analizden elde edilen sonuçlar Sekil 12'de gösterilmistir.

Sekil lZ'deki veriler, polisorbat 20'nin dogrudan anti-VEGF antikorunun besleme akimina eklendigi durumda en büyük çiktinin gözlemlendigini göstermektedir. Tersine, ultrafiltrasyon membraninin polisorbat 20 ile ön-muamelesi, kontrol örnegi için elde edilen çiktilarin altinda olan çiktilarla sonuçlanmistir. Bu veriler, bir sürfaktan veya diger iyonik olmayan, sürfaktan olmayan maddenin dogrudan sulu protein içeren besleme akimina ilave edilmesinin, ultrafiltrasyon membraninin bunlarla ön muameleye tabi tutulmasina kiyasla ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesini azaltmada veya önlemede önemli faydali bir etkiye sahip oldugunu göstermektedir. Örnek 7: Sulu Çözeltilerde Protein Agregatlarini Ayirmak için Sürfaktanlarin Kullanimi Bir sürfaktan kullanarak protein agregatlarinin ayrismasini degerlendirmek için bir çalisma gerçeklestirilmistir. Örnekler, 1000 ppm'lik nihai yardimci madde konsantrasyonuna ulasmak için Tablo 1'de tarif edilen sulu anti-PDLl çözeltisine %10'luk bir polisorbat 20 ya da Triton® X-lOO stok çözeltisi ilave edilerek hazirlanmistir. Eksipiyan içeren sulu çözeltiler, analizden önce 30 dakika süreyle oda sicakliginda enkübe edilmistir. Sulu çözelti içindeki 21,6 um agregat parçaciklari bir HIAC (sivi parçacik sayma sistemi, model 9703) kullanilarak ölçülmüstür. Alet, 1,5 um ila 100 um arasinda degisen bilinen boyutlardaki PSL parçacik dispersiyon standartlari kullanilarak kalibre edilmistir. Örnekler, parçaciklari analizden hemen önce homojen olarak dagitmak için kapta döndürülerek hafifçe karistirilmistir.

Sulu örnekler dört kere çalistirilmis (her çalisma için 1 mL) ayri ayri test edilmis ve belirlenmis boyutlardaki parçacik sayilari sayilmistir. Son üç çalistirmanin parçacik sayim verileri kaydedilmistir, ilk çalistirmanin sonucu atilmistir.

Bu analizden elde edilen sonuçlar, asagidaki sayisal degerlerin sulu çözelti ml'si basina referans alinan boyuttaki partikül sayisini temsil ettigi asagidaki Tablo 4'te gösterilmistir.

Parçacik Sürfaktan yok Polisorbat 20 Triton® X-1OO Boyutu (um) Tablo 4'te gösterildigi gibi, HIAC verileri, bir antikor içeren sulu besleme çözeltisindeki sürfaktan ilavesinin önceden mevcut agregat parçaciklarini ayristirabildigini ve dolayisiyla, kirlenmeyi azaltarak veya önleyerek ultrafiltrasyon membran performansini iyilestirme islevi görebilecegini göstermektedir.

Claims

ISTEMLER Bir prosesteki ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesinin azaltilmasi için bir yöntem olup, özelligi; burada Virüs parçaciklarinin, bahsedilen Virüs parçaciklari ve en az bir protein içeren bir sulu çözeltiden çikarilmasi, yöntemin su adimlari içermesidir: a)söz konusu sulu çözeltiyelO-ZOO PPM polisorbat 20 veya Triton® X-lOO eklemek, ve b) bahsedilen 10 ila 200 PPM polisorbat 20 veya Triton'® X- 100 ihtiva eden söz konusu sulu çözeltiyi bahsedilen ultrafiltrasyon membranlari içerisinden filtrelemek, burada adi geçen sulu çözelti içindeki adi geçen 10 ila 200 PPM polisorbat 20 veya Triton® X-lOO'ün varliginin, bahsedilen sulu çözeltideki söz konusu 10 ila 200 PPM polisorbat 20 veya Triton® X-lOO eklenmemesine kiyasla, bahsedilen ultrafiltrasyon membraninin kirlenmesini yaklasik %50 oraninda azaltmasi ve burada bahsedilen sulu çözeltiyi filtreleme adiminin, normal akis filtrasyonu ile olmasidir.
Istem l'in yöntemi olup, özelligi; burada bahsedilen ultrafiltrasyon membraninin bir parvovirüs tutucu membrani olmasidir.
Istem 2'nin yöntemi olup, özelligi; ultrafiltrasyon membraninin, yaklasik 100 nm'den daha az veya daha az'lik bir gözenek boyutuna sahip olmasidir.
Istem 2'nin yöntemi olup, özelligi; ultrafiltrasyon membraninin, yaklasik 20 nm veya daha az bir gözenek boyutuna sahip olmasidir.
Istemler l-4'ün yöntemi olup, Özelligi; burada bahsedilen proteinin bir antikor olmasidir.
Istemler l-5'in yöntemi olup, özelligi; burada bahsedilen 10-200 PPM polisorbat 20 veya Triton® X-lOO'ün eklenmesinin bahsedilen ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %10 arttirmasidir.
Istemler 1-6'nin yöntemi olup, özelligi; burada bahsedilen 10-200 PPM polisorbat 20 veya Triton® X-lOO'ün söz konusu sulu çözeltiye eklenmesinin bahsedilen ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini en az %50 arttirmasidir.
Istem l-7'nin yöntemi olup, özelligi; ayrica, bahsedilen sulu çözeltinin, istem l'in adim a)'sindan önce veya sonra, bir veya daha fazla yüzerici derinlik filtresi katmani veya bir veya daha fazla yüklü veya yüzeyi degistirilmis mikro gözenekli membran katmanini içermesidir.
Bir prosesteki ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini artirma yöntemi olup, özelligi; burada virus parçaciklarinin, bahsedilen virüs parçaciklari ve en az bir protein içeren bir sulu çözeltiden çikarilmasi, yöntemin, bahsedilen sulu çözeltinin bahsedilen ultrafiltrasyon membranlari içerisinden filtrelemesinden önce bahsedilen sulu çözeltiye 10-200 PPM polisorbat 20 veya Triton® X-lOO eklenmesini içermesi, burada adi geçen 10-200 PPM polisorbat 20 ve Tiiton® X-lOO'ün varliginin, bahsedilen 10-200 PPM polisorbat 20 veya Triton® X-lOO'ün yoklugu ile karsilastirildiginda adi geçen ultrafiltrasyon membraninin filtrasyon çikti verimliligini arttirmasi ve burada söz konusu sulu çözeltiyi filtreleme adiminin normal akis filtrasyonu yoluyla olmasidir.
10. Bir ultrafiltrasyon besleme akisindaki polipeptit agregatlarini ayristirmak veya polipeptit agregatlarinin olusumunu azaltmak için bir yöntem olup, özelligi; en az bir protein içeren sulu bir çözelti içermesi, yöntemin, adi geçen sulu çözeltiye 10-200 PPM polisorbat 20 veya Triton® X-lOO ilave edilmesini içermesidir.
11. Önceki istemler l-lO'dan herhangi birine göre bir yöntem olup, özelligi; burada antikorun. bir anti-PDLl antikoru, bir anti-HERZ antikoru, bir anti-VEGF antikoru, bir anti- MUC16 antikoru veya bir anti-DRS antikoru olmasidir.