TR201815580T4 - Yaraları iyileştirmeye yönelik çözelti bileşimleri ve bunların kullanımlarını içeren yeni selüler faktör. - Google Patents

Abstract

Buluş, çözelti bileşimleri içeren yeni yavaş salınımlı selüler faktör, bu tür yeni bileşimlerin ve bunların kullanımlarının yapılmasının yöntemlerini içeren, çözelti bileşimleri (burada "SR-CFS" bileşimleri olarak adlandırılmaktadır) içeren yeni selüler faktör ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME YARALARI IYILESTIRMEYE YÖNELIK ÇÖZELTI BILESIMLERI VE BUNLARIN KULLANIMLARINI IÇEREN YENI SELÜLER FAKTÖR Teknik Alan Bulusun teknik alani; solüsyon bilesimleri (burada “SR-CFS” bilesimleri olarak atifta bulunulmaktadir) içeren yeni gelistirilen yavas salinimli selüler faktör içeren, yeni gelistirilen selüler faktör içeren solüsyon bilesimleri (burada “CFS” bilesimleri olarak atifta bulunulmaktadir), bu türde yeni gelistirilen bilesimlerin yapilmasi ve bunlarin kullanimlari ile iliskilidir. Önceki Teknik Birçok bireysel sitokin ve büyüme faktörü, çok çesitli hastaligin, rahatsizligin ve yaralanmalarin tedavisinde terapötik faydalari bakimindan degerlendirilmislerdir. Ne yazik ki, sonuçlar yalnizca kismen umut verici olmustur. Örnegin, PDGF-BB`nin diyabetik ayak ülserlerinin tedavisinde faydali oldugu kanitlanmistir; GM-CSF hem venöz ülserler hem de diyabetik ayak ülserleri için Avrupa'da pazarlanmaktadir; ve HGH (insan büyüme hormonu) pediatrik yaniklar için ABD'de pazarlanmaktadir. Basarisiz olanlar, ALS”nin tedavisindeki tesirlerini ölçmek için tasarlanan klinik deneylerde tamamimin degerlendirildigi, herbirisinin hayal kirikligina neden olan sonuçlara sahip oldugu BDNF, CNTF ve lGF-1'i içermektedir; TGFß2 venöz ülserlerin 2. Evre deneyinde basarisiz olmustur; ve !GF-1 ve PDGF kombinasyon terapisi diyabetik ayak ülserlerinde basarisiz olmustur.

Klinikte, bu bireysel sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin çogunun neden basarisiz oldugu çok net degilken, bir teori de sudur; proteinler fizyolojik olmayan dozlarda verilmistir, yani in vivo normal bulunan fizyolojik seviyeler ile karsilastirildigi zaman çok yüksek dozlarda. Ayrica. verilen bir fizyolojik nisteki sitokinler ve büyüme faktörleri arasindaki karmasik etkilesimden ötürü, özellikle anormal yüksek düzeylerde olan bir tanesi, fizyolojik nisi yeniden olusturamamaktadir, gerçekte, onun hassas dengesini büyük ölçüde bozmaktadir.

Klinikteki sinirli basarilari ile birlestirildiginde, sitokinler ve büyüme faktörleri ve diger protein-esasli terapötiklerin genellikle hastalara verilmesi diger farmasötiklerden daha zordur. Proteinin tesiri biçimi ile iliskili oldugundan ötürü, protein-esasli terapötikler proteinin veya orada bulunan proteinlerin açilmasina, veya denatüre olmasina neden olabilen kosullara tabi tutulamaz. Sonuç olarak, protein esasli terapötiklerin hazirlanmasi, depolanmasi ve uygulamasinda özel bir ihtimam gösterilmesi gereklidir.

Proteinin herhangi bir denatürasyonundan kaçinilmasina ilaveten, zaman içinde hastaya verilen protein miktarinin denetlenebilmesi de siklikla arzu edilmektedir. Bu, hastada Istenmeyen sekilde yüksek veya düsük olan veya istenilen düzeyden çok fazla inip çikan protein konsantrasyonlarindan kaçinilmasina, ve bunun yerine hastada terapötigin istikrarli bir seviyesinin tesis edilmesine yardimci olmaktadir. Buna atfen, protein esasli terapötikler içeren birçok terapötik için yavas salinimli formülasyonlar, gelistirilmis veya halihazirda gelistirilmektedir. Yavas salinimli protein esasli terapötikler birçok yöntem ile verilebilir, bunlara tablet veya kapsüllerin agizdan verilmesi, tozlarin solunmasi, implantasyon, bir matrise dahil edilmesi, veya proteinin zaman içinde kademeli bir sekilde salindigi kapsüllenmis bir terapötigin topikal uygulamasi dahildir ancak bunlarla sinirli degildir.

Bu yavas salinimli formülasyonlarin hazirlanmasi çesitlidir. Bir yöntem organik solvent ile proteinin karistirilmasini içermektedir. Örnegin, protein ve organik solvent karisiminin sivi nitrojen içerisine püskürtülmesi ile bir toz formülasyon yapilabilir. Diger bir yöntem organik bir solvent içerisinde dirimsel asinabilir/biyoçözünür bir polimer solüsyonla proteinin karistirilmasini içermektedir, karisimin koagülasyonu ile protein ve polimeri içeren mikropartiküllerin olusturulmasi ile sonuçlanmaktadir. Yine diger bir yöntemde, proteinler, toz haline getirilmis formülasyonlar veya mikropartiküller, bir hastaya enjekte edilebilen veya topikal olarak uygulanabilen bir sivi veya jel üretmek için organik bir solvent içerisinde karistirilabilir. Ne yazik ki, organik solvent kullanimina iliskin dezavantajlar bunlarin protein denatürasyonuna neden olma egilimleridir.

Denatüre edici organik bir solvent ortaminda proteinlerin stabilize edilmesi için katki maddeleri kullanilmistir. Bu katki maddeleri yüzey aktif maddeleri (bakiniz U.S. Pat. No. içermektedir.

Bugüne kadar, saglikli ve hasta veya yaralanma durumlarinda vücutta dogal olarak bulunan fizyolojik olarak iliskili sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin fizyolojik düzeylerini ve kompleks birlesimini verimli bir sekilde yeniden olusturan veya taklit eden protein esasli hiçbir terapötik ajan (yani sitokinler ve büyüme faktörleri) bulunamamistir.

Hâlihazirda bulunan her protein esasli terapötik vücutta normal olarak bulunan sitokinler veya büyüme faktörlerinden çok fazla yüksek seviyelerde bir doz vermektedir. Buna ilaveten, hiç kimse bu fizyolojik olarak iliskili sitokinleri ve büyüme faktörlerini fizyolojik düzeylerde verememistir. Ilaveten, hiç kimse bu fizyolojik olarak iliskili sitokinleri ve büyüme faktörlerini fizyolojik düzeylerde yavas salinimli bir formülasyon içerisinde verememistir. Böylece, Basvuru sahipleri ilk kez bu yaziyla birlikte fizyolojik olarak iliskili büyüme faktörleri ve sitokinlerin fizyolojik seviyelerde (CFS bilesimleri) saglanmasina iliskin karsilanmayan tibbi ihtiyaci karsilamak amacinda olan, ve bazi durumlarda yavas salinimli bir formülasyon (SR-CFS bilesimleri) kullanarak fizyolojik düzeylerde fizyolojik olarak iliskili büyüme faktörleri ve sitokinleri veren simdiki bulusu sunmaktadirlar.

Bulusun Kisa Açiklamasi Kompleks ve özgün kombinasyonu ve biyolojik nislerde bulunan bu türdeki sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin fizyolojik seviyelerini yeniden olusturan yeni gelistirilen selüler faktör içeren solüsyon (CFS) bilesimlerini saglamak simdiki bulusun amacidir. Simdiki bulusun bir baska amaci da kompleks ve özgün kombinasyonu ve biyolojik nislerde dogal olarak bulunan bu türdeki sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin fizyolojik seviyelerini içeren yeni gelistirilen yavas salinimli selüler faktör içeren solüsyon (SR-CFS) bilesimlerinin saglanmasidir. Selüler faktörler vücutta bulunan fizyolojik seviyeler ile karsilastirilabilir seviyelerde mevcut oldugundan ötürü bunlar, hastaligin ve/veya yaralanmanin tedavisine ve/veya iyilestirilmesine dahil olan biyokimyasal ve biyolojik yöntemleri desteklemek, baslatmak, yenisi ile degistirmek, hizlandirmak veya etkilemek için müdahale gerektiren terapötik uygulamalarda kullanmak için çok uygundur. SR-CFS bilesimleri durumunda, selüler faktörler iyilestirme ve/veya toparlanmayi en iyi hale getirmek için bu türde faktörlerin devam eden, tutarli fizyolojik seviyesini saglamak için zaman içinde yavas bir sekilde salinmaktadir.

Burada açiklanan yeni gelistirilen CFS bilesimlerine ilaveten, ayrica hücreden elde edilen bilesimlerin (yani havuzlanmis-ECS ve havuzlanmis-ACCS bilesimleri) ve SR- CFS bilesimlerinin havuzlanmasini içeren bu türde yeni gelistirilen CFS bilesimlerinin yapilmasi için yöntemlerin ayni zamanda bunlarin terapötik kullanimlarinin saglanmasi bulusun bir amacidir.

Havuzlanmis hücreden elde edilmis bilesimler, havuzlanmamis bilesimler ile kiyaslandiginda terapötik etki için gerekli olan fizyolojik olarak iliskili selüler faktörlerin seviyelerinde azalan bir degiskenligi içeren birkaç önemli özellige ve karakteristige sahiptir. Selüler faktörler vücutta bulunan fizyolojik seviyler ile karsilastirilabilir seviyelerde mevcuttur ve bundan dolayi da bir hastaligin ve/veya yaralanmanin tedavi edilmesinde ve/veya iyilestirilmesinde rol oynayan biyokimyasal ve biyolojik islemleri desteklemek, baslatmak, yenisi ile degistirmek, hizlandirmak veya etkilemek için müdahale gerektiren terapötik uygulamalarda kullanmak için çok uygundur. Burada açiklanan yeni gelistirilen degiskenligi azaltmak için hücreden elde edilen bilesimlerin havuzlanmasi yöntemi salgilanan faktörlerinin seviyelerinin en uygun hale getirilmesi etkisine sahiptir söyle ki; bunlarin tüm terapötik potansiyeli her havuzda elde edilebilir.

Bu türde havuzlanmis bilesimlerin terapötik degerine ilaveten, havuzlanmamis bilesim ila bilesim degiskenliginin azaltilmasi için numunelerin havuzlanmasi yöntemi, ürün sartnamesini karsilamak için basarisiz olabilir diye havuzlanmamis bilesimin reddedilmesini en aza indirgeyerek, ve sonuç olarak üretim maliyetlerini de en aza indirgeyerek ve gelirleri arttirarak artan üretim verimliliklerinin kaydadeger ticari avantajlarina sahiptir.

Dolayisiyla, bulusun birinci yönü, VEGF, TGFß2, Anjiogenin, PDGF, TIMP-1 ve TIMP- 2'nin fizyolojik konsantrasyonlarini içeren bir amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonudur, burada fizyolojik konsantrasyon VEGF için ~5.0-16ng/mL7dir, Anjiogenin TIMP-l için ~0,68ug/mL'dir ve TIMP-2 için ~1,04pg/mL`dir, burada amniyondan- türetilmis selüler sitokin solüsyonu bilesimi asagidaki yöntemler ile elde edilebilir: (a) bir plasentanin amniyonundan amniyon epitelyal hücrelerinin izole edilmesi; (b) amniyon epitelyal hücrelerinden AMP hücrelerinin seçilmesi; (c) hayvandan-bagimsiz esasli medyumda AMP hücrelerinin kültürlenmesi, burada medyum %10'luk bir konsantrasyona kadar eklenen klinik düzeyde albümin ile tamamlanmaktadir ta ki konflüansa erisinceye kadar; (d) kültür medyumunun degistirilmesi; (e) 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 günde medyumdaki hücrelerin kültürlenmesi; ve (f) amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonunu elde etmek için (9) adiminda kültürlenen medyumun toplanmasi; burada (0) adimindaki medyum; Stemline I veya II, Opti-pro, IMDM veya DMEM'dir.

Bulusun ikinci yönü birinci yönün bilesimidir, burada adim (f) birden çok kez tekrarlanmaktadir ve (f) adiminda elde edilen amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyon havuzlanmis amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyon olusturmak için birlestirilmektedir.

Bulusun üçüncü yönü birinci yönün (c) kisminin bilesimdir, burada medyum serumsuzdur.

Bulusun dördüncü yönü, birinci, ikinci veya üçüncü yönünün bilesimidir, burada bazal medyuma ilaveten 0 ve 1 ug/ml arasinda bir yogunlukta olan EGF eklenmektedir.

Bulusun besinci yönü birinci veya ikinci yönün herhangi birisinin amniyondan- türetilmis selüler sitokin solüsyonunu içeren yavas salinimli bir bilesimdir.

Bulusun altinci yönü, selüler faktör-içeren solüsyon bilesiminin yavas salinimi etkileyebilen bir ajanla birlikte selüler faktör-içeren bir solüsyon bilesimini birlestirme adimlarini içeren, besinci yönün yavas salinimli bir bilesiminin yapilmasi yöntemidir.

Bulusun yedinci yönü birinci ila besinci yönün herhangi birisinin bilesimini içeren farmasötik bir bilesimdir, Bulusun sekizinci yönü yara iyilestirmenin hizlandirilmasi yönteminde kullanilmasi için, birinci ila besinci yönün veya yedinci yönün herhangi birisinin bir bilesimidir.

Tanimlamalar Burada tanimlandigi gibi “izole edilmis” terimi orijinal ortamindan çikarilan ve böylece dogal durumundan “insan eli ile” degistirilmis malzemeye atifta bulunmaktadir.

Burada kullanildigi gibi, "protein belirteci" terimi bir hücrenin veya bazi durumlarda spesifik hücre türünün herhangi protein molekül özelligi anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, "zenginlestirilmis” terimi bir karisimdan istenmeyen malzemelerin eliminasyonu istenilen malzemelerin seçimi veya ayrilmasi ile bir veya daha fazla malzemenin miktarini selektif olarak yogunlastirmak veya arttirmak anlamina gelmektedir (yani, popülasyondaki tüm hücrelerin belirteci ifade etmedigi heterojen bir hücre popülasyonundan spesifik hücre belirteçleri ile birlikte ayri hücreler).

Burada kullanildigi gibi, “büyük oranda saflastirilmis” terimi belirli bir belirteç veya belirteçler kombinasyonu için büyük oranda homojen olan hücrelerin bir popülasyonu anlamina gelmektedir. Büyük oranda homojen ile belirli bir belirteç veya belirteçlerin kombinasyonu için en az %90, ve tercihen %95 homojen denilmek Istenmektedir. gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, "totipotent hücreler” terimi asagidaki anlama sahip olmalidir.

Memelilerde, totipotent hücreler yetiskin vücudunda herhangi bir hücre türüne; ekstraembriyonik membranlarin (örnegin plasenta) herhangi bir hücre türüne(türlerine) dönüsme potansiyeline sahiptir. Totipotent hücreler döllenmis yumurtadir ve yaklasik olarak klevaji ile üretilen ilk 4 hücredir.

Burada kullanildigi gibi, "pluripotent kök hücreleri” terimi asagidaki anlama sahip olmalidir. Pluripotent kök hücreler vücuttaki herhangi bir diferansiye hücre yapmak için potansiyele sahip gerçek kök hücrelerdir, ancak trofoblasttan türetilen ekstraembriyonik membranlarin bilesenlerini yapmaya katkida bulunamaz. Amniyon epiblasttan gelismektedir, trofoblasttan degil. Üç türde pluripotent kök hücre simdiye kadar onaylanmistir: Embriyonik Kök (ES) Hücreler (primatarda totipotent olabilir), Embriyonik Üreme (EG) Hücreleri, ve Embriyonik Karsinom (EC) Hücreleri. Bu EC hücreleri, bir fetüsün gonadinda bazen ortaya çikan bir tümör olan teratokarsinomdan izole edilebilir.

Diger ikisinin aksine, bunlar aneuploiddir.

Burada kullanildigi gibi, "multipotent kök hücreler" terimi gerçek kök hücreleridir ancak yalnizca sinirli sayida türe farklilasabilmektedirler. Örnegin, kanin tüm hücrelerini meydana getiren ancak diger hücre türlerine farklilasamayan multipotent kök hücreler içermektedir.

Burada kullanildigi gibi, “ekstraembriyonik doku” terimi embriyonun korunmasini, beslenmesini, atik temizlemesini vs. kapsayan Embriyonik gövde disina konumlanmis doku anlamina gelmektedir. Ekstraembriyonik doku dogumda atilmaktadir.

Ekstraembriyonik doku; amniyon, koryon (trofoblast ve göbek bagi ve damarlarini içeren ekstraembriyonik mesoderm), yolk kesesi, allantois ve amniyotik sivi (orada bulunan tüm bilesenleri içeren) içermektedir ancak bununla sinirli degildir. Ekstraembriyonik doku ve oradan türetilmis hücreler gelisen embriyo olarak ayni genotipe sahiptir.

Burada kullanildigi gibi, “ekstraembriyonik sitokin salgilayan hücreler" veya “ECS hücreleri'; fizyolojik olarak iliskili geçici sekildeki fizyolojik olarak iliskili sitokinlerin özgün bir kombinasyonunun ekstraselüler boslugun içine veya çevreleyen kültür ortaminin içine salgilanmasi özelligine sahip ve herhangi bir hayvandan türetilmis ürün ortaminda kültürlenmemis, insanda klinik kullanim için uygun olarak türetilmis hücre ürünleri olan ekstraembriyonik dokudan türetilmis hücrelerin bir popülasyonu anlamina gelmektedir.

Bir yapilandirmada, ECS hücreleri; VEGF, Anjiogenin, PDGF ve TGFß2 ve en az bir MMP inhibitörden seçilen en az bir sitokin salgilamaktadir. Spesifik bir yapilandirmada, MMP inhibitörü; TIMP-i ve TIMP-2'den seçilmektedir. Baska bir yapilandirmada, ECS hücreleri; VEGF, Anjiogenin, PDGF ve TGFßZ ve birden fazla MMP inhibitöründen seçilen bir sitokinden fazlasini salgilamaktadir. Spesifik bir yapilandirmada, MMP inhibitörü;TIMP-1 ve TIMP-2'den seçilmektedir. Tercih edilen bir yapilandirmada, ECS hücreleri; VEGF sitokinlerini, Anjiogenin, PDGF ve TGFß2 ve MMP inhibitörleri TIMP-i ve/veya TlMP-2 salgilamaktadir. Özgün kombinasyondaki sitokinin veya sitokinlerin fizyolojik orani asagidaki gibidir: VEGF için ~5-16ng/mL, Anjiogenin için ~3.5-4.5 ng/mL, TIMP-2 için ~1.04 pg/mL. ECS hücreleri istege bagli olarak Timozin B4 ifade etmektedir. seçilebilir.

Burada kullanildigi gibi, “amniyondan-türetilmis multipotent progenitör hücre” terimi veya spesifik bir popülasyonu anlamina gelmektedir. ECS hücreleri için yukarida açiklanan özelliklere ilaveten, AMP hücreleri asagidaki özelliklere sahiptir. Hayvandan türetilmis herhangi bir ürünün ortaminda kültürlenmemislerdir, bunlarin yapilmasi ve bunlardan türetilmis hücre ürünleri insanda klinik kullanim için uygundur. Besleyici katmanlar olmaksizin büyümektedirler, protein telomeraz ve non-tümörijenik ifade etmezler. AMP hücreleri hemotopoietik kök hücre belirteci CD34 proteini ifade etmezler. Bu popülasyonda CD34 pozitif hücrelerin yoklugu, izolatlarin örnegin göbek kordonu kani veya Embriyonik fibroblastlar gibi hematopoietik kök hücreler ile kontamine olmadiklarini göstermektedir. Aslinda hücrelerin %100'ü antikorlar ile düsük moleküler agirlikli sitokeratinlere reaksiyon göstermemektedir, bunlarin epitelyal dogasini dogrulamaktadir. Taze izole edilen AMP hücreleri antikorlar ile kök/progenitör hücre belirteçleri c-kiti (CD117) ve Thy-1 (CD90)'a reaksiyon göstermeyecektir. Miyadinda veya pre-term plasentadan hücrelerin elde edilmesi için kullanilan birkaç yöntem teknikte kullanilan yöntemler hücrelerin gelistirilmis bilesimlerini ve popülasyonlarini saglamaktadir. AMP hücreleri önceden “amniyondan-türetilmis hücreler” olarak Burada açiklanan belirli bilesimlere, büyüme kosullarina, kültür ortamina vs. atifta bulunuldugu zaman “hayvandan-bagimsiz” terimi su anlama gelmektedir; hayvandan- türetilmis hiçbir malzeme, örnegin hayvandan-türetilmis serum, klinik seviyede insan malzemelerinden baskalari, örnegin rekombinant olarak üretilmis insan proteinleri, belirli bilesim veya yöntemin hazirlanmasinda, büyütülmesinde, kültürlenmesinde, ekspansiyonunda. depolanmasinda veya formülasyonunda kullanilmamaktadir.

Burada açiklanan belirli bilesimlere, büyüme kosullarina, kültür ortamina vs. atifta bulunuldugu zaman “serumsuz” terimi ile su anlatilmak istenmektedir; belirli bilesim veya yöntemin hazirlanmasinda, büyütülmesinde, kültürlenmesinde, ekspansiyonunda, depolanmasinda veya formülasyonunda hiçbir hayvandan-türetilmis serum (yani hiçbir insan-olmayan) kullanilmamaktadir.

Hücre bilesimlerine atfen kullanilan “ekspande” terimi ile su anlatilmak istenmektedir; hücre popülasyonu önceki yöntemler kullanilarak elde edilenden önemli ölçüde daha yüksek bir hücre konsantrasyonunu tesis etmektedir. Örnegin, AMP hücrelerinin ekspande bilesimlerindeki amniyotik dokunun grami basina hücrelerin seviyesi, önceki yöntemler kullanilarak bu tür hücrelerde yaklasik 20 katlik bir artis ile kiyaslandiginda, 5 geçisten sonra primer kültürdeki hücrelerin sayisinin 50 ila 150 katidir. Baska bir örnekte, AMP hücrelerinin ekspande bilesimlerindeki amniyotik dokunun grami basina hücrelerin seviyesi 3 geçisten sonra primer kültürdeki hücrelerin sayisindan en az 30 ve 100 kata kadar daha yüksektir. Dolayisiyla bir “ekspande” popülasyon önceki yöntemler üzerinden amniyotik dokunun grami basina hücre sayilarinda en az 2 kat ve 10 kata kadar iyilestirmeye sahiptir. “Ekspande” terimi yalnizca bir kisinin hücrelerin sayisini arttirmak istedigi kosullari kapsiyor anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, “geçis" terimi konflüans kazanan veya bir doku kültürü veselinde konflüansa yakin olan kültürde büyüyen hücrelerin veselden çikarildigi, taze kültür ortami (yani 1:5 oraninda sulandirilmis) ile sulandirildigi ve devam eden büyümeleri ve canliliklarini saglamak için yeni bir doku kültürü veseline yerlestirildigi bir hücre kültürü teknigi anlamina gelmektedir. Örnegin, amniyondan izole edilen hücreler primer hücreler olarak adlandirilmaktadir. Bu hücreler burada açiklanan büyüme medyumu içerisinde yetistirilerek kültürde ekSpande edilmektedirler. Bu primer hücreler alt-kültürlendikleri zaman, alt-kültürlemenin herbir devrine geçis denilmektedir. Burada kullanildigi gibi, "primer kültür" taze izole edilen hücre popülasyonu anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, "sartli medyum" içerisinde spesifik bir hücrenin veya hücre popülasyonunun kültürlendigi ve daha sonra çikarildigi medyumdur. Hücreler bir medyum içerisinde kültürlendigi zaman, diger hücrelere destek saglayabilen veya diger hücrelerin davranisini etkileyebilen selüler faktörler salgilayabilirler. Bu faktörler sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; hormonlar, sitokinler, ekstraselüler matris (ECM), proteinler, veziküller, antikorlar, kemokinler, reseptörler, inhibitörler ve granüller.

Selüler faktörleri içeren medyum sartli medyumdur. Sartli ortamin hazirlanmasi yöntemlerinin örnekleri U.S. Patent 6,372,494'te açiklanmaktadir. Burada kullanildigi gibi, sartli medyum ayrica AMP hücreleri dahil ECS hücrelerinden veya sartli medyumdan geri kazanilan ve/veya arindirilan örnegin proteinler gibi bilesenlere atifta bulunmaktadir.

Burada kullanildigi gibi, "selüler faktör-içeren solüsyon" veya "CFS" bilesimi terimi VEGF, Anjiogenin, PDGF ve TGFßZ ve en az bir MMP inhibitörden seçilen bir veya daha fazla faktörün fizyolojik konsantrasyonlarina sahip bir bilesim anlamina gelmektedir. Uygun MMP inhibitör örnekleri TlMP-1 ve TlMP-2`yi içermektedir ancak bunlarla sinirli degildir. CFS bilesimleri; ECS hücrelerinden türetilmis sartli ortam, amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyon bilesimleri (bakiniz asagidaki açiklama), fizyolojik sitokin solüsyon bilesimleri (bakiniz asagidaki açiklama), ve bu CFS bilesimlerinin yavas salinimli formülasyonlarini içermektedir.

Burada kullanildigi gibi, "amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonu'i veya "ACCS" terimi AMP hücrelerinden veya ekspande AMP hücrelerinden türetilmis olan sartli medyum anlamina gelmektedir. Amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonu veya ACCS önceden “amniyondan-türetilmis sitokin süspansiyonu” olarak adlandirilmistir.

Burada kullanildigi gibi, "fizyolojik sitokin solüsyonu" veya "PCS" bilesimi hücreden- türetilmemis ve VEGF, Anjiogenin, PDGF ve TGFßZ ve en az bir MMP inhibitörün'den seçilen bir veya daha fazla faktörün fizyolojik konsantrasyonlarina sahip bir bilesim anlamina gelmektedir. Uygun MMP inhibitörlerinin örnekleri TIMP- 1 ve TIMP-2'yi içermektedir ancak bunlarla sinirli degildir.

Burada kullanildigi gibi, "süspansiyon" terimi örnegin sitokinler gibi dagilmis bilesenler içeren bir sivi anlamina gelmektedir. Dagilmis bilesenler sivi içerisinde tamamen çözülmüs, kismen çözülmüs, süspanse edilmis veya dagilmis olabilir. Uygun sivilar sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; su, ozmotik solüsyonlar örnegin tuzlu ve/veya sekerli solüsyonlar, hücre kültür ortami, ve diger sulu veya susuz solüsyonlar. zaman ve istege bagli olarak selüler artik (örnegin selüler membran) temizlendigi zaman elde edilen bilesime atifta bulunmaktadir. Bu mekanik araçlar ile dondurarak ve çözdürerek, sonikasyon ile, örnegin EDTA gibi deterjanlarin kullanimi ile, veya örnegin hiyalüronidaz, dispaz, proteazlar ve nükleazlar gibi enzimatik sindirim ile elde edilebilir. bir maddenin bulundugu ve biyokimyasal ve/veya biyolojik yöntemin düzgün islemesi ile iliskili oldugu seviye anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, "havuzlanmis" terimi havuzlanmamis bilesimlerle kiyaslandiginda daha sabit ve tutarli özelliklere sahip yeni bir bilesime birlestirilmis birden çok bilesim anlamina gelmektedir. Örnegin, havuzlanmis ACCS havuzlanmamis ACCS ile kiyaslandigi zaman daha sabit ve tutarli özelliklere sahiptir. Havuzlanmis bilesimlerin örnekleri "SP havuzlarini" (ACCS koleksiyonu (bir plasentadan daha fazla), havuzlarini" (birden çok ACCS koleksiyonu/plasenta, birçok plasenta) içermektedir.

Burada kullanildigi gibi, "substrat" terimi hücrelerin büyümek, ve/veya göç etmek için yapistiklari bir yüzey üzerindeki tanimlanmis bir kaplama anlamina gelmektedir. Burada kullanildigi gibi, "matris" terimi kendi bilesenleri içerisinde tanimlanabilen veya tanimlanamayan veya içinde veya üzerinde hücrelerin büyüdügü bir madde anlamina gelmektedir. Matris hem biyolojik hem de biyolojik olmayan maddeler içermektedir.

Burada kullanildigi gibi, "yapi iskelesi" terimi hücrelerin içinde veya üzerinde büyüdügü üç boyutlu (3D) bir yapi (substrat ve/veya matris) anlamina gelmektedir. Biyolojik bilesenlerden, sentetik bilesenlerden veya bunlarin bir kombinasyonundan olusabilir.

Ilaveten, hücreler tarafindan dogal olarak tesis edilebilir veya yapay olarak tesis edilebilir. Buna ilaveten, yapi iskelesi uygun kosullar altinda biyolojik aktiviteye sahip bilesenler içerebilir. (örnegin büyüme faktörleri, diferansiyasyon faktörleri, melezlesme faktörleri, sitokinler, morfojenler, proteazlar (örnegin endojenöz hücre delaminasyonu, proteaz inhibitörlerini kolaylastirmak için), ekstraselüler matris bilesenlerini (örnegin fibronektin vs.) içeren bir hücreden yapilan ve salgilanan herhangi ve tüm maddelere atifta bulunmaktadir. iyilesmesinin hizlandirilmasi) elde etmek için gerekli terapötik ajanin miktari anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, “farmasötik olarak kabul edilebilir” terimi terapötik ajana ilaveten formülasyonu içeren bilesenlerin, mevcut bulusa göre tedavi edilen hastaya vermek için uygun oldugu anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, “terapötik bilesen” terimi bilesen bir süjeye verildigi zaman terapötik bir fayda sunan bilesimin bir bileseni anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, “terapötik protein” terimi; büyüme faktörleri, enzimler, hormonlar, sitokinler, sitokinlerin inhibitörleri, kanin pihtilasmasi faktörleri, peptit büyüme ve diferansiyasyon faktörleri içeren, ancak bunlarla sinirli olmayan, genis aralikta biyolojik olarak aktif proteinler içermektedir.

Burada kullanildigi gibi, “doku” terimi belirli bir islevin performansinda birlesen benzer özel hücrelerin kümelenmesine atifta bulunmaktadir.

Burada kullanildigi gibi, "bir" terimi bir veya daha fazla; en az bir anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, "birlesik" terimi birlikte, beraber, ilaveten, iliskili ve benzeri anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi, "birlikte-verme" terimi iki veya daha fazla ajanin es zamanli veya ardisik verilmesini içerebilir.

Burada kullanildigi gibi, "ajan" terimi aktif bir ajan veya inaktif bir ajan anlamina gelmektedir. "Aktif ajan" terimi ile bir süjeye verildigi zaman bir fizyolojik etkiye sahip olabilen bir ajan anlatilmak istenmektedir. Aktif ajanlarin sinirlayici olamayan örnekleri; büyüme faktörleri, sitokinler, antibiyotikler, hücreler, hücrelerden sartli ortam vs. içermektedir. "inaktif ajan" terimi ile verildigi zaman bir fizyolojik etkiye sahip olmayan bir ajan anlatilmak istenmektedir. Bu türde ajanlar alternatif olarak "farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlar" olarak da adlandirilmaktadir. Sinirlayici olmayan örnekler zaman salinimli kapsüller ve benzerini içermektedir. genellikle enjeksiyonla yapilan enteral ve topikal uygulama modlarindan baska modlara atifta bulunmaktadir, ve sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; intravenöz, intramüsküler, intraarteryel, intratekal, intrakapsüler, intraorbital, intrakardiyak, intradermal, intraperitoneal, transtrakeal, subkütanöz, subkütiküler, intra-artiküler, subkapsüler, subaraknoid, intraspinal, epidural, intraserebral ve intrasternal enjeksiyon veya infüzyon. salinmasi Için formüle edilmis genellikle terapötik bir ajan veya ilaç olan bir ajan anlamina gelmektedir. maddenin kirilmasi ile sonuçlanan fiziksel (yani çözünme) ve kimyasal (yani kimyasal bag klevaji) islemlerinin bir kombinasyonu anlamina gelmektedir. bir maddenin kirilmasi için bir biyolojik ajanin (yani bir enzim, mikrop veya hücre) sorumlu oldugu anlamina gelmektedir. aktivite (yani fagositoz) ile kirilmis bir ürünün kaldirilmasi anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi gibi "nanopartikül" terimi, ayni malzemenin daha büyük partikülleri ile karsilastirildiginda yeni veya arttirilmis ebat-bagimsiz özellikler sergileyen çap olarak 100 nm”den daha küçük partiküller anlamina gelmektedir. bir insan olan bir memelinin bir hastaliginin veya bir durumunun herhangi bir tedavisini kapsamaktadir, ve sunlari içermektedir: (a) hastalik veya duruma meyilli ancak kendisine tani henüz konulmamis bir süjede hastalik veya durumun meydana gelmesinin engellenmesi; (b) hastalik veya durumun engellenmesi, yani gelismesinin durdurulmasi; (c) hastalik veya durumun rahatlatilmasi veya hafifletilmesi, yani hastalik veya durumun gerilemesine neden olunmasi; veya (d) hastaligin veya durumun iyilestirilmesi, yani gelismesinin veya ilerlemesinin durdurulmasi. Bulusun bilesimleri ile tedavi edilen süjeler popülasyonu istenmeyen durum veya hastaliktan mustarip olan, ayni zamanda durum veya hastaligin gelistirilmesi için risk altinda olan süjeleri içermektedir.

Burada kullanildigi gibi, bir "yara"; travmatik yaralanmalar örnegin mekanik (yani siyrik, delinme), termal, kimyasal, elektriksel, radyasyon, sarsinti ve Insizyonel yaralanmalar; elektif yaralanmalar örnegin ameliyat ve çikan insizyonel fitiklar, fistüller vs; akut yaralar, kronik yaralar, enfekte yaralar, ve steril yaralar, ayni zamanda hastalik durumlari ile iliskili yaralar (yani diyabetik nöropati veya genitoüriner yol ülserleri) içeren normal anatominin (dahili ve/veya harici anatomi) hangi sebeple olursa olsun herhangi bir sekilde bozulmasidir. Bir yara dinamiktir ve iyilesme süreci yaralanma zamaninda baslayan ve stabil bir yara izine eriserek ilk yaradan ilerleme kaydeden bir dizi entegre ve birbiri ile iliskili selüler süreçler gerektiren bir süreçtir. Bu selüler süreçler sinirlama olmaksizin sitokinler, Ienfokinler, büyüme faktörleri ve hormonlari içeren hümoral maddeler araciligiyla saglanmistir ve niteligi degistirilmistir. Bulusun konusuna göre, maddelerin iyilestirilmesine atifta bulunmaktadir söyle ki iyilesme daha hizli olmaktadir, ve/veya elde edilen iyilestirilmis alan daha az yara izine sahiptir ve/veya yaralanmis alan yaralanmamis dokuya yakin olan doku dayanimina sahip olmaktadir ve/veya yaralanmis doku islevsel iyilesmenin belirli bir derecesine sahip olmaktadir.

Burada kullanildigi gibi "yara iyilestirme için standart hayvan modeli " terimi hizlandirilmis yara iyilestirme ile ölçüldügü gibi bulusun bilesimlerinin tesir ettigi yara iyilestirme için teknikte-kabul görmüs herhangi bir hayvan modeline atifta bulunmaktadir. Uygun modellerin sinirlayici olmayan örnekleri surada açiklanmaktadir; Hayward PG, Robson MC.' Animal mode/s of wound contraction. In Barbul A, ve ark.: Clinical ve Experimental Approaches to Dermal ve Epidermal Repair.' Normal ve Chronic Wounds. John Wiley & Sons, New York, 1990; De/Becarro, ve ark.' The use of specific thromboxane inhibitors to preserve the dermal microcircu/ation after burning. artisans are aware of other suitable models.

Ayrintili Açiklama Mevcut bulusa göre, teknigin becerisi dahilinde geleneksel moleküler biyoloji, mikrobiyoloji, ve rekombinat DNA teknikleri kullanilabilir. Bu türde teknikler literatürde tamamen açiklanmaktadir. Bakiniz örnegin, Sambrook ve ark, 2001, "Molecular Cloning.' A Laboratory Manual'j' Ausubel, ed., 1994, "Current Protoco/s in Molecular Bio/ogy" Volumes l-lll; Cells, ed., 1994, "Ce/l Bio/ogy: A Laboratory Handbook" Volumes Hamas & Higgi'ns, eds., 1984, 'Transcription Ve Translation“; Freshney, ed., 1986, Degerler araliginin belirlendigi yerde, metinde aksi açikça bildirilmedikçe, o araligin üst ve alt siniri arasinda herbir ara degerin alt limitin biriminin onda biri olarak ve belirtilen araliktaki herhangi diger belirtilen veya ara deger olarak gösterilmektedir. Bu, belirtilen aralikta spesifik olarak kapsam disi kalmayan herhangi bir Iimite maruz kalarak, daha küçük araliklarin üst ve alt limitlerin daha küçük araliklara bagimsiz bir sekilde dahil edilebilecegi de gösterilmektedir. Belirtilen araligin limitlerin bir veya daha fazlasini içerdigi yerde, dahil edilen 0 limitlerin birisini dislayan araliklar da ayrica açiklanmaktadir.

Aksi belirlenmedikçe, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler bulusun ait oldugu teknikte kalifiye bir kimse tarafindan yaygin bir sekilde anlasildigi sekilde ayni anlama sahiptir. Burada açiklananlara benzer veya esdeger herhangi bir yöntem ve malzeme mevcut bulusun uygulamasinda veya test edilmesinde kullanilsa dahi, tercih edilen yöntemler ve malzemeler burada açiklanmaktadir.

Burada ve ekli istemlerde kullanildigi gibi “bir", “ve” tekil biçimler ile, metin açikça aksini bildirmedikçe, çogul referanslari içerdigi de göz önünde bulundurulmalidir.

Hücrelerin Elde Edilmesi ve Kültürlenmesi ECS hücreleri- Daha sonradan simdiki bulusun ECS hücrelerini üretmek için kullanilabilecek olan, ekstraembriyonik dokudan hücrelerin izole edilmesi için çesitli ECS hücrelerinin tanimlanmasi - Ekstraembriyonik doku izole edildigi zaman, dokudaki hangi hücrelerin ECS hücreleri ile iliskili özelliklere sahip oldugunun belirlenmesi gerekmektedir (bakiniz asagidaki açiklama). Örnegin hücreler, ekstraselüler boslugun Içine veya çevreleyen kültür medyumunun içine sitokinlerin özgün bir kombinasyonunu salgilamalari kabiliyetleri için deneye tabi tutulmaktadirlar. Uygun hücreler içerisinde fizyolojik araliginda sitokin veya sitokinlerin meydana geldigidir. Uygun hücreler istege bagli olarak Timozin P4 salgilamaktadirlar.

AMP hücreleri- Belirli bir yapilandirmada, AMP hücre bilesimleri asagidaki adimlar kullanilarak hazirlanmaktadirlar; a) plasentadan amniyonun geri kazanimi, b) amniyotik membrandan amniyon epitelyal hücrelerin ayrilmasi, c) amniyon epitelyal hücrelerinden AMP hücrelerinin izole edilmesi, d) dogal olarak türetilmis veya rekombinat olarak üretilmis insan proteininin eklenmesi ile bazal medyumda AMP hücrelerinin kültürlenmesi; ve istege bagli olarak d) ilaveten ilave katki maddeleri ve/veya büyüme A1'de bulunmaktadir.

AMP hücreleri asagidaki biçimde kültürlenmektedir: AMP hücreleri bir bazal medyum içerisinde kültürlenmektedirler. Bunun gibi bir medyum sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; Epilife (Cascade Biologicals), Opti-pro, VP-SFM, IMDM, Advanced HPGM, Pro 293S-CDM, Pro 293A-CDM, UItraMDCK, UltraCulture (tamami Cambrex tarafindan yapilmistir), Stemline I ve Stemline lI (her ikisi de Sigma-Aldrich tarafindan yapilmistir), DMEM, DMEM/F-12, Ham's F12, MI99, ve diger karsilastirilabilir bazal ortam. Bunun gibi bir ortam istege bagli olarak klinik düzeyde insan proteini içerebilir veya klinik düzeyde insan proteini buna ilave edilebilmektedir. Burada kullanildigi gibi bir "insan proteini" dogal olarak üretilen veya rekombinat teknoloji kullanilarak üretilendir. Belirli spesifik yapilandirmalarda, "insan proteini" ayrica bir insan sivisi veya türevi veya örnegin insan proteini içeren insan serumu veya amniyotik sivi gibi bunun bir preparasyonunu içeriyor anlamina gelmektedir.

En fazla tercih edilen yapilandirmada, hücreler kseno-kontaminasyondan kaçinmak için hayvan ürünlerinden bagimsiz bir sistem kullanilarak kültürlenmektedirler. Bu yapilandirmada, kültür medyumu Stemline l veya Il, Opti-pro, IMDM veya DMEM'dir, ve istege bagli olarak %10 yogunluguna kadar eklenen klinik düzeyde insan albümini eklenmektedir. Tercih edilen yapilandirmalarda, medyum hayvan-içermemesinin yanisira serumsuzdur. .

Istege bagli olarak, diger faktörler kullanilmaktadir. Bir tarifnamede, O-I ug/mL'lik bir konsantrasyonda olan epidermel büyüme faktörü (EGF) kullanilmaktadir. Tercih edilen bir yapilandirmada, EGF konsantrasyonu yaklasik 10 ng/mL'dir. Kullanilabilen alternatif büyüme faktörleri sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; TGFa veya TGFß (5ng/mL; aralik , aktivin A, kolera toksini (tercihen yaklasik 0.1pg/mL; O-10pg/mL araligi düzeyinde), transferrin (5pg/mL; 0.1-100pg/mL araliginda), fibroblast büyüme faktörleri (bFGF 40ng/mL ( 0-200ng/mL araliginda), aFGF, FGF-4, FGF-8; (tamami 0- veya hücre proliferasyonunu gelistirmek için bilinen diger büyüme faktörleri. Tüm ilaveler klinik düzeydedir.

Selüler Faktör-Içeren Solüsyon Sartli Medyumunun Üretilmesi ECS sartli medyumunun üretilmesi - ACCS için asagida açiklandigi sekilde elde edilmektedir, ECS hücrelerinin kullanilmasi disinda.

ACCS'nin üretilmesi - Bulusun AMP hücreleri ACCS üretmek için kullanilabilir. Bir açiklamada, AMP hücreleri burada açiklandigi gibi izole edilmektedirler ve 5-30 mL arasinda kültür medyumu, tercihen 10-25 mL arasinda kültür medyumu, ve en fazla tercihen yaklasik 10mL kültür medyumu içeren T75 siseleri içerisine IxlOB hücre/mL ekilmistir. Konflüente kadar hücreler kültürlenmistir, medyum degistirilmistir ve bir yapilandirmada ACCS konflüanstan 1 gün sonra toplanmistir. Baska bir yapilandirmada medyum degistirilmistir ve ACCS konflüanstan 2 gün sonra toplanmistir. Baska bir yapilandirmada medyum degistirilmistir ve ACCS konflüanstan 4 gün sonra toplanmistir. Baska bir yapilandirmada medyum degistirilmistir ve ACCS konflüanstan 5 gün sonra toplanmistir. Tercih edilen bir yapilandirmada medyum degistirilmistir ve ACCS konflüanstan 3 gün sonra toplanmistir. Baska bir tercih edilen yapilandirmada medyum degistirilmistir ve ACCS konflüanstan 3, 4, 5, 6 veya daha fazla gün sonra toplanmistir. Kalifiye kisiler, diger doku kültürü damarlarinin kullanimi gibi, AMP hücre kültürlerinden ACCS'nin elde edilmesi için sinirlama olmaksizin hücre fabrikalari, yassi siseler, içi bos fiberler veya süspansiyon kültür aparati içeren diger araçlari fark etmektedirler veya alt-konflüent ve/veya aktif olarak çogalan kültürlerden ACCSfnin toplanmasi da ayrica düsünülmektedir. ACCS'nin toplamayi takiben dondurularak saklanmasi da tasarlanmistir. ACCS'nin toplamayi takiben Iiyofilize oldugu da ayrica tasarlanmaktadir. Bulus tarafindan ayrica toplamayi takiben yavas salinim Için formüle edilmesi tasarlanmistir. ACCS üretiminin klinik test ve ticarilestirme Için yeterli ürünün üretilmesi için ölçeklendirilmesi de tasarlanmistir. Kalifiye kisiler kriyoprezervasyon Örnegin ACCS ve havuzlanmis ACCS gibi CFS bilesimlerinin kullanimdan önce uygun bir sulandirici ile sulandirilmasi da ayrica tasarlanmistir. Uygun sulandiricilar sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; normal salin, PBS, Iaktatli Ringer solüsyonu, hücre kültürü ortami, sartli hücre kültürü ortami, su ve benzeri. Bunun gibi sulandirmalar 1:2, 1:1,1:0.5, vs). gerekli uygun sulandirma kullanim amacina dayali olacaktir ve bundan dolayi kalifiye zanaatkarlar tarafindan deneysel olarak belirlenmesi gerekecektir.

ACCS ve havuzlanmis ACCS dahil, bulusun CFS bilesenleri; VEGF için ~5-16ng/mL, TIMP-1 için ~0.68ug/mL ve TIMP-2 için ~1.04ug/mL fizyolojik olarak ilgili araliklarda fizyolojik olarak ilgili sitokinler için deney yapilmasi ile karakterize edilmektedir. ACCS ve havuzlanmis ACCS Timozin P4'ün varligi için istege bagli olarak tahlil edilmektedir.

Fizyolojik Sitokin Solüsyonu (PCS) Bilesiminin Üretimi ACCS (burada Fizyolojik Sitokin Solüsyonu olarak atifta bulunulmaktadir) ("PCS") bilesiminin selüler olmayan türetilmis bir formu, bir tasiyicida bir veya daha fazla VEGF, Anjiogenin, PDGF, TGFß2 ve bir veya daha fazla MMP inhibitörünün (yani TIMP-1 ve/veya TIMP-2) fizyolojik seviyeleri birlestirilerek üretilmektedir. Istege bagli olarak, PCS Timozin P4 içermektedir. Bu sitokinler için fizyolojik seviyeler ACSSlde bulunanlar ile aynidir. Uygun tasiyicilar; normal salin, PBS, Iaktatli Ringer solüsyonu, hücre kültürü medyumu, sartli hücre kültürü ortami, su, vs. içermektedir. Bunun gibi bilesimler kriyoprezervation, liyofilizasyon, yavas salinimli formülasyon. ölçek büyütme ve benzeri için uygundur. PCS; ACCS'de bulunanlardan daha fazla yogunlastirilmis seviyeler içerecegi ve kullanimdan önce uygun bir sulandirici ile sonradan sulandirilabilecegi sekilde üretilebilecegi üzerinde düsünülmüstür. Uygun sulandiricilar sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; normal salin, PBS, Iaktatli Ringer solüsyonu, hücre kültürü ortami, sartli hücre kültürü ortami, su ve benzeri. Bunun gibi sulandirmalar 1:2, 121,1:0.5, vs.). gerekli uygun sulandirma kullanim amacina dayali olacaktir ve bundan dolayi kalifiye zanaatkarlar tarafindan deneysel olarak belirlenmesi gerekecektir.

Bulusun bilesimleri kullanim amaçlarina dayali olarak çesitli yöntemlerle hazirlanabilir. Örnegin. bir bilesim bulusun bir ajanini içeren bir sivi olabilir, örnegin ACCS, veya havuzlanmis ACCS. Bir sivi kompozisyon ayrica bir jel içermektedir. Sivi bilesim sulu olabilir veya pomat, merhem, krem veya benzeri biçimde olabilir. Sivi bilesim sprey veya aerosol uygulamasi için uygun olabilecek sekilde formüle edilebilir.

Kullanisli bir sulu solüsyon süspanse edici ajanlar olarak bir veya daha fazla polimer içerebilir. Faydali polimerler selülozik polimerler gibi suda-çözünür polimerler ve çapraz bagli karboksiI-içeren polimerler gibi suda-çözünmez polimerler içermektedir. Sulu bir süspansiyon veya solüsyon/süspansiyon tercihen akismaz veya mukozaya yapisan,veya daha fazla tercihen, hem akismaz hem de mukozaya yapisan olmaktadir.

Yavas-Salinimli Bilesimler Sinirlama olmaksizin ACCS, havuzlanmis ACCS ve PCS içeren CFS bilesimleri, yavas- salinimli CFS bilesimleri (burada "SR-CFS" olarak atifta bulunulmaktadir) olarak formüle edilebilir. Kalifiye kisiler örnegin ACCS, havuzlanmis ACCS veya PCS içeren terapötik ajanlarin yavas-salinimli bilesimlerini olusturmak için metodolojilere asinadir.

Sinirlama olmaksizin SR-ACCS ve SR-PCS içeren SR-CFS, burada açiklanan yöntemlerden herhangi birisi ile yapilabilir. Örnegin, multiveziküler lipozom formülasyon teknolojisi proteinin ve peptit terapötiklerinin yavas-salinimi için faydalidir. Qui, J., ve ark, formülasyonu için bu metodolojiyi açiklamaktadir. Vyas, S.P., ve ark, (Drug Dev Ind alfayi anlatmaktadir. ACCS (havuzlanmis ACCS dahil) ve PCS multiveziküler lipozom yavas-salinimli formülasyonda kullanmak için uygundurlar.

Nanopartikül teknolojisi ayrica SR-CFS yapmak için kullanislidir. Örnegin, Packhaeuser, dialkilaminoalkiI-amin-poli(vinil alkoI)-g-poli(Iaktid-ko-glikolid) nanopartiküllerine dayali biyolojik olarak parçalanan parenteral depo sistemlerini anlatmaktadir ve biyoaktif makromoleküller (örnegin proteinler) için kontrollü-salinimli araçlarin tasarimi için nanopartikül-esasli depolarin uygun adaylar oldugu ile sonuçlandirmaktadir. Dailey, PLGA'ya dayali aerosol terapisi için yüzey aktif maddeden-bagimsiz, biyolojik olarak parçalanabilen nanopartiküllerin anlatmaktadir ve DEAPA-PVAL-g-PLGAinin versatil ilaç dagitim sistemleri oldugu ile noktalamaktadir. ACCS (havuzlanmis ACCS dahil) ve PCS nanopartiküI-esasli yavas-salinimli formülasyonlarda kullanmak için uygundurlar.

Polimer-esasli yavas-salinimli formülasyonlar da ayrica son derece kullanislidir. Chan, yavas salinimi için kullanilan, Medusa Sisteminin (Flamel Technologies) bir revizyonunu saglamaktadir. Bu zamana kadar Medusa sistemi hayvan modellerinde (siçanlar, köpekler, maymunlar), ve renal kanserde (IL-2) klinik denemelerde ve hepatit C`de (lFN- alfa (2b)) hastalarinda IL-2 ve IFN-alfa (2b)'nin subkütanöz enjeksiyonuna uygulanmistir. yavas ve gelistirilmis selüler dagitimi için yeni bir platform olarak yüzey aktif-polimer nanopartiküllerden bahsetmektedir. Takeuchi, H., ve ark, (Adv Drug Deliv Res, 2001, 47(I).'39-54) Iipozomlar ve polimerik nanopartiküller dahil, peptit ilaç dagitimi için mukozaya yapisan nanopartikülat sistemleri açiklamaktadir. Wong, H.L., ve ark, (Pharm doksorubisinin sitotoksisitesini arttirdigi gösterilmis olan yeni bir polimer-Iipid hibrit sistemden bahsetmektedir. Sinirlama olmaksizin ACCS (havuzlanmis ACCS dahil) ve PCS içeren CFS bilesimleri yukarida belirtilen yavas-salinimli formülasyon metodolojilerinde kullanmak için uygundurlar. ilaveten, teknikte kalifiye kisilerin asina oldugu diger yavas-salinimli metodolojiler, burada özellikle açiklanmazken, CFS bilesimleri ile kullanim için uygundurlar.

Sinirlama Olmaksizin ACCS, Havuzlanmis ACCS, PCS, SR-ACCS (havuzlanmis ACCS dahil), ve SR-PCS Içeren CFS Bilesimlerinin Farmasötik Bilesimleri Mevcut bulus CFS bilesimlerinin farmasötik bilesimlerini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici saglamaktadir. "Farmasötik olarak kabul edilebilir" terimi U.S.

Farmakope veya hayvanlarda ve özellikle de insanlarda kullanmak için diger genel olarak taninmis Farmakopede listelenen veya devlet veya Federal düzenleme makaminca onaylanmis anlamina gelmektedir. "Tasiyici'i terimi birlikte bilesimin verildigi bir sulandirici, adjuvan, eksipiyan veya veziküle atifta bulunmaktadir. Bunun gibi farmasötik tasiyicilar sunlar olabilir; steril sivilar, örnegin su ve yaglar, petrol, hayvan, sebze veya sentetik menseili olanlar dahil, örnegin fistik yagi, soya fasulyesi yagi, mineral yag, susam yagi ve benzeri. Uygun farmasötik eksipiyanlar sunlari içermektedir; nisasta, glikoz, Iaktoz, sakaroz, jelatin, malt, pirinç, un, tebesir, silika jel, sodyum stearat, gliserol monostearat, talk, sodyum klorür, yagsiz süt tozu, gliserol, propilen, glikol, su, etanol ve benzeri. Bilesim, eger istenir ise, islatma veya emülsifiye edici ajanlarin veya pH tamponlayici ajanlarinin küçük miktarlarini içerebilir. Bu bilesimler, solüsyonlar, emülsiyon, tabletler, haplar, kapsüller, tozlar, yavas-salinimli formülasyonlar ve benzerinin biçimini alabilir. Uygun farmasötik tasiyicilarin örnekleri halihazirda kalifiye kisilerin asina olduklaridir.

Bulusun farmasötik bilesimleri nötr veya tuz formlarinda formüle edilebilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar örnegin hidroklorik, fosforik, asetik, oksalik, tartarik asitler vs. `den türetilmis olanlar gibi serbest amino gruplar ile olusturulanlar ve sodyum, potasyum, amonyum, kalsiyum, demir hidroksit, izopropilamin, trietilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain, vs'den türetilmis olanlar gibi serbest karboksil gruplar ile olusturulanlari içermektedir.

Sinirlama Olmaksizin ACCS, Havuzlanmis ACCS, PCS, SR-ACCS (havuzlanmis ACCS dahil), ve SR-PCS Içeren CFS Bilesimlerini içeren Tedavi Kitleri Ayrica ambalajlama malzemesi ve ambalajlama malzemesi dahilinde bulunan bulusun farmasötik bir bilesiminin içeren üretimin bir maddesi açiklanmaktadir, burada farmasötik bilesim CFS bilesimleri içermektedir. Ambalajlama malzemesi; orada bulunan CFS bilesimlerinin örnegin yara iyilestirme gibi terapötik uygulamalar için kullanilabilir oldugunu gösteren bir etiket veya bir kullanma talimati içermektedir.

Sinirlama Olmaksizin ACCS, Havuzlanmis ACCS, PCS, SR-ACCS (havuzlanmis ACCS dahil), ve SR-PCS Içeren CFS Bilesimlerinin Formülasyonu, Dozaji ve Uygulamasi CFS bilesimleri içeren bilesimler örnegin yara iyilestirmeyi hizlandirmak için çesitli selüler veya doku islevleri saglamak amaciyla bir süjeye verilebilir. Burada kullanildigi gibi Bunun gibi bilesimler istege bagli olarak eksipiyanlar ve yardimcilar içeren bir veya daha fazla fizyolojik olarak kabul edilebilir tasiyicilar kullanilarak herhangi bir geleneksel biçimde formüle edilebilir. Uygun formülasyon seçilen uygulamanin yöntemine dayalidir.

Bilesimler terapötik kullanimlari için yazli talimatlar ile birlikte ambalajlanabilir. Bilesimler ayrica bir veya daha fazla fizyolojik olarak kabul edilebilir tasiyicilarda aliciya verilebilir.

CFS bilesimleri için tasiyicilar sinirlama olmaksizin normal salin, fosfat tamponlu salin (PBS) solüsyonlari, fizyolojik konsantrasyonlarda tuzlarin bir karisimini içeren laktatli Ringer solüsyonu, veya hücre kültürü medyumu içerebilir. ilaveten, teknikte kalifiye bir kisi belirli bir amaç için CFS bilesimlerinin uygun dozunu hâlihazirda belirleyebilir. Tercih edilen bir doz uygulama alaninin santimetre karesinde mikrogram/ uygulama alanidir. CFS bilesimlerinin oldukça küçük miktarlarinin terapötik olarak faydali oldugu da tespit edilmistir. Bunun gibi terapötik bir faydanin bir örneklendirmesi de ACCS'nin (havuzlanmis ACCS dahil) yara iyilestirmenin ciddiyetine, tedavi edilen bozukluk veya yaralanmanin ciddiyetine dayali olarak uygulanacak dozlarin sayisinin deneysel olarak belirlenmesi gerektigini de fark edecektir. Örnegin, terapötik bir etkiye (yani yara iyilestirmenin hizlandirilmasi) sahip olmak için bir doz yetmektedir. Diger tarifnameler terapötik etki için 2, 3, 4 veya daha fazla doz üzerinde düsünmüslerdir.

Kalifiye kisi buna ihtiyaci olan bir hastada, tercih edilen bir dozun yara iyilestirmenin hizlandirilmasi gibi terapötik bir etkiyi (terapötik olarak etkili miktar) saglayan doz oldugunu fark edeceklerdir. Tabii ki, CFS bilesimlerinin dogru dozlari sinirlama olmaksizin yaralanmanin ciddiyeti ve türü, tedavi edilen bozukluk veya durum; hastanin yasi, kilosu, cinsiyeti, sagligi; diger ilaçlari ve hastaya verilen diger tedaviler; ve benzerini içeren birkaç degiskene dayali olarak kullanim zamaninda deneysel belirleme gerektirecektir. Teknikte kalifiye bir kisi ayrica verilecek dozlarin sayisinin (doz rejimi) örnegin tedavi edilen yaralanmanin, bozuklugun veya durumun ciddiyetine ve türüne dayali olarak deneysel biçimde belirlenmesi gerektigini de fark edecektir. Ilaveten teknikte kalifiye bir kisi ayrica verilecek dozun sikliginin örnegin tedavi edilen yaralanmanin, bozuklugun veya durumun ciddiyetine ve türüne dayali olarak deneysel biçimde belirlenmesi gerektigini de fark edecektir. Belirli tarifnamelerde, bir doz verilen gün sayilari (örnegin 7 gün boyunca günde bir kez vs.) boyunca her gün bir doz uygulanmaktadir. Diger tarifnamelerde, bir günde birçok doz verilebilir )(örnegin her 4 saatte bir vs.). Birçok gün için günlük birçok doz da ayrica tasarlanmistir.

Sonraki tarifnamelerde, CFS bilesimleri ile en az bir ilave ajan birlestirilebilir. Bunun gibi ajanlar terapötik etkiyi arttirmak için bulusun CFS bilesimleri ile birlikte sinerjik olarak hareket edebilir. Bunun gibi ajanlar sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; büyüme faktörleri, sitokinler, kemokinler, antikorlar, inhibitörler, antibiyotikler, immunosupresif ajanlar, steroidler, anti-fungaller, anti-viraller veya diger hücre türleri (örnegin kök hücreler veya kök-benzeri hücreler, örnegin AMP hücreleri). Inaktif ajanlar sunlari içermektedir; tasiyicilar, sulandiricilar, stabilize ediciler, jellestirme ajanlari, dagitim vezikülleri ECM'Ier (dogal ve sentetik), yapi iskeleleri ve benzeri. CFS bilesimleri diger farmasötik olarak aktif ajanlar ile birlikte verildigi zaman, CFS bilesimlerinin daha azinin dahi terapötik olarak etkili olmasi gerekebilmektedir.

CFS bilesimleri tercihen bir boru gibi bir dagitim cihazi örnegin kateter ile bir süjenin hedef bölgesine enjeksiyon ile uygulanabilmektedir. Tercih edilen bir tarifnamede, boru ilaveten bir igne örnegin siringa içermektedir, bu sayede CFS bilesimleri istenilen konumda süjeye CFS bilesimleri verilebilmektedir. Süjelere CFS bilesimlerinin verilmesine iliskin spesifik, sinirlayici olmayan örnekleri subkütanöz enjeksiyon, intra- müsküler enjeksiyon, intravenöz enjeksiyon, intraarteriyel enjeksiyon, intrakardiyak enjeksiyon, intradermal enjeksiyon, intratekal enjeksiyon, epidural enjeksiyon, intraperitoneal enjeksiyon, veya Intraserebral enjeksiyon ile uygulama içerebilir.

Infüzyonlar da ayrica tasarlanmaktadir (örnegin subdural, intratekal veya intraserebral infüzyon). Eger uygulama intravenöz ise, enjekte edilebilir bir sivi süspansiyon kesintisiz bir damla veya bolus olarak hazirlanabilmektedir ve uygulanabilmektedir. Bazi durumlarda, CFS bilesimleririin bir infüzyon pompasi kullanilarak verilmesi uygun olabilmektedir.

CFS bilesimlerinin uygulama süresi tedavi edilen hasatligin, bozuklugun veya yaralanmanin ciddiyetine ve türüne dayali olacaktir. Bir tarifnamede, CFS bilesenleri tani veya yaralanmadan sonra mümkün oldugunca çabuk bir sekilde verilmektedir. Baska bir tarifnamede, CFS bilesimleri tani veya yaralanmayi takiben bir kereden daha fazla verilmektedir. Belirli tarifnamelerde, ameliyatin gerekli oldugu yerde, CFS bilesimleri ameliyatta verilmektedir. Yine diger tarifnamelerde, CFS bilesimleri hem ameliyatta hem de ameliyattan sonra verilmektedir. Bunun gibi ameliyat sonrasi uygulama tekil veya çogul uygulamalar biçiminde olabilmektedir.

CFS bilesimleri ayrica örnegin siringa gibi bir dagitim aracina farkli formlarda girilebilmektedir. Örnegin, CFS bilesimleri bunun gibi bir dagitim aracina dahil edilen bir solüsyonun parçasi olabilir. Burada kullanildigi gibi, "solüsyon" terimi farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya sulandirici içermektedir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar ve sulandiricilar sunlari içermektedir; salin, sulu tampon Solüsyonlari, Solventler ve/veya dagitim ortami. Bunun gibi tasiyicilarin ve sulandiricilarin kullanimi teknikte iyi bilinmektedir. Solüsyon tercihen sterildir ve kolay siringa edilebilir olacagi kadar sividir. Tercihen solüsyon üretim ve depolama kosullari altinda stabildir ve istege bagli olarak parabenler, klorobutanol, fenol, askorbik asit, timerosal, ve benzerinin kullanimi ile örnegin bakteriler ve mantar gibi mikroorganizmalarin kirletici eylemine karsin korunabilmektedir. Bulusun solüsyonlari farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya sulandirici ve gerektigi sekilde yukarida siralanmis olan diger içerikler içerisine CFS bilesimleri dahil edilerek hazirlanabilmektedir.

CFS bilesimleri sistematik olarak (örnegin intravenöz olarak), lokal olarak (örnegin gözlem altinda ameliyat sirasinda dogrudan uygulama ile) veya topikal olarak verilebilmektedir. Bunun gibi bir uygulama için, bilesimler enjekte edilebilir bir sivi süspansiyon içinde veya sivi formda enjekte edilebilir olan ve hasar görmüs dokunun alaninda yari kati haline gelen biyo-uyumlu bir medyum Içerisinde olabilmektedir. Kontrol edilebilir bir endoskopik dagitim araci da ayrica kullanilabilmektedir.

CFS bilesimlerinin içerisine dahil edilebildigi veya gömülebildigi destek matrisleri alici ile uyumlu ve aliciya zararli olmayan ürünlerin içinde çözünen matrisleri içermektedir.

Dogal ve/veya sentetik biyolojik olarak parçalanabilen matrisler bunun gibi matrislere örnektir. Dogal biyolojik olarak parçalanan matrisler örnegin bir memeliden elde edilen plazma pihtilari, kolajen, fibronektin ve laminin matrislerini içermektedir. Uygun sentetik matris malzemesi immünolojik komplikasyonlari engellemek için biyouyumlu olmalidir.

Ayrica yeniden emilebilir olmalidir. Matris çesitli sekillere yapilandirilabilmelidir ve implantasyon üzerine çöküsü önlemek için yeterli dayanima sahip olmalidir. Son zamanlardaki çalismalar sunu göstermekdir ki; poliglikolik asitten yapilan biyolojik olarak parçalanabilen polyester polimerler bu kriterlerin tamamini karsilamaktadirlar (Vacanti, parçalanabilen destek matrisleri örnegin polianhidritler, poliortoesterler ve polilaktik asit gibi sentetik polimerler içermektedirler. Sentetik polimerlerin ve bu matrislere bilesimlerin dahil edilmesi veya gömülmesi yöntemlerinin ilave örnekleri de ayrica Dokümanlari.

Biyolojik olarak parçalanabilen polimerik matrisinin avantajlarindan bir tanesi de sudur; CFS bilesimleri dogrudan destek matrisine dahil edilebilmektedir böylece in vivo olarak destek matrisi çözündükçe yavas bir sekilde salinmaktadir. CFS bilesimlerine ilaveten, besin maddeleri, büyüme faktörleri, farklilasma veya farklilasmama (yani farklilastirilmis hücrelerin farklilasma özelliklerini kaybetmelerinin saglanmasi ve proliferasyon veya daha fazla genel islev özelliklerinin kazandirilmasi) indükleyicilerini içeren diger faktörler, salgilama ürünleri, immunomodülatörler, enflamasyon inhibitörleri, gerileme faktörleri, lenfatik ag veya sinir tellerinin iç büyümesini arttiran veya saglayan biyolojik olarak aktif bilesenler, hiyalüronik asit, ve teknikte kalifiye kisiler tarafindan bilinen ve örnegin Collaborative Research, Sigma Chemical Co. Gibi tedarikçilerden ticari olarak elde edilebilen etkili miktarin nasil tesis edildigine iliskin talimatlar ile birlikte ilaçlar, büyüme faktörleri örnegin epidermal büyüme faktörü (EGF) ve büyüme faktörü (HB- EGF) gibi heparin baglayici epidermal büyüme faktörü, matrisin içine dahil edilebilmektedir veya matris ile baglantili olarak temine edilebilmektedir. Benzer bir sekilde, örnegin tutunma peptidi RGD (Arg-Gly-Asp) gibi peptitler içeren polimerler, matrislerin olusturulmasi için kullanim amaciyla sentezlenebilmektedir (bakiniz örnegin Dokümanlari).

Baska bir örnekte, CFS bilesimleri bir jel matrisine dahil edilebilir (örnegin Upjohn Company”den Gelfoam). Çesitli enkapsülasyon teknolojileri gelistirilmistir (örnegin Lacy No. 4,892,538). Hastalikli veya hasar görmüs dokuya dogrudan fiziksel erisim içeren açik ameliyat islemleri sirasinda, CFS bilesimi dagitim preperasyonlarinin açiklanan biçimlerinin tamami kullanilabilir opsiyonlardir. Bu bilesimler örnegin hizlandirilmis yara iyilestirme gibi istenilen bir terapötik etki elde edilinceye kadar aralikli bir sekilde tekrar tekrar verilebilmektedir.

Kullanilacak olan üç-boyutlu matrisler doku iyilestirme ve olusturmayi yönlendirmek için bir yapi iskelesi saglayan yapisal matrislerdir. Yapi iskeleleri fiberler, jeller, kumaslar, sünger-benzeri levhalar, ve kompleks Kati Içermeyen Formda Fabrikasyon )SFFF) yaklasimlari kullanan gözenekler ve kanallara sahip kompleks 3D-yapilar araliginda biçimler alabilmektedir. Burada kullanildigi gibi, "yapi iskelesi" terimi üç-boyutlu (3D) bir yapi (substrat ve/veya matris) anlamina gelmektedir. Biyolojik bilesenlerden, sentetik bilesenlerden veya bunlarin her ikisinin bir kombinasyonundan olusabilmektedir.

Ilaveten, hücreler tarafindan dogal olarak yapilabilmektedir veya yapay olarak yapilabilmektedir. ilaveten, yapi iskelesi uygun kosullar altinda biyolojik aktiviteye sahip olan bilesenler içerebilmektedir. Yapi iskelesinin yapisi bir ag, bir sünger içerebilmektedir veya bir hidrojelden olusturulabilmektedir. Üç-boyutlu bir matrisin olusturulmasi için yapi iskeletinin tasarimi ve yapimi birinci derecede önemlidir. Vasküler iç büyüme için matris yumusak, toksik olmayan, enjekte edilebilir gözenekli bir sablon olmalidir. Gözenekler vasküler iç büyümeyi saglamalidir.

Bunlar yaklasik 100 ila 300 mikron arasinda bir aralikta biri ile ara baglantili gözeneklerdir, örnegin her ne kadar daha genis açikliklar kullanilabilse dahi bunlar yaklasik 100 ila 300 mikron arasinda interstisyel bosluga sahiptirler. Matris, besinlerin, gazlarin ve büyüme faktörlerinin uygun bir sekilde nüfus etmesini saglamak için yüzey alanini maksimize etmek için sekillendirilmelidir. Simdiki zamanda, sikistirmaya nispeten dayanimli olan gözenekli bir yapi tercih edilmektedir, matrisin genellikle alti kenarinin bir veya iki tanesinin sikistirilmasi durumunda dahi, matris doku büyümesi elde etmek için halen etkili olmaktadir.

Polimerik matris istenilen nihai biçim, yapi ve isleve dayali olarak esnek veya rijit yapilabilmektedir. Bir defektin tamiri için, örnegin esnek bir fibroz mat defektin tamamini ortalamak için kesilmektedir daha sonra implantasyon sirasinda gerektigi yerde cerrahi olarak hazirlanan defekte oturtulmaktadir. Fibroz matrislerin kullanilmasinin bir avantaji implantasyon sirasinda yapilarin yeniden biçimlendirilmesinde ve yeniden düzenlenmesindeki kolayliktir.

Ayrica yukaridaki destek matrislerinin herhangi birisi ayni zamanda amniyondan türetilmis membranlar ile iliskili olarak CFS bilesimlerinin dagitimi açiklanmaktadir.

Bunun gibi membranlar AMP hücrelerinin geri kazanimi için burada açiklanan yöntemin bir yan ürünü olarak veya asagidakilerde açiklandigi gibi diger yöntemler ile elde edilebilmektedir; örnegin insan amniyotik membranindan cerrahi bir greft kullanmak, depolamak ve yapmak için bir yöntemden bahseden U.S.6,326,019 Sayili Patent Dokümani, konaktaki bir alana, terapötik moleküllerin, proteinlerin veya metabolitlerin yavas verilmesi için yeniden yapilandirilmis ve rekombinant amniyotik membranlarin bakterileri disarda birakabilen veya bakteriyel aktiviteyi engelleyebilen veya dokunun iyilesmesini veya büyümesini tesvik edebilen bir doku yüzeyi için kaplama yapan bir bagli amniyon membranlarinin hazirlanmasi ile ilgili olan ve yaniklarin ve yaralarin tedavi edilmesi için olan yöntemlerde bunlarin kullanimi ile ilgili olan US. 4,361,552 Sayili Patent Dokümani. Mevcut bulusa göre, CFS bilesimleri bunun gibi membranlarin içine dahil edilebilmektedir.

Sinirlama Olmaksizin ACCS, Havuzlanmis ACCS, PCS, SR-ACCS (havuzlanmis ACCS dahil), ve SR-PCS içeren CFS Bilesimlerinin Örnek Terapötik Kullanimlari Yara Iyilestirme - Mevcut bulusun CFS bilesimleri sinirlama olmaksizin kesik, sikisma, termal, radyasyon, nüfus eden, sarsinti, akut, kronik, enfekte, ve steril yaralanmalari içeren bir dizi kaynagin neden oldugu yaralarin hizlandirilmis iyilestirilmesinde etkili olmaktadirlar. Simdiki bulus CFS bilesimlerinin örnegin yara alaninin yüzeyine özellikle topikal olarak uygulandigi zaman, tüm yara türleri için yara iyilestirme islemini hizlandirabildigi kesfine dayalidir. CFS bilesimleri kullanilarak, tüm yara türleri mekanik veya termal, akut veya kronik, enfekte veya steril, dogal olarak iyilesmeye birakilan veya halihazirda kullanilabilir yöntemler ile tedavi edilen benzer yaralardan daha hizli bir sekilde iyilesmektedir. Mevcut bulusun anlami dahilinde bir terapötik ajanin "terapötik olarak etkili miktar" terimi hastanin doktora veya veterinere basvurmasi ile belirlenecektir. Bu miktarlar teknikte kalifiye kisi tarafindan belirlenmektedir ve mevcut bulusa uygun olarak verildigi zaman hizlandirilmis yara iyilestirme saglayacaktir.

Terapötik olarak etkili bir miktarin ne oldugunu etkileyen faktörler; kullanilan terapötik ajanin spesifik aktivitesi, yara tipi (mekanik veya termal, tam veya kismi kalinlikta vs.), yaranin ebadi, yaranin derinligi (tam kalinlikta ise), enfeksiyonun olmamasi veya olmasi, yaranin sikintili durumundan itibaren geçen zaman ve yas, fiziksel durum, diger hastalik durumlarinin varligi, hastanin beslenme durumunu içerecektir. ilaveten hastanin aldigi diger ilaçlar verilecek olan terapötik ajanin terapötik olarak etkili miktarinin belirlenmesini etkileyecektir. Örnekler Asagidaki örnekler teknikte kalifiye kisiler için bulusun bilesimlerinin ve yöntemlerinin nasil yapilacagi ve kullanilacagi konusunda tam bir açiklama ve tarif saglamak için ortaya konulmaktadirlar, ve mucitlerin kendi icatlari için düsündükleri kapsami sinirlandirma amaci tasimamaktadirlar. Kullanilan sayilara (örnegin miktarlar, sicakliklar vs.) iliskin olarak dogrulugun saglanmasi için büyük çabalar gösterilmistir ancak bazi deneysel hatalar ve saplamalar da göz önünde bulundurulmalidir. Aksi açikça belirtilmedigi sürece, parçalar agirliginca parçalardir, moleküler agirlik ortalama moleküler agirliktir, sicaklik santigrat derecedir, ve basinç atmosferikte veya ona yakindir. Örnek 1: AMP hücre bilesimlerinin Hazirlanmasi AMP hücrelerinin qeri kazanimi- AMP hücreleri çözülme ajanlari PXXIII ve tripsin kullanilarak amniyotik membrandan baslanarak çözülmüstür. Bir amniyonun ortalama agirlik araligi 18-27 9 olmustur. Amniyon grami basina geri kazanilan hücrelerin sayisi PXXIII ile çözülme için yaklasik 10-15 x 106 olmustur ve tripsin ile çözülmek için hücrelerin sayisi 5-8 x 106 olmustur.

Seçilen AMP hücrelerinin elde edilmesi yöntemi: Amniyondan izole edilmeleri üzerine hücreler derhal kaplanmistir. Kültürde 2 güç geçtikten sonra, tutunmayan hücreler çikarilmistir ve tutunan hücreler elde tutulmustur. Plastik doku kültürü veseline olan bu tutunma istenilen popülasyondaki AMP hücrelerinin elde edilmesi için seçin yöntemidir.

Tutunan ve tutunmayan AMP hücreleri benzer bir hücre yüzeyi belirteci ifade profiline sahip görünmektedir ancak tutunan hücreler daha fazla canliliga sahiptirler ve istenilen erisinceye kadar kültürlenmislerdir. Bu noktada, kültürler konflüent olmustur. Uygun hücre kültürleri ~ 5-14 gün arasinda bu sayidaki hücreye ulasacaktir. Bu kritere ulasilmasi AMP hücrelerinin proliferatif potansiyelinin bir göstergesidir ve bu kriteri saglamayan hücreler ilave analiz ve kullanim için seçilmemektedirler. AMP hücreleri dondurularak saklanmislardir. Bu toplama süresine pO denilmektedir. Örnek 2: ACCS”nin Üretilmesi Bulusun AMP hücreleri havuzlanmis ACCS dahil, ACCS üretmek için kullanilabilmektedir. AMP hücreleri yukarida açiklandigi gibi izole edilmistir ve ~10mL kültür medyumu içeren T75 yassi siselere ~1 x 106 hücre/mL ekilmistir. Hücreler konflüente kadar kültürlenmistir, medyum degistirilmistir ve ACCS konflüanstan 3 gün sonra toplanmistir. Teknikte kalifiye kisiler konflüent kültürlerden ACCS'nIn toplanmasi için diger araçlarinda düsünüldügü fark edeceklerdir, örnegin diger doku kültürü vesellerinin kullanimi gibi, sinirlama olmaksizin sunlari içermektedir; hücre fabrikalari, yassi siseler, içi bos fiberler, veya süspansiyon kültür aparati vs. (bakiniz yukaridaki Detayli Açiklama). ACCS`nin toplandiktan sonra dondurularak saklanmasi, Iiyofilize edilmesi veya yavas-salinim için formüle edilmesi de ayrica düsünülmüstür. ACCS'nin farkli zaman noktasinda (detaylar için bakiniz Detayli Açiklama) toplanmasi da ayrica düsünülmüstür. Örnek 3: Havuzlanmis ACCS'Ierin Üretimi ACCS esasen yukarida açiklandigi gibi elde edilmektedir. Belirli yapilandirmamalarda, ACCS bir plasentadan türetilmis bir AMP hücre kültüründen birçok kez toplanmistir ve bu birçok ACCS koleksiyonu bir arada havuzlanmistir. Bunun gibi havuzlara "SP havuzlari" (birden fazla ACCS koleksiyonu/bir plasenta) denilmektedir. Baska bir uygulamada, AMP hücre kültürleri örnegin 5 veya 10 plasentadan türetilmistir. Herbir plasentadan AMP hücreleri kültürlenmistir ve herbir kültürden bir ACCS koleksiyonu toplanmistir ve daha sonra bunlarin tamami havuzlanmistir. Bu havuzlar "MP1 havuzlari" (bir ACCS koleksiyonu/plasenta, birçok plasenta) olarak adlandirilmaktadir.

Yine diger yapilandirmada, AMP hücre kültürleri örnegin 5 veya 10 plasentadan türetilmistir. Herbir plasentadan AMP hücreleri kültürlenmistir ve herbir AMP hücre kültüründen birden fazla ACCS koleksiyonu gerçeklestirilmistir ve daha sonra havuzlanmistir. Bu havuzlar "MP2 havuzlari" (birden fazla ACCS koleksiyonu/plasenta, birçok plasenta) olarak adlandirilmaktadir. Örnek 4: ELISA kullanilarak Havuzlanmamis ve Havuzlanmis ACCSide Sitokinlerin Algilanmasi Kalifiye kisilerin asina oldugu standart ELlSA'Iar 10 farkli plasentadan elde edilen AMP hücrelerinden ACCS üzerinde gerçeklestirilmektedir. Bireysel olarak herbir ACCS numunesinin test edilmesine ilaveten, numuneler arasindaki ELlSA sonuçlarinin degiskenliginin azaltildigini belirlemek için havuzlanmis ACCS numuneleri de ayrica test edilmektedirler. ACCS yukarida açiklandigi gibi elde edilmektedir. Havuzlar asagidaki gibi yapilmaktadir: Havuz 1 plasentalar 1-5'ten ACCS'den olusmaktadir, Havuz 2 plasentalar 6-10'dan ACCS'den olusmaktadir, ve Havuz 3 plasentalar 1-10'dan ACCS'den olusmaktadir. Ilaveten, SP, MP1, MP2 havuzlarinin ELISAisi gerçeklestirilmektedir. Örnek 5: PCS Bilesimlerinin Üretilmesi Asagidaki PCS bilesimleri bir tasiyicida fizyolojik düzeylerde belirtilen sitokin veya faktörün birlestirilmesi ile üretilmektedir: Bilesim A: VEGF ve TIMP-1 Bilesim B: VEGF, Anjiogenin ve TIMP-1 Bilesim C: VEGF, Anjiogenin, PDGF-BB ve TIMP-1 Bilesim D: VEGF, Anjiogenin, PDGF-BB, TGFß2 ve TIMP-1 Bilesim E: VEGF ve TIMP-2 Bilesim F: VEGF, Anjiogenin ve TlMP-2 Bilesim G: VEGF, Anjiogenin, PDGF-BB ve TlMP-2 Bilesim H: VEGF, Anjiogenin, PDGF-BB, TGFß2 ve TIMP-2 Bilesim J: VEGF, Anjiogenin, TlMP-1 ve TIMP-2 Bilesim K: VEGF, Anjiogenin, PDGF-BB, TIMP-1 ve TlMP-2 Bilesim L: VEGF, Anjiogenin, PDGF-BB, TGFß2, TIMP-1 ve TIMP-2 Bilesim M: Anjiogenin ve TlMP-1 Bilesim N: Anjiogenin, PDGF-BB ve TlMP-1 Bilesim O: Anjiogenin, PDGF-BB, TGFß2 ve TIMP-1 Bilesim P: Anjiogenin ve TlMP-2 Bilesim Q: Anjiogenin, PDGF-BB ve TlMP-2 Bilesim R: Anjiogenin, PDGF-BB, TGFß2 ve TlMP-2 Bilesim s: Anjiogenin, PDGF-BB, TGFßZ, TIMP-1 ve TIMP-2 Bilesim T: PDGF-BB ve TIMP-1 Bilesim U: PDGF-BB, TGFß2 ve TlMP-1 Bilesim V: PDGF-BB ve TIMP-2 Bilesim W: PDGF-BB, TGFßZ ve TIMP-2 Bilesim X: PDGF-BB, TlMP-1 ve TlMP-2 Bilesim Y: PDGF-BB, TGFß2, TIMP-1 ve TlMP-2 Bilesimler A-Y istege bagli olarak Timozin P4 içermektedir. Kalifiye kisiler belirli yapilandirmalarda diger MMP inhibitörlerin (örnegin TIMP-3, TIMP-4 veya sentetik MMP inhibitörleri) uygun olabilecegini düsüneceklerdir (J. Frederick Woessner, Jr., J. Clin.

VEGF, Anjiogenin, PDGF-BB, TGFBZ, TlMP-1 ve TIMP-2 asagidaki fizyolojik seviyelerde eklenmektedirler: VEGF için ~5-16ng/mL, Anjiogenin için ~3.5-4.5 ng/mL, katalogu #PHG9114'ten elde edilebilir; TIMP-1 R&D Systems katalogu #970-TM- edilebilir. VEGF, Anjiogenin, PDGF-BB, TGFß2, TlMP-1 ve TIMP-2 örnegin normal salin, PBS, Iaktatli Ringer solüsyonu, hücre kültürü ortami, su veya teknikte kalifiye kisiler tarafindan bilinen diger uygun sulu solüsyon olarak bir tasiyiciya eklenmektedir.

Aktivitenin degerlendirilmesi için yara iyilestirmede standart hayvan modellerinde PCS bilesimleri test edilmektedir (bakiniz yara iyilestirme için standart hayvan modelleri için yukaridaki Tanimlamalar). Örnek 6: Yavas-Salinimli CFS Bilesimlerinin Üretilmesi Örnegin SR-ACCS (havuzlanmis ACCS dahil) veya SR-PCS gibi SR-CFS bilesimleri, burada açiklanan yavas-salinimli formülasyon teknolojilerinin herhangi birisi (bakiniz Detayli Açiklama) veya kalifiye kisilerin asina olduklari ile CFS bilesimlerinin birlestirilmesi ile üretilmektedir. Örnek 7: kronik yara iyilestirme hayvan modelinde ACCS”nin etkileri.

Kronik granüle olan yara için teknikte-kabul edilen bir hayvan modeli kronik yara iyilesmesi üzerinde ACCS'nin etkilerini test etmek için kullanilmistir (Hayward PG, Robson MC: Animal models of wound contracti'on. In Barbul A, ve ark: Clinical ve Experimental Approaches to Dermal ve Epidermal Repair: Normal ve Chronic Wounds.

John Wiley & Sons, New York, 1990.).

Sonuçlar: doku bakteriyel biyoloji yükünün proliferasyonuna imkan saglanmamasinda ACCS etkili olmustur. ACCS, tedavi görmemis enfekte kontrol gruplarindan kaydadeger bir sekilde daha hizli bir sekilde granüle olmus yaranin hizlandirilmis iyilestirmesini imkân vermistir. Örnek 8: Kronik yara Iyilestirme Hayvan Modelinde CFS Bilesimleri PCS, SR-ACCS ve SR-PCSinin Kullanilmasi.

PCS'nin etkilerini test etmek için kronik granüle olan yara için teknikte-kabul görmüs bir hayvan modeli (Hayward PG, Robson MC.' Animal models of wound contraction. ln Barbul A, ve ark.' Clinical ve Experimental Approaches to Dermal ve Epidermal Repair: Normal ve Chronic Wounds. John Wiley & Sons, New York, 1990) kullanilmaktadir.

Claims (1)

ISTEMLER

1. Fizyolojik konsantrasyonun VEGF için ~5.0-16ng/mL, Anjiogenin için ~3.5- ~0,68pg/mL ve TIMP-2 için ~1,04pg/mL oldugu, VEGF, TGFß2, Anjiogenin, PDGF, TIMP-1 ve TIMP-2lnin fizyolojik konsantrasyonlarini içeren bir amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonu olup, özelligi; amniyondan- türetilmis selüler sitokin solüsyonu bilesimi asagidaki yöntemler ile elde edilebilmesidir: (a) bir plasentanin amniyonundan amniyon epitelyal hücrelerinin izole edilmesi; (b) amniyon epitelyal hücrelerinden AMP hücrelerinin seçilmesi; (c) hayvandan-bagimsiz esasli medyumda AMP hücrelerinin kültürlenmesi, burada medyum, konflüansa erisinceye kadar, %10'Iuk bir konsantrasyona kadar eklenen klinik düzeyde albümin ile tamamlanmaktadir; (d) kültür medyumunun degistirilmesi; (e) 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 günde medyumdaki hücrelerin kültürlenmesi; ve (f) amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonunu elde etmek için (e) adiminda kültürlenen medyumun toplanmasi; burada (0) adimindaki medyum; Stemline I veya ll, Opti-pro, IMDM veya DMEM'dir. . istem 1le göre bir bilesim olup, özelligi; (f) adiminin birçok kez tekrar edilmesi ve (f) adiminda elde edilen amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonunun havuzlanmis bir amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonu elde etmek için birlestirilmesidir. . Istem 1(c)'ye göre bilesim olup, özelligi; medyumun serumsuz olmasidir. . Istemler 1 ila Biten herhangi birisine göre bir bilesim olup, özelligi; bazal medyumun 0 ve 1 pg/mL arasinda bir yogunlukta EGF ile ilaveten tamamlanmasidir. . Istem 1 ila 2'den herhangi birisinin amniyondan-türetilmis selüler sitokin solüsyonunu içeren yavas-salinimli bir bilesim olmasidir. . Istem 5'e göre yavas-salinimli bir bilesimini yapilmasi yöntemi olup, özelligi; selüler faktör-içeren solüsyon bilesiminin yavas salinimini etkileyebilen bir ajan ile birlikte selüler faktör-içeren solüsyon bilesiminin birlestirilmesi adimlarini içermesidir. . Istemler 1 ila 5”ten herhangi birisine göre bir bilesimi içeren bir farmasötik bilesim olmasidir. . Istemler 1 ila 5 veya 7'den herhangi birisine göre bir bilesim olup, özelligi; yara iyilestirmenin hizlandirilmasi yönteminde kullanim için olmasidir.