TR201819919T4 - Rizomanyaya Karşı Direnç Geni - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş yoluyla, ilgili polipeptidin eksprese edildiği bir bitkide, özellikle de Beta cinsi bir bitkide bir patojene karşı, özellikle ?Şeker Pancarı Nekrotik Sarı Damar Virüsü?ne karşı bir direnç kazandırma kabiliyetine sahip bir polipeptidi kodlayan yeni bir nükleik asit molekülü, ayrıca Beta maritima menşeli RZ-3-genini kodlayan bir tercihli nükleik asit molekülü, onun türevleri ve homologları kullanıma sunulmaktadır. Buluşun diğer özellikleri, vektörleri, transgenik bitki hücrelerini, transgenik bitkileri, onların üretimi için yöntemleri ve direnç-kazandırıcı bir nükleik asit molekülünün tanımlanmasına yönelik yöntemleri içermektedir.

Description

TARIFNAME RIZOMANYAYA KARSI DIRENC GENI Bulusun Alani Mevcut bulus, bir patojene karsi, özellikle bir bitkide ve bilhassa polipeptidin eksprese edildigi beta cinsi bir bitkide "Seker Pancari Nekrotik Sari Damar Virüsü"ne karsi bir direnç kazandirma kabiliyetine sahip bir polipeptidi kodlayan bir nükleik asit molekülüyle ilgilidir. Bulus, ayrica, bir bitkide bir patojene karsi direnç, 'Özellikle de polipeptidin eksprese edildigi beta cinsi bir bitkide BNYVV°ye karsi direnç kazandirina kabiliyetine sahip olan ve bulusa uygun nükleik asit molekülü tarafindan kodlanan bir polipeptidle ilgilidir. Bulus, ayrica, nükleik asit molekülünü veya onun parçalarini içeren bir transgenik bitkiyle, bitki hücresiyle, bitki dokusuyla, bitki kisiniyla veya bir bitki tohumuyla, bunun yaninda böyle bir transgenik bitkiyi veya bitki hücresini üretmek için bir yöntemle ilgilidir. Bulus, bunlara ilaveten, direnç kazandiran nükleik asit molekülünü teshis etmek için yöntemleri ve ayrica direnç-kazandiran nükleik asit molekülünü içeren bitkileri veya bitki hücrelerini seçmek için yöntemleri de kapsar. Bulus hakkinda 'Ön-bilgiler Rizomanya, % 50 ve üzerinde gelir kaybina neden olabilinesi bakimindan dünya çapinda ekonomik olarak en ciddi seker pancari hastaligidir. "Sakalli kök" olarak da adlandirilan hastaliga "Seker Pancari Nekrotik Sari Dainar Virüsü" (BNYVV) neden olur ve hastalik toprakta bulunan Polymyxa betae protozoalari tarafindan bulastirilir. Bir BNYVV-enfeksiyonu ince köklerde ve yan köklerde bir proliferasyon artisiyla ve seker içerigi düserek asiri ufalmis bir kök gövdesinin olusumuyla tezahür eder. Enfekte bitkiler daha az su absorpsiyonu gösterirler ve dolayisiyla kuruluk stresine karsi daha hassas hale gelirler. Enfeksiyon bitkinin tamamina yayildiginda yaprak dainarlarinda sararma, nekrotik lezyonlar ve yapraklar üzerinde sari lekeler meydana gelir. Diger Viral hastaliklarda oldugu gibi hastalikla küratif mücadele olanaklari mevcut olmadigindan dolayi, hastaligin hasari sadece dirençli türlerin yetistirilinesiyle azaltilabilir. Su anda rizomanyaya karsi esas olarak üç ana gen incelenmektedir: RZ-l ("Holly" olarak da adlandirilir), RZ-2 ve RZ-3. Bunlara ek olarak, literatürde daha az 'onemli rizoinanya direnç genleri tarif edilmistir. Bu noktada RZ-l direnç geni halihazirda birçok islah hattina (tohum ebeveyni ve/Veya tozlayici ebeveyni bilesenleri) dâhil edilmistir. Ancak kuvvetli enfekte bölgelerde veya farkli BNYVV- patotipli bölgelerde (örn. Sohi & Maleki, 2004), RZ-l "in aracilik ettigi direncin yeterli olinadigi görülmüstür. Bundan dolayi bir süredir RZ- l"in örnegin RZ-2 veya RZ-3 ile kombine edilmesi önerilegelmektedir. RZ-2 ve RZ-3 Beta vulgaris alt türü maritima- kaynaklarindan (WB42, WB41) türetilir ve genetik olarak seker pancari genomunda kromozom 3 üzerindeki ayni bölgeye haritalanirken, RZ-l, ayni sekilde kromozom 3 üzerinde, fakat RZ-Z ve RZ-3"ün güneyine haritalanir. Scholten ve arkadaslari (1999) RZ- ana genleri RZ-l ve RZ-2 arasinda 20-25 cM"lik bir mesafe tespit etmistir. Gidner ve arkadaslari. (2005) RZ-l ve RZ-2 arasinda 5 cM°lik daha küçük bir mesafe bulmuslardir, fakat RZ-2 ve RZ-3"ün ayni lokus üzerinde haritalandiklari ihtimalini dislamamaktadirlar. Schmidlin ve arkadaslari (2008) enfekte seker pancarlarinda ekspresyon analizi yoluyla farkli indüklenmis genler tanimlamislardir, fakat bunlarin RZ-2 veya RZ-37e karsilik gelmedikleri görülmüstür. Larson ve arkadaslarinin (2008) çalismasinda, seker paiiearinda MALDI-TOF -MS yöntemiyle bazi BNYVV-indüklü proteinler teshis edilmis, ancak bilim insanlarinin RZ-l, RZ-2 veya RZ-3 tarafindan kodlanan proteinleri taniinlamalari mümkün olmamistir. Üstüne üstlük, 'Özellikle bu direnç geni etrafindaki sekans bölgesi tekrarli olup, bu durum diyagnostik markerlerin gelistirilmesini `Özellikle güçlestirmektedir. Dolayisiyla bugüne degin sözü edilen rizonianya- direnç genleri için yüksek çözünürlüklü marker haritalari veya dogrulanmis aday genler genel kullanima açik olarak temin edilebilmis degildir. Dahasi, bu RZ direnç genlerinin islevsel arkaplani, yani genetik yapisi da bugüne degin tamamen karanlikta kalmistir. Rizomanyaya karsi, direnç-kirici BNYVV-izolatlarindan kaynaklanan riski önlemeye yönelik sürdürülebilir bir yetistiricilik için, sürekli yeiii direnç genlerinin tanimlanmasi ve bunlarin seker pancari gibi kültür bitkilerinin gen havuzuna entegre edilmesi zorunludur. Bulusun 'özeti Mevcut bulus teknigin yukarida tarif edilen son durumu temelinde gelistirilinis olup, burada mevcut bulusun amaci, bir bitkide rizomanyaya karsi direnç kazandirma kabiliyetine sahip bir nükleik asit molekülünün ve/veya bir polipeptidin temin edilmesidir. Buna ilaveten, bulusun bir diger konusu, bir transgenik rizomanya-dirençli bitki ve bunun yayinda bunu üretmeye yönelik bir yöntem temin etmektir. Mevcut bulusun bir baska konusu, rizomanyaya karsi verimli bir yetistiricilige ve yeni dirençli bitki hatlarinin gelistirilmesine olanak veren moleküler inarkerlerden yararlanmaya ve onlari gelistirmeye yönelik yöntemlerini temin etmektir. Mevcut bulusun konulan hedeflere ulastiran yapilari, Beta vulgaris subsp. inaritima donör'unden kaynaklanan ve ilgili polipeptidin eksprese edildigi bir bitkideki bir patojene karsi direnç kazandirma kabiliyetine sahip bir polipeptid veya protein için kodlayan bir genin genetik olarak detayli haritalanmasina, tanimlanmasina, izole edilmesine ve karakterizasyonuna dayanir. Ilk olarak bu basvuru kullanilan bazi kavramlar asagida daha ayrintili olarak açiklaninistir: Bir nükleik asit sekansinin uzunlugu baglaminda "asagi yukari" ifadesi, +/- 200 baz çifti, tercihen +/- 100 baz çifti ve özellikle tercihen +/- 50 baz çifti ölçüsünde bir sapma anlamina gelir. "Beta cinsi bir bitki" tilkikuyrugu (Amaranthaceae) familyasina mensup bir bitkidir. Bu bitkilerin kapsamina, Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta loinatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigyna ve Beta nana türü bitkiler girer. Beta vulgaris türü bir bitki özellikle Beta vulgaris subsp. inaritima (bakiniz Mangold) veya Beta vulgaris subsp. Vulgaris alt-türlerinden bir bitkidir. Bunlarin kapsamina Örnegin Beta vulgariss subsp. vulgaris var. altissima (dar anlainda seker pancari), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (Mangold), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. Conditiva (kirmizipancar/pancarkökü), Betaulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba (yem pancari) kökü), Beta vulgaris SSp. vulgaris var. crassa/alba (yem pancari) çesitleri girer. "Hibritlestirme" veya "hibridizasyon" terimleriyle kastedilen, tek- zincirli bir nükleik asit molekülünün büyük ölçüde tamamlayici bir nükleik asit zincirine baglandigi, yani onunla baz çifti olusturdugu bir islemdir. Standart hibridizasyon yöntemleri 'Örnegin Sambrook ve arkadaslari 2001 çalismasinda tarif edilmistir. Tercihen bunlarla kastedilen, nükleik asit molekülünün bazlarinin en az % 60"inin, daha tercihen en az % 65, % 70, % 75, % 80 veya % 85°inin, `Özellikle tercihen % 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97, % 98°nin büyük ölçüde tamamlayici nükleik asit zincirinin nükleik asit zinciriyle bir baz çifti olusturinasidir. Bu sekilde bir baglanmanin olasiligi hibritlesme sartlarinin sikiligina baglidir. "Sikilik" terimi hibridizasyon sartlarina atif yapar. Buna göre baz çiftlesmesi zor ise yüksek sikilik, baz çiftlesmesi kolay ise düsük sikilik söz konusudur. Hibridizasyon sartlarinin sikiligi Örnegin tuz konsantrasyonuna veya iyon kuvvetine ve sicakliga baglidir. Genel olarak, sicaklik yükseltilerek ve/veya tuz içerigi düsürülerek sikilik artirilabilir. "Siki hibridizasyon sartlarindan", hibritlesmenin agirlikli olarak sadece homolog nükleik asit molekülleri arasinda gerçeklestigi sartlar anlasilmalidir. Bu durumda "hibridizasyon sartlari" terimi, sadece nükleik asitlerin fiilen baglanmasi sirasinda hakim olan sartlari degil, fakat ayni zamanda müteakip yikama adimlarinda hakim olan sartlari da kapsar. Siki hibridizasyon sartlari, örnegin, sadece agirlikli olarak en az % 70, tercihen en az % 75, en az % 80, en az % 85, en az % 90 veya en az % 95 sekans özdesligi tasiyan nükleik asit moleküllerinin hibritlestigi sartlardir. Siki hibridizasyon sartlari, örnegin sunlari içerir: 65 °C°de 4 x SSC içinde hibritlesme ve ardindan t0plam olarak asagi yukari 1 saat boyunca 65 °C"de 0,1 x SSC içinde birden çok defa yikama. Burada kullanilan "siki hibridizasyon sartlari" terimi ayni zamanda su anlama da gelebilir: 68 °C"de 0,25 M sodyum fosfat, pH 7.2, % 7 SDS, 1 mM EDTA ve % `l BSA içinde 16 saat boyunca hibritlesme ve ardindan 68 OC"de 2 x SSC ve % 0,1 SDS ile iki defa yikama. Tercihen hibridizasyon siki sartlar altinda gerçeklestirilir. "Izole edilmis iiükleik asit molekülü" ile kastedilen, dogal veya orijinal çevresinden k0parilmis bir nükleik asit molekülüdür. Terim ayni zamanda sentetik olarak üretilmis bir nükleik asit molekülünü de kapsar. "Izole edilmis polipeptid" ile kastedilen, dogal veya orijinal çevresinden koparilinis bir polipeptiddir. Terim ayni zamanda senteti olarak üretilmis bir polipeptidi de kapsar. Bir "moleküler marker" bir bitkisel popülasyon içinde polimorf olan bir nükleik asittir. Dolayisiyla böyle bir marker, çesitli alel durumlari (alelleri) teshis etme ve ayirt etme kabiliyetine sahiptir. Bunun için, örnegin RFLP, AFLP, SNP, SSR veya KASP gibi bilinen yöntemlerden yararlanilir. "Moleküler marker" terimi, ayni zamanda, genomik sekanslari, örnegin prob veya primer olarak kullanilan nükleik asitleri tamamlayan veya en azindan olabildigince genis ölçüde tamamlayan veya onlara hoinolog olan nükleotid sekanslarina atif yapar. Genetik polimorfizmleri tamamlayan markerler, kullanimi iyice yerleSmis yöntemler kullanilarak teshis edilebilirler. Bunlar, örn. PCR-bazli bir sekans-spesifik amplifikasyon, 'Restriksiyon Fraginaiii Uzunluk Polimorfizmleri' (RFLP) deteksiyoiiu, 'Alel Spesifik Hibridizasyon' (ASH) yoluyla polin'ûkleotid-polimorfizmleri deteksiyonu, bitki genomunda amplifiye degisken sekanslarin deteksiyonu, 'Kendine Yeterli Sekaiis Replikasyonu' deteksiyonu, 'Basit Sekans Tekrarlari' (SSRler) deteksiyonu, 'Tek Nükleotid Polimorfizmleri' (SNPler) deteksiyonu veya 'Amplifiye Fraginan Uzunluk Polimorfizmleri' (AFLPler) deteksiyonu olabilir. Bunlara ek olarak 'Eksprese Sekans Etiketleri'nin (ESTler) ve EST-sekanslarindan türetilmis SSR-inarkerlernin ve 'Rasgele Amplifiye Edilmis Polimorfik DNA'nin (RAPD) deteksiyonuna yönelik yöntemler de bilinmektedir. Bir "promotör", tipik olarak bir kodlayici bölgenin yukari akisinda bulunan, RNA-polimeraz için baglanma yerlerini içeren ve DNA transkripsiyonunu baslatan, translate edilmemis bir regülatör DNA sekansi anlainina gelir. Bir "patojen", bir bitkiyle girdigi etkilesiniler sonucunda 0 bitkinin bir veya birden çok organinda hastalik semptoinlarina neden olan bir organizma anlamina gelir. Bu patojenlerin kapsamina örnegin hayvansal, mantarsi, bakteriyel veya Viral organizmalar veya ooinycetler girer. Bir "patojen enfeksiyonu" ile kastedilen, bir patojenin bir bitkisel konakçi dokuya entegre oldugu en erken zaman noktasidir. Örnegin BNYW viral patojeni söz konusu oldugunda, bu, Polyinyxa betae protozoalari tarafindan bulastirilir. Polyinyxa, toprakta onyillarca hayatta kalabilen sporlar olusturur. Bu Sporlarin içinde Virüs de hayatta kalir. Bu kalici sporlar mobil zoosporlar olusturacak sekilde gelistiginde, virüs bunlar yoluyla bitkisel konakçi dokunun hücrelerine intikal edebilir ve orada konakçiya entegre olabilir (Esser 2000) Bitkisel "organlar" örnegin yapraklari, filiz eksenini, sapi, kökler, hipokotili, besler yumrulari, meristemleri, embriyolari, anterleri, ovülleri veya meyveleri tanimlar. Bitkisel "kisimlar", birden çok organin, örn. bir çiçek ve bir tohumun bir bilesiiniiii veya bir organin bir kismini, örn. filizden alinan bir çapraz kesiti tanimlar. Bitkisel "dokular" örnegin kallus dokusu, depolama dokusu, merisinatik doku, yaprak dokusu, filiz dokusu, kök dokusu, bitki tümörü dokusu veya üreme dokusudur. Bitkisel "hücrelerle" kastedilen, örnegin, bir hücre duvarina sahip izole hücreler veya onlarin agregatlari veya protoplastlaridir. "Direnç" terimi genis manada anlasilmalidir ve hastalik gelisimiiiin geciktirilmesinden tamamen önleiiiiiesine kadar uzanan bir koruma araligini kapsar. Ciddi bir patojen ömegi Seker Pancari Nekrotik Sari Damar Virüsü"dür (BNYVV). Tercihen bulus kapsamindaki bir dirençli bitki hücresi veya bulusun bir dirençli bitkisi BNYVV"ye karsi dirençli hale gelir. Bir patojeiie karsi direnç, bu patojenin neden oldugu bir hastaliga karsi dirençle, örnegin BNYVV°ye karsi direnç Rizomanyasya karsi bir dirençle esanlamlidir. "Transgenik bitki" terimi, genomuna en az bir nükleik asit entegre edilmis olan bir bitkiyi tanimlar. Burada söz konusu olan bir heterolog nükleik asit olabilir. Tercihen nükleik asit kararli entegre edilmistir ve bu, entegre edilen nükleik asitin bitkide varligini stabil olarak sürdürdügü, eksprese edilebildigi ve hatta kalitim yoluyla stabil olarak altsoylara aktarilabildigi aiilainina gelir. Mevcut basvuru, ilgili polipeptidin eksprese edildigi bir bitkide bir patojene karsi bir direnç kazandirina kabiliyetine sahip bir polipeptidi kodlayaii bir nükleik asit molekülünü açiklamaktadir. Nükleik asit molekülü asagidakiler arasindan seçilen bir nükleotid sekansini içerir: a) SEK. KIM. NO: 2 veya SEK. KIM. NO: 3°e uygun bir aininoasit sekansina sahip bir polipeptidi kodlayan bir nükleotid sekansi, b) SEK. KIM. NO: l"e uygun DNA-sekansinin kodlayici sekansini içeren bir nükleotid sekansi, c) Siki sartlar altinda a) veya b)°ye uygun bir nükleotid sekansinin tamamlayici sekansiyla hibritleseii bir nükleotid sekansi, (:1) a) veya b)'ye uygun nükleotid sekansi tarafindan kodlanan bir aminoasit sekansinin bir veya birden çok aminoasitinin sübstitüsyonu, delesyonu ve/Veya adisyonu yoluyla, a) veya b)°ye uygun nükleotid sekansi tarafindan kodlanan bir polipeptidden türetilen bir polipeptidi kodlayan bir nükleotid sekansi, e) a) veya b)'ye uygun nükleotid sekansi tarafindan kodlanan bir aminoasit sekansiyla en az % 60 özdes olan bir aininoasit sekansina sahip bir polipeptidi kodlayan bir nükleotid sekansi veya f) SEK. KIM. NO: 2,nin aminoasit konumlari 168-227°ye uygun veya SEK. KIM. NO: 3°ün aminoasit konumlari 182-241 "e uygun en az bir nükleotid-baglayici domaini (NBS veya NB-ARC), SEK. KIM. NO: 2"nin aminoasit konumlari 591-613"e uygun veya SEK. KIM. NO: 3°ün aminoasit konumlari 605-627,ye uygun en az bir lösince-zengin domaini (LRR) ve/Veya SEK. KIM. NO: 2°nin aminoasit konumlari 1013-1072"ye uygun veya SEK. KIM. NO: 3°ün aminoasit konumlari 1027-1086"ya uygun en az bir iç tekrarlayan domaini (IR) kodlayan bir nükleotid sekansi. Nükleik asit molekülü bir izole nükleik asit molekülü olabilir. Bu tercihen DNA ve özellikle tercihen cDNA"dir (kodlayici DNA). Tercihen, bulusa uygun nükleik asit molekülü tarafindan kodlanan polipeptid, Rizomanya adli bitki hastaligina neden olan Viral patojen "Seker Pancari Nekrotik Sari Damar Virüsü"ne (BNYVV) karsi direnç kazandirir. Bulusa uygun nükleik asit molekülü tarafindan kodlanan polipeptid, ayrica, 'ozellikle Beta cinsi bir bitkide bir patojene karsi direnç kazandirir. Buradaki bitki tercihen Beta vulgaris türünden bir bitki, `Özellikle tercihen Beta vulgaris subsp. maritima veya Beta vulgaris subsp. vulgaris alt-türünden bir bitkidir; bunlarin kapsamina örnegin seker pancari, kirinizi pancar, yem pancari, pazi ve yaban pancari kültür tipleri girer. Bulusa uygun nükleik asit molekülünün bir yapisinda, nükleik asit molekülü a)°ya uygun nükleotid sekansini içerir. Kodlanan polipeptidin SEK. KIM. NO: 2°ye uygun ve/Veya Kodlanan polipeptidin SEK. KIM. NO: 3°e uygun aminoasit sekansi RZ-3- geninin direnç proteinini olusturur. Burada Söz konusu olan, belirli yapi motifleriyle karakterize olan NBS-LRR tipi bir direnç genidir/proteinidir. Bu gibi direnç proteinlerinin bitkilerdeki genel yapisi halihazirda etraflica arastirilmistir (Martin et al. 2003). Ancak, bilhassa, çogunlukla bilinmeyen patojen efektörler için potansiyel taniina domainleri olarak kabul edilen LRR-domainlerinin yapisal olusum prensibi önceden kestirilemez. Bununla baglantili olarak, BNYVV-direnci kazandiran bir genin veya proteinin biliiien yapisal motifler temelinde tanimlanmasi mümkün degildir. RZ-3-direnç geninin tanimlanmasi, RZ-3-direnç geninin ilk basta bulunmasinin tahmin edildigi hedef bölgenin kapsamli olarak genetik haritalanmasini ve detayli-haritalanmasini gerektiren bir harita-bazli klonlanlama prosesi çerçevesinde vuku bulmustur. Gelistirme çalismalari ilerleyen bölümlerde daha ayrintili olarak açiklanmaktadir. Tanimlanan direnç proteini NBS-LRR tipine mensuptur ve SEK. KIM. NO: 2"nin aminoasit konumlari 168-227'ye uygun veya SEK. KIM. NO: 3'i'1n aminoasit konumlari l82-24l'e uygun en az bir nükleotid-baglayici domaine (NBS veya NB-ARC (nucleotide-binding adaptor shared by APAF-l, R proteins, and ÇED-4) olarak da bilinir), SEK. KIM. NO: 2°nin aminoasit konumlari 591-613°e uygun veya SEK. KIM. NO: 3°ün aminoasit konumlari 605-627"ye uygun en az bir l'osince-zengin domaine (LRR) ve SEK. KIM. NO: 2°nin aminoasit konumlari 1013-1072'ye uygun veya SEK. KIM. NO: 3"i`in aminoasit konumlari 1027-1086°ya uygun en az bir iç tekrarlayan domaine (IR; Intemal Repeat-Domain) sahiptir. NBS-domaini SEK. KIM. NO: 1°in 2019-2882 nükleotidleri tarafindan, LRR-domaini SEK. KIM. NO: 1°in 3288-3356 nükleotidleri tarafindan ve IR-domaini SEK. KIM. NO: liin 4554-4871 nükleotidleri tarafindan kodlanir. NB-ARC- domaini bir merkezi nükleotid-baglayici domaindir ve muhtemelen bir direnç-proteininin aktivitesini regüle ettigi tahmin edilen bir islevsel ATPaz-domainidir. NB-ARC-domaini üç alt-domainden olusur: NB, ARC 1 ve ARC2. NB-ARC-domaininin karakteristik motifleri, muhtemelen hipersensitiviteden sorumlu olan APAF-l (apoptotic proteaseactivating factor-1), thRExE, Walker-A veya P-lupu, Walker-B, GxP, RNBS-A ilâ D ve MHD°dir (Ooijen ve arkadaslari, 2008). Anilan motiflerin bazilari 'Önceden tanimlanabilmistir. Bulusa uygun nükleik asit moleküli'in'ûn bir baska yapisinda, nükleik asit molekülü b)°ye uygun nükleotid sekansini içerir. Nükleotid sekansi, SEK. KIM. NO: 2 ve 3"e uygun aminoasit sekanslarini kodlayan SEK. KIM. NO: 1"e uygun DNA-sekansinin kodlayici sekanslarini içerir. Bulusa uygun nükleik asit niolekülün'un bir baska yapisinda, nükleik asit molekülü d)"ye uygun nükleotid sekansini içerir. Bu nükleotid sekansi, polipeptidin a) veya b)°ye uygun nükleotid sekansi tarafindan kodlanan bir türevini olusturur. Polipeptidin bir türevi, bir veya birden çok aminoasitin sübstitüsyonunu, delesyonunu veya adisyonunu içeren bir türetilmis aminoasit sekansini temsil eder ve burada kodlanan polipeptidin/proteinin islevselligi korunur. Bir aminoasitin, ayni veya esdeger veya benzer kimyasal-fiziksel 'özelliklere sahip baska bir aminoasitle sübstitüsyonu durumunda bir "konservatif degisimden" veya "yari-konservatif degisimden" bahsedilir. Bir aminoasitin fiziko-kimyasal özelliklerine örnek olarak aminoasitin hidrofobikligi veya yükü verilebilir. Alanin uzmani, hangi aminoasit sübstitüsyonlarmin bir konservatif ve yari-konservatif degisim olusturdugunu bilir. Buna ilaveten, genel uzmanlik bilgisi, alanin uzmanina hangi aininoasit delesyonlarinin ve adisyonlarinin RZ-3 direnç geninin islevselligi için zararsiz oldugunu ve bunlariii hangi konumlarda mümkün oldugunu tanima, tanimlama ve teshis etme olanagi verir. Alanin uzmani, mevcut NBS-LRR-proteini söz konusu oldugunda aminoasit sekansinin inodifikasyonlari (bir veya birden çok aminoasitin sübstitüsyonlari, delesyonlari veya adisyonlari) için özellikle yukarida tanimlanan korunmus doinainlerin islevselliginin korunmasi gerektigini ve dolayisiyla bu domainlerde yukaridaki tipte modifikasyonlarin ancak sinirli ölçüde mümkün oldugunu bilir. Ha] bu iken, mevcut yapinin nükleotid sekansi, nükleotid sekansinin a) veya b)°ye uygun nükleotid sekansiyla en az % 80, % 85, % 90, % 92, % 94, % 96, % 97, % 98, % 99 oraninda homolog veya özdes olmasi durumunda bir türevi veya bir türetilmis aininoasit sekansini kodlar. Tercihen, bir türevi veya bir türetilmis amiiioasit sekansini kodlayan bu gibi nükleotid sekanslari, tüm uzunlugunca veya en azindan kismen SEK. KIM. NO: 1"e veya burada açiklanan bir baska sekansa uygun olan bir baslangiç nükleotid sekansindan dogrudan veya dolayli olarak (Örnegin amplifikasyon veya replikasyon adimlari yoluyla) üretilebilirler. Bulusa uygun nükleik asit molekülünün bir baska yapisinda, nükleik asit molekülü e)"ye uygun ii'i'ikleotid sekansini içerir. Bu nükleotid sekansi, a) veya b)"ye uygun nükleotid sekansi tarafindan kodlaiian bir aminoasit sekansina en az % 80, % 85, % 90, % 92, % 94, % 96, % 97, % 98, % 99 oraninda özdes olan bir aininoasit sekansina sahip bir polipeptidi kodlar. Bulusa uygun nükleik asit molekülünün bir baska yapisinda, nükleik asit molekülü f),ye uygun nükleotid sekansini içerir. Nükleotid sekansi, SEK. KIM. NO: 2,nin aminoasit konumlari 168-227°ye uygun veya SEK. KIM. NO: 3°ün aminoasit konumlari 182-241°e uygun en az bir nükleotid-baglayici domaini (NBS), SEK. KIM. NO: 2°nin aininoasit konumlari 591-61376 uygun veya SEK. KIM. NO: 3"ün aminoasit konumlari 605-627"ye uygun en az bir lösince-zengin domaini (LRR) ve SEK. KIM. NO: 2'nin aminoasit konumlari 1013- 1072"ye uygun veya SEK. KIM. NO: 3"ün aininoasit konumlari 1027- 1086°ya uygun en az bir iç tekrarlayan domaini (IR) içeren bir polipeptidi kodlar. Bu domainler, özellikle tercihen, polipeptidde N ucundan C ucuna dogru NBS - LRR - IR sirasiyla dizilirler ve bu durumda domainler arasinda her durumda bir veya birden çok baska aminoasit mevcut olabilir. Mevcut bulus, ayrica, ilgili polipeptidin eksprese edildigi bir bitkide bir patojene karsi bir direnç kazandirma kabiliyetine sahip olan ve bulusa uygun nükleik asit molekülü tarafindan kodlanan ve bu durumda patojenin tercihen BNYVV oldugu ve/veya bitkinin tercihen Beta cinsi bir bitki, özellikle de Beta vulgaris türü bir bitki oldugu bir polipeptidle de ilgilidir. Polipeptid, özellikle tercihen SEK. KIM. NO: 2°ye uygun veya SEK. KIM. NO: 3'c uygun bir aminoasit sekansina sahiptir. Polipeptidin bir izole edilmis polipeptid olmasi söz konusu olabilir. Mevcut bulus, bir baska özelligi itibariyle, bulusa uygun nükleik asit molekülünü içeren bir vektörle ilgilidir. Bu vektör bir plazmid, bir kozmid, bir faj veya bir ekspresyon vektörü, bir transformasyon vektör'u, mekik vektörü veya klonlama vektörü olabilir, ayrica çift- Zincirli veya tek-Zincirli, dogrusal veya dairesel olabilir veya bir prokaryot veya ökaryot konakçiyi, gerek onun genomuna entegre olarak, gerekse de ekstrakroinozomal olarak transforme edebilir. Bulusa uygun iiükleik asit molekülü, tercihen, bir prokaryot veya ökaryot konakçi hücrede transkripsiyona ve opsiyonel olarak ekspresyona olanak veren bir veya birden çok regülatör sekansa sahip bir ekspresyon vektörüne operasyonel olarak baglanmistir. Örnegin, iiükleik asit molekülü uygun bir promotörün veya bir terminatörün kontrolü altindadir. Uygun promotörler, yapisal olarak indüklenen proinotörler olabilir (Orn.: "Kamabahar mozaik Virüsü" kökenli 358- promotörü (Odell ve arkadaslari. 1985); patojenik olarak indüklenebilir tipte promotörler özellikle uygundur (Orn.: Maydanoz kökenli PRl-promotörü (Rushton ve arkadaslari, 1996). Patojenik olarak indüklenebilir promotörlerin özellikle uygun olaiilari, dogada bulunmayan, birçok eleinanin bilesiminden meydana gelen ve bir minimal proinotör içeren, ayrica iniiiimal proinotörün yukari akisinda, özel transkripsiyon faktörleri için baglanma yeri islevi gören en az bir cis-regülatör elemana sahip olan sentetik veya kimerik proinotörlerdir. Kimerik promotörler istenen gereksinimlere göre tasarlanirlar ve farkli faktörler tarafindan indüklenir veya baskilanirlar. Bu gibi promotörlerin örnekleri WO 00/29592, WO 2007/147395 ve WO 2013/091612 dokümanlariiida bulunabilir. Uygun bir terminatör, örnegin nos-terminatörüdür (Depieker ve arkadaslari, 1982). Mevcut bulus, yukarida tarif edilen vektörlere ilaveten, tarif edilen bir vektörün bir konakçi hücreye entegre edilmesini içereii bir yöntemi de temin eder. Vektör, örnegin, konjügasyon, mobilizasyon, biyolitik transformasyon, agrobakteri-aracili transformasyon, transfeksiyon, transdüksiyon, vakum infiltrasyonu veya elektroporasyon yoluyla ekleiiebilir. Bu gibi yöntemler ve tarif edilen vektörleri hazirlainaya yönelik yöntemler alanin uzmani tarafindan bilinir (Sambrook ve arkadaslari. 2001). Mevcut bulus, bir baska özelligi itibariyle, bulusa uygun nükleik asit inolekülünü veya mevcut bulusun vektörünü içeren bir konakçi hücreyle ilgilidir. Bulustaki anlamiyla bir konakçi hücre bir prokaryot hücresi (öm. bakteriyel) veya bir maya hücresi olabilir. Konakçi hücre, tercihen, bulusa uygun nükleik asit molekülünü veya mevcut bulusun vektörünü içeren Agrobacteriuin tumefacieiis veya Agrobacterium rhizogenes gibi bir agrobakteridir. Alanin uzinani, hem bulusa uygun nükleik asit molekülünü veya mevcut bulusun vektörünü bir agrobakteriye entegre edebilmesine imkân veren konjügasyon veya elektroporasyon gibi yöntemleri, hem de bulusa uygun nükleik asit molekülünü veya inevcut bulusun vektörünü bir bitki hücresine entegre edebilmesine imkân veren çesitli transformasyon yöntemlerini (biyolitik transformasyon, agrobakteri- aracili transformasyon) bilir (Sambrook ve arkadaslari. 2001). Mevcut bulus, bir baska özelligi itibariyle, transgen olarak bulusa uygun bir nükleik asit molekülünü veya mevcut bulusun vektörünü içeren bir transgenik bitki hücresiyle ilgilidir. Bu gibi bir transgenik bitki hücresi, örnegin, bulusa uygun nükleik asit molekülüyle veya mevcut bulusun vektörüyle tercihen stabil olarak transforme edilmis bir bitki hücresidir. Transgenik bitki hücresinin tercih edilen bir yapisinda, nükleik asit molekülü, bitki hücresinde transkripsiyona ve opsiyonel olarak ekspresyona olanak veren bir veya birden çok regülatör sekansla operasyonel olarak baglantilidir. Bu durumda bulusa uygun nükleik asit molekülünün ve regülatör sekansin/sekanslarin olusturdugu yapi bütünü transgeni meydana getirir. Bu gibi regülatör sekanslar örnegin bir promotör veya bir terminatördür. Alanin uzmani, bitkilerde kullanilabilecek çok sayida islevsel promotörü veya terminatörü bilir. Mevcut bulusun transgenik bitki hücresi, özellikle de Beta cinsi bir bitkinin bir hücresi, bir patojene karsi, özellikle de BNYVV'yc karsi, transforme-edilmemis mukabil bitki hücresinden (transgeni içermeyen bitki hücresi) daha yüksek bir direnç gösterir. Örnegin BNYVV"ye karsi direncin seviyesi Beta cinsi bitkilerde seviye skorlarinin tayini yoluyla kalitatif olarak belirlenebilir (Beta cinsi bitkiler için seviye skorlari teknigin son durumundan bilinmektedir, örnegin seker pancari için bkz. Mechelke (1997)). Daha yüksek bir direnç, direncin en az bir seviye skoru, en az iki seviye skoru, en az üç veya daha yüksek seviye skoru ölçüsünde iyilesmesiyle kendini gösterir. Mevcut bulus, ayrica, mevcut bulusun bir transgenik bitki hücresini üretmek için bulusa uygun nükleik asit molekülünün veya mevcut bulusun vektörünün bir bitki hücresine entegre edilmesini içeren bir yöntemle de ilgilidir. Bu entegrasyon örnegin transformasyon, tercihen stabil transformasyon yoluyla gerçeklesebilir. Biyolitik transformasyon, agrobakteri-aracili transformasyon veya elektroporasyon gibi, sözü edilen entegrasyon için uygun olan teknikler alanin uzmani tarafindan bilinir (Sambrook ve arkadaslari. 2001). Mevcut bulus, bir baska özelligi itibariyle, yukarida tarif edilen transgenik bitki hücresini içeren bir transgenik bitkiyle veya onun bir kismiyla ilgilidir. Buradaki bitki kismi bir hücre, bir doku, bir organ veya birden çok hücrenin, dokunun veya organin bir bilesimi olabilir. Birden çok organin bir bilesimi öm. bir çiçek veya bir tohumdur. Bulusun özel bir yapisi transgenik bitkinin bir tohumuyla ilgili olup, bu tohum transgen olarak bulusa uygun nükleik asit molekülünü içerir. Mevcut bulusun transgenik bitkisi, özellikle de Beta cinsi bir bitki, bir patojene karsi, özellikle de BNYVV"ye karsi, transforme-edilmemis inukabil bitkiden (transgeni içermeyen bitki) daha yüksek bir direnç gösterir. Örnegin BNYVV"ye karsi direncin seviyesi Beta cinsi bitkilerde seviye skorlarinin tayini yoluyla kalitatif olarak belirlenebilir (Beta cinsi bitkiler için seviye skorlari teknigin son durumundan bilininektedir, örnegin seker pancari için bkz. Mechelke (1997)). Daha yüksek bir direnç, direncin en az bir seviye skoru, en az iki seviye skoru, en az üç veya daha yüksek seviye skoru ölçüsünde iyilesinesiyle kendini gösterir. Mevcut bulus, ayrica, mevcut bulusun bir transgenik bitkisini üretmek için bulusa uygun nükleik asit inolekülünün veya inevcut bulusun vektörünün bir bitki hücresine entegre edilmesi adimini ve opsiyonel olarak bir transgenik bitki hücresinin seçilmesi adimini içeren bir yönteini temin eder. Bir transgenik bitkiyi üretineye yönelik böyle bir yöntem, ilaveten, birinci adimda üretilen transgenik bitki hücresinden transgenik bitkinin yeniden üretilmesini içeren bir müteakip adimla karakterizedir. Alanin uzmani uygun yeniden üretme yöntemlerini teknigin son durumundan bilir. Mevcut bulus, bir baska özelligi itibariyle, bir bitkide, tercihen Beta cinsi bir bitkide bir patojene karsi, özellikle BNYVV°ye karsi direnç kazandirmak veya direnci yükseltmek için bir bitki hücresinin bulusa uygun bir nükleik asit molekülüyle veya mevcut bulusun vektörüyle transforme edilmesi adimini içeren bir yöntemle de ilgilidir. Tercihen bu yöntein direncin en az bir seviye skoru ölçüsünde iyilesmesine, özellikle tercihen direncin en az iki, üç veya daha yüksek bir seviye skoru ölçüsünde iyilesmesine yol açar. Beta cinsi bitkiler için seviye skorlari semalari teknigin son durumundan bilinmektedir, örnegin seker pancari için bkz. Mechelke (1997). Mevcut bulus, bir baska özelligi itibariyle, bulusa uygun nükleik asit molekülünü içeren bir genin ekspresyonunu kontrol eden bir proinotör regülatör sekansiyla ilgili olup, karakterize edici özelligi, regülatör sekansin bir patojen enfeksiyonu neticesinde bir heterolog DNA- sekansinin ekspresyonuna aracilik etme veya onu modüle etme kabiliyetine sahip olmasi ve regülatör sekansin 1-1403 nükleotidlerinin SEK. KIM. NO: l"e uygun nükleotid sekansini içermesidir. Tercihen heterolog DNA-sekansi, bitkisel patojen savuninasinin bir bilesenini kodlayan (Om.: Direnç genleri (R-genleri) veya kinazlar ya da fosfatazlar gibi sinyal transferinde rol oynayan enziinleri kodlayan, ayrica G-proteinini kodlayan genler) veya bir patojenik efektörü (avirulens genleri (avr) denilen genler) kodlayan bir nükleotid sekansidir. Mevcut bulus, ayrica, yukarida tarif edilen regülatör sekansi içeren bir rekombinant DNA-molekülünü de kapsar. Tercihen rekombinant DNA-molekülü bir heterolog DNA-sekansiyla operasyonel olarak baglantilidir. Mevcut bulus, bir baska özelligi itibariyle, yukarida tarif edilen regülatör sekansla veya sözü edilen rekoinbinant DNA-molekülüyle transforme edilmis olan bir konakçi hücreyle ve bunun yaninda, transgen olarak regülatör sekansi veya rekombinant DNA-molekülünü içeren bir transgenik bitkiyle, bitki dokusuyla veya bitki hücresiyle ilgilidir. Bulus, ayrica, bir transgenik bitki hücresini üretmek için, bulusun regülatör sekansini veya rekoinbinant DNA-molekülünü entegre etme adimini ve opsiyonel olarak bir transgenik bitki hücresini seçme adimini içeren bir yöntemi temin eder. Bulus, bunlara ek olarak, bir transgenik bitkiyi üretmek için, bulusun regülatör sekansini veya rekoinbiiiant DNA-molekülünü bir bitki hücresine entegre etme adimini ve opsiyonel olarak bir transgenik bitki hücresini seçme adimini içeren bir yöntemi temin eder. Bir transgenik bitkiyi üretmeye yönelik böyle bir yöntem, ilaveten, birinci adimda üretilen transgenik bitki hücresinden transgenik bitkinin yeniden üretilmesini içeren bir müteakip adimla karakterizedir. Yukarida 'Önceden açiklanmis oldugu üzere, RZ-3-direnç geninin tanimlanmasi bir harita-bazli klonlama prosesi çerçevesinde gerçeklesmistir. Uygulanan proses `Örnegin su adimlari içermekteydi: Genetik detayli-haritalama, fiziki haritalaina, 8000°in üzerinde F2- splaysing altsoyu içeren çok genis bir splaysing popülasyoiiunun olusturulmasi, rekombinant-tarama, hedef bölgede marker gelistirme, dirençli ve duyarli genotiplerde karsilastirmali BAC sekanslamasi, biyoinforinatik analizler, protein tahminleri ve proteinler arasinda karsilastirma. Bu gibi zahmetli gelistirme çalismalari her zaman alabildigine masraflidir ve genin gerçekten tanimlanip taniinlanamayacagi da belirsizdir. Beta vulgaris subsp. Maritima"dan gelen RZ-3-lokusunun Beta cinsi bir bitkiye, spesifik olarak seker pancarina (Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima) entegrasyonundan sonra RZ-3-geiiom seginentinin takibi için detayli- haritalaniada üstün diyagnostik deger tasiyan inarkerler gelistirilmis, ancak hedef bölgenin genis bölgelerde tekrarli olmasindan dolayi bu süreç bilhassa güç olmustur. Buna ragmen, sasirtici bir sekilde, kismi olarak sadece pirosekanslar gibi belirli bir inarker teknigiyle, yani PSQ-markeri olarak islev gören veya sifir alel olan az sayida birkaç diyagnostik markerin gelistirilmesi mümkün olmustur. Bu teknik güçlüklere ragmen bu inarkerlerin kullanildigi kapsainli analizler yoluyla RZ-3-lokusunun 0,67 cM"lik bir genoinik bölgeyle sinirlandirilmasi saglanabilmistir. Bu asagi yukari 340.000 bp"lik bir fiziksel uzunluga karsilik gelir. Kapsainli ileri gelistirme çalismalarina ragmen, Beta vulgaris subsp. inaritima-introgresyonunun marker- destekli olarak genin etrafinda daha da indirgenebilmesi ve RZ-3-geni için aday genlerin tanimlanabilmesi ancak kisitli Ölçüde mümkün olabilmistir. Öte yandan, RZ-3-genine sikica baglanmis potansiyel herhangi bir "baglanti sürüklenmesini" elimine etmek için, introgresyonun daha da kisaltilinasi kültürleme açisindan her halükarda arzu edilen bir durumdur. Sonuçta, detayli-haritalama yoluyla uygulanan birçok adimda ve fiziksel haritalardan elde elden sekans bilgisinin dahil edilinesiyle hedef bölgenin asagi yukari 0,07 cM°yle sinirlanmasi ancak mümkün olabilmistir. Bu, her biri 90-180 altsoyda yogun olarak analiz edilen bilgilendirici rekombinant BCZSI veya BCZSZ bitkileri de dâhil olinak üzere toplam 8004 adet bitkinin incelenmesiyle mümkün olmustur. Bilinmeyen nedenlerden ötürü direnç ekspresyonu her zaman belirgin olmadigindan dolayi bu gerekli görülmüstür. Bu altsoylarin bitkileri tek tek genotiplenmis ve paralel olarak fenotiplenmistir. Bilgilendirici rekombinantlarin fenotipleri (homozigot dirençli - RR; heterozigot dirençli - Rs; homozigot duyarli - ss) istatistiksel yöntemler (t-Test, güç analizi) kullanilarak tespit edilmis ve böylelikle bilgilendirici rekombinantlarin genotipi hakkinda çikarimlara varilinistir. Duyarli genotipte asagi yukari 38.000 bp°lik nispeten küçük hedef bölgede on adet genin anotasyonu yapilabilmistir. Bu hedef bölge için, spesifik olarak hedef bölgeyi tanimlayan yeni markerler yardimiyla bir dirençli BAC kütüphanesinden örtüsüm klonlari tanimlanmis ve nihayetinde sekanslanmistir. Hedef bölgenin tekrarli karakterinden dolayi, duyarli genotipin sekansi, bilinmeyen sekans içerigine sahip çok sayida küçük bölümler göstermistir. Bundan dolayi RR ve ss sekanslarinin birlestirilmesi alabildigine zorlayici olmustur. Buna ragmen bir putatif direnç geni tanimlanabilmistir. Bu gen neredeyse tüm ss-genotiplerinde LRR-domaini ve IR-domaini arasinda yaklasik 8000 bp uzunlugunda bir retrotranspozon içermektedir; RR- genotiplerinde bu retrotranspozon tespit edilmemistir. Putatif direnç geni sekansindan tahmin edilen bir aminoasit sekansi, genin, muhtemelen NB-ARC-LRR-proteinini kodladigini göstermektedir. Bu retrotranspozon insersiyonunun duyarli ss-genotiplerinde genin islevini tahrip ettigi varsayilabilir, zira bu iç tekrar-domainini (IR) diger iki domainden (NB-ARC ve LRR) ayirmaktadir. Dahasi, ss-genotiplerindeki NBS-LRR-geninin RR- genotiplerindekiyle karsilastirmasi, Sekil 1, 2 ve 3"ten çikartilabilecek diyagnostik polimorfizmleri göstermektedir. NBS-LRR genindeki bu polimorfizmler temelinde markerler gelistirilmis ve neredeyse 100 ss- Ve RR-genotipi içeren genis bir kümede test edilmistir. Marker paterni, hatta bunun yaninda hedef gendeki karsilastirici sekanslama, insersiyonun neredeyse daima duyarlilikla baglantili oldugunu teyit etmistir. Bununla birlikte retrotranspozon insersiyonunu içermeyen ve buna ragmen duyarli olan az sayida ss-genotipi de bulunmustur. Ancak bu ss-genotipleri, Sekil 1, 2 ve/veya 3"e uygun diyagnostik polimorfizmleri tanimlayan inarkerler yoluyla RR-genotiplerinden açik seçik ayirt edilebilmistir. Analiz edilen popülasyon içinde hedef bölgede bir yanda NBS-LRR- geni ile diger yanda bir aiikirin tekrar proteini için kodlama yapabilecek, yukari akista konumlanmis ve anotasyonu yapilmis komsu putatif gen arasinda bir rekombinasyon gösteren rekombinatlar teshis edilmis ve tanimlanmistir. Iki bitki söz konusu oldugunda, bir yanda NBS-LRR-geni ile diger yanda bir DUF565 proteini (islevi bilinmeyen protein) için kodlama yapabilecek, yukari akista konumlanmis ve anotasyonu. yapilmis komsu putatif gen arasinda rekombinasyonlar bulunabilir. Tüm bu rekombinant bitkilerin altsoyunda yapilan direnç analizi yoluyla (NBS-LRR-geninin yukari akisinda ve asagi akisinda tek-gen-uzaklastirma), genin ankiriii tekrar geni ve DUF565 geni arasindaki genin, yaiii burada karakterize edilen NBS-LRR-geninin RR-genotiplerinde dirençten sorumlu oldugu çok açik bir sekilde iSpat edilebilmistir. Sekil 4ite, gelistirilmis markerlerle birlikte RZ-3-hedef bölgesinin fiziki haritasi gösterilmistir. Sekiz siki rekombinant hattin genotip verileri ve bunlarin altsoylarinin istatistiksel analizi Sekil 5"te sunulmustur. Mevcut bulus, bir baska özelligi itibariyle, ilgili proteinin eksprese edildigi Beta cinsi bir bitkide BNYVV patojenine karsi bir direnç kazandirma kabiliyetine sahip bir proteini kodlayan bir nükleik asit molekülünü tanimlamaya yöiielik bir yöntemle ilgilidir. Yöntem, nükleik asit molekülünün kodlayici nükleotid sekansinda bir insersiyonun bulunmadiginin tespitini içerir. Tercihen, yöntem, nükleik asit molekülünün kodlayici nükleotid sekansinda bir insersiyonun, özellikle de bir retrotranspozonun bulunmadiginin tespitini içerir. Retrotranspozon örnegin asagi yukari 500 bp, asagi yukari 1000 bp, asagi yukari 2000 bp, asagi yukari 4000 bp, asagi yukari 8000 bp veya asagi yukari 8000 bp'nin üzerinde bir uzunluga sahip olabilir. Yöntemin özel bir yapisinda, nükleik asit molekülü yukarida tarif edilen bulusa uygun nükleik asit molekülüdür ve direnç- kazandiran RZ-3-genini veya RZ-37ün bir islevsel homologunu kodlar. Tercihen Beta cinsi bitki, Beta vulgaris subSp. inaritima veya Beta vulgaris subsp. vulgaris var. A1tissima"d1r (seker pancari). Alanin uzmani, insersiyonun yoklugunu ispat etmek için hangi yöntemlerin uygun oldugunu bilir. Örnegin, alanin uzmani, burada açiklanan bulusa uygun nükleik asit molekülleri hakkindaki bilgisiyle, NBS- LRR-geninin yukarida tarif edilen bölgesinde bir insersiyonun varligini veya yoklugunu kanitlayan moleküler markerler gelistirebilir (örnek prosedür için ömeklere bakiniz). Mevcut bulus, bu gibi markerleri ve ayrica dirençli, özellikle BNYVV-dirençli bitkilerin, özellikle Beta vulgaris subSp. maritima veya Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissiina (seker pancari) bitkilerinin seçimi için, insersiyonun varligini veya yoklugunu kanitlamaya yönelik olarak bu markerlerin kullanilmasini da kapsar. Tercihen bu gibi markerler retrotranspozonun insersiyon konumlarindaki lokuslari tanimlarlar. Insersiyon konumlari, genomik DNA ve retrotranspozon arasinda insersiyonun 5'- ve/veya 3'-kenarinda bulunan geçis noktalari anlamina gelir. Geçis noktalari genis olarak tanimlanmalidir ve marker lokuslari DNA üzerindeki bir insersiyon konumunun yukari akisinda veya asagi akisinda 1000 nükleotidden az, tercihen 800 veya 600 nükleotidden az, özellikle tercihen 400, 200, 150, 100, 50, 40, 30, veya 10 nükleotidden az uzaklikta bulunabilir. Yöntem, nükleik asit molekülünün kodlayici nükleotid sekansinda bir insersiyonun varligini veya yoklugunu kanitlaina adimiiia alternatif veya ek olarak, polimorfizmleri, 'Özellikle de diyagnostik polimorfizmleri taniyan moleküler markerleri kullanarak bulusa uygun nükleik asit molekülünün kodlayici nükleotid sekansiiida Sekil 1, 2 ve/Veya 3,e uygun en az bir polimorfizmin, tercihen Sekil 1, 2 ve/veya 3›e uygun en az iki veya üç polimorfizmin, 'Özellikle tercihen Sekil 1, 2 ve/veya 3"e uygun en az dört, bes veya daha fazla polimorfizmin teSpit edilmesini içerebilir. Tercihen bu kanitlama, polimorfizm basina, 'Özellikle de diyagnostik polimorfizm basina en az bir moleküler marker kullanilarak yapilir. Alanin uzmani, uygun bir polimorfizmi kanitlamak için hangi marker tekniklerinin kullanilmasi gerektigini ve bunun için markerlerin nasil tasarlanacagini bilir (literatür). Mevcut bulus, ayrica, Sekil 1, 2 ve/veya 3°e uygun bir polimorfizmi tarif eden veya tespit eden moleküler markerleri kapsadigi gibi, Sekil 1, 2 ve/veya 3"e uygun bir polimorfizmi tespit etmek içiii bir moleküler markerin kullanimini da kapsar. Bunlara ek olarak, yukaridaki tanimlama yöntemleri, ayni zamanda BNYVV"ye karsi bir direnç gösteren bir bitkinin seleksiyonuna yönelik yöntemlerdir. Seleksiyon yöntemi, son adiin olarak dirençli bir bitkinin seçilmesini içerir. Bunlara ilaveten, incelenen RR genotiplerinde, her biri RZ-3 genine sikica baglanmis halde olinak üzere RZ-3"ün yukari akisinda (SEK. KIM. NO: 1) ona bitisik olarak SEK. KIM. NO: 4"e uygun genomik DNA sekansi parçasinin ve RZ-3"ün asagi akisinda (SEK. KIM. NO: 1) ona bitisik olarak SEK. KIM. NO: 5°e uygun genomik DNA sekans parçasinin bulundugu, dolayisiyla bunlarin RZ-3 için diyagnostik markerler gelistirmek aiiiacina mükemmel elverisli olduklari gösterilebilmistir. Dolayisiyla mevcut bulus, BNYVV°ye karsi bir direnç gösteren bir bitkinin seleksiyonuna yönelik bir yöntemle ilgilidir. Seleksiyon yöntemi, bir moleküler markeriii SEK. KIM. NO: 4"e uygun bir DNA sekansi 'uzerinde ve/veya SEK. KIM. NO: 5,e uygun bir DNA sekansi üzerinde kullanilmasini ve son adiin olarak bir dirençli bitkinin seçilmesini içerir. Alanin uzmani, açiklanan sekans bilgileri temeliiide inarkerleri nasil gelistirecegini ve nasil kullanacagini bilir. Mevcut bulus yoluyla ayrica Beta cinsi yeni dirençli bitki hatlarinin yetistirilinesi ve gelistirilmesi içiii asagidaki avantajlar elde edilebilir: Açiklanan genin dirençli RR alelleri ve duyarli ss alellerini birbirinden ayirt etmeye olanak veren sekans bilgileri ve bunun yaninda tanimlanmis polimorfizmler dogrudan gen içinde marker gelistirmeyi mümkün kilar ve bu durum özellikle "baglanti sürüklemesi" içerineyeii optimal elit hatlarin gelistirilinesi açisindan bitki yetistiricisi için büyük kolaylik saglar. Buna ek olarak, edinilen sekans yapisi bilgisi, 'Özellikle rizomanyaya karsi, 'Örnegin kismen hoinolog olan baska direnç genlerinin tanimlanmasi içiii kullanilabilir. Dirençli gen alellerinin burada açiklanan sekilde cis- veya trans- genetik yaklasimlarda kullanirim, doz etkisi teinelinde daha yüksek bir direnç gösteren veya açiklanan genin baska direnç geiileriyle istiflenmesi yoluyla bir direnç kesintisinden kaçiiiilabileii ve direnç ekspresyonu optiinize edilebilen yeni dirençli Beta cinsi türlerini gelistirme imkânini dogurur. Buna ilaveten, yeni dirençli alelleri gelistirmek için genin Tilling veya selektif gen mühendisligi yoluyla modifikasyonlari düsünülebilir. Mevcut bulus, bunlara ek olarak, bir genetik veya moleküler istifteki tanimlanmis dirençli RZ3-gen alellerinin agronomik olarak avantajli özellikler kazandiran baska elemanlarla birlikte bir bitkide kullanilmasiyla ilgilidir. Böylelikle, örnegin mahsul performansini artirinak veya bir bitki için önceleri diger etinenlerin yaninda agir patojen baskisi gibi biyotik faktörler veya kuruluk gibi abiyotik faktörler nedeniyle bu bitkiyi yetistirmek için elverisli olmayan yeiii yetistirme alanlarini kullanima açmak suretiyle kültür bitkilerinin ekonomik degeri belirgin ölçüde artirilabilir. Agronomik olarak avantajli bir özellik, örnegin glifosat, glufosinat veya ALS- inhibitörleri gibi bir herbisite karsi tolerans olabilir. Alanin uzmani teknigin son durumundan çok sayida baska herbisiti ve bunlarin kullanilabilirligini bilir. Bahsedilen uzman kisi, bitkilerde uygun bir toleransi uygulamak üzere hangi genetik elemanlarin ne tarzda ve sekilde kullanilmasi gerektigine dair bilgi edinmek için teknigin son durumuna basvurabilir. Agronomik olarak avantajli bir özellige baska bir örnek ilave bir patojen direnci olup, buradaki patojenler örnegin hasarat, Virüsler, nematodlar, bakteriler veya mantarlar olabilir. Örnegin, genetik elemanlarin birbirini tamamlayici etkiler göstermesinden dolayi, farkli patojen dirençleri/toleranslari kombine edilmek suretiyle bir bitki için genis bir patojen savunmasi temin edilebilir. Bu amaçla, alanin uzmani, genetik eleman olarak örnegin çok sayida direnç genini bilir. Agronomik olarak avantajli bir özellik için bir diger örnek soguk veya don toleransidir. Bu özelligi tasiyan bitkiler yil içinde daha erken hasat edilebilir veya örnegin don dönemlerini de kapsayan daha uzun süreler boyunca tarlada kalabilir ve bu da örnegin rekolte artisini beraberinde getirebilir. Keza burada da alanin uzmani uygun genetik elemanlari bulmak için teknigin son durumuna basvurabilir. Agronoiiiik olarak avantajli diger özellikler arasinda su kullanim verimi, azot kullanim verimi ve hasat sayilabilir. Bu gibi özellikleri kazandirmak için kullanilabilecek genetik elemanlar teknigin son durumunda bulunabilir. Alanin uzmani ayrica patojen savunmasi için çok sayida modifikasyonu da bilir. Siklikla tarif edilen R-geni ailelerinin yani sira, Avr/R-yaklasimi, Avr-Gen-Tamamlamasi (WO 2013/127379), bir R-geninin otoaktivasyonu (WO 2006/ 128444), HIGS (host induced gene silencing)-yaklasimi (örn. W02013/050024) veya VIGS (Virus induced gene silencing)-yaklas1mi avantajli bir sekilde kullanilabilir. Mevcut bulus açisindan özellikle bir R-geninin otoaktivasyonu önem arz edebilir. Bunun için, bitkilerde patojenlere karsi bir direnç olusturmak için bir otoaktive direnç proteiniiii kodlayan bir nükleik asit hazirlanmalidir. Neticede bu nükleik asit, NBS-LRR-direnç geninin sadece RZ3-geni gibi sinirli bir bölümünü içermekte olup, bu bölüm NBS-LRR-direnç geninin kodlayici bölgesinin 5'-ucundan asagi akis yönünde NBS-LRR-direnç geninin NBS-domainin baslangicina kadar uzanir ki, burada NBS-LRR-direnç geni bir TIR- NBS-LRR-direnç geni degildir. Bulus, ayrica, yukarida tarif edilen bir yöntemle tanimlanmis dirençli RZ3-gen alelinin yukaridaki modifikasyonlardan biriyle veya bir bitkiye agronomik olarak avantajli bir veya birden çok özellik kazandirabilen yukarida tarif edilmis bir genetik elemanla kombinasyon için kullanimini da içerir. Mevcut bulusun yapilari veya varyantlari ekli sekillere ve sekanslara yapilan atiflar üzerinden örnek mahiyetinde tarif edilmektedir: Sekanslar: SEK. KIM. NO: 1: RZ-3 direnç geninin genomik DNA sekansi. Sekaiis nükleotid l"den l403°e kadar promotör'ûn regülatör bölgesini içerir SEK. KIM. NO: 2: RZ-3_l direnç proteiiiinin tahinini protein sekansi SEK. KIM. NO: 3 = RZ-3_2 direnç proteininin tahmini protein sekansi SEK. KIM. NO: 4 = RZ-3"ün (SEK. KIM. NO: 1) yukari akisinda ona bitisen kromozomal bölge SEK. KIM. NO: 5 : RZ-3°ün (SEK. KIM. NO: 1) asagi akisinda ona bitisen kromozomal bölge SEK. KIM. NO: 6 = ss-genotiplerinde RZ-3-geninin genomik sekansinin konsens'ûs sekansi SEK. KIM. NO: 7 : pZFN-C48-RNAi vektöründe RNAi-yapisinin RZ3-geninin hedef sekansi. Sekiller: Sekil 1 A-I: ss-genotiplerinde RZ-3-geninin geiiomik sekansinin konsensüs sekansi (SEK. KIM. NO: 6) ve RR-genotiplerinin RZ-3 geni (SEK. KIM. NO: 1) arasinda nükleotid sekansi karsilastirmasi. Diyagnostik polimorfizmler gri arkaplanda koyu renkli vurgulanmistir. Diyagnostik olinayan polimorfizmlerin alti çizilmistir. Gendeki potansiyel transkripsiyon baslangiç noktalari oklarla belirtilmistir. Bunlar RZ-3_l ve RZ-3_2 olinak üzere iki polipeptid- varyantina yol açarlar. Retrotranspozonun konumu üstteki bir siyah üçgenle belirtilmistir. Sekil 2 A-L: RR-genotiplerinden tahmin edilen polipeptidin (RZ-3_l; SEK. KIM. NO: 2) ve 22 farkli ss-genotipinden polipeptidlerin aminoasit sekansi karsilastirmasi. Diyagnostik polimorfizmler gri arkaplanda koyu renkli vurgulanmistir. Diyagnostik olmayan polimorfizmlerin alti çizilmistir. Sekil 3 A-L: RR-genotiplerinden tahinin edilen polipeptidin (RZ-3_2; SEK. KIM. NO: 3) ve 22 farkli ss-genotipinden polipeptidlerin aminoasit sekansi karsilastirmasi. Diyagnostik polimorfizmler gri arkaplanda koyu renkli vurgulanmistir. Diyagnostik olinayan polimorfizmlerin alti çizilmistir. Sekil 4: RZ-3-hedef bölgesinin fiziki haritasi. Duyarli referans genotipin gösterilen hedef bölgesinde bes genin anotasyonu yapilmistir ("2" (DUF565), "3" (varsayimsal protein), "4" (NBS-LRR aday geni), "5" (retrotranspozon) ve "6" (ankirin-tekrari)). NBS-LRR aday geni ("4") duyarli referans sekans içinde bir retrotranspozon insersiyonu ("5") içerir. Bu retrotranspozon dirençli gende tamainen eksik olup, neticede dirençli genotipte sadece dört genin anotasyonu yapilabilmistir ("2", "3", "4" ve "6"). En siki rekoinbinasyonlarin konumlari (Rekombinantlar: lllT_3515/ ZR11007_03075 "7" rakamiyla ve lllPB3645/ZR08093_05621 "8" rakainiyla) 'üst tarafta gösterilmistir. Bunlarin yardimiyla daha kisa hedef bölge "l" sinirlandirilabilmistir. Bu amaç için rekoinbinantlarin analizinden gelistirilen markerler seklin alt kisminda siyah tirelerle gösterilmistir. RNAi-yaklasiminda genin validasyonuna yönelik olarak, dirençli RZ- 3-gen alelinde gen susturina için "10" domain bölgesinden hedef gen olarak bir kismi gen segmenti ("9") seçilmistir. Sekil 5: RZ-3 hedef bölgesindeki en siki rekombinantlarin marker analizi (koyu-çerçeveli bölgedeki küçük harfler in silico üretilen marker verileridir). Toplami 1051 altsoyla sekiz rekombinant hattin fenotipi ve genotipi çikarilmistir. Altsoylar NBS-LRR aday genindeki veya NBS-LRR aday geninin homozigot RR veya ss olmasi durumunda koinsu Splaysing bölgesindeki marker verileri temelinde üç grubu ayrilinistir (RR-dirençli homozigot, Rs-heterozigot, ss- duyarli homozigot). Bunlarin yani sira, ilgili ELlSA degerleri gösterilmistir. Altsoylarda splaysing veya non-splaysing için T-testi ve Wilcoxon istatistigi kullanilarak anlamlilik incelemesi yapilmistir. Sonuçlar temelinde aday gen apaçik bir sekilde s3e5800501 ve s3e5 87380 1 markerleri arasinda sinirlanabilmistir. Sekil 6: Transformasyon vektörü pZFN-C48-RNAI: d358-promotörü; C48 s: C48 sekans sens oryantasyonu; AtAAP6 intron2: Arabidopsis thaliana aminoasit permeaz 6 intronu; C48 as: C48 sekans antisens oryantasyonu; Nos-T: nos terminatörü; LB bitisme noktasi: Sol sinir bitisme noktasi; ZFN noktasi: Zinc-finger nükleaz tanima noktasi (tamamlayici); Pnos: Nos promotöiü; NPT: kodlama sekansi; neomisin fosfotransferaz (npt) geni; pAG7: pAG7 terminatörü; BVpal3'UTR: Beta vulgaris Pal geninin translate-edilmemis 3' bölgesi; LB: Sol sinir; aadA: kodlama sekansi; aminoglikozid-3"- adenililtransferazlari (AAD); pVSl-REP: pVSl replikasyon kökeni; ColEl ori: ColEl replikasyon kökeni; RB: sag sinir. Örnekler RZ-3-geninin haritalanmasi ve detayli-haritalanmasi/Genetik-Fiziki Haritalar. RZ-3-direnci (C48-direnci veya C48 olarak da adlandirilir) birden çok adimda haritalama ve detayli-haritalama yoluyla kroinozom 3 üzerinde 57,1 ve 57,8 cM arasinda (iç referans harita), yani genetik haritada iki komsu inarker arasindaki 0,0714 cM"lik bir genetik mesafe üzerinde haritalanmistir. Haritalama için 8504 (duyarli genotip) X T74 (dirençli genotip) çaprazlamasindan elde edilen toplam 8004 adet bitki incelenmistir. C48 QTL haritalamasina paralel olarak, her haritalama adimindan sonra yeni bilgilendirici inarkerler gelistirilmis ve C48 hedef bölgesini sinirlandirmak için kullanilmistir. Detayli-haritalama koordinatlari ayrica bilgilendirici rekombinantlarin altsoylarinin analiziyle de teyit edilmistir. Bunun için bilgilendirici rekombinant BCZSl veya BCZSZ bitkileri ayri ayri 90-180 altsoyda yogun olarak analiz edilmistir. Bu altsoylar tek tek bitkiler halinde genotiplenmis ve paralel olarak fenotiplenmistir. Istatistiksel yöntemler yoluyla (t-Test, güç analizi) bilgilendirici rekombinantlarin fenotipleri (homozigot dirençli-RR/heterozigot-Rs/homozigot duyarli- ss) tespit edilmis ve böylece bilgilendirici rekombinantlarin genotipi hakkinda çikarimlara varilmistir. Sayet altsoylarin hoinozigot siniflari (RR VS. ss) direnç olarak birbirinden farkli ise, gen, ebeveyn bitkinin heterozigot bölgesinde (Rs); aksi halde ebeveyn bitkinin homozigot bölgesinde (RR veya ss) bulunuyor demektir. Markerler ve onlarin genetik konumlari kromozom sekanslarinin üzerine yansitilmak suretiyle rizomanya-duyarli bir genotip için bir fiziki harita olusturulmustur. C48 QTL-bölgesinin sinirlandirilinasiyla birlikte, referans sekans ve dirençli genotiplerde ilave karsilastirici sekanslamalar (Yeni Nesil Sekanslama ve Sanger Sekanslamasi) temelinde yeni bilgilendirici markerler gelistirilmistir. Detayli-haritalama yoluyla tanimlanan bölge, duyarli referans sekansta 37996 baz çifti (komsu SNP-markerlerinin konumlari) ölçüsünde bir sekans uzunlugu içerir. Hedef bölgede genetik ve fiziki haritalar arasindaki dogrudaslik tamdir (hedef bölgede 12 marker dizisi). Dirençli BAC klonlarinin tanimlanmasi ve sekanslanmasi Seçilmis bir RZ-3 (C48) dirençli genotip için bir BAC kütüphanesi gelistirilmistir. Bu BAC bankasi kullanilan markerlerle C48 QTL bölgesinde taranmistir. Yukarida tanimlanan hedef bölge için birçok BAC klonu bulunmustur. Bunlardan, hedef bölgeyi tamamen kapsayan farkli uzunlukta üç BAC-klonu sekanslama için seçilmistir. BAC klonlari sekanslanmis ve elde edilen sekans Okumalari temelinde bir "de novo" birlestirme yapilmistir. Ortaya çikan dirençli sekans kontigleri arasinda en büyük sekans 110909 bp uzunluktadir (34537 okuma) ve hedef bölgeyi tamamen içermektedir. Duyarli ve dirençli sekanslarin karsilastirmasi - Sekans degerlendirmesi ss- ve RR-sekanslarinm dogrudasligi farkli yazilim-araçlari kullanilarak karsilastirilmistir. Hem dirençli hem de duyarli sekanslar için Maker ve Pedant yazilimlariyla bir gen anotasyonu yapilmistir. Her iki sekans üzerindeki gen anotasyonu ayni putatif gen sirasini göstermistir. Ancak, sasirtici bir sekilde, bu genlerden birinde, açikçasi mevcut bulusun geninde (RZ-3) bariz bir fark tespit edilmistir. Tanimlanan bu NBS-LRR genindeki duyarli genotipte bir retrotranspozonun anotasyonu yapilmistir. Gende retrotranspozonun insersiyonu LRR-domaini ve IR-domaini arasinda gerçeklesmistir. Dirençli genotipte bu insersiyon mevcut degildir ve SEK. KIM. NO: 1°de bu nokta gösterilmistir. Ardindan ilave olarak tahmin edilen polipeptid sekanslari karsilastirilmis ve degerlendirilmistir (Sekil 2 ve 3"te kismen gösterilmistir). NB-ARC-LRR-aday geninde karsilastirmali sekanslama NB-ARC-LRR-aday geni iki adimda karsilastirmali olarak sekanslanmistir. Retrotranspozon insersiyon noktalari toplam 92 dirençli ve duyarli genotip içeren bir genotip kümesinde dogrulanmistir. Bu analiz, dirençli genotiplerinin hiçbirinin retrotranspozon insersiyonu içerinedigini göstermistir. Duyarli genotiplerin % 90"1ndan fazlasinda insersiyon teSpit edilmistir. Dolayisiyla insersiyon teshisi duyarli genotiple baglantili gibi görünmektedir. Ancak karsilasilan çelisik bulgulardan dolayi (geri kalan % 10 insersiyonsuz genotip) sekanslama islemi ikinci adimda insersiyon noktasi önündeki tüm gen için promotör bölgesiyle (SEK. KIM. NO: 1) genisletilmistir. Toplamda, çeliskili genotiplerde de dahil 31 adet seçilmis dirençli ve duyarli genotip sekanslanmis ve karsilastirilmistir. Sonuç olarak, yedi farkli direnç kaynagina atfedilebilecek tüm dirençli geiiotipler karsilastirilan yaklasik 4100 baz çifti için % 100 özdestir. Bunun yaninda, nükleotid sekansinda birçogu protein sekansinda aininoasit sübstit'usyonlarina yol açan tamamen diyagnostik polimorfizmler bulunmustur (bakiniz Sekil 1, 2 ve 3). Bu sübstitüsyonlarin özellikle domain bölgelerinde gerçeklesen bazilari tanimlanan direnç proteininin ss-genotiplerinde islev kaybina ugramasina neden olabilir. Ayrica, yine promotör bölgesinde dirençle tamamen baglantili (baglanti dengesizligi : l) INDELiler bulunmustur (Sekil 1). Keza bu INDELiler de islev kaybinin muhtemel adaylari olarak görülebilir. Siki rekombinantlar yoluyla genin dogrulanmasi Analiz elden 8004 bitkilik popülasyonda hedef bölge içinde 16 rekombinat tanimlanmistir (37996 baz çiftli detayli-haritalanmis bölge). Bu 16 genotipten 9 bitki, NB-ARC-LRR-proteini ve sag tarafta bulunan komsu ankirin-tekrar-proteini arasinda rekombinasyon içermektedir. Iki bitkide rekombinasyonlar NB-ARC-LRR-proteini ve soldan komsu DUF565 (islevi bilinmeyen protein) proteini arasindadir. Tüm bu rekombinant bitkilerin altsoylarinin analizi yoluyla (solda ve sagda bir gen uzaklastirma), genin DUF565 ve ankirin tekrar proteini arasinda bulundugu, yani dirençten sadece NB- ARC geninin sorumlu oldugu çok açik bir sekilde kanitlanmistir. Transpozon insersiyonu yoklugunun 'örnek olarak tespiti Retrotranspozon insersiyonunun tespiti için 3 'Özel dominant primer kombinasyon gelistirilmistir. Birinci ve ikinci primer kombinasyonlar insersiyonu tespit etme kabiliyetine sahiptir, zira iki primer çiftinden her durumda bir primer retrotranspozon içinde oturur (retrotranspozonun sol veya sag yani) ve ikinci primer dogrudan retrotranspozonun önüne veya ardina baglanir. Bir üçüncü primer çifti, primerin retrotranspozonun önünde veya ardinda bir baglanma noktasi bulmasiyla retrotranspozonun eksikligini tespit eder. Standart sartlar altinda bir PCR-ürünü ancak ve sadece retrotranspozonun eksikligi halinde meydana gelebilir, zira aksi taktirde PCR ürünü retrotranspozonla birlikte çok büyük olacaktir ve bu sekilde hiç amplikon meydana gelmeyecektir. RN Ai-yaklasimiyla genin dogrulanmasi Genin yukarida tarif edilen sekilde siki rekoinbinantlar yoluyla dogrulanmasinin yaninda, genin direnç etkisini RNA-enterferansi yoluyla tespit etme yoluna da gidilmistir. Bu amaçla bir dirençli standart seker paiicari genotipi, çift-Zincirli bir hairpin-RNAayi kodlayan bir DNA yapisiyla transforme edilmistir. Bu dsRNA, dirençli RZ-3-gen alelinin etkisini zayiflatacak veya ortadan kaldiracak, böylece önceden dirençli olan seker pancari genotipinin rizomanyaya karsi duyarli hale gelmesini saglayacak olan bir postraiiskripsiyonel gen susturina kabiliyetine sahiptir. Uygun bir DNA-yapisi hazirlamak amaciyla, dirençli RZ3-geni alelinin 434 baz çifti uzunlugunda tanimlanmis bir hedef sekans bölgesi (SEK. KIM. NO: 7; Sekil 4) seçilmis, PCR ile ainplifiye edilmis ve hairpin-yapilarini sentezlemeye uygun olan pZFN vektör'une hem sens yönünde hem de antisens yönünde klonlanmistir (Sekil 6). Bu vektör bir çift CaMV 3SS-pr0motörüne, bir çoklu klonlama noktasina, Arabidopsis thaliana bitkisinde bir aminoasit permeaz için kodlayaii AtAAP6 geninden bir introna, baska bir çoklu klonlama noktasina, ayrica bir nos-terminatör'une sahiptir. Seker pancarinin hazirlanan vektörle transformasyonu, Lindsey & Gallois (1990) protokolüne göre seleksiyon markeri olarak Kanainisin antibiyotigi kullanilarak gerçeklestirilmistir. Birden çok seleksiyon adimindan sonra, transgenik sürgünlerdeki transformasyonun basarisi PCR vasitasiyla nptll-geninin, AAP6-intronunun ve her iki t-DNA- sinir sekansinin (LB/RB) varliginin ve vir yoklugunun tespit edilmesi suretiyle kontrol edilmistir. Pozitif sürgünlerin her biri in- vitro ortainda klonal olarak 30 sürgün verecek sekilde çogaltilmis, köklendirilrriis ve sera içinde topraga aktarilmistir. Yaklasik 2 hafta sonra transgenik bitkiler rizomanya-kontaminasyonlu topraga dikilmis ve burada 8 ilâ 10 hafta yetistirilmistir. Kontrol olarak ayni sartlar altinda ayni dirençli genetik standart transformasyon arkaplanina sahip transforme edilmemis bitkiler kullanilmistir. Rizomanya yayilmasini teshis etmek için seker pancari bitkilerinin kökleri hasat edilmis ve ELISA-testi yoluyla BNYVV saldirisi kantifiye edilmis olup, burada düsük bir ELISA degeri direnci gösterirken, yüksek bir deger duyarliliga isaret eder (Mechelke 1997, Clark & Adams 1977). Transforme edilmis seker pancarlarinin ortalama ELISA degeri 3,55 olup, ayni sekilde dirençli olan kontrollerin ortalama 1,27 olan ELISA degeriiiden anlamli ölçüde yüksek ve duyarli standart D108_ss,in degeriyle benzerdir (Tablo 1). Buna göre, ELISA testinin degerleri, transformasyon arkaplaninda dirençli olan RZ-3-alelinde spesifik gen susturmasi yoluyla önceden dirençli olan bir genin BNYVV°ye karsi duyarli hale geldigini göstermistir. Sonuç olarak, mevcut bulusun geni apaçik bir sekilde RZ3 direnç geni olarak dogrulanabilmistir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (14)

ISTEMLER

1. Ilgili polipeptidin eksprese edildigi bir bitkide bir patojene karsi bir direnç kazandirma kabiliyetine sahip bir polipeptidi kodlayan bir nükleik asit molekülü olup, karakterize edici 'Özelligi, nükleik asit molekülünün asagidakiler arasindan seçilen bir nükleotid sekansini içerinesidir: a) SEK. KIM. NO: 2 veya SEK. KIM. NO: 3”e uygun bir aminoasit sekansina sahip bir polipeptidi kodlayan bir nükleotid sekansi, b) SEK. KIM. NO: l°e uygun DNA-sekansinin kodlayici sekansini içeren bir nükleotid sekansi, c) a) veya b)”ye uygun nükleotid sekansi tarafindan kodlanan bir aminoasit sekansinin bir aminoasitinin sübstit'usyonu, delesyonu ve/veya adisyonu yoluyla, a) veya b),ye uygun nükleotid sekansi tarafindan kodlaiiaii bir polipeptidden türetilen bir polipeptidi kodlayan bir nükleotid sekansi, (1) a) veya b)”ye uygun nükleotid sekansi tarafindan kodlanan bir aminoasit sekansiyla en az % 80 özdes olan bir aminoasit sekansina sahip bir polipeptidi kodlayan bir nükleotid sekansi veya e) en azindan SEK. KIM. NO: 2°nin 168-227 aminoasit konumlarini ve en azindan SEK. KIM. NO: 21nin 591-613 aminoasit konumlarini ve en azindan SEK. KIM. NO: 2°nin 1013-1072 aminoasit konumlarini veya en azindan SEK. KIM. NO: 3,`un 182-241 aminoasit konumlarini, en azindan SEK. KIM. NO: 3°ün 605-627 aminoasit konumlarini ve en azindan SEK. KIM. NO: 3'ün 1027-1086 aminoasit konumlarini kodlayan bir nükleotid sekansi.

2. Istem 1,e uygun nükleik asit molekülünü içeren bir vektördür.

3. Istem l”e uygun nükleik asit molekülünü veya Istein 2°ye uygun vektörü içeren bir prokaryot hücre veya maya hücresidir.

4. Ilgili polipeptidin eksprese edildigi bir bitkide bir patojene karsi bir direnç kazandirma kabiliyetine sahip olan ve Istein l,e uygun nükleik asit molekülü tarafindan kodlanan bir polipeptiddir.

5. Transgen olarak Istem 1°e uygun nükleik asit molekülünü veya Istem Ziye uygun vektörü içeren bir transgenik bitki hücresidir.

6. Istem 5°e uygun bir bitki hücresini içeren bir transgenik bitki veya onun bir kismidir.

7. Istein 6°ya uygun bitkinin tohumu olup, buradaki tohum transgen olarak Istein 1°e uygun nükleik asit molekülünü içerir.

8. Bir transgenik bitki hücresini üretmek için yöntem olup, karakterize edici 'Özelligi, bu yöntemin, Istein l”e uygun nükleik asit molekülünün veya Istem 2°ye uygun vektörün, bitki hücresine entegre edilmesi adimini içermesidir.

9. Bir transgenik bitkiyi üretmek için yöntem olup, karakterize edici özelligi, bu yöntemin asagidaki adimlari içermesidir: a) Istem l”e uygun nükleik asit molekülünün veya Istem 2”ye uygun vektörün bir bitki hücresine entegre edilmesi ve b) a) adiminda elde edilen transgenik bitki hücresinden transgenik bitkinin yeniden üretilmesi.

10. Ilgili proteinin eksprese edildigi Beta cinsi bir bitkide BNYVV patojeniiie karsi bir direnç kazandirina kabiliyetine sahip bir proteini kodlayan bir nükleik asit molekülünü taniinlainaya yönelik bir yöntem olup, karakterize edici özelligi, bu yöntemin asagidaki adimlari içermesidir: i. Istem Ve uygun nükleik asit molekülünün kodlayici nükleotid sekansinda bir insersiyonun bulunmadiginin tespit edilmesi veya ii. Istem l°e uygun nükleik asit molekülünün kodlayici nükleotid sekansinda Sekil 1, 2 ve/veya 3”e uygun en az bir polimorfizmin, polimorfizmi taniyan moleküler markerler kullanilarak tespit edilmesi.

11. Istem l”e uygun nükleik asit molekülüne sahip bir bitki hücresini içeren bir bitki veya onun bir kismi olup, buradaki bitki veya bitki kismi Beta cinsine ve Beta vulgaris ssp. Vulgaris alt türüne mensuptur ve burada bitkinin kazanilmasi yalnizca temelde biyolojik bir yöntemle gerçeklesmemistir..

12. BNYVV-dirençli bitkilerin seleksiyonu için, Sekil 1, 2 veya 3°e uygun bir polimorfizmi tespit eden bir moleküler markerdir.

13. Istem 12”ye uygun bir moleküler inarkerin BNYVV-dirençli bitkilerin seleksiyonu için kullanimi olup, i) Sekil 1, 2 veya 3”e uygun bir polimorfizniin tespit edilmesini içerir ii) Istem l°e uygun bir nükleik asit moleküli'inün kodlayici nükleotid sekansinda bir insersiyonun varliginin veya yoklugunun tespit edilmesini içerir.

14. Istem l'e uygun bir nükleik asit molekülüne sikica baglanmis bir moleküler markerin, BNYVV°ye karsi direnç tasiyan bir bitkinin seleksiyonuna yönelik bir yöntemde SEK. KIM. NO: 4”e uygun bir DNA sekansi üzerinde veya SEK. KIM. NO: 5,e uygun bir DNA sekansi üzerinde kullanilmasidir.