RS58268B2 - Gen otpornosti protiv rizomanije - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

Ovaj se pronalazak odnosi na molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji može da prenese otpornost na patogen, specifično na “virus žutih nekrotičkih nerava repe” u nekoj biljci, specifično iz roda blitvi (Beta genus) u kom je taj polipeptid izražen. Ovaj se pronalazak takođe odnosi na polipeptid koji može da prenese otpornost na patogen u biljci, specifično otpornost na BNYVV u biljci iz roda blitvi (Beta genus), u kom je polipeptid izražen i koji se kodiran molekulom nukleinske kiseline prema ovom pronalasku. Ovaj se pronalazak takođe odnosi na transgensku biljku, biljnu ćeliju, biljni organ, tkivo biljke, deo biljke ili seme biljke koje obuhvata molekul nukleinske kiseline ili njegove delove, i takođe postupke za proizvodnju transgenske biljke ili biljne ćelije ovog tipa. Ovaj pronalazak takođe obuhvata postupke za detektovanje molekula nukleinske kiseline koji nose otpornost i postupke za odabir biljaka ili biljnih ćelija koje imaju molekul kiseline koji nosi otpornost.

Stanje tehnike

Rizomanija je najozbiljnija bolest šećerne repe širom sveta u smislu profitabilnosti može da prouzrokuje gubitke od 50 % i više zarade. Ovu bolest, koja se takođe pominje kao 'ludilo korena”, prouzrokuje “virus žutih nekrotičkih nerava repe” (BNYVV) i prenosi se protozoama koje nosi zemljište Polymyxa betae. BNYVV infekcija manifestuje povećanu proliferaciju tankih korena i sekudnarnih korena i formiranje u velikoj meri smanjenog tela korena sa smanjenim sadržajem šećera. Inficirane biljke pokazuju smanjenu apsorpciju vode i zato su mnogo oseljtljivije na suvi stres. Kada se infekcija širi na celu biljku, ovo daje kao rezultat da nervi lista požute, nekrotičke lezije, i žute fleke na lišću. Kako je borba za izlečenje suzbijanjem bolesti nemoguća, kao što je slučaj sa drugim virusnim bolestima, štetu je moguće sprečiti samo preko kultivacije otpornih vrsta. Tri glavna gena protiv rizomanije se sada ispituju posebno: RZ-1 (se takođe pominje kao “Sveti”), RZ-2 i RZ-3. Pored toga, dodatni geni otpornosti na rizomaniju su opisani u literaturi, iako su oni manje značajni. Ovde, gen otpornosti RZ-1 je već ugrađen u većinu linija za uzgoj (komponente roditeljskog semena i/ili komponente roditeljskog oprašivanja). Utvrđeno je, međutim, da otpornost koju prenosi RZ-1 nije dovoljna u teško inficiranim regionima ili u regionima koji imaju raznovrsne BNYVV patotipe (na primer Sohi & Maleki, 2004). Iz ovog razloga, već je pre nekog vremena predloženo da se kombinuje RZ-1 sa, na primer, RZ-2 ili RZ-3. RZ-2 i RZ-3 potiču iz izvora Beta vulgaris podvrsta maritime (WB42, WB41) i genetski se mapiraju u istom regionu na hromozomu 3 genoma šećerne repe, pri čemu RZ-1 slične mape na hromozomu 3, ali južno od RZ-2 i RZ-3. Scholten et al. (1999) su utvrdili rastojanje 20-25 cM između RZ glavnih gena RZ-1 i RZ-2. Gidner et al. (2005) su pronašli kraće rastojanje od 5 cM između RZ-1 i RZ-2 i nisu zaključili da se RZ-2 i RZ-3 mapiraju na istom lokusu. Schmidlin et al. (2008) je utvrdio različito indukovane gene pomoću analize ekspresije u inficiranim šećernim repama, međutim ovo nije odgovaralo RZ-2 ili RZ-3. U ovoj studiji Larson et al. (2008), neki u BNYVV indukovani proteini su detektovani u šećernoj repi korišćenjem MALDI-TOF-MS postupke, međutim proteine koji su kodirani pomoću RZ-1, RZ-2 ili RZ-3 naučnici nisu mogli da identifikuju. Pored toga, region sekvence, specifično oko ovog gena otpornosti, se ponavlja, što čini razvoj dijagnostičkih markera posebno teškim. Sve do sada, ni mape markera u visokoj rezoluciji niti verifikovani geni kandidata nisu bili dostupni javno za navedene gene otpornosti na rizomaniju. Pored toga, funkcionalna pozadina ovih gena otpornosti, t.j. genetska struktura, prethodno nije bila u potpunosti poznata.

Za održivu kultivaciju protiv rizomanije predviđene da protivreči riziku od BNYVV izolata koji prekidaju otpornost, neophodno je neprekidno identifikovati nove gene otpornosti i integrisati ih u izolate, neophodno je konstantno identifikovati nove gene za otpornost i da se integrišu ovi u zalihu gena u biljkama useva kao što je šećerne repe.

Kratak opis pronalaska

Ovaj pronalazak je razvijen na bazi gore opisanog stanja tehnike, pri čemu je cilj ovog pronalaska da se obezbedi molekul nukleinske kiseline i/ili polipeptid koji može da prenese otpornost protiv rizomanije u biljci. Još jedan cilj je da se obezbedi transgneska biljka otporna na rizomaniju i postupak za njenu proizvodnju. Još jedan cilj ovog pronalaska je da se obezbede postupci za upotrebu i razvoj molekularnih marketa koji omogućavaju efikasnu kultivaciju protiv rizomanije i razvoj novih linija biljke koje su otporne.

Izvođenja iz ovog pronalaska koja ostvaruju ciljeve se zasnivaju na genetski finom mapiranju, identifikaciji, izolaciji i karakterizaciji gena koji potiče od donatora Beta vulgaris podvrsta maritima i kodiranja za polipeptid ili protein može da prenese otpornost protiv patogena u biljku u kojoj je izražen polipeptid.

Neki od ovih pojmova se koriste u ovoj primeni će prvo biti objašnjeni detaljnije dalje u tekstu:

Pojam “približno” u vezi sa specifikacijom dužine sekvence nukleotida znači odstupanje ± 200 baznih parova, preporučljivo putem ± 100 baznih parova i specifično poželjno putem ± 50 baznih parova.

“Biljka iz roda blitvi (Beta genus)” pripada familiji velikorepnih muhar (Amaranthaceae). Ove biljke obuhvataju biljke iz vrsta Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta lomatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigyna i Beta nana. Biljke iz vrsta Beta vulgaris je specifično biljka iz podvrste Beta vulgaris podvrsta maritima (Morska blitva) ili Beta vulgaris podvrsta vulgaris. Ove obuhvataju, na primer, Beta vulgaris podvrsta vulgaris var. altissima (šećerna repa u užem smislu), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (blitva), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva (cvekla), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba (šećerna repa za stočnu hranu).

Pojam “hibridizuje” ili “hibridizacija” treba razumeti tako da znači postupak u kom molekul jednolančane nukleinske kiseline spaja na lanac nukleinske kiseline koji je komplementaran u najvećoj mogućoj meri, t.j. formira bazne parove. Standardni postupci za hibridizaciju su opisani na primer kod Sambrook et al.2001. Ovo preporučljivo treba razumeti da znači barem 60%, još preporučljivije barem 65%, 70%, 75%, 80% ili 85%, specifično preporučljivo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% baza molekula nukleinske kiseline formiraju bazno uparivanje sa lancem nukleinske kiseline koji je komplementaran u najvećoj mogućoj meri. Mogućnost takvog temperiranja zavisi od strogosti useva hibridizacije. Pojam “strogost” se odnosi na uslove hibridizacije. Visoka strogost se zatim određuje kada se ometa bazno uparivanje, i niska strogost kada se bazno uparivanje olakšava. Strogost uslova hibridizacije zavisi na primer od koncentracije soli ili jačine jona i temperature. Generalno, strogost može da se poveća povećanjem temperature i/ili snižavanjem sadržaja soli. “Strogi uslovi hibiridizacije” se razumeju da znače uslove pod kojima se odvija hibridizacija pretežno samo između homolognih molekula nukleinske kiseline. Pojam “uslovi hibridizacije” se ovde ne odnosi samo na uslove koji preovladavaju tokom stvarnog spoja nukleinskih kiselina, već takođe i na uslove koji prevladavaju tokom naknadnih koraka pranja. Strogi uslovi hibridizacije su, na primer uslovi pod kojima se pretežno hibridizuju molekuli nukleinske kiseline koji imaju identičnost sekvence barem 70%, preporučljivo samo se hibridizuju molekuli nukleinske kiseline koji imaju barem 75%, barem 80%, barem 85% ili barem 90%, a posebno preporučljivo barem 95%, barem 96%, barem 97%, barem 98% ili barem 99%. Strogi uslovi hibridizacije na primer su hibridizacija u 4 x SSC na 65 °C i naknadno višestruko pranje u 0,1 x SSC na 65 °C i ukupno od približno 1 sat. Pojam “strogi uslovi hibridizacije” koji se ovde koriste takođe znače: hibridizaciju na 68 °C u 0,25 M natrijum fosfatu, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA i 1 % BSA tokom 16 sati i naknadno pranje dvaput sa 2 x SSC i 0,1 % SDS na 68 °C. hibridizacija se poželjno odvija pod strogim uslovima.

''Izolovani molekul nukleinske kiseline'' treba razumeti da znači molekul nukleinske kiseline rastvoren iz njegovog prirodnog ili originalnog okruženja. Pojam takođe obuhvata sintetički proizveden molekul nukleinske kiseline. “Izolovani polipeptid” treba razumeti da znači polipeptid rastvoren iz njegovog prirodnog ili originalnog okruženja. Pojam takođe obuhvata sintetički proizveden polipeptid.

“Molekularni marker” je nukleinska kiselina koja je polimorfna u populaciji biljke. Takav marker je dakle sposoban da detektuje i diferencira različita alelna stanja (alele). Poznate analitičke metode korišćene u ovu svrhu su RFLP, AFLP, SNP, SSR ili KASP, na primer. Pojam “molekularni marker” se odnosi na sekvence nukleotida koje su komplementarne ili barem komplementarne u najvećoj mogućoj meri ili homologne sa genomskim sekvencama, na primer nukleinske kiseline koje se koriste kao proteini ili početnice. Markere koji opisuju polimorfizme moguće je detektovati sa upotrebom dobro uspostavljenih postupaka. Ove obuhvataju, na primer, na PCR zasnovanu specifičnu amplifikaciju sekvence, detekciju ‘dužine polimorfizama od fragmenta ograničenja’ (RFLP), detekciju polimorfizama polinukleotida pomoću ‘hibridizacije specifične za alel’ (ASH), detekciju pojačanih promenljivih sekvenci genoma biljke, detekciju samoodržive replikacije sekvence’, detekciju ‘jednostavnih ponavljnanja sekvence’ (SSR), detekcija ‘jednonukleotidnih polimorfizama’ (SNP), ili detekcija ‘dužine polimorfizama pojačanog fragmenta’ (AFLP). Pored toga, postupci za detekciju ‘oznaka sekvence sa ekspresijom’ (EST) i SSR markeri izvedeni iz EST sekvenci i ‘nasumično pojačane polimorfne DNK’ (RAPD) su takođe poznate.

“Promoter” znači netranslatiranu regulatornu sekvencu DNK, obično uzvodno od regiona kodiranja, koji obuhvata tačku vezivanja za RNK polimerazu i pokreće transkripciju DNK.

“Patogen” znači organizam koji u interakciji sa biljkom vodi do simptoma smrti na jednom ili više organa te biljke. Ovi patogeni obuhvataju, na primer, životinjske, fungicidne, bakterijske ili virusne organizme ili oomicete.

“Patogena infekcija” se koristi da znači najraniji trenutak u kom patogen reaguje sa tkivom biljke domaćina. Primera radi u slučaju virusnog patogena BNYVV, ovo se prenosi putem protozoa Polymyxa betae. Polymyxa oblici spora koji mogu da opstanu u zemjlištu i tokom više decenija. Virus takođe živi u ovim sporama. Kada ove uspavane spore klijaju da formiraju mobilne zoospore, virus može da prođe preko ovih spora u ćelije tkiva biljke domaćina i može da reaguje međusobno tamo gde je domaćin (Esser 2000).

“Organi” biljke na primer znači lišća, ose izdanka, stablo, korenje, hipokotil, vegetativne pupoljke, meristemna tkiva, embrione, prašnike, ovule ili plodove. “Delovi” biljke znače kombinaciju broja organa na primer cveta ili semena, ili deo organa, na primer poprečni presek kroz stablo. “Tkiva” biljke su, na primer, zadebljalo tkivo, skladišno tkivo, meristematsko tkivo, tkivo lista, tkivo stabla, tkivo korena, tkivo tumora biljke ili reproduktivno tkvio. “Ćelije” biljke na primer treba razumeti da znače izolovane ćelije sa zidom ćelije ili njegovim agregatima ili protoplastima.

Pojam “otpornost” treba razumeti široko i obuhvata obim zaštite od odlaganja do potpunog suzbijanja razvoja biljke. Primer patogenog značaja je virus žutih nekrotičkih nerava repe (BNYVV). Ćelija otporne biljke iz ovog pronalaska ili otporna biljka iz ovog pronalaska poželjno stiče otpornost na BNYVV. Otpornost na patogen treba da bude izjednačena sa otporonošću na bolest koju ovaj patogen prouzrokuje, na primer otpornost na BNYVV i otpornost na rizomaniju.

"Transgenska biljka” se ovde dovodi u vezu sa genomom od kog se barem jedna nukleinska kiselina integriše. Ovo može da bude heterologna nukleinska kiselina. Nukleinska kiselina je poželjno integrisana na stabilan način, što znači da se integrisana nukleinska kiselina zadržava u biljci na stabilan način, može da bude izražena, i može da se prenese na stabilan način na potomka.

Ova prijava opisuje molekul nukleinske kiseline koji obuhvata polipeptid koji može da prenese otpornost na patogen u biljci u kojoj je izražen taj polipeptid. Molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida izabranu iz

a) sekvence nukleotida koja kodira polipipeptid sa sekvencom amino kiseline prema SEK ID BR: 2 ili SEK ID BR: 3,

b) sekvence nukleotida koja obuhvata kodirajuću sekvencu DNK sekvence prema SEK ID BR: 1,

c) sekvence nukleotida koja se hibridizuje sa komplementarnom sekvencom sekvence nukleotida prema a) ili b) pod strogim uslovima,

d) sekvence nukleotida koja kodira polipeptid koji je izveden supstitucijom, brisanjem i/ili dodavanjem jedne ili više amino kiselina iz sekvence amino kiseline kodirane sekvencom nukleotida prema a) ili b) iz polipeptida kodiranog sekvencom nukleotida prema a) ili b), e) sekvence nukleotida koja kodira polipeptid koji ima sekvencu amino kiseline barem 60% identičnu sekvenci amino kiseline kodiranoj sekvencom nukleotida prema a) ili b), ili

f) sekvence nukleotida koja kodira barem jedan domen koji vezuje nukleotid (NBS ili NB-ARC) odgovara pozicijama 168-227 amino kiseline iz SEK ID BR: 2 ili odgovara pozicijama 182-241 amino kiseline iz SEK ID BR: 3, barem jedan domen bogat leucinom (LRR) koji odgovara pozicijama 591-613 amino kiseline iz SEK ID BR: 2 ili odgovara pozicijama 605-627 amino kiseline iz SEK ID BR: 3 i/ili barem jedan interni domen (IR) koji se ponavlja odgovara pozicijama 1013-1072 amino kiseline iz SEK ID BR: 2 ili odgovara pozicijama 1027-1086 amino kiseline iz SEK ID BR: 3.

Molekul nukleinske kiseline može biti izolovan molekul nukleinske kiseline. Poželjno je DNK, i posebno poželjno kDNK (koja kodira DNK). Polipeptid koji kodira molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku poželjno nosi otpornost na virusni patogen “virus žutih nekrotičkih nerava repe ” (BNYVV), koji prouzrokuje bolest biljke poznatu kao rizomanija. Pored toga, polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline prema ovom pronalasku, specifično biljke iz roda blitve (Beta genus), prenosi otpornost na patogen. Biljka je poželjno biljka iz vrste Beta vulgaris, specifično biljka podvrsta Beta vulgaris podvrsta maritime ili Beta vulgaris podvrsta vulgaris; one obuhvataju, na primer, tipove useva koji čine šećerna repa, cvekla, repa za stočnu hranu, lisnata repa, blitva.

U jednom izvođenju molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida prema a). Sekvenca amino kiseline prema SEK ID BR: 2 kodiranog polipeptida i/ili prema SEK ID BR: 3 kodiranog plipeptida obuhvata protein otpornosti od RZ-3 gena. Ovde, ovaj protein gena otpornosi od NBS-LRR tipa, koji karakteriše izvesni strukturni motiv. Opšta struktura takvih proteina otpornosti u biljkama je već dobro ispitana (Martin et al. 2003). Međutim, princip strukturnog formiranja posebno onoga što je poznato kao LRR domen, koji je potencijalni domen identifikacije za većinu nepoznatih patogenih efektora, nije moguće predvideti. Shodno tome, identifikacija BNYVV otpornosti koju nosi gen ili protein na bazi čisto poznatih strukturnih motiva nije moguća. Identifikacija gena otpornosti RZ-3 se odvija tokom postupka kloniranja na bazi mape, koji zahteva intenzivno genetsko mapiranjei fino mapiranje ciljnog regiona u kom se na samom početku sumnjalo da se nalazi gen otpornosti RZ-3. Posao razvoja će biti detaljnije opisan dole u tekstu.

Identifikovani protein otpornosti pripada NBS-LRR tipu i ima domen vezivanja nukleotida (NBS, takođe je poznat kao NB-ARC) (adapter vezivanja nukleotida koji dele APAF-1, R proteini, i CED-4)) koji odgovara pozicijama 168-227 amino kiselinaiz SEK ID BR: 2 ili koji odgovara pozicijama 182-241 amino kiseline iz SEK ID BR: 3, domen bogat leucinom (LRR) koji odgovara pozicijama 591-613 amino kiseline iz SEK ID BR: 2 ili koji odgovara pozicijama 605-627 amino kiseline iz SEK ID BR: 3 i/ili barem jedan interni domen (IR ; interni domen koji se ponavlja) koji se ponavlja a koji odgovara pozicijama 1013-1072 amino kiseline iz SEK ID BR: 2 ili odgovara pozicijama 1027-1086 amino kiseline iz SEK ID BR: 3. NBS domen je kodiran nukleotidima 2019-2882 iz SEK ID BR: 1, taj LRR domen je kodiran nukleotidima 3288-3356 iz SEK ID BR: 1, taj IR domen je kodiran nukleotidima 4554-4871 iz SEK ID BR: 1. NB-ARC domen je centralni domen koji vezuje nukleotid. To je verovatno funkcionalni domen ATPaze, koji kako se očekuje reguliše aktivnost proteina otpora. NB-ARC domen obuhvata tri poddomena: NB, ARC1 i ARC2. Karakterističkni motivi NB-ARC domena su APAF-1 (faktor 1 aktiviranja apoptotske proteaze), koji je pretpostavlja da je odgovoran za reakciju prekomerne osetljivosti, hhGRExE, Walker-A- ili P-zaliha, Walker-B, GxP, RNBS-A do D i MHD (Ooijen et al., 2008). Neke od preciziranih motiva je već moguće identifikovati. U još jednom izvođenju molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida prema b). Sekvenca nukleotida obuhvata sekvencu kodiranja DNK sekvence prema SEK ID BR: 1, koja kodira za sekvence amino kiseline prema SEK ID BR: 2 i 3.

U još jednom izvođenju molekula nukleinske kiseline taj molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida prema d). Ova sekvenca nukleotida kodira polipeptid koji čini derivat polipeptida kodiran pomoću sekvence nukleotida prema a) ili b). Derivat polipeptida čini izvedenu sekvencu amino kiseline, koja ima barem jednu supstituciju, brisanje ili dodavanje jedne ili više amino kiselina, pri čemu se zadržava funkcionalnost kodiranog polipeptida/proteina. U slučaju supstitucije amino kiseline drugom amino kiselinom koja ima ista ili ekvivalentna ili slična hemijskofizička svojstva, eferenca se daje na “konzervativnu izmenu” ili “polukonzervativnu izmenu”. Primeri fizičkohemijskih svojstava amino kiseline su, na primer, hidrofobnost ili naelektrisanje. Stručnjaku u ovoj oblasti je poznato koja supstitucija amino kiseline čini konzervativnu ili polukonzervativnu izmenu. Opšte poznate činjenice u ovoj oblasti dodatno omogućavaju stručnjaku u ovoj oblati da prepozna, identifikuje i detektuje brisanja amino kiseline i dodavanja štetna za funkcionalnost proteina otpora RZ-3 i takođe one pozicije na kojima su one moguće. Još je poznato za stručnjaka u ovoj oblasti da u uslučaju prisustva NBS-LRR proteina za modifikacije amino kiseline (supstitucije, brisanja ili dodavanja jedne ili više amino kiselina), funkcionalnost gore definisanih sačuvanih domena mora da bude zadržana specifične i samim tim samo ograničene modifikacije gore pomenutog tipa su moguće u ovim domenima. Sekvenca nukleotida iz ovih izvođenja zatim kodira za derivat ili za izvedenu sekvencu amino kiseline kada je sekvenca nukleotida homologna ili identična barem do nivoa od 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% sekvenci nukleotida prema a) ili b). Takve sekvence nukleotida, koje kodiraju derivat ili za izvedenu sekvencu amino kiseline, poželjno mogu da budu proizvedene bilo direktno ili indirektno (na primer preko koraka pojačavanja ili replikacije) formiraju početnu sekvencu nukleotida koja odgovara celom dužinom ili barem delimično SEK ID BR: 1 ili drugoj ovde opisanoj sekvenci.

U još jednom izvođenju molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida prema e). Ova sekvenca nukleotida kodira polipeptid koji ima sekvencu amino kiseline identičnu nivou od barem 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% do sekvence amino kiseline kodirane sekvencom nukleotida prema a) ili b).

U još jednom izvođenju molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku, molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida prema f). Sekvenca nukleotida ovde kodira polipeptid koji obuhvata barem jedan domen koji vezuje nukleotid (NBS) a koji odgovara pozicijama 168-227 amino kiseline od SEK ID BR: 2 ili odgovara pozicijama 182-241 amino kiseline iz SEK ID BR: 3, barem jedan domen bogat leucinom (LRR) koji odgovara pozicijama 591-613 amino kiseline iz SEK ID BR: 2 ili odgovara pozicijama 605-627 amino kiseline iz SEK ID BR: 3 i barem jedan interni domen (IR) koji se ponavlja odgovara pozicijama 1013-1072 amino kiseline iz SEK ID BR: 2 ili odgovara pozicijama 1027-1086 amino kiseline iz SEK ID BR: 3. Ovi domeni su specifično poželjno raspoređeni u tom polipeptidu u nizu od N do C terminusa prema redosledu NBS-LRR-IR, pri čemu u svakom slučaju jedna ili više amino kiselina može da bude prisutna između domena.

Ovaj se pronalazak takođe odnosi na polipeptid koji može da prenese otpornost napatogen u biljci kod koje je taj polipeptid izražen ili koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline prema ovom pronalasku, pri čemu je taj patogen poželjno BNYVV i/ili ta biljka je poželjno biljka koja pripada vrsti blitve (Beta genus), a specifično biljka iz vrste Beta vulgaris. Polipeptid posebno poželjno ima sekvencu amino kiseline prema SEK ID BR: 2 ili prema SEK ID BR: 3. Polipeptid može da bude izolovan polipeptid.

U još jedno varijantnom rešenju ovaj pronalazak se odnosi na vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku. Taj vektor može da bude plazmid, fag ili vektor ekspresije, vektor transformacije, prenosni vektor ili vektor kloniranja, može biti dvolančani ili jednolančani, linearni ili kružni, ili može da transformiše prokariotskog ili eukariotskog domaćina bilo integraciom u njegov genom ili ekstrahromozomno. Molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku je poželjno funkcionalno povezan na fektor ekspresije na jednu ili više regulatornih sekvenci koje dozvoljavaju transkripciju i opciono ekspresiju u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćina. Samo kao primer, molekul nukleinske kiseline je pod kontrolom pogodnog promotera ili terminatora. Pogodni promoteri mogu da budu promoteri koji su konstitutivno indukovani (Npr.: 35S promoter iz “Cauliflower mosaic virus (Virusa mozaika karfiola)“ (Odell et al. 1985), i promoteri koji su patogen induktibilni su posebno pogodni (Npr.: PR1 promoter iz Petersilie (Rushton et al., 1996). Posebno pogodni patogen induktibilni promoteri su sintetički ili himerni promoteri, koji nisu prisutni u prirodi, i formirani su iz izvesnog broja elemenata, i obuhvataju minimalni promoter i takođe imaju, uzvodno od minimalnog promotera, barem jedan cis-regulatorni element koji služi kao tačka vezivanja za specijalne faktore transkripcije. Himerni promoteri su projektovani u skladu sa željenim zahtevima i indukovani ili potisnuti različitim činiocima. Primere takvih promotera moguće je pronaći u WO 00/29592, WO 2007/147395 i WO 2013/091612. Pogodni terminator je na primer nos terminator (Depicker et al., 1982).

Pored gore opisanih vektora, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak koji obuhvata uvođenje opisanog vektora u ćeliju domaćina. Vektor je moguće uvesti na primer konjugacijom, mobilizacijom, biolističkom transformacijom, agrobakerijski prenetom transformacijom, transfekcijom, transdukcijom, vakumskim infiltriranjem ili elektroporacijom. Stručnjak u ovoj oblasti je upoznat sa takvim postupcima i takođe postupciama za dobijanje opisanih vektora (Sambrook et al.2001).

U još jednom varijantnom rešenju ovaj pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku ili vektor iz ovog pronalaska. Ćelija domaćin u smislu ovog pronalaska može da bude prokariotska (na primer bakterijska) ćelija. Ćelija domaćin je poželjno agrobakterija kao što je Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes ili ćelija biljke koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku ili vektor iz ovog pronalaska. Brojni postupci kao što je konjugacija ili elektroporacija su poznati stručnjaku u ovoj oblasti, pomoću kojih pomento lice može uvesti molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku ili vektor iz ovog pronalaska u agrobakteriju, i postupke kao što su raznovrsni postupci transformacije (biolistička transformacija, agrobakterijsKi posredovana transformacija) su takođe poznati takvom licu, pomoću kojih pomenuto lice može uvesti molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku ili vektor iz ovog pronalaska u ćeliju domaćina (Sambrook et al.2001).

U još jednom varijantnom rešenju ovaj pronalazak se odnosi na ćeliju transgenske biljke koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku kao transgen ili obuhvata vektor iz ovog pronalaska. Ćelija rransgenske biljke ovog tipa putem ovog primera je ćelija biljke koja je transformisana, poželjno na stabilan način, sa molekulom nukleinske kiseline prema ovom pronalasku ili sa vektorom iz ovog pronalaska. U preporučenom izvođenju ova ćelija transgenske biljke, molekul nukleinske kiseline je funkcionalno povezan na jednu ili više regulatornih sekvenci koje dozvoljavaju transkripciju i opciono ekspresiju u ćeliji biljke. Celokupan konstrukt iz molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku i regulatorne sekvence(i) zatim čini transgen. Takve regulatorne sekvence primera radi jesu promoter ili terminator. Brojni funkcionalni promoteri i terminatori koji su u upotrebi za biljke su poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Transgenska biljna ćelija iz ovog pronalaska, specifično ćelija biljke iz roda blitvi Beta genus, preporučljivo pokazuje višu otpornost na patogen, posebno BNYVV, nego odgovarajuća netransformisana ćelije biljke (ćelija biljke bez transgena). Nivo otpornosti kao primer za BNYVV moguće je definisati kvanittavino za biljke iz roda blitve (Beta genus) određivanjem ocena rangiranja (šeme ocena rangiranja za biljke iz roda blitve (Beta genu) su poznate iz prethodnog stanja tehnike, na primer za šećernu repu Mechelke (1997)). Veća otpornost predstavlja se u poboljšanju otpornosti prema barem jednoj od ocena rangiranja, za barem dve ocene rangiranja, ili za barem tri ili više ocena rangiranja.

1

Ovaj se pronalazak takođe odnosi na postupak proizvodnje ćelije transgenske biljke iz ovog pronalaska obuhvata korak uvođenja molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku ili vektora iz ovog pronalaska u ćeliji biljke. Primera radi, uvođenje se može odvijati u vidu transformacije, poželjno putem stabilne transformacije. Ove pogodne tehnike uvođenja, kao što je biolistička transformacija, agrobakterijom posredovana transformacija ili elektroporacija, su poznate stručnjaku u ovoj oblasti (Sambrook et al.2001).

U još jednom varijantnom rešenju iz ovog pronalaska koje se odnosi na transgensku biljku ili njen deo, obuhvata ćeliju transgenske biljke kako je ovde opisano. Ovde, biljka može da bude ćelija, tkivo, organ ili kombinacija nekoliko ćelija, tkiva ili organa. Kombinacija nekoliko organa je, na primer, cvet ili seme. U specifičnom izvođenju ovaj pronalazak se odnosi na seme iz transgenske biljke, pri čemu to seme obuhvata molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku kao transgen. Transgenska biljka iz ovog pronalaska, specifično biljka iz roda blitvi (Beta genus), preporučljivo pokazuje višu otpornost na patogen, posebno BNYVV, nego odgovarajuća netransformisana biljka (biljka bez transgena). Nivo otpornosti kao primer za BNVYY moguće je definisati kvantitativno za biljke iz roda blitve (Beta genus) određivanjem ocena rangiranja (šeme ocena rangiranja za biljke iz roda blitve (Beta genu) su poznate iz prethodnog stanja tehnike, na primer za šećernu repu Mechelke (1997)). Veća otpornost predstavlja se u poboljšanju otpornosti prema barem jednoj od ocena rangiranja, za barem dve ocene rangiranja, ili za barem tri ili više ocena rangiranja. Ovaj se pronalazak odnosi i na postupak za proizvodnju transgenske biljke i obuhvata korak uvođenja molekula nukleinske kiseline u ovaj pronalazak ili vektor iz ovog pronalaska u biljku ćelije i opciono korak odabira ćelije iz transgenske biljke. Pored toga, takav postupak za proizvodnju transgenske biljke karakteriše naknadni korak koji obuhvata regenerisanje transgenske biljke iz ćelije transgenske biljke proizvedene u ovom koraku. Postupci za regnerisanje su poznati iz prethodnog stanja tehnike stručnjaku u ovoj oblasti.

U još jednom varijantnm rešenju ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za prenošenje ili povećanje otpornosti na patogen, posebno BNYVV, za biljku, poželjno biljku iz roda blitve (Beta genus), obuhvata korak transformisanja ćelije biljke sa molekulom nukleinske kiseline prema ovom pronalasku ili vektora iz ovog pronalaska. Ovaj postupak poželjno vodi poboljšanju otpora za barem jednu ocenu rangiranja, posebno poželjno za poboljšanje otpora za barem dve, tri ili više ocena rangiranja. Šeme ocene rangiranja za biljke beta vrste su poznate iz prethodnog stanja tehnike, na primer za šećernu repu Mechelke (1997).

U još jednom varijantnom rešenju ovaj pronalazak se odnosi na regulatornu sekvencu promotera koja kontroliše ekspresiju gena koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku, karakteristično po tome što je regulatorna sekvenca sposobna da prenese ili modulira ekspresiju heterologne DNK sekvence kao rezultat infekcije patogenom, i regulatorna skevenca obuhvata molekul nukleinske kiselina sa sekvencom nukleotida prema SEK ID BR: 1 od nukleotida 1-1403. Heterologna DNK sekvenca je poželjno sekvenca nukleotida koja kodira za komponentu odbrane patogena biljke (Npr.: gen otpornosti (R-gen) ili gen koji kodira za enzime uključene u prenos signala, kao što su kinaze ili fosfataze i za G-protein) ili koji kodira patogeni efektor (koji su poznati kao avirulentni geni (avr)). Pored toga, ovaj pronalazak obuhvata molekul rekombinantne DNK koji obuhvata gore opisanu regulatornu sekvencu. Molekul rekombinantne DNK je poželjno funkcionalno povezan na heterolognu DNK sekvencu.

U još jednom varijantnom rešenju ovaj pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina trnasformisanu sa gore opisanom regulatornom sekvencom ili sa specificiranim molekulom rekombinantne DNK na transgensku biljku, tkivo biljke ili ćeliju biljke obuhvata regulatornu sekvencu ili molekul rekombinantne DNK kao transgen. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju ćelije transgenske biljke koji obuhvata korak uvođenja regulatorne sekvence iz ovog pronalaska ili molekula rekombinantne DNK i opciono korak odabira ćeliju transgenske biljke. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju transgenske biljke koji obuhvata korak uvođenja regulatorne sekvence iz ovog pronalaska ili molekul rekombinantne DNK u ćeliju biljke i opciono korak odabira ćelije transgenske biljke. Takav postupak za proizvodnju transgenske biljke je još karakterisan naknadnim korakom koji obuhvata regenerisanje transgenske biljke iz ćelije transgenske biljke proizvedene u prvom koraku.

Kao što je već pomenuto gore, gen otpornosti RZ-3 je identifikovan tokom postupka kloniranja na bazi mape. Postupak izveden kao primer je obuhvatao sledeće korake: genetsko fino mapiranje, fizičko mapiranje, izgradnja veoma velike populacije srastanja (splajsovanja) od više od 8000 potomaka srastanja F2, rekombinantnog skrininga, razvoja markera u ciljnom regionu, uporedno sekvencioniranje BAC u rezistentnim i senzitivnim genotipovima, bioinformatičke analize, predviđanja proteina i upoređivanje proteina. Takav predan rad na razvoju je izuzetno skup i nepoznato je da li je uspešan za identivikovanje gena. Posle integracije RZ-3 lokusa iz podvrste Beta vulgaris podvrsta maritima u biljcii iz roda blitve (Beta genus), specifično u šećernoj repi (Beta vulgaris podvrsta vulgaris var. altissima), markeri koji imaju dobru dijagnostičku vrednost su razvijeni za praćenje segmenta genoma RZ-3 za fino mapiranje, koji se pokazao kao posebno težak, jer se taj ciljni region ponavlja tokom širokih područja. Neočekivano, međutim, bilo je moguće uspešno razviti nekoliko dijagnostičkih markera koji su delimično funkcionisali samo sa izvesnom tehnikom markera, kao što su pirosekvence, t.j. kao PSQ markeri, ili koji su bili nulto alelni.

Uprkos ovim tehničkim teškoćama, bilo je moguće razgraničiti RZ-3 lokus na genomski region 0,67 cM sveobuhvatnom analizom sa upotrebom ovih markera. Ovo odgovara fizičkoj dužini od približno 340.000 bp. Uprkos intenzivnim razvojima, bilo je moguće smao do izvesne mere da se dodatno smanji Beta vulgaris podvrsta maritima prelaz gena iz jedne u drugu vrstu, poznat kao introgresija, oko gena tako da potpomogne marker i da identifikuje gene kandidate za RZ-3 gen. Još jedno skraćenje introgresije, međutim, je poželjno u svakom slučaju sa stanovitšta kultivacije da bi se eliminisalo bilo kakvo sprečavanje prenošenja nepoželjnih gena “prevlačenje vezanih gena”, tesno vezanih na RZ-3 gen. Najzad, ciljni region bi mogao biti ograničen na samo približno 0,07 cM u izvesnom broju koraka putem finog mapiranja i inkorporiranjem informacije sekvence iz fizičkih mapa. Ovo je, međutim, bilo moguće samo zato što je bilo ispitano ukupno 8004, uključujući informativnu rekombinantnu BC2S1 ili BC2S2 biljke, koje su analizirane intenzivno sa 90-180 potomcima u svakom slučaju. Ovo je bilo neophodno jer ekspresija otpornosti nije bila uvek jasna iz nepoznatih razloga. Ovi potomci su bili genotipovani u pojedinačne biljke i fenotipovani paralelno sa tim. Putem statističkih postupaka (t-test, analiza snage), ti fenotipovi informativnih rekombinanti (otpornost homozigota – RR; otpornost heterozigota – Rs; podložnost uticaju homozigota – ss) su detektovani i samim tim nije moguće doneti zaključke u vezi sa genotipom informativnih rekombinanata.

U relativno malom ciljnom regionu od približno 38.000 bp, deset gena je moglo biti anotirano u genotipu osetljivom na uticaj. Preklapanje klonova iz BAC biblioteke otpornosti su bili identifikovani za ovaj ciljni region uz pomoć novih markera, koji opisuju specifično ciljni region, i bili su zatim sekvencionirani Usled ponavljanja ciljnog regiona, sekvenca osetljivog genotipa je pokazala brojne male delove sa nepoznatim sadržajem sekvence. Iz ovog razloga, sklapanje i RR i ss sekvence su bili posebno zahtevni. Međutim, bilo je moguće da se identifikuje pretpostavljeni gen otpornosti. Ovo je sadržano, u praktično svim ss genotipovima, retrotranspozonu koji ima dužinu od približno 8000 bp između LRR domena i IR domena, koji ne bi bilo moguće detektovati u RR genotipovima. Sekvenca amino kiseline predviđena iz predviđene sekvence gena otpornosti je pokazala da taj gen pretpostavljeno kodira NB-ARC-LRR protein. Može se pretpostaviti da ovaj umetak retrotranspozona uništava funkciju gena u podložnim ss genotipovima, jer odvaja unutrašnji domen ponavljanja (IR) od dva druga domena (NB-ARC i LRR).

Upoređivanje NBS-LRR gena u ss genotipovima sa istim u RR genotipovima je takođe pokazalo dijagnostičke polimorfizme, koje je moguće izvesti sa Slika 1, 2 i 3. Na osnovu ovih polimorfizama u NBS-LRR genu, markeri su razvijeni i testirani u širokom dijapazonu od približno 100 ss i RR genotipova. Obrasci markera, ali taođe uporedno sekvencioniranje u ciljnom genu, je potvrdilo da je umetak praktično uvek spojen sa senzitivnišću. Međutim, kod

1

nekoliko ss genotipova je utvrđeno da nije imalo umetanje retrotranspozona i bili su i pored toga podložni. Ovi ss genotipovi, međutim, mogli bi jasno biti razgraničeni od RR genotipova pomoću markera koji opisuju dijagnostičke polimorfizme prema Slikama 1, 2 i/ili 3.

U analiziranoj populaciji, rekombinantni su identifikovani u ciljnom regionu koji pokazuje rekombinaciju između NBS-LRR gena i nizvodno, susedni anotirani putativni gen, koji je mogao da kodira protein ankirinskog ponavljanja. U slučaju dve biljke, rekombinacije je moguće naći između NBS-LRR gena i uzvodno, susednog anotiranog pretpostavljenog gena, koji je moguće kodirati za DUF565 protein (protein sa nepoznatom funkcijom). Analizom otpornosti potomaka ovih rekombinantnih biljaka (uklanjanje jednog gena uzvodno i nizvodno od NBS-LRR gena), bilo je moguće pokazati sasvim jasno da taj gen imeđu gena ankirinskog ponavljanja i DUF565 gen, specifično ovde karakteriziran NBS-LLR gen , je odgovoran za otpornost u RR genotipu. Slika 4 pokazuje fizičku mapu od ciljnog regiona RZ-3 sa razvijenim markerima. Podaci o genotipu od osam gustih rekombinantnih linija, i takođe statističku analizu njegovih potomaka su ilustrovani na Slici 5.

U još jednom varijantnom rešenju ovaj pronalazak se odnosi na postupak za identifikovanje molekula nukleinske kiseline koji kodira protein koji može da prenese otpornost na patogen BNYVV u biljci iz roda blitve (Beta genus) u kom je taj protein izražen. Postupak obuhvata detekciju u odsustvu umetka u sekvenci kodirajućeg nukleotida koji koji kodira molekul nukleinske kiseline. Ovaj postupak poželjno obuhvata detekciju odsustva umetka, posebno retrotranspozona, u kodirajućoj sekvenci nukleotida molekula nukleinske kiseline. Retrotranspozon može biti, na primer, dug približno 500 bp, približno 1000 bp, približno 2000 bp, približno 4000 bp, približno 8000 bp, ili više od približno 8000 bp. U specifičnom izovđenju ovog postupka molekul nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kako je gore opisano i kodira RZ-3 gen koji nosi otpornost ili funkcionalni homolog od RZ-3. Biljka iz roda blitve (Beta genus) je poželjno Beta vulgaris podvrsta maritima ili Beta vulgaris podvrsta vulgaris var. altissima (šećerna repa). Stručnjak u ovoj oblasti zna koji postupci su pogodni za detektovanje odsustva umetka. Primera radi, stručnjak sa znanjem iz oblasti molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku je opisan ovde razvija molekularne markere koji detektuju prisustvo ili odsustvo umetka u gore opisanom regionu u genu NBS-LLR (videti primere pristupa uzetog kao primer). Ovaj pronalazak obuhvata takve markere i njihovu upotrebu za detektovanje prisustva ili odsustva umetka za odabir otpornih, a posebno BNYVV otpornih, biljaka, posebno Beta vulgaris podvrsta maritima ili Beta vulgaris podvrsta vulgaris var. altissima (šećerna repa). Takvi markeri poželjno opisuju mesta na tačkama umetanja retrotranspozona. Tačke umetanja znače tačke prelaza između geomske DNK i retrotranspozona na 5’ i/ili 3’ strani umetka. Tačke umetka treba definisati široko, i mesta markera moguće je rasporediti na DNK na rastojanju manjem od 1000 nukleotida, poželjno manje od 800 ili 600 nukleotida, posebno poželjno manje od 400, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20 ili 10 nukleotida uzvodno ili nizvodno od tačke umetka. Alternativno ili kao dodatak koraku detektovanja prisustva ili odsustva umetka u kodirajućoj sekvenci kodirajućeg nukleotida molekula nukleinske kiseline, taj postupak može takođe da obuhvati detekciju barem jednog polimorfizma prema Slikama 1, 2 i/ili 3, poželjno barem 2 ili 3 polimorfizama prema Slikama 1, 2 i/ili 3, posebno poželjno od barem četiri, pet ili više polimorfizama prema Slikama 1, 2 i/ili 3 u sekvenci kodirajućeg nukleotida molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku sa upotrebom molekularnih markera koji identifikuju polimorfizme, posebno dijagnostičke polimorfizme. Ova detekcija se poželjno odvija sa upotrebom barem jednog molekularnog markera po polimorfizmu, posebno po dijagnostičkom polimorfizmu. Stručnjak u ovoj oblasti zna koje tehnike markera treba primeniti za detekciju odgovarajućeg polimorfizma, i kako konstruisati molekularne markere za ovo (literatura). Pored toga, ovaj pronalazak obuhvata molekularne markere koji opisuju ili detektuju polimorfizam prema Slikama 1, 2 i/ili 3, i takođe upotrebu molekularnog markera za detekciju polimorfizma prema Slikama 1, 2 i/ili 3. Pored toga, gornji postupci identifikacije takođe obuhvataju postupke za odabir biljke koja ima otpornost na BNYVV. Postupak odabira obuhvata korak završetka odabira otporne biljke.

Pored toga, takođe je moguće da se pokaže da je u ispitanim RR genotipovima bilo genomskog dela sekvence DNK prema SEK ID BR: 4 uzvodno od i susedno uz RZ-3 (SEK ID BR: 1) kao i genomski deo DNK sekvence prema SEK ID BR: 5 nizvodno od i susedno uz RZ-3 (SEK ID BR: 1), koje su blisko spojene na RZ-3 gen i samim tim su izuzetno pogodne kao DNK regioni za razvoj dijagnostičkih markera za RZ-3. Ovaj pronalazak samim tim se odnosi na postupak za odabir biljke koja ima otpornost na BNYVV. Postupak odabira obuhvata upotrebu molekularnog markera na DNK sekvenci prema SEK ID BR: 4 i/ili na DNK sekvenci prema SEK ID BR: 5 i korak završetka odabira otprne biljke. Stručnjak u ovoj oblasti zna kako da razvije i koristi markere na bazi opisane informacije sekvence.

Putem ovog pronalaska, još dodatnih prednosti je moguće dobiti za kultivaciju i razvoj novih otpornih linija biljke iz roda blitve (Beta genus):

Informaciju sekvence i takođe identifikovane polimorfizme, koji omogućavaju distinkciju između otpornog RR i podložne ss alele opIsanog gena, čine razvoj markera mogućim direktno u tom genu, koji čini značajno olakšanje za izdanak biljke posebno u svetlu razvoja optimizovanih elitnih linija bez prenošenja nepoželjnih gena “prevlačenje vezanih gena”. Pored toga, poznavanje strukture sekvence je moguće koristiti za identifikaciju dodatnih gena otpornosti, posebno protiv rizomanije, koja je na primer delimično homologna.

Ovde opisana upotreba alela otpornog gena u cis- ili trans-genetskim pristupima otvara

1

mogućnost razvoja novih otpornih vrsta iz roda blitve (Beta genus), koje na račun efekta doze imaju veću otpornost ili kod koje, kao rezultat slaganja opisanog gena sa drugim genima otpornosti, prekid otpornosti može da bude izbegnut i ekspresija gena može biti optimimizovana. Modifikacije gena pomoću obrade ili selektivnog inženjeringa su takođe zamislive za razvoj novih alela otpornosti.

Ovaj se pronalazak takođe odnosi na upotrebu identifikovanog alela gena RZ3 u genetskom ili molekularnom slogu sa drugim genetskim elementima, koji mogu da nose agronomski pogodna svojstva, u nekoj biljci. Kao rezultat, ekonomska vrednost poljoprivrednih kultura može biti značajno povećana, na primer povećanjem učinka prinosa ili razvojem novih područja kultivacije za biljku koji nisu bili prethodno dostupni za kultivaciju ovih biljaka, inter alia usled biotskih faktora kao što je težak pritisak patogena ili abiotski faktori kao što je suvoća. Agronomski pogodno svojstvo je, na primer, tolerancija na herbicid, kao što je glifosat, glufosinat ili ALS inhibitori. Brojni dodatni herbicidi i njihova primenljivost su poznati iz prethodnog stanja tehnike stručnjaku u ovoj oblasti. Pomenuto lice može da pogleda prethodno stanje tehnike da bi steklo znanje o tome koje genetske elemente treba koristiti i na koji način da bi se primenila odgovarajuća tolerantnost u biljkama. Dodatni primer argonomski pogodnog svojstva je dodatna otpornost na patogen, pri čemu ti patogeni mogu da budu, na primer, insekti, virusi, nematode, bakterije ili gljive. Primera radi, kombinovanjem različitih patogenih otpornosti/toleranciji, može da se postigne sve obuhvatna patogena odbrana za neku biljku, jer genetski elementi mogu imati dejstva koja dopunjuju jedna druge. Brojni geni otpornosti na primer su poznati u ovu svrhu stručnjaku u ovoj oblasti kao genetički elementi. Još jedan primer argonomski pogodnog svojstva je tolerancija hladnih temperatura ili mraza. Biljke koje imaju ovo svojstvo bi mogle biti ranije zasejane tokom godine ili bi, na primer, mogle ostati duže u polju, čak i tokom perioda mrazeva, što na primer vodi do povećanog prinosa. Ovde takođe stručnjak u ovoj oblasti bi mogao da uputi na prethodno stanje da bi se pronašli pogodni genetički elementi. Više primera za argonomski pogodna svojstva su efikasnost korišćenja vode, efikasnost korišćenja azota i žetva. Genetske elemente koje je moguće koristiti da se prenesu takva svojstva je moguće naći u prethodnom stanju tehnike.

Brojne modifikacije za odbranu od patogena su takođe poznate stručnjaku u ovoj oblasti. Pored često opisanih porodica R gena, Avr/R pristup, komplementacija Avr gena (WO 2013/127379), automatska aktivacija R gena (WO 2006/128444), HIGS (utišavanje gena indukovano u domaćinu) pristup (na primer WO2013/050024) ili VIGS (virusom indukovano utišavanje gena) pristup bi mogao biti korišćen kao pogodnost. Specifično, automatska aktivacija R gena bi mogla biti od značaja za ovaj pronalazak. Nukleinska kiselina koja kodira automatski aktiviran protein otpornosti za proizvodnju otpornosti za patogene u biljkama

1

treba da se stvori u tu svrhu. Ova nukleinska kiselina zatim ima samo ograničen deo NBS-LRR gena otpornosti, kao što je RZ3 gen, koji se nastavlja nizvodno od 5'-kraja regiona kodiranja NBS-LRR gena otpornosti na početku NBS domena od NBS-LRR gena otpornosti, pri čemu taj NBS-LRR gen otpornosti nije gen otpornosti TIR-NBS-LRR.

Pored toga, ovaj pronalazak takođe obuhvata upotrebu otpornog alela gena RZ3, identifikovan sa gore opisanim postupkom, za kombinovanje sa jednom od gornjih modifikacija ili sa gore opisanim genetskim elementom koji može da prenese jednu ili više agronomski pogodnih svojstava u biljci.

Varijantna rešenja i izvođenja iz ovog pronalaska će biti opisani samo kao primer sa pozivom na priložene slike i sekvence:

Sekvence:

SEK ID BR: 1 genomska DNK sekvenca gena otpornosti RZ-3. Sekvenca obuhvata nukleotid 1 do 1403 regulatornog regiona promotera

SEK ID BR: 2 predviđene proteinske sekvence od proteina otpornosti RZ-3_1

SEK ID BR: 3 predviđene proteinska sekvenca od proteina otpornosti RZ-3_2

SEK ID BR: 4 susedni hromozomni region uzvodno od RZ-3 (SEK ID BR: 1)

SEK ID BR: 5 susedni hromozomni region nizvodno od RZ-3 (SEK ID BR: 1)

SEK ID BR: 6 konsenzus sekvence iz genomske sekvence iz RZ-3 gena u ss genotipovima

SEK ID BR: 7 ciljna sekvenca u genu RZ3 od RNKi konstrukta u vektoru pZFN-C48-RNKi.

Slike:

Sl. 1 A-I: poređenje sekvence nukleotida između konsenzus sekvence genomske sekvence RZ-3 gena u ss genotipovima (SEK ID BR: 6) i RZ-3 gen od genotipova RR (SEK ID BR: 1). Dijagnostički polimorfizmi su prikazani sivim i masnim slovima. Polimorfizmi koji nisu dijagnostički su podvučeni. Potencijalne tačke početka tanskripcije u genu su označene strelicama. Oni vode do dve varijante polipeptida RZ-3_1 i RZ-3_2. Pozicija retrotranspozona je naznačena crnim trouglom u vrhu.

1

Sl. 2 A-L: poređenje sekvence amino kiseline od predviđenog polipeptida iz RR genotipa (RZ-3_1; SEK ID BR: 2) i polipeptide iz 22 različita ss genotipa. Dijagnostički polimorfizmi su prikazani sivim i masnim slovima. Polimorfizmi koji nisu dijagnostički su podvučeni.

Sl. 3 A-L: poređenje sekvence amino kiseline od predviđenog polipeptida iz genotipova RR (RZ-3_2; SEK ID BR: 3) i polipeptide iz 22 različita ss genotipa. Dijagnostički polimorfizmi su prikazani sivim i masnim slovima. Polimorfizmi koji nisu dijagnostički su podvučeni.

Sl. 4: fizička mapa RZ-3 ciljnog regiona. Pet gena je bilo anotirano na ilustrovanom ciljnom regionu osetljivog referentnog genotipa: (“2” (DUF565), “3” (hipotetički protein), “4” (NBS-LRR gen kandidat), “5” (retrotranspozon) i “6” (ankirinsko ponavljanje)). Gen kandidat NBS-LRR (“4”) obuhvata retrotranspozon (“5”) u senzitivnoj referentnoj sekvenci. Ovaj retrotranspozon potpuno nedostaje u sekvenci otpornosti, i samim tim samo četiri gena mogu još da budu anotirani u otpornom genotipu “2”, “3”, “4” i “6”). Pozicije najgušćih rekombinacija (rekombinanti: 111T_3515/ ZR11007_03075 sa brojem “7” i 111PB3645/ZR08093_05621 sa brojem “8”) su ilustrovane na vrhu. Uz njihovu pomoć, kraći ciljni region “1” bi mogao biti ograničen. Markeri razvijeni u ovu svrhu iz rekombinantne analize su reprodukovani kao crne crtice u donjem delu slike. Segment (“9”) gena izabran delimično iz regiona “10” domena kao ciljne sekvence je korišćen za validaciju gena u RNKi pristupu za srastanje gena alela otpornog RZ-3 gena.

Sl.5: analiza markera najgušćih rekombinanata u ciljnom regionu RZ-3 (mala slova u regionu sa masnim okvirom su marker podaci generisani in silico). Osam rekombinantnih linija su fenotipovane i genotipovane sa ukupno 1051 potomaka. Potomci su podeljeni u 3 grupe (otporni homozigot RR, Rs heterozigot, ss senzitivni homozigot) na bazi marker podataka u genu kandidatu NBS-LRR ili prirubnom regionu srastanja u slučaju da gen kandidat NBS-LRR jeste RR homozigot ili ss. Pored toga, reprodukovane su odgovarajuće ELISA vrednosti. Srastanje ili nesrastanje potomaka je ispitano t-testom i Vilkokokson (Wilcoxon) statistikom. Gen kandidat je mogao sasvim jasno da se razgraniči između markera s3e5800s01 i s3e5873s01 na bazi tih rezultata.

Sl. 6: vektor transformacije pZFN-C48-RNKi: d35S-promoter; C48 s: sens (matična) orijentacija sekvence C48; AtAAP6 intron2: Intron 6 permeaze amino kiseline Arabidopsis thaliana; C48 as: orijentacija antisens (kodirajuće) sekvence C48; Nos-T: nos terminator; prirubno mesto LB: Prirubno mesto leve granice; ZFN mesto: Mesto prepoznavanja nukleaze cinkovog prsta (komplementarno); Pnos: Nos promoter; NPT: kodirajuća sekvenca; gen fosfotransferaze neomicina (npt); pAG7: pAG7 terminator; Bvpal3’UTR: 3’ netranslatirani region roda blitve (Beta vulgaris) Pal gena; LB: Leva granica; aadA: kodirajuća sekvenca;

1

aminoglikozid-3″-adenililtransferaza (AAD); pVS1-REP: pVS1 poreklo replikacije;

ColE1 ori: ColE1 poreklo replikacije; RB: desna granica.

Primeri:

Mapiranje i fino mapiranje RZ-3 gena/genetske fizičke mape

RZ-3 otpornost (takođe se pominje kao C48 otpornost ili C48) je mapirana u izvesnom brojukoraka pomoću mapiranja i finog mapiranja na hromozomu 3 između 57.1 i 57.8 cM (interna referentna mapa), t.j. pri genetskom rastojanju između dva prirubna markera od 0,0714 cM u genetskoj mapi. Ukupno 8004 biljaka za ukrštanje S504 (osetljivog genotipa) x T74 (otpornog genotipa) su ispitani za mapiranje. Paralelno sa C48 QTL mapiranje novih informativnih markera je razvijeno na način da je usmeren na cilj posle svakog koraka mapiranja i korišćeni su za ograničavanje ciljnog regiona C48.

Koordinate finog mapiranja su dodatno potvrđene sa analizom potomaka informativnih rekombinanata. Informativni rekombinanti BC2S1 ili BC2S2 biljke su analizirani intezivno u ovu svrhu, u svakom slučaju sa 90-180 potomaka. Ovi potomci su genotipovani i fenotipovani kao paralela sa istim na bazi pojedinačne biljke. Putem statističkih postupaka (t-test, analiza snage), ti fenotipovi informativnih rekombinanti (otporan RR homozigot/heterozigot Rs/homozigot podložan ss) su detektovani i moguće je bilo izvesti zaključke u vezi sa genotipom informativnih rekombinanata. Date klase homozigota potomaka (RR naspram ss) različite u smislu otpornosti, gen je bio prisutan u regionu heterozigota (Rs) biljke roditelja; inače je prisutan u regionu homozigota (RR ili ss) biljke roditelja.

Fizička mapa je generisana za genotip osetljiv na rizomaniju markerima za označavanje i njihovim genetskim pozicijama na sekvence hromozoma. Sa ograničenjem C48 QTL regiona, novi informativni markeri su razvijeni na bazi referentne sekvence i dodatnih komparativnih sekvenci u otpornim genotipovima (sledeća generacija sekvenciranja i Sanger sekvenciranje).

Region identifikovan finim mapiranjem obuhvata dužinu sekvence od 37996 baznih parova (pozicije prirubnih SNP markera) u senzitivnoj referentnoj sekvenci. Kolinearnost između genetske i fizičke mape u ciljnom regionu je dosledna (sekvenca od 12 markera u ciljnom regionu).

Identifikaicija i sekvenciranje otpornih BAC klonova

1

BAC biblioteka je razvijena za izabrani RZ-3 (C48) otporni genotip. Ova BAC banka je uzorkovana sa korišćenim markerima u C48 QTL regionu. Broj BAC klonova je pronađen za gore identifikovan ciljni region. Od ovoga, tri BAC klona različite dužine, koji su potpuno detektovali ciljni region, su izabrani za sekvenciranje. BAC klonovi su sekvencirani i “de novo” sklapanje je izvedeno na bazi očitavanja sekvenci dobijenih kao rezultat. Među dodirnim otpornim sekvencama dobijenim kao rezultat, najveća sekvenca je imala dužinu od 110909 bp (34537 očitavanja) i obuhvatila je ciljni region u potpunosti.

Poređenje senzitivnih i otpornih sekvenci - procena sekvence

Kolinearnost dve ss i RR sekvence je upoređena sa upotrebom različitih softverskih alata. I za otporne i za senzitivne sekvence, anotacija gena je izvedena korišćenjem softvera Maker i Pedant. Anotacija gena na obe sekvence je pokazala istu sekvencu pretpostavljenih gena. Neočekivano, međutim, značajna razlika u jednom od ovih gena bi mogla biti određena, specifično u genu iz ovog pronalaska (RZ-3). Retrotranspozon bi mogao biti anotiran u senzitivnom genotipu u ovom identifikovanom NBS-LRR genu. Umetanje retrotranspozona koji je prošao u gen između dva domena, LRR i IR domena. Otporni genotip nema ovaj umetak i reprodukovan je u SEK ID BR: 1. Pored toga, predviđene sekvence polipeptida su zatim upoređene i procenjene (ilustrovane delimično na Slikama 2 i 3).

Uporedno sekvenciranje gena kandidata NB-ARC-LRR

Gen kandidat NB-ARC-LRR je sekvenciran uporedno u dva koraka. Tačka umetanja retrotranspozona je verifikovana u kompletu genotipa koji ima ukupno 92 otporna i senzitivna genotipa. Ova analiza je pokazala da nijedan od otpornih genotipova nije imao umetak retrotranspozona. Od ovih senzitivnih genotipova, umetak bi bilo moguće detektovati u više od 90% slučajeva. Detekcija umetka se samim tim čini da je spoljena sa podložnim genotipom. Usled pronađenih nedoslednosti (približno 10% od preostalih podložnih genotipova bez umetka) međutim, sekvenciranje je produženo sa regionom promotera u drugom koraku za ceo gen pre tačke umetanja (SEK ID BR: 1). U celini, 31 izabran otporan i podložan genotip koji obuhvata nedosledne genotipove je sekvenciran i upoređen. Kao rezultat, svi otporni genotipovi, koje treba pripisati sedmorici različitih izvora otpornosti, su bili 100% identični sa upoređenih približno 4100 baznih parova. Pored toga, potpuno dijagnostički polimorfizmi su pronađeni u sekvenci nukleotida, od čega je izvestan broj doveo do supstitucija amino kiseline u sekvenci proteina (videti Slike 1, 2 i 3). Neke od ovih supstitucija, posebno u regionima domena, bi mogle da prouzrokuju funkcionalni gubitak identifikovanog proteina otpornosti u ss genotipovima. Pored toga, tri INDEL spojena su potpuno sa otpornošću (neravnoteža povezanosti = 1) su takođe pronađeni u regionu

2

promoteru (Slika 1). Ove INDEL treba posmatrati kao potencijalne kandidate za funkcionalni gubitak.

Verifikacija gena pomoću gustih rekombinanata

U analiziranoj populaciji sa 8004 biljke, 16 rekombinanata je identifikovano u ciljnom regionu (fino mapiran region sa 37996 baznih parova). Od ovih 16 genotipova, 9 biljaka je sadržalo rekombinaciju između proteina NB-ARC-LRR i susednog proteina ankirinskog ponavljanja na desnoj strani. U slučaju dve biljke rekombinacije su između proteina NB-ARC-LRR i susednih proteina DUF565 levo (protein sa nepoznatom funkcijom). Pomoću analize potomstva od svih od ovih rekombinantnih biljaka (rastojanje gena na levo i desno) bilo je moguće da se pokaže sasvim jasno da taj gen leži između DUF565 i protein ankirinskog ponavljanja, specifično da je samo NB-ARC protein odgovoran za otpornost.

Primer detekcije odsustva umetka transpozona

Za detekciju umetka retrotranspozona, 3 specijalne dominantne kombinacije početnica je razvijeno. Kombinacije prve i druge početnice su mogle da detektuju umetak, jer u svakom slučaju jedna početnica od dva para početnica sedi u retrotranspozonu (levo ili desno prirubno od retrotranspozona) i druga početnica se vezuje direktno pre ili posle tog retrotranspozona. Treći par početnice detektuje odsustvo retrotranspozona u toj početnici nalazi tačku vezivanja pre i posle retrotranspozona. PCR proizvod moguće je zatim proizvesti pod standardnim uslovima samo kada nedostaje retrotranspozon, PCT proizvod bi bio preveliki i u ovom slučaju nije bilo moguće kreirati amplikon.

Verifikacija gena pomoću RNKi pristupa

Pored gore opisane verifikacije gena pomoću gustih rekombinanata, dodatna detekcija efekta otpornosti gena je takođe izvedena pomoću RNK interferencije. U ovu svrhu, otporni standardni genotip šećerne repe je transformisan sa DNK konstruktom, koji kodira dvolančanu RNK u obliku ukosnice. Ova dsRNK je mogla da sprovede u delo posttranskripciono utišavanje gena, što bi smanjilo ili isključilo dejstvo otpornog alela gena RZ-3, pri čemu bi prethodno otporan genotip šećerne repe postao osetljiv na rizomaniju.

Da bi se obezbedio pogodan DNK konstrukt, definisani ciljni region sekvence otpornog alela gena RZ3 dužine od 434 bazna para (SEK ID BR: 7; Slika 4) je izabran, pojačan putem PCR i kloniran u sens (matičnom) i antisens (kodirajućem) smeru u vektoru pZFN, koji je pogodan za sintezu struktura u obliku ukosnice (Slika 6). Ovaj vektor ima udvostručen CaMV 35S promoter, višestruku tačku kloniranja, intron iz gena AtAAP6, koji kodira Arabidopsis thaliana permeazu amino kiseline, dodatnu tačku višestrukog kloniranja, i nos terminator. Transformacija šećerne repe sa datim vektorom je izvedena u skladu sa protokolom Lindsey & Gallois (1990) uz upotrebu antibiotika kanamicina kao markera selekcije. Sledeći nekolicinu koraka selekcije, uspešna transformacija je ispitana na transgenskim izdancima preko PCR pomoću detekcije prisustva nptll gena, AAP6 intron i dve t-DNK granične sekvence (LB/RB) i odsustvo vir. Pozitivni izdanci su klonalno umnoženi in vitro do 30 izdanaka u svakom slučaju, ukorenjeni, i preneti u zemlju u plastenik. Približno 2 nedelje posle postavljanja transgenskih biljaka šećerne repe u zemlju kontaminiranu rizomanijom, u kojoj su kultivisani tokom 8 do 10 nedelja. Kao kontrola, netransformisane biljke iste otporne genetički standardne transformacione pozadine (porekla) su korišćene pod istim uslovima. Da bi se detektovalo širenje rizomanije, koreni biljaka šećerne repe su prikupljeni i kvantifikovani pomoću ELISA testa za BNYVV napad, pri čemu je niska ELISA vrednost označila otpornost i visoka vrednost označila je osetljivost (Mechelke 1997, Clark & Adams 1977). ELISA vrednost transformisane šećerne repe, sa srednjom vrednošću od 3,55, je bila značajno viša od ELISA vrednosti kontrolnog materijala, koji je takođe bio otporan, sa srednjom vrednošću od 1,27 i bio je kompatibilan sa osetljivim (senzitivnim) standardnim D108_ss (Tabela 1). Rezultati ELISA testa su sa tim u skladu pokazali da je prethodno otporna biljka bila osetljiva na BNYVV kao rezultat specifičnog utišavanja gena otpornog RZ-3 alela u toj transformacionoj pozadini. Samim tim, gen iz ovog pronalaska bi mogao biti jasno verifikovan kao RZ3 gen otpornosti.

Tabela 1: Rezultati ELISA- testa posle statističkih analiza (D108_ss = standardno osetljiv; 6921_RR = otporna pozadina transformacije; 6921_RNAi = otporna pozadina transformacije sa dsRNK usmerenim protiv RZ3 gena).

Reference

Clark, M.F.; Adams, A.N. (1977): Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol.

34, 475-483

Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM (1982) Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet.1(6): 561-73.

Esser K (2000) Kryptogamen 1: Cyanobakterien Algen Pilze Flechten Praktikum und Lehrbuch. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 3. Aufl.2000.

Gidner S, Lennefors BL, Nilsson NO, Bensefelt J, Johansson E, Gyllenspetz U, Kraft T (2005) QTL mapping of BNYVV resistance from the WB41 source in sugar beet. Genome 48: 279-285.

2

Larson RL, Wintermantel WM, Hill A, Fortis L, Nunez A (2008) Proteome changes in sugar beet in response to Beet necrotic yellow vein virus. Physiological and Mol. Pl. Pathol.72: 62-72.

Lindsey, K., and P. Gallois (1990) "Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens."Journal of experimental botany 41.5: 529-536.

Martin GB, Bogdanove AJ; Sessa G (2003) Understanding the functions of plant disease resistance proteins. Annual Review of Plant Biology 54: 23-61.

Mechelke W (1997) Probleme in der Rizomaniaresistenzzüchtung, Vorträge für Pflanzenzüchtung, Resistenzzüch- tung bei Zuckerrüben, Gesellschaft für Pflanzenzüchtung e.V., 113-123.

Odell JT, Nagy F, Chua N-H (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313, 810-812

Rushton PJ, Torres JT, Parniske M, Wernert P, Hahlbrock K, and Somssich IE (1996) Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes. EMBO J.15(20): 5690-5700.

Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl.2001.

Schmidlin LEDEB, Weyens G, Lefebvre M, Gilmer D (2008) Identification of differentially expressed root genes upon rhizomania disease. Mol. Plant Pathol.9(6):741-51.

Scholten OE, Bock TSMD, Klein-Lankhorst RM, Lange W (1999) Inheritance of resistance to Beet necrotic yellow vein virus in Beta vulgaris conferred by a second gene for resistance. Theor. Appl. Genet.99:740-746.

Sohi HH, Maleki M(2004) Evidence for presence of types A and B of beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) in Iran. Virus Genes 29(3): 353-8.

Van Ooijen G, Mayr G, Kasiem MMA, Albrecht M, Cornelissen BJC, Takken FLW (2008) Structurefunction analysis of the NB-ARC domain of plant disease resistance proteins. Journal of Experimental Botany, 59(6): 1383-1397

WO/2000/29592 (Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.). Chimeric promoters capable of mediating gene expression in plants upon pathogen infection and uses thereof.

WO/2006/128444 (KWS SAAT AG). AUTOACTIVATED RESISTANCE PROTEIN.

WO/2007/147395 (KWS SAAT AG). Pathogen induzierbarer synthetischer Promotor.

WO/2013/127379 (KWS SAAT AG). PATHOGEN-RESISTANT TRANSGENIC PLANT.

WO/2013/050024 (KWS SAAT AG). TRANSGENIC PLANT OF THE SPECIES BETA VULGARIS HAVING ENHANCED RESISTANCE TO CERCOSPORA.

WO/2013/091612 (KWS SAAT AG). NOVEL PLANT-DERIVED CIS-REGULATORY ELEMENTS FOR THE DEVELOPMENT OF PATHOGEN-RESPONSIVE CHIMERIC PROMOTORS.

2

SEQUENCE LISTING

[0058]

2

�

2

�

�

�

<211> 1177 <212> PRT <213> Beta vulgaris

<400> 3

�

<211> 987 <212> DNA <213> Beta vulgaris

210> 5

<211> 12364 <212> DNA <213> Beta vulgaris <400> 5

�

�

<211> 4659

<212> DNA

<213> Beta vulgaris

<220>

<221> misc_feature <222> (461)..(485) <223> n is a, c, g, or t

<220>

4

<221> misc_feature <222> (621)..(696) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (704)..(707) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (1115)..(1123) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (1169)..(1170) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (1879)..(1880) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (2194)..(2194) <223> n is a, c, g, or t <400> 6

4

�

�

<211> 434 <212> DNA <213> Beta vulgaris <400> 7

4

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Molekul nukleinske kiseline, koji kodira polipeptid koji je sposoban da učestvuje u otporrnosti na patogen kod biljke kod koje je izražen taj polipeptid, naznačen time što molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida izabranu iz

a) sekvence nukleotida koja kodira polipipeptid sa sekvencom amino kiseline prema SEK ID BR.2 ili SEK ID BR.3,

b) sekvenca nukleotida obuhvata kodirajuću sekvencu DNK sekvence prema SEK ID BR.1,

c) sekvenca nukleotida koja kodira polipeptid koji je izveden supstitucijom, brisanjem i/ili dodavanjem amino kiseline iz sekvence amino kiseline kodirane sekvencom nukleotida prema a) ili b), iz polipeptida kodiranog sekvencom nukleotida prema a) ili b),

d) sekvenca nukleotida koja kodira polipeptid koji ima sekvencu amino kiseline, koja je barem 80% identična sekvenci amino kiseline kodiranoj sekvencom nukleotida prema a) ili b), ili

e) sekvenci nukleotida koja kodira barem pozicije 168-227 amino kiseline iz SEK ID BR.2 i barem pozicije 591-613 amino kiseline iz SEK ID BR.2 i barem pozicije 1013-1072 amino kiseline iz SEK ID BR.2 koja kodira barem pozicije 182-241 amino kiseline iz SEK ID BR.3 barem pozicije 605-627 amino kiseline iz SEK ID BR.3 i barem pozicije 1027-1086 amino kiseline iz SEK ID BR.3.

2.Vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1.

3.Prokariotska ćelija ili ćelija kvasca koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili vektor prema patentnom zahtevu 2.

4.Polipeptid, koji je sposoban da učestvuje u otpornosti na patogen u biljci u kojoj je polipeptid izražen i čiji je polipeptid izražen molekulom nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1.

5.Ćelija transgenske biljke koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 kao transgen, ili vektor prema patentnom zahtevu 2.

6.Transgenska biljka ili njen deo koji obuhvata ćeliju biljke prema patentnom zahtevu 5.

7.Seme biljke prema patentnom zahtevu 6, pri čemu to seme obuhvata molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 kao transgen.

8.Postupak za proizvodnju ćelije transgenske biljke, naznačen time što taj postupak obuhvata korak uvođenja molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili vektor prema patentnom zahtevu 2 u ćeliji biljke.

9.Postupak za proizvodnju transgenske biljke, naznačen time što taj isti postupak obuhvata sledeće korake:

a) uvođenje molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili vektor prema patentnom zahtevu 2 u ćeliji biljke, i

b) regenerisanje transgenske biljke iz ćelije transgenske biljke iz koraka a).

10. Postupak za identifikovanje molekula nukleinske kiseline, koji kodira protein koji može da učestvuje u otpornosti na BNYVV patogen u biljci iz roda blitve (Beta genus), u kojoj je taj protein izražen, naznačen time što taj postupak obuhvata sledeće korake:

i. detektuje odsustvo umetka u sekvenci kodirajućeg nukleotida molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili

ii. detektovanje barem jednog polimorfizma prema Slikama 1, 2 i/ili 3 u sekvenci kodirajućeg nukleotida molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 korišćenjem molekularnih markera, koji detektuju polimorfizam.

11. Molekularni marker za odabir biljaka otrpornih na BNYVV, pogodno za detektovanje polimorfizma prema Slikama 1, 2 ili 3

12. Upotreba molekularnog markera prema patentnom zahtevu 11 za odabir biljaka otpornih na BNYVV, obuhvata

i) detektovanje polimorfizma prema Slikama 1, 2 ili 3

ili

ii) obuhvata detektovanje prisustva ili odsustva umetka u sekvenci kodirajućeg nukleotida iz

molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1.

13.Upotreba molekularnog markera koji je blisko spojen sa molekulom nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 na DNK sekvenci prema SEK ID BR.4 ili na DNK sekvenci prema SEK ID BR. 5 u postupku za odabir biljke koja ima otpornost na BNYVV.