TR201820018T4 - Streptococcus pneumonıae polisakaridinden bulaşkanların ph manipülasyonuyla ayrılması. - Google Patents

Abstract

Saflaştırma öncesinde bir kompleks hücresel O Streptococcus pneumoniae lisatı besiyeri içerisindeki protein içeriğinin azaltılmasına ve kapsüler polisakarid içeriğinin korunmasına yönelik bir proses tarif edilir. Hücre lizizi sonrasında pH düşürmeden faydalanılması, protein spesifikasyonunu tutarlı şekilde karşılayan saflaştırılmış bir polisakarid ve saflaştırma prosesi sırasında daha yüksek polisakarid geri kazanım verimleri ile sonuçlanmıştır.

Description

TARIFNAME STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE POLISAKARIDINDEN BULASKANLARIN PH MANIPULASYONUYLA AYRILMASI BULUSUN ALT YAPISI Bu bulus, pnömokok polisakaridlerinin üretiininde kullanilan Streptococcus pncumoniae (S. pneuinoniae) serotiplerinin hücre lisatlarindan çözülebilir protein fazlasinin çikarilmasina yönelik yöntemler ile ilgilidir. Asi ürünleri için kullanilan her bir S. pneuinoniae serotipi için kapsüler polisakarid, organizmanin kompleks bir sivi ortaminda büyütülmesiyle üretilir. Organizma popülasyonu siklikla bir tohum flakonundan tohum siselerine çogaltilir ve üretim ölçeginde fermantasyon hacimlerine ulasilana kadar hacmi arttirilan bir veya daha fazla tohum fermantöründen geçirilir. Büyüme döngüsünün sonu, birkaç yöntemden biriyle belirlenebilir; bu noktada hücreler, hücre çeperinin bozulmasina ve hücre duragan faza ulastiginda hücre lizizine neden olan otolisin salimina yardimci olan bir deterjan ilavesiyle lizlenir. Lisat besiyeri daha sonra asagi yönde (saflastirma) prosesler için toplanir. Bu saflastirma, bakteri hücrelerini çevreleyen kapsüler polisakaridin geri kazanilmasi için birkaç kolon kromatografisi ve dia-filtreleme adimlari içerir. Polisakarid, moleküler agirligi yüksek bir protein, örn., CRM197 ile konjuge edildiginde ve birçok serotipten olusan konjugatlar içeren bir asi halinde formüle edildiginde, örnegin bebekler ve küçük çocuklar gibi hedef popülasyona enjekte edildigi durumda iminünite (S. pneuinoniae"ye karsi) kazandirmaya yardimci olur. Her bir serotipin saflastirilmis polisakaridi içerisindeki protein içerigi için asi kaynakli olumsuz durum riskini azaltmak amaciyla Spesifikasyonlar belirleninistir. Örnegin halen satisi yapilaii 7 valansli pnömokok konjugat (7VPnC) asisinin (Previiar®) durumunda saflastirilmis serotip 4 polisakaridi içerisindeki protein içerigi spesifikasyonu, %3"ten fazla degildir ve saflastirilmis serotip 6B polisakaridinin durumunda bu, kuru agirlik bazinda %2"den fazla degildir. Bazi durumlarda bütün saflastirma prosesiiiin ardindan hala mevcut olan rezidual proteini çikarmanin zor oldugu kanitlanmistir. Bu sorunu, hücre lisatinin saflastirma prosesinde degisiklikler yaparak çözme girisimleri, sadece orta düzeyde basari saglamistir. Bu yüzden bu sorunla, prosesin yukari akis yönünde savasmaya karar verildi. Hücre büyümesi ve bütünlügü için kritik olan baslica bulaskan proteinler belirlendi. Böylelikle toplam proteini azaltmak için elde kalan opsiyonlar, büyütme ve/Veya toplama kosullarinin degistirilmesinden mütesekkildi. Fermantasyon prosesi makul düzeyde ilerletilir. Hücreler (tohum), soya bazli ortamlarin oldugu siselerde büyütüldükten soiira bir veya iki tohum ferinantöründeii geçirilir ve son olarak da üretim ölçeginde bir fermantöre geçirilir. Her bir adimda sicaklik ve pH, yakindan izlenirken pH, bir baz materyal (%20 sodyum karbonat) ilave edilerek kontrol edilir. Büyüme, belirli bir noktaya ulastiginda bir hücre liziz prosesini baslatan deoksikolat (DOC) sodyum gibi bir deterjan dahil edilerek akis sonlandirilir. Bir tutma periyodunun ardindan lisat besiyerinin pH°si, 6.6"ya ayarlanarak deoksikolat ve hücre membran koinpleksleri çökeltilir. Bu materyal, katilarin çikmasi için santrifüjleme ve filtreleme islemleri yapilana kadar tutulur. Bununla birlikte proteinin çogu, aritilmis lisat içerisinde hala çözülebilir oldugundan saflastirilmis polisakarid içerisindeki rezidual protein içeriginin spesifikasyonun üzerinde olmasina neden olur. Bu nedenle birkaç pnöinokok serotipi içerisindeki çözülebilir protein seviyelerinin fermantasyon yada saflastirma prosesi sirasinda azaltilmasi gerekir. EP 0 024 493 A2, pnömokok kapsüler polisakaridinin preparasyonuna Ve saflastirilmasina yönelik bir prosesi açiklar. BULUSUN OZETI Mevcut bulus, saflastirina öncesinde koinpleks hücresel bir Streptococcus pneumoniae lisatli besiyeri içerisindeki protein içeriginin azaltilmasina ve kapsüler polisakarid içeriginin korunmasina yönelik bir proses saglamak suretiyle bu ihtiyaci karsilar. Bu proses, su adimlari içerir: (a) soya bazli bir ortainda seçilen bir S. pneuinoniae serotipinin bir baslangiç kabindan üretim ölçeginde bir kaba artan hacimlerde büyütülmesi ve hücre büyümesi sirasinda stabil bir pH ve sicakligin muhafaza edilmesi; (b) adim (a)"da üretilen bakteri hücrelerinin bir deterjan ile lizlenmesi, böylelikle çözülebilir proteinler, hücre döküntüsü, nükleik asitler ve polisakarid ihtiva eden bir lisat üretilmesi; (c) hücre lisatinin, tam liziz ve polisakarid salimi saglamak için yeterli bir süre çalkalanmasi; (d) hücre lisatinin pH'sinin, 5.5"in altina düsürülmesiyle deterjanin ve çözülebilir proteinlerin çogunun çökeltilerek çikarilmasi; (e) adim (d)°de olusturulan çözeltinin ve çökeltinin, çökeltinin oturmasina olanak saglamak için yeterli bir süre çalkalanmadan tutulmasi; ve (I) çözeltinin ve çökeltinin, santrifüjleme ve/Veya filtreleme yoluyla islenmesi, bu suretle çözelti halinde kapsüler polisakaridin muhafaza edilmesi ve çözülebilir proteinin etkin sekilde azaltilmasi. Bulusun bu düzenegi için 'Örnek sinirlayici olmayan S. pneuinoniae serotipleri, l, 4, 5, 6A, 6B, 7F ve 19A'dir. Bulusun 'Özel bir düzeneginde ve adim (a)"da büyütülmekte olan serotipe bagli olarak adim (aydaki fermantasyon pH°si, sodyum hidroksid, sodyum karbonat veya bunlarin bir kombinasyonundan olusan bir baz beslemesiyle muhafaza edilir. Bir baska düzenekte adim (d)°deki pH, 4.5 ile 5.5"ten az arasina düsürülür. Yine bir baska düzenekte deterjan, deoksikolat sodyumdur. Serotipin, serotip 5 veya 19A oldugu yine bir baska düzenekte soya bazli ortam, sodyum bikarbonat ile desteklenir. Bu bulus, büyük miktarlarda fazla proteinin kontaininasyonunun hücre lisatindan çikarilmasini saglar, böylelikle genellikle `Önceki fermantasyon ve geri kazanim yöntemi kullanilarak mümkün olandan daha yüksek polisakarid geri kazaniinlari ve toplam polisakarid veriinleri saglayacak saflastirina için daha temiz bir ürün (Hücresiz Besiyeri veya CFB) kalir. ÇIZIMLERIN KISA TARIFI SEKIL 1, S. pneumoniae Tip 4 için pH, asetik asit ile düsürüldükçe her bir litre lisat basina gram cinsinden çözülebilir proteinde anlamli azalma gösteren bir SDS-PAGE jeldir. 39 kDa ve 48 kDa'lik bilesenler, hücre çeperi yüzeyi proteinleridir. polisakarid verimi de gösterilmistir. SEKIL 2, S. pneumoniae Tip 6B için pH°nin pH 5'e düsürülerek ayarlanmasinin sonuçlarindan olusan, SDS-PAGE ile belirlenen sekilde protein azalmasini ve refraktif endeks (RI) detektörlü HPLC- SEC ile belirlenen sekilde polisakarid (Ps) verimini gösteren bir çizelgedir. SEKIL 3, S. pneumoniae Tip 1 için 3, pH"nin pH 5"e düsürülerek ayarlaninasinin sonuçlarindan olusan, SDS-PAGE ile belirlenen sekilde protein azalmasini ve R1 detektörlü HPLC-SEC ile belirlenen sekilde polisakarid verimini gösteren bir çizelgedir. SEKIL 4, S. pneuinoniae Tip 5 için pH°nin pH 4.1"e düsürülerek ayarlanmasinin sonuçlarindan olusan, SDS-PAGE ile belirlenen sekilde protein azalmasini ve R1 detektörlü HPLC-SEÇ ile belirlenen sekilde polisakarid verimini gösteren bir çizelgedir. SEKIL 5, S. pneuinoniae Tip 6A için, pH°nin pH 4.5"e düsürülerek ayarlanmasinin sonuçlarindan olusan, SDS-PAGE ile belirlenen sekilde protein azalmasini ve R1 detektörlü HPLC-SEÇ ile belirlenen sekilde polisakarid verimini gösteren iki farkli fermantasyon akisinin bir çizelgesidir. SEKIL 6, S. pneuinoniae Tip 7F için, pH°nin pH 4.8"e düsürülerek ayarlanmasinin sonuçlarindan olusan, SDS-PAGE ile belirlenen sekilde protein azalmasini ve R1 detektörlü HPLC-SEC ile belirlenen sekilde polisakarid verimini gösteren bir çizelgedir. BULUSUN DETAYLI TARIFI Streptococcus pneuinoniae, genellikle çiftler halinde (diplokoklar) halinde olinakla birlikte kisa zincirler veya tekli hücreler olarak da görülen Gram-pozitif, bisturi biçiminde koklardir. Bunlar, kan agar plakalari üzerinde isildayan kolonilerle kolayca büyür ve beta hemoliz gösterdikleri anaerobik sekilde büyütülmedikleri sürece alfa hemoliz sergilerler. Bunlar, hücrelerin kendi enzimi, otolisin varligiyla hücre çeperini bozabilen safra tuzlarina duyarlidirlar. Organizma, aero- toleransli bir anaerobdur ve kompleks besin gereksinimleri oldugundan zor gelisir. Birçok pnömokok serotipli hücreler, her bir hücreyi çevreleyen bir polisakarid kilifi olan bir kapsüle sahiptir. Bu kapsül, insanlarda bir Virülans determinantidir çünkü antikorlarin bakteri hücrelerine baglanmasini engellemek suretiyle fagositoza müdahale eder. Halen taniinlaninis 90 kapsüler serotip vardir ve 23 serotip, envazif hastaliklarin yaklasik %90°indan sorumludur. Bir asi olarak polisakarid kilifi, iinmün sistemleri gelistirilmis veya bozulmamis kisilerde makul bir derecede immünite (S. pneumoniaelye karsi) kazandirabilir ancak polisakarid ile konjuge edilmis bir protein, yine çogunlukla pnömokok enfeksiyonlari riski tasiyan bebek ve yaslilarda bir iminün tepkisini müinkün kilar. Bu kapsüler polisakaridin lizleninis (ölü) bakterilerden ayrilabilmesi ve mümkün oldugu kadar çok hücre döküntüsünün çikarilabilinesi önemlidir. Burada tarif edildigi gibi bu çikarma, bir dizi fermantasyon prosesi degisikligiyle yapildi. Asagi yönde prosesleri büyük ölçüde gelistiren baslica üç degisiklik su sekildedir: (l) fermantasyon baz beslemesinin mümkün olan yerde sodyum karbonattan sodyum hidrokside degistirilmesi; (2) deoksikolati tutma araliginda fermantör içerisindeki çalkalamanin muhafaza edilmesi; ve (3) deoksikolat lisati tutmasindan sonra pH°nin .5 "in altina düsürülmesi. Ilk bulus, pH°nin 5.5"in altina düsürülmesiyle istenmeyen çözülebilir proteinin %50-90"inin, asagi yönde proseslerden (saflastirma) önce hücre lisatindan çikarilabilecegi idi. Bu, çok önemli bir proses gelismesi iken pH"yi fermantasyon akislari sirasinda istenen degerde tutmak için büyük hacimlerde sodyum karbonat kullanilmasi, pHinin asetik asit ile 5.0"a ayarlandigi durumda ciddi bir köpürine problemine neden oldu. Ayrica çözelti içinde birçok karbonat formu mevcut oldugundan ayarlama sonrasinda stabil bir pH"yi korumanin zor oldugu da bulundu. Bu, fermantasyon besiyerinde bir karbonat yigilinasi yaratmayacak alternatif baz besleineler araninasina yol açti. Sodyum hidroksid seçildi çünkü bu, asilama öncesinde ortamin ve tohum siselerinin pH°si ayarlamak için zaten kullanilmaktaydi. 100L°lik fermantasyonlara kadar çalismalari, bunun, optik yogunluga (OD) bagli olarak büyümede sadece küçük bir düsüs olinasiyla geçerli bir alternatif oldugunu gösterdi. Bu baz ayrica köpürme probleinini de çözdü. Sodyum hidroksidin yani sira baska bazlar da kullanilabilir ve organizmanin, örnegin serotip 5 ve 19A ile büyümeyi koruyabilen bir karbonat formu gerektirdiginin belirlenmesi durumunda bir destekleyici olarak sodyum bikarbonat kullanilabilir. Om., serotip l9A durumunda birincil baz beslemesi olarak sodyum karbonat kullanilmasi durumunda lisat sonrasi pH ayarlamasi (5.5"in altinda bir pH"ye), köpürmeden kaçinmak için yavas çok saatli kontrollü bir asit ilavesi gerektirir. Son olarak laboratuvar gözlemine dayanarak deoksikolat tutma isleminin çalkalama yapilmadan (önceki bir protokolde oldugu gibi) ilerlemesi durumunda fermantör çeperleri ve pH probu üzerine jel benzeri bir çökelti yerlesip yerlesmedigi belirlendi. Bu, pH°nin ayarlandigi durumda güvenilir olmayan yerinde pH Okumalari yaratti. Çalkalama adimi, bu çökeltinin olusmasini engelledi ve pH probu bütünlügünün korunmasini sagladi. Böylece hali hazirda isteinde bulunulan bulusta, seçilen Streptococcus pneumoniae serotipleri, `Örnegin enzim dijest edilmis soya bazli bir ürün, sodyum klorid, potasyum fosfat monobazik, kalsiyum klorid ve seçilmis bir ainino asitten mütesekkil bir steril ortamda baslangiç tohum flakonlarindan artan hacimlerde büyütülür. Sivi ortamda büyümeyi sürdürmek için karbon kaynagi olarak magnezyum sülfatli dekstroz kullanilir. Ortam ayrica spesifik serotip veya prosesin gerektirdigi sekilde baska katki maddeleri ile de desteklenebilir. Kültür, tohum siseleri gibi birinci bir kapta baslar; bu, konveksiyon bazli bir inkübatör içerisinde bir büyüme araligindan sonra, bir tohum fermantörü gibi ikinci bir kaba asilama yapmak için kullanilir ve bu da sonrasinda arzu edilirse en az bir giderek daha büyük bir kaba, örn., bir üretim fermantörüne, üretim ölçegine ulasilana kadar asilama yapmak için kullanilabilir. Bir düzenekte seçilen bir S. pneuinoniae serotipi, baslangiçtaki tohum flakonlarindan tohum siselerine, 20L"lik bir ferinantöre, 200L'lik bir üretim fermantörüne, 2000L'lik bir üretim fermantörüne artan hacimlerde büyütülür. Büyüme parametreleri, optik yogunluk, sicaklik ve pH bakiininda yakindan izlenerek kültürün ne zaman bir sonraki fermantasyon ölçegine aktarilacagi ve ayrica küine akisinin ne zaman sonlandirilacagi belirlenir. Bakterilerin duragan faza girdigi durumda üretim fermantöründeki hücreler, bir anyonik veya katyonik deterjan gibi bir deterjan ilave edilerek lizize zorlanir. Bu tür deterjanlarin temsili 'ornekleri arasinda deoksikolat sodyum, N-lauril sarkosin, çenodeoksikolik asit sodyum ve saponinler yer alir. Hücre lisatinin, hücre ölümünün tamamlanmasini saglamak için yeterli bir süre boyunca, örn., 8 ila 24 saat arasinda bir süre boyunca ve 7°C ile 13°C arasindaki bir sicaklikta çalkalanmasinin ardindan hücre lisatinin pH°sini, bir asit çözeltisi, örn., %50 asetik asit ile pH 5.5,in altina düsürmek için ikinci proses fazi gelir. Gerçek pH düsüsü, dayanikli bir üretim prosesi için gereken tutarli bir sekilde son saflastirilmis protein spesifikasyonunun altina düsürülebilmesi amaciyla serotipe göre degiskenlik gösterir. Bulusun 'Özel bir düzeiieginde pH, 4.5 ile 5.5 "ten az arasina düsürülür. pH düsürme adimi, eskiden çözülebilir olan proteinlerden "tuz çikmasina" (çökmesine) neden olur. Bu, izoelektrik noktalarina ulastiklarinda proteinler üzeriiideki iyi bilinen bir kimyasal etkidir. Bu adimi, mevcut bulus içerisinde benzersiz kilan, yüksek düzeyde kompleks bir hücresel lisat besiyerinde bir saflastirnia adini] olarak kullanilmasidir. Besiyeri, "kompleks" olarak tanimlanir çünkü, ortam bilesenleri, DNA, proteinler, polisakaridler, RNA ve baska hücresel döküntüler ihtiva eder. Asetik aside ek olarak isteinde bulunulan prosesin, sülfürik asit ve fosforik asitler ile de çalistigi ve bu asitlerin bir parçasi oldugu Hofmeister serisini takip ederek degisken verimliliklerle çalisniasi gerektigi de gösterilmistir. Hofmeister serisi, çesitli anyonlar ve katyonlar ve bunlarin protein karisimlarindan çökerek çikma kabiliyetlerini içeren bir siralamadir. Bu bilesikleriii (Hofmeister serisindeki) çözelti halinde son konsantrasyonlari, çesitli proteinlerin en üst düzey çözünürlügünü belirler. Çökeltinin oturmasini saglaiiiak ve böylelikle sürekli santrifüjleme prosesine yardimci olniak için yeterli çalkalamasiz bir tutma süresinin, örnegin 15°C ile 25°C arasindaki bir sicaklikta 12 ila 24 saatin ardindan önceki çözülebilir proteinlerin anlamli bir bölümü (ve muhtemelen önceden çözülebilir diger bulaskan bilesenlerin bir kismi), hala çözelti halinde olan polisakarid ürününde küçük bir kayip veya degradasyonla bir kati çökelti halinde çözeltiden damlayarak çikar. Bu çökeltili çözelti daha sonra bir sürekli santrifüjden geçirilerek veya alternatif olarak standart sise santrifüjlemesiyle islemden geçirilir. Polisakarid ihtiva eden süpernatan toplanir ve partikülat ve mikron filtrelemeden geçirilerek yürütüldükten sonra asagi yönde konsantrasyon ve saflastirma için transfer edilir. Bu bulusa ait prosesi kullanmanin sonuçlari, Sekillerde gösterilmistir. Sekil 1, S. pneumoniae serotip 4 için hücresel lisat besiyeri üzeriiide pH"yi 6.8"den 5.0"a düsürmek için asetik asit kullanilarak gözlenen protein azalinasinin temsili bir SDS-PAGE jelidir. Uzak sol serit, protein agirligi için bir referans olarak kullanilan bir moleküler agirlik markeridir. Ornek Seridi 1 ("C"), pH ayarlamasi yapilmamis bir kontroldür. Sayilar, baslica iki protein bulaskan bandinin(48kDa ve 39kDa) ve ayrica bütün seritteki toplam proteinin yaklasik degerini (lizleiiinis besiyerinde g/L) gösterir. Ayrica HPLC-SEC analizine tabi tutulan bir ömek bölüntüsü içerisinde yer alan toplam polisakarid verimi de gösterilir. Serit 2-8, pH ayarlamasi yapilmis örneklerden gelen ayni bilgileri gösterir. Serit 9-11, temel lineer regresyon analiziyle protein verimlerini belirlemek için kullanilan BSA standartlaridir. Ps analizi, pH"si 6.8 olan örnek üzerinde yapilmadi. Bu özel serotipte, bir miktar orta düzeyde polisakarid. (Ps) kaybi vardi ancak pH"nin düsürülmesiyle olan protein kaybindan çok daha düsük bir orandaydi. Sekil 2, S. pneumoniae serotip 6B°den hücre lisatindaki protein azalmasini, hücre lisatinin pH"sinin 5.07a düsürüldügü durumda polisakarid verimi stabilitesi ile birlikte gösteren taslak halinde bir grafiktir. Bu serotip ile polisakarid kaybi görülmedi. Buna karsilik toplam protein, yaridan fazla azaldi. Sekil 3, S. pneumoniae serotip l'den hücre lisatindaki protein azalmasini, hücre lisatinin pH"sinin 5.0"a düsürüldügü durumda polisakarid verimi stabilitesi ile birlikte gösteren taslak halinde bir grafiktir. Polisakarid konsantrasyonunda hemen hiç degisiklik gözlenmedi. Buna karsilik toplam protein, %90°dan fazla azaldi. Sekil 4, S. pneuinoniae serotip 5"den hücre lisatindaki protein azalmasini, hücre lisatiiiin pH"sinin 4.1"a düsürüldügü durumda polisakarid veriini stabilitesi ile birlikte gösteren taslak haliiide bir grafiktir. Katilan asit miktarina bagli bir seyreltme etkisine yorulan çok düsük pH"ye kadar polisakarid konsantrasyonunda hemen hiç degisiklik gözlenmedi. Buna karsilik toplam protein, pH 4.5"te %75"den fazla azaldi. Sekil 5, S. pneumoniae serotip 6A"dan hücre lisatiiidaki protein azalmasini, hücre lisatinin pH"sinin 4.5"e düsürüldügü durumda polisakarid verimi stabilitesi ile birlikte gösteren iki farkli fermantasyon akisinin taslak halinde bir grafigidir. Polisakarid konsantrasyonunda hemen hiç degisiklik gözlenmedi. Bu grafik ayrica Na2CO3 yerine NaOH kullanildigi durumda polisakarid koiisantrasyonlari muhafaza edilirken protein konsantrasyonlarinin düstügünü de gösterir. Sekil 6, S. pneumoniae serotip 7F°den hücre lisatindaki protein azalmasini, hücre lisatinin pH"sinin 4.876 düsürüldügü durumda polisakarid verimi stabilitesi ile birlikte gösteren taslak halinde bir grafiktir. Polisakarid konsantrasyonunda hemen hiç degisiklik gözlenmedi. Buna karsilik toplam protein, pH 4.8"de %80°den fazla azaldi Asagidaki Tablo 1, bu bulusa ait proses kullanildiktan sonra son saflastirilmis polisakaridlerden protein azalmasi ve polisakarid kazançlarinin bazilarinin temsilidir. Tablo 1. Birkaç S. pneumoiiiae Serotipi için Protein Koiisantrasyonu ve Polisakarid Verimi Orijinal Proses Bulusa ait Proses . Protein Serotip Spesifikasyonu Protein Ps Protein Ps Kons. Verimi Kons. Verimi 1 5%2,0 %11,7 11,25; TR TR

Claims (8)

ISTEMLER

1. Saflastirmadan önce bir kompleks hücresel Streptococcus pneumoniae lisati besiyeri içerisindeki proteinin azaltilmasina ve kapsüler polisakaridin korunmasina yönelik bir proses olup, proses, su adimlari içerir: (a) soya bazli bir ortamda seçilen bir 8. pneumoniae serotipinin bir baslangiç kabindan üretim ölçeginde bir kaba artan hacimlerde büyütülmesi ve hücre büyüinesi sirasinda stabil bir pH ve sicakligin muhafaza edilmesi; (b) adim (a)”da üretilen bakteri hücrelerinin bir deterjan ile [izlenmesi, böylelikle çözülebilir proteinler, hücre döküntüsü, nükleik asitler ve polisakarid ihtiva eden bir lisat üretilmesi; (c) hücre lisatinin, tain liziz ve polisakarid salimi saglamak için yeterli bir süre çalkalanmasi; (d) hücre lisatinin pH”sinin, 5.5”in altina düsürülmesiyle deterjanin ve çözülebilir proteinlerin çogunun çökeltilerek çikarilmasi; (6) adim (d)'de olusturulan çözeltinin ve çökeltinin, çökeltinin oturmasina olanak saglamak için yeterli bir süre çalkalaninadan tutulmasi; ve (f) çözeltinin ve çökeltinin, santrifûjleme ve/Veya filtreleme yoluyla islenmesi, bu suretle çözelti halinde kapsüler polisakaridin muhafaza edilmesi ve çözülebilir proteinin etkin sekilde azaltilmasi.

2. Istem l°e ait proses olup burada seçilen S. pneumoniae serotipi, l,

3. Istem l°e ait proses olup burada adim (a)°daki pH, sodyum hidroksid, sodyum karbonat veya bunlarin bir kombinasyonundan olusan bir haz beslemesiyle muhafaza edilir.

4. Istem l,e göre bir proses olup proses, su adimlari içerir: (a) soya bazli bir ortamda serotip l, 4, 6A, 6B ve 7F°nin olusturdugu gruptan seçilen bir S. pneumoniae serotipinin bir baslangiç kabindan üretim ölçeginde bir kaba artan hacimlerde büyütülmesi ve hücre büyümesi sirasinda stabil bir pH ve sicakligin inuhafaza edilmesi; pH, sodyum hidroksid ile muhafaza edilir; (b) adim (a)”da üretilen bakteri hücrelerinin bir deterjan ile lizlenmesi, böylelikle çözülebilir proteinler, hücre döküntüsü, nükleik asitler ve polisakarid ihtiva eden bir lisat üretilmesi; (c) hücre lisatmin, tam liziz ve polisakarid salimi saglamak için yeterli bir süre çalkalanmasi; (d) hücre lisatinin pH”sinin, 5.5”in altina düsürülinesiyle deterjanin ve çözülebilir proteinlerin çogunun çökeltilerek çikarilmasi; (e) adim (d)'de olusturulan çözeltinin ve çökeltinin, çökeltinin oturmasina olanak saglamak için yeterli bir süre çalkalaninadan tutulmasi; ve (f) çözeltinin ve çökeltinin, santriiüjleme ve/Veya filtreleme yoluyla islenmesi, bu suretle çözelti halinde kapsüler polisakaridin muhafaza edilmesi ve çözülebilir proteinin etkin sekilde azaltilmasi.

5. Istem l”e göre bir proses olup proses, su adimlari içerir: (a) sodyum bikarbonat ile desteklenen soya bazli bir ortamda S. pneumoniae serotipi 5sin bir baslangiç kabindan üretim ölçeginde bir kaba artan hacimlerde büyütülmesi ve hücre büyümesi sirasinda stabil bir pH ve sicakligin muhafaza edilmesi; pH, sodyum hidroksid ile muhafaza edilir; (b) adim (a)”da üretilen bakteri hücreleriiiin bir deterjan ile lizlenmesi, böylelikle çözülebilir proteinler, hücre döküntüsü, nükleik asitler ve polisakarid ihtiva eden bir lisat üretilmesi; (c) hücre lisatiiiin, tam liziz ve polisakarid salimi saglamak için yeterli bir süre çalkalaiimasi; (d) hücre lisatinin pH'sinin, 5.5”in altina düsürülmesiyle deterjanin ve çözülebilir proteinlerin çogunun çökeltilerek çikarilmasi; (e) adim (d)°de olusturulan çözeltinin ve çökeltinin, çökeltinin oturrnasiiia olanak saglamak için yeterli bir süre çalkalanmadan tutulmasi; ve (f) çözeltinin ve çökeltinin, santrifüjleme ve/Veya filtreleme yoluyla islenmesi, bu suretle çözelti halinde kapsüler polisakaridin muhafaza edilmesi ve çözülebilir proteinin etkin sekilde azaltilmasi.

6. Istem l”e göre bir proses olup proses, su adimlari içerir: (a) sodyum bikarbonat ile desteklenen soya bazli bir ortamda S. pneumoniae serotipi 19A”nin bir baslangiç kabindan üretim ölçeginde bir kaba artaii hacimlerde büyütülmesi ve hücre büyümesi sirasinda stabil bir pH ve sicakligin muhafaza edilmesi; pH, sodyum karbonat ile muhafaza edilir; (b) adim (a)'da üretilen bakteri hücrelerinin bir deterjan ile lizlenmesi, böylelikle çözülebilir proteinler, hücre döküntüsü, nükleik asitler ve polisakarid ihtiva eden bir lisat üretilmesi; (c) hücre lisatinin, tam liziz ve polisakarid salimi saglamak için yeterli bir süre çalkalanmasi; (d) hücre lisatiiiin pH°sinin, 5.5”in altina düsürülmesiyle deterjanin ve çözülebilir proteinlerin çogunun çökeltilerek çikarilmasi; (e) adim (d)°de olusturulan çözeltinin ve çökeltinin, çökeltinin oturmasina olanak saglamak için yeterli bir süre çalkalanmadan tutulmasi; ve (f) çözeltinin ve çökeltinin, santrifûjleme ve/veya filtreleme yoluyla islenmesi, bu suretle çözelti halinde kapsüler polisakaridin muhafaza edilmesi ve çözülebilir proteinin etkin sekilde azaltilmasi.

7. Istem 1, istem 4, istem 5 veya istem 6°dan herhangi birine ait proses olup burada deterjan, deoksikolat sodyumdur.

8. Istem 1, istem 4, istem 5 veya istem 6”dan herhangi birine ait proses olup burada adim (d)°de pH, 4.5 ile 5.5”ten az arasina düsürülür.