TARIFNAME PCV/MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE KOMBINASYON ASISI Bulusun Teknik Alani Mevcut bulus, domuz sirkovirüsü ve Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae veya M.hy0) ile ilgilidir. Daha özellikle bulus, bir Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) kültürünün süpernatanini ve bir domuz sirkovirüsü tip 2 (PCVZ) antijeni içeren multivalent bir immünojenik kompozisyon, ki burada M. hyo kültürünün süpernatani, çözülmeyen hücresel materyalden santrifujleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmistir ve hem (i) IgG hem de (ii) immünoglobuline bagli antijenden olusan immünokomplekslerden muaftir; ve bunun, domuzlarin enzootik pnömoni ve Sütten kesilme sonrasi Multisistemik Tükenme Sendromuna (PMWS) karsi korunmasina yönelik bir asi içinde kullanilmasi ile ilgilidir. Bulusun Alt Yapisi Domuzlarda, mikoplazmal pnömoni adiyla da bilinen enzootik pnömoniye, M.hy0. neden olur. Hastalik, her yastan domuzlari etkileyen kronik, fatal olmayan bir hastaliktir. Enfekte domuzlar, sadece hafif öksürük ve ates semptomlari gösterir ancak hastaligin, yem verimliliginin azalmasi ve kilo alimiiiin azalmasindan dolayi anlamli bir ekonomik etkisi vardir. Enzootik pnömoni, enfekte domuzlarin akcigerlerinden atilan havadaki organizmalar tarafindan domuzdan domuza nazal geçitler vasitasiyla iletilir. M.hyo tarafindan primer enfeksiyonu, diger mikoplazma türleri (Mycoplasina hyorhinis ve Mycoplasma flocculare) ve ayrica diger bakteriyel patojenler tarafindan sekonder enfeksiyon takip edebilir. M.hyo, mutlak eksogen steroller ve yagli asitlere gereksinimleri oldugundan siklikla ökaryotik hücrelerle birlikte bulunmasina ragmen serbest yasam sürdürebilen küçük, prokaryotik bir mikroptur. Bu gereksinimler genellikle serum ihtiva eden ortamlarda büyümeyi gerektirir. M.hyo, bir hücre membrani tarafindan baglanir, bir hücre çeperi tarafindan degil. Mikoplazmalarin konakçi hücre yüzeyi ile fiziksel iliskisi, enzootik pnömoninin gelismesi ve kaliciligi için temel teskil eder. M.hyo, domuzlarin solunum sistemini, trake, bronslar ve bronkiolleri kolonize etmek suretiyle enfekte eder. Mikoplazma, solunum geçitlerini kaplayan kirpiklerin atinayi durdurmasina neden olan bir siliostatik faktör üretir. Sonunda kirpikler dejenere olarak domuzun sekonder patojenlerin neden oldugu enfeksiyona yatkin hale gelmesine neden olur. Enfekte hayvanlarda karakteristik mor ila gri konsolidasyon bölgeleri lezyonlari gözlemlenir. Kesilen hayvanlarla yapilan arastirmalar, domuzlarin % 30 ila % 80°inde lezyonlar ortaya çikardi. 13 eyaletteki 37 sürüden elde edilen sonuçlar, sürülerin % 99'unda, enzootik pnömoniye 'Özgü pnömoni lezyonlarina sahip domuzlar oldugunu göstermistir. Bu nedenle, etkili önleyici ve tedavi tedbirlerine olan ihtiyaç büyüktür. Tiamulin, trimetoprim, tetrasiklinler ve linkoinisin gibi antibiyotikler bazi yararlara sahiptir, ancak pahalidir ve uzun süreli kullaniin gerektirir. Ek olarak, antibiyotiklerin M.hyo'nun yayilmasini veya tekrar enfeksiyonunu etkin bir sekilde ortadan kaldirdigi gösterilmemistir. Patojen içermeyen sürüleri koruyarak `Önleme bazen mümkündür, ancak siklikla tekrar M.hy0 girisi olur. Domuz pnömonisinin ciddi ekonomik sonuçlari oldugundan M.hy0'ya karsi asilar aranmaktadir. Serum içeren ortamda yetistirilen mik0plazmal organizmalarin preparasyonlarini ihtiva eden asilarin satisi yapilmaktadir ancak immünize edici inateryalde bulunan serum bilesenlerinin (immünokompleksler veya immünojenik olmayan spesifik proteinler gibi) indükledigi olumsuz reaksiyonlarla ilgili endiseler artmaktadir. M. hyo asilari saglamada diger girisimler basarili olmustur, ancak hastalik yayginlasmaktadir. Bir M.hy0 kültürünün süpematanina dayanan bir asi, Okada M. et al., 2000, Vaccine, 18: 2825-2831"de açiklanmistir. WO 2009/126356, M. Hy0"dan"dan antijenler ve PCVZ içeren multivalent kompozisyonlari açiklar. Bir örnek, domuz yavrularinin, su üç asinin bir karisimindan tek bir doz ile asilaninasini gösterir: lngelvac® MycoFLEXTM, 1ngelvac® PRRS MLVTM ve lngelvac® CircoFlexTM. M.hyo ve domuz sitkovirüsü tip 2 (PCVZ), domuz endüstrisinde karsilasilan en yaygin iki patojendir. PCVZ ile enfekte olan domuzlar, yaygin sekilde Sütten kesilme sonrasi Multisistemik Tükenme Sendromu (PMWS) olarak anilan bir sendrom gösterir. PMWS klinik olarak tükenme, cilt soluklugu, huzursuzluk, solunum sikintisi, ishal, ikterus ve sarilik ile karakterize edilir. PMWS'ye ek olarak PCV2, psödorabiler, domuz üreine ve solunum sendromu (PRRS), Glasser hastaligi, streptokok menenjit, salmonelloz, sütten kesme sonrasi kolibasilloz, diyetetik hepatoz ve süpüratif bronkopnömoni dahil olmak üzere birçok baska enfeksiyonla da iliskilendirilmistir. M.hyo, enzootik pnömoni ile iliskilidir ve ayrica, Domuz Sirkovirsü ile Iliskili Hastalik (PCVAD) gelisiminde ana kofaktörlerden biri olarak da gösterilmistir. Domuz üreme ve solunum sendromuna (PRRS), özellikle akcigerde bulunaii inakrofajlar (alveolar makrofajlar) için özel bir afiniteye sahip olan bir arterivirüs neden olur. Bu inakrofajlar, istilaci bakteri ve virüsleri alir ve yok eder, fakat PRRS virüsünün (PRRSV) durumunda degil. PRRS virüsünün durumunda bu, makrofajlar içinde çogalarak daha fazla virüs üretir ve makrofajlari öldürür. PRRSV bir sürüye girdiginde süresiz olarak mevcut ve aktif kalmaya nieyillidir. Makrofajlarin %40 kadari yok edilir ki bu durum, bakterilerin ve diger virüslerin çogalmasina ve hasar vermesine olanak saglar. Bunun yaygin bir örnegi, PRRS virüsü ile enfekte olduklarinda üretici/sonlandirici birimlerindeki enzootik pnömoninin siddetinde gözle görülen artistir. Sütten kesme yasindaki PRRS virüsü negatif domuzlarin yarisindan fazlasi, pazara gitmeden önce enfekte olur. Gerekli olan, domuzlarda hem PCV2 hem de mikoplazma enfeksiyonuna karsi bir PCV2/M.hyo kombinasyon asisidir. Tercihen bu multivalent asi, PRRS virüsü anti jeni gibi diger domuz anti jenleri ile uyumlu olacaktir. Tek sise içinde tek doz kullanima hazir bir PCV2/M.hyo kombinasyon asisi temin edilmesi yüksek düzeyde arzu edilir. Bulusun Ozeti Mevcut bulus, bir Mycoplasma hyopneumoniae (M.hy0) kültürünün süpematanini ve bir domuz sirkovirüsü tip 2 (PCV2) anti jeni içeren multivalent bir iinmünojenik koinpozisyon saglar, ki burada M. hyo kültürünün süpernatani, çözülmeyen hücresel materyalden santrifüjleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmistir ve hem (i) IgG hem de (ii) immünoglobuline bagli antijenden olusan immünokomplekslerden muaftir. Bir yönde M.hyo tam hücre preparasyonunun çözülebilir bölümü, immünojenik kompozisyona ilave edilmeden önce protein-A veya protein-G ile isleme tabi tutulmustur. Bir baska yönde kompozisyon, kullanima hazir bir sivi kompozisyon seklindedir. M.hyo preparasyonu, M.hyo protein anti jenleri içerir. Bazi düzeneklerde mevcut bulusa ait kompozisyon, M.hy0 ve PCV2sye karsi koruyucu bir immün yanit ortaya çikarir. Bir düzenekte PCV2 anti jeni, bir kimerik tip-l-tip 2 sirkovirüsü seklindedir; kimerik Virüs, domuz sirkovirüsü tip 2 ORF2 proteinini eksprese eden eylemsizlestirilmis bir rekombinant domuz sirkovirüsü tip 1 içerir. Bir baska düzenekte PCV2 anti jeni, bir rekombinant ORF2 proteini seklindedir. Yine bir baska düzenekte rekombinant ORF2 proteini, bir bakülovirüs vektöründen eksprese edilir. Bazi düzeneklerde mevcut bulusa ait PCV2/M.hyo kompozisyonu ayrica en az bir ilave anti jen de içerir. Bir düzenekte en az bir ilave antijen, doinuzlarda hastaliga neden olabilen bir mikroorganizmaya karsi koruyucudur. Bir düzenekte mikroorganizma, bakterileri, virüsleri veya protozoanlari kapsar. Bir baska düzenekte mikroorganizma, bunlarla sinirli olmaksizin, asagidakiler arasindan seçilir: doinuz üreme ve solunum sendromu virüsü (PRRSV), domuz parvovirüs'u (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcuin suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplaina hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, leptospira bacteria, Lawsonia intracellularis, domuz influenza Virüsü (SIV), Escherichia coli antijeni, Brachyspira hyodysenteriae, domuz solunum koronavirüsü, Domuz Epidemik Ishal (PED) virüsü, rotavirüsü, Torque teno virüsü (TTV), Domuz Sitomegalovirüs'û, Domuz enterovir'ûsleri, Ensefalomiyokardit Virüsü, Klasik Domuz atesi (CSF) olan Aujesky's Hastaligina neden olan bir patojen ve Bulasici Domuz Gastroenteritine neden olan bir patojen veya bunlarin kombinasyonlari. Bazi düzeneklerde mevcut bulusa ait kompozisyon, bir adjuvan da içerir. Bir düzenekte ad juvan, bunlarla sinirli olmaksizin, asagidakiler arasindan seçilir: bir su içinde yag adjuvani, bir polimer ve su adjuvani, bir yag içinde su adjuvani, bir alüminyum hidroksit adjuvani, bir E Vitamini adjuvani ve bunlarin kombinasyonlari. Bir baska düzenekte mevcut bulusa ait kompozisyon, farmas'otik olarak kabul edilebilir bir tasiyici da içerir. Belirli düzeneklerde mevcut bulusa ait kompozisyon, tek bir doz uygulama halinde uygulandigi durumda hein M.hyo hem de PCV2"ye karsi koruyucu bir immün yanit ortaya çikarir. Baska düzeneklerde kompozisyon, tek bir doz uygulama halinde uygulandigi durumda M.hyo, PCV2 ve domuzlarda hastaliga neden olabilen en az bir ilave mikroorganizmaya karsi koruyucu bir immün yanit ortaya çikarir. Yine baska düzeneklerde mevcut bulusa ait bir kompozisyon, iki dozlu bir uygulama halinde uygulandigi durumda hem M.hyo hem de PCV2sye karsi koruyucu bir yanit ortaya çikarir. Mevcut bulus ayrica bir domuzun M.hyo ve PCV2"ye karsi immünize edilmesine yönelik bir yöntem de saglar. Bu yöntem, domuza, bir Mycoplasina hyopneuinoniae (M.hyo) kültürünün süpernatanini ve bir domuz sirkovirüsü tip 2 (PCV2) antijeni içeren multivalent bir immünojenik kompozisyonun uygulanmasini kapsar ki burada M. hyo kültürünün süpematani, çözülmeyen hücresel inateryalden santritüjleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmistir ve hem (i) IgG hem de (ii) immünoglobuline bagli antijendcn olusan immünokomplekslerden muaftir. Uygulanan koinpozisyonun M.hyo preparasyonunun çözülebilir bölümünde M.hyo protein antijenleri vardir. Mevcut bulusa ait yöntemin bir düzenegindc kompozisyon, intramüsküler, intradermal, transdermal veya subkütan yoldan uygulanir. Bu bulusa ait yöntemin bir baska düzeneginde kompozisyon, tek doz uygulanir. Bu bulusa ait yöntemin yine bir baska düzeneginde kompozisyon, iki doz halinde uygulanir. Mevcut bulusa ait yöntemin bir baska düzeneginde PCVZ/Mhyo kompozisyonu, domuzlarda hastaliga neden olabilen bir mikroorganizmaya, örn., yukarida tarif edilen mikroorganizmalardan birine veya daha fazlasina karsi koruyucu en az bir ilave anti jen ile birlikte uygulanir. Bu tür diger anti jenler, PCVZ/Mhyo kompozisyonu ile es zamanli olarak (yani ayri ayri tekli asilar halinde) veya kullanima hazir bir asi halinde birlestirilmis olarak verilebilir. Bir baska düzenekte kompozisyon, anne türevli antikorlari olan domuzlara domuzlara, M.hy0 ve PCV2°den en az birine karsi uygulanir. Yine bir baska düzenekte kompozisyon, anne türevli antikorlari olan doinuzlara domuzlara, hem M.hyo hem de PCV2"ye karsi uygulanir. Bir düzenekte kompozisyon, 3 haftalik veya daha büyük domuzlara uygulanir. Mevcut bulus ayrica bir kit de saglar. Kit, bir immünojenik kompozisyon içeren bir sise ihtiva eder. Bu iinmünojenik kompozisyon, hem bir PCVZ antijeni hem de bir Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo) kültürünün süpernatanini içerir ki burada M. hyo kültürünün süpernatani, çözülmeyen hücresel materyalden santrifujleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmistir ve hem (i) IgG hem de (ii) antijen/immünoglobulin immünokomplekslerinden muaftir. Bir düzenekte kit ayrica immünojenik kompozisyonun uygulanmasiyla ilgili bilgiler ihtiva edeii bir talimat kilavuzu da içerir. Bir baska düzenekte sise içinde immünojenik kompozisyon, kullanima hazir bir sivi kompozisyon halinde temin edilir. Ek olarak mevcut bulus, bir immünojenik kompozisyon hazirlama yöntemi de saglar. Bu yöntem, sunlari kapsar: i) M.hyo"nun, uygun bir ortamda 18-144 saat araligindaki süreler zarfinda kültürlenmesi; ii) müteakiben M.hy0 kültürünün eylemsizlestirilmesi; iii) eylemsizlestirilmis kültür sivisinin hasat edilmesi ki burada eylemsizlestirilmis kültür sivisi, hem çözülebilir bir sivi fraksiyonu hem de çözülmeyen hücresel inateryal içerir; iV) çözülebilir sivi fraksiyonunun çözülmeyen hücresel inateryalden santrifujleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmasi; V) ayrilinis olan çözülebilir sivi fraksiyonundan hem lgG hem de antijen/immünoglobülin immünokomplekslerinin 'Önemli ölçüde giderilmesiyle hem (i) IgG hem de (ii) immünoglobüline bagli anti jenden olusan immünokomplekslerden muaf M.hy0 kültür süpernatani olusturulmasi; ve vi) müteakiben süpernatanin bir PCV2 anti jeni ile birlestirilmesi. Cizimlerin Kisa Tarifi Sekil 1, farkli islemlerden (Ornek 3°te tarif edilen TOZ-TIO) M.hyo anti jenleri ile hazirlanmis M.hy0 monovalent asilarinin etkinligini, bir plaseboya (TOl) karsi gösteren bir grafiktir. Sonuçlar, % Akciger Lezyonu En küçük Kare Ortalama degerleri olarak sunulur. Sekil 2, M.hy0 asilarinin, öldürülmüs PCV Tip l-Tip 2 kimerik Virüsü ile kombinasyon halinde PCV2 anti jen potansi sonuçlarinini (PCV2 antijeni ELISA) gösteren bir grafiktir. Kimerik Virüs, kompozisyonlara, yaklasik 1.65 RP°lik bir baslangiç seviyesinde dahil edildi. Her bir `Örnegin durumu, nispi potans (RP) olarak ifade edilir. Sekil 3 , farkli adjuvan platformlari kullanilan PCV/M.hyo asi formülasyonlari ile gözlemlenen PCV2 Viremi sonuçlarini (PCV2 Kantitatif PCR) gösteren bir grafiktir. Sekil 4 , l, 20 ve 42nci tehdit günlerinde farkli adjuvan platformlari kullanilan PCV/M.hy0 asi formülasyonlari ile gözlemlenen PCV2 antikoru ELISA (S/P) serolojik sonuçlarini gösteren bir grafiktir. Sekil 5, Ornek 7°de tarif edilen TOZ-TO4 islemleri ile elde edilen PCV2 diski atigini bir plaseboya (T01) karsi gösteren bir grafiktir. Sonuçlar, ml basina PCV2 DNA kopyalari seklinde ifade edilir. Sekil 6, Örnek 7'de tarif edilen T02-T04 islemleri ile elde edilen PCV2 nazal atigi, plaseboya (T01) karsi gösteren bir grafiktir. Sonuçlar, ml basina PCV2 DNA kopyalari seklinde ifade edilir. Sekil 7 (A ve B), PCVZ'ye özel hücre aracili iminün (CMI) yanitlari ölçen bir interferon-gamma (IFN-y) testinin sonuçlarini gösteren grafiklerdir. Asilama sonrasi/tehdit öncesi sonuçlar, Sekil 7A7da sunulinustur ve asilama sonrasi/tehdit sonrasi sonuçlar, Sekil 7B"de sunulmustur. 5 x 106 hücrenin uyarilmasi, anlamli sayildi. Sekil 8, SP-yagi içinde PCV2/M.hy0 deneysel asi formülasyonlarinin M.hyo etkinligini gösterir. M.hyo tedavileri T02-TO8 kullanilan formülasyonlara karsilik bir plasebo (T01) için akciger skorlari, Sekil 8A"da grafikle gösterilmistir. Sekil SB"deki tablo, TOZ-TOS tedavilerinin plasebo ile kontrastini gösterir. Sekil 9, PCV2 uyumlu Protein A ile isleme tabi tutulmus M.hyo anti jeni hazirlamak için kullanilan bir üretim prosesinin bir düzenegini gösteren bir akis semasidir. Sekil 10, PRRS virüsüne karsi virüsidal aktivite için adjuvan degerlendirmesini gösteren bir tablodur. Sekanslarin Kisa Tarifi SEK.KIM.NO: l, M.hy0°nun P-5722 susundan p46'y1 sifreleyen bir nükleotit sekansmin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 2, M.hy0°nun P-5722 susundan p46°ya karsilik gelen bir amino asit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 3, M.hyo°nun P-5722 susundan p97"y1 sifreleyen bir nükleotit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 4, M.hy0"nun P-5722 susundan p97°ya karsilik gelen bir amino asit sekansmin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 5, bir kimerik PCV1-2 Virüsünü sifreleyen bir genomik sekansm bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 6, bir domuz sirkovir'usüne ait ORFZ'ye karsilik gelen bir nükleotit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 7, bir domuz sirkovirüsüne ait ORF2 polipeptidine karsilik gelen bir amino asit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 8, bir kimerik PCV1-2 Virüsünü sifreleyen bir genomik sekansm bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 9, bir domuz sirkovirüsüne ait ORF2°ye karsilik gelen bir nükleotit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 10, bir domuz sirkovirüsüne ait ORF2 polipeptidine karsilik gelen bir amino asit sekansinm bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 11, bir domuz sirkovirüsüne ait ORF2 polipeptidine karsilik gelen bir amino asit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 12, SEK.KIM.NO: ll"e ait amino asit sekansini sifreyelen bir nükleotit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 13, bir domuz sirkovirüsüne ait ORF2 polipeptidine karsilik gelen bir amino asit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 14, SEK.KIM.NO: 13°e ait amino asit sekansini sifreyelen bir nükleotit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 15, bir domuz sirkovirüsüne ait ORF2 polipeptidine karsilik gelen bir ainino asit sekansinin bir düzenegidir; SEK.KIM.NO: 16, P129 adli Kuzey Amerikali PRRS Virüsü izolatinin Virülan olmayan bir fomunun bir genomik sekansinin bir düzenegidir ve SEK.KIM.NO: 17, ISU-55 adli PRRS Virüsü izolatina ait ORF2 ila ORF5,e karsilik gelen bir nükleotit sekansinin bir düzenegidir. SEK.KIM.NO: 18, ISU-55 adli PRRS Virüsü izolatina ait ORF6 ve ORF7iye karsilik gelen bir nükleotit sekansinin bir düzenegidir. Bulusun Detayli Tarifi Mevcut bulus, bir Mycoplasma hyopneuinoniae (Mhyo) kültürünün süpernatanini ve bir domuz sirkovirüsü tip 2 (PCV2) anti jeni içeren multivalent bir immünojenik koinpozisyon saglar, ki burada M. hyo kültürünün süpematani, çözülmeyen hücresel inateryalden santriiüjleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmistir ve hem (i) IgG hem de (ii) immünoglobuline bagli antijenden olusan immünokomplekslerden muaftir. Bir düzenekte kompozisyon, bir doinuzda hem PCV2 hem de M.hy0.°ya karsi koruyucu bir immün yanit ortaya çikarir. Basvuru sahipleri sasirtici sekilde Mhyo tam hücre preparasyonunun çözülmeyen fraksiyonunun immünojenik olmadigini kesfetmistir. Buna karsilik lgG°siz M.hyo çözülebilir preparasyonu, immünojeniktir ve anti jenler arasinda analitik veya immünolojik bir müdahale olmaksizin PCV2 gibi baska patojenlerden antijenler ile etkili sekilde birlestirilebilir. Bu, M.hy0 çözülebilir preparasyonunu, tek sise, kullanima hazir formülasyonlar dahil olmak üzere bu bulusa ait multivalent asilar için etkili bir platform haline getirir. Basvuru sahipler ayrica sasirtici sekilde M.hyo preparasyonundan immünoglobülin ve çözülmeyen hücre döküntülerinin çikarilmasinin, immünojenik kompozisyonun güvenligi arttirdigini da kesfetmistir. Spesifikasyonda ve istenilerde kullanildigi gibi "bir" "bir" ve "bu" tekil formlari, baglamda açikça aksi belirtilmedikçe çogul göndermeleri de kapsar. Örnegin, "bir protein antijeni" terimi, karisimlari dahil olmak üzere çok sayida hücreyi kapsar. Burada kullanildigi gibi "içeren" teriminin, kompozisyonlarin ve yöntemlerin, belirtilen elementleri içermesi ancak diger elementleri disarida birakmamasi anlamina gelmesi amaçlanir. Burada tanimlandigi gibi bir M.hyo tam hücre preparasyonunun çözülebilir bölümü, bir Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kültürünün süpematanina karsilik gelir ki burada M. hyo kültürünün süpernatam, çözülmeyen hücresel materyalden santritüjleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmistir ve hem (i) IgG hem de (ii) immünoglobuline bagli anti jenden olusan immünokomplekslerden muaftir. Süpematan fraksiyonu, çözülmeyen proteinlerden, tam bakterilerden ve diger çözülmeyen M.hy0 hücresel materyalinden klasik santrifüjleme, filtrasyon veya çökeltme yöntemleriyle ayrilmis veya izole edilmis olan M.hyo°nun eksprese ettigi çözülebilir proteinleri (Mhyo protein antijenleri) kapsar. M.hyo°ya 'Özel çözülebilir proteinleri içermesine ek olarak M.hyo tam hücre preparasyonunun çözülebilir bölümü, heterolog proteinler, örn., M.hyo fermantasyonu için kullanilan kültür ortaminda yer alanlari da içerir. "Antijen" terimi, bir hayvanda antikor üretimini veya bir T hücresi tepkisini veya her ikisini de uyarabilen bir bilesik, koinpozisyon veya immünojenik maddeye, örnegin bir hayvana enjekte edilen veya absorbe edilen kompozisyonlara karsilik gelir. Iminün yanit, tam molekül için veya molekülün bir bölümü (örn. bir epitop veya hapten) için üretilebilir. Burada tanimlandigi gibi bir "immünojenik veya immünolojik kompozisyon", konakçida, ilgili kompozisyon veya asiya hücresel veya antikor aracili bir immün yaniti içeren bir iminünolojik tepki ortaya çikaran en az bir antijen içeren bir madde koinpozisyonuna karsilik gelir. Burada kullanildigi gibi "immün yanit", bir hayvanda ortaya çikan bir tepkiye karsilik gelir. Bir iininün yanit, hücresel immünite (CMI), humoral immüniteye karsilik gelebilir veya her ikisini de kapsayabilir. Mevcut bulus ayrica iinmün sistemin bir kismi ile sinirli bir tepkiyi de konu eder. Genellikle bir "immünolojik tepki", bunlarla sinirli olmaksizin, asagidaki etkilerden birini veya daha fazlasini kapsar: ilgili kompozisyon veya asi içerisinde yer alan bir antijene veya antijenlere spesifik olarak yönlendirilmis, antikorlar, B hücreleri, yardiinci T hücreleri, baskilayici T hücreleri ve/Veya sitotoksik T hücreleri ve/Veya yd T hücrelerinin üretilmesi veya aktiflestirilmesi. Tercihen konakçi, bir terapötik yada koruyucu immünolojik tepkiyi, yeni enfeksiyona karsi direnç artacak ve/ hastaligin klinik ciddiyeti azalacak sekilde sergileyecektir. Bu tür bir koruma, enfekte bir konakçinin norinal olarak gösterdigi semptomlarda bir azalma yada bunlarin ortadan kalkmasi, daha çabuk bir geri kazaniin süresi ve/veya enfekte konakçida viral titerin düsmesiyle gösterilecektir. Burada kullanildigi gibi "immünojenisite", bir konakçi hayvanda bir anti jen veya anti jenlere karsi bir iminün yanit üretilebilmesi anlamina gelir. Immün yanit, bir asinin spesifik enfeksiyöz bir organizmaya karsi ortaya çikardigi koruyucu immünitenin temelini olusturur. Burada kullanildigi gibi bir "adjuvan", anti jen(ler)e karsi bir iminün yaniti güçlendiren bir veya daha fazla maddeden olusan bir kompozisyon anlamina gelir. Bir adjuvanin çalisma mekanizmasi tam anlainiyla bilinmemektedir. Bazi adjuvanlarin, anti jen saliinini yavaslatmak suretiyle immün yaniti güçleiidirdigine inanilirken diger adjuvanlar, kendi baslarina kuvvetli sekilde immünojeniktir ve bunlarin sinerjistik olarak fonksiyon gösterdigine inanilir. Burada kullanildigi gibi "multivalent", ister ayni türden (yani Mycoplasina hyopneumoniaeîiin farkli izolatlari), ister farkli bir türden (yani hem Pasteurella hemolytica hem de Pasteurella inultocida°dan izolatlar) olsun birden fazla anti jen ihtiva eden bir asi veya farkli türlerden anti jenlerin bir kombinasyonunu ihtiva eden bir asi (ömegin Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus soinnus ve Clostridium,dan antijenler içeren bir asi) anlamina gelir. Burada kullanildigi gibi "domuz" veya "domuz yavrusu", domuz menseli bir hayvan anlamina gelirken "disi domuz", üreme yasi ve kapasitesinde bir disiye karsilik gelir. Bir "genç disi domuz", hiç hamile kalmamis bir disi domuzdur. Burada kullanildigi gibi "virülan" terimi, bir hayvan konakçida enfeksiyöz olma yetisini koruyan bir izolat anlamina gelir. "Eylemsizlestirilmis asi", artik replikasyon veya büyüme yapamayan bir enfeksiyöz organizma veya patojen ihtiva eden bir asi kompozisyonu anlamina gelir. Patojen, bakteriyel, Viral, protozoal veya fungal menseli olabilir. Eylemsizlestirme, dondurma-eritme, kimyasal islem (örnegin timerosal veya formalin ile islem), sonikleme, isin verme, isi veya immünojenisitesi korunurken organizmanin replikasyonunu veya büyümesini engellemek için yeterli diger konvansiyon vasitalari dahil olinak üzere çesitli yöntemlerle yapilabilir. Burada kullanildigi gibi "varyant" terimi, ilgili polipeptidin, vahsi tip polipeptit ile kiyaslandigi durumda öneinli ölçüde denk bir fonksiyona sahip olmasi için bir veya daha fazla konzervatif amino asit varyasyonu veya baska küçük modifikasyonlarm oldugu bir polipeptide veya polipeptidi sifreleyen bir nükleik asit sekansina karsilik gelir. "Konzervatif varyasyon", bir amino asit tortusunun biyolojik açidan benzer bir baska tortu ile degistirilmesini veya bir nükleik asit sekansi içerisindeki bir nükleotidin, sifrelenmis amino asit tortusu degismeyecek veya biyolojik açidan benzer bir baska tortu olacak sekilde yerinden çikarilmasini isaret eder. Konzervatif varyasyonlarin 'Örnekleri arasinda, bir hidrofobik tortu yerine bir baska hidrofobik tortu, örn., izolösin, valin, lösin veya metiyonin konulinasi ve lisin yerine arginin, aspartik asit yerine glutainik asit veya asparagin yerine glutamin ve benzeri gibi bir polar tortu ikamesi yer alir. "Konzerveatif varyasyon" terimi ayrica ikame edilmemis bir ana amino asit yerine ikame edilmis bir amino asidin, ikame edilmis polipeptide karsi yükselen antikorlarin, ikame edilmemis polipeptit ile de immünoreaksiyona girniesi sartiyla kullanilmasini kapsar. Burada kullanildigi gibi "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici" ve "farmasötik olarak kabul edilebilir araç" terimleri, dönüsümlü olarak kullanilir ve olumsuz etkiler olmaksizin bir konakçiya enjekte edilebilen asi anti jenlerini ihtiva edecek bir sivi araca karsilik gelir. Bu konuda bilinen farmasötik olarak kabul edilebilir uygun tasiyicilar arasinda, bunlarla sinirli olmaksizin, steril su, tuz, glukoz, dekstrozveya tamponlu çözeltiler yer alir. Tasiyicilar arasinda örnegin ve bunlarla sinirli olmaksizin, seyrelticiler, stabilzerler (yani sekerler ve ainino asitler), prezervatifler, islatici ajanlar, emülsife edici ajanlar, pH tamponlama ajanlari, Viskozite arttirici katki maddeleri, renkler ve benzerleri gibi yardimci ajanlar yer alabilir. Burada kullanildigi gibi "asi kompozisyonu" terimi, bir konakçida bir immün yanit indüklenmesinde faydali farmasötik olarak kabul edilebilir bir araç içinde en az bir anti jen veya immünojeni kapsar. Asi kompozisyonlari, tip veya veterinerlik konularinda uzman kisilerce iyi bilinen dozajlarda ve tekniklerle, alici hayvanin yasi, cinsiyeti, agirligi, türü ve duruinu ve uygulama yolu göz önünde bulundurularak uygulanabilir. Uygulama yolu, perk'ûtan, mukozal uygulama ('orn., oral, nazal, anal, vajinal) vasitasiyla veya bir parenteral yol ((intradermal, transdermal, intramüsküler, subkütan, intravenöz veya intraperitonel) vasitasiyla olabilir. Asi kompozisyonu, tek basina uygulanabilir veya diger tedaviler veya terapiler ile birlikte uygulanabilir veya sirayla uygulanabilir. Uygulama formlari arasinda sü5pansiyonlar, suruplar veya iksirler ve parenteral, subkütan, intradermal, intramüsküler veya intravenöz uygulama (örn., enjekte edilebilir uygulama) için preparasyonlar, örn., steril süspansiyonlar veya em'ûlsiyonlar yer alabilir. Asi kompozisyonlari, bir sprey halinde veya yem ve/veya suya karistirilinis olarak uygulanabilir veya uygun bir tasiyici, seyreltici veya eksipiyan, örn., steril su, fizyolojik tuz, glukoz veya benzeri ile karisim halinde verilebilir. Kompozisyonlar, uygulama yoluna ve arzu edilen preparasyona bagli olarak islatici veya emülsife edici ajanlar, pH tamponlama ajanlari, adjuvanlar, jellestirici veya Viskozite arttirici katki maddeleri, prezervatifler, aroma ajanlari, renkler ve benzerleri gibi yardimci maddeler ihtiva edebilir. Gereksiz deneyler yapilmadan uygun preparasyonlar hazirlamak için "Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990 gibi standar farmasötik metinlere basvurulabilir. "Kuzey Amerikali PRRS virüsü", genetik karakteristikleri, bir Kuzey Amerikali PRRS virüsü izolati, `Örnegin ve bunlarla sinirli olmaksizin, ilk olarak l990"1arin baslarinda Birlesik Devletlerde izole edilmis olan PRRS Virüsü (bakiniz, örnegin Collins, J. E. ve arkadaslari, 1992, I. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); Kuzey Amerikali PRRS virüsü izolati MN-lb (Kwang, .1. ve arkadaslari, 1994, .1. Vet. Diagn. Invest. 62293- 296); PRRS virüsünün Quebec LAF-exp9l susu (Mardassi, H. ve arkadaslari, 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418); ve Kuzey Ainerikai PRRS Virüsü izolati VR 2385 (Meng, X.-J ve arkadaslari, 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801) ile iliskili herhangi bir PRRS Virüsü anlamina gelir. Kuzey Ainerikali PRRS Virüsü suslarinin ilave örnekleri, burada açiklanmistir. Genetik karakteristikler, Kuzey Amerikali PRRS Virüsü suslarinin paylastigi genomik nükleotit sekansi benzerligine ve amino asit sekansi benzerligine karsilik gelir. Çinli PRRS Virüsü suslari genellikle Kuzey Ainerikali suslari ile yaklasik %80-93 nükleotit sekansi benzerligi olduguna kanittir. "Avrupali PRRS Virüsü", genetik karakteristikleri, ilk olarak 1991 civarinda Avrupa"da izole edilmis olan PRRS Virüsü ile iliskili olan herhangi bir PRRS Virüsü susuna karsilik gelir (bakiniz, örnegin Wensvoort, G. ve arkadaslari, 1991, Vet. Q. 13:121-130). "Avrupali PRRS Virüsü" bu konuda bazen "Lelystad Virüsü" olarak da anilir. Avrupali PRRS virüsünün baska `ornekleri, burada açiklanmistir. Genetigi modifiye edilmis bir virüs, modifiye edilmemis ana susundan daha az Virülan olmasi durumunda"atenüe edilmis"tir. Bir sus, hastaligin ciddiyetini belirleyen bir veya daha fazla parametrede istatistiksel açidan anlamli bir düsüs göstermesi durumunda "daha az Virülan"dir. Bu tür parametreler arasinda Viremi seviyesi, ates, solunum güçlügünün ciddiyeti, üreme semptomlarinin ciddiyeti veya akciger lezyonlarinin sayisi veya ciddiyeti, vb. yer alir. Bir "Enfeksiyöz klon", laboratuarda spesifik ve kasitli olarak modifiye edilebilen ve sonra yeniden canli genetigi modifiye edilmis organizma yaratmak için kullanilabilen izole edilmis veya klonlanmis bir hastalik ajani (örn., virüsler) genomudur. Enfeksiyöz klondan üretilen canli genetigi modifiye edilmis bir virüs, bir canli viral asi içinde kullanilabilir. Alternatif olarak eylemsizlestirilmis virüs asilari, enfeksiyöz klondan türetilmis canli virüsün eylenisizlestirici ajanlar, örn., formalin veya hidrofobik solveiitler, asitler, Vb. ile isleme tabi tutulmasi, ultraviyole isini veya X isinlari verilmesi, isitilmasi, Vb. yoluyla hazirlanabilir. Halen elde edilebilen tüm M.hyo ve ve Mhyo kombinasyon asilari, öldürülmüs tam hücre mikoplazma preparasyonlarindan (bakterinler) yapilir. Buna karsilik mevcut bulusta, bir Mycoplasma hyopneumoniae (M.hy0) kültürünün süpernatani ve bir domuz sirkovirüsü tip 2 (PCV2) antijeni kullanilir ki burada M. hyo kültürünün süpernatani, çözülmeyen hücresel materyalden santrifüjleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmistir ve hem (i) IgG hem de (ii) immünoglobuline bagli antijenden olusan immünokomplekslerden muaftir. M.hy0›nun eksogen steroller ve yagli asitlere mutlak gereksinimleri vardir. Bu gereksinimler genellikle M.hyo"nun domuz derumu gibi serum ihtiva eden ortamlarda büyütülmesini gerektirir. Çözülmeyen materyalin M. Hyo tam hücre preparasyonunun çözülebilir bölümünden (örn., santrifüjleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla) ayrilmasi, domuz IgG7sini veya immün kompleksleri oretadan kaldirmaz. Mevcut bulusun bir düzeneginde M.hyo"nun çözülebilir bölümü, kültür süpernatani içerisinde yer alan IgG ve immün kopleksleri öiiemli ölçüde çikarmak için protein-A veya protein-G ile isleme tabi tutulur. Bu düzenekte protein-A isleminin, M.hyo fermantasyonundan sonra oldugu anlasilir. Bu alternatif olarak burada asagi yönde protein A islemi olarak da anilir. Bir baska düzenekte büyüme ortaminin yukari yönde protein A islemine tabi tutulmasindan (yani M.hyo fermantasyonundan önce) faydalanilabilir. Protein A, IgG'nin FC bölümüne baglanir. Protein G tercihen IgG°nin FC bölümüne baglanir, ancak ayrica Fab bölgesine de baglanabilir. Doku kültürü süpernatani, serum ve assit sivisi gibi ham protein karisimlarindan toplam IgG'yi saflastirma/çikarma yönteinleri, bu konuda bilinir. M.hyo preparasyonunun çözülebilir bölüinü, M.hyo protein anti jenleri içerir. M.hyo°nun süpematan fraksiyonu en aziiidan moleküler agirliklari yaklasik olarak 46kD (p46), 64kD (p64) ve 97kD (p97) olan M.hy0 protein antijenleri içerir. Yaklasik olarak 64kD°lik M.hyo proteini (p64) alternatif olarak burada Kim ve arkadaslari [Infect` Immun. 58(8):2637-2643 (1990)] ve ayrica ABD Patenti No. 5,788,962°de tarif edilen M.hy0"dan p65 yüzey anti jeni olarak da anilabilir. Futo ve arkadaslari, M.hyo"dan, bu bulusa ait kompozisyonlarda kullanilabilen 46kD°lik bir yüzey proteininin klonlanmasini ve karakterizasyonunu açikladi [J. Bact 177: 1915-1917 (1995)]. Bir düzenekte M.hy0"nun kültür süpematani, P-5722 susundan karsilik gelen nükleotit ve amino asit sekanslari, ayri ayri SEK.KIM.NO.: 1 ve 2"de verilen p46"yi içerir. Ayrica bu tür p46 sekanslarinin varyantlarinin, asagida tarif edildigi gibi mevcut bulusa ait kompozisyonlar içerisinde kullanilabilmesi de tasarlanir. Zhang ve arkadaslari, M.hyo,nun bir p97 adhezyon proteinini [Infect Iinmun. 63: 1013-1019, 1995] açikladi ve karakterize etti. Ek olarak King ve arkadaslari, M.hy0°nun P-5722 susuiidan Mhpl adli 124kD"1ik bir proteini açikladi ve Mhpl ve p97"nin ayni protein oldugunu ileri süren veriler sundu [Vaccine 1525-35 (1997)]. Bu tür p97 proteinleri, bu bulusa ait kompozisyonlarda kullanilabilir. Bir düzenekte M.hyo°nun kültür süpematani, P-5722 susundan karsilik gelen nükleotit ve amino asit sekanslari, ayri ayri SEK.KIM.NO.: 3 ve 4"te verilen p97"yi içerir. Ayrica bu tür p97 sekanslarinin varyantlarmm, asagida tarif edildigi gibi inevcut bulusa ait kompozisyonlar içerisinde kullanilabilinesi de tasarlanir. M.hyo kültür süpernatani ayrica bunlarla sinirli olmaksizin yaklasik olarak 41kD (p41), 42kD (p42), 89kD (p89) ve 65kD"lik (p65) proteinler gibi M.hy0"ya 'Özel baska protein anti jenleri de içerebilir. Bakiniz Okada ve arkadaslari, 2000, J. Vet. Med. B 47:527-533 ve Kim ve arkadaslari, 1990, Infect. Iminun. 58(8):2637-2643. Ek olarak M.hyo kültür süpernatani, yaklasik olarak lOZkD (p102) ve 216kD"lik (p216) M.hy0,ya 'Özel protein anti jenleri de içerebilir. Bakiniz Minnion ve arkadaslarina ait ABD Patentleri No. 6,162,435 ve 7,419,806. Mevcut bulusa ait kompozisyonlar içeren M.hy0 preparasyonunun çözülebilir bölümünü 'üretmek için bir baslangiç materyali olarak herhaiigi bir M.hy0 susu kullanilabilir. Uygun M.hyo suslari, ticari veya akademik kaynaklardan, örnegin Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu (ATCC) (Manassas, Va.) ve NRRL Kültür Koleksiyonu (Tarim Arastirma Servisi, ABD Tarim Departmani, 111.) gibi emanetçilerden elde edilebilir. Tek basina ATCC, asagidaki satilacak alti M.hyo susunu siralar: M.hy0 ATCC 25095, M.hy0 ATCC 25617, M.hyo ATCC 25934, M.hyo ATCC 27714, M.hyo ATCC 27715 ve M.hyo ATCC 25934D. Bu bulusun düzeneklerinde kullanilmasi tercih edilen bir M.hyo susu, ABD Patent ve Marka Dairesinin sart kostugu erisebilirlik kurallarina uygun olarak 30 Mayis 1990 tarihinde birakilmis P-5722-3 susu, ATCC no. 55052 olarak tanimlanir. Hastaligin genis Ölçüde yayilmasi göz önüne alindiginda, suslar ayrica M.hyo'nun, domuzlarda mikoplazinal pnömoniye neden olan bilinen suslarla enfekte olnius doinuzdan aliiiaii akciger sekresyonlarindan veya dokulardan geri kazanilmasiyla da elde edilebilir. Bu konuda uzmaii kisiler, M.hy0 sekanslarinin varyantlarinin, mevcut bulusa ait kompozisyonlarda kullanilabilecegini anlar. Bu tür varyantlar, sekans özdesligi bakimindan %10-20 kadar çok degiskenlik gösterebilir ve kendisini immünojenik kompozisyonlarda faydali hale getiren antijenik karakteristiklerini muhafaza edebilir. Tercihen M.hyo varyantlari, vahsi tip M.hyo susunun tam boyda genomik sekansi ile en az %80, tercihen en az %85, daha tercihen en az %90, çok daha tercihen en az %95 sekans özdesligi gösterir. Bir immünolojik kompozisyonun antijenik karakteristikleri, örnegin, Orneklerde verildigi gibi tehdit deneyiyle tahmin edilebilir. Ayrica modifiye edilmis bir M.hyo antijeninin, vahsi tip M.hto proteini ile kiyaslandiginda koruyucu immünitenin en az %70,ini, tercihen %80°ini, daha tercihen %90°1ni verdigi durumda da modifiye edilmis anti jenin anti jenik karakteristigi hala korunuyordur. Bir düzenekte M.hy0 çözülebilir p46 antijeni, bulusa ait kompozisyonlara, yaklasik 1.5 tig/ml ila yaklasik 10 tig/ml, tercihen yaklasik 2 tig/ml ila yaklasik 6 tig/ml arasindaki nihai bir konsantrasyonda dahil edilir. p467nin, M.hy0 potans testi için kullanilan protein oldugu kaydedilir (bakiniz asagidaki `Örnek bölümü). Bir baska düzenekte M.hy0 antijeni, kompozisyonlara, M.hyo tam kültür proteini A ile isleme tabi tutulmus süpernataninin yaklasik %5.5"i ila yaklasik %35'i arasindaki nihai bir miktarda dahil edilebilir. Mevcut bulusa ait M.hy0 çözülebilir preparasyonu, M.hy0°ya karsi hem güvenli hem de etkilidir ve tek doz uygulama için uygundur. Ek olarak Basvuru sahipleri sasirtici sekilde M.hy0 çözülebilir preparasyonunun, anti jenler arasina immünolojik müdahale olmaksizin PCV2 dahil olmak üzere diger patojenlerden antijenler ile etkili sekilde birlestirilebilecegini de kesfetmistir. Bu, M.hyo çözülebilir preparasyonunu, bu. bulusa ait PCV2/M.hyo kombinasyon asisi dahil olmak üzere multivalent asilar için etkili bir platform haline getirir. PCV2 antijeni, M.hy0 kompozisyonu ile es zamanli olarak verilebilir (yani ayri ayri tekli asilar halinde) ancak tercihen kullanima hazir tek siselik bir asi halinde birlestirilir. Bir düzenekte mevcut bulusa ait immünojenik PCV2/M.hyo kompozisyonlari, en az bir ilave anti jen içerir. Bir düzenekte en az bir ilave antijen, doinuzlarda hastaliga neden olabilen bir mikroorganizmaya karsi koruyucudur. Bazi düzeneklerde en az bir ilave anti jen bileseni, domuzlari enfekte ettigi bilinen bakterilere, virüslere veya protozoanlara karsi koruyucudur. Bu tür mikroorganizmalarin 'ornekleri arasinda, bunlarla sinirli olmaksizin, asagidakiler yer alir: domuz üreme ve solunum sendromu virüsü (PRRSV), domuz parvovir'usü (PPV), Haem0philus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasina hyosynoviae, leptospira bacteria, Lawsonia intracellularis, swine influenza Virus (SIV), Escherichia coli anti jeni, Brachyspira hyodysenteriae, domuz solunum koronavirüsü, Domuz Epidemik Ishal (PED) Virüsü, rotavir'i'is'û, Torque teno Virüsü (TTV), Domuz Sitomegalovirüs'u, Domuz enterovir'ûsleri, Ensefalomiyokardit Virüsü, Klasik Domuz atesi (CSF) olan Aujesky Hastaligina neden olan bir patojen ve Bulasici Domuz Gastroenteritine neden olan bir patojen veya bunlarin kombinasyonlari. Bir düzenekte mevcut bulusa göre bir PCVZ/Mhyo kombinasyon asisi, tek doz, kullanima hazir tek siselik bir asi halinde tedarik edilir. Bu tür bir kullanima hazir kombinasyon asisi, ayri ayri asilarin karistirilmasini gerektirmez, böylece karistirma ile iliskili kontaminasyon veya ilave emek riski ortadan kalkar ve karisimin birkaç saat içerisinde kullanilmasina gerek olmaz. Ayrica tek siselik bir PCVZ/M.hy0 koinbinasyon asisi, atik ve buzdolabi saklama boslugunu yariya indirir. Ayrica tek doz uygulama, hayavana ikinci bir dozun uygulanmasi ile iliskili emegi de ortadan kaldirir. Hali hazirda PCVZ/Mhyo kombinasyon asilarinin mevcut olmasina ragmen bunlarin, iki dozluk kullanima hazir bir asi (Cireumvent®PCVM) yada ayri ayri asilarin (örn., Ingelvac CircoFLEX® ve Ingelvac MycoFLEX®) ayni anda uygulanmasini gerektiren tek doz 2 siselik bir asi halinde tedarik edildigi kaydedilir. Tereihen mevcut bulusa göre PCV2/M.hyo kombinasyonu, PRRS virüsü antijeni gibi diger antijenler ile uyumludur, böylece bütün anti jenler, tek bir doz halinde uygulanabilir. Bazi düzeneklerde bir PCVZ/Mhyo kombinasyon asisinin PCVZ antijen bileseni, kimerik bir tip-l-tip 2 sirkovirüsü seklindedir. Kiinerik virüs, domuz sirkovirüsü tip 2 ORF2 proteininini eksprese eden eyleinsizlestirilmis rekombinant bir domuz sirkovirüsü tip l"i kapsar. Kimerik domuz sirkovirüsleri ve bunlarin preparasyon yöntemleri, buraya kendi bütünlükleri içinde referans olarak dahil edilen WO 03/049703 A2"de ve ayrica ABD Patentleri No. 7,279,166 ve 7,575,752°de tarif edilir. Bir düzenekte kimerik PCVl-2 Virüsü genomunun tam boyda DNA sekansi, asagida tarif edildigi gibi SEK.KIM.NO: 5,e veya bunun varyantlarina karsilik gelir. Bir baska düzenekte kimerik PCVl-Z virüsünün immünojenik ORF2 kapsid geni, SEK.KIM.NO:6"ya karsilik gelir. Bir baska düzenekte kimerik PCVl-2 virüsünün eksprese ettigi immünojenik ORF2 proteininin amino asit sekansi, SEK.KIM.NO:7°ye karsilik gelir. Yine bir baska düzenekte kimerik PCVl-Z Virüsü genomunun tam boyda DNA sekansi, SEK.KIM.NO: 8"e karsilik gelir. Bir düzenekte kimerik PCVl-Z virüsünün immünojenik ORF2 kapsid geni, SEK.KIM.NO:9°a karsilik gelir. Bir baska düzenekte kiiiierik PCVl-2 virüsünün eksprese ettigi iiniiiünojenik ORF2 proteiniiiin aiiiino asit sekansi, SEK.KIM.NOleQ karsilik gelir. Bununla birlikte kinierik PCVl-2 virüsüne ait PCV2 ORF2 DNA°si ve proteini, yukarida tarif edilen sekanslar ile sinirli degildir çünkü PCV2 ORF2 DNA"si ve proteini, PCV2 izolatlari içerisinde yüksek düzeyde konzerve bir alandir. Bazi düzeneklerde bir M.hy0/PCV2 kombinasyon asisinin PCV2 antijen bileseni, bir rekombinant ORF2 proteini seklindedir. Bir düzenekte rekombinant ORF2 proteini, bir bakülovirüs vektöründen eksprese edilir. Alternatif olarak bunlarla sinirli olmaksizin, parapox vektörleri gibi bilinen diger ekSpresyon vektörleri de kullanilabilir. Bir düzenekte rekombinant PCV2 ORF2 proteini, SEK.KIM.NO: 1 l "e ait olup SEK.KIM.NO: 12 tarafindan sifrelenendir (GenBank Erisim No. AFO86834). Bir baska düzenekte rekombinant ORF2 proteini, SEK.KIM.NO: l3°e ait olup SEK.KIM.NO: 14 tarafindan sifrelenendir. Yine bir baska düzenekte rekombinant ORF2 proteini, SEK.KIM.NO:15"e karsilik gelir. Yine bir baska düzenekte rekombinant PCV2 ORF2 proteini, SEK.KIM.NO:7"ye karsilik gelir. Yine bir baska düzenekte rekombinant PCV2 ORF2 proteini, SEK.KIM.NO: 10"a karsilik gelir. Bununla birlikte mevcut bulus, yukarida tarif edilen özel ORF2 DNA°s1 ve protein sekanslari ile sinirli degildir. PCV2 ORF2 DNAssi ve proteini, PCV2 izolatlari içerisinde yüksek düzeyde konzerve bir alan oldugundan herhangi bir PCV2 ORF29nin, kimerik PCVl-2 Virüsü veya rekoiiibiiiant PCV2 proteini içerisinde kullanilan PCV2 ORF2 DNA ve/veya polipeptit kaynagi kadar etkili olmasi yüksek olasiliktir. PCV2 ORF2 DNA ve protein sekaiislariniii türetilebildigi uygun bir PCV2 izolatiniii bir örnegi, 40895 numarali PCV2 izolatidir (ATCC°ye 7 Aralik 2001,de birakilmis ve ATCC Patent Birakma Kodu FTA-3914 tahsis edilmis). 40895 numarali PCV2 izolatinin genomik (nükleotit) sekansi, GenBank erisim numarasi AF264042 altinda bulunabilir. PCV2 ORF2 DNA ve protein sekanslarinin türetilebildigi uygun PCV2 izolatlariniii örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmaksizin, asagidakiler yer alir: Imp.999, Iinp.lOlO-St00n, Imp.lOll-48121 ve Imp.1011-48285. Bu PCV2 izolatlarina karsilik gelen genomik sekanslarin GenBank erisim numaralari, ayri ayri AF055391, AF055392, AF055393 ve AF055394'tür. Bazi formlarda PCV2 ORF2 proteininin immünojenik bölümleri, kompozisyon içerisinde antijenik bilesen olarak kullanilir. Örnegin mevcut bulusa ait kompozisyonlarda, PCV2 ORF2 proteiiiinin kesik ve/veya ikame edilmis formlari kullanilabilir. Bu konuda uzman kisiler, mevcut bulusa ait kompozisyonlarda, PCV2 sekanslarinin varyantlarinin kullanilabilecegini anlar. Bu tür varyantlar, sekans özdesligi bakimindaii %10-20 kadar çok degiskenlik gösterebilir ve kendisini iminünojenik koinpozisyonlarda faydali hale getiren antijenik karakteristiklerini muhafaza edebilir. Tercihen PCV2 varyantlari, vahsi tip PCV2 izolatinin tam boyda genomik sekansi ile en az %80, tercihen en az %85, daha tercihen en az %90, çok daha tercihen en az %95 sekans özdesligi gösterir. Bir immünolojik kompozisyonun antijenik karakteristikleri, örnegin, Orneklerde verildigi gibi tehdit deneyiyle tahmin edilebilir. Ayrica modifiye edilmis bir PCV2 anti jeninin, vahsi tip PCV2 ORF2 proteini ile kiyaslandiginda koruyucu immünitenin en az %70'ini, tercihen %80°ini, daha tercihen %90°1n1 verdigi durumda da modifiye edilmis anti jenin anti jenik karakteristigi hala korunuyordur. PCV2 anti jen bileseni, immünojenik kompozisyon içinde arzu edilen immün yanitin indüklenmesi, yani PCV2 enfeksiyonundan kaynaklanan klinik belirtilerin olma sikliginin azaltilmasi veya ciddiyetinin azaltilmasi için etkili bir antijen dahil etme seviyesinde tedarik edilir. Bir düzenekte bir kimerik PCVl-2 virüsü, blusa ait kompozisyonlara, en azindan 1.0 S RP 5 5.0 seviyesinde dahil edilir ki burada RP, bir referans asiya kiyasla RLlSA anti jen nicelendirmesi (in vitro potans testi) ile belirlenen Nispi Potans birimidir. Bir baska düzenekte bir kimerik PCV1-2 virüsü, bulusa ait koinpozisyon içerisine, 20 kez (20X) konsantre edilmis yigin PCVl-2 antijeninin yaklasik %0.5'ila yaklasik %5"i arasindaki nihai bir konsantrasyonda dahil edilir. Bir baska düzenekte PCV2 ORF2 rekombinant proteini, bulusa ait kompozisyonlara, nihai immünojenik kompozisyonun her bir 1n1°si basina en az 0.2 ug anti jen seviyesinde (ag/ml) dahil edilir. Bir baska düzenekte PCV2 ORF2 rekombinant proteini dahil etme seviyesi, ml basina yaklasik 0.2 ila yaklasik 400 ug arasindadir. Yine bir baska düzenekte PCV2 ORF2 rekombinant proteini dahil etme seviyesi, ml basina yaklasik 0.3 ila yaklasik 200 ug arasindadir. Yine bir baska düzenekte PCV2 ORF2 rekombinant proteini dahil etme seviyesi, ml basina yaklasik 0.35 ila yaklasik 100 ug arasindadir. Yine bir baska düzenekte PCV2 ORF2 rekombinant proteini dahil etme seviyesi, ml basina yaklasik 04 ila yaklasik 50 ug arasindadir. Bir düzenekte mevcut bulusa ait bir immünojenik kompozisyon, M.hyo çözülebilir anti jenleri ve bir domuz sirkovir'usü tip 2 (PCV2) antijeninin yani sira bir PRRS Virüs antijeni de içeren bulusa ait kombinasyonu içerir. Bir baska düzenekte kompozisyon, bir domuzda M.hyo, PCV2 ve PRRS virüsüne karsi koruyucu bir immün yanit ortaya çikarir. Bir düzenekte bir PCV2/M.hyo/PRRS kombinasyon asisi, tek doz, 2 siselik bir asi halinde tedarik edilir. Örnegin bazi düzeneklerde bir PCV2/M.hyo kombinasyonu, birinci bir sise içinde stabil bir sivi kompozisyonu halinde tedarik edilir ve bir PRRS virüsü, ikinci bir sise içinde liyofilize edilmis bir durumda tedarik edilir. Bazi düzeneklerde ilave domuz antijenleri, birinci yada ikinci siseye ilave edilebilir. Bir düzenekte PRRS virüs bileseni, liyofilize edilmis, genetigi modifiye edilmis canli bir Virüs halinde tedarik edilir. Uygulama öncesinde birinci bir siseden gelen PCV2/M.hyo sivisi, ikinci bir sise içinde PRRS virüsünü yeniden sulandirmak için kullanilabilir böylece üç anti jenin hepsi, hayvana tek bir dozda uygulanabilir. Her ne kadar hali hazirda PCVZ/Mhyo/PRRS kombinasyon asilari mevcut olsa da bunlarin, üç ayri asinin (örn., Ingelvac CircoFLEX®, Ingelvac MycoFLEX® ve Ingelvac®PRRS MLV) ayni anda uygulanmasini gerektiren tek doz 3 siselik bir asi halinde tedarik edildigi kaydedilir. PRRS etyolojik ajani, ilk olarak Hollanda"da izole edildi ve Lelystad virüsü olarak adlandirildi. Bu Virüs, WO 92/21375ste (Stichting Centraal Diegeneeskundig lnstituut) tarif edildi, Avrupali PRRS virüsünün bir izolati, I-1102 numarasi ile Pasteur Enstitüsü, Paris"e birakildi. Kuzey Amerikali tipi, Avrupali tipi virüsün izolasyonu ile neredeyse ayni anda izole edildi ve bu, WO-93/03760'ta (Collinsve arkadaslari) tarif edir. Kuzey Amerikali tipi virüsün bir izolati, VR- 2332 numarasi ile Amerikan Tip Kültür Koleksiyonuna (ATCC) birakildi. Farkli suslar, hem Avrupali hem de Kuzey Amerikali Virüs tiplerinden izole edilmistir. WO 93/07898 (Akzo), l-l 140 numarasiyla CNCM°ye (Pateur Enstitüsü) birakilmis bir Avrupali susunu ve bundan türetilmis asilari açiklar. Ayrica WO 93/14196 (Rhone-Merieux), Fransa"da izole edilmis, 1-1153 numarasiyla CNCM°ye (Pateur Enstitüsü) birakilmis yeni bir susu açiklar. Ayrica EP0595436 Bl(Solvay), basta açiklanandan daha virülan yeni bir Kuzey Amerikali tipi susu ve bunun asilarini açiklar. Bu sus, ATCC"ye birakilmistir ancak birakma numarasi, patent basvurusunda detaylandirilmamistir. Ek olarak ESZO74950 BA (Cyanamid Iberica) ve bunun emsali GB2282811 B2, diger Avrupali ve Kuzey Amerikali suslarindan farkli, bilinen adiyla bir "Ispanyol susu"nu açiklar. Bu "Ispanyol susu", V93070'108 numarasiyla Avrupali Hayvan Hücre Kültür Koleksiyonuna (EACCC) birakilmistir. Mevcut bulusa ait PCVZ/Mhyo/PRRS koinpozisyonlarinda kullanilmak için uygun PRRS virüs anti jenleri arasinda Kuzey Amerikali PRRS Virüs izolatlari, Çinli PRRS virüs suslari ve Avrupali PRRS Virüs suslarinin yani sira bu tür izolatlarin/suslarin genetigi modifiye edilmis versiyonlari yer alir. Bir düzenekte mevcut bulusa göre kompoizsyonlarda kullanilan PRRS virüs antijeni, bir Kuzey Amerikali PRRS virüsüdür. Bazi düzeneklerde bu bulusa ait kompozisyonlarda kullanilan PRRS virüs antijen bileseni, P129 adinda Kuzey Amerikali PRRS virüs izolati veya bunun canli, genetigi modifiye edilmis bir versiyonudur. Tercihen genetigi modifiye edilmis PRRS virüsü, patojenik bir enfeksiyon üretemezken vahsi tip PRRS virüsünün neden oldugu enfeksiyona karsi hala etkili bir immünokoruyucu tepki ortaya çikarabilir. Bulusa ait kompoizsyonlarda kullanilma amaçli genetigi modifiye edilmis bir PRRS Virüsü, enfeksiyöz bir klondan üretilebilir. P129 adinda Kuzey Amerikali PRRS virüs izolatinin enfeksiyöz bir cDNA klonuun preparasyonu, bu suretle tamamen referans olarak dahil edilmis olan ABD Pat. No. 6,500,662"De°de tarif edilir. P129 cDNA"sinin sekansi, Genbank Erisi Numarasi AF494042°de ve ABD Pat. No. 6,500,662"De,de açiklanir. Bir düzenekte mevcut bulusa ait kompozisyonlarda kullanilma amaçli P129"un Virülan olmayan bir formunun nükleotit sekansi, SEK.KIM.NO: 16 ile temsil edilir. Bununla birlikte mevcut bulus, bu sekans ile sinirli degildir. P129°un bu sekansi ve diger virülan olinayan forinlarinin sekanslari, Uluslararasi Patent Basvurusu No. PCT/IB2011/055003, dosyalama tarihi 9 Kasim 2011°de tarif edilir, bunun içerikleri (bu Uluslararasi Basvuruya dayanan her US Ulusal Kademesindeki dosyalaina dahil olmak üzere), buraya kendi bütünlügü içerisinde referans olarak dahil edilmistir. Tercihen PRRS Virüsü, interferon aracili fonksiyonun asagi regülasyonunu engellemek için modifiye edilir. Diger düzeneklerde bulusa ait kompozisyonlarda kullanilan PRRS Virüs antijen bileseni, ISU-55 adinda PRRS Virüs izolatidir. ISU-55 izolati, Amerikali Tipi Kültür Koleksiyonuna (ATCC), VR2430 erisim numarasi altinda birakildi. ISU-55 izolatina ait ORF2 ila ORF5 genlerinin nükleotit sekansi, SEK.KIM.NO: 17 ile temsil edilir. ISU- 55 izolatina ait ORF6 ve ORF7 genlerinin nükleotit sekansi, SEK.KIM.NO: '18 ile temsil edilir. Kompozisyonlarda kullanilan bir diger uygun Kuzey Amerikali PRRS Virüs izolati, ATCC"ye VR23 85 [3 x plak saflastirlnasi yapilmis] ve VR2386 [plak saflastirmasi yapilmamis] erisim numaralari altinda birakilmis olan [SU-12°dir. Bu bulusa ait kompozisyonlarda kullanilabilen yine diger uygun Kuzey Amerikali PRRS Virüs izolatlari, asagidakilerdir: ISU-51, ISU-3927, ISU-1894, ISU-22 ve ISU-79; bunlar, sirasiyla VR2498, VR2431, VR2475, VR2429 ve VR2474 erisim numaralari altinda ATCC"ye birakildi. Bu ISU izolatlarindan herhangi birinin genetigi modifiye edilmis versiyonlari, bu bulusa ait kompozisyonlarda kullanilabilir. Bu ISU izolatlari ve ISU-55 izolati, Paul ve arkadaslarina ait asagidaki ABD patentleriiide detayli olarak tarif edilmektedir: US 5,695,766, 6,110,467, 6,251,397, 6,251,404, 6,380,376, 6,592,873, 6,773,908, 6,977,078, 7,223,854, 7,264,802, 7,264,957 ve 7,517,976, bunlarin tamami buraya kendi bütünlügü içerisinde referans olarak dahil edilmistir. Yine diger düzeiieklerde mevcut bulusa göre kompozisyonlarda kullanilan PRRS virüs anti jen bileseni, Amerikali Tipi Kültür Koleksiyonuna (ATCC) VR-2332 numarasi ile birakilmis Kuzey Amerikali tipi veya bunun genetigi modifiye edilmis bir versiyonudur. Örnegin PRRS virüsü, Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc."den INGELVAC® PRRS ATP ve INGELVAC® PRRS MLV içinde kullanilan, ATCC VR2332 olarak tanimlanan izolata dayanan modifiye edilmis bir canli virüs olabilir. Yine diger düzeiieklerde mevcut bulusa ait kompozisyonlarda kullanilan PRRS virüs antijen bileseni, bir Avrupali PRRS Virüs izolati veya Lelystad virüsü veya bunun genetigi modifiye edilmis bir versiyonudur. Uygun bir PRRS virüs susunun bir 'Örnegi, yukarida tarif edilen birakma No. 1-1102 olarak tanimlanir. Birakma 1-1102"ye karsilik gelen nükleotit ve amino asit sekaiislari, buraya bu suretle tamamen referans olarak dahil edilmis olan Wensvoort ve arkadaslariiia ait ABD Patent no. 5,620,691 'de tarif edilmektedir. Bir Avrupali PRRS virüs izolatinin veya Lelystad virüsünün enfeksiyöz bir klonunun preparasyonu, buraya bu suretle tamamen referans olarak dahil edilmis olan ABD Pat. No. 6,268,1991da tarif edilmektedir. Uygun PRRS virüs izolatlarinin diger örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmaksizin, yukarida tarif edilenler yer alir. Ayrica mevcut bulusa ait kompozisyonlarda, PRRS virüs izolatlarinin canli, genetigi modifiye edilmis versiyonlari da kullanilabilir. Bu tür canli genetigi modifiye edilmis orgaiizmalari yenideii yaratmak için bir enfeksiyöz klon kullanilabilir. Bu konuda uzinan kisiler, mevcut bulusa ait kompozisyonlarda, PRRS virüs sekanslarinin varyantlarinin kullanilabilecegini anlar. Bu tür varyantlar, sekans özdesligi bakiinindan %10-20 kadar çok degiskenlik gösterebilir ve kendisini immünojenik kompozisyonlarda faydali hale getiren anti jenik karakteristiklerini muhafaza edebilir. Tercihen PRRS virüs varyantlari, vahsi tip PRRS virüs izolatinin tam boyda genomik sekansi ile en az %80, tercihen en az %85, daha tercihen en az %90, çok daha tercihen en az %95 sekans özdesligi gösterir. Bir immünolojik kompozisyonun antijenik karakteristikleri, örnegin, tehdit deiieyleriyle tahmin edilebilir. Ayrica modifiye edilmis bir PRRS virüs anti jeninin, vahsi tip PRRS virüs anti jeni ile kiyaslandiginda koruyucu iminünitenin en az %70"ini, tercihen %80"ini, daha tercihen %90"1ni verdigi durumda da modifiye edilmis anti jenin anti jenik karakteristigi hala korunuyordur. Bir düzenekte PRRS virüs antijen bileseni, bulusa ait kompozisyonlara en azindan 2.1 î TCID505 5.2 seviyesinde dahil edilen genetigi modifiye edilmis bir canli virüstür, burada TCID50, antijeii nicelendirme (in vitro potans testi) yoluyla belirlenmis %50 doku kültürü enfeksiyöz dozudur. Bulusaait PCV2/M.hyo/PRRS kompozisyonlarinin PCV2 anti jen bileseni, bir kimerik tip-l-tip 2 sirkovirüsü seklinde olabilir; kimerik Virüs, domuz sirkovirüsü tip 2 ORF2 proteinini eksprese eden eylemsizlestirilmis bir rekombinant domuz sirkovirüsü tip 1 içerir. Bir baka düzenekte bulusa ait PCV2/M.hyo/PRRS koinpozisyonlarinin PCV2 anti jen bileseni, bir rekombinant ORF2 proteini seklindedir. PCV2/M.hyo/PRRS kompozisyonlarinda kullanima uygun PCV2 antijenleri, yukarida tarif edilen PCV2 izolatlarinin yani sira diger PCV2 izolatlarinin herhangi birinden türetilebilir. Bulusa ait kompozisyonlarda kullanima uygun PCV2 anti jenleri arasinda, bunlarla sinirli olmaksizin, yukarida tarif edilen PCV2 sekanslari ve bunlarin varyantlari yer alir. Mevcut bulusa ait asilar, kabul edilmis olan konvansiyon izlenerek insanlar (eger uygunsa) dahil olmak üzere hayvanlar için kabul edilebilir tasiyicilar, örn., standart tamponlar, stabilizerler, seyrelticiler, prezervatifler ve/Veya çözünürlestiriciler içerecek sekilde formüle edilebilir ve ayrica sürekli salimi kolaylastiracak sekilde de forinüle edilebilir. Seyrelticiler araisnda su, tuz, dekstroz, etanol, gliserol ve benzerleri yer alir. Izotoniklik için katki maddeleri, digerleri arasinda, sodyum klorür, dekstroz, manitol, sorbitol ve laktozu kapsar. Stabilizerler, digerleri arasinda, albümini kapsar. Ozellikle modifiye edilmis canli asilarin formüle edilmesinde faydali olanlar dahil olmak üzere diger uygun asi araçlari ve katki maddeleri, bu konuda uzman kisilerce bilinir veya anlasilacaktir. Bakiniz, örnegin buraya referans olarak dahil edilinis olan Remington's Pharmaceutical Science, '18inci baski, 1990, Mack Publishing. Mevcut bulusa ait asilar ayrica bir veya dahafazla ilave immüno- modüle edici bilesen, Örn., digerleri arasinda bir ad juvan veya sitokin de içerebilir. Mevcut bulusa ait koinpozisyonlarda kullanima uygun adjuvan tipleri arasinda sunlar yer alir: bir su içinde yag adjuvani, bir polimer ve su adjuvani, bir yag içinde su adjuvani, bir alüininyum hidroksit adjuvani, bir E vitamini adjuvani ve bunlarin kombinasyonlari. Adjuvanlarin bazi spesifik 'Örnekleri arasiiida, buiilarla sinirli olmaksizin, tam Freund ad juvani, tam olmayan Freund ad juvani, Corynebacteriuin parvuin, Bacillus Calmette Guerin, alüminyum hidroksit jel, glukan, dekstran sülfat, demir oksid, sodyum alginat, Bacto-Adjuvan, belirli sentetik polimerler, örn., poli amino asitler ve amino asit kopolimerleri, Blok kopolimer (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-2l (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass), SAF-M (Chiron, Eineryville Calif.), AMPHIGEN® adjuvani, saponin, Quil A veya diger saponin fraksiyonu, monofosforil lipit A ve Avridine lipit- amin ad juvani (N,N-dioktadesil-N',N'-bis(2 -hidroksietiD- propandiamin), "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), parafin yagi, RIBI adjuvan sistemi (Ribi Inc., Hamilton, Mont), muramil dipeptit ve benzerleri yer alir. Bulusa ait asi içinde faydali su içinde yag emülsiyonlarinin sinirlayici olmayan örnekleri araisnda modifiye edilmis SEAM62 ve SEAM 1/2 formülasyonlari yer alir. Modifiye edilinis SEAM62, %5 (h/h) skualen (Sigma), %1 (h/h) SPAN® 85 deterjan (ICI Surfactants), %0.7 (h/h) TWEEN® 80 deterjan (ICI Surfactants), %25 (h/h) etanol, 200 ug/ml Quil A, 100 tig/ml kolesterol ve %05 (h/h) lesitin ihtiva eden bir su içinde yag emülsiyonudur. Modifiye edilmis SEAM 1/2, %5 (h/h) skualeii, %1 (h/h) SPAN® 85 deterjan, %0.7 (h/h) TWEEN® 80 deterjan, %2.5 (h/h) etanol, 100 tig/m1 Quil A ve 50 tig/ml kolesterol içeren bir su içinde yag emi'ilsiyonudur. Bulusa ait kompozisyonlarda faydali bir baska adjuvan örnegi, SP yagidir. Spesifikasyonda ve isteinlerde kullanildigi gibi "SP yagi" terimi, bir polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri, skualen, polioksietilen sorbitan monooleat ve tamponlu bir tuz çözeltisi içeren bir yag emülsiyonunu isaret eder. Polioksietilen-polioksiprOpileii blok kopolimerleri, kati ve sivi bilesenlerin süspanse olmasina yardimci olan surfektanlardir. Bu surfektanlar, P1uronic® markasi altinda polimerler olarak ticari yollarla elde edilebilir. Tercih edilen surfektan, P1uronic® L-121 markasiyla ticari yollarla elde edilebilen poloksamer 401"dir. Geiiel olarak SP yagi emülsiyonu, yaklasik %1 ila 3 hacim/hacim blok kopolimer, yaklasik %2 ila 6 hacim/hacim skualan, daha özellikle yaklasik %3 ila 6 skualan ve yaklasik %0.] ila 0.5 hacim/hacim polioksietilen sorbitan monooleat içeren, geri kalani, tamponlanmis bir tuz çözeltisi olan immüno-uyarici bir adjuvan karisimidir. Bir düzenekte SP yagi einülsiyonu,nihai kompozisyonda, yaklasik %1 ila %25, tercihen yaklasik %2 ila %15, daha tercihen yaklasik %5 ila %12 h/h arasindaki miktarlarda bulunur. Bulusa ait kompozisyonlarda kullanima uygun bir ad juvanin yine bir baska örnegi, bir sivi yag, genellikle hafif sivi parafin içinde çözündürülmüs yagi alinmis lesitinden olusan bir AMPHIGENTM adjuvandir. Bulusa ait kompozisyonlarda faydali adjuvanlarin diger `Örnekleri, asagidaki tescilli adjuvanlardir: Microsol Diluvac Forte® duel emülsiyon adjuvan sistemi, Emunade adjuvan ve Xsolve adjuvan. Hem Emunade hem de Xsolve adjuvanlar, su içinde hafif mineral yagli emülsiyonlardir ancak Emunade ayrica alhidrojel de ihtiva eder ve d,l-0L-tokoferil asetat, XSolve ad juvanin bir parçasidir. Bulusa ait kompozisyonlarda kullanima uygun bir adjuvanin yine bir baska örnegi, ImpranFLEXTM adjuvandir (bir yag içinde su adjuvani). Uygun bir adjuvain yine bir baska 'Örnegi, Karbomer (Carbopol®) bazli bir adjuvandir. Tercih edilen Carb0pol® adjuvanlar arasinda Carbopol® 934 polimer ve Carbopol®941 polimer yer alir. Bir düzenekte ad juvan veya ad juvan karisimi, doz basina yaklasik 100 pg ila yaklasik 10 mg araisndaki bir miktarda ilave edilir. Bir baska düzenekte adjuvan/adjuvan karisimi, doz basina yaklasik 200 ug ila yaklasik 5 mg arasindaki bir miktarda ilave edilir. Yine bir baska düzenekte adjuvan/adjuvan karisimi, doz basina yaklasik 300 pg ila yaklasik 1 mg arasindaki bir miktarda ilave edilir. Adjuvan veya ad juvan karisimi, bulusa ait asi koinpozisyonu içerisinde tipik olarak yaklasik %1 ila %25, tercihen yaklasik %2 ila %15, daha tercihen yaklasik %5 ila %12 arasindaki h/h miktarlarda bulunur. Asi içerisine dahil edilebilen diger "immünomodülatörler" arasinda, örn., bir veya daha fazla interlökin, interferon veya bilinen diger sitokinler yer alir. Bir düzenekte adjuvan, bir siklodekstrin veya bir polianyonik polimer, Örn., ayri ayri ABD Pat. No. 6,165,995 ve 6,610,310"da tarif edilenler olabilir. Bir baska yön, mevcut bulusa göre bir immünojenik kompozisyonun hazirlanmasina yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Bu yöntem, sunlari kapsar: i) M.hy0"nun, uygun bir ortamda 18-144 saat araligindaki süreler zarfinda kültürlenmesi; ii) müteakiben M.hy0 kültürünün eylemsizlestirilmesi; iii) eyleinsizlestirilinis kültür sivisinin hasat edilmesi ki burada eyleinsizlestirilmis kültür sivisi, hem çözülebilir bir sivi fraksiyonu hem de çözülmeyen hücresel materyal içerir; iv) çözülebilir sivi fraksiyonunun çözülmeyen hücresel materyalden santrifüjleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmasi; V) ayrilmis olan çözülebilir sivi fraksiyonundan hem lgG hem de antijen/immünoglobülin immünokomplekslerinin 'Önemli ölçüde giderilmesiyle hem (i) IgG hem de (ii) immünoglobüline bagli anti jenden olusan imniünokomplekslerden muaf M.hy0 kültür süpernatani olusturulmasi; ve vi) müteakiben süpernatanm bir PCVZ anti jeni ile birlestirilmesi. M.hyo"nun kültürlenmesi için uygun bir ortam örnegi, besin zengilestiriciler ile desteklendigi durumda Mikoplazma"nin izole ve kültive edilmesi için kullanilan PPLO Besiyeridir (Mikoplazma Besiyeri Tabani). Bazi düzeneklerde M.hyo kültürü, geç log fazinda büyümeye kadar büyütülür, ardindan kültür eylemsizlestirilir. Diger bazi düzeneklerde kültür, pH "nin yükseltilmeisyle (örn., yaklasik 7. 8 "e) eylemsizlestirilir. Bu, üretim kültürünün ikili etileniinin (BEI) gibi bir eylemsizlestirme ajanma maruz birakilmasiyla olur. BEI, üretim kültüründe L-bromoetilamin hidrobroinürün (BEA) inkübe edilmesi sirasinda yerinde üretilir. Müteakiben eylemsizlestirilmis kültürün pH°si, örn., çözelti içerisinde eylemsizlestirme ajanini nötralize edene denk miktarda bir ajan ilave edilerek nötralize edilir. Bazi düzeneklerde eylemsizlestirme ajani, BEFdir ve nötralizasyon ajani, sodyum tiyosülfattir. Bir düzenekte eylemsizlestirilmis kültürün pH°si, sodyum tiyosülfat ilave edilerek yaklasik 7.4"e ayarlanir. M.hyo tam hücre preparasyonunun çözülebilir sivi fraksiyonu, çözülmeyen hücresel materyalden klasik yöntemler kullanilarak ayrilir. Bir düzenekte bu ayirma, bir filtrasyon adiiniyla olur. Bir baska düzenekte bu ayirma, bir santrifüjleme adimiyla olur. Yine bir baska düzenekte ayirma, bir çökeltme adiiniyla olur. Bir düzenekte eylemsizlestirilmis, nötralize edilmis bir M.hy0 tam hücre preparasyonunun çözülebilir SlVl fraksiyonu, Protein A resini ile isleme tabi tutularak buradaki hem IgG hem de anti jen/immünoglobülin immünokompleksleri önemli ölçüde giderilir. Diger düzeneklerde çözülebilir sivi fraksiyonu içerisinde yer alan hem IgG hem de antijen/immünoglobülin immünokomplekslerini önemli ölçüde gidermek için Protein G resini kullanilabilir. Hem lgG"yi hem de anti jen/immünoglobülin immünokomplekslerini Protein A yada Protein G resinleri ile gidermerye yönelik yöntemler, bu konuda iyi bilinir. Bir baska yöne göre, mevcut bulusa göre bir multivalent immünojenik kompozisyon hazirlamaya yönelik yöntem, yukarida tarif edildigi gibi çözülebilir M.hy0 anti jeni hazirlanmasini ve bunun bir PCVZ anti jeni, uygun bir adjuvan ve bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici ile karistirilinasini kapsar. Bu yöntem istege bagli olarak en azindan bir ilave domuz antijeni, `om, ve bununla sinirli olmaksizin, yukarida tarif edildigi gibi PRRS virüs antijeni ilave edilmesini kapsar. Mevcut bulusun bir baska yönü, bir kit ile ilgilidir. Bir "kit", birlikte gruplandirilan çok sayida bilesene karsilik gelir. Bir düzenekte mevcut bulusa göre bir kit, bir iinmünojenik kompozisyon içeren bir sise (veya baska uygun bir hazne) içerir. Bu immünojenik kompozisyon, bir Mycoplasina hyopneumoiiiae (M.hy0) kültürünün süpernatanini ve bir domuz sirkovirüsü tip 2 (PCVZ) anti jeni içerir ki burada M. hyo kültürünün süpernatani, çözülmeyen hücresel materyalden santrifüjleme, filtrasyon veya çökeltme yoluyla ayrilmistir ve hem (i) IgG hem de (ii) antijen/imniünoglobulin immünokomplekslerinden muaftir. Istege bagli olarak kit ayrica bir kullanma kilavuzu da içerebilir. Kullanma kilavuzu, immünojenik kompozisyonun uygulanmasiyla ilgili bilgiler içerir. Bazi düzeneklerde kitteki sise içerisinde yer alan PCV2/M.hyo kombinasyonu, kullanima hazir bir sivi kompozisyon halinde tedarik edilir. Diger düzeneklerde kit, PRRS virüs antijeni içeren ikinci bir sise içerir. Bazi düzeneklerde PRRS virüs antijeni, liyofilize edilmis bir durumda tedarik edilen genetigi modifiye edilmis canli bir virüs seklindedir. Bu tür durumlarda kullanma kilavuzu, PRRS virüs bileseninin, PCVZ/Mhyo kombinasyonunu ihtiva eden siseden gelen sivi içerikler ile yeniden sulandirilmasina yönelik talimatlar içerecektir. Kullanma kilavuzu ayrica sonuçta elde edilen PCV2/M.hy0/PRRS trivalent formülasyon(lar)inin uygulanmasina yönelik bilgiler de içerecektir. Bazi düzeneklerde bu bulusa göre bir immünojenik kompozisyon, M.hy0"ya karsi anne türevli antikorlari olan domuzlara uygulanir. Diger düzeneklerde mevcut bulusa ait bir immünojenik kompozisyon, hem M.hy0 hem de PCV2°ye karsi anne türevli antikorlari olan domuzlara uygulanir. Bazi düzeneklerde mevcut bulusa göre bir multivalent immünojenik kompozisyon, 3 haftalik veya daha büyük bir domuz yavrusuna uygulanir. Bununla birlikte bulusa göre bir multivalent asi kompozisyonunun, yavrulama 'Öncesi genç disi domuzlarin tekrar asilanmasinda da kullanilabilmesi tasarlanir. Bu konuda bilindigi gibi bir genç disi domuz, hiç hamile kalmamis bir disi domuzdur. Asilanmis genç disi domuzlar, anne türevli antikorlarini emen yeni doganlarina kolostrum vasitasiyla geçirecektir. Ayrica bulusa göre multivaleiit bir asinin, yavrulayan sürüleri her yil tekrar asilamak için kullanilabilmesi de tasarlanir. Tercihen mevcut bulusa göre multivalent bir asi, domuzlara (örn., yavru domuzlar veya genç disi doinuzlar) tek doz uygulanir. Bir düzenekte mevcut bulusa göre bir multivalent asi, ayri ayri monovalent asilariii uygulama 'Öncesinde karistirilinasini gerektirmez, yani bir sise içerisinde yer alan kullanima hazir bir PCV2/M.hy0 formülasyonu halinde tedarik edilir. Bir baska düzenekte bir multivalent formülasyon, birinci bir sise içerisinde yer alan mevcut bulusa göre bir divalent asinin, ikinci bir sise içerisinde yer alan bir monovalent asi ile karistirilmasini gerektirir. Bir düzenekte ikinci sise içerisinde yer alan monovalent asi, PRRS virüs anti jeni içerir. Istege bagli olarak bu siselerden herhangi birine ilave anti jenler katilabilir. Bazi düzeneklerde immünite baslangici, mevcut bulusa göre bir multivalent asi konipozisyonu ile asilama sonrasi 2-3 haftadir. Diger düzeneklerde immünite süresi, mevcut bulusa göre bir multivalent asi kompozisyonu ile asilama sonrasi yaklasik 17-23 haftadir. Asagidaki ömekler, mevcut bulusa uygun tercih edilen materyalleri ve prosedürleri belirtir. Bununla birlikte bu örneklerin, sadece açiklama amaciyla verildigi ve buradaki hiçbir seyin, bulusun genel kapsami üzerinde bir siiiirlaina sayilamayacagi anlasilacaktir. Ornekler Ornek 1: PCVZ ile birlestirilebilir M.hv0 antiieni için Mvcoplasma hvopneumoniae 'üretim yöntemi M.hv0 Fermantasyonu ve Evlemsizlestirmesi Tohum ölçegi ve aiitijen üretimi için ortamlar, asagidaki gibi hazirlandi. Domuz kalbinden çikarilmis Plevropnömoni benzeri Organizma (PPLO) Besiyeri (BD Biosciences katalog No. 21498), üreticinin talimatlarina göre yapildi (yani 21g/L) ve maya özüt'u çözeltisi, USP içinde 21g/L olarak yapildi. Maya özütü çözeltisi daha sonra PPLO°ya %625 olarak ilave edildi ve karisim, 2 30 dakika süreyle 121°C°ye isitilarak sterilize edildi. Sistein hidroklorür, 90g/L olarak hazirlandi ve filtreli sterilizasyon yapildi. Dekstroz çözeltisi, her bir litre USP suyu basina 450 g dekstroz ilave edilerek yapildiktan sonra isiyla sterilizasyon yapildi. Nihai ortami hazirlamak için taban ortaiiia %10 domuz seruniu ilave edildikten soiira %001 sistein ve %l.0 dekstroz eklendi. Ortama, %10 hzh log fazinda M. hyopeuinoniae (sus P-5722-3) kültürü asilandi. Kültür, 37°C"de tutuldu ve pH ve dO, ayri ayri %7.0 ve %25"te tutuldu. Geç log fazinda büyümede kültür, 2-brom0etilamin hidrobromürden üretilmis bir aziridin bilesigi olan ikili etilenimin (BEI) vasitasiyla eylemsizlestirildi. Spesifik olarak eylemsizlesme, 4 mM°lik nihai bir konsantrasyona kadar 2-bromoetilaminhidrobromür (BEA) ilave etmek ve 24 saat süreyle inkübasyon yapinak suretiyle pH'nin 7.8'e çikarilmasiyla meydana geldi. BEI, l:l°lik bir inolar oranda sodyum tiyosülfat ilavesini takiben 24 saat daha inkübasyon yapilarak nötralize edildi. Eylemsizlestirilmis kültür sivisi, bir baska isleme kadar 2-8°C"de tutuldu. Ornek 2: Kimerik Domuz Sirkovirüsü (cPCV)1-2 Uretim Yöntemleri cPCVl-Z, patojenik domuz sirkovirüsü tip 2"nin (PCV2) immünojenik kapsid geminin, patojenik olmayan domuz sirkovirüsü tip l"in (PCVl) genomik omurgasi içine klonlanmasiyla yapilandirildi. Kimerik DNA klonunun yapilandirilmasina yönelik prosedür, örnegin, buraya kendi bütünlügü içerisinde referans olarak dahil edilmis olan ABD Patenti No. 7,279,166"da tarif edilir. Enfeksiyöz bir kimerik virüs stoku, Dr. X. J. Meng, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA°dan edinildi ve %0.05 laktalbümin hidrolisati (LAH), ug/mL gentainisiii sülfat ve %5 fetal inek serumu ile desteklenmis Minimum Esansiyel Ortamda (MEM) büyütülen Domuz Böbrek (PK)- hücrelerini enfekte etmek için kullanildi. Sonuçta elde edilen cPCV1-2 ile enfekte edilmis PK-15 hücreleri, %2-3 fetal inek serumu haricinde ayni büyüme ortami kullanilarak dört kez daha seri geçisle daha da büyütüldü. Besinci geçis donduruldu, eritildi ve filtre edildi ve sonuçta elde edilen lisatlar, bir ana tohum öncesini ve müteakip ana tohumu hazirlamak için kullanildi. Virüs tohumlari üretmek için kullanilan ortam, Virüs stoku üretiminde kullanilanla ayniydi. Büyüme ortami konusunda, PK-15 hücre çizgsini filizlenmesi için ekmek için kullanilabilen bazal ortam, MEM, OptiMEM veya muadilidir. Büyüme ortami, %10 kadar inek serumu, %05 kadar laktalbümin hidrolisati, %05 kadar inek serum albüinini ve 30 ug/mL kadar gentamisin ile desteklenebilir. Virüs çogaltma ortami konusunda, MEM, OptiMEM ve muadili kullanilir. Virüs çogaltma ortami, %05 kadar laktalbümin hidrolisati, %2 kadar inek serum albümini, %05 kadar inek serum albümini ve 30 ug/mL kadar gentamisin ile desteklenebilir. Büyüme ortamina ve/veya Virüs çogaltma ortamina, hücrelerin devami için gerektiginde 5 g/L kadar glukoz ve 5 mmol/L kadar L-glutamin ilave edilebilir. PK-15 hücrelerini içeren bir hücre süspansiyonuna, cPCVl-Z ana tohum virüsü ilave edilir ve 3 saat kadar adsorbe edilir. Tohum Virüsü, büyüme baza ortaminda seyreltilerek 0.1-0.0001 arasinda bir enfeksiyon derecesi (MOI) saglanir. PK-15 hücrelerinin kültürlerine baslangiçta hücre ekimi sirasinda veya hücreler, yaklasik olarak %20 ila %50 konflüense ulastiginda çalisan tohum Virüsü asilanir. Bu ilk geçis, anti jen stoku üretilmesi için "Tek adimli Enfeksiyon Yöntemi" olarak anilabilir veya seri geçisler için de kullanilabilir. Seri geçislerde cPCVl-Z ile enfekte edilmis PK-15 hücreleri, virüsün çogaltilmasi için 1:5-20 oraninda seri bölünmelerle 7nci geçise kadar daha da büyütüldü. Onceki geçisteii gelen enfekte edilmis bir hücre süspansiyonunu ihtiva eden kültür ortami, bir sonraki geçis için tohum materyali görevi görür. cPCV1-2 ile enfekte edilmis hücreler, hücrelerin 2 %90 konflüense ulastigi durumda 36 ± 2°C"de her bir geçis için üç (3) ila 14 gün süreyle iiikübe edilir. cPCVl-Z virüsü, Viral replikasyon sirasinda gözlemlenebilir sitopatik degisikliklere neden olur. Hasatta hücrelerin yuvarlandigi ve kayda deger yüzer kalintilar gözlemlenir. Kültrürler, bakteriyel veya fungal kontaminasyonun görsel olarak kanitlanmasi için de gözlemlenir. cPCV antijeni içiii hasatlar arasiiidaki inkübasyon süresi, asagidaki Tablo 1 "de verilmistir: Tablo 1 cPCV Antiieninin Hasat edilmesi için Minimum ve Maksimum Süreler Yöntem Minimum/Maksimum Sicaklik Süre Araligi Tek Adimda Enfeksiyon 5 ila 16 gün 36 ± 2°C Seri Geçis (MSV + 3 ila MSV + 7) 16 ila 36 gün 36 ± 2°C cPCVl-2 kültür sivilari, steril kaplar içerisine toplanir ve bilinen yöntemler kullanilarak mikoplazina testleri için örneklenir. Silindir siselerden, bioreaktörlerden ve perfüzyon kaplarindan çoklu hasatlar yapilabilir. Hasat edilmis cPCV1-2 Virüsü eylemsizlestirilineden önce bir veya daha fazla antijen grubu, ultrafiltreleme yoluyla konsantre edilebilir (örn., 60)( kadar). Konsantratlar, dengeli tuz çözeltisi ile yikanarak serum proteinleri azaltilabilir. Simdi CPCV1-2 virüsünün eylemsizlestirilmesine, atenüe edilmesine veya detoksifiye edilmesine yönelik yöntem açiklanacaktir. cPCV anti jeiii konsantrasyonundan soiira havuz haline getirilmis cPCVl-2 Viral materyaliiie Beta-propiyolakton (BPL) ilave edilerek yaklasik olarak %02 h/h'lik bir konsantrasyon elde edilir. Havuz haline getirilmis viral sivilar daha sonra minimum 15 dakika süreyle çalkalanir ve sonra eylemsizlestirici yigin antijen sivilari, ikinci bir steril kaba aktarilir. Aktarilan antijen sivilari, minimum 24 saat süreyle bir taratan sabir çalkalama yapilarak 2-7°C"de tutulur. Minimum 24 saat sonra havuz haline getirilmis süspansiyona, %02 h/h"lik ikinci bir BPL ilavesi yapilir. Içerikler müteakiben çalkalanir, üçüncü bir kaba aktarilir ve 84 saatten kisa olmayan ilave bir süre boyunca, bir taraftan sabit çalkalama yapilarak, 2-7OC"de tutulur. Geiiel olara t0plam eylemsizlestirme süresi, 108 saatten kisa ve 120 saatten uzun degildir. Eylemsizlestirme yöntemi, asagidaki Tablo 2°de özetlenmistir. Tablo 2 Eylemsizlestirme Yöntemi Eylemsizlestirici Nihai Konsaiitrasyon Sicaklik Araligi Süre-Saat (Min/Maks.) Beta-propiyolakton %0.4 h/h (2 X %02 2-7°C (Çalkalama 108 -120 (BPL) h/h"lik ilave) esliginde) Eylemsizlestirme islemi, 0.] M°den fazla olmayan nihai bir konsantrasyonda sodyum tiyosi'ilfat çözeltisi ilave edilerek sonlandirilir. Eylemsizlestirilmis anti jen stokunun pH7si, NaOH veya HCl kullanilarak yaklasik 6.8'e ayarlanir. Eylemsizlestirme sonrasinda havuzdan temsili bir örnek alinir ve eylemsizlestirmenin tamamlanmasi için test edilir. Eylemsizlestirilmis cPCVl-Z antijen ürünü, potans ELISA yoluyla ölçülen sekilde 1.0 RP°nin üzerindeki bir hedefi karsilayacak sekilde standardize edilir. Örnek 3: M.hv0 antiienlerinin Asagi Akisli Islemleri ve Bu Islem görmüs Antiienlerin Analitik Testleri M.hv0 antiienlerinin Asagi Akisli Islemleri: Eylemsizlestirilmis fermantasyon sivisi (Ornek 1°de yukarida tarif edildigi gibi hazirlanmistir), belirtilen her bir grup için asagidaki gibi isleme tabi tutuldu. Islemden geçirilen bu M.hyo antijenleri, asagida Ornek 4"te kullanildi M (Tam Yigin) Islem görmemis. m (10X UF ile konsantre edilmis) Moleküler agirlik kesimi 100 kDa olan bir membrandan (delikli fiber) tegetsel akis filtrasyoiiu yoluyla konsantre edildi. Nihai hacim azalmasi, 10X°a denkti. T04 ve TOS: (10X UF ile konsantre edilmis ve santrifüjlenmis) Konsantre edilmis mikoplazma hücreleri (T03"ten) toplandi ve ~20,000xg"de santrifûjleme (Sorvall model RCSB) yoluyla bir kez PBS ile yikandi. T06 ve T07: (10X santrifûjlenmis) Eylemsizlestirilmis fermantasyon sivisi, ~20,000xg'de santrifi'ijlendi (Sorvall RCSB) ve hücreleri PBS içinde yeniden süspanse etme suretiyle bir kez yikandiktan soiira ilave bir santrifüjleme yapildi. Nihai hacim azalmasi, 10X"a denkti. @ (10X santrifüjlenmis ve Isitilmis) Mikoplazma hücreleri, her bir T06 basina konsantre edildi ve yikandi ve 10 dakika süreyle 65°C°ye isitildi. m (Hücresiz süpernatan) T06 için tarif edildigi gibi birinci santrifüjlemeden t0planmis olan süpernatana, 0.2 mikronluk bir filtreden (Nagene) filtreli sterilizasyon yapildi. m (Hücresiz süpernatan-Protein A ile isleme tabi tutulmus) Steril süpematan (her bir T09 basina hazirlanmis olan), Protein A resini (Protein A Sefaroz, Pharmacia Inc) ile, 10:1"lik bir hacim oraninda 4 saat süreyle karistirildi. Resin, steril filtrasyonla çikarildi ve filtre edilmis olan sivi, 2-8°C°de saklandi. Bu proseste, fermantasyon sonrasi "asagi yönde" protein A islemi kullanilarak antikorlar ve immünokompleksler giderildi. Her ne kadar mevcut bulus, yukari yönde protein A islemini engellemese de mevcut bulus sahipleri, M.hy0 durumunda, büyüme ortaminin yukari yönde protein A islemine tabi tutulmasinin, islem görmemis ortama kiyasla daha düsük ve tutarsiz p46 sonuçlarina yol açtigini bulinuslardir (veriler gösterilmemistir). M.hv0 Asagi v'onde Islem Görmüs Antiienlerinin Analitik Testleri Asagi yönde islem görmüs M.hyo anti jen preparasyonlari (yukarida tarif edildigi gibi hazirlanmis), M.hyo°ya `Özel p46 antijeninin geri kazanilmasi ve PCV2 antikorunun varligi bakimindan test edildi. Ek olarak bu M.hyo antijen preparasyonlari, genotip 1 (ngTV) ve genotip 2 (g2TTV) dahil olmak üzere Torque Teno Virüsünün (TTV) varligi bakiinindan test edildi. Sonuçlar, asagida Tablo 3"te sunulmustur. Tablo 3 M.hvo Asagi v'önde Islem görmüs Antiienlerinin Karakterizasyonu Islem Yigm PCV2 qPCR DNA M.Hyo ab p46 S/P ngTV gZTTV RU/mL orani Tam yigin 809 0,248 1.00E+03 1.78E+03 10x UF ile konsantre edilmis 6666 0,819 l.00E+03 9.94E+03 10x UF ile konsantre edilmis + 614 0,019 0 0 Santrifûj 10x Santrifüjleiiniis 763 -0,015 1.90E+02 1.91E+02 10x Santrifûjlenmis + lsitilmis 690 -0,012 0 2.07E+02 Hücresiz süpernatan 719 0,242 4.20E+02 3.23E+03 Hücresiz süpernatan (Prot A) 826 -0,014 0 2.06E+03 Yukaridaki Tablo 3°e gönderme yapildiginda, M.hy0 islem görmüs anti jen preparasyonlarindan her biri için M.hy0"ya 'Özel p46 anti jeiii geri kazanimi ortaya konuldu. Ek olarak asagidaki islemlerle PCV2 antikoru basarili bir sekilde giderildi: 10X UF ile konsantre edilmis ve santrifûjlenmis, 10x santrifûjlenmis, 10X santrifûjlenmis ve isitilmis ve Hücresiz süpernatan (Protein A ile isleme tabi tutulmus). TTV7ye iliskin olarak, asagidaki islemlerle ngTV basarili bir sekilde giderildi: 10X UF ile konsantre edilmis ve santrifujlenmis, 10x santrifûjlenmis ve isitilmis ve Hücresiz süpernatan (Protein A ile isleme tabi tutulmus). Sadece 10)( UF ile konsantre edilmis ve santrifüjlenmis olarak adlandirilan islemle g2TTV giderildi. Genotip 1 ve 2 dahil olmak üzere Torque teno Virüsü izolatlari, buraya kendi bütünlügü içerisinde referans olarak dahil edilmis olan USZOl 10150913'te tarif edilir. Protein Aanin IgG°ye baglandigi bu konuda bilindiginden bu konuda siradan uzinanliga sahip kisiler, sadece PCV2 antikorunun degil ayni zamanda PRRS antikoru, HPS antikoru ve SIV antikoru dahil olinak üzere diger domuz antikorlarinin da Protein A isleiniyle etkili sekilde giderilecegini anlar. Bu, bu bulusa ait Hücresiz Protein A ile isleme tabi tutulmus M.hyo süpernatanini, sadece PCV2 antijeni ile degil ayni zamanda antijenler arasinda immünolojik müdahale olmamasindan dolayi diger domuz antijenleri ile de uyumlu hale getirir. Ek olarak koruyucu olmayan hücre kalintisinin giderilmesiyle ve immünoglobülin ve anti jen/immünoglobülin komplekslerinin giderilmesiyle daha güvenli bir asi elde edilmesi de makul bir beklentidir. Ornek 4: M.hv0 deneysel asi formülasvonlarinin preparasvonu Bütüii deneysel M.hyo asilari, %5"lik bir nihai konsantrasyonda Amphigen ad juvani ile formüle edildi. Ek olarak bütün asilar, bir p46 ELISA ile standardize edildi ve timerosal ile muhafaza edildi. Deneysel asi formülasyonlari, yukaridaki TOZ-TOl islemlerine göre islem görmüs M.hyo anti jenleri ile hazirlandi. Ek olarak Islem T01, bir plaseboya (Mhyo antijeni yok, sadece %5 Amphigen adjuvan) karsilik gelirken Isleni Tl l, süresi geçmis bakterin bazli bir Mhyo asisina (RespiSure-ONE®, Pfizer Animal Health) karsilik gelen bir pozitif kontroldür. Bu formülasyonlar, asagida Tablo 4"te tarif edilir. Tablo 4 M.hv0 Deneysel Asi Form'ûlasvonlari Islem IVP Seri* Hedef p46 M Hyo Adjuvan Formûlasyon birimleri/ds antijeni (mL) Hacmi (mL) (mL) T01 123639 Sadece %5 Amphigen only, Anti jen Yok (Plasebo) T02 L100211A 452 279,36 250 1000 T03 L10021 1 B 452 6,78 50 200 T04 L10021 IC 452 73,62 50 200 TOS L100211D 816 132,90 50 200 T06 L100211E 452 59,24 50 200 T07 L100211F 816 106,95 50 200 T08 L100211G 452 65,51 50 200 T09 L100211H 452 62,87 50 200 T10 L100211J 452 54,72 50 200 T] 1 A827870 S'i'iresi geçmis "ReSpiSure" asisi *Arastirma altinda Veterinerlik Ürünü (lVP) Serisi Ornek 5: Farkli asagi yönde proseslerden M.hv0 antiienleri ile M.hv0 asilarinin in viv0 etkinliginin degerlendirilmesi Bu çalisma, farkli asagi yönde proseslerden (DSP) M hyo antijenleri ile Mycoplasina hyopneumoniae (M hyo) asilarinin in vivoetkinligini degerlendirmek için yapildi. 3 haftalik domuzlar, yukarida Tablo 4"te tarif edilen farkli asi formülasyonlarindan tek bir doz ile intramüsküler yoldan asilandi. Tedavi gruplarindan her birine on alti hayvan dahil edildi. Hayvanlar, asilainadan 21 gün sonra Viri'ilan bir M.hyo saha izolati ile tehdit edildi. Hayvanlara, tehditten 28 gün sonra nekropsi yapildi ve akcigerler çikarildi ve M.hyo enfeksiyonu ile tutarli konsolidasyon bakiinindan skorlandi. M.hyo tehdidine karsi korumada birincil kriter, akciger konsolidasyon skorlari idi. Genellikle enzootik pnömoninin neden oldugu akciger lezyonlarinin ebadi ile büyüme hizi üzerindeki olumsuz etki arasinda bir iliski oldugu kabul edilir. Asagidaki Tablo 5, ilgili tedavi gruplari için akciger lezyonu skorlarini ihtiva eder. Istatistiksel anlain, her bir grup için akciger skorlarinin Karisik Model Analiziyle belirlendi. Tablo 5 Akciger Lezvonu Sonuçlari Tedavi Açiklama p46 RP Hedef Geri Lezyonlu Kontrast p- Anlam /G'özlemlenen Transforme % degeri edilmis % Akciger Akciger Araligi Lezyonlari LS Ortalamalari T01 Plasebo (%5 mevcut degil 11,7 1,2 - 44,3 mevcut mevcut mevcut Ainphigen) degil degil degil TO2 Tam yigin 13/15.6 1,2 0,1 - 18,5 T019e 0 Evet karsilik 02 T03 Tam yigin UF 13/11.9 0,3 0,0 - 2,8 T01°e 0 Evet )( karsilik 03 T04 UF 10x + 13/28.1 5,9 0,0 - 40,5 T017e 0,1589 Hayir Santrifujlenmis karsilik 04 T05 UF 10x + 24/48.2 3,7 0,0 - 42,3 T01"e 0,0309 Evet Santrifûjlenmis karsilik T05 T06 10x 13/30.4 4,7 0,0 - 23,6 T01"e 0,0388 Evet Santrifujlenmis karsilik 06 T07 10x 24/57.4 4,6 0,3 - 37,3 T01,e 0,0323 Evet Santrifûjlenmis karsilik T07 T08 10x 13/17.7 4,5 0,3 - 21,7 T01"e 0,0137 Evet Santrifûjlenmis karsilik + Isitilmis T08 T09 Süpernatan 13/ 14.1 1,4 0,0 - 33,0 T01"e 0,0004 Evet (hücre yok) karsilik Süpernatan + 13/12.l 3,1 0,0 - 25,8 T01"e 0,0094 Prot A karsilik TlO Evet Süresi geçmis 13/12.5 2,2 0,1 - 32,1 T017e 0,0009 RSO karsilik T] 1 Yukaridaki Tablo 5"e gönderme yapildiginda, farkli asagi yönde proseslerden gelen M.hy0 anti jenleri ile sonuçlar, T04 disinda bütün deneysel asilarin plasebodan anlamli sekilde farkli oldugunu isaret etti. Bu M.hyo lezyon sonuçlari, Sekil l"de grafikle gösterilmistir. Sekil l"de gösterildigi gibi TO4, kabul edilemez sonuçlar verdi. Diger bütün tedaviler, plasebodan (T01) anlamli sekilde farkliydi. Akciger konsolidasyon skorlari, T02, T03 ve T09-Tll°in M.hy0 tehdidine karsi en etkili koruinayi sagladigini isaret etti. Deneysel asilarin p46 nispi potaiisi, bir çift antikorlu sandviç enzime bagli immünosorbent deneyi (DAS ELISA) kullanilarak degerlendirildi. Yukaridaki Tablo 5"te sunulan p46 DAS ELISA sonuçlari, bütün deneysel asilarin, hedef potansin üzerinde oldugununu isaret eder. Ek olarak p46 nispi potansi, bir aylik bir süre zarfinda asilarin depolanmasi sirasinda ya muhafaza edildi yada artti (veriler gösterilinemistir). Santrifûjleninis antijenlerde, isiya tabi tutulmis olan anti jenler disinda, zaman içerisinde fark edilir bir potans artisi gözlemlendi. Herhangi bir teoriye bagli kalma arzusu güdülmeksizin hücre "karkaslari"nin zamanla parçalanmasi ve santrifûjlenmis anti jenler durumunda membrana bagli p46 anti jeninin daha fazla salininasi muhtemeldir. Ornek 6: Deneysel M.hyo asilarinin PCV2 antijeni ile uvumlulugunun degerlendirilmesi Bu çalisma, M.hyo deneysel asilarinin, PCV2 anti jeni ile farkli asagi yönde proseslerden gelen M.hyo antijenleri ile uyuinlulugunu degerlendirmek için yapildi. M.hyo deneysel asi formülasyonlari, yukaridaki tablo 4 ve 5°te tarif edilmistir. Bu asilar için gözlemlenen p46 mSpi potaiislari, yukaridaki Tablo Site tarif edilinistir. Bu M.hyo deneysel asilarindan her biri, PCV2 antijeni ile birlestirildi. Bu örnekte PCV2 antijeni, Ornek 2°de yukarida tarif edildigi gibi hazirlanmis öldürülmüs bir PCV Tip l-Tip 2 kimerik virüsü (Fostera PCV) idi. Kimerik Virüs, kompozisyonlara, yaklasik 1.6 5 RP°lik baslangiç seviyesinde dahil edildi ki burada RP, etkili bir referans asiya kiyasla PCV2 ELISA antijen nicelendirinesi (in vitro potans testi) ile belirlenen Nispi Potans birimidir. Deneysel M.hy0/PCV2 kombinasyon formülasyonlari, PCV2 ELISA yoluyla degerlendirildi. Sonuçlar, Sekil 2'de sunulur. Sekil Zide gösterildigi gibi sadece asagidaki asagi yönde proseslerden gelen M.hyo antijen preparasyonlari, PCV2 antijeni ile uyumlu idi: Ultrafiltreleme ve Santriiüjleme (T04 ve TOS), Santritüjleme (T06 ve TO7), Santrifüjleme arti isitma (TOS) ve Protein A ile isleme tabi tutulmus Süpernatan (TlO). Bunlarda M.hyo Protein A ile isleme tabi tutulmus süpematani, kimerik virüs ve Amphigen adjuvan içeren ancak hiç M.hyo antijeni olinayan plasebo kontrol ile kiyaslandigi durumda PCV2 anti jeni ile en uyumlu olandi. Protein A ile isleme tabi tutulmus süpernatan içerisindeki kimerik PCV virüsü seviyesi, plasebo için olan 1.69 RP"ye karsilik 1.5 RP idi. Böylece Protein A ile isleme tabi tutulmus M.hyo çözülebilir antijen preparasyonu ile kimerik virüsün PCV2 antijeni arasinda hiçbir immünolojik müdahale olmadigi veya minimum düzeyde oldugu sonucuna varildi. Yukarida Ornek 5'te gösterilen Protein-A ile isleme tabi tutulmus M.hyo süpernataninm in vivo etkinligi, mevcut örnekte açiklanan sonuçlarla birlikte, Protein-A ile isleine tabi tutulmus süpematanin, M.hyo-PCVZ kombinasyonlari için potansiyel olarak etkili bir platform oldugunu gösterdi. Ornek 7: Farkli Adiuvan Formülasvonlarinda 1 Siselik bir PCV2/M.hv0 Kombinasvon Asisinin PCV2 Etkinliginin Degerlendirilmesi Bu çalisma, farkli adjuvan formülasyonlarinda l-siselik bir PCV2/M.hyo koinbinasyon asisinda PCV2 etkinligini degerlendirmek için tasarlandi. Bu örnekte PCVZ antijeni, öldürülmüs bir PCV Tip 1- Tip 2 kimerik Virüsü (Fostera PCV) idi. Kimerik Virüs, IgG°den 'Önemli ölçüde muaf (yani Protein A ile isleme tabi tutulmus süpematan) M.hyo çözülebilir anti jen preparasyonu. ile birlestirildi. Sivilarin islenmesi: Eylemsizlestirilmis M.hyo fermantasyon sivisi (Ornek 1°de yukarida tarif edilmistir), belirtilen her bir grup için asagidaki gibi isleme tabi tutuldu. T02-T04: Canli M. hyopneumoniae hücreleri (yukarida tarif edilmistir) ihtiva eden tam fermantasyon sivisi, ~20,000xg"de santrifujlendi (Sorvall RC5B) ve süpernatan toplandi ve 0.2 pM"lik bir filtreden geçirilerek sterilize edildi. rProtein A Sefaroz (parti numarasi 17-5199-03, GE Healthcare), lUlik bir kroinatografi kolonu içerisine paketlendi. Depolama tamponu çikarildiktan ve 2 kolon hacminde lM asetik asit ile isleme tabi tutulduktan sonra resin, 5 kolon hacminde 50 mM NaPO4/'1M NaCl tamponu, pH 7.04 ile dengelendi. Yaklasik olarak 2 litre aritilinis/filtre edilmis M. hyopneumoniae antijeni içerikli sivi, Protein A resininden saatte 10 cm"1ik bir akis hizinda geçirildi. Devridaiin toplandi ve 0.2 nM"1ik bir filtre vasitasiyla sterilize edildi. m Bu, Fostera PCV benzeri bir formülasyona (M.hy0 anti jeni yok) karsilik gelen bir pozitif kontroldür. Bu Fostera PCV benzeri forini'ilasyondaki kimerik Virüs seviyesi, yaklasik olarak Minimum Iininünize edici Doz (MlD) formülasyon seviyelerinde idi. Kimerik Virüs, PCV2/M.hy0 deneysel asilarina benzer formülasyon seviyelerinde dahil edildi. Bütün deneysel PCV2/M.hyo asilari, farkli adjuvan formülasyonlari ile formüle edildi. Deneysel asi formülasyonlari, yukaridaki T02-TO4 isleinlerine göre islem görmüs M.hyo antijenleri ile hazirlandi. Ek olarak lslein TOI, bir plaseboya (steril tuz) karsilik geldi. Bütün asilar, bir p46 ELISA ile standardize edildi ve timerosal ile muhafaza edildi. Bu deneysel formülasyonlar, asagidaki tablo 6"da tarif edilmistir, burada * sembolü, global M hyo tohumu, Protein A ile isleme tabi tutulmus Süpematanmdan M hyo anti jenini isaret eder ve ** sembolü, Araltirina altinda Veterinerlik Ur'unü (IVP) Serisini isaret eder. Tablo 6 PCV2 Etkinlik Calismasi için Kullanilan PCV2/M.hvo Deneysel Asi Form'ûlasvonlari Islem IVP Seri* PCVl-Z M Hyo* Adjuvan Diger Ag Ag TOl 87-244-DK Mevcut degil Steril Tuz (Plasebo) T02 L04l 1RK08 1.6 RP 7.5 RP %10 SP Yagi Mevcut T03 L041 1RK09 %5 Amphigen degil TO4 L061 lRKO3 %5 Amphigen + %5 SLCD T05 L06l IRK04 Mevcut %20 SLCD degil 3 haftalik domuzlar, yukarida Tablo 6,da tarif edilen farkli asi formülasyonlarmdan tek bir doz ile intramüsküler yoldan asilandi. Tedavi gruplarindan her birine on alti hayvan dahil edildi. Hayvanlar, asilamadan 21 gün sonra virülan bir PCV2 saha izolati ile tehdit edildi. Sekil 3, farkli adjuvan platformlari ile gözlemlenen PCV2 viremi sonuçlarini (PCV2 Kantitatif PCR) gösteren bir grafiktir. PCV2 viremisinin, biriiicil etkinlik degiskeni olarak kullanildigi kaydedilir. PCV2 vireinisinin sonuçlari, m1 basina DNA kopyalari olarak sunulmustur. Sekil 3°te gösterildigi gibi bütün tedavilerde, 28, 35 ve 42nci günlerde (tehdit, 21nci gündeydi) plaseboya kiyasla anlamli sekilde daha az viremi vardi .%10 SP yagi adjuvani, 28 ve 35inci Günlerde %5 Ainphigen°e kiyasla anlamli sekilde daha az vireini gösterdi. %5 Amphigen arti %5 SLCD adjuvani, 28 ve 35inci Günlerde %5 Amphigen°e kiyasla anlamli sekilde daha az Vireini gösterdi. %20 SLCD ad juvan platformu, 28, 35 ve 42nci Günlerde %5 Amphigen"e kiyasla anlamli sekilde daha az Viremi gösterdi. PCV2 Serolojisi, PCV2 diski atigi, PCV2 iiazal atigi, Hücre Aracili Immün (CMI) tepkileri, lenfoid tükenmesi ve Immünohistokimya (IHC) de ikinci] etkinlik degiskenleri olarak izlendi. Bu sonuçlar simdi asagida tarif edilecektir. Sekil 4, l, 20 ve 42nci çalisma günlerinde (tehdit, 21inci gündeydi) PCV2 ELISA sonuçlarini gösteren bir grafiktir. Her bir örnegin durumu, bir örnek-pozitif orani (S/P) olarak ifade edildi. Sekil 4°te gösterildigi gibi %20 SLCD, hem 20nci gün hem de 42nci günde plasebodan (TOI) anlainli sekilde farkli olan tek tedavi idi. Ayrica %5 Amphigen, 20nci günde plasebodan anlamli sekilde farkli olmayan tek tedavi idi. Sekil 5, T02-TO4 islemleri ile elde edilen PCV2 diski atigini plaseboya (TOl) karsi gösteren bir grafiktir. Bu sonuçlar, ml basina PCV2 DNA kopyalari seklinde ifade edilir. Sekil 5"teki sonuçlar, bütün tedavilerde, 42nci günde plaseboya kiyasla anlamli sekilde daha az diski atigi oldugunu gösterir. Ek olarak %5 Amphigen ve %5 SLCD (TO4), 42nci günde %5 Amphigen°e (T03) kiyasla anlamli sekilde daha az diski atigi gösterdi. Baska hiçbir tedavi farkliligi kaydedilmedi. Sekil 6, T02-T04 tedavileri ile elde edilen PCV2 nazal atigini plaseboya (TOl) karsi gösteren bir grafiktir. Bu sonuçlar, ml basina PCV2 DNA kopyalari seklinde ifade edilir. Sekil 6°daki sonuçlar, bütün tedavilerde, 42nci günde plaseboya kiyasla anlamli sekilde daha az nazal atik oldugunu gösterir. Ek olarak %20 SLCD (T05), 42nci günde %5 Amphigen"e (T03) kiyasla anlamli sekilde daha az nazal atik gösterdi. Baska hiçbir tedavi farkliligi kaydedilmedi. Sekil 7 (A ve B), PCV2"ye özel hücre aracili immün (CMI) yanitlari ölçen bir interferon-gamma (IFN-y) testinin sonuçlarini gösteren iki grafiktir. CMI sonuçlari, asilaina sonrasi/tehdit öncesi (Sekil 7A) ve asilania sonrasi/tehdit sonrasi (Sekil 78) gösterilir. Bu grafikllerde 5 x 106 hücrenin uyarilmasi, anlamli sayildi (...). Bütün PCV2/M.hyo deney asilari, asilama sonrasinda saptanabilir bir lFN-y tepkis verdi. %10 SP yagi (TOZ), asilama sonrasi en güçlü IFN-y tepkisini tahrik etti. %20 SLCD (T05), daha erken bir tepki ancak 20nci günde en düsük tepkiyi indükledi. Ozellikle plasebo grubuiida büyük bir tehdit sonrasi tepki görüldü. Ek olarak tehdit sonrasi tepki, asilanmis domuz tedavi gruplarinda, plasebo grubuna kiyasla daha düsüktü. Asagidaki Tablo 7, plaseboya karsilik deneysel tedaviler ile elde edilen lenfoid tükenmesini gösterir. Tablo 7 PCV2 Histopatoloiisi (Lenfoid Tükenmesi) Lenfoid Tükenmesi Plaseboya Karsilik Tedavi Pozitif Negatif % Her zaman P-degeri Anlam Pozitif Plasebo 9 7 %56 Mevcut Mevcut degil degil %10 SP yagi 1 15 %6 0,0059 Evet %5 Amphigeii l 15 %6 0,0059 Evet %5 Ainph + %5 SLCD 0 16 %0 0,0008 Evet %20 SLCD 1 15 %6 0,0059 Evet Yukaridaki Tablo 7°de sunulan sonuçlar, bütün asilarin, lenfoid tükenmesine karsi kuvvetli koruma sagladigini gösterir. Ayrica istatistiksel açidan anlamli hiçbir asi tedavi kontrasti gözlemleninedi. Asagidaki Tablo 8, plaseboya kiyasla deneysel tedaviler ile elde edilen iminünohistokimyayi gösterir. Tablo 8 PCV2 Histopatoloiisi (Immünohistokimva) Imm'i'inohistokimya Plaseboya Karsilik Tedavi Pozitif Negatif % Her zaman P-degeri Anlam Pozitif Plasebo 12 4 %75 Mevcut Mevcut degil degil %10 SP yagi 0 16 %0 0,0001 Evet %5 Ainphigen l 15 %6 0,0002 Evet %5 Amph + %5 0 16 %0 0,0001 Evet SLCD %20 SLCD 0 16 %6 0,0001 Evet Yukaridaki Tablo 8°de sunulan sonuçlar, bütün asilarin, immünohistokimya ile kanitlandigi gibi PCV2 kolonizasyonuna karsi kuvvetli koruma sagladigini gösterir. Ayrica istatistiksel açidan anlamli hiçbir asi tedavi kontrasti gözlemlenniedi. Sonuç itibariyle bu örnekte sunulan sonuçlar, M.hyo çözülebilir anti jen preparasyonunun, PCV2 etkinligine müdahale etmedigini gösterir. Sonuçlar ayrica bütün PCV/M.hy0 deneysel asi formülasyonlarinin PCV2 tehdidine karsi etkinlik sagladigini da gösterir. Ek olarak sonuçlar, farkli adjuvan forinülasyonlari ile bazi istatistiksel ve sayisal farkliliklar elde edildigini, %10 SP yaginin en güçlü etkinligi sagladigini isaret eder. Ornek 8: Farkli Adjuvan Formülasyonlarinda 1 Siselik bir PCV2/M.hv0 Kombinasvon Asisinin M.hv0 Etkinliginin Degerlendirilmesi Bu çalisma, farkli adjuvan formülasyonlari ile l-siselik bir PCV2/M.hyo kombinasyon asisinin Mhyo etkinligini degerlendirmek için tasarlandi. M.hy0 anti jeni, bir sise içinde Domuz Sirkovirüsü (Tip l-Tip 2 Kimerasi veya PCVl-2, öldürülmüs Virüs) ile birlestirildi. Sivilarin islenmesi: Eylemsizlestirilmis M.hyo fermantasyon sivisi (Ornek l"de yukarida tarif edilmistir), belirtilen her bir grup için asagidaki gibi isleme tabi tutuldu. T02-T04: Bu islemler, yukaridaki Ornek 7'de T02-T04 islem gruplari için tarif edilenler ile ayniydi. m Bu, yukaridaki Ornek 1"de "Fermantasyon ve Eylemsizlestirme" basligi altinda tarif edildigi gibi eylemsizlestirilmis M.hyo hücreleri (Mhyo bakterini) ile eylemsizlestirildi. Bütün deneysel PCVZ/Mhyo asilari, farkli adjuvan formülasyonlari ile formüle edildi. Deneysel asi formülasyonlari, T02-T04 islemlerine göre islem görmüs M.hyo anti jenleri ile hazirlandi. Ek olarak Islem TOl, bir plaseboya (steril tuz) karsilik geldi. Islem TOS, M.hy0 bakterini bazli bir asi (Pfizer Animal Health) olan süresi geçmis bir RespiSure® asisina karsilik gelen bir pozitif kontroldür. Bu deneysel formülasyonlar, asagidaki Tablo 9"da tarif edilmistir, burada * sembolü, global M hyo tohumu, Protein A ile isleme tabi tutulmus süpernatanindan M hyo anti jenini isaret eder ve ** sembolü, Arastirma altinda Veterinerlik Urün'û (IVP) Serisini isaret eder. Tablo 9 Farkli Adiuvan Form'i'ilasvonlarinda M.hy0 Etkinlik Çalismasi için Kullanilan PCV2/M.hv0 Deneysel Asi F orm'ûlasyonlari Islem IVP Serisi* PCV1-2 M Hyo* Adjuvan Diger Ag Ag T01 87-244-DK Mevcut degil Steril Tuz (Plasebo) TOZ L0411RK08 1.6 RP 7.5 RP %10 SP Yagi Mevcut TO3 L041 lRK09 %5 Amphigen degil TO4 L0611RK03 %5 Amphigen + %5 SLCD T05 A827870 Süresi geçmis "RespiSure" asisi 3 haftalik domuzlar, yukarida Tablo 9"da tarif edilen farkli asi formülasyonlarindan tek bir doz ile intramüsküler yoldan asilandi. On dört hayvan, hem plasebo hem de %10 SP yagi gruplarina dahil edildi; on üç hayvan, pozitif kontrol grubuna dahil edildi ve on alti hayvan, hem %5 Amphigen hem de %5 Amphigen + %5 SLCD gruplarina dahil edildi. Hayvanlar, asilamadan 21 gün sonra virülan bir Mhyo saha izolati ile tehdit edildi. Hayvanlara, tehditten 28 gün sonra nekropsi yapildi ve akcigerler çikarildi ve Mhyo enfeksiyonu ile tutarli konsolidasyon bakimindan skorlandi. Asagidaki Tablo 10, ilgili tedavi gruplari için akciger lezyonu skorlarini ihtiva eder. Istatistiksel anlam, her bir grup için akciger skorlarinin Karisik Model Analiziyle belirlendi. Tablo 10 M.hv0 Akciger Lezyonlari Tedavi Hayvan LS Ortalama % Akciger sayisi Akciger Lezyonu Lezyonu Araligi Plasebo (T01) 14 %13,1 0,1 - 50,5 %10 SP yagi (TOZ) 14 %4,3 0,0 - 50,8 %5 Amphigen (TO3) 16 %4,7 0,0 - 38,5 %5 Amph + %5 16 %12,0 0,1 - 55,8 SLCD (T04) Süresi geçmis RSO 13 %2,28 0,0 - 34,5 (TOS) Yukaridaki Tablo lO'da gösterildigi gibi plasebo grubunun ortalama akciger lezyonu skoru, %131 iken buna karsilik %10 SP yagi ve %5 Amphigen tedavi gruplarinin ortalama akciger skorlari ayri ayri %43 ve %4.7 idi. Hem %10% SP yagi hem de %5 Amphigen formülasyonlari, akciger lezyonlarini azaltti ve/veya engelledi. Bu yüzden %10 SP yagi veya %5 Amphigen ile formüle edilmis deneysel PCV/M.hyo asilari, etkili kabul edildi. PCV2 antijeni, bu formülasyonlarin M.hyo etkinligine müdahale eder görünmedi. Buna karsilik %5 Amphigen + %5 SLCD grubunun ortalama akciger lezyonu skoru, %12.0 idi ki bu, plasebo ile kiyaslandiginda farkli olmadigindan kabul edilemez bir sonuç idi. Sonuç itibariyle %5 Ainphigen + %5 SLCD ile formüle edilmis deney PCV/M.hyo asisi, etkili kabul edilmedi. Akciger lezyonu skorlamasinda hayvan sayisinin azalmis olmasindan ve yüksek degiskenlikten ötürü bu çalismanin sonucunda hiçbir istatistiksel tedavi etkisi gösterilemedigi kaydedilir. Bu nedenle %10 SP yagi içinde PCV/M.hyo deneysel formülasyonlarinin M.hyo etkinligini test etinek için baska bir çalisma tasarlanmasina karar verildi. Bu tekrar çalismasi, asagidaki Ornek 9"da sunulmustur. Ornek 9: %10 SP yaginda 1 Siselik bir PCV2/M.hvo Kombinasvon Asisinin M.hv0 Etkinliginin Degerlendirilmesi Bu çalisma, lgG"yi çikarmak için Protein Aidan faydalanilan farkli M.hy0 üretme prosesleriyle hazirlanmis dört deneysel PCV2/M.hyo asisinin (asagidaki Tablo ll"de L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 ve L0711RKl4 Serileri) M.hy0 fraksiyonu etkinligini, standart M.hyo üretme prosesi ile hazirlaninis kontrol asilarina kiyasla degerlendirmek için tasarlanmis bir konsept kanitidir. Bu dört deneysel PCV2/M.hyo asisindan her biri, ad juvan olarak %10 SP yagi içeriyordu. Sivilarin islenmesi: m Yukaridaki Ornek 1'de "Fermantasyon ve Eylemsizlestirme" altinda tarif edildigi gibi eyleinsizlestirilmis M. hyopneumoniae antijeni. T03 ve T04: Yukaridaki Ornek l°de "Fermantasyon ve Eylemsizlestirme" altinda tarif edildigi gibi eylemsizlestirilmis M. hyopneumoniae hücreleri ile formüle edilmis. m M. Hyopneumoniae°yi°yi büyütmek için kullanilan ortamin Protein A ile isleine tabi tutulmasi. PPLO (domuz kalbinden çikarilmis), üreticinin talimatlarina göre (yani 2] g/ L) yapildi ve inaya özütü çözeltisi, USP içinde 21g/L olarak yapildi. Maya özütü çözeltisi daha sonra PPLO"ya %625 olarak ilave edildi ve karisim, 2 30 dakika süreyle 121°C°ye isitilarak sterilize edildi. Sistein hidroklorür, 90g/L olarak hazirlandi ve filtreli sterilizasyon yapildi. Dekstroz çözeltisi, her bir litre USP suyu basina 450 g dekstroz ilave edilerek yapildiktan sonra isiyla sterilizasyon yapildi. Nihai ortami hazirlamak için taban ortama %10 domuz serumu ilave edildikten sonra %001 sistein ve %10 dekstroz eklendi. Tam PPLO ortamindaki antikorlar, protein A ile isleme tabi tutularak çikarildi. Kisacasi bir litre eProtein A Sefaroz (parti numarasi 17-5199-03 GE Healthcare), bir cam kolon (10 X 11.5 cm) içerisine paketlendi. Depolama tamponu çikarildiktan sonra kolon, 2 kolon hacminde lM asetik asit ile isleme tabi tutuldu. Resim, kolon hacminde 50 mM NaPO4, lM NaCl tamponu (pH 7.0) ile dengelendi. PPLO ortaminin on bes litresi, resin üzerine saatte 140 cm"lik lineer bir akis hizinda yüklendi. Kolon devridaimi toplandi ve 0.2 mikronluk bir filtreden (Sartorius) geçirilerek filtreli sterilizasyon yapildi. Isleme tabi tutulmus ortam, yukarida "Fermeantasyon ve Eylemsizlestirme" altinda tarif edildigi gibi M. Hyopnömoniae hücrlerini çogaltmak için kullanildi. Tam eylemsizlestirilmis kültür (hücreler dahil olinak üzere), son asi halinde formüle edildi. m Eylemsizlestirilmis M. hyopneumoniae hücreleri, yukaridaki Ornek l"de "Fermantasyon ve Eylemsizlestirme" altinda tarif edildigi gibi hazrilandi. Eylemizlestirilmis fermantasyon sivisi, ~20,000xg"de (Sorvall RCSB) 30 dakika süreyle santrifüjlendi ve süpematan, 0.2 uM"lik filtrasyon vasitasiyla sterilize edildi. Yüz on bes ml rProtein A resini (parti numaras112-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare), bir kromatografi kolonu (5x6 cm) içerisine paketlendi. Depolama tainponu çikarildiktan ve 2 kolon hacminde IM asetik asit ile isleme tabi tutulduktan sonra resim, 5 kolon hacminde 50 HM NaPO4/1M NaCl tamponu, pH 7.01 ile dengelendi. Yaklasik olarak 1.2 litre aritilmis/filtre edilmis M. hyopneuinoniae antijeni içerikli sivi, resinden saatte 120 cm,lik bir akis hizinda geçirildi. Devridaiin toplandi ve 0.2 üM"1ik bir filtre vasitasiyla sterilize edildi. m Eylemsizlestirilmis M. hyopneuinoniae hücreleri, yukaridaki Ornek 1°de "Fermantasyon ve Eylemsizlestiiine" altinda tarif edildigi gibi hazrilandi. Eylemizlestirilmis ferinantasyon sivisi, tegetsel akis filtrasyonu vasitasiyla aritildi. Kisacasi nominal gözenek büyüklügü 0.2 uM olan bir polieter sülfon filtre (GE HealthCare, parti numarasi 56-4102-71), 0.5N sodyum hidroksit çözeltisi ile sterilize edildikten sonra steril USP suyu il yogun sekilde durulandi. Eylemsizlestirilmis inikoplazma kültür sivisi, aparata, dakikada 14.6L"ye hedefleninis bir tekrar sirkülasyon hizinda ve 2-34 PSI°11k bir transmembran basincinda dahil edildi. Aritma, oda sicakliginda yapildi. Filtre permeati t0plandi ve bir baska isleme kadar 2-8C°de saklandi. Yüz on bes ml rProtein A resini (parti nuinarasilZ-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare), bir kroinatografi kolonu (5x6 cm) içerisine paketlendi. Depolama tamponu çikarildiktan ve 2 kolon hacminde lM asetik asit ile isleme tabi tutulduktan sonra resin, 5 kolon hacminde 50 mM NaPO4/lM NaCl tamponu, pH 7.01 ile dengelendi. Yaklasik olarak 2.3 litre aritilmis/filtre edilmis M. hyopneumoniae anti jeni içerikli sivi, resinden saatte 120 cm°lik bir akis hizinda geçirildi. Devridaim toplandi ve 0.2 iiM'lik bir filtre vasitasiyla sterilize edildi. m Eylemsizlestirilmis M. hyopneumoniae hücreleri, yukaridaki "Fermantasyon ve Eylemsizlestirme" altinda tarif edildigi gibi hazirlandi. Eylemizlestirilmis fermantasyon sivisi, ~20,000xg"de (Sorvall RCSB) 30 dakika süreyle santrifujlendi ve süpematan, 0.2 uM"lik filtrasyon vasitasiyla sterilize edildi. Yüz on bes ml rProtein A Sefaroz (parti numarasi 17-5199-03 GE Healthcare), bir kromatografi kolonu (5x6 cm) içerisine paketlendi. Depolama tamponu çikarildiktan ve 2 kolon hacminde IM asetik asit ile isleme tabi tutulduktaii sonra resin, 5 kolon hacminde 50 HM NaPO4/1M NaCl tamponu, pH 7.01 ile deiigeleiidi. Yaklasik olarak 1.2 litre aritilmis/filtre edilmis M. hyopiieuinoiiiae antijeni içerikli sivi, resinden saatte 120 cm°lik bir akis hizinda geçirildi. Devridaiin toplandi ve 0.2 uM°lik bir filtre vasitasiyla sterilize edildi, Deneysel asi formülasyonlari, yukaridaki T02-T08 islemlerine göre islem görmüs M.hyo antijenleri ile hazirlandi. T02, T03 ve T04, pozitif kontrollere karsilik geldi. Ek olarak Islem T01, bir plaseboya (steril tuz) karsilik geldi. Bu deneysel formülasyonlar, asagida Tablo 11°de tarif edilir. M.hyo antijeni, global M.hyo tohumu, Protein A ile isleme tabi tutulmus süpernatanindan M.hyo antijenine karsilik gelir. "Protein A Islemi" koloiiundaki bilgiler, M.hyo süpernataninin Protein A ile fermantasyondaii önce mi yoksa sonra mi isleme tabi tutuldugunu gösterir. Tablo 11 SP Yagi Adiuvani icinde M.hv0 Etkinlik Cali_smasi için Kullanilan PCV2/M.hv0 Denevsel Asi Formi'ilasvonlari Islem Seri No. PCV1-2 M.hy0 Protein A Si'ipernatan Aritma Protein A Adjuvan Diger Ag Ag Islemi Yöntemi Markasi T01 L0311ASll Mevcut degil Steril Tuz TOZ A828718 Mevcut 13 S'uresi geçmis RespiSure One Amphigen Mevcut degil degil T03 L07IIRK09 1.5 RP 7.5 RP Protein A Islemi olmadan ve PCV-Z ile M.hy0 %10 SP T04 L0711RK10 Mevcut Protein A Islemi olmadan ve PCV-Z olmadan M.hyo Yagi degil TOS L0711RK11 1.5 RP Once Mevcut degil Sefaroz T06 L0711RK12 Sonra Santril'û j MAbSelect T07 L0711RK13 Sonra Filtre MAbSelect T08 L071 1RK14 Sonra Santrifu j Sel'aroz 3 haftalik domuzlar, yukarida Tablo ll°da tarif edilen farkli asi formülasyonlarindan tek bir doz ile intrami'isküler yoldan asilandi. Her bir tedavi grubuna 18 domuz dahil edildi. Hayvanlar, asilamadan 21 gün sonra virülan bir M.hyo saha izolati ile tehdit edildi. Hayvanlara, tehditten 28 gün sonra nekropsi yapildi ve akcigerler çikarildi ve M.hyo enfeksiyonu ile tutarli konsolidasyon bakimindan skorlandi. Sekil 8 (A ve B), ilgili tedavi gruplari için akciger lezyonu skorlarini gösterir. Istatistiksel anlam, her bir grup için akciger skorlarinin Karisik Model Analiziyle belirlendi. Sekil 8A ve 8Bsde gösterilen akciger lezyonu sonuçlari, sadece ikisinde (TO7 ve T08) domuzlarin %100"ü olmak üzere bütün tedavilerdekilerin, TR TR TR TR TR TR TR TR TR