TR201905272T4 - İmmünojenik bileşim. - Google Patents

Abstract

Bu buluş, bir Clostridium difficile (C. difficile) polipeptidi ve bir alüminyumsuz adjuvan içeren immünojenik bileşimler ile ilgilidir.

Description

TEKNIK ALAN Bu bulus, bir Clostridiuin difficile (C. difficile) polipeptidi ve bir alüminyumsuz adjuvan içeren immünojenik bilesimler ile ilgilidir. Bu bulus, ayni zamanda, asi bilesiinleriyle ve bu bulusa uygun asilar ve immünojenik bilesimlerin profilaksi veya tedavide ya da bir ilacin üretiminde kullanimiyla da ilgilidir.

BULUS HAKKINDA ON BILGILER C. difficile, nozokomiyal bagirsak enfeksiyonlarinin en önde gelen sebebidir ve insanlarda görülen psödomembranöz kolitin baslica nedenidir (Bartlett et al Ain. J. Clin. Nutr. ll suppl: 2521-6 (1980)).

C. difficile ile enfekte bireyler için taniyi takip eden 3 aylik periyoda istinaden hesaplanan genel mortalite orani %5,99'dur ve mortalite oraninin yas ilerledikçe arttigi, 80 üzeri yaslarda bulunan hastalarda (2010)). C. difficile enfeksiyonu için günümüzde tercih edilen tedavi yaklasimi antibiyotik (metronidazol ve vankomisin) kullanimina dayanmaktadir, fakat son dönemde bu amaçla kullanilan antibiyotiklere dirençli suslarin gelismis olduguna dair bulgular edinilmistir (Shah et al., Expert ReV. Anti Infect. Ther. 8(5), 555-564 (2010)). Bundan dolayi, C. difficile'yi hedef alan antikorlara ve/Veya ona karsi bir koruyucu immün cevap indükleme kabiliyetine sahip olan immünojenik bilesimlere ihtiyaç vardir.

C. difficile'nin enterotoksisitesinin temel kaynagi, A toksini ('ToxA') ve B toksini ('ToxB') adlariyla anilan iki toksinin etkisidir. A toksini ile B toksininin C-terminal domainlerinde tekrarlayan birimler bulunur; örnegin A toksininin C-terminal domaini, tekrarlayan bitisik nedenle bu C-terminal domaini 'tekrar domaini' olarak anilabilir. "Ho gibi, bu tekrar kisimlari da ayrica kisa tekrarlar (SR'ler) ile uzun tekrarlara (LR'ler) ayrilabilirler.

Daha önceden açiklanmis ve ortaya konmus olan C. difficile kaynakli anti jenlerin yer aldiklari immünojenik bilesimler bulunmaktadir. hamsterlerde bir koruyucu immün cevap indükte etmeye yarayan A toksini fragmanlari, somutlastirmak gerekirse C-terminal domain fragmanlari ortaya konmaktadir. WO 9920304 sayili patent yayini ise, formaldehit içinde inkübe edilerek inaktive edilmis olan birlikte saflastirilmis A toksini ile B toksininin karisimi hakkindadir. Diger yandan WO 00/61762 sayili patent yayini, C. difficile A toksini ve B toksininin tam boy C-terminal domainlerini ya da C-terminal domainlerinin fragmanlarini içeren inimi'inojenik bilesimler ile B toksininin olasi fragmanlari ve yani sira onlarin füzyon proteinleri konu edilmekte ve açiklanmaktadir. Immünojenisite yönünden daha ileri bir seviyeye tasinmis olan yeni bilesimler veya asilara ihtiyaç vardir. Bu amaçla gelistirilen bir stratejide, bir anti jene karsi immün cevap olusmasini saglamak ve olusan immün cevabi gelistirmek sayili patent yayininda, C. difficile A ve B toksinlerinin bir toksoidinin ve alüminyum hidroksit bilesigi gibi bir adjuvanin bulundugu bir bilesim anlatilmakta ve açiklanmaktadir.

Lipopolisakkarit ve Quillaja saponinlerinin kombinasyonlarini içeren adjuvanlar daha önceden örnegin EP 06071948 sayili patent yayininda açiklanmislardir. Suda yag emülsiyonlari da sektörde iyi bilinmekte olup, adjuvan bilesimleri olarak kullanimlarinin faydali sonuçlar C. difficile'ye karsi uygun bir immün cevap olusmasini saglayan asilara ve immünojenik bilesimlere hâlâ ihtiyaç duyulmaktadir.

Bulusun bir özelligine göre, bu bulus, bir Clostridium diffieile (C. difficile) A toksini fragmani ve/veya bir C. difficile B toksini fragmaiii içeren bir polipeptidin ve bir lipozom formunda olan bir immünolojik açidan aktif saponin fraksiyonu içeren bir adjuvanin yer aldigi bir immünojenik bilesim ile ilgilidir. Immünolojik açidan aktif saponin fraksiyonu QSZl olabilir ve lipopolisakkarit 3D-MPL olabilir. En uygunu, immünojenik bilesiinin yaklasik 50 ug 3D-MPL ve yaklasik 50 tig QSZl içermesidir.

Burada ayni zainanda, bir C. difficile A toksini fragmani ve/Veya bir C. difficile B toksini fragmani içeren bir polipeptidin ve bir suda-yag emülsiyonu içeren bir adjuvanin yer aldigi bir immünojenik bilesim de açiklanmakta olup, burada bahsi geçen suda-yag emülsiyonu bir metabolize edilebilir yag, bir tokol ve bir emülsifiye edici içerir. Söz konusu metabolize edilebilir yag, yaklasik 5,35 mg miktarinda bulunabilir. Tokol, yaklasik 5,94 mg miktarinda bulunabilir.

Emülsifiye edici ajanin yaklasik 2,425 mg miktarinda bulunmasi uygundur. Metabolize edilebilir yagin skualen, tokolün alfa-tokoferol ve emi'ilsifiye edici ajanin polioksietilen sorbitan monooleat olmasi uygundur.

Bu bulusun herhangi bir özelligine konu olan bir immünojenik bilesimin bir C. difficile A toksini tekrar domaini fragmani ve bir C. difficile B toksini tekrar domaini fragmani içermesi ve A toksini ve B toksinini nötralize eden antikorlar ortaya çikmasini saglamasi uygundur. Bulusun bir diger yapisinda, immünojenik bilesim, bir C. difficile A toksini fragmani ve bir C. difficile B toksini fragmani içermekte olup, burada fragmanlardan biri bir N-terminal fragman iken, digeri bir tekrar domaini fragmanidir.

Bu bulusun herhangi bir özelligine konu olan bir immünojenik bilesimin SEKANS KOD NO.: 3, SEKANS KOD NO.: 4, SEKANS NO.: 25 ya da SEKANS KOD NO.: 27'de gösterilen polipeptid varyantini içermesi uygundur.

Bu bulusun herhangi bir özelligine konu olan bir immünojenik bilesimin SEKANS KOD NO.: 10, SEKANS KOD NO.: 11, SEKANS KOD NO.: 33, SEKANS KOD NO.: 34 ya da SEKANS KOD NO.: 35 sekansmm bulundugu bir polipeptidi ya da bu sekaiislardan herhangi birinin bir varyanti veya fragmanini içermesi uygundur.

Bu bulusa konu olan immünojenik bilesimler, ek baska antijenler, örnegin Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Haemophilus influenzae (H.inf1uenzae), Neisseria ineningitidis (N. meningitidis), Escherichia coli (E.Coli), Moraxella catarrhalis (M. cattarhalis), Clostridium tetani (C. tetani), Corynebacterium diptherieriae (C. diptherieriae), Bordetella pertussis (B. pertussis), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), enterokoklar ve Staphylococcus aureus'tan (S. aureus) olusan grup içerisinden seçilen bir bakterinin kaynaklik ettigi anti jenler içerebilirler.

Bu bulus, bir özelligine göre, bulusa uygun bir immünojenik bilesimin ve bir farmasötik açidan kabul edilebilir yardimci maddenin bulundugu bir asi ile ilgilidir.

Bu bulus, bir özelligine göre, bulusa uygun bir immünojenik bilesim veya asinin C. difficile hastaliginin tedavisinde veya önlenmesinde kullanimi ile ilgilidir.

Bu bulus, bir özelligine göre, C. difficile hastaliginin tedavisinde veya önlenmesinde kullaiiim için olan bulusa uygun bir immünojenik bilesim veya asi ile ilgilidir.

Bu bulus, bir özelligine göre, bulusa uygun bir iminünojenik bilesim veya asinin C. difficile hastaliginin önlenmesi veya tedavisine yönelik bir ilacin hazirlanmasinda kullanimi ile ilgilidir.

Bu bulus, bir özeligine göre, C. difficile hastaligini 'Önlemek veya tedavi etmek için olan ve bulusa uygun bir immünojeiiik bilesim veya asinin bir denege uygulanmasini içeren bir yöiitem ile ilgilidir.

SEKILLERE DAIR KISA AÇIKLAMALAR SEKIL 1 - Adjuvan A, QSZl bulunmayan Adjuvan A ve MPL bulunmayan Adjuvan A ile formüle edilen F2 ile immünize edilen hamsterlere iliskin anti-ToxA ve anti-TOXB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafikler.

SEKIL 2 - Adjuvan A, Adjuvaii B ve Alum ile formüle edilen F2 veya adjuvansiz F2 ile immünize edilen hamsterlere iliskin anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafikler.

SEKIL 3 - Adjuvan B, ASO4D, Adjuvan A veya Adjuvan C'de formüle edilen F2 füzyon proteinleri ile farkli dozlarda iininünize edilen erkek ve disi hamsterlerden I. dozlainadan sonra alinan serumlara iliskin anti-ToxA ve anti-TOXB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafikler.

SEKIL 4 - Adjuvan B, ASO4D, Adjuvan A veya Adjuvan C'de formüle edilen F2 füzyon proteinleri ile farkli dozlarda iininünize edilen erkek ve disi hamsterlerden II. dozlamadan sonra alinan serumlara iliskin anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafikler.

SEKIL 5 - Adjuvan B, ASO4D, Adjuvan A veya Adjuvan C'de forinüle edilen F2 füzyon proteinleri ile farkli dozlarda iininünize edilen erkek ve disi hamsterlerden III. dozlamadan sonra alinan serumlara iliskin anti-ToxA ve anti-TOXB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafikler.

SEKIL 6 - Adjuvan B, ASO4D, Adjuvan A veya Adjuvan C'de formüle edilen F2 füzyon proteinleri ile farkli dozlarda iininünize edilen erkek ve disi hamsterlerden lll. dozlamadan sonra 87. günde alinan serumlara iliskin anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafikler.

SEKIL 7 - Adjuvan B, ASO4D, Adjuvan A veya Adjuvan C'de formüle edilen F2 füzyon proteinleri ile farkli dozlarda iminünize edilen erkek hamsterlerden I., II. ve III. dozlainalardan sonra alinan serumlara iliskin anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafikler.

SEKIL 8 - Alum veya Adjuvan A'da formüle edilen F2 füzyon proteini ile veya bir Karisim (ToxA + ToxB) ile immünize edilen erkek ve disi hamsterlere iliskin anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafikler.

SEKIL 9 - Ad juvan B'de formüle edilen A toksininin bir C-terminal fragmani (2387-2706 sayili ainino asitler), B toksininin bir C-terminal ile immünize edilen farelerde kaydedilen anti-ToxA immünojenisitesinin gösterildigi grafik.

SEKIL 10 - Adjuvan B'de formüle edilen A toksininin bir C-terminal fragmani (2387-2706 sayili amino asitler), B toksininin bir C-terminal ile immünize edilen farelerde kaydedilen hemaglütinasyon inhibisyonunun gösterildigi grafik.

SEKIL l 1 - Adjuvan B'de formüle edilen A toksininin bir C-terminal fragmam (2387-2706 sayili ainino asitler), B toksininin bir C-terininal ile immünize edilen farelerde kaydedilen anti-ToxB immünojenisitesinin gösterildigi grafik.

SEKIL 12 - Adjuvan B'de formüle edilen A toksininin bir C-terminal fragmani (2387-2706 sayili ainino asitler), B toksininin bir C-terminal ile immünize edilen farelerde kaydedilen sitotoksisite inhibisyon SEKIL 13 - Adjuvan B'de formüle edilen F2, F52NeW, F54Gly, F54New veya F5ToxB füzyonu ile immünize edilen farelere iliskin anti-ToxA ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafik.

SEKIL 14 - Adjuvan B'de forinüle edilen F2, F52NeW, F54Gly, F54New veya F5ToxB füzyonu ile immünize edilen farelere iliskin anti-ToxB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafik.

SEKIL 15 - Adjuvan B'de formüle edilen F2, F52NeW, F54Gly, F54NeW veya F5T0XB füzyonu ile immünize edilen farelerde kaydedilen heinaglütinasyon inhibisyonunun gösterildigi grafik.

SEKIL 16 - Adjuvan B'de formüle edilen F2, F52New, F54Gly, F54NeW veya F5ToxB füzyonu ile immünize edilen farelerden alinan HT29 hücrelerinde kaydedilen sitotoksisite titrelerinin gösterildigi grafik.

SEKIL 17 - Adjuvan B'de formüle edilen F2, F52NeW, F54G1y, F54New veya F5ToxB füzyonu ile immünize edilen farelerden alinan grafik.

ToxB-Cter (1750-2360 sayili amino asitler) ve füzyon proteinleri (adjuvansiz) ile immünize edilen farelere iliskin anti-ToxA ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafik.

ToxB-Cter (1750-2360 sayili amino asitler) ve füzyon proteinleri (adjuvansiz) ile immünize edilen farelere iliskin anti-ToxB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafik.

SEKIL 20 - Adjuvan B'de formüle edilen C. difficile ToxA-Cter asitler) ve füzyon proteinleri ile imm'ünize edilen farelere iliskin anti- ToxA ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafik: II. dozlamadan sonra, 111. dozlaniadan sonra, rapelden önce ve IV. dozlamadan sonra alinan serumlar.

SEKIL 21 - Ad juvan B'de formüle edilen C. difficile ToxA-Cter asitler) ve füzyon proteinleri ile immünize edilen farelere iliskin anti- ToxB ELISA sonuçlarinin gösterildigi grafik: ll. dozlamadan sonra, 111. dozlamadan sonra, rapelden önce ve IV. dozlamadan sonra alinan serumlar.

SEKIL 22 - Dairesel dikroizm kullanilarak ölçülen Füzyonlar 2, 3, 4 ve 5'in uzak-UV spektrumlarinin gösterildigi grafik. Füzyon 2'ye iliskin spektrum, küçük kareler biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir; füzyon 3'e iliskin spektrum, küçük elmaslar biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile teinsil edilmektedir; füzyon 4'e iliskin spektrum, daireler biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir ve füzyon 5'e iliskin spektrum, çarpi isaretleri biçiininde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir.

SEKIL 23 - Dairesel dikroizm kullanilarak ölçülen Füzyonlar 2, 3, 4 ve 5'in yakin-UV spektrumlarinin gösterildigi grafik. Füzyon 2'ye iliskin spektrum, çarpi isaretleri biçiminde resinedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile teinsil edilmektedir; füzyon 3'e iliskin Spektruin, daireler biçiminde resinedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir; füzyon 4'e iliskin spektrum, üçgenler biçiminde resinedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir ve füzyon 5'e iliskin spektrum, küçük elinaslar biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir.

SEKIL 24 - Dairesel dikroizm kullanilarak ölçülen F52New, F54Gly, F54NeW ve F5TOXB füzyonlarinin uzak-UV spektrumlarinin gösterildigi grafik. F52New'e iliskin Spektruin, çift çarpi isaretleri biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir; F54Gly'ye iliskin spektrum, üçgenler biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile teinsil edilmektedir; F54New'e iliskin spektrum, kareler biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir ve F5T0xB'ye iliskin spektrum, çarpi isaretleri biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir.

SEKIL 25 - Dairesel dikroizm kullanilarak ölçülen F52New, F54Gly, F54NeW ve F5TOXB füzyonlarinin yakin-UV spektrumlarinin gösterildigi grafik. F52New'e iliskin spektrum, çift çarpi isaretleri biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile teinsil edilinektedir; F54Gly'ye iliskin spektrum, 'üçgenler biçiininde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir; F54NeW'e iliskin spektruin, kareler biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilinektedir ve F5ToxB'ye iliskin spektrum, çarpi isaretleri biçiminde resmedilen noktalarin yer aldigi bir çizgi ile temsil edilmektedir.

AYRINTILI AÇIKLAMA Bulus sahipleri, aluin içermeyen adjuvanlar ile, somutlastirmak gerekirse burada açiklanan Adjuvan A ve Adjuvan B gibi adjuvanlar ile formüle edilen ve bir C. difficile A toksini fragmani ve/Veya bir C. difficile B toksini fragmani içeren bir polipeptidin bulundugu immünojenik bilesimlerin adjuvansiz C. difficile polipeptidi içeren bilesiinlere kiyasla C. difficile'ye karsi daha gelismis bir immün cevap ortaya çikmasini sagladiklarini göstermislerdir. Bu bulusa konu olan immünojenik bilesimler, alum ile formüle edilen C. difficile polipeptidlerinin C. difficile'ye karsi ortaya çikmasini sagladiklari immün cevaptan daha gelismis olan bir immün cevap ortaya çikmasini da saglayabilirler.

POLIPEPTIDLER Bir C. difficile A toksini fraginani ve/Veya bir C. difficile B toksini fragmani içeren polipeptid, WO 9920304 sayili patent yayininda açiklananlarin örnek gösterilebilecegi, formeldehitte inkübe edilerek inaktive edilmis olan bir saflastirilmis A toksini veya B toksini ihtiva edebilir.

Polipeptid, bir C. difficile A toksini N-terminal fragmani ve bir C. difficile B toksini tekrar domaini fraginani içerebilir. Polipeptid, bir C. difficile A toksini tekrar domaini fragmani ve bir C. difficile B toksini N-terminal fragmani içerebilir. Polipeptid, bir C. difficile A toksini tekrar domaini fragmani ve bir C. difficile B toksini tekrar domaini fragmani içerebilir.

Polipeptid, C. difficile A toksini ve B toksininin tam boy N-terminal ve/Veya C-terminal domainlerini veya onlarin fragmanlarini içerebilir.

Bulusun bir yapisinda, bulusa konu olan immünojenik bilesimlerde bulunan polipeptid, C. difficile A toksini ve/Veya B toksininin tam boy N-terminal doinainini içermez. Bulusun bir yapisinda, bulusa konu olan imini'inojenik bilesimlerde bulunan polipeptid, C. difficile A toksini ve/Veya B toksininin bir N-terminal domain fragmanini Polipeptid, bir füzyon proteini olabilir. Örnek vermek gerekirse, füzyon proteini, SEKANS KOD NO.: 36 ve 37 gibi bir füzyon sekansi sekanslari içerebilir.

Polipeptid bir birinci fragman ve bir ikinci fragman içerebilecek olup, (i) birinci fragman, bir A toksini tekrar domaini fragmanidir; (ii) ikinci fragman, bir B toksini tekrar domaini fragmanidir; (iii) birinci fragman, bir birinci tekrar kismi içinde yer alan bir birinci yakin uç içerir; (iv) ikinci fragman, bir ikinci tekrar kismi içinde yer alan bir ikinci yakin uç içerir; ve burada birinci fragman ile ikinci fragman birbirlerine komsudurlar ve burada birinci tekrar kismi ile ikinci tekrar kismi yapisal benzerlige sahiptirler.

Polipeptid terimi, art arda dizili amino asitlerden meydana gelen bir amino asit sekansina atif yapar. tekrarlayan sekanslar içeren C-terininal domainine atif yapar. A toksini proteininin C-terininal domaini, örnegin VP110463 susu asitlerini ve/Veya farkli bir sustaki mütekabi] bölgeyi teskil edebilir.

VP kaynakli A toksininin 1832-2710 sayili amino asitleri, SEKANS KOD NO.: l'deki 1832-2710 sayili amino asitlere tekabül eder. tekrarlayan sekanslar içeren C-terminal doinainine atif yapar. B toksini proteininin C-terminal domaini, ömegin VP110463 susu asitlerini ve/Veya farkli bir sustaki mütekabi] bölgeyi teskil edebilir.

VP kaynakli A toksininin 1834-2366 sayili amino asitleri, SEKANS KOD NO.: 2'deki 1834-2366 sayili amino asitlere tekabül eder.

A toksininin tam boy N-terminal domaini, VP110463 susu (ATCC 43255) kaynakli A toksininin 1-542 sayili amino asitlerini ve/Veya farkli bir sustaki mütekabil bölgeyi teskil edebilir. Dolayisiyla, "bir C. difficile A toksini N-terminal fragmani" ya da "bir A toksini N- terminal doinain fragmani" teriini, VP kaynakli A toksininin '1-542 sayili amino asitlerinden olusan bir fragmanina ve/Veya farkli bir sustaki mütekabil bölgeye atif yapar.

VP kaynakli A toksininin l-542 sayili amino asitleri, SEKANS KOD NO.: 1'deki 1-542 sayili amino asitlere tekabül eder.

B toksininin tam boy N-terminal domaini, VP110463 susu (ATCC 43255) kaynakli B toksininin 1-543 sayili amino asitlerini ve/veya farkli bir sustaki mütekabil bölgeyi teskil edebilir. Dolayisiyla, "bir C. difficile B toksini N-terminal fragmani" ya da "bir B toksini N- terminal domain fragmani" terimi, VP kaynakli B toksininin l-543 sayili amino asitlerinden olusan bir fragmamna ve/Veya farkli bir sustaki mütekabil bölgeye atif yapar.

VP kaynakli B toksiiiinin 1-543 sayili amino asitleri, SEKANS KOD NO.: 2'deki 1-543 sayili amino asitlere tekabül eder.

C. difficile A ve B toksinleri, korunan proteinlerdir. Bununla birlikte, bu proteinlerin farkli suslardaki muadillerinin sekanslari arasinda ufak farklar vardir. Farkli suslardaki A toksini veya B toksini ainino asit sekanslari, amino asit sayisi bakimindan da farklilik gösterebilirler.

Bulusun bir yapisinda, A toksini tekrar domaini ve/Veya B toksini tekrar domaini, SEKANS KOD NO.: 1'deki 1832-2710 sayili amino özdesligine sahip olan bir varyant sekans ya da SEKANS KOD NO.: olabilir.

Bulusun bir yapisinda, A toksini N-terminal domaini, SEKANS KOD veya %100 oraninda sekans özdesligine sahip olan bir varyant sekans olabilir. Bulusun bir yapisinda, B toksini N-terminal domaini, SEKANS KOD NO.: 2'deki 1-543 sayili ainino asitler ile en az %90, bir varyant sekans olabilir.

Bir 'varyant', bir artigin yerine ayni fiziko-kimyasal özelliklere sahip olan baska bir artigin geçmesi anlamina gelen konservatif amino asit ikameleri disinda referans polipeptid ile ayni olan bir polipeptidi teskil eder. Bu tür ikamelere verilebilecek standart örnekler arasinda, Ala, Val, Leu ve Ile arasi ikameler, Ser ve Thr arasi ikameler, asidik artiklar Asp ile Glu arasi ikameler, Asn ve Gln arasi ikameler, bazik artiklar Lys ile Arg arasi ikameler ve aromatik artiklar Phe ile Tyr arasi ikaineler bulunur.

Ayrica, bir susun A toksini (veya 8 toksini) ile baska bir susun A toksininin (veya B toksininin) C-terminal domainleri veya N-terminal domainleri amino asit nuinaralandirmasi bakimindan da birbirlerinden farkli olabilir. Bu sebeple, 'farkli bir sustaki mütekabil' tabiri, bir referans susta (Örnegin C. difficile VP110463 susu) bulunan amino asitlere tekabül eden, fakat farkli bir susun kaynaklik ettigi bir toksiiide bulunan ve bundan dolayi farkli numaralandirilabilecek olan amino asitlere atif yapar. 'Mütekabil' amino asitlerden meydana gelen bir bölge, farkli suslarin toksinleriniii sekanslari birbirleri ile hizalanarak belirlenebilir. Burada sunulan amino asit numaralari, VP110463 susundaki amino asit numaralarina atif yaparlar.

Bir polipeptid veya proteinin 'fragman'i, o polipeptid veya proteindeki meydana gelen bir kisimdir.

C. difficile'nin "A toksiiii N-terminal domain fragmani", A toksininiii tam boy N-teiininal domaininde yer alan art arda dizili örnegin 100, adet amino asitten meydana gelen bir kisimdir. C. difficile'nin "B toksiiii N-terminal domain fragmani", B toksiiiinin tam boy N- terniinal doinaininde yer alan art arda dizili örnegin 100, 150, 180, asitten meydana gelen bir kisimdir.

A toksini tekrar domaini fragmani, A toksini tekrar domaiiiinde yer bir kisim olabilir. A toksini tekrar domaini fraginani, art arda dizili sayida veya 580'den az sayida amino asitten meydana gelen bir kisim olabilir. B toksini tekrar domaini fragmani, B toksini tekrar meydana gelen bir kisim olabilir. B toksini tekrar domaini fragmani, art arda dizili 530'dan az sayida, 500'den az sayida, 480'den az sayida veya 450'den az sayida amino asitten meydana gelen bir kisim olabilir. kisma atif yapar. 'Ikinci fragman' terimi, B toksini tekrar domaininde atif yapar. bulunmakta olup 0 fragmani ikinci fragmana (B toksini fragmani) kovalent baglayan veya birinci fragman ile ikinci fragman arasindaki bir baglayici sekansa kovalent baglayan uca atif yapar. 'Ikinci yakin uç' terimi, birincil yapida (ainino asit sekans) ikinci fragmanin birinci fragmana en yakin olan ucuna atif yapar.

A toksininin C-terminal domaini, 8 tekrar kismindan (yani tekrar kismi 1, tekrar kisini ll, tekrar kisini lll, tekrar kisini IV, tekrar kismi V, tekrar kisini VI, tekrar kismi VII ve tekrar kismi VIII) olusur. Bu tekrar kisimlari da ayrica kisa tekrarlar (SR'ler) ile uzun tekrarlara (LR'ler) ayrilabilir (bir uzun tekrar bulunmayan A toksini tekrar kismi VIII hariç). Uzun tekrarlarin her biri, diger uzun tekrarlar ile bir miktar yapisal benzerlik ve sekans benzerligine sahiptir. Kisa tekrarlar da diger kisa tekrarlar ile bir miktar yapisal benzerlik ve sekans benzerligine sahiptir. B toksininin C-terminal domaini de benzer sekilde 5 tekrar kismindan olusur ve bu kisimlarin her biri ayrica SR'ler ve LR'lere ayrilabilir. Her tekrar kisini bir LR ve 2 ile 5 arasi sayida SR içerir (bir uzun tekrar bulunmayan B toksini tekrar kismi V hariç). Bu tarifnamede "'bir' tekrar kismi" tabiri geçen yerlerde atif yapilan ya ToxA'nin sekiz tekrar kismindan biri (yani 1, II, III, IV, V, VI, VII veya VIII), ya TOXB'nin bes tekrar kismindan biri (yani 1, II, kismi tekrar kisinidir. Burada kullanildigi anlainiyla 'birinci tekrar kismi' terimi, A toksini tekrar domaininde yer alan bir tekrar kismina (veya kismi tekrar kismina) atif yapar. 'Ikinci tekrar kismi' ise, B toksini tekrar domaininde yer alan bir tekrar kismina (veya kismi tekrar kismina) atif yapar. Örnegin, ToxA'nin tekrar kismi I üç SR ve bir LR içerir ve bunlara sirasiyla TOXA'nm birinci SRI'si, TOXA'nm ikinci SRI'si, ToxA'nin üçüncü SRI'si ve TOXA'nin LRI'si olarak atif yapilabilir.

Birinci fragmanin sonlandigi amino asit hangi 'tekrar kismi' içinde yer aliyorsa, birinci yakin uç 0 tekrar kismi içinde sayilir (yani birinci yakin uç, tekrar kismi sekansinin yalnizca bir kismini içerir). Ayiii sekilde, ikinci fragmanin soiilandigi amino asit hangi 'tekrar kismi' içinde yer aliyorsa, ikinci yakin uç 0 tekrar kismi içinde sayilir. Ornek amino asitlerinden veya baska bir sustaki mütekabil amino asitlerden herhangi biri ile sonlaniyorsa, birinci yakin ucun TOXA'nin tekrar kismi 1 içinde yer aldigi kabul edilir. Ayrica, birinci yakin ucun sonlandigi amino asidin yer aldigi 'uzun tekrar' ya da 'kisa tekrar', birinci yakin ucun içinde bulundugu 'uzun tekrar' veya 'kisa tekrar'dir; ayni sekilde, ikinci yakin ucun sonlandigi amino asidin yer aldigi VPIlO A toksini ile B toksininin her bir domaininin amino asit pozisyonlari tanimlanmistir. Bunlar asagida gösterildigi gibidir (Tablo 1).

Ad Baslangiç pozisyonu Bitis pozisyonu ToxA_I SRl 1832 1852 SR2 l 853 l 873 SR3 1874 1893 LR 1894 1924 ToxA_II SRl 1925 1944 SR2 1945 1965 SR3 1966 l 986 SR4 1987 2007 LR 2028 2058 T0xA_III SRl 2059 2078 SR2 2079 2099 SR3 2100 2120 SR4 2121 2141 SR5 2142 2161 LR 2162 2192 T0xA_IV SRl 2193 2212 SR2 2213 2233 SR3 2234 2253 SR4 2254 2275 LR 2276 2306 T0xA_V SRl 2307 2326 SR2 2327 2347 SR3 2348 2368 SR4 2369 2389 SR5 2390 2409 LR 2410 2440 T0xA_VI SRl 2441 2460 SR2 2461 2481 SR3 2482 2502 SR4 2503 2522 LR 2523 2553 SR2 2574 2594 SR3 2595 2613 LR 2614 2644 SR2 2665 2686 SR3 2687 2710 SR2 1855 1876 SR3 1877 1896 LR 1897 1926 SR2 1947 1967 SR3 1968 1987 SR4 1988 2007 LR 2028 2057 TOXB_III SR1 2058 2078 SR2 2079 2099 SR3 2100 2119 SR4 2120 2139 LR 2160 2189 SR2 2213 2233 SR3 2234 2253 SR4 2254 2273 LR 2294 2323 SR2 2344 2366 Bulusun bir yapisinda, A toksininin tekrar kisini denildiginde atif 2645-2710 sayili amino asitleri ya da farkli bir C. difficile susundaki mütekabil bölgedir. Bulusun bir diger yapisinda, B toksininin tekrar kismi denildiginde atif yapilan, B toksininin (SEKANS KOD NO.: 2) ainino asitleri ya da farkli bir C. difficile susundaki mütekabil bölgedir. difficile susundaki mütekabil amino asitlere atif yapiyor olabilir.

Ayni sekilde, 'uzun tekrar' terimi, A toksininin (SEKANS KOD NO.: 2294-2323 sayili amino asitlerine ya da farkli bir C. difficile susundaki mütekabil amino asitlere atif yapiyor olabilir.

Bu bulusa konu olan polipeptidler, daha büyük bir proteinin, örnegin bir prekürsör veya bir füzyon proteininin bir parçasini teskil ediyor olabilirler. Saflastirmada yardimci olan sekanslar içeren bir ek amino asit sekansinin, örnegin birden çok sayida histidin artiginin ya da rekombinan üretim sirasinda stabilitenin korunmasini saglayan bir ek sekansin bulunmasi genelde faydali olur. Ayrica, nihai molekülün immünojenik potansiyelini artirmak üzere bir eksojen polipeptid veya lipid kuyruk veya polinükleotid sekanslarinin eklenmesi de düsünülebilir. veya 1 veya daha az sayida amino asit bulundugu ya da 0 amino asit bulundugu anlainina gelir.

Fragmanlarin bulunabilecekleri konumlara istinaden devam etmek gerekirse, birinci fragmanin N-terminali ikinci fragmanin C- terminaline komsu olabilir; alternatif olarak birinci fraginanin C- terininali ikinci fragmanin N-terminaline komsu olabilir ya da birinci fragmanin C-terminali ikinci fragmanin C-terminaline komsu olabilir ya da birinci fragmanin N-terminali ikinci fragmanin N-terminaline komsu olabilir. veya daha yüksek bir oranda ya da %100 oraninda sekans özdesligi bulunan iki sekans, 'birbirleri ile sekans benzerligine sahip' olan sekanslar sayilacaklardir. hangisi ilgiliyse iki veya daha fazla sayida polipeptid sekansi ya da iki veya daha fazla sayida polinükleotid sekansi arasinda bulunan ve o sekanslar karsilastirilarak belirlenen bir iliskidir. Sektörde "özdeslik", duruma göre hangisi ilgiliyse polipeptid ya da polinükleotid sekanslari arasinda söz konusu olan ve o sekanslarin dizilimleri arasindaki eslesmeye bakilarak belirlenen sekans ilintililik derecesi anlamina da gelir. "Ozdeslik", sadece bunlarla sinirli kalmaksizin ve fakat asagida belirtilen eserlerde açiklanan yöntemler dahil olmak üzere sektörde bilinen yöntemler ile kolayca hesaplanabilir: Coniputational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genoine Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, (1988). Ozdeslik belirleme yöntemleri, test edilen sekanslar arasindaki en büyük eslesmenin yakalanmasini saglayacak sekilde tasarlanan yöntemlerdir. Ayrica, özdeslik belirleme yöntemleri, genel kullanima açik bilgisayar programlarinda kodlanan yöntenilerdir. Iki sekans arasindaki özdesligi belirleme amaçli bilgisayar programi yöntemleri arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, Needle programi, BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403- 410 (1990)) ve FASTA (Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci.

NCBl'dan ve baska kaynaklardan herkesçe erisilebilir (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; belirlemek için, iyi bilinen Smith Waterman algoritmasi da kullanilabilir.

Bir örnekte, polipeptid sekans karsilastirmasinda kullanilan parametreler asagida gösterildigi gibidir: Algoritma: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Karsilastirma matrisi: BLOSSUM62, Henikoff and Henikoff, Bosluk bedeli: 10 Bosluk uzatma bedeli: 0,5 Bu parametrelerde kullanimda faydali sonuçlar veren bir genel kullanima açik program, EMBOSS paketi içinde 'Needle' prograini adi altinda bulunmaktadir (Rice P.et al, Trends in Genetics 2000 col. 16(6):276-277). Yukarida belirtilen parametreler, peptid karsilastirmalari için (uç bosluklari için sifir bedel ile birlikte) varsayilan parainetrelerdir.

Bulusun bir yapisinda, birinci tekrar kismi ile ikinci tekrar kisini birbirleriyle yüksek ölçüde yapisal benzerlige sahiptirler. Aralarindaki sekans özdesligi %40, %45, %50 veya %60'tan yüksek olan iki sekansin yüksek yapisal benzerlige sahip oldugu kabul edilebilir.

Yüksek sekans özdesliginin bulunup bulunmadigi, sekanslari hizalamaya olanak saglayan yazilimlar (EMBOSS, Blast, ...) kullanilarak belirlenebilir. Bilinen bir 3D yapiya sahip olan bir protein ile %40, %45, %50 veya %60 oraninda sekans özdesligine sahip olan bir proteinin 3D model yapisi, SwissModel web sunucusu kullanilarak aslina uygun bir sekilde olusturulabilir.

Bulusun bir yapisinda, bulusa konu olan polipeptid, A toksini veya B toksinini n'otralize eden antikorlar ortaya çikmasini saglar. Bulusun bir diger yapisinda, söz konusu polipeptid, A toksinini nötralize eden antikorlar ortaya çikmasini saglar. Bulusun bir diger yapisinda, söz konusu polipeptid, B toksinini nötralize eden antikorlar ortaya çikmasini saglar. Bulusun bir diger yapisinda, söz konusu polipeptid, hem A toksinini hem de B toksinini nötralize eden antikorlar ortaya çikmasini saglar. Burada geçen 'nötralize edici antikorlar ortaya çikmasini saglar' tabiriyle anlatilmak istenen, ilgili bilesimler bir meineliyi, örnegin, bir fareyi, bir gine domuzunu veya bir insani immünize etmek üzere kullanildiklarinda, o memelide nötralize edici antikorlarin olustugudur.

Bir polipeptidin bir toksini hedef alan nötralize edici antikorlar ortaya çikmasini saglayip saglamadigi, o polipeptidi içeren bir immünojenik bilesimle bir grup farenin immünize edilmesi, ardindan farelerin serum numunelerinin alinmasi ve enzim-bagli immünosorbent eseyi (ELISA) uygulanarak bu serum numunelerindeki anti-toksin titrelerinin analiz edilmesi yoluyla Ölçülebilir. Serumlar, immünize edilmemis olan baska farelerden alinan bir referans numune ile karsilastirilabilir. Bu teknigin bir örnegi, 'Örnek 6'da bulunabilir.

Serumlardan bu bulusa konu olan polipeptide karsi referans daha yüksek ya da ondan da fazla olan bir ELISA okuma degeri elde edilmesi, o polipeptidin A toksinini nötralize eden antikorlar ortaya çikmasini sagladigi anlamina gelir.

Bulusun bir diger yapisinda, bulusa konu olan polipeptid, bir konakçi memelide C. difficile suslarina karsi bir koruyucu immün cevap ortaya çikmasiiii saglar. Burada geçen 'bir koruyucu immün cevap ortaya çikmasini saglar' ifadesi ile anlatilmak istenen, bulusa konu olan immünojeiiik bilesim bir memeliyi, örnegin bir fare, gine domuzu veya insani inimüiiize etmek üzere kullanildiginda, 0 memelide memeliyi C. difficile'den dolayi ölmekten koruma kabiliyetine sahip olan antikorlar olustugudur. Bulusun bir yapisinda, burada bahsi geçen konakçi memeli, fare, tavsan, gine domuzu, maymun, insan olmayan priniatlar ve insandan olusan grup içinden seçilir. Bulusun bir yapisinda, konakçi memeli bir faredir. Bulusun bir diger yapisinda, koiiakçi memeli bir insandir.

Bir polipeptidin bir konakçi memelide C. difficile suslarina karsi bir koruyucu iminüii cevap ortaya çikmasini saglayip saglayamadigi, bir yükleme eseyi uygulanarak belirlenebilir. Bu tür bir eseyde, konakçi memeli polipeptid ile asilanir ve C. difficile yüklemesine maruz birakilir. Memeliiiin yüklemeden sonra ne kadar süreyle sag kaldigi, polipeptid ile imniünize edilmemis olan bir referans nienieliiiin yüklemeden sonra ne kadar süreyle sag kaldigi ile karsilastirilir. Bir polipeptid ile immünize edilen bir memeliniii C. difficile yüklemesinden sonra sag kaldigi sürenin 0 polipeptid ile immünize edilmemis olan bir referans memeliniii yüklemeden sonra sag kaldigi daha uzun olmasi, o polipeptidin bir koruyucu imiiiün cevap ortaya çikmasini sagladigi anlamina gelir. Bulusun bir yapisinda, bulusa konu olan polipeptid, fare, gine domuzu, maymun ve insandan olusan grup içinden seçilen bir memelide C. difficile'ye karsi bir koruyucu immün cevap ortaya çikmasiiii saglar. Bulusun bir yapisinda, bahsi geçen memeli bir faredir; bulusun bir diger yapisinda, bahsi geçen memeli bir insandir.

A ve B toksinlerinin C-terminal (tekrar) domainlerinin nativ yapisi, bir uzamis ß solenoid-benzeri yapidan olusur. Bu yapi, "Ho et al. (PNAS yapi ile birlikte temelde [3 yaprak yapilarindan olusur. Ikincil yapilar, dairesel dikroizm (CD) kullanilarak belirlenebilirler. Örnek vermek gerekirse, ikincil yapi, CD spektrumlarinin uzak-UV bölgesindeki (190-250 nm) sekli ve magnitüdü ölçülerek ve elde edilen sonuçlar bilinen yapilara iliskin bulgular ile karsilastirilarak belirlenebilir. Bu belirleme, örnegin asagidaki `Örnek 5'te görülebilecegi gibi, bir Jasco J- 720 spektropolarimetrede 1 nm çözünürlük ve bant genisliginde 178 nM'den 250 nm'ye kadar olan 0,01 cm'lik bir optik yol üzerinde gerçeklestirilebilir. içerir. Bulusun bir yapisinda, ikinci fragman, %28, %25, %23, %20, içerir. Bulusun bir diger yapisinda, birinci fragman ile ikinci içerir. Bulusun bir yapisinda, ikinci fragman, %20, %25, %28, %30, yapisi içerir. Bulusun bir diger yapisinda, birinci fragman ile ikinci veya %42'den yüksek bir oranda beta yaprak yapisi içerir.

Bulusun bir yapisinda, birinci yakin uç, A toksininin tekrar kismi V (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2307-2440 sayili aniino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil ainino asitler), tekrar kismi VI (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2441-2553 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki inütekabil amino asitler), tekrar kismi VII (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2554-2644 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amiiio asitler) ya da tekrar kismi VIII (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2645-2710 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki ni'ûtekabil ainino asitler) içinde yer alir. Bulusun bir diger yapisinda, birinci yakin uç, A toksiniiiin tekrar kisini VII (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2554-2644 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir. Bulusun bir diger yapisinda, birinci yakin uç, A toksininin tekrar kismi VIII (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2645-2710 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir.

Bulusun bir yapisinda, ikinci yakin uç, B toksininin tekrar kismi 1 (SEKANS KOD NO.: 2'deki 1834-1926 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amiiio asitler), tekrar kismi 11 (SEKANS KOD NO.: 2'deki 1927-2057 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil ainino asitler) veya tekrar kismi 111 (SEKANS KOD NO.: 2'deki 2058-2189 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir. Bulusun bir diger yapisinda, ikinci yakin uç, B toksininiii tekrar kismi 11 (SEKANS KOD NO.: 2'deki 1927-2057 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amiiio asitler) içinde yer alir. Bulusun bir diger yapisinda, ikinci yakin uç, B toksininin tekrar kismi 1 (SEKANS KOD NO.: 2'deki 1834- 1926 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir.

Bulusun bir yapisinda, birinci yakin uç, bir uzun tekrar içinde yer alir.

Birinci yakin uç, A toksininin uzun tekrari V (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2410-2440 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) veya A toksininin uzun tekrari VI (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2523-2553 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) veya A toksininin uzun tekrari VII (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2614-2644 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki inütekabil amino asitler) içinde yer alir.

Bulusun bir yapisinda, ikinci yakin uç, bir uzun tekrar içinde yer alir.

Ikinci yakin uç, B toksininin uzun tekrari I (SEKANS KOD NO.: 2'deki 1897-1926 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) veya B toksininin uzun tekrari II (SEKANS KOD NO.: 2'deki 2028-2057 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki ni'i'itekabil amino asitler) veya B toksininin uzun tekrari III (SEKANS KOD NO.: 2'deki 2160-2189 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir.

Bulusun bir diger yapisinda, birinci yakin uç ile ikinci yakin ucun her ikisi de uzun tekrarlar içinde yer alirlar. Bulusun bir yapisinda, birinci yakin uç, A toksininin uzun tekrari V (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2410-2440 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) veya A toksininin uzun tekrari VI (SEKANS KOD NO.: 1'deki 2523-2553 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil ainino asitler) veya A toksininin uzun tekrari Vll uzun (SEKANS KOD NO.: l'deki 26l4-2644 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir ve ikinci yakin uç, B toksininin uzun tekrari I (SEKANS KOD NO.: 2'deki 1897-1926 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) veya B toksininin uzun tekrari II (SEKANS KOD NO.: 2'deki 2028-2057 sayili ainino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) veya B toksininin uzun tekrari III (SEKANS KOD NO.: 2'deki 2160-2189 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir.

Bulusun bir yapisinda, birinci yakin uç, A toksininin uzun tekrari VII (SEKANS KOD NO.: l'deki 2614-2644 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir ve ikinci yakin uç, B toksininin uzun tekrari II (SEKANS KOD NO.: 2'deki 2028-2057 sayili amino asitler veya farkli bir sustaki mütekabil amino asitler) içinde yer alir.

Bulusun bir yapisinda, birinci yakin uç, A toksininin 2620-2660 sayili amino asitleri içinde yer alir. Bulusun bir yapisinda, ikinci yakin uç, B toksininin 2030-2050 sayili amino asitleri içinde yer alir. Bulusun bir diger yapisinda, birinci yakin uç, A toksiniiiin 2620-2660 sayili amino asitleri içinde yer alir ve ikinci yakin uç, B toksininin 2030-2050 sayili amino asitleri içinde yer alir. ainino asit içerir. Bulusun bir yapisinda, ikinci fragman, en az 100, amino asit içerir.

Bulusun bir yapisinda, polipeptid bir baglayici da içerir. Bu baglayici, birinci yakin uç ile ikinci yakin uç arasinda bulunabilir; alternatif olarak, baglayici, birinci fragman ve/Veya ikinci fragmanin uzak uçlarini baska bir amino asit sekansina baglama görevi görüyor olabilir.

Birinci fraginan ile ikinci fraginani birbirlerinden ayirmak için bir baglayici peptid sekansi kullanilabilir. Bir baglayici peptid sekaiisiiii füzyon proteinine sokmak için sektörde iyi biliiien standart teknikler kullanilir. Uygun baglayici peptid sekanslari, asagida belirtilen faktörler esas alinarak seçilebilirler: (1) bir esnek uzayan konformasyona sahip olma; (2) birinci fragman 've/veya ikinci fragnianda bulunan fonksiyonel epitoplar ile etkilesiine girebilecek bir ikinci yapiya sahip olmama; ve (3) ToxA ve/Veya ToxB fonksiyonel epitoplari ile reaksiyona girebilecek hidrofobik veya yüklü artiklar içermeme. Baglayici peptid sekanslari, Glisin (Gly), Asparajin (Asn) ve Serin (Ser) artiklari içerebilirler. Baglayici sekansta, Thr ve Ala gibi baska hemen hemen nötr amino asitler de bulunabilir. Baglayici olarak faydali olabilecek amiiio asit sekanslari arasinda, asagida belirtilen eserlerde açiklanan sekanslar bulunur: Maratea et al., Gene patenti. Baglayici sekans, genelde 1 ilâ yaklasik 50 amino asit uzunlugunda olabilir. yapisinda, baglayici bir glisinli baglayicidir; baglayici, birden çok 14, 15, 17 veya 20) içerebilir ya da alternatif olarak, baglayici, bir miktar glisin artigi ve yani sira bir miktar baska amino asit artiklari, örnegin alanin içerebilir. Bulusun bir diger yapisinda, baglayici, tek bir glisin artigi içerir.

Bulusun bir yapisinda, bulusa konu olan polipeptid daha büyük bir füzyon proteininin bir parçasini teskil eder. Füzyon proteinleri, baska bir protein anti jeninin bir immünojenik kisinini kodlayan amino asitler de içerebilirler. Ornek vermek gerekirse, füzyon proteini, S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, E. coli, M.cattarhalis, C. tetanii, C. diphtheriae, B. pertussis, S. epidermidis, enterokoklar, S. aureus ve Pseudomonas aeruginosa'dan olusan grup içinden seçilen bir bakteriden elde edilen veya türetilen bir protein antijeninin bir immünojenik kismini içerebilir. Bu durumda, baglayici, birinci fragman veya ikinci fragman ile baska bir protein anti jenine ait baska bir immünojenik kisim arasinda yer alabilir. polipeptidin sitotoksik T lenfositleri, yardimci T lenfositleri veya B hücreleri tarafindan algilanip taninan bir epitop içeren bir fragmanina atif yapar. Immünojenik kisimda, referans sekanstaki ainino asitlerin en az %30'u, daha uygunu en az %50'si, özellikle de en az %75'i ve bilhassa en az %90'inin (%95 veya %98) bulunmasi uygun olacaktir.

Bulusun bir yapisinda, immünojenik kisim, referans sekansin epitop bölgelerinin hepsini içerecektir.

Bir C. difficile A toksini tekrar domaini fragmani ile bir C. difficile B toksini tekrar domaini fragmaninin bulundugu burada açiklanan spesifik füzyon proteinlerini içeren bulusa uygun inimünojenik bilesimlerin bilinen C. difficile polipeptidleri veya fragmanlarini içeren bilesimlere kiyasla C. difficile'ye karsi daha gelismis bir iminün cevap saglamalari da beklenmektedir.

ADJ UVAN LAR Burada açiklanan immünojenik bilesimler, bir alüminyumsuz adjuvan ile birlikte en az bir adet C. difficile polipeptidi içerirler. Bu polipeptidler, alüminyum veya alüminyum tuzlari bulunmayan bir adjuvan ile, yani bir alüminyunisuz ad juvan veya ad juvan sistemi ile formüle edilirler.

Bulusun belirli yapilarinda, C. difficile polipeptidi, bir lipozom formunda olan bir immünolojik açidan aktif saponin fraksiyonu içeren bir adjuvan ile formüle edilirler. Bu adjuvan, bir lipopolisakkarit de içerebilir. Bu adjuvanda QSZ] bulunabilir. Örnek vermek gerekirse, bulusun bir yapisinda, adjuvan, bir lipozomal formülasyonda bulunan QSZ] içerir. Bulusun bir yapisinda, adjuvan sisteminde 3D-MPL ve QSZ] bulunur. Örnegin, bulusun bir yapisinda, adjuvan, bir lipozomal formülasyon haliiide bulunan 3D-MPL ve QSZl içerir. Adjuvan sistemi içinde istege bagli olarak kolesterol de yer alabilir. Bulusun bir spesifik yapisinda, adjuvanda QSZI ve kolesterol yer alir. Adjuvan sisteminde istege bagli olarak l,2-dioleoi1-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) de bulunabilir. Örnegin, bir spesifik ad juvan sistemi, kolesterol, DOPC, 3D-MPL ve QSZl içerir.

Somut bir örnekte, iminünojenik bilesimin bir dozunda, asagida belirtilen içerikleri asagi belirtilen miktarlarda içeren bir adjuvan bulunur: yaklasik 0,1 mg ilâ yaklasik 0,5 mg kolesterol; yaklasik 0,25 mg ilâ yaklasik 2 mg DOPC; yaklasik 10 ug ilâ 100 ug 3D-MPL; ve yaklasik 10 ug ilâ yaklasik 100 ug QSZl. Bir diger somut örnekte, immünojenik bilesimin bir dozunda, asagida belirtilen içerikleri asagida belirtilen miktarlarda içeren bir ad juvan bulunur: yaklasik 0,1 mg ilâ yaklasik 0,5 mg kolesterol; yaklasik 0,25 mg ilâ yaklasik 2 mg DOPC; yaklasik 10 ug ilâ yaklasik 100 ug 3D-MPL; ve yaklasik 10 ug ilâ yaklasik 100 ug QS21. Bir diger somut örnekte, immünojenik bilesimin bir dozunda, asagida belirtilen içerikleri asagida belirtilen miktarlarda içeren bir adjuvan bulunur: yaklasik 0,] mg ilâ yaklasik 0,5 mg kolesterol; yaklasik 0,25 mg ilâ yaklasik 2 mg DOPC; yaklasik ug ilâ yaklasik 70 ug 3D-MPL; ve yaklasik 10 ug ilâ yaklasik 70 pg QSZl. Somut bir örnekte, adjuvanin tek dozunda sunlar bulunur: yaklasik 0,25 mg kolesterol; yaklasik 1,0 mg DOPC; yaklasik 50 ug 3D-MPL; ve yaklasik 50 ug QS21. Bulusun baska yapilarinda, immünojenik bilesim, bir fraksiyonel doz ile (yani, yukarida belirtilen tek doz formülasyonlarindan birinin bir fraksiyonu olan bir doz), QSZI) miktarlarinin yari ölçüde bulundugu dozla, yukarida belirtilen bilesen niiktarlarinin 1/4 ölçüde bulundugu bir dozla ya da yukarida belirtilen bilesen miktarlarinin baska bir ölçüde (örnegin 1/3, 1/6 ve benzeri) bulundugu bir doz ile formüle edilir.

Bulusun bir yapisinda, bulusa konu olan immünojenik bilesimler, daha önceden örnegin EP0671948 sayili patent yayininda açiklanmis olan Quillaja saponinleri ile lipopolisakkaridin koinbinasyonlarini içeren bir adjuvan ihtiva ederler. Bahsi geçen patentte, bir lipopolisakkarit (3D-MPL) bir Quillaja saponini (QSZl) kombine edildiginde ikisi arasinda kuvvetli bir sinerjinin olustugu kanitlanmistir.

Adjuvanda, immünostimüle edici oligonükleotidler (örnegin CpG) veya bir tasiyici da bulunabilir.

Bu bulusta kullanima özellikle uygun olan saponinlerden biri Quil A' ve onun türevleridir. Quil A, Güney Ainerika agaci Quilla ja Saponaria Molina'dan izole edilen bir saponin preparatidir ve adjuvan aktivitesine sahip oldugu ilk kez 1974 senesinde Dalsgaard ve arkadaslari tarafindan ortaya konmustur ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Cilt 44, Springer Verlag, Berlin, Sayfa 243-254). Quil A ile iliskileiidirilen toksisiteyi göstermeyip adjuvan aktivitesini muhafaza eden ömegin (QA7 ve QA21 adlariyla da biliiien) QS7 ve QSZl gibi saflastirilmis Quil A fraginanlari HPLC ile izole edilinislerdir (EP O 362 278). QSZI, Quillaja saponaria Molina'nin kabugundan elde edilen ve CD8+ sitotoksik T hücrelerini (CTL'ler), Th'l hücrelerini ve bir baskin lgG2a antikor cevabi indükleyen bir dogal sapoiiindir ve bu bulusa istinaden tercih edilen sapoiiinlerden biridir.

Bulusun spesifik bir yapisinda, QSZl, bir eksojen sterol ile, 'Örnegin kolesterol ile söndürülmüs oldugu bir daha az reaktojenik bilesim formunda teinin edilir. QSZl'in bir eksojen kolesterol ile söndür'ülmüs oldugu bir dizi daha az reaktojeiiik bilesim formu vardir. Bulusun Spesifik bir yapisinda, saponin/sterol, bir lipozom yapisi formundadir (WO 96/33739, Örnek 1). Bu bulus yapisinda, lipozoinlar, bir nötr lipid, örnegin oda sicakliginda kristalin karakter göstermeyen fosfatidilkolin, örnegin yumurta sarisi fosfatidilkolini, dioleoil fosfatidilkolin (DOPC) veya dilauril fosfatidilkolin içerirler.

Lipozomlar, doymus lipidlerden olusan lipozoinlarin lipozom-QSZI yapisinin stabilitesini artiran bir yüklü lipid de içerebilirler. Böyle bir durumda, yüklü lipid miktarinin %1-20 a/a düzeyinde olmasi uygundur ve %5-10 düzeyinde olmasi tercih edilir. Sterolüii fosfalipide orani %1-50 (mol/mol) arasi bir düzeyde olur ve %20-25 arasi bir düzeyde olmasi daha uygundur.

Uygun steroller arasinda, ß-sitosterol, stiginasterol, ergosterol, ergokalsiferol ve kolesterol bulunur. Bulusun belirli bir yapisinda, adjuvan bilesiminde sterol olarak kolesterol yer alir. Bu steroller sektörde iyi bilinmekte olup, örnegin kolesterol, Merck Index, 11th Edn sayfa 341'de hayvanlarin yaginda bulunan bir dogada kendiliginden olusan sterol olarak anlatilmakta ve açiklanmaktadir.

Aktif saponin fraksiyonu QSZl olacaksa, QSZl : sterol orani normalde 1:100 ile 1:] (a/a) arasi bir düzeyde, daha uygunu 1:10 ile 1:] (a/a) arasi bir düzeyde ve tercihen 1:5 ile 1:1 (a/a) arasi bir düzeyde olacaktir. Sterolün daha fazla olmasi ve QSZ] : sterol oraninin en az 122 (a/a) olniasi uygun olacaktir. Bulusun bir yapisinda, QS21 : sterol orani 1:5'tir (a/a). Kullanilan sterolün kolesterol olmasi uygundur.

Bu bulus, bir yapisinda, bir dozunda 60 ug veya daha az miktarda, örnegin 1 ug ile 60 ug arasi bir miktarda immünolojik açidan aktif saponin, tercihen QSZl içeren bir immünojenik bilesim ortaya koyar.

Bulusun bir yapisinda, iminünojenik bilesim dozunda, yaklasik 50 ug düzeyinde, örnegin 45 ug ile 55 ug arasi bir miktarda, daha uygunu 46 veya 49 ug ile 51 ug arasi bir miktarda ya da 50 ug düzeyinde QSZl Bulusun bir diger yapisinda, immünojenik bilesim dozu, yaklasik 25 ug seviyesinde, örnegin 20 ug ile 30 ug arasi bir miktarda, daha 27 ug arasi veya 24 ug ile 26 ug arasi bir miktarda ya da 25 ug düzeyinde QS2l içerir.

Bulusun bir diger yapisinda, immünojenik bilesim dozu, yaklasik 10 ug seviyesinde, örnegin 5 ug ile 15 ug arasi bir miktarda, daha uygunu 6 ug ile 14 ug arasi bir miktarda, örnegin 7 ug ile 13 ug arasi veya 8 ug ile 12 ug arasi veya 9 ug ile 11 ug arasi bir miktarda ya da ug düzeyinde QSZl içerir.

Somutlastirmak gerekirse, 0,5 ml'lik bir asi dozu hacminde 25 ug veya 50 ug QS2l bulunur. Somutlastirmak gerekirse, 0,5 ml'lik bir asi dozu hacminde 50 ug QSZl bulunur.

Lipopolisakkarit, bir toksik olmayan lipid A türevi, özellikle de monofosforil lipid A veya bilhassa 3-deasile monofosforil lipid A (3D-MPL) olabilir. 3D-MPL, GlaxoSmithKline Biologicals N.A. tarafindan MPL adi altinda satilmakta olup, bu tarifname içinde MPL veya 3D-MPL 4912.094 sayili ABD patentleri. 3D-M PL, öncelikli olarak, bir lFN-IZI (Thl) fenotipine sahip olan CD4+ T hücresi cevaplarini artirir. 3D- MPL, GB 2 220 211 A sayili patent yayininda açiklanan yöntemlere göre üretilebilir. Kimyasal olarak, 3-deasile monofosforil lipid A ile 3, 4, 5 veya 6 adet asilli zincirin bir karisimini teskil eder. Bu bulusa konu olan bilesimlerde küçük partiküllü 3D-MPL kullanilmasi tercih edilir. Küçük partiküllü 3D-MPL, 0,22 um ebatlarindaki bir filtreden geçirilerek steril filtrelenmesine olanak saglayacak kadar küçük bir partikül büyüklügüne sahiptir. Bu gibi preparatlar WO 94/21292 sayili patent yayininda anlatilmakta ve açiklanmaktadirlar.

Dolayisiyla bu bulus, bir dozunda 75 ug veya daha az miktarda, MPL içeren bir immünojenik bilesim ortaya koyar. Bulusun bir yapisinda, lipopolisakkarit, doz basina yaklasik 50 ug miktarinda Bulusun bir yapisinda, immünojenik bilesim dozu, yaklasik 50 ug seviyesinde, örnegin 45 ug ile 55 ug arasi bir miktarda, daha uygunu arasi veya 49 ug ile 51 ug arasi bir miktarda ya da 50 ug düzeyinde 3D-MPL içerir.

Bulusun bir yapisinda, immünojenik bilesim dozu, yaklasik 25 ug seviyesinde, örnegin 20 ug ile 30 ug arasi bir miktarda, daha uygunu arasi veya 24 ug ile 26 ug arasi bir miktarda ya da 25 ug düzeyinde 3D-MPL içerir.

Bulusun bir diger yapisinda, immünojenik bilesim dozu, yaklasik 10 ug seviyesinde, örnegin 5 ug ile 15 ug arasi bir miktarda, daha uygunu 6 ug ile 14 ug arasi bir miktarda, örnegin 7 ug ile 13 ug arasi veya 8 ug ile 12 ug arasi veya 9 ug ile 11 ug arasi bir miktarda ya da Bulusun bir yapisinda, doz hacmi 0,5 ml'dir. Bulusun bir diger yapisinda, iinmünojenik bilesim, bir doz için uygun olan ve 0,5 ml'den hacimde bulunur. Bulusun bir diger yapisinda, insan dozu 1 ml ile 1,5 ml arasi bir düzeydedir.

Somutlastirmak gerekirse, 0,5 ml'lik bir asi dozu hacminde 25 ug veya 50 ug 3D-MPL bulunur. Somutlastirmak gerekirse, 0,5 ml'lik bir asi dozu hacminde 50 ug 3D-MPL bulunur.

Bulusun herhangi bir özelligine istinaden bahsi geçen immünojenik bilesim dozunun atif yaptigi doz insan dozudur. "Insan dozu" ile kastedilen, beseri kullaniin için uygun bir hacimde bulunan bir dozdur. Bu doz genelde 0,3 ml ile 1,5 ml arasi bir düzeyde olur.

Bulusun bir yapisinda, bir insan dozu 0,5 ml'dir. Bulusun baska bir yapisinda, bir insan dozu 0,5 ml'den yüksektir, örnegin 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 veya 1 ml'dir. Bulusun bir baska yapisinda, bir insan dozu 1 m1 ile 1,5 ml arasi bir düzeydedir.

Bu bulusa uygun bilesimler, lipozomlarin baslangiçta MPL olmadan hazirlandiklari (WC 96/ 33739 sayili patent yayininda açiklandigi gibi) ve daha sonra, 100 nm'nin altindaki küçük partiküller ya da 0,22 um membrandan geçirilerek steril filtrelenebilecek büyüklükteki partiküller formunda MPL'nin ilave edildigi bilesimlerdir. Dolayisiyla MPL, vezikül meinbrani içinde yer almaz (membran disi MPL olarak bilinir). MPL'nin vezikül meinbrani içinde bulundugu bilesimler (membran içi MPL olarak bilinir) de bu bulusun bir özelligini teskil ederler. Bir C. difficile A toksini fragmani ve/veya bir C. difficile B toksini fragmani içeren polipeptid, vezikül meinbraninin içinde ya da vezikül ineinbraninin disinda bulunabilir.

Bulusun spesifik bir yapisinda, QSZ] ile 3D-MPL, immünojenik bilesimin her dozunda ayni nihai konsantrasyonda bulunurlar. Bu bulusa iliskin bir özellikte, immünojenik bilesimin bir dozunda, nihai olarak 25 ug düzeyinde 3D-MPL ve 25 ug düzeyinde QSZl ya da 50 ug düzeyinde 3D-MPL ve 50 ug düzeyinde QSZl bulunur.

Bulusun bir yapisinda, adjuvan, bir suda-yag emülsiyonu içerir. Bu suda-yag emülsiyonunda 'Örnegin bir metabolize edilebilir yag bulunan bir yag fazi ve bir ek yag fazi bileseni, 'Örnegin bir tokol yer alir. Suda- yag emülsiyonu, bir aköz bilesen, örnegin bir tainponlu salin çözeltisi (ömegin fosfat tamponlu salin) de içerebilir. Bunlarin yani sira, suda- yag emülsiyonu normalde bir emülsifiye edici de barindirir. Bulusun bir yapisinda, inetabolize edilebilir yag, skualendir. Bulusun bir yapisinda, tokol, alfa-tokoferoldür. Bulusun bir yapisinda, emülsifiye edici, bir iyonik olinayan sürfaktan emülsifiye edicidir (örnegin polioksietilen sorbitan monooleat, TWEEN8OTM). Bulusun örnek yapilarinda, suda-yag emülsiyonu, %l'e (a/a) denk veya ondan düsük bir oranda skualen ve alfa tokoferol içerir.

Suda-yag emülsiyonundaki metabolize edilebilir yag, 0,5-10 mg arasi bir miktarda bulunabilir. Suda-yag emülsiyonundaki tokol, 0,5-11 mg arasi bir miktarda bulunabilir. Suda-yag emülsiyonundaki emülsifiye edici ajan, 0,4-4 mg arasi bir miktarda bulunabilir.

Bir suda-yag bilesiminin beseri uygulamaya uygun olmasi için, emülsiyon sisteminin yag fazinda bir metabolize edilebilir yag buluiimalidir. Metabolize edilebilir yag teriminin anlami sektörde iyi bilinmektedir. Metabolize edilebilirlik, 'metabolizma tarafindan traiisforme edilebilirlik' olarak tanimlanabilir (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)). Bu yag, alici için toksik olmayan ve metabolizma tarafindan transforme edilebilecek olan herhangi bir bitkisel yag, balik yagi, hayvansal yag veya sentetik yag olabilir. Yemisler, tohumlar ve tahillar, yaygin bitkisel yag kaynaklarindandir. Sentetik yaglar da bu bulusun bir parçasini teskil ederler ve bunlar arasinda, NEOBEE® (bitkisel yag kaynaklarindan elde edilen gliserol ve hindistan cevizi veya palm çekirdegi yaglarindan elde edilen orta boy Zincirli yag asitleri (MCT'ler) kullanilarak yapilan kaprilik/kaprik trigliseritler) ve benzeri baska yaglarin 'Örnek gösterilebilecegi ticari piyasada mevcut bulunan yaglar sayilabilir. Ozellikle uygun metabolize edilebilir yaglardan biri tetrakosaheksen), köpek baligi karaciger yaginda yüksek miktarlarda ve zeytinyagi, bugday tohumu yagi, pirinç kepegi yagi ve mayalarda düsük miktarlarda bulunan ve bu bulusta kullanilmasi bilhassa tercih edilen bir doymamis yagdir. Skualen, kolesterolün biyosentezinde olusan bir ara ürün olmasindan dolayi bir metabolize edilebilir yagi teskil eder (Merck index, 10th Edition, girdi 110.8619).

Metabolize edilebilir yagin adjuvan bilesiminde 0,5-10 mg arasi bir (örnegin 2-3, 5-6 veya 9-10 mg) arasi bir miktarda buluninasi, spesifik olarak yaklasik 5,35 mg veya yaklasik 2,4 mg/doz düzeyinde buluninasi tercih edilir.

Tokoller sektörde iyi bilinmekte olup, EP 0382271 sayili patent yayininda anlatilmakta ve açiklanmaktadirlar. Tokoli'in alfa-tokoferol veya onun bir türevi, 'Örnegin (E Vitamini süksinati olarak da bilinen) alfa-tokoferol süksinat olmasi uygundur. Söz konusu tokolün 0,5-11 bulunmasi tercih edilir. Bulusun spesifik bir yapisinda, tokol, yaklasik ,94 mg veya yaklasik 2,38 mg/doz düzeyinde bulunur.

Suda-yag em'ulsiyonunda ayrica bir emülsifiye edici ajan da bulunur.

Emülsifiye edici ajanin polioksietilen sorbitan monooleat olmasi uygundur. Bulusun belirli bir yapisinda, emülsifiye edici ajan, Polysorbate® 80 (Polioksietilen (20) sorbitan monooleat) ya da Tween® 80'dir.

Söz konusu emûlsifiye edici ajanin adjuvan bilesiminde 0,1-5, 0,2-5, miktarda bulunmasi uygundur. Bulusun spesifik bir yapisinda, emülsifiye edici ajan, yaklasik 0,97 mg veya yaklasik 2,425 mg düzeyinde bulunur.

Bulusun bir yapisinda, bilesimde bulunan spesifik bilesenlerin miktarlari, 0,5 ml'lik bir insan dozunda bulunan miktarlari teskil ederler. Bulusun bir diger yapisinda, immünojenik bilesim, bir insan veya 1 m1 düzeyinde olan bir haciinde bulunur. Bulusun bir diger yapisinda, insan dozu 1 ml ile 1,5 ml arasi bir düzeydedir.

Adjuvan sivi formda bulunuyorsa ve yine sivi formda olan bir polipeptid bilesiini ile kombine edilecekse, bir insan dozundaki adjuvan bilesiminin hacmi, insan dozu için hedeflenen nihai hacmin bir fraksiyonu, örnegin insan dozu için hedeflenen nihai hacinin yaklasik yarisi, örnegin hedeflenen insan dozu 0,7 ml ise 350 ul ya da hedeflenen insan dozu 0,5 ml ise 250 ul olacaktir. Adjuvan bilesimi, polipeptid anti jen bilesimi ile kombine edildiginde asinin nihai insan dozuna ulasmak üzere seyreltilir. Elbette, dozun nihai hacmi, adjuvan bilesiininin baslangiç hacmi ile ad juvan bilesiinine eklenen polipeptid antijen bilesiminin hacmine bagli olarak farklilik gösterecektir.

Bulusun alternatif bir yapisinda, bir liyofilize polipeptid bilesimini sulandirinak için bir sivi adjuvan kullanilir. Bulusun bu yapisinda, ad juvanin bilesiininiii insan dozu, insan dozu nihai hacmine hemen hemen esittir. Sivi adjuvan bilesimi, liyofilize polipeptid bilesimini içeren flakoiia ilave edilir. Nihai insan dozu, 0,5 ml ile 1,5 m1 arasinda degisebilir.

Suda-yag emülsiyonu üretme yöntemi sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca iyi bilinen bir yöntemdir. Bu tarz bir yöntemde genelde tokol içeren yag fazi bir PBS/polioksietilen sorbitan monooleat çözeltisi gibi bir sürfaktan ile karistirilir ve ardindan bir homojenlestirici kullaiiilarak içerik homojenlestirilir. Karisimin bir enjektör ignesiiiden iki defa geçirilmesini içeren bir yöntemin küçük haciinlerde siviyi homojenlestirmek için uygun oldugu sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarca bilinir. Sektörde bilgi ve beceri sahibi bir uzman, inikro-akiskanlastiricida eiiiülsifikasyoii prosesini (M1 108 Microfluidics makinesi, maksimum 50 geçis, 6 bar maksimum basinç girisinde (yaklasik 850 bar çikis basinci) 2 dakika boyunca) küçük veya daha büyük haciinlerde emülsiyoii üretmek içiii uyarlayabilir. Bu uyarlama, gereken çap degerine sahip yag danilaciklari bulunaii bir preparata ulasilana kadar eldeki emülsiyonun ölçülmesini içeren standart deney ve denemeler ile saglanabilir.

Bir suda-yag emülsiyonunda, yag ile emülsifiye edici bir aköz tasiyici içinde bulunmalidir. Bu aköz tasiyici, örnegin fosfat tampoiilu salin olabilir.

Burada açiklanan suda-yag emülsiyon sistemlerinde yag dainlacigi büyüklügünün mikron alti ölçüde olmasi tercih edilir. Damlacik büyüklüklerinin çap bakiinindaii 120 nm ilâ 750 nm araligi içinde olniasi uygundur ve söz konusu büyüklükleriii 120 ilâ 600 nm araligi içinde olmasi daha çok tercih edilir. En çok tercih edilen, suda-yag emülsiyonunda yogunluk bakiinindan en az %70'i 500 nm'den kisa bir çapa, daha çok tercihen yogunluk bakimindan en az %80'i 300 nm'den kisa bir çapa, daha çok tercihen yogunluk bakimindan en az %901 120 nm ile 200 nm arasi bir çapa sahip olan yag dainlaciklari bulunmasidir.

Bulusun bir yapisinda, immünojenik bilesim, 0,5 ml doz basina 0,125 niL SB62 em'ûlsiyonu (Toplam hacim), 5,35 mg skualen, 5,94 mg, DL-oi-tokoferol ve 2,425 mg polisorbat 80 bulunan bir suda-yag emi'ilsiyonu içeren bir ad juvan ile onunla kombine halde bulunan ve 3 ug veya 10 ug olan SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 7'den herhangi birinden olusmaz. Bulusun bir yapisinda, 0,5 ml doz basina 5,35 mg skualen, ,94 mg DL-a-tokoferol ve 2,425 mg polisorbat 80 bulunan bir suda- yag emi'ilsiyonu içeren bir ad juvan ile onunla koinbine halde bulunan Ve 3 ug veya 10 ug olan SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 7'den herhangi birinden olusmaz. Bulusun bir yapisinda, immünojenik bilesim, skualen, DL-a-tokoferol ve polisorbat 80 bulunan bir suda-yag emi'ilsiyonunun yer aldigi bir adjuvan içermez.

IMMUNOJENIK BILESIMLER VE ASILAR Bulusun bir yapisinda, immünojenik bilesimde ayrica ek antijenler bulunur. Bulusun bir yapisinda, ek antijenler, Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Haeinophilus influenzae (H. influenzae), Neisseria meningitidis (N. meningitidis), Escherichia coli (E. coli), Moraxella catarrhalis (M.cattarhalis), Clostridium tetani (C. tetani), Corynebacterium diptherieriae (C. diptherieriae), Bordetella pertussis (B. pertussis), Staphylococcus epiderinidis (S. epiderinidis), enterokoklar ve Staphylococcus aureus'tan (S. aureus) olusan grup içinden seçilen bir bakteriden elde edilen antijenlerdir.

Bulusun bir diger yapisinda, bulusa konu olan immünojenik bilesim, C. difficile kaynakli ek anti jenler, Ömegin S-tabakasi proteinleri (WO 01/73030) içerebilir. Iinmünojenik bilesiinde istege bagli olarak C. difficile kaynakli bir sakkarit de bulunabilir.

Burada ayrica iminüiiojenik bilesimi içeren bir asi da sunulmaktadir.

Bu asi ayrica bir farmasötik açidan kabul edilebilir yardimci madde içerebilir. Bulusun bir diger özelliginde, bulusa uygun immünojenik bilesiinin ve bir ad juvanin yer aldigi bir asi ortaya konmaktadir.

Bu bulusa uygun immünojenik bilesimleri içeren asi preparatlari, bu gibi bir asiyi sistemik veya mukoza] yolla uygulamak suretiyle C. difficile enfeksiyonuna yatkinligi olan bir meineliyi korumak ya da C. difficile enfeksiyonu buluiian bir memeliyi tedavi etmek için kullanilabilirler. Bu uygulama, intraniüsküler, intraperitoneal, intradermal veya subkütan yolla yapilan bir enjeksiyon uygulainasi ya da oral/sindirim, solunum, üreme ve bosaltim yollarina dogru yapilan bir mukoza] uygulama olabilir. Bu bulusa konu olan asi tek doz halinde uygulanabilecek olmakla birlikte, asinin bilesenlerini ayiii anda veya farkli zamanlarda birlikte uygulamak da mümkündür (örnek vermek gerekirse, immün cevaplarin birbirleri ile koordine olmasini saglamak adina, pnömokokal sakkarit konjugatlari asinin herhangi bir bakteriyel protein bileseninden ayri, onuiila ayni anda ya da ondan 1-2 hafta sonra uygulanabilirler). Ayrica, tek uygulama yolu kullanilabilecegi gibi, 2 farkli uygulama yolu da kullanilabilir. Örnegin, sakkaritler veya sakkarit konjugatlari intramüsküler (IM) veya intradermal (ID) yolla uygulanirkeii, bakteriyel proteinler intranazal (IN) veya intradermal (ID) yolla uygulanabilirler. Ek olarak, bulusa konu olan asilarin primer dozlari IM yolla, rapel dozlari ise IN yolla uygulanabilirler. Asidaki toksin içerigi, normalde 1-250 ug, tercihen 5-50 ug ve genelde 5-25 ug araliginda olacaktir.

Deneklere bir baslangiç asilamasindaii sonra, aralarinda yeteri kadar süre birakilan bir veya daha fazla sayida rapel immünizasyonu uygulanabilir. Asi preparati, genel hatlariyla "Vaccine Design ("The subunit and ad juvant approach" (eds Powell M.F. & Newman MJ.) (1995) Plenum Press New York)" eserinde anlatilmaktadir.

Lipozomlar içinde kapsülleme, 4.235.877 sayili ve Fullerton imzali ABD patent yayininda anlatilmaktadir.

Burada, burada açiklandigi gibi istege bagli olarak liyofilize formda bulunan bulusa uygun bir immünojenik bilesimin yer aldigi bir flakon Ve ayrica bir adjuvanin yer aldigi bir flakon içeren bir asi kiti de açiklaninaktadir. Bulusun bu özelliginde, adjuvanin liyofilize immünojenik bilesimi sulandirinak amaci ile kullanilmasi tasarlanmaktadir.

Bu bulusuii bir diger özelligi, bu bulusa konu olan immünojenik bilesim veya asindan bir immüno-koruyucu dozun denege uygulanmasini içeren C. difficile enfeksiyonunun önlenmesi veya tedavisine yönelik bir yöntemi ile ilgilidir. Bulusun bir yapisinda, bulusa konu olan immünojenik bilesim veya asidaii bir immüno- koruyucu dozun denege uygulanmasini içeren C. difficile enfeksiyonunun baslangiç ve/veya nüks epizodlarinin önlenmesi veya tedavisine yönelik bir yöntem ortaya konmaktadir. Bulusun bir yapisinda, söz konusu denek, fare, tavsan, gine domuzu, maymun, insan olinayan primatlar ve insandan olusan grup içinden seçilir.

Bulusun bir yapisinda, denek bir faredir. Bulusun bir diger yapisinda, denek bir insandir.

Bulusun bir diger özelligi, C. difficile'nin neden oldugu enfeksiyon veya hastaligin tedavisi veya önlenmesinde kullaniiii için olan bulusa uygun bir iminünojenik bilesim veya asi ile ilgilidir. Bulusun bir yapisinda, C. difficile hastaliginin baslangiç ve/veya nüks epizodlarinin tedavisi veya önlenmesinde kullanim için olan bulusa uygun bir immünojenik bilesim veya asi ortaya konmaktadir.

Bulusuii bir diger özelligi, bulusa konu olan inimünojenik bilesim veya asinin C. difficile hastaliginin tedavisi veya 'Önlenmesine yönelik bir ilacin üretiminde kullanimi ile ilgilidir. Bulusun bir yapisinda, C. difficile hastaliginin baslangiç ve/veya nüks epizodlariniii tedavisi veya 'Önlenmesine yönelik bir ilacin üretiminde kullanim için olan bulusa uygun bir immünojenik bilesim veya asi ortaya konmaktadir. olduklari herhangi bir enfeksiyon veya hastaliga atif yapar. C. difficile hastaligina verilebilecek örnekler arasinda, hayati tehlike yaratabilecek olan antibiyotikle iliskili diyare (AAD), psödomembranöz kolit ve toksik inegakolon bulunur. belirtilen rakamin %10 fazlasi ile azi arasinda kalan degerler olarak tanimlanir.

Bulus sahipleri, "içeren , içerir" ve "içerirler" terimlerini burada her durumda istege bagli olarak sirasiyla "olusan", "olusur" ve "olusurlar" terimleri ile ikame edilebilecek bir sekilde kullanmislardir. "Içerir" terimi, "kapsar" anlamina gelir. Dolayisiyla, "içerir" sözcügü ve onun düsünülmesi gerekmedigi sürece, belirtilen bilesik veya bilesim (örnegin nükleik asit, polipeptid, anti jen) veya basamak ya da bilesik grubu veya basamak grubunun kapsam içinde yer aldigi anlaminda anlasilmalidirlar; baska bir deyisle, baska bilesikler, bilesimler, basamaklar veya bunlarin gruplarinin kapsam içinde veya disinda olup olmadigi konusunda bir sey söylemezler. "e.g." kisaltmasi, Latince tasimayan örneklere isaret etmek amaci ile kullanilmaktadir. Baska bir deyisle, "e.g." kisaltmasi, "örnegin" sözcügü ile esanlamlidir.

Bulusa konu olan "asi" ile ilgili olarak burada sunulan bulus yapilari, bulusa konu olan "immünojenik bilesimler" ile ilgili bulus yapilari ile de ilgilidirler ve tersi durum da geçerlidir.

Açikça aksi bir duruma isaret eden bir tanimlama yapilmamissa, burada kullanilan bütün teknik ve bilimsel terimler, bu bulusuii dahil oldugu sektörde siradan ve olagan bir bilgi ve beceri düzeyine sahip olan uzmanlarin ilk bakista anlayacaklari anlamlara karsilik gelmektedirler. Moleküler biyoloji alaninda yaygin kullaiiilaii terimlerin tanimlari asagida belirtilen eserlerde bulunabilir: Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., .

Bu patent basvurusunda kullanildigi haliyle, baglamda açikça aksi ifade edilmedikçe, "bir" gibi teklik bildiren terimler, atif yapilanin çogulunu da içeren bir anlam tasirlar. Benzer sekilde, baglamda açikça aksi ifade edilmedikçe, "veya" sözcügü, `'ve" anlami da tasir. "Birden çok" terimi, atif yaptigi unsurdan iki veya daha fazla sayida bulundugunu ifade eder. Nükleik asitler veya polipeptidler için verilen bütün temel büyüklükler veya amino asit büyüklüklerinin ve ayrica bütün molekül agirligi veya molekül kütlesi degerlerinin yaklasik degerler oldugu ve açiklama amaçli sunuldugu da anlasilmalidir. Ek olarak, bir maddenin, örnegin bir polipeptid antijeninin konsantrasyonlari veya seviyelerine istinaden belirtilen sayisal kisitlamalar, yaklasik anlaminda olabilir.

Asagida sunulan örneklerin tek ainaci bulusu örneklendirmek olup, bu örnekler bulusun kapsamini herhangi bir yönden sinirlayici bir anlamda yorumlanmamalidirlar.

Burada açiklanan belirli bulus özellikleri ve yapilarinin yalnizca örnek olarak sunulduklari ve bulusu sinirlayici bir anlam tasimadiklari anlasilacaktir. Bu bulusun temel özellikleri, bulusun kapsaminiii disina çikilmadan bulusun çesitli yapilarinda kullanilabilirler.

Sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar, burada açiklanan spesifik prosedürler yerine kullanilabilecek muadil nitelikteki diger pek çok prosedürü bu tarifnameyi okudugunda anlayacak ya da standart bir çalisma yürütmek suretiyle bu prosedürleri belirleyebilecektir.

Bu tarifnamede bahsi geçen bütün yayinlar ve patent basvurulari, bu bulusun ilgili oldugu sektörde bilgi ve beceri sahibi olan uzmanlarin bilgi ve beceri seviyesini göstermektedir. birlikte kullanildigi yerlerde, "bir adet" anlamina gelebilecegi gibi, sayida" anlamini da tasiyor olabilir.

Takip eden kisimda, bulus, asagida verilen ve sinirlayici bir anlam tasimayan sekiller ve örnekler çerçevesinde daha ayrintili anlatilacak ve açiklanacaktir. ÖRNEKLER Deneylerde kullanilan adiuvanlar: Adjuvan A 0,5 m1 doz basina bir lipozoin formunda olan 50 ug QSZl, 50 ug 3D- MPL, 0,25 mg kolesterol ve 1,0 mg DOPC bulunan adjuvan.

Hamsterleri immünize etmek için uygun 50 ;11'lik bir dozda, 5 ug QSZl, 5 ug 3D-MPL, 0,025 mg kolesterol ve 0,1 mg DOPC bulunur.

Adjuvan B 0,5 ml doz basina , 5,35 skualen, 5,94 mg DL-d tokoferol ve 2,425 mg polisorbat bulunaii bir suda-yag emülsiyonundan olusan adjuvan. 50 ul'lik bir doz, 0,0125 ml d-tokoferol ve 0,2425 mg polisorbat 80 içerir.

Adjuvan C Bir lipozom formunda olan 25 ug QSZl, 25 ug 3D-MPL, 0,25 mg kolesterol ve 1,0 mg DOPC bulunan ad juvari. 50 ul'lik bir doz, 25 ug QSZl, 2,5 ug 3D-MPL, 0,025 mg kolesterol ve 0,1 mg DOPC içerir.

GSK adiuvani ASO4D adiuvan. 50 ul'lik bir doz, 5 ug MPL ve 50 ug (Al3+ toplam) içerir. 0.5 ml doz basina 500 ug alüminvum hidroksit bulunan adiuvan.

Hamster imm'ûnizasvonu için uygun 50 ;11'lik bir doz, 50 ug doz basina 50 [gg içerir.

Protokoller Anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA cevabi: Ornekler 2 ilâ 4, 7 ve 8'e iliskin protokol Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2 ug/ml (ToxA için) veya 1 ug/ml (ToxB için) yogunlugunda kullanilan ToxA veya ToxB fragmanlari 2360)) ile, yüksek baglanimli mikrotitre plakalarinin (Nunc MAXISORPTM) üzeri 4°C sicaklikta gece boyunca kaplandi. Plakalar, RT altinda 30 dakika boyunca PBS+%1 bovin serum albümini (BSA) ile karistirilip bloke edildiler. Hamster veya fare serumlari, PBS-BSA numuneler için) veya oraninda `Önceden seyreltildiler ve daha sonra, mikroplakalarda 2 tane daha iki misli seyrelti yapildi ve bunlar 30 dakika boyunca oda sicakligi (RT) altinda ink'i'ibe edildiler. Yikama yapildiktan sonra, Jackson ImmunoLaboratories Inc. peroksidaZ-konjuge Anti-Fare (ref: ('belirleme antikoru') kullanilarak, baglanan hamster veya fare antikoru tespit edildi. Belirleme antikorlari, 20°C sicaklik altinda 30 dakika boyunca karistirilip inkübe edildiler. Oda sicakligi altinda karanlikta 10 ml pH 4,5 0,1 M sitrat tamponu basina 4 mg O- fenilendiamin (OPD) + 5 u] H202 kullanilarak 15 dakika boyunca renk develope edildi. Reaksiyon, 50 u] HC] ile durduruldu ve 620 nm'ye göre 490 nm'de optik yogunluk (0D) okundu.

Her bir serumda, her plakaya eklenen (Jackson Global lgG'ye karsi kalibre edilmis olan) bir referans serum ile karsilastirma yapilarak anti-ToxA veya anti-ToxB antikorlarinin seviyesi belirlendi ve bu seviyeler ug/ml cinsinden ifade edildiler. Excel yazilimi kullanilarak, Hamster veya fare immünizasyonlarina konu olan her bir tedavi grubundaki numuneler için bir geometrik ortalama titre GMT degeri hesaplandi.

Bes C. difficile T oxA-ToxB füzyon proteininin tasarlanmasi ToxA ve TOXB'nin C-terminal tekrar domainlerinin fragmanlarini içeren ('füzyonlar' da denen) füzyon proteinleri tasarlandi. Bu füzyon proteinlerinde, ToxA'nin C-terminal tekrar doinaininin bir fragmani, ToxB'nin C-terminal tekrar domaiiiinin bir fragmani ve ToxA fragmaninin C-terminal ucu ile TOXB fragmaninin N-terminal ucu arasinda yer alan bir birlesine yeri vardi. Iki strateji gelistirildi; ilk stratejide, füzyon, iki fragman arasindaki birlesme yerinde söz konusu olan uzun solenoid yapinin korunmasini saglayacak sekilde tasarlandi.

Ikinci stratejide, fragmanlarin birbirlerinden bagimsiz dogru katlanmasina olanak saglamak adina füzyonlardaki iki fragman birbirlerinden bir baglayici ile ayrildi.

ToxA ve ToxB'nin C-terminal bölgeleri, tekrarlanan sekanslardan olusur: kisa tekrarlar (SR) ve uzun tekrarlar (LR) (PNAS 2005 Cilt ToxA'nin C-terminal domaininin kismen bilinen 3D yapisi açiklanmis PDB kodlari: 2F6E, 2G7C ve 2QJ 6).

Bulus sahipleri, ToxA ve ToxB'nin C-terminal bölgelerindeki artiklar arasinda iki çesit 'Önemli etkilesim söz konusu oldugu tahmininde bulunmuslardir. Birinci etkilesim, bir LR'de ve ondan önce gelen SR'de bulunan artiklar arasinda meydana gelmekte olup, solenoid- benzeri yapinin koruninasi açisindan önem arz etmektedir. Ikinci etkilesim ise, bir LR'de ve onu takip eden SR'de bulunan artiklar arasinda meydana gelmekte olup, toksinin karbonhidrata baglanma fonksiyonuna aracilik etmektedir.

Yeni bir "yapisal-fonksiyonel" SR-LR-SR tekrari tanimlandi. Bu tekrarin yapisi, tasarlanan füzyonlarda bozulmadan korundu.

ToxA ve ToxB tekrarlarinin kisa (SR) ve uzun tekrarlarin (LR) pozisyonlari Tablo 1'de belirtilmektedir.

ToxA ve ToxB'nin C-terminal domainlerinde bulunan "SR-LR-SR" kutularinin bir listesi ise asagidaki Tablo 2'de sunulmaktadir.

Ad Baslangiç pozisyonu Bitis pozisyonu Son olarak, uzun solenoid-benzeri yapiyi devam ettirmek adina iki LR arasindaki SR adedi tasarlanan füzyonlarda korundu.

Füzyonlara iliskin birlesme yerleri tasarlaninadan önce, iki çalisma hipotezi tanimlandi: birinci hipoteze göre, füzyonlar ne kadar kisa olursa füzyonlarin stabil bir sekilde asiri eksprese olma ihtimali o kadar yüksek olur; ikinci hipoteze göre, "SR-LR-SR" kutulari konseptine istinadeii, bu daha 'Önceden taiiiinlaiimis olan SR-LR-SR kutusundaki ilk SR'nin dogru katlaiimasini saglama alinak için baslangiç pozisyoiiu seçilmelidir. Bu sebeplerle, füzyonlar, SR-LR-SR kutusundan önce gelen SR'nin baslangicindan baslarlar. Bu iki hipotez isiginda üç baslangiç pozisyonu analiz edildi: ToxA'nin 2370, 2234 ve 2121 sayili artiklari.

Baslangiç pozisyoiiu 2370 kabul edilmedi. Proteinin yapisal stabilitesi açisindan `Önem arz eden etkilesimlerde rol oynayan artiklardan birinin korunmainasina yol açacagi için baslangiç pozisyonu 2234 de dislandi. Dolayisiyla, tasarlanaii bütün füzyonlarin ToxA'nin 2121 sayili artigindan baslamasina karar verildi.

Bütün Fuzyonlar, ToxB'nin son artiginda sona ereceklerdir.

Füzyonun tamaminin iki fuzyon fragniaiii arasinda olusturulmus bir uzun solenoid-benzeri yapi formunda korunmasini saglama anlayisiyla dört fuzyon (F1 -4) tasarlandi.

Füzyonlar 1 (F 1) ve 2 (F2), ayni hipotez kullanilarak tasarlandilar.

ToxA ve ToxB'nin bütün SR protein sekanslari, bir çoklu hizalaiiia yazilimi kullanilarak daha önceden karsilastirilmisti (ClustalW - Digerlerine kiyasla birbirlerine daha çok benzeyen sekanslar, ToxA'nin VIII. kismindaki üçüncü SR ile ToxB'nin II. kismindaki üçüncü SR ve ToxB'nin III. kisinindaki üçüncü SR'dir. T0XB'nin bahsi geçen iki SR'si arasinda bir seçim yapmak için, kismi ToxA C- terminal domaininin bilinen 3D yapisi (PDB kodu: 2Q16) kullanilarak ToxB'nin C-terminal bölgesine dair bir yapisal homoloji modellemesi (SWiSSMOdel arayüzü kullanilarak - Arnold K et al. (2006) Bioinformatics, 22, 195-201) gerçeklestirildi. ToxA'mn Vlll. kismindaki üçüncü SR'nin en iyi lokal yapisal süperpozisyonu TOXB'nin ll. kismindaki üçüncü SR ile gösterdigi belirlendi (SwissPDBViewer kullanilarak yapilan degerlendirmeye göre - Guex ToxA'nin VIII. kismindaki üçüncü SR ile ToxB'nin II. kismindaki dördüncü SR arasinda olan (F1) ve ikincisi ToxA'nin VIII. kismindaki ikinci SR ile ToxB'nin II. kismindaki üçüncü SR arasinda olan (F2) iki birlesme yeri tasarlandi.

Füzyon 3'ü (F3) tasarlamak için, ToxA'nin kismi C-terminal domaininin bilinen yapisi ile ToxB'nin C-terminal domaininin kestirilen yapisi arasinda bir global yapisal süperpozisyon gerçeklestirildi (SwissModel ve SwissPDBViewer yazilimlari kullanilarak). En iyi süperpozisyonun ToxA'nin VII. kismindaki LR ile ToxB'nin II. kismindaki LR arasinda oldugu tespit edildi. Buna bagli olarak, bu benzer LR'ler arasinda bir birlestirme yapilmasina karar verildi. Birlestirme 'Öncelikle ToxA ile ToxB arasinda sekansin korundugu bölgede, ardindan füzyonun ToxA parçasini tutturmak için önceki SR ile etkilesime giren artiklarda ve son olarak ToxB parçasini tutturmak için takip eden SR ile etkilesime giren artiklarda gerçeklestirildi.

Füzyon 4'ü (F4) tasarlamak için, ToxB'nin C-terminal domaini 4 fragmana bölündü ve bu fragmaiilara dair daha kesin ve isabetli bir homolo ji modellemesi (SwissModel) gerçeklestirildi. Bölme, "SR-LR- SR" kutularinin bozulmasina müsaade etmeyecek sekilde gerçeklestirildi (her domain, bir LR'yi takip eden SR'nin sonunda bitmektedir). Bu fragmanlarin kestirilen yapilari ile ToxA'nin bilinen 3D yapisi arasinda bir yapisal süperpozisyon yapildi ve en iyi yapisal süperpozisyonun ToxB'nin üçüncü SR'si (SR I) ile ToxA'nin son SR'si (VIII. kisimdaki üçüncü SR) arasinda gerçeklestigi tespit edildi.

Dolayisiyla, birlestirme, ToxA'nin VIII. kismindaki ikinci SR ile ToxB'nin I. kismindaki üçüncü SR arasinda yapildi.

Son füzyon (F5), füzyonun iki fragmaninin birbirlerinden bagimsiz dogru bir katlanma gerçeklestirinesine olanak saglayacak bir sekilde tasarlandi. ToxA protein sekansinin son artigi ile ToxB'nin ll. kismindaki dördüncü SR'nin baslangicinin arasina bir baglayici ilave edildi ("SR-LR-SR" kutularinin bozulmamasinin 'Önemi her zaman akilda tutularak). Baglayici olarak tek bir eksojen artik (Glisin) kullanildi ve bu artik, mevcut iki Glisinin arasina yerlestirildi.

Dolayisiyla, bu baglayici, bilinen (ToxA için) ve kestirilen (ToxB için) beta-iplikçik ile çevrili 3 Glisinden olusan bir unsur olarak da tanimlanabilir.

Hamsterlerin F2 füzyon proteini ile imm'i'inizasyonu: Adjuvan A, 0821 bulunmayan Adiuvan A veya MPL bulunmayan Adiuvan A ve Adiuvan B, Alum veya adiuvansiz form'i'ilasvonlar ile karsilastirma 16 hamsterden (erkek ve disi karisik) olusan hamster gruplari, 50 u] Ad juvan A, MPL bulunmayan Ad juvan A, QSZl bulunmayan Ad juvan A, Ad juvan B veya Aluin ile adjuvanli ya da adjuvansiz 1 ug füzyon proteini ile 0, 14 ve 28. günlerde IM yolla immünize edildiler. 41/42. günlerde (111. dozdan sonra) alinan serumlarin her birinde ayri ayri anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA titreleri belirlendi. Elde edilen sonuçlar, tablolar 3 ile 4'te ve sekiller 1 ile 2'de belirtilmekte ve gösterilmektedir.

Tablo 3: ELISA anti-ToxA: 42. günde alinan serumlarda kaydedilen konsantrasyonlar (ug/ml) Gruplar 1 2 3 4 5 6 F2 F2 F2 F2 F2 F2 ADJUVAN A A-Q3 adjuvansiz Geometrik C] = güven araligi Sta. Sap. = standart sapma Tablo 4: ELISA anti-ToxB: 42. günde alinan serumlarda kaydedilen konsantrasvonlar (ug/ml) Gruplar 1 2 3 4 5 6 F2 F2 F2 F2 F2 F2 ADJUVAN A A-Q3 adjuvansiz Geometrik ortalama Sekiller 1 ve 2 Sekil l'e iliskin sonuçlar: F2; tam adjuvan A ile ya da Q821 bulunmayan veya MPL bulunmayan benzer bir formülasyon ile birlikte enjekte edildi. Anti- ToxA cevabina istinaden, QS2`1 daha etkili olsa da MPL ile QS2`1 'in her ikisinin de bir katina degerinin bulundugu saptandi.

Anti-TOXB cevabina istinaden, bu kez MPL'nin etkisinin daha az oldugu ve QS21'in çikarilmasinin IgG titreleri üzerinde siddetli bir etkisinin oldugu belirlendi.

Sekil Z'ye iliskin sonuçlar: Adjuvan karsilastirmasi ile ilgili olarak, Alum, Adjuvan B veya ad juvansiz formülasyonlara kiyasla ad juvan A'iiin istatistiksel açidan anlamli ölçüde daha fazla anti-ToxA ve anti-ToxB antikoru indükledigi tespit edildi. Adjuvansiz formülasyonlara kiyasla adjuvan B, daha fazla anti-TOXA ve anti-ToxB antikoru indükledi.

Pimler 20110544 - Erkek hamsterlerin Adiuvan B, ASO4D, Adiuvan A veva Adiuvan C'de formüle edilen F2 f'ûzvon proteini ile farkli dozlarda imm'ûnizasvonu erkek hamsterden olusan hamster gruplari, 50 pl dozunda Ad juvan B, ASO4D, Ad juvan A veya Adjuvan C ile ad juvanli 0,3 ug, 1 tig veya 3 tig F2 füzyon proteini ile 0, 14 ve 28. günlerde IM yolla immünize 13. günde (1. dozdan sonra), 27. günde (11. dozdan sonra), 42. günde alinan seruinlarda anti-ToxA ve anti-TOXB ELISA titreleri ölçüldü.

Pimler 20110545 - Disi hamsterlerin Adiuvan B, ASO4D, Adiuvan A veva Adiuvan C'de form'i'ile edilen F2 füzyon proteini ile farkli dozlarda immîinizasvonu disi hainsterden olusan fare gruplari, Ad juvan B, ASO4D, Adjuvan A veya Adjuvan C ile adjuvanli 0,3 tig, l tig veya 3 tig F2 füzyon proteini ile 0, 14 ve 28. günlerde IM yolla immünize edildiler. 13. dozdan 14 gün sonra) ve 84. günde (111. dozdan 56 gün sonra) toplanan serumlarda anti-ToxA ve anti-TOXB ELISA titreleri Ölçüldü.

Sekiller 3 ilâ 7 Tablo 5: 1. doz sonrasi anti-ToxA ELISA titreleri (Geometrik ortalama titre ya da GMT) Tablo 6: 1. doz sonrasi anti-TOXB ELISA titreleri (GMT) Tablo 7: II. doz sonrasi anti-ToxA ELISA titreleri (GMT) hayvan lig lig ”8 118 ”8 ”8 ”8 ”8 ”8 lig ug Mg Adjuvan C C C A A A B B B ASO4D ASO4D ASO4D Tablo 8: 11. doz sonrasi anti-ToxB ELISA titreleri (GMT) Adjuvan C C C A A A B B B ASO4D ASO4D ASO4D Tablo 9: III. doz sonrasi 42. günde anti-ToxA ELISA titreleri (GMT) hayvan lig ”8 ”8 lig ug Mg ug Mg ug lig ”8 ug Adjuvan C C C A A A B B B ASO4D ASO4D ASO4D Tablo 10: III. doz sonrasi 42. günde anti-ToxB ELISA titreleri (GMT) hayvan ug Mg Mg Mg Mg Mg iig Mg Mg lig ug Mg Adjuvan C C C A A A B B B ASO4D ASO4D ASO4D Tablo 11: 111. doz sonrasi 84. günde anti-ToxA ELISA titreleri hayvan Mg ug Mg Hg ug ug iig Mg ug iig ug Hg Adjuvan C C C A A A B B B ASO4D ASO4D ASO4D Tablo 12: III. doz sonrasi 84. günde anti-ToxB ELISA titreleri (GMT) Adjuvan C C C A A A B B B ASO4D ASO4D ASO4D A'da va da adiuvansiz formüle edilen F2 fi'izvon proteini veva A toksini ile B toksini fragmanlarinin bir karisimi ile imm'i'inizasyonu 8 disi ve 8 erkek hamsterden olusan hamster gruplari, Alum veya Ad juvan A'da veya adjuvansiz formüle edilen 1 ;Lg F2 füzyon proteini, bir poli His tagi (F2-His tagli) bulunan bir F2 füzyonu veya bir C- karisimi ile 0, 14 ve 28. günlerde IM yolla immünize edildiler. 13. günde, 27. günde ve 42. günde (111. dozdan sonra) toplanan serumlarda anti-TOXB ve anti-TOXB ELISA titreleri belirlendi. Sekil 8 veva Adiuvan A'da formîile edilen F2 f'i'izvon proteini ile bir Karisimin (T0xA+T0xB) imm'iinoienisiteleri arasi karsilastirma ELISA anti-TOXA: III. dozdan sonra toplanan serumlarda kaydedilen konsantrasvonlar (ug/ml) Gruplar 1 2 3 4 5 6 ToxA (0,6 ng) F2-His (1 ng) (0,6 TOXA F2 F2 +TOXB (0,4iig) tagli gg) +T0xB Karisimi (l ng) (1 ng) Karisimi (1 ng) AI(OH)3 AI(OH)3 Ad _]. A A Ad). A ad Juvansiz veva Adiuvan A'da form'i'ile edilen F2 fûzvon proteini ile bir Karisimin (T0xA+T0xB) imm'ûnoienisiteleri arasi karsilastirma ELISA anti-ToxB: III. dozdan sonra toplanan serumlarda kavdedilen konsantrasyonlar (ua/m1) Gruplar 1 2 3 4 5 6 ToxA 0,6 ToxA 0,6 FZ-His + OX , Mg + 0x 9 Mg tagi (1 ug) (lug) (lug) Karisimi Karisimi (1 pg) AI(OH)3 AI(OH)3 Ad j A AÃJ' Adj. A ad juvansiz Geo ort. = Geometrik Ortalama Titre Sonuçlar: Anti-TOXA ve anti-ToxB antikorlari, hem F2 füzyon proteini ile immünizasyondan sonra hem de TOXA ile ToxB karisimi ile immünizasyondan sonra indükte oldular. Adjuvan A'li formülasyon, diger formülasyonlara kiyasla istatistiksel açidan anlamli Ölçüde daha yüksek ELISA titreleri ind'ûkledi.

Farelerin ToxA veya ToxB fragmanlari ve ToxA-TOXB füzyonlari ile immünizasyonu Sekiller 9 ilâ 12 Balb/C fareleri, örnek 1'de açiklanan yapilar ile immünize edildiler. disi Balb/c faresinden olusan fare gruplari, 3 ug veya 10 ug dozunda kullanilan ve Adjuvan B ile adjuvanli olan ayri ToxA ve günlerde IM yolla inimünize edildiler. 10 fareden olusan bir kontrol grubu, tek basina Adjuvan B ile asilandi. 42. günde (III. dozdan sonra) toplanan serumlarda anti-ToxA ve anti- ToxB ELISA titreleri belirlendi.

Bir araya toplanan III. doz sonrasi serumlarinda hemaglütinasyon inhibisyon titreleri belirlendi.

Anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA cevabi: Protokol Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yer almakta olup ToxB fragmanlari söz konusu ise 1 ug/ml yogunlugunda, ToxA fragmanlari söz konusu ise 2 ug/ml yogunlugunda kullanilan ToxA veya ToxB fragmani nuinuneleri ile, yüksek baglaniinli mikrotitre plakalarinin (Nunc MAXISORPTM) üzeri 4°C sicaklikta gece boyunca kaplandi.

Plakalar, RT altinda 30 dakika boyunca PBS+%1 BSA ile karistirilip bloke edildiler. Fare anti-serumlari, PBS-BSA %0,2-TweenTM mikroplakalarda ek iki misli seyreltiler yapildi ve bunlar 30 dakika boyunca RT altinda karistirilarak inkübe edildiler. Yikama yapildiktan olan Jackson ImmunoLaboratories Inc. peroksidaz-konjuge Affini- Pure Keçi Anti-Fare IgG (H+L) (ref: 115-035-003) antikoru kullanilarak, baglanan fare antikoru tespit edildi. Belirleine antikorlari, °C sicaklik altinda 30 dakika boyunca karistirilip ink'ube edildiler.

Oda sicakligi altinda karanlikta 10 ml pH 4,5 0,1 M sitrat tamponu basina 4 mg O-fenilendiamin (OPD) + 5 ;41 HZOZ kullanilarak 15 dakika boyunca renk develope edildi. Reaksiyon, 50 u] HC] ile durduruldu ve 620 nin'ye göre 490 nm'de optik yogunluk (OD) Serumlarda bulunan anti-TOXA veya anti-ToxB antikorlarinin seviyeleri, bir referans serum ile yapilan karsilastirma çerçevesinde orta nokta titreleri cinsinden ifade edildiler. Her tedavi grubunda ayri ayri 15 numunenin (kontrol grubunda 10 numunenin) GMT'si hesaplandi.

Hemaglîitinasvon inhibisvonu esevi: Protokol Bir araya toplanan fare anti-serumlari (25 ul), 96-kuyucuklu U-tabanli mikrOpalakalarda fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 8 seri iki inisli seyreltineye tâbi tutuldular.

Daha sonra 25 ul natiV A toksini (0,2 ug/kuyucuk) ilave edildi ve plakalar oda sicakligi altinda 30 dakika boyunca inkübe edildiler.

Inkübasyondan sonra, her bir kuyucuga %2 oraninda seyreltilmis olan 50 pl saflastirilmis tavsan eritrositleri eklendi. Plakalar 37°C sicaklik altinda 2 saat boyunca inkübe edildiler.

Plakalar, görsel olarak analiz edildiler ve kuyucukta daginik halde kirmizi hücrelerin gözlemlenmesi hemaglütinasyon varligi olarak, kuyucukta çökelmis bir kirmizi noktanin gözlemlenmesi hemaglütinasyonun inhibe olmus olmasi olarak yorumlandi.

Inhibisyon titreleri, hemaglütinasyonun inhibe oldugu en yüksek serum seyreltisinin resiprokali olarak tanimlandilar.

Sitotoksisite eseyi (penisilin-streptomisin-amfoterisin) içinde %5 COZ ve 37°C kosullari altinda kültürlendi ve 96-kuyucuklu doku kültürü plakalarina 5,10 hücre/kuyucuk yogunlugunda ekildiler. 24 saat sonra, 100 u] hücre vasati kuyucuklardan çikarildi. Bir araya t0planan fare anti-serumlari (50 ul), hücre vasatinda 8 (örnek 5'te konu edilen deney için) veya 12 (örnek 6'da konu edilen deney için) seri iki misli seyreltmeye tâbi tutuldular.

Daha sonra 50 ul natiV B toksini (0,5 ng/ml) ilave edildi ve plakalar 24 saat sonra hücreler gözlemlendi ve yuvarlak hücrelerin orani belirlendi.

Inhibisyon titreleri, hücre yuvarlanmasinin %50'sinin inhibe oldugu en yüksek serum seyreltisinin resiprokali olarak tanimlandilar.

Sonuçlar: Tek basina TOXA fragmani ile immünizasyondan sonra ve 5 füzyondan herhangi biri ile immünizasyondan sonra anti-ToxA antikorlari indükte oldular.

Bu antikorlarin fonksiyonel özellikleri, hemaglütinasyon eseyinde test edildi. TOXB'den dolayi hemaglütinasyon gözlemlenmedigi için, bu esey yalnizca TOXA degerlendirmesi için adapte edildi.

Anti-TOXA fragmani seruinlariyla ya da ToxA-ToxB füzyonlarindan herhangi birine yönelik serumlarla hemaglütinasyon inhibisyonu gözlemlendi.

ToxB antikorlarinin kullanildigi bir ELISA da gerçeklestirildi. Tek basina ToxB fragmani ile immünizasyondan sonra ve ayrica F2, F3 ve F4 füzyonlari ile immünizasyonlardan sonra anti-TOXB antikorlari indükte oldular.

ToxB fragmaniyla veya ToxA-ToxB füzyonlariyla immünize edilen farelerden alinan serumlar kullanilarak elde edilen inhibisyon titreleri, kontrol serumlari kullanilarak elde edilen titre degerlerinden daha Farelerin ToxA-ToxB fûzvonlari ile immünizasvonu disi fareden olusan fare gruplari, Adjuvan B'de formüle edilen 3 ug ToxA-ToxB füzyon proteinleri ya da 10 ag adjuvansiz ToxA (6 ng) + ToxB (4 ng) karisimi ile 0, 14 ve 28. günlerde IM yolla immünize edildiler. F2'nin yani sira, baska dört adet füzyon proteini yapisi kullanildi; bunlari, F54 Gly (SEKANS KOD NO.: 21), F54 New (SEKANS KOD NO.: 23), F5 ToxB (SEKANS KOD NO.: 25) ve F52 New (SEKANS KOD NO.: 27) idi.

Burada yüksek baglanimli mikrotitre plakalarinin üzerinin fosfat tainponlu salin içinde 1 tig/ml yogunlugunda bulunan toxA veya toxB fragmani numuneleri kaplanmasi disinda örnek 5'te anlatilan anti- ToxA ve anti-ToxB ELISA cevabi protokolü ayni sekilde uygulanarak bir ELISA gerçeklestirildi. Ornek 5'te tarif edildigi gibi bir hemaglütinasyon inhibisyonu eseyi gerçeklestirildi, ancak burada örnek 5'ten farkli olarak tavsan eritrositleri %2,5 oraninda seyreltildiler. Ornek 5 'te tarif edildigi gibi bir toxB sitotoksisitesi eseyi gerçeklestirildi, ancak burada 0,015 ug/ml konsantrasyonunda 50 pl B toksini kullanildi. Ayrica asagida tarif edildigi gibi bir toxA toksisitesi eseyi gerçeklestirildi. 42. günde (111. dozdan sonra 14. günde) toplanan serumlarda anti- ToxA ve anti-ToxB ELISA titreleri belirlendi. Sekiller 13 ve 14 20110350: Adiuvan B'de form'i'ile edilen C. difficile fûzvon proteinleri ile farelerin imm'i'inizasvonu ELISA a-ToxA: III. dozdan sonra toplanan serumlarda kaydedilen konsantrasvonlar (ug/ml) Gruplar 1 2 3 4 5 6 F2 Füzyon A Füzyon B Füzyon C Füzyon D TOXB (F52neW) (F54G1y) (F 54new) (F5 ToxB) Karisimi 3ug 3ug 3ug 3ug 3ug ugA+4 Ag/hayvan B B B B B adjuvansiz 20110350: Adiuvan B'de form'ûle edilen C. difficile fûzvon proteinleri ile farelerin imm'i'inizasvonu ELISA a-ToxB: III. dozdan sonra toplanan serumlarda kaydedilen konsantrasyonlar (112/ml) Gruplar 1 2 3 4 5 6 F2 Füzyon A Füzyon B Füzyon C Füzyon D ToxB (F52new) (F54Gly) (F 54new) (F5 ToxB) Karisimi 3ug 3ug 3ug 3ug 3ug ugA+4 Ag/hayvan B B B B B adjuvansiz Sekiller 15 ilâ 17 Ornek 5'te tarif edildigi gibi bir heinaglütinasyon inhibisyonu eseyi gerçeklestirildi. Örnek 5'te tarif edildigi gibi bir toxB sitotoksisitesi eseyi gerçeklestirildi, fakat burada bir araya toplanan anti-seruinlar 8 yerine 12 seri iki misli seyreltmeye tâbi tutuldular ve hücrelere yönelik gözlem yapilmadan önce plakalar 24 saat degil de gece boyunca inkübe edildiler. Ayrica asagida tarif edildigi gibi bir toxA sitotoksisitesi eseyi gerçeklestirildi.

ToxA sitotoksisitesi esevi HT29 hücreleri, DMEM + %10 fetal bovin serumu + %1 glutainin + ve 37°C kosullari altinda kültürlendi ve 96-kuyucuklu doku kültürü plakalarina 5,104 hücre/kuyucuk yogunluguiida ekildiler. 24 saat sonra, hücre vasati kuyucuklardan çikarildi. Bir araya toplanan fare anti-serumlari (50 ul), hücre seri iki misli seyreltmelere tâbi tutuldular.

Daha sonra 50 ul nativ A toksini (0,15 ng/ml) ilave edildi ve plakalar saat sonra hücreler gözleinlendi ve yuvarlak hücrelerin oraiii belirlendi. Anti-ToxA ELISA, anti-ToxB ELlSA, hemaglütinasyon inhibisyonu ve sitotoksisite eseylerine iliskin sonuçlar, yukarida bahsi geçen Sekiller 13 ilâ 17'de gösterilmektedir.

Bir adiuvamz formülasvonda formüle edilen C. difficile ToxA- Cter, TOXB-Cter ya da füzyon proteinleri ile farelerin immünizasyonu disi fareden olusan fare gruplari, 1 veya 3 ug ToxA C-ter, ToxB C- ter ya da TOXA-TOXB füzyon proteinleri ile 0, 14, 28 ve 120. günlerde forinülasyon içinde enjekte edildi. Bir kontrol grubuna (10 fare) tek basina NaCl enjekte edildi. günde (rapel öncesi 87) ve 134. günde (IV. doz sonrasi 14. gün) toplanan seruinlarda anti-ToxA ve anti-ToxB ELISA titreleri ölçüldü.

Sekiller 18 ve 19. 20100723: Ad'uvansiz C. di le ToxA-Cter ToxB-Cter ve l'i'iz 0n roteinleri ile farelerin immünizas ELlSA a-ToxA: GMT konsantras onlari /ml Ad juvan Adjuvansiz Adjuvansiz Adjuvansiz Ad juvansiz Adjuvansiz Adjuvansiz Adjuvansiz Ad juvansiz Adjuvansiz Adjuvansiz Adjivaiisiz Ad juvansiz Ad juvansiz Ad juvansiz NaCl sonrasi 1114 doz sonrasi öncesi sonrasi 20100723: Ad'uvansiz C. difficile ToxA-Cter ToxB-Cter ve l'i'iz on roteinleri ile farelerin imm'i'inizas onu ELISA a-ToxB: GMT konsantrasvonlari mglml) Ad juvan Ad juvansiz Ad juvaiisiz Ad juvansiz Ad juvamsiz Ad juvansiz Ad juvansiz Ad juvansiz Ad juvansiz Adjuvansiz Ad juvansiz Adjuvansiz Ad juvansiz Adjuvansiz Ad juvansiz NaCI sonrasi 1114 doz sonrasi Öncesi Adiuvan B'de form'i'ile edilen C. difficile ToxA-Cter, ToxB-Cter veva fûzvon proteinleri ile farelerin imm'i'inizasvonu Sekiller 20 ve 21 disi fareden olusan fare gruplari, 1 veya 3 ug ToxA C-term (2387- asitler) veya ToxA-ToxB füzyon proteinleri ile 0, 14, 28 ve 120. günlerde IM yolla immünize edildiler. Bu proteinler, bir Adjuvan B formülasyonu içinde enjekte edildiler.

Ayrica bir kontrol grubuna (10 fare) tek basina Adjuvan B enjekte günde (rapel öncesi 87) ve 134. günde (IV. doz sonrasi 14. gün) toplanan serumlarda anti-ToxA ve anti-TOXB ELISA titreleri Ölçüldü.

ELISA a-ToxA: ll. dozdan sonra III. dozdan sonra ra elden 'Önce ve IV. dozdan sonra alinan serumlarda ka dedilen konsantrasvonlar Adiuvan B'de formüle edilen C. dil'l'icile ToxA-Cter, ToxB-Cter ve fûzvon Qroteinleri ile farelerin imm'i'inizasxonu sonrasi 1114 doz 801111151 sonrasi 20100798: Ad`uvan B'de form'i'ile edilen C. difficile ToxA-Cter ToxB-Cter ve l'i'izvon roteinleri ile farelerin imm'iinizasvonu SOHFBSI 1114 doz sonrasi Öncesi sonrasi Fi'izvon proteinlerinin klonlanmasi, ekspresyonu ve saHastirilmasi Ekspresvon plazmidi ve rekombinan sus ToxA ve ToxB'nin kismi C-terminal domainlerinin bulundugu füzyon proteinlerini (SEKANS KOD NO.: 3, 4, 5, 6 ve 7) ve bir His tagi kodlayan genler, standart prosedürler çerçevesinde NdeI/XhoI restriksiyon yerleri kullanilarak pET24b(+) ekspresyon vektörüne (Novagen) klonlandilar. Nihai yapi, CaClz uygulanmis hücrelerin kullanildigi standart yönteme göre E. coli susu BLR'nin (DE3) söz konusu rekombinan ekspresyon vektörü ile transforme edilinesi yoluyla olusturuldu (Hanahan D. « Plasinid transformation by Simanis. >› In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London.

Konakgi sus: BLR (DE3). BLR, BLZl'in bir recA türevidir. Söz konusu adlandirmaya (DE3) sahip olan suslar, IPTG ile indi'iklenebilir bir T7 RNA poliineraz içeren bir 7» profaji için lizogeniktirler. ?t DE3 lizogenleri, pET vektörlerinden protein ekspresyonu gerçeklestirmek amaci ile tasarlanmis olan unsurlardir. Bu susta ayni zamanda Ion ve ompT proteazlari da bulunmaz.

Genotip: E. coli BLR::DE3 susu, F`ompT hsdSB(rB` 1113`) gal dem (DE3) A(sr1-recA)306::Tn10 (TetR) Rekombinan proteinlerin ekspresyonu: Bir E. coli transformanti agar plakasindan alinip 200 ml LBT sivi besiyeri + %1 (a/h) glukoz + kanainisine (50 tig/ml) inoküle edilerek, 600 nin'de 0,1-0,2 arasi bir CD. elde edildi. Kültürler, 37°C sicaklik altinda 250 devir/dakika hizla gece boyunca inkübe edildiler.

Gece boyunca inkübe edilen bu kültür, kanainisin (50 ;lg/ml) içeren 500 ml LBT vasatinda 1:20 oraninda seyreltildi ve 620 nin'de O.D. 0,5/0,6 düzeyine ulasana dek 250 devir/dakika karistirma hiziyla 37°C sicaklik altinda çogaltildi. 600 nm'de 0,6 civari bir O.D.'de, kültür sogutuldu, ardindan 1 mM izopropil ß-D-l-tiogalaktopiranosid (IPTG; EMD Cheniicals Inc., katalog numarasi: 5815) ilave edilerek rekoinbinan protein ekspresyonu indüklendi ve takip eden gece boyunca kültür 23°C sicaklikta 250 devir/dakika hizla inkübe edildi.

Gece boyunca sürdürülen indüksiyondan sonra (yaklasik 16 saat), indüksiyon sonrasi O.D.600nm degerlendirildi ve kültür 14.000 devir/dakika hizla 15 dakika boyunca santrifüje tâbi tutulup ardindan peletler -20°C sicaklik altiiida ayri ayri donduruldular.

Sailastirma: Bakteriyel pelet, 500 mM NaCl ve bir proteaz inhibitörü karisimi (Complete, Roche) içeren 20 mM bisin tamponunda (pH 8,0) yeniden süspanse edildi. Bakteriler, 20.000 PSI basinçta bir Fransiz Pres sistemi kullanilarak lize edildiler. Çözünür (üst faz) ve çözünmez (pelet) bilesenler, 4°C sicaklikta 20.000 g'de 30 dakika boyunca santrifû j uygulanarak ayristirildilar. 6-His tagli protein, IMAC'de natiV kosullar altinda saflastirildi. Çözünür bilesenler, bakteriyel yeiiiden süspansiyon için kullaiiilaii tampon ile ayni tampon kullanilarak 'Önceden dengelenmis olan bir GE kolonuna (örnegin 15 ml) (Ni yüklü) yükleiidiler. Kolona yükleme yapildiktan sonra, Söz konusu kolon ayni tampon ile yikandi. 500 mM NaCl ve farkli konsantrasyonlarda imidazol ( içeren bir 20 mM bisiii tamponu (pH 8,0) kullanilarak eli'isyon gerçeklestirildi. Jel analizinden sonra, daha fazla saHastirilmak üzere daha saf olan fraksiyonlar seçildi, konsantre edildi ve SEC kromatografisine yüklendiler.

Füzyon proteinlerini içeren fraksiyonlar, saflik temelinde SDS-PAGE ile seçildiler ve bisin tamponuna (5 mM EDTA bulunan veya bulunmayan 20 mM bisin, karsi diyalize tâbi tutuldular. BioRad DC Protein Eseyi gerçeklestirilerek protein konsantrasyonu belirlendi. Böylelikle proteinler bir araya toplandi, 0,22 um filtreden geçirilerek steril filtrelendi ve -80°C sicaklikta saklandilar.

Alternatif olarak, IMAC ile saflastirma basamagindan önce, yükleme ve yikama için 2 mM bisin tamponunun (pH 8,0) kullanildigi ve bu kez 1 M NaCl eklenmis olan ayni tamponun bulundugu bir gradyanla eli'isyon yapilan bir DEAE ile saflastirma basainagi uygulandi.

Avri C. difficile ToxA ve ToxB fragmanlarinin klonlanmasi, ekspresvonu VC saflastirilmasi Ekspresvon plazmidi ve rekombinan sus ToxA ve ToxB'nin protein fragmanlarini (SEKANS KOD NO.: 8 ve SEKANS KOD NO.: 9) ve bir His tagi kodlayan genler, standart prosedürler çerçevesinde Ndel/Xhol restriksiyon yerleri kullanilarak pET24b(+) ekspresyon vektör'ûne (Novagen) klonlandilar. Nihai yapi, CaClz uygulanmis hücrelerin kullanildigi standart yönteme göre E. coli susu BLR'nin (DE3) söz konusu rekombinan ekspresyon vektörü ile transforme edilinesi yoluyla olusturuldu (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning.

Konakgi sus: BLR (DE3). BLR, BLZl'in bir recA türevidir. Söz konusu adlandirmaya (DE3) sahip olan suslar, IPTG ile induklenebilir bir T7 RNA polimeraz içeren bir 7» profaji için lizogeniktirler. ?L DE3 lizogenleri, pET vektörlerinden protein ekspresyonu gerçeklestirmek amaci ile tasarlanmis olan unsurlardir. Bu susta ayni zamanda Ion ve ompT proteazlari da bulunmaz.

Genotip: E. coli BLR::DE3 susu, F`ompT hsdSB(rB`mB`) gal dcm (DE3) A(srl-recA)306::TnlO (TetR) Rekombinan proteinlerin ekspresyonu: Bir E. coli transformanti agar plakasindan alinip 200 ml LBT sivi besiyeri + %1 (a/h) glukoz + kanainisine (50 tig/ml) inoküle edilerek, 600 nm'de 0,1-0,2 arasi bir O.D. elde edildi. Kültürler, 37°C sicaklik altinda 250 devir/dakika hizla gece boyunca inkübe edildiler.

Gece boyunca inkübe edilen bu kültür, kanamisin (50 ug/ml) içeren 0,5/0,6 düzeyine ulasana dek 250 devir/dakika karistirma hiziyla 37°C sicaklik altinda çogaltildi. 600 nm'de 0,6 civari bir O.D.'de, kültür sogutuldu, ardindan 1 mM izopropil ß-D-l-tiogalaktopiranosid (IPTG; EMD Chemicals Inc., katalog numarasi: 5815) ilave edilerek rekombinan protein ekspresyonu indüklendi ve takip eden gece boyunca kültür 23°C sicaklikta 250 devir/dakika hizla inkübe edildi.

Gece boyunca sürdürülen indüksiyondan sonra (yaklasik 16 saat), indüksiyon sonrasi O.D.600nm degerlendirildi ve kültür 14.000 devir/dakika hizla 15 dakika boyunca santrifüje tâbi tutulup ardindan peletler -20°C sicaklik altiiida ayri ayri donduruldular.

Sailastirma: Bakteriyel pelet, bir proteaz inhibitörü (EDTA bulunmayan Complete, bisin tamponunda (pH 8,0) yeniden süspanse edildi. Bakteriler, 2 x .000 PSI basinçta bir Fransiz Pres sistemi kullanilarak lize edildiler. Çözünür (üst faz) ve çözüninez (pelet) bilesenler, 4°C sicaklikta uygulanarak ayristirildilar. Ust faz hasat edildi ve 0,22 um filtre ile filtrelendi. 6-His tagli protein, IMAC'de nativ kosullar altinda saflastirildi. Çözünür bilesenler, bakteriyel yeniden süspansiyon için kullanilan tampon ile ayni tampon kullanilarak önceden dengelenmis olan bir GE kolonuna (örnegin 15 ml) (Ni yüklü) yüklendiler. Kolona yükleme yapildiktan sonra, söz konusu kolon ayni tampon ile yikandi.

ToxA için: içeren bir 20 mM bisin tainponu (pH 8,0) kullanilarak elüsyon gerçeklestirildi. Jel analizinden sonra, imidazol olmadan ayni tamponda daha fazla saflastirilmak üzere daha saf olan fraksiyonlar seçildi, konsantre edildi ve SEC kromatografisine (SUPERDEXTM 75) yüklendiler.

TOXB için: 500 mM NaCl ve %0,5 deoksikolat içeren 20 mM bisin tamponuyla (pH 8,0) ya da 150 mM NaCl bulunan ayni tamponla bir ikinci yikama gerçeklestirildi. 500 mM NaCl ve farkli konsantrasyonlarda imidazol ( kullanilarak elüsyon gerçeklestirildi. Jel analizinden sonra, 5 mM EDTA bulunan ayni tamponda daha fazla saflastirilmak üzere daha saf olan fraksiyonlar seçildi, 5 niM EDTA takviyesine tâbi tutuldu ve SEC kroinatografisine (SUPERDEXTM 200) yüklendiler.

ToxA veya ToxB fragmanlarini içeren fraksiyoiilar, saflik temelinde SDS-PAGE ile seçildiler ve bisin tamponuna (20 mM bisin, 150 mM NaCl, pH 8,0) karsi diyalize tâbi tutuldular. BioRad RCDC Protein Eseyi gerçeklestirilerek protein konsantrasyonu belirlendi. Böylelikle proteinler bir araya toplandi, 0,22 um filtreden geçirilerek steril filtrelendi ve -80°C sicaklikta saklaiidilar.

Bes C. difficile T oxA-ToxB fûzvonu için yürütülen molekül agirligi degerlendirmesi Bir protein numunesi içinde buluiian farkli türlerin çözeltideki homojenligi ve büyüklük dagilimini belirlemek için, analitik ultrasantrifûj gerçeklestirilerek moleküllerin bir saiitrifüj kuvvetine cevaben ne hizda hareket ettikleri ölçülür. Bu uygulama, söz konusu farkli türlerin moleküler sekilleri ve kütlelerine bagli olan ve sedimantasyon hizi deneyi ile elde edilen sedimantasyon katsayilarina dair yapilan hesaplamaya dayanir. 1. Protein numuneleri, AN-60Ti rotoru 15°C sicakliga dengelendikten sonra 42.000 devir/dakika hizla bir Beckmaii- Coulter PROTEOMELABTM XL-l analitik ultrasantrifüjde döndürülürler. a. F1 füzyon proteini, 500 ug/ml, 20 mM bisin, 150 mM NaCl, pH 8,0 b. F2 füzyon proteini, 500 tig/ml, 20 mM bisin, 150 mM NaCl, pH 8,0 c. F3 füzyon proteini, 500 tig/ml, 20 mM bisin, 150 mM NaCl, pH 8,0 d. F4 füzyon proteini, 500 ug/nil, 20 mM bisin, 150 mM NaCl, pH 8,0 e. F5 füzyon proteini, 500 tig/ml, 20 mM bisin, 150 mM NaCl, pH 8,0 2. Veriler, her 5 dakikada bir 280 nm'de 160 taraina kayit altina alinarak toplandi. 3. C(S) dagilimini tayin etmek için SEDFIT programi kullanilarak veri analizi gerçeklestirildi. SEDNTERP yazilimi kullanilarak, proteinlerin amino asit sekanslari üzerinden proteinlerin kismi özgül hacimleri belirlendi. Ayrica yine SEDNTERP kullanilarak, taniponuii Viskozitesi ve yogunlugu belirlendi. 4. C(S) dagiliminin (koiisantrasyona karsi sedimantasyon katsayisi) bir karisimin büyüklük dagiliiiiini karakterize etiiie konusunda ham verileri C(M) dagiliindan (konsantrasyona karsi molekül agirligi) daha iyi temsil ettigi dikkate alinarak, C(S) dagilim grafigi üzeriiiden farkli türlerin molekül agirliklari belirlendi. Bes ToxA-TOXB füzyon proteininin C(S) dagilimi üzerinden tespit edilen majör türlerin molekül agirliklari, onlarin monomerik formlarina tekabül etmektedir. Söz konusu bes füzyona istinaden belirlenen en iyi uyumlu fraksiyonel oranlarin hepsi 2 ile 2,2 arasi düzeylerdedir. Bu bulgu temelinde, proteinleriii çözeltide protein yapisi ile uyumlu ve tutarli olan uzamis bir formda bulunduklari söylenebilir.

C. difficile ToxA-ToxB füzyonlarinin ikincil ve üçüncü] yapilarinin dairesel dikroizm ve floresans spektroskopisi ile deg erlendirilmesi Dairesel dikroizm, sol kutuplu isigin absorpsiyoiiu ile sag kutuplu isigin absorpsiyonu arasinda yapisal asimetriden dolayi olusan farki ölçmek suretiyle bir proteinin ikincil yapi bilesimini belirlemek içiii kullanilir. Bir proteinin bir beta-yaprak, alfa-helis veya randoiiiize yaprak yapisi sergiledigi ve sergilemedigi durumlarda, uzak-UV bölgedeki (190-250 nm) CD spektrumlarinin sekli ve magnitüdü farkli sonuçlar verir. Bir protein numuiiesindeki her bir ikincil yapinin nispi abundansi, referans spektruinlara kiyasla hesaplanabilir.

Bir proteinin üçüncül yapisi, aromatik amiiio asitlerin imniobilizasyonuna dair degerlendirme yapilarak analiz edilebilir.

Yakiii UV bölgesinde (250-50 nm) bir CD sinyaliiiin gözlemlenmesi, fenilalanin, tiroziii ve triptofan artiklarinin polarizasyoiiu ile iliskilendirilebilecek olup, proteinin sinirlari belli iyi tanimli bir yapi formunda katlandiginin iyi bir göstergesi sayilir.

Asagida açiklanan protokol kullanildi: 1. Uzak UV spektrumlari, bir Jasco J-720 spektropolarimetrede l nm çözünürlük ve bant genisliginde 178 nM'den 250 nm'ye kadar olan 0,01 cm'lik bir Optik yol kullanilarak ölçülürler.

Hücrenin sicakligi, bir Peltier termostatli RTE-111 hücre blogu ile 23°C'de tutulur. Olçümler sirasinda 10 L/dakika hizinda bir nitro jen akisi idame ettirilir. 2. Yakin-UV spektruinlari, bir Jasco J -720 spektropolarimetrede 1 nm çözünürlük ve bant genisliginde 250 nM'den 300 nm'ye kadar olan 0,01 cm'lik bir optik yol kullanilarak ölçülürler.

Hücrenin sicakligi, bir Peltier termostatli RTE-111 hücre blogu ile 23°C'de tutulur. Olçümler sirasinda 6 L/dakika hizinda bir nitro jen akisi idame ettirilir.

Bes ToxA-ToxB füzyon proteininin hepsinin için uzak-UV spektrumlari (sekil 22), alfa helis yapilarinin düsük bir düzeyde ve beta yaprak yapilarinin yüksek bir düzeyde bulunduklarini göstermektedir. Ayrica, çözünür globüler proteinler için olagandisi bir bulgu olarak, bütün proteinler 230 nm'de maksimum sergilediler. Bu özellik literatürde bütün yönleriyle karakterize edilmis olup, alfa helis içermemeleri ve beta yaprak ve aromatik ainino asit yönünden yüksek düzey bir içerige sahip olmalari ile bilinen küçük bir protein grubu ile özellikler, ToxA-TOXB füzyon proteinleri için beklenen yapi ile uyumlu bir profile sahptirler. 230 nm'de bir pozitif sinyalin bulundugu karakteristik CD spektrumlari sergileyen 13 proteinin kristal yapisi karsilastirildi (Protein Veri Bankasi). Bu proteinlerin ortalama ikincil yapi içerigi, %42 beta yaprak ± %9 ve %7 alfa helis ± %6'dir. Bu bulgularin kuvvetle isaret ettigi üzere, ToxA-ToxB füzyon proteinlerinin spektral imzasi, yüksek düzeyde beta yaprak ve düsük düzeyde alfa helis içeren bir proteinin göstergesidir.

Bes füzyon proteininin hepsinin yakin-UV spektruinlarinin sekli (sekil 23), aromatik amino asitlerden en azindan bazilarinin iminobilize olduguna isaret etmektedir ve bu da kompakt ve spesifik bir üçüncü] yapinin söz konusu oldugunun kuvvetli bir göstergesidir. Ayrica, proteinin denatüre edici bir konsantrasyonda üre ile islemden geçirilmesi, yakin-UV sinyalinin kaybolmasina yol açti; bu da, bu karakteristik spektrumlarin protein katlanmasindan kaynaklandigina isaret eden bir baska göstergedir. 4 ek füzyon proteininin tasarlanmasi, klonlanmasi, ekspresvonu ve saflastirilmasi Ornek 1'de açiklanan tasarim prensipleri kullanilarak dört ek füzyon proteini tasarlandi ve bunlara F54 Gly (SEKANS KOD NO.: 21), F54 New (SEKANS KOD NO.: 23), F5 ToxB (SEKANS KOD NO.: 25) ve F52 New (SEKANS KOD NO.: 27) adlari verildi.

Bu füzyon proteinleri, örnek 9'de anlatilan prosedüre göre eksprese NO.: 25 ve SEKANS KOD NO.: 27 'de gösterilen C. difficile ToxA- TOXB fûzvonlari için vürütülen molekül agirligi degerlendirmesi NO.: 25 ve SEKANS KOD NO.: 27'de gösterilen füzyonlarin molekül agirliklari, örnek 1 1'de anlatilan prosedür takip edilerek belirlendi.

NO.: 25 ve SEKANS KOD NO.: 27'de gösterilen dört protein füzyonunun hepsinde C(S) dagilimi üzerinden belirlenen ana tür molekül agirliklari onlarin monomerik formlarina tekabül etmektedir Ve bütün proteinler, F1 ilâ F5 füzyonlarina benzer sedimantasyon özellikleri sergilemektedirler.

NO.: 1525 ve SEKANS KOD NO.: 27'de gösterilen C. difficile ToxA-ToxB füzvonlarinin ikincil ve üçüncü yapilarinin degerlendirilmesi NO.: 25 ve SEKANS KOD NO.: 27'de gösterilen füzyonlarin ikinci] ve üçüncü] yapilari, 'Örnek 5'te anlatilan yönteme göre degerlendirildiler. Bu füzyon proteinlerinin uzak UV CD spektrumlari sekil 24'te bulunabilir ve bu füzyonlarin yakin UV spektrumlari sekil 'te bulunabilir.

NO.: 25 ve SEKANS KOD NO.: 27'de gösterilen proteinlerin yakin ve uzak UV CD spektrumlarina dair yapilan analiz, bu dört proteinin hepsinin F1 ilâ F5 füzyonlarindakinden daha yüksek düzeyde olan ayni beta yaprak yapisina sahip olduklarini göstermektedir. Ek olarak, yakin UV spektrumlarina dair yapilan gözlem, üçüncül yapidaki aromatik amino asitlerin pozisyonlarinda Fl ilâ F5 füzyonlarina kiyasla istatistiksel açidan anlamli bir fark söz konusu olmadigini göstermektedir.

Claims (15)

1. ISTEMLER Asagida belirtilenleri içeren bir immünojenik bilesim: a) bir izole Clostridium difficile A toksini fragmani ve bir izole C. difficile B toksini fragmam içeren bir polipeptid; b) bir lipozom formunda olan bir immünolojik açidan aktif saponin fraksiyonu içeren bir ad juvan; burada polipeptid, bir A toksini tekrar domaini fragmani ve bir B toksini tekrar domaini fragmani içerir.
2. Istem l'e uygun immünojenik bilesim olup, burada söz konusu adjuvan, bir sterol, bir lipopolisakkarit ve 1,2-diole0il-sn- glisero-3-f0sfokolinden (DOPC) herhangi birini veya birden fazlasini da içerir.
3. Istem Z'ye uygun bir immünojenik bilesim olup, burada söz konusu sterol kolesterold'ûr.
4. Istem Z'ye veya istem 3'e uygun bir immünojenik bilesim olup, burada söz konusu immünolojik açidan aktif saponin fraksiyonu QSZl'dir.
5. Istem 2'ye uygun bir immünojenik bilesim olup, burada söz konusu lipopolisakkarit, 3D-MPL gibi bir lipid A türevidir.
6. 6. Önceki istemlerden herhangi birine uygun immünojenik bilesim olup, burada söz konusu adjuvan, kolesterol, DOPC, 3D-MPL ve QSZl içerir.
7. 7. Onceki istemlerden herhangi birine uygun immünojenik bilesim olup, burada adjuvan, asagida belirtilenleri içeren bir dozda formüle edilir: 0,1 mg ilâ 0,5 mg kolesterol 0,25 mg ilâ 2 mg DOPC; 10 ug ilâ 70 ug 3D-MPL; ve 10 ug ilâ 70 ug QSZl.
8. 8. Onceki istemlerden herhangi birine uygun imniünojenik bilesim olup, burada adjuvan, asagida belirtilenleri içeren bir dozda formüle edilir: yaklasik 0,25 mg kolesterol; yaklasik 1,0 mg DOPC; yaklasik 50 ug 3D-MPL; ve yaklasik 50 ug QSZ l.
9. 9. Onceki istemlerden herhangi birine uygun bir immünojenik bilesim olup, burada polipeptidler, A toksinini veya B toksinini ya da bunlarin her ikisini de nötralize eden antikorlarin ortaya çikmasini saglarlar.
10. Önceki istemlerden herhangi birine uygun bir immünojenik bilesim olup, burada polipeptid, bir birinci fragman ve bir ikinci fragman içeren bir polipeptiddir, burada: (i) birinci fragman, bir A toksini tekrar domaini fragmanidir; (ii) ikinci fragman, bir B toksini tekrar domaini fragmanidir; (iii) birinci fragman, bir birinci yakin uca sahiptir; ve (iv) ikinci fragman, bir ikinci yakin uca sahiptir; ve burada birinci fragman ile ikinci fragman birbirlerine komsudurlar.
11. Istem 10'a uygun bir immünojenik bilesim olup, burada birinci yakin uç, bir kisa tekrar içinde yer alir ve/veya ikinci yakin uç, bir kisa tekrar içinde yer alir.
12. Istem 10'a veya istem l l'e uygun bir immünojenik bilesim olup, burada birinci yakin uç ve ikinci yakin uç, kisa tekrar-uzun tekrar-kisa tekrar (SR-LR-SR) parçalarini kesintiye ugratmazlar.
13. Istemler lO-lZ'den herhangi birine uygun bir immünojenik bilesim olup, burada polipeptid, SEKANS KOD NO.: 3, 23, SEKANS KOD NO.: 25 veya SEKANS KOD NO.: 27'nin bir immünojenik fragmanini içerir.
14. 14. Istemler 10-12'den herhangi birine uygun bir iinmünojenik bilesim olup, burada polipeptid, asagida belirtilenlerden birini SEKANS KOD NO.: 32, SEKANS KOD NO.: 33 veya SEKANS KOD NO.: 34 veya SEKANS KOD NO.: 35; SEKANS KOD NO.: 32, SEKANS KOD NO.: 33 veya SEKANS KOD NO.: 34 veya SEKANS KOD NO.: 35 ile benzerlige sahip olan bir polipeptid; veya SEKANS KOD NO.: 32, SEKANS KOD NO.: 33 veya SEKANS KOD NO.: 34 veya SEKANS KOD NO.: 35'in fragman.
15. 15. Istemler l-9'dan herhangi birine uygun bir immünojenik bilesim olup, burada polipeptid, bir birinci fragman ve bir ikinci fragman içeren bir polipeptiddir, burada: (i) birinci fragman, bir A toksini tekrar domaini fragmanidir; (ii) ikinci fragman, bir B toksini tekrar domaini fragmanidir; (iii) birinci fragman, bir birinci tekrar kismi içinde yer alan bir birinci yakin uç içerir; ve (iv) ikinci fragman, bir ikinci tekrar kismi içinde yer alan burada birinci fragman ile ikinci fragman birbirlerine komsudurlar ve burada birinci tekrar kismi ile ikinci tekrar kismi yapisal benzerlige sahiptirler. Istem 15'e uygun bir immünojenik bilesim olup, burada birinci yakin uç, A toksininin tekrar kisini VII içinde yer alir ve/Veya ikinci yakin uç, B toksininin tekrar kismi 11 içinde yer alir. Istem 15'e veya istem 16'ya uygun bir immünojenik bilesim olup, burada birinci yakin uç, bir uzun tekrar içinde yer alir ve/Veya ikinci yakin uç, bir uzun tekrar içinde yer alir. Onceki istemlerden herhangi birine uygun iminünojenik bilesimin ve bir farmasötik açidan kabul edilebilir yardimci maddenin bulundugu bir asi. C. difficile hastaliginin tedavisinde veya önlenmesinde kullanim için, istemler l-l7'den herhangi birine uygun inimünojenik bilesim.