TARIFNAME FAKTÖR vii BILESIMI Mevcut bulus faktör VII (FVll) içeren stabil bir farmasötik bilesim ile ilgilidir. Teknoloiik alt yapi: Koagülasyon fenomeni birçogunun aktif yerleri düzeyinde bir serini içeren proteazlar oldugu koagülasyon faktörlerini dahil eden bir enzimatik reaksiyon kaskadini içerir. Nihai adim, çözünebilir fibrinojenin aglari içinde sirküle eden hücreleri çevreleyen fibrin filamanlarina dönüsümüdür. Koagülasyon faktörleri I'den Xlll'e giden numaralar yoluyla belirtilir. Sonuncu koagülasyon adiminda araya giren faktör XIII hariç olmak üzere, diger faktörler numaralandirmalarinin tersi sirada araya girer; böylelikle faktör XII koagülasyonu baslatir ve faktör l bunu sonlandirir. Her bir faktör a harfi ile belirtilerek, inaktif öncül formda ve aktive formda mevcuttur. Koagülasyon, bir nihai ortak yola yol açarak, biri içsel diger dissal olmak üzere iki yol uygular. Iki mekanizmanin kombinasyonu yeterli bir mobilite garanti ederek kari basincina direnen kati ve esnek bir kari pihtisinin olusmasini mümkün kilar. Trombin eylemi altinda, fibrinojen fibrinin olusmasina yol açan kimyasal modifikasyonlara maruz kalir. Fibrin pihtinin olusmasina yönelik gereklidir. Içsel yol sirkülasyon içinde mevcut faktörleri içerir ve koagülasyon prosesi kan damari içinde dahi hareket eder. Dissal yolun kendisi normal olarak sirkülasyon içinde mevcut olmayan ve bir damar lezyonu sirasinda serbest birakilan doku faktörlerini uygular. Bu yolun aktivasyonu sirasinda zincirde bir reaksiyon olusur, bu sirada, aktive bir koagülasyon faktörü, sonraki koagülasyon faktörünün aktivasyonunu tetikler. Bu yol plazma içinde mevcut faktör VII'in (FVll) araya girmesini dahil eder. Ayni zamanda prokonvertin olarak adlandirilan aktive faktör VII, kan koagülasyonu mekanizmasina dahil edilen, yaklasik 50 kDa'lik moleküler agirliga sahip faktörlerden biridir. Bu, aktive formda sentezinin K vitaminine bagli oldugu proteaz serinleri familyasinin bir glikoproteinidir. Koagülasyon kaskadini baslatmaya yönelik olarak, FVII FVlla'da aktive edilmelidir. Sadece FVIla (kompleks degildir) düsük bir proteolitik aktiviteye sahiptir. Aktive edilmesi halinde FVIIa vasküler lezyon sirasinda serbest birakilan, fosfolipitler ile iliskilendirilen protein olan doku faktörüne (FT) kompleks hale gelir. FVIIa-FT kompleksi akabinde kalsiyum iyonlarin varliginda faktör X'u faktör Xa'ya dönüstürür. Bu kompleks ayni zamanda böylelikle içsel yolu katalize ederek faktör FIX'in FlXa'ya aktivasyonunu etkiler. Faktörler IXa ve Xa, buna karsilik aktive faktör Vll'yi aktive eder. Aktive faktör FVfye ve protrombinaza kompleks haline getirilen faktör Xa protrombini trombine dönüstürür. Trombin dolayisiyla bunu fibrine dönüstürmeye yönelik fibrinojeni etkiler ve ayni zamanda sirasiyla FVIII ve FV'den FVIIa ve FVa'nin aktivasyonuna olanak saglar. Trombin diger yandan, kalsiyumun varliginda oldugunda, fibrin pihtisinin konsolidasyonundan sorumlu faktör Xllla'yi aktive etmeye olanak saglar. Bununla birlikte, bir koagülasyon faktörü eksik oldugunda, reaksiyon kaskadi yarida kesilir veya eksiktir ve böylelikle anormal bir koagülasyon söz konusudur. Aktive faktör VII, faktör VIII veya IX'in yoklugunda dahi, hemorajiye yol asçan bir doku Iezyonundan sonra serbest birakilan doku faktörünün varliginda lokal olarak hareket eder. Bundan dolayi, tercih edildigi üzere aktive formda faktör VII, kanamalar yoluyla kendini gösteren kan koagülasyonuna yönelik bazi sorunlarin tedavisine yönelik uzun zamandan beri kullanilir. Faktör, hastalarinin faktörler VIII veya IX'in inhibitörlerine sahip oldugu A veya B tipi hemofili, sonradan kazanilmis hemofili, konjenital faktör VII eksikligi gibi çok sayida patolojide ve cerrahi operasyonlar sirasinda meydana gelebilen hemorajilerin önlenmesine yönelik ürün olarak uygulanir. Günümüzde, hemofili veya konjenital faktör VII eksikliginden sikayetçi bu hastalarin tedavisine yönelik ticari olarak mevcut bir ilaç bilinir. Danimarkali NovoNordisk firmasi tarafindan üretilen, 1996 yilindan beri Avrupa marketinde yetkilendirilen ve 1999'da Amerikan marketinde yetkilendirilen NovoSeven® söz konusudur. NovoSeven® aktif içerik maddesinin eptacog alfa (yeni dogan hamsterlarin BHK böbrek hücrelerinden genetik mühendisleri tarafindan üretilen aktive insan rekombinant koagülasyonunun aktive faktör VII) oldugu bir ilaçtir. Bu ürün ilave olarak sodyum klorür (2,92 g/I), dihidratli kalsiyum klorür (1,47 g/I), glisilglisin (1,32 g/I), polisorbat 80 (0,07 g/I), mannitol (30 g/I) içerir. Ayni zamanda ortam sicakliginda (25°C) ürünün muhafaza edilmesine olanak saglayan, NovoSeven® RT olarak adlandirilan NovoSeven'in bir çesidi mevcuttur. Bu ikinci ürün, sodyum klorür (2,92 g/I), dihidratli kalsiyum klorür (1,47 g/I), glisilglisin (1,32 g/I), polisorbat 80 (0,07 g/I), mannitol (25 g/I), klorhidrik asit ve pH'i ayarlamaya yönelik sodyum hidroksit içerir ve ayni zamanda sakkaroz (10 g/I) ve metiyonin (0,5 g/l) (antioksidan olarak kullanilir) içerir. Bu ürünün yeniden solüsyon haline getirilmesi, enjekte edilebilir preparata yönelik suyu ancak ayni zamanda histidini gerektirir. N0voSeven® RT Avrupa ve Amerika marketlerinde 2008'de yetkilendirilmistir. Rekombinant FVIIa (rFVIIa) için temel terapötik gösterge anti-faktör VIII antikorlarindan gelistirilen A hemofillerin ve anti-faktör IX antikorlarindan gelistirilen B hemofillerin ani veya cerrahi kanama tedavisi ile ilgilidir. Avrupa'da, bu ayni zamanda bir konjenital FVII eksikligine sahip hastalarda Glanzmann trombastenisi hastalarinda kullanimina yönelik belirtilir. Ilaveten, çok sayida yayin konjenital koagülasyon faktör eksikligine veya trombasteniye sahip olmayan hastalarda, cerrahi müdahaleler sirasinda hemorajinin kontrolünde rFVlla'nin etkinligini belirtir. Nedergaard et al, 2008 makalesi [Nedergaard H. et al, In vitro stability of lyophilized and reconstituted recombinant activated factor VIl formulated for storage at room temperature, Clinical Therapeutics, Vol 30, N°7, p1309-1315, 2008] NovoSeven® RT'nin 25°C'de 24 aylik, 30°C'de 12 aylik, 40°C'de 6 aylik ve 50°C ve 60 °C'de 12 saatlik bir periyot boyunca liyofilize formunda stabil kaldigini açiklar. Ilaveten, bu ürün likit sulandirilmasindan sonra sadece alti saat boyunca stabildir ve bunun sonucunda sulandirmadan sonra Üç saat içinde enjeksiyonun gerçeklestirilmesi tavsiye edilir. Bu ürün dolayisiyla bu stabilite ile idare zorluklarina ve uygulama saatleri düzeyinde kisitlamalara sahiptir. EP 1 210 361 patenti aktive faktör Vllinin bir liyofilize bilesimini stabilize etmeye yönelik glisilglisinin kullanilmasina yönelik avantaji açiklar. WO2004/000347 patent basvurusu diger çesitli stabilizasyon ajanlarini sunar. Soenderkaer S. et al, 2004 yayini [Soenderkaer S. et al, Effects of sucrose on rFVIIa aggregation and methionine oxidation, European Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 21, p597-606, 2004] aktive faktör VII`nin agregasyonuna ve termal denatürasyonuna karsi stabilizasyona yönelik temel eksipiyan olarak sakkarozu açiklar. Bu ögretiye göre, sakkaroz proteinlerin yüzeyinin sekerlerini hariç birakarak aköz solüsyonda natif formunda proteinin muhafaza edilmesine olanak saglar, bu da molekülün kimyasal potansiyelinin arttirilmasina olanak saglar. Sonuç olarak ve yüzeyinin düsürülmesi ile protein bir kompakt uyusum içinde kalir. Eksipiyan olarak sakkarozun varligi Iiyofilize formunda aktive faktör Vlllnin stabilize edilmesine olanak saglar. Bununla birlikte, sakkarozun varligi bu türde bilesiklerin eklenmesi ile iliskili teknik kisitlamalara ve yönetmeliklere yol açarak, formülasyon içinde antioksidan bilesiklerin indüksiyonu ile sonuçlanir. Dolayisiyla günümüzde antioksidanlardan yoksun, kimyasal ve fiziksel olarak ortam sicakliginda stabil ve hemofili veya konjenital faktör VII eksikligine sahip hastalar tarafindan kullanilmasi kolay olan faktör VII içeren ilaçlarin gelistirilmesine yönelik gerçek bir ihtiyaç mevcuttur. Bulusun kisa açiklamasi: Bulus faktör VII içeren farmasötik bir bilesimi saglar, söz konusu bilesim mannitol, herhangi bir seker ve glisilglisin içermez ve en az arginin ve en az bir hidrofob amino asit içerir. Tercih edilen bir düzenlemeye göre, bilesim ilaveten herhangi bir antioksidan ajan içermez. Tercih edilen bir düzenlemeye göre, bulusun bilesimi faktör VII, en az arginin, en az bir hidrofob amino asit ve bir alkali metal tuzu, bir toprak alkali metal tuzu veya bir geçis metali tuzu içerir, söz konusu bilesim mannitol ve sakkaroz içermez. Avantajli bir sekilde, kati formdaki bilesim bir toz veya bir kek (« cake » veya « plug ») formunda olabilir. Bilesim tercih edildigi üzere %3'ten az veya buna esit bir nem derecesine sahiptir. Özel bir düzenlemeye göre, bilesim liyofilize formdadir. Bulusun bir diger amaci, bu tür bir bilesimin hazirlanmasina yönelik bir prosestir, söz konusu proses, bir tampon solüsyonu ile FVIIlnin karistirilmasi, gerekli olmasi halinde pH ayarlama, bir likit formu elde etmeye yönelik filtrasyon içerir. Bu likit form akabinde kati formu elde etmeye yönelik bir kurutmaya tabi tutulabilir. « Tampon solüsyonu » terimi hidrofil veya pozitif olarak yüklenmis bir dogrusal zincirin tasiyicisi en az bir amino asit ve bir alkali metal tuzu, bir toprak alkali metal tuzu veya bir geçis metali tuzunu dahil eder. Avantajli olarak, tampon solüsyonu ayni zamanda en az bir hidrofob amino asit içerir. Bulusun bir diger amaci, terapötik kullanimda enjekte edilebilen bir formülasyonun hazirlanmasina yönelik bir prosesten olusur, söz konusu proses, enjekte edilebilen preparatlara yönelik su için burada tanimlandigi üzere bir kati bilesimin çözünmesini içerir. Bulus ayni zamanda bu proses yoluyla elde edilebilen enjekte edilebilen bir formülasyonu amaçlar. Bulusun detayli açiklamasi: Basvuru sahibi ortam sicakliginda kimyasal ve fiziksel olarak stabil olan ve hemofili ve özellikle konjenital faktör Vll eksikligine sahip hastalar tarafindan kullanilmasi kolay faktör VII bilesimlerini saglar. Özellikle, bulusun yeni farmasötik bilesimi 25°C'den az veya buna esit bir sicaklikta 24 aydan fazla kati formda bir stabiliteye sahiptir. Bilesim dolayisiyla faktör Vlltnin önemli ölçüde bozunumu olmaksizin ortam sicakliginda muhafaza edilebilir. Ortam sicakligi ile normal olarak 10°C ila 30°C arasinda, tercih edildigi üzere 15°C ila 25°C arasinda bulunan bir odanin içindeki sicaklik anlasilir. "Faktör Vll " veya "FVII" terimi, vahsi türde Insan faktör Vll"nin (U. 8. 4,784, 950 patentinde açiklandigi üzere) veya bir diger türden (örnegin, sigir, domuz, köpek, siçan) derive edilen FVII'nin 1-406 dizisini içeren polipeptitleri dahil eder. Bu ilaveten mevcut olabilen faktör Vllinin dogal alelik varyasyonlar ve herhangi bir glikosilasyon formu veya derecesi veya diger post-tradüksiyonel modifikasyonu içerir. « Faktör Vll » terimi, ayni zamanda vahsi formun aktivitesine göre ayni veya fazla bir biyolojik aktiviteye sahip FVII çesitlerini dahil eder, bu çesitler özellikle bir veya daha fazla amino asidin insersiyonu, delesyonu veya sübstitüsyonu yoluyla vahsi FVIIa'dan farklilik gösteren polipeptitleri dahil eder. « Faktör VII » veya « FVll » ayrik olmayan FVll (zimojen) ve aktive Faktör VII içerir. Faktör VII tercih edildigi üzere aktive formda bilesim içinde kullanilir. "Faktör Vlla'nin biyolojik aktivitesi" terimi, örnegin aktive trombositlerin yüzeyinde trombin olusturmaya yönelik kapasiteyi dahil eder. Bilesim içinde Faktör Vll'nin aktivitesi, farkli sekillerde degerlendirilebilir. Örnegin bu, bir koagülasyon testi ile belirlenen Faktör VIIa miktari ile anti-FVII antikorlari ile immünoreaktivite ile belirlenen Faktör VIl miktari arasindaki oran yoluyla ölçülebilir. "Stabil bilesim" terimi burada, agregalarin (çözünemeyen veya çözünebilir) olusumunun minimum hale getirildigini ve/veya kimyasal bozunumun indirgendigini belirtir, pH sürdürülür ve proteinin uyusumu, proteinin biyolojik aktivitesinin ve stabilitesinin muhafaza edilecegi sekilde, bulusun bilesimlerinin Üretimi veya muhafaza edilmesi sirasinda önemli ölçüde modifiye edilmez. Bilesimler bir liyofilizasyona maruz kaldiginda, bilesimlerin stabilizasyonu proteinin bir liyoproteksiyonunu ve bir kriyoproteksiyonunu içerir. Faktör Vll'nin "fiziksel stabilitesi" terimi, Faktör Vll'nin dimerik, oligomerik veya polimerik formlarinin çözünemeyen veya çözünebilir agregalarinin olusumun indirgenmesine veya yokluguna, bunun yani sira molekülün herhangi bir yapisal denatürasyonunun indirgenmesine veya yokluguna refere eder. "Kimyasal stabilite" terimi, hizlandirilmis kosullarda, kati halde veya çözünmüs formda, depolama sirasinda faktör VII'nin herhangi bir kimyasal modifikasyonunun indirgenmesine veya yokluguna refere eder. Örnegin, hidroliz, deaminasyon ve/veya oksidasyon fenomenleri önlenir veya geciktirilir. Sülfür içeren amino asitlerin oksidasyonu sinirlandirilir. Örnegin, bulusun kati bilesimleri, hazirlama prosesinin sonunda ve muhafazadan önce oksit formlarin ve agregalarin düsük içeriklerini içerir, örnegin, agirlikça %5'ten az, tercih edildigi üzere agirlikça %4iten az veya %3'ten az veya %2'den az FVII oksitli forma dönüstürülür ve agirlikça %5`ten az, tercih edildigi üzere agirlikça %4'ten az veya %3'ten az veya %2'den az FVII dimerik veya polimerik forma dönüstürülür. Muhafaza esnasinda, karanlikta 24 aydan sonra 30°C'de muhafaza edilmesinden sonra tercih edildigi üzere agirlikça %10'dan az FVIl oksitli forma dönüstürülür ve agirlikça %10'dan az FVII dimerik veya polimerik forma dönüstürülür. Bulusa göre bir Iiyofilize bilesim ayni zamanda yapisal bir stabiliteye sahiptir, diger bir deyisle bu, ani sekilde dagilmayan ve kullanimdan önce su içinde kolay sekilde çözünebilen bir keki (« cake » veya « plug ») olusturabilir. Bulusun farmasötik bilesimi faktör VII içeren bir bilesimdir, söz konusu bilesim, manniyol, herhangi bir seker ve glisilglisin içermez, söz konusu bilesim arginin ve bir hidrofob amino asit içerir. Bulusun bilesimi içinde, tercih edildigi üzere faktör Vlla formunda faktör VII içerigi bu sekilde olabilir: 0,1 ile 15mg/ml arasinda, tercih edildigi üzere 0,1 ile 10mg/ml arasinda, tercih edildigi üzere 0,2 ile 5mg/ml arasinda veya 0,2 ile 2mg/ml arasindadir (tercih edildigi üzere kurutmadan önce likit formunda veya rekonstitüsyondan sonra enjekte edilebilen preparat formunda ölçülmüstür). Tercihen, bilesim herhangi bir seker, poliol veya metiyonin içermez. Önlenecek sekerler özellikle, sakkaroza ilave olarak, dekstroz, Iaktoz, maltoz, trehaloz, siklodekstrinler, maltodekstrinler ve dekstranlar gibi di- ve tr-sakkaritler ve polisakkaritleri içerir. Önlenecek polioller özellikle, mannitole ilave olarak, sorbitol ve ksilitol içerir. Bilesim, glisilglisin içermez. Tercih edilen bir düzenlemeye göre, bulusun bilesimi ilaveten herhangi bir antioksidan ajan içermez. Antioksidanlar örnegin bu bilesiklerin bir veya daha fazlasini içerir: homosistein, sistein, sistation, metiyonin, glutation. Bulusa göre bilesim arginin ve en az bir hidrofob amino asit içerir. Hidrofil (veya polar) amino asitler veya pozitif olarak yüklü bir dogrusal zinciri tasiyan amino aistler Lisin, Arginin, Histidin, Glisin, Serin, Treonin, Tirosin, Asparagin, Glutamin'i içerir. Hidrofil olan veya pozitif olarak yükle bir dogrusal zinciri tasiyan amino asitler arasindan, tercih edildigi üzere arginin veya arginin klorhidrat veya arginin fosfat gibi bunun derive tuzlarindan biri kullanilabilir. Glisin ve/veya Iisin gibi amino asitler veya lisin klorhidrat gibi bunun derive tuzlarindan biri avantajli olarak eklenebilir. Arginin gibi, hidrofil olan veya pozitif olarak yüklü bir dogrusal zinciri tasiyan bir amino asidin ve gerekli olmasi halinde bir hidrofob amino asit hatta bir alkali, toprak alkali metal tuzu veya bir geçis metalinin eklenmesi faktör VII'nin stabilizasyonunu ve Iiyofilie formlarin çözünmesini destekler. Hidrofob amino asitler (apolar dogrusal zincir içerir) özellikle bu amino asitleri içerir: Alanin, Valin, Lösin, Izolösin, Fenilalanin, Triptofan, Prolin. Tercih edildigi üzere, bu bulusun kapsami dahilinde hidrofob amino asit izolösin, Iösin veya ikisinin bir karisimidir. Tercih edildigi üzere, bulusun bilesimi bir alkali metal tuzu, bir toprak alkali metal tuzu veya bir geçis metalinin bir tuzunu içerir. Özellikle trisodyum sitrat, kalsiyum klorür veya çinko klorür belirtilebilir. Tercih edilen bir sekilde, kullanilan tuz tercihen sodyum sitrat veya kalsiyum klorürdür. Son olarak, bulusun bilesimi polisorbatlar gibi iyonik olmayan türde bir veya daha fazla deterjan, poloksamerler, polioksietilen alkil eterleri, etilen/polipropilen ve polietilenglikolün bir ko-polimer blogunu içerebilir. Avantajli olarak, tercih edilen deterjanlar polisorbat 80 ve polisorbat 20'dir. Bir düzenleme örneginde, bilesim asagidaki unsurlari içerir: - tercih edildigi üzere faktör Vlla formunda, faktör VII; - istege bagli olarak klorhidrat formunda arginin; - izolösin; - Iisin; - glisin; - trisodyum sitrat veya kalsiyum klorür; - ve gerekli olmasi halinde polisorbat 80 veya polisorbat 20. Daha özel olarak, bilesim asagidaki unsurlari içerebilir - tercih edildigi üzere faktör Vlla formunda, faktör VII; - istege bagli olarak klorhidrat formunda 10 ila 40 g/l arginin; - 4,2 ila 6,6 g/I izolösin; - 0,6 ila 1,8 g/I lisin; - 0,6 ila 1,8 g/I glisin; - 1 ila 2 g/I dihidratli trisodyum sitrat veya 0 ila 0,2 g/L dihidratli kalsiyum klorür; - ve gerekli olmasi halinde 0 ile 0,5 g/I polisorbat 80. Özel bir örnege göre, bilesim asagidaki unsurlari içerir - 0,2 ila Zg/I'de faktör VII (tercih edildigi üzere faktör Vlla formunda), - 24 g/I'de arginin klorhidrat, - 6 g/l'de izolösin, - 1,5 g/I'de dihidratli trisodyum sitrat, - 1,2 g/I'de glisin, - 1,2 g/I'de Iisin klorhidrat. - ve/veya 0,07 g/I'de polisorbat 80. Özel bir diger örnege göre, bilesim asagidaki unsurlari içerir - 0,2 ila Zg/l'de faktör VII (tercih edildigi üzere faktör Vlla formunda), - 34 g/Iide arginin klorhidrat, - 0,15 g/I'de dihidratli kalsiyum klorür, - 6 g/I'de izolösin. Konsantrasyonlar kurutmadan önce likit formunda veya rekonstitüsyondan sonra enjekte edilebilen preparat formunda bilesimlere göre belirlenir. Basvuru sahibi sakkarozun yani sira mannitolü farmasötik kullanimli bilesiminden elimine etmistir, bu içerik maddeleri ancak faktör VII içeren farmasötik formülasyonlarin seyrelticileri veya stabilizörleri olarak normal sekilde kullanilir. Sakkaroz ve manntiolün yoklugu çok sayida avantaj saglar. Bir yandan, sakkaroz tarafindan saglanabilen oksidan veya endotoksin elemanlarin varligi önlenir. Mannitolün varliginin liyofilizasyon esnasinda bilesimin içinde mannitol kristallerinin polimorf formlarinin olusumunu önledigi ve özellikle bilesimde mannoz varligi gibi safsizliklara yönelik riski sinirlandirdigi sasirtici bir sekilde ortaya çikar. Bununla birlikte, tüm beklentiye karsilik, bulusun bilesiminin mannitol ve sakkaroz yoklugu bilesimin stabilitesine zarar vermez. Buna karsilik, mevcut formülasyonlara, örnegin NovoSeven® RT'ye göre bilesimin cam geçil sicakliginda bir artis gözlemlenir. Cam geçisi, bir ikinci siradan geçistir, diger bir deyisle ancak gizil isida olmamak üzere isitma kapasitesinde bir degisiklik içeren bir termal geçistir. Bu, yeterli ölçüde düsük bir sicaklikta ve yeterli ölçüde hizli sekilde kristallesmeksizin sogutulan ve bir cam haline gelen asiri sogutulmus likitlerin ve bir kati halden bir viskoelastik hale geçen amorf polimerlerin veya kristalin polimerlerin amorf bölümünün karateristigidir. Cam geçis sicakligi veya Tg bunda bu hal degisiminin meydana geldigi sicakliktir. Bir likit ürün bu sicakligin altinda sogutuldugunda, bu, cam gibi kati ve kirilgan hale gelir, bunlarin camsi halde oldugu söylenir. Moleküllerin mobilitesinin, ürün camsi halde oldugunda bloke edilmesinden dolayi (sadece radikal fonksiyonlar nispi bir düsük mobiliteye sahiptir), ürünlerin, camsi geçislerinden düsük sicakliklarda muhafaza edilmesi avantajlidir. Yüksek bir cam geçis sicakligi dolayisiyla yüksek sicakliklarda (25°C) Iiyofilize bilesimin daha iyi bir stabilitesini destekler ve böylelikle aktif içerik maddesinin reaktivitesini düsürür [Pikal et al., The Effects of Formulation Variables on the Stability of Freeze-Dried Human Growth Hormone, Journal of Pharmaceutical Research, Vol 8, p 427-436, 1991]. ilaveten, formülasyonu sayesinde bulusa göre farmasötik kullanimli bilesim proteinin agregasyonunu önler. NovoSeven®RT formülasyonunda oldugu gibi mannitol ve sakkarozun varliginda, cam geçis sicakligi 45°C'dir. Sakkaroz ve mannitol içermeyen bulusun bilesiminin cam geçis sicakligi 60°C'den fazla ve genel olarak 74 ile 93°C arasinda bulunur, bu da, buzdolabi disinda ve hatta 25°C`den fazla sicakliklarda bir depolamanin tasarlanmasina olanak saglar (kiyasla Sekil 2). Faktör VII genel olarak bir insan faktör Vllidir. Bu, farkli sekillerde, örnegin insan plazmasindan kriyopresipite edilemeyen fraksiyondan veya hücrelerden veya transgenik hayvanlardan genetik mühendisligi yoluyla elde edilebilir. Tercih edilen bir sekilde, faktör Vll (tercih edildigi üzere, faktör Vlla formunda) özellikle transgenik hayvan sütü içinde üretilir, bulusun formülasyonu, faktör Vll'nin Iiyofilizasyonundan sonra memnun edici bir biyolojik aktivitede muhafaza edilmesine olanak saglar. Tercih edilen bir düzenlemeye göre, insan faktör VII genetik olarak bu proteini üretmeye yönelik modifiye edilen, insan olmayan transgenik memelilerin sütü içinde üretilir. Tercih edildigi üzere, transgenik bir tavsanin veya bir keçinin sütü söz konusudur Transgenik memelinin sütü içinde salgilanmasina olanak saglayan memeli bezeleri yoluyla faktör Vlllnin salgilanmasi, dokuya bagli sekilde faktör Vll'nin ekspresyonunun kontrolünü içerir. Bu tür kontrol yöntemleri teknikte uzman kisi tarafindan iyi sekilde bilinir. ifadenin kontrolü, hayvanin özel bir dokusuna dogru proteinin ifade edilmesine olanak saglayan diziler sayesinde gerçeklestirilir. Özellikle WAP, beta-kazein, beta- Iaktoglobülin öncül dizileri ve sinyal peptit dizileri söz konusudur. Transgenik hayvanlarin sütünden ilgili proteinlerin çikarilmasina yönelik proses EPO 264 166 patentinde açiklanir. Bulusun bilesimi alisilagelmis herhangi bir teknik kullanilarak elde edilebilir. Özellikle bulusun bilesimi faktör VII ile bir tampon solüsyonun karistirilmasi, gerekli olmasi halinde pH'in ayarlanmasi, bir likit formun elde edilmesine yönelik filtrasyon, akabinde bir kati formun elde edilmesine yönelik gerekli olmasi halinde kurutulmasi içeren bir proses uygulanarak elde edilebilir. Tercih edildigi üzere, kurutmadan önce solüsyonun lei 4,0 ile 9,0 arasinda, daha özel olarak 4,0 ile 8,0; 4,0 ile 7,5; 4,5 ile 7,5; 5,0 ile 7,5; 5,5 ile 7,0; 6,0 ile 7,5; 6,5 ile 7,5 düzeylerinde bulunur. Kurutma, ileri bir asamada suyun eliminasyonuna yönelik bir prosestir. Mümkün oldugunca suyun elimine edilmesinin amaçlandigi bir dehidrasyon söz konusudur. Bu fenomen dogal sekilde veya basinçlandirilmis olabilir. Bu kurutma, Iiyofilizasyon, atomizasyon ve kriyoatomizasyon teknikleri araciligiyla gerçeklestirilebilir. Bulusa göre farmasötik kullanimli bilesimin kati formunun elde edilmesine yönelik tercih edilen mod Iiyofilizasyondur. Liyofilizasyon yöntemleri teknikte uzman kisi tarafindan iyi sekilde bilinir, bakiniz örnegin [Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60, 2000]. Bilesimin nem derecesi veya su içerigini düsürmeye yönelik uygun diger prosesler tasarlanabilir. Tercih edildigi üzere nem derecesi agirlikça %3'ten az veya buna esit, tercihen %2,5'ten az veya buna esit, tercihen %2'den az veya buna esit. tercihen %1 ,5'ten az veya buna esittir. Bulusa göre bilesim avantajli olarak, örnegin Iiyofilizatin kuru isitilma islemi yoluyla bulasici ajanlarin eliminaysonuna veya inaktivasyonuna yönelik bir yönteme tabi tutulabilir. Tercih edildigi üzere Iiyofilize formda bulusa göre kati bilesim terapötik kullanimli bir formülasyonu elde etmeye yönelik enjekte edilebilen preparatlara yönelik su içinde (veya « water for injection veya WFI ») çözdürülebilir. Tercih edilen bir sekilde, faktör Vll"nin çözünmesi saf su içinde gerçeklestirilebilir, bu da NovoSeven® RT ürününde kullanilan histidin ile solvent gibi daha karmasik rekonstitüsyon solventlerine göre avantajlidir. Bulusa göre likit bilesim (kurutmadan önce) 2 ile 8 °C arasinda en az 3 günlük bir kimyasal veya fiziksel stabiliteye sahiptir. Bulusa göre kati bilesim, 24 aydan fazla ve genel olarak en az 36 aya kadar, 25°C'den az veya buna esit bir sicaklikta kati formda bir kimyasal veya fiziksel stabiliteye sahiptir. Rekonstitüe edilen enjekte edilebilen formülasyon ayni zamanda oldukça stabildir, bunun likit formdaki kimyasal ve fiziksel stabilitesi, 25°C'de 6 saatten fazla, tercih edildigi üzere 12 saatten fazla, tercihen 24 saatten fazla, tercihen bir haftadan fazladir. Likit formda veya kati formda farmasötik bilesim veya enjekte edilebilen formülasyon, çesitli patolojilerin tedavisine yönelik kullanislidir. Bulusun bir amaci bir hemofilinin veya bir konjenital faktör VII eksikliginin tedavisinde bir kullanima yönelik, bir farmasötik bilesim veya yukarida tanimlandigi gibi enjekte edilebilen formülasyondur. Ayni zamanda bir hemofolinin veya bir konjenital faktör VII eksikliginin tedavisine yönelik bir yöntemde bilesimin kullanilmasi açiklanir, burada bu tür bir tedaviye ihtiyaç duyan bir hastaya açiklanan enjekte edilebilen formülasyonun etkili bir miktari uygulanir. Hemofili, A tipi veya B tipi olabilir. A tipi hemofili bir faktör VIII eksikligi ile karakterize edilir iken B tipi hemofili bir faktör IX eksikliginin sonucu ortaya çikar. Konjenital faktör VII eksikligi, koagülasyon faktör Vllisinin azaltilmasi veya yoklugundan kaynaklanan, nadir otozomal resessif kalitimla geçen bir hemorajik hastaliktir. Enjekte edilebilen formülasyon doktor tarafindan belirlenen bir miktarda parenteral (intravenöz, subkütanöz, intramüsküler) yol ile uygulanabilir. Uygun olan herhangi bir yol ve herhangi bir yöntem ile likit formun (kurutmadan önce) veya kati formun uygulanmasi hariç tutulmaz. Asagidaki örnekler ve sekiller, bunun kapsami sinirlandirilmaksizin bulusu açiklamaktadir. Sekillerin Açiklamalari: Sekil 1, formülasyonun (F3) sonucunda ortaya çikan FVIIa'nin aktivitesinin, 25°C'de 6 günlük bir depolamadan sonra, rekonstitüsyonundan sonra likit formda korundugunu gösteren bir grafiktir. Sekil 2, kati formda formülasyonlarin (F3, F4 ve F7) 1 ay boyunca 40°C'de bir depolama sirasinda proteinin aktivitesinin (FVIIa) ( FVIIa/FVII:Ag orani ile ifade edilir) korunmasina olanak sagladigini gösteren bir grafiktir. ÖRNEKLER: Örneklerde kullanilan FVII W02008099077 patent basvurusunda açiklandigi üzere transgenik tavsanlarin sütünden elde edilir. Saflastirilmasi esnasinda aktive edilen insan faktör VII söz konusudur. Örnek 1: Formülasvonlarin hazirlanmasi: 1. 1: Likit formülasyonlarin (F1 ila F7) hazirlanmasi: Sirasiyla 0,6mg/ml (formülasyonlar (F1 ila F5)) ve 0,4mg/ml (formülasyonlar (F6 ile F7)) olan yaklasik bir konsantrasyonda saflastirilan ve aktive edilen faktör VII (10-20ml) Tablo 1'de karsilik gelen satirda tanimlandigi gibi, 2 litrelik tampon solüsyonuna karsi 12 saat boyunca diyalize edilmistir. pH (6,0 ± 0,2) 1M NaOH veya 1M HCI ile ayarlanmistir. Formüle edilen FVIla solüsyonlari filtrelenmistir ve sise basina 0,5 ml düzeyinde siseler içine dagitilmistir. Siseler akabinde bromobütil tikaçlar kullanilarak önceden kapatilmistir. 1.2: Yukaridaki 1.1 noktasinda hazirlanan likit formülasyonlarin (F1 ila F7) sonucunda ortaya çikan Iiyofilize formülasyonlarin hazirlanmasi: Siseler önceden tanimlanan bir döngüye göre Iiyofilize edilmistir. Kurutma isleminin sonunu saptamaya olanak saglamaya yönelik olarak, Iiyofilizatör bir kapasitans nem sensörü ile donatilmistir. Liyofilizasyon dönügüsünün sonunda, siseler vakum altinda kapatilmistir ve alüminyum kapsüller ile sizdirmaz hale getirilmistir. 1. 3: Likit formülasyonun (F8) hazirlanmasi: Saflastirilan ve aktive edilen faktör VII (0,4mg/ml) bir Superdex 200 jel filtrasyon kolonu üzerinde tampon degisimi yoluyla formüle edilmistir. Kolon baslangiçta trisodyum sitrat (1,0g/I), arginin klorhidrat (309/I) ve izolösin (6,09/I) içeren bir tampon solüsyonu ile dengelenmistir (bakiniz Tablo: F8). pH (7,0 ± 0,2) ayarlanmistir. Eluatin konsantrasyonu yaklasik 0,4mg/ml'de belirlenmistir. Formüle edilen FVIIa solüsyonu filtrelenmistir ve sise basina 0,5 ml düzeyinde siseler içine dagitilmistir. Akabinde siseler bromobütil tikaçlar kullanilarak önceden kapatilmistir. 1.4: Yukaridaki 1.3 noktasinda hazirlanan likit formülasyonun (F8) sonucunda ortaya çikan Iiyofilize formülasyonun hazirlanmasi: Siseler önceden tanimlanan bir döngüye göre Iiyofilize edilmistir. Kurutma isleminin sonunu görüntülemeye olanak saglamaya yönelik olarak, Iiyofilizatör bir kapasitans nem sensörü ile donatilmistir. Liyofilizasyon dönügüsünün sonunda, siseler vakum altinda kapatilmistir ve alüminyum kapsüller ile sizdirmaz hale getirilmistir. 1.5: Likit formülasyonun (F9) hazirlanmasi ve Iiyofilizasyon: Saflastirilan ve aktive edilen faktör Vll (yaklasik 0,4 mg/ml) bir Superdex 200 jel filtrasyon kolonu üzerinde tampon degisimi yoluyla formüle edilmistir. Kolon baslangiçta trisodyum sitrat (1,0g/I), arginin klorhidrat (309/I) ve izolösin (6,0g/I) içeren bir tampon solüsyonu ile dengelenmistir (bakiniz Tablo: F9). pH (7,0 ± 0,2) ayarlanmistir. Glisin (1,2 mg/ml) ve Iisin klorhidrat (1,2 mg/ml) eklenmistir. Formüle edilen FVIla solüsyonu filtrelenmistir ve sise basina 1,0 ml düzeyinde siseler içine dagitilmistir. Akabinde siseler bromobütil tikaçlar kullanilarak önceden kapatilmistir. Siseler akabinde önceden oldugu gibi ayni sekilde Iiyofilize edilmistir ve 6 ay boyunca 40°C'de depolanmistir. 1.6: Likit formülasyonlarin (F10 ve F11) hazirlanmasi ve Iiyofilizasyon: Sirasiyla 1,0 mg/ml (F10) ve 0,8 mg/ml (F11) olan bir yaklasik konsantrasyonda saflastirilan ve aktive edilen faktör VII, tablolar 3 ve 4'te (bakiniz tablo: F1O ve F11) tanimlandigi gibi tampon ile boruda diyaliz ile formüle edilmistir. pH (7,0 ± 0,2) ayarlanmistir. Formüle edilen FVIla solüsyonlari filtrelenmistir ve sise basina 1,0 ml düzeyinde siseler içine dagitilmistir. Akabinde siseler bromobütil tikaçlar kullanilarak önceden kapatilmistir. Siseler akabinde önceden oldugu gibi ayni sekilde Iiyofilize edilmistir. Formülasyon (F1 O) asagidaki kosullarda muhafaza edilmistir: - 144 saat boyunca 5°C'de akabinde 6 saat boyunca 25°C'de likit, e Dondurma ve buz çözme döngüsü (ardisik 4 döngü), - Liyofilize edilmis ve 6 ay boyunca 25°C ve 40°C`de depolanmis, - 6 ay boyunca < - 70°C'de dondurulmus. Formülasyon (F11) asagidaki kosullarda muhafaza edilmistir: - 72 saat boyunca 5°C`de, ayrica 25°C'de ilave 6 saat likit, - Liyofilize edilmis ve 25°C ve 40°C'de depolanmis, - Diyaliz adimindan önce tamponda < - 70°C'de dondurulmus: Trometamol (2,42 mg/ml), NaCI (8,77 mg/ml) ve mannitol (30 mg/ml). Örnek 2: Formülasvonlarin testleri Materyaller ve yöntemler: 2.1. Asagida « DLS » olarak adlandirilan, dinamik isik saçilma (Dynamic Light Scattering) ölçümleri. Liyofilizasyonun sonucunda ortaya çikan her bir numuneden 500 mikrolitre bir Zetasizer Nano aparati (Malvern Instruments, Worcestershire, BK) içine aktarilmis olan bir mikroküvet (Plastibrand®, Wertheim, Almanya) içine yerlestirilmistir. Bu aparat 4mM'de bir 633nm He-Ne Iazeri ve invazif olmayan bir geri saçilim « Non-Invasive Backscatter » veya NIBS teknigi ile islev görür. Yogunluk ve hacim yoluyla proteinin monomerik popülasyonlarinin boyunun dagilimi Malvern7e ait Dispersion Technology Software (versiyon 4.00) yazilimindan hesaplanmistir. Materyalin ve dagiticinin kirilma indeksleri sirasiyla 1,33 ve 1,45"te tanimlanmistir. Ölçümler esnasindaki sicaklik kontrol edilmistir ve 20°C'ye sabitlenmistir. Test edilen formülasyonlara yönelik kalite parametreleri monomerlerin formunda proteinlerin popülasyonunun çagini ve proteinlerin popülasyonunun dagilim yogunlugunu içerir. 2.2. Rekonstitüe edilen formülasyonlarin görsel denetimi. Test edilecek formülasyon enjekte edilebilen preparatlara yönelik 0,59 su ile Iiyofilize formülasyondan rekonstitüe edilmistir. Solvent tikaç vasitasiyla bir siringa araciligiyla Iiyofilizatin sisesi içine enjekte edilmistir. Kekin tamamen çözünmesinden sonra, rekonstitüe ürün Avrupa Farmakopesi ile ilgili görsel denetim yöntemine göre incelenmistir (Methods of Analysis - Pharmaceutical Technical Procedures - Particulate contamination-visible particules - paragraf 2.9.20). Test edilen formülasyonlar görünür partiküller yoluyla bulasma derecelerine göre yari- nicel sekilde siniflandirilmistir; - = sifir görünür partikül a = birkaç nadir görünür partikül + = görünür partiküllerin az miktarda görünür partikülleri ++ = çok miktarda görünür partikül +++ = oldukça çok miktarda görünür partikül Testlerin tümü bagimsiz sekilde ve üç farkli operatör tarafindan yürütülmüstür. 2.3. Agregalarin saptanmasina yönelik filtre üzerinde test. Kullanilan yöntem [Li et al, A simple method for the detection of insoluble aggregates iri protein formulations, Journal of Pharmaceutical Sciences Vol 96 (7), p1840-1843, 2007] makalesinden alinmistir. Bir Millex® GV 0,2pm steril membran filtresi 3 ml su ile akabinde ayni hacimde tampon solüsyonu ile durulanmistir. Akabinde analiz edilecek 0,5 ml protein solüsyonu (FVIla) bu filtre Üzerinde filtrelerimistir. Akabinde, filtre enjekte edilebilen preparatlara yönelik esit su (3ml) akabinde tampon solüsyonu (3ml) hacimleri ile yeniden durulanmistir. Filtre tarafindan tutulan protein fraksiyonlari 2 ml renklendirme solüsyonunun (SIGMA'ya ait « Reversible Protein Detection KIT ») eklenmesi ile renklendirilmistir. Renklendirme solüsyonu akmadan önce 5 dakika boyunca filtrasyon membrani ile temas halinde tutulmustur. Akabinde membran yeniden yukarida açiklandigi gibi durulanmistir. Test edilen formülasyonlar proteinlerden kaynaklanan, filtre üzerinde gözlemlenen renkli partiküllerin derecelerine göre yari-nicel sekilde sinilandirilmistir: - = Proteinlerden kaynaklanan, sifir saptanan görünür partikül. a = Proteinlerden kaynaklanan, birkaç nadir saptanan görünür partikül + = Proteinlerden kaynaklanan, az miktarda saptanan görünür partikül ++ = Proteinlerden kaynaklanan, çok miktarda saptanan görünür partikül +++ = Proteinlerden kaynaklanan, oldukça çok miktarda saptanan görünür partikül 2.4. Cam geçis sicakliginin (Tg) belirlenmesi. Cam geçis sicakligi indiyum (kaynasma sicakligi (Tm) 156,6°C) ve n-oktadekan (Tm 38,2°C) araciligiyla kalibre edilmis bir DSC 7 diferansiyel taramali termoanalizör (Perkin Elmer) yoluyla belirlenmistir. Numuneler 20°C/dakikalik hizda - 50 ila 138°C derecelere tabi tutulmustur. Deneyleri ortam sicakligindan az bir sicakliga tasimaya yönelik helyum kullanilmistir. Cam geçis sicakligi, görünür spesifik isida endotermik degisiminin orta noktasina tasinmistir. Iki ölçüm gerçeklestirilmistir ve ortalama Tg'yi verir. 2.5. FVIIaIFVII :Ag oraninin belirlenmesi Bilesim içindeki Faktör VII'nin aktivitesi, bir koagülasyon testi ile belirlenen Faktör Vlla miktari ile anti-FVII antikorlari ile immünoreaktivite ile belirlenen Faktör VII miktari arasindaki oran yoluyla degerlendirilmistir. Faktör VII (burada « antijen Faktör VII » veya « FVIIAg » belirtir) dozaji: FVII ticari reaktifler (Diagnostica Stago) ile immünoenzimatik yöntem (ELISA) yoluyla dozlanir. Kisa sekilde, dozlanacak Faktör Vll, bir kati fazda immobilize bir insan anti- Faktör VII antikoru yoluyla yakalanir. Sabitlenen Faktör VII akabinde bir peroksidaz immüno-konjügat tarafindan taninir. Bagli peroksidaz orani oksijenli su varliginda orto- fenilendiamin substrat üzerinde bunun aktivitesi ile ölçülür. Bir kuvvetli asit ile reaksiyonun durdurulmasindan sonra, renklendirme yogunlugu baslangiçta numune içinde bulunan faktör VII miktarina göredir. Aktive formda Faktör Vll'nin dozaji: Aktive Faktör FVII (FVlIa) ticari reaktifler (Diagnostica Stago) ile kronometrik yöntem yoluyla ölçülür. Çözünebilir rekombinant doku Faktörü (rsTF) Faktör Vlla'nin bir kofaktör fonksiyonuna sahiptir ve fosfolipitlerin ve kalsiyumun varliginda plazmanin koagülasyonuna olanak saglar. Bu sistemde, elde edilen koagülasyon süresi, test edilecek numune içinde bulunan Faktör VII miktarina göre olacaktir. rsTF Faktör Vlla'da Faktör Vll'yi aktive etmez; bunun sonucunda, plazma içinde bulunan Faktör VII, dozaj içine müdahale etmez. 2.6: Moleküler boyun dagilimi (DTM): Moleküler boyun dagiliminin belirlenmesi bir pompa, termostat ile ayarlanmis bir enjektör, bir UV detektörü ile bir Superdex Tricorn 200 10/300 GL kolonu (GE Healthcare, referans 17-5175-01) kullanilarak bir bilgisayar edinim sistemi ile donatili bir kromatografi sistemi sayesinde gerçeklesir. Mobil faz 7,4 pH'a sahip 0,01M fosfat tamponu, 0,138M sodyum klorür ve 0,0027M potasyum klorürden olusur. Bunun debisi 0.4 mI/dakika'dir. Analiz için, 100 pl numune enjekte edilir. UV yoluyla deteksiyon 280 nm'de gerçeklestirilir. 2.7: SDS-PAGE (indirgenmis/indirgenmemis): Kovalent agregalarin ve parçalarin orani düzeyinde numunelerin kalitesi indirgen olmayan kosullarda ve 2-(N-morflino)etansüIfonik asit veya MES (Invitrogen) tamponunda jeller kullanilarak bir Novex sisteminde indirgen kosullarda SDS-PAGE elektroforetik migrasyon yoluyla proteinlerin kütlesine bagsi farklarin analizi yoluyla degerlendirilmistir. 2 pg proteine karsilik gelen bir miktar biriktirilmistir. Proteinin ortaya çikmasi koomassie mavisi ve/veya gümüs nitrat ile renklendirme yoluyla gerçeklesti rilmistir. 2.8: IEF Izoelektrik noktalarina göre FVII'nin farkli izoformlarinin ayrilmasi izoelektrik fokalizasyon (IEF) yoluyla gerçeklestirilmistir. Migrasyon, natif kosullarda (indirgen olmayan ve denatüre edici olmayan) bir Multiphor sisteminde bir Focugel 3-10 ETC (Gelcompany) üzerinde gerçeklestirilmistir. Ürün, bir filtrasyon ünitesi (boyut dislama kDa) üzerinde bir tuz giderme islemine tabi tutulmustur. 280 nm'de DO yoluyla ürünün konsantrasyonunun belirlenmesinden sonra, 30 ug jel üzerinde biriktirilmistir. CBB-GZSO (Koomassie Parlak Mavi G250) yoluyla bir renklendirmeden sonra iki farkli pl standardi (GEiden standart pl 5,5-10,5 ve Sigma'dan standart pl 5,4-5,9-6,6, ayri standartlarin belirlenmesi) FVII'nIn izoformlarinin pl'sinin tanimlanmasina olanak saglamistir (Quantity one yazilimi, BioRad yoluyla nicellestirme). Sonuçlar: 1. Formülasyonlar (F1 ila F8) Asagidaki tablo 1'de. formülasyonlar (F1. F2) karsilastirmali olarak verilir. Bulusa göre (F3 ila F8) bilesimler arasindan, formülasyonlar (F3, F4 ve F7) tercih edilir. Bu tabloya göre, formülasyonlar (F4, F5 ve F7), NovoSeven® (F1) (%9) ve NovoSeven RT® (F2) (%27) formülasyonlarinda elde edilenlerden fazla olan, proteinin monomerik popülasyonunun bir yogunluk yüzdesini (sirasiyla %58, %61 ve %55) gösterir. Bu sonuçlar, kati formda ürünün stabilitesinde bir artis ifade eder ve monomerlerin varligi immünolojik reaksiyonlara yönelik risklerin azaltilmasina olanak saglar. FVIla/FVllzAg orani ile ilgili olarak, formülasyonlar (F3, F4 ve F8), NovoSeven® (F1) ve NovoSeven RT® (F2) gibi formülasyOnlar ile elde edilenlerden daha yüksek olan, liyofilizasyondan önce ve likit formda rekonstitüsyondan sonra FVlla/FVIlzAg oranlarina sahiptir, bu da bulusa göre bilesim içinde bulunan proteinin (FVIIa) daha aktive oldugunu ifade eder. Liyofilizasyondan önce NovoSeven® (F1) ve NovoSeven RT® formülasyonlari ile elde edilenlere yönelik 14'e karsi, F3 için 17'lik ve F8 için 23'lük bir FVIIa/FVllzAg orani, bunun yani sira rekonstitüsyondan sonra likit formda, NovoSeven® (F1) ve NovoSeven RT® formülasyonlari ile elde edilenlere yönelik 15'e karsi F3 için 19'Iuk ve F8 için 20'lik bir FVlIa/FVllzAg orani gözlemlenebilir. Cam geçis sicakliginda (Tg) gerçeklestirilen deneyler ile ilgili olarak bulusa göre formülasyonlar (F3 ila F8) cam geçis sicakliginda bir artis gösterir. Özellikle formülasyona (F3) yönelik, 75°C esit ve formülasyona (F7) yönelik 93 °C"ye esit bir cam geçis sicakligi elde edilir. Bu sonuçlar, proteinin (FVIIa) bu formülasyonlar içinde avantajli olarak stabil oldugunu gösterir. Esas olarak yüksek bir Tg aktif içerik maddesinin mobilitesini ve reaktivitesini düsürerek proteine yönelik iyilestirilmis bir stabiliteye olanak saglar. ilaveten, bu sonuçlar bulusa göre ürünlerin NovoNordisk sirketine ait NovoSeven® ürününün aksine buzdolabi disinda muhafaza edilebilecegini gösterir. Agregalarin deteksiyonuna yönelik filtre üzerindeki test ile ilgili olarak, sonuçlar, bulusa göre formülasyonlarin (F3 ila F8), formülasyonlara (F4, F7 ve F8) yönelik az miktarda agregayi, hatta toplam agregalarda bir yoklugu belirtir. Sekil 1'de gösterildigi üzere, formülasyonun (F3) sonucunda ortaya çikan FVII'nin aktivitesi (rekonstitüsyondan sonra likit formda) en az %80'Iik bir aktivite ile 6 günün sonunda memnun edicidir. Sekil 2'de gösterildigi üzere, formülasyonun (F3) sonucunda ortaya çikan FVII'nin aktivitesi (kati formda), formülasyona (F3) yönelik en az %80'Iik, formülasyona (F4) yönelik en az %90'Iik bir aktivite ile bir ayin sonunda memnun edicidir. TR TR TR TR