TARIFNAME lL-4 R ALFAYA BAGLANAN GÖZYASI LIPOKALINI MUTEINLERI Bulusun Sahasi Mevcut bulus, insan gözyasi Iipokalininin IL-4 reseptörü alfaya baglanan muteinleriyle ilgilidir. Bulus ayrica, bu tip bir muteini kodlayan karsilik gelen nükleik asit molekülleriyle de ilgilidir. Son olarak, bulus, bu tip bir Iipokalin mutein içeren farmasötik bir bilesime yöneliktir. Alt Yapi EsdegerIi-olmayan etkilesim yoluyla seçilen hedeflere seçimli olarak baglanan proteinler, biyoteknoloji, tip, biyoanalitiklerin yani sira genel olarak biyolojik ve yasam bilimlerinde çok önemli bir rol oynamaktadir. Antibiyotikler, yani immünoglobülinler, proteinlerin bu sinifinin önde gelen bir örnegidir. Manifoldun bu tip proteinlere ligandlarin/hedeflerin taninmasi, baglanmasi ve/veya ayrilmasiyla birlikte ihtiyaç duymasina ragmen, halihazirda neredeyse yalnizca immünoglobülinler kullanilmaktadir. Tanimli Iigand-baglama karakteristiklerine sahip diger proteinlerin örnegin Iektinlerin uygulanmasi özel vakalarla sinirli kalmistir. Antikor-benzeri fonksiyonlara sahip ilave proteinli baglayici moleküller, Iipokalin familyasinin, Iigandlari baglamak için dogal olarak evrilmis olan üyeleridir. Lipokalinler, omurgalilar, böcekler, bitkiler ve bakteriler dahil olmak üzere birçok organizmada ortaya çikar. Lipokalin protein familyasinin üyeleri (Pervaiz, S., & Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) tipik olarak küçük, salgilanan proteinlerdir ve tek bir polipeptit zincirine sahiptir. Bir dizi farkli moleküler-taninma özellikleriyle karakterizedirler: çesitli, prensip olarak hidrofob moleküllere (mesela retinoidler, yag asitleri, kolesteroller, prostaglandinler, biliverdinler, feromonlar, tastantlar ve odorantlar) baglanma yetileri, spesifik hücre-yüzeyi reseptörlerine baglanmalari ve makromoleküler kompleksleri olusturmalari. Her ne kadar bunlar, geçmiste, birincil olarak tasima proteinleri olarak siniflandirilmis olsalar da, artik Iipokalinlerin çesitli fizyolojik fonksiyonlari yerine getirdigi nettir. Bunlara retinol tasinmasindaki, koku almadaki, feromon sinyallemedeki ve prostaglandinlerin sentezindeki roller dahildir. Lipokalinler ayrica bagisiklik yanitinin düzenlenmesine ve hücre homeostazina aracilik etmeye de dahil edilmistir (örnegin, Biophys. Acta 1482, 9-24'te incelenmistir). Lipokalinler, siklikla %20'den daha az dizi özdesligiyle, genel dizi korunmasinin olagandisi düsük seviyelerini paylasir. Lipokalin yapisinin merkez parçasi, kesintisiz bir hidrojen-bagli ß-haznesi olusturmak için kendi üzerine geri kapali bir sekiz-sarmalli anti-paralel ß-katmanindan olusur. Bu ß-haznesi merkez bir bosluk olusturur. Haznenin bir ucu, dibi boyunca ilerleyen N-ucu peptit segmentinin yani sira ß-sarmallarini baglayan üç peptit özesi tarafindan sterik olarak blokedir. ß-haznesinin diger ucu çözücüye açiktir ve dört adet esnek peptit özesi tarafindan olusturulan bir hedef- baglama alanini kapsar. Her biri farkli boyuttaki, sekildeki ve kimyasal karakterdeki hedefleri barindirabilen çesitli farkli baglama modlarina sebebiyet veren, baska durumlarda rijit lipokalin iskeleleri olan özelerin bu çesitliligidir (örnegin, Flower, D.R. Uluslararasi patent basvurusu WO 99/16873, lipokalin familyasinin, dört peptit özesinin bölgesinde, baglama cebini kapsayan silindirik ß-haznesi yapisinin uzunda yer alan ve 129 arasindaki amino asit konumlarini Içeren dogrusal polipeptit dizisindeki o segmentlere karsilik gelen, mutasyonlara ugratilmis amino asit konumlarina sahip polipeptitlerini açiklamaktadir. Lipokalin familyasinin üyelerinin post-translasyonel olarak modifiye edilmis oldugu bildirilmistir, örnegin, fosforilasyon ve gözyasi 1861). Yine de, bunlarin moleküler taninma özellikleri için hiç post-translasyonel Uluslararasi patent basvurusu WO 00/75308, bilin-baglayici proteinin, digoksijenine özgül olarak baglanan muteinlerini açiklarken uluslararasi patent basvurulari WO (hNGAL) ve apoliprotein D'nin muteinleriyle ilgilidir. Bir lipokalin varyantinin ligand afinitesinin, özgüllügünün yani sira yayilma stabilitesinin daha da gelistirilmesi ve ince ayari amaciyla, ilave amino asit kalintilarinin degistirilmesi gibi, lipokalin familyasinin farkli üyelerini kullanan yaklasimlar önerilmistir (Skerra, A. (2001) Rev. Mo!. Biotechnol. sahip insan nötrofil jelatinaz-iliskili Iipokalinin muteinlerini açiklamaktadir. Uluslararasi patent basvurusu WO 2005/19256, gözyasi Iipokalininin, farkli veya ayni hedef Iigand için en az bir baglanma alanina sahip muteinlerini açiklamakta ve insan gözyasi lipokalinlerinin olusturulmasi için bir yöntem saglamaktadir. Bu PCT yayinina göre, gözyasi Iipokalininin birincil dizisi, özellikle olgun insan gözyasi Iipokalininin 7-14, bölgelerindeki belirli amino asit germeleri, baglanma afinitelerine sahip muteinler olusturmak amaciyla mutajeneze tabi tutulur. Ortaya çikan muteinler seçili Iigand için nanomolar aralikta, birçok durumda sahiptir. alfa dahil olmak üzere belirli bir dogal-olmayan Iiganda baglanan muteinlerini açiklamaktadir. Baglanma afiniteleri, yüzey plazmon rezonans deneylerinde neredeyse 1 x 10'10 M kadar düsük seviyeye ulasacak sekilde nanomolar araliktadir. Lipokalin-1, gözyasi ön-albümini veya von Ebner bezi proteini olarak da isimlendirilen insan gözyasi Iipokalini (TLPC veya Tlc) özgün olarak insan gözyasi sivisinin bir ana proteini (toplam protein içeriginin yaklasik olarak üçte biri) olarak tarif edilmistir ancak prostat, böbrek üstü bezi, timüs, meme bezi, testis, burun mukozasi ve trakeal mukoza dahil olmak üzere çesitli diger salgilayici dokularin yani sira hipofiz bezinin kortikotroflarinda da tanimlanmistir. Homolog proteinler resus maymununda, sempanzede, siçanda, farede, domuzda, hemstirda, inekte, köpekte ve atta bulunmustur. Gözyasi Iipokalini, diger lipokalinlere kiyasla olagandisi bir genis Iigand özgüllügü sergilemesi açisindan ve bagil çözünmez Iipitler için yüksek gelisigüzelligi açisindan olagandisi bir lipokalin üyesidir (bakiniz Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. fungal büyümeyi önlemedeki fonksiyonuna atfedilmistir. Yag asitleri, yag alkolleri, fosfolipitler, glikolipitler ve kolesterol gibi farkli kimyasal siniflarin önemli bir sayida lipokalinlerin aksine Iigand (hedef) baglamanin kuvveti, hem alkil amitleri hem yag asitleri için hidrokarbon kuyrugunun uzunluguyla koreledir. Böylelikle, gözyasi Iipokalini en güçlü sekilde en az çözünür lipitleri baglar (Glasgow, B.J. et al. (1995) Curr. Eye Gözyasi Iipokalininin 1,8-Ä kristal yapisi, bunun ß-haznesinde olagan disi sekilde büyük bir bosluk açiga çikarmistir (Breustedt, D.A. et al. (2005) J. Bio!. Chem. 280, 1, olmak üzere, IL-4 reseptörü alfaya baglanan mutantlarinin yani sira söz konusu mutantlarin olusturulmasi ve seçilmesi için yöntemleri açiklamaktadir. Bu gelismeye ragmen, basit ifadeyle Insan gözyasi Iipokalininin muteinlerinin tanisal ve terapötik uygulamalarda uygunlugunu daha da gelistirmek amaciyla lL-4 reseptörü alfa için gelismis baglanma özelliklerine, özellikle daha yüksek baglanma afinitesine sahip bir insan gözyasi Iipokalini muteinine sahip olmak halen arzu edilmektedir. Bulusun kisa açiklamasi Dolayisiyla, bulusun bir amaci, IL 4 reseptörü alfa için yüksek baglanma afinitesine sahip bir diger insan gözyasi Iipokalini muteini saglamaktir. Bu amaca, istemlerde, özellikle istem 1'de ortaya konan özelliklere sahip bir insan gözyasi Iipokalini muteiniyle ulasilir. Bir birinci yönde mevcut açiklama, insan gözyasi Iipokalininin bir muteinini saglamaktadir. Mutein IL 4 reseptörü alfaya baglanir. Mutein, olgun insan gözyasi 104-106 ve 108 dizi konumlarinin herhangi birinde veya daha fazlasinda bir mutasyona ugratilmis amino asit kalintisi içerir. Mutein ayrica, olgun insan gözyasi Iipokalininin ikisinde veya daha fazlasinda bir mutasyona ugratilmis amino asit kalintisi içerir. Insan gözyasi Iipokalininin muteininin amino asit dizisi asagidaki amino asit kombinasyonlari amino asit dizisi içerisindeki konumu veya bir nükleotidin burada gösterilen bir nükleik asit dizisi içerisindeki konumu anlamina gelmektedir. "Karsilik gelen" terimi, burada kullanildigi sekliyle ayrica, yalnizca önceki nükleotidlerin/amino asitlerin sayisiyla belirlenmeyen bir konumu da içermektedir. Dolayisiyla, ikame edilebilecek olan bulusa göre belirli bir amino asidin konumu, bir (mutant veya dogal sus) lipokalinde baska bir yerde amino asitlerin silinmesi veya eklenmesi nedeniyle degisebilir. Benzer sekilde, ikame edilebilen bulusa göre belirli bir nükleotidin konumu da, promotör ve/veya (eksonlar ve intronlar dahil olmak üzere) herhangi bir diger düzenleyici dizi veya gen dahil olmak üzere bir mutein veya dogal sus Iipokalin 5'-transle edilmemis bölgede (UTR) baska yerlerdeki silintiler veya ilave nükleotidler nedeniyle degisebilir. Böylelikle, bulusa göre bir "karsilik gelen konum" altinda tercihen, nükleotidlerin/amino asitlerin gösterilen sayi açisindan farkli olabilecegi ancak yine de benzer komsu nükleotidlere/amino asitlere sahip olabilecekleri anlasilacaktir. Degis tokusa edilebilen, silinebilen veya eklenebilen söz konusu nükleotidler/amino asitler de "karsilik gelen konum" terimi tarafindan içerilmektedir. Spesifik olarak, açiklamanin bir TIC Iipokalininden farkli bir Iipokalinin amino asit dizsinin bir nükleotid kalintisinin veya amino asit kalintisinin, bir Iipokalin muteininin amino asit dizisinin, özellikle SEQ ID NO`Iar: 2-11'in herhangi birinin veya Tlc'nin nükleotid dizisindeki veya amino asit dizisindeki belirli bir konuma karsilik gelip gelmedigi belirlemek amaciyla, teknikte uzman bir kisi teknikte iyi-bilinen araçlari ve yöntemleri, örnegin, ya elle veya Temel Lokal Hizalama Arama Aracinin (Basic Local Alignment Search Tool) kisaltmasi olan BLAST 2.0 veya ClustaIW gibi bilgisayar programlari veya dizi hizalamalarini olusturmak için uygun herhangi bir diger program kullanilarak hizalamalari kullanabilir. Dolayisiyla, SEO ID NO'Iar: 2-11`in herhangi ikamesine sahip bir Iipokalin muteini "özne dizi" görevi görebilirken, Tlc'den farkli bir Buradaki açiklama, insan gözyasi Iipokalininin bir muteininin olusturulmasinin bir yöntemidir. Mutein IL-4 reseptörü alfaya baglanir. Yöntem, bir insan gözyasi lipokalinini kodlayan bir nükleik asit molekülünün, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal asit dizisi konumlarinin herhangi birinde veya daha fazlasinda mutajeneze tabi tutulmasini içerir. Yöntem ayrica, bir insan gözyasi Iipokalinini kodlayan bir nükleik asit molekülünün, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal polipeptit dizisinin 26, 32, 34, 55, 56, 58 ve 63 amino asit dizisi konumlarinin herhangi ikisinde veya daha fazlasinda mutajeneze tabi tutulmasini içerir. Olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal polipeptit veya daha fazlasinin en az biri. Bunun bir sonucu olarak, insan gözyasi Iipokalininin bir muteinini kodlayan bir veya daha fazla nükleik asit elde edilir. Kodlanan muteinin amino asit dizisi, asagidaki amino asit kombinasyonlari kümelerinin birini içerir: (1) Ser 26, Glu (15) Glu 26, Gly 34, Leu 58. Yöntem ayrica, bu sekilde elde edilen bir veya daha fazla mutein kodlayan nükleik asit moleküllerinin bir ekspresyon sisteminde eksprese edilmesini de içerir. Yöntem bu sayede, bir veya daha fazla mutein elde edilmesini içerir. Yöntem ayrica, bu sekilde elde edilen, IL 4 reseptörü alfaya baglanan bir veya daha fazla muteinin seçim ve/veya izolasyon araciligiyla zenginlestirilmesini de içerir. Mevcut bulus, istem @ya göre bir nükleik molekülü saglar. Nükleik asit molekülü, 1 ila 4 arasindaki istemlerin herhangi birine göre bir muteini kodlayan bir nükleotid dizisi içerir. Mevcut bulus, istem 7'ye göre bir konak hücre saglar. Konak hücre, istem 6'ya göre bir nükleik asit molekülü ihtiva eder. Mevcut bulus, istem 8ie göre farmasötik bir bilesim saglar. Farmasötik bilesim, 1 ila 4 arasindaki istemlere göre bir insan gözyasi Iipokalininin bir muteinini içerir. Farmasötik bilesim ayrica farmakolojik olarak kabul edilen bir eksipiyan içerir. Bulus, sinirlayici-olmayan örneklerle ve eslik eden çizimlerle birlikte degerlendirildiginde ayrintili tarifname istinaden daha iyi anlasilacaktir. Sekillerin Açiklamasi Sekil 1, insan gözyasi Iipokalininin, lL-4 reseptörü alfaya baglanma afinitesine haiz bir muteini olan S191.4-B24'ün polipeptit dizisini göstermektedir. Sekil 2, IL-4 reseptörü alfa için yüksek afiniteye sahip emsal muteinlerin polipeptit dizilerini (SEQ ID NO'lar: 2-11) göstermektedir. Sekil 3, TF-1 hücresi proliferasyonunun, lL-4 (A) ve IL-3 (B) varliginda bulusun muteinlerinin arttirilan miktarlariyla önlenmesini göstermektedir. Sekil 4, Sekil 3"ün ICso degerlerini ve bulusun bir insan gözyasi Iipokalini muteinlerinin, insan IL-4 reseptörü alfa gibi lL-4 reseptörü alfaya baglanmasinin Biacore ölçümlerinin verilerini göstermektedir. Bulusun Detayli Açiklamasi Mevcut bulus, insan gözyasi Iipokalininin, IL-4 reseptörü alfa için özellikle yüksek bir afiniteye sahip muteinlerini saglamaktadir. Mevcut bulusun bir muteininin bir hedefi olarak lL-4 reseptörü alfa tipik olarak bir memeli proteini, mesela bir insan proteinidir. In vivo lL-4 reseptörü alfa, B hücrelerinde IgE antikoru üretimini düzenlemek için interlökin 4 ve interlökin 12'ü baglayabilir. Bulusa göre muteinlerin baglanma afiniteleri 0,1 nM'nin altinda ve bazi uygulamalarda yaklasik 1 pikomolarlik (pM) bir Kn'ye sahiptir (karsilastiriniz Sekil 4). Bulusun lipokalin muteinleri dolayisiyla lL-4 alfa reseptörü alfayi saptanabilir afiniteyle, yani en az yaklasik 0,1 nM, yaklasik 10 pM veya daha az bir ayrisma sabitiyle baglayabilir. Bir muteinin seçilen bir hedefe, mevcut durumda IL-4 reseptörü alfaya baglanma afinitesi ölçülebilir ve bu sayede bir mutein-ligand kompleksinin KD degerleri, teknikte uzman kisilerce bilinen birden gazla yöntemle belirlenebilir. Bu yöntemlere, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, floresan titrasyon, rekabetçi ELISA, izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) gibi kalorimetrik yöntemler ve yüzey plazmon rezonansi (BlAcore) dahildir. Bu tip yöntemler için örnekler asagida ayrintili olarak verilmektedir (Bakiniz örnegin Örnek 2). Insan interlökin-4 reseptörü alfa zinciri, SWISS PROT Veri Bankasi Erisim No. P veya bunun fragmanlarinin amino asit dizisine sahip olabilir. Insan interlökin-4 reseptörü alfa zincirinin bir fragmaninin resmedici bir örnegi, alfa 1,in amino asit dizisi SEQ ID NO: 19"da gösterilmektedir. Genel olarak, burada bulusun gözyasi Iipokalini muteinlerinin protein ligandlariyla ilgili olarak kullanildigi sekliyle "fragman" terimi, tam boy Iigandin bulusa göre bir mutein tarafindan taninma ve/veya baglanma becerisini koruyan, N-ucundan ve/veya C- ucundan kisaltilmis protein veya peptit Iigandlariyla ilgilidir. ve/veya IL-13 antagonisti veya bir evrik lL-4 agonisti ve/veya evrik IL-13 agonisti görevi görebilir. Evrik bir agonist belirli bir reseptör için bir agonistle ayni baglanma-alanina baglanir ve ilgili reseptörün yapisal aktivitesini tersine çevirir. Simdiye dek IL-4 reseptörlerinin intrinsik kinaz aktivitesine haiz oldugu bildirilmemistir, böylece bulusun bir muteini tipik olarak bir IL-4 antagonisti ve/veya lL-13 antagonisti görevi görebilir. Bir uygulamada, insan gözyasli Iipokalini muteinleri insan IL-4 ve/veya insan lL-13'ün antagonistleri görevi görür. Bazi uygulamalarda, mutein, sinomolgus IL-4 IL-4 reseptörü alfayla çapraz-tepkendir ve bu itibarla IL-4 ve/veya lL-13 gibi sinomolgus ligandlarinin bir antagonisti görevi görür. Bazi uygulamalarda, mutein, marmoset IL-4 IL-4 reseptörü alfayla çapraz-tepkendir ve bu itibarla IL-4 ve/veya lL-13 gibi marmoset ligandlarinin bir antagonisti görevi görür. için alinabilir. "Dogal-olmayan ligand" terimi, fizyolojik kosullar altinda natif olgun Insan gözyasi Iipokalinine baglanmayan bir bilesigi ifade etmektedir. Burada kullanildigi sekliyle "insan gözyasi Iipokalini" terimi, SWISS-PROT Veri Bankasi Erisim Numarasi P31025'in proteinine karsilik gelen olgun insan gözyasi lipokalinini ifade etmektedir. Olgun insan gözyasi Iipokalini, SWISS-PROT Erisim Numarasi P31025'in dizisinde yer alan N-ucu sinyal peptidini içermez (bakiniz Sekil 2). Bulusun bir muteininin amino asit dizisi, diger Iipokalinlere (supra) dizi özdeslikleriyle kiyaslandiginda olgun insan gözyasi Iipokalinine yüksek bir dizi özdesligine sahiptir. Bu genel baglamda bulusun bir muteininin amino asit dizisi, olgun insan gözyasi muteininin, olgun insan gözyasi Iipokalininin dizilerine büyük ölçüde benzer olan ilgili bir dizisi, degistirilen konumun veya dizinin muhafaza edilmesi sartiyla olgun insan gözyasi Iipokalininin dizisine en az %95 dahil olmak üzere en az %75, en az %80, en az %82, en az %85, en az %87, en az %90 özdeslige sahip olup burada olgun insan gözyasi Iipokalininin dizisi asagidakidir: HHL LÄSDEEIOCVSGTWYLKAMWÜRE:PEMNLESVT PMYL TILEGGNLEAKVI VLI SGRCOEVKA VLEKTDEPGKYTADGGKHVAYI RSHVKDHYITYCEGELPiGi(P'i.'RG'v'Kl VGROPKNNI FM FDFFK AAGARGLSTESI -IPROSETCSPGSO kastedilmektedir. Özdeslik, özdes kalintilarinin sayisinin, kalintilarin toplam sayisina bölünmesi ve sonucun 100 ile çarpilmasiyla ölçülür. olan bosluklardir. Böylelikle, tam olarak ayni dizinin iki kopyasi %100 özdeslige sahiptir, ancak daha az sekilde oldukça korunmus ve silintililere, eklentilere veya degistirmelere sahip olan diziler daha düsük bir özdeslik derecesine sahip olabilir. Teknikte uzman kisiler, standart parametreler kullanilarak dizi özdesliginin belirlenmesi için çesitli bilgisayar programlarinin mevcut oldugunu fark edecektir, örnegin Blast 147, 195-197). Bir nükleik aside veya bir polipeptide istinaden "mutasyona ugratilmis" veya "mutant terimi, dogal olusumlu nükleik asit veya polipeptide kiyasla, bir veya daha fazla nükleotidin veya amino asidin, sirasiyla, degisimini, silintisini veya sokuntusunu ifade etmektedir. Bazi uygulamalarda, açiklamaya göre bir mutein, 61 ve/veya 153 konumlarinda bir natif sistein kalintisinin bir serin kalintisi tarafindan bir amino asit ikamesini içerir. Bu baglamda, dogal sus gözyasi Iipokalininin, (ilgili bir naif nükleik asit kitapligi seviyesinde) sistein kalintilari 61 ve 153 tarafindan olusturulan yapisal disülfit baginin (karsilastiriniz Breustedt, et al., 2005, supra) yok edilmesinin, yalnizca stabil olarak katli gözyasi Iipokalini muteinleri degil ek olarak belirli bir dogal-olmayan liganda yüksek afiniteyle baglanabilen muteinler de sagladiginin bulunmus oldugu kaydedilmektedir. Teoriyle sinirli kalmaksizin, yapisal disülfit baginin ortadan kaldirilmasinin, dogal-olmayan suni disülfit baglarinin (spontan) olusturulmasina veya bu baglarin bulusun muteinlerinin içine kasti eklenmesine (bakiniz Örnekler), bu sayede muteinlerin, örnegin, stabilitesinin arttirilmasina olanak saglanmasi hususunda bir diger avantaj sagladigina da inanilmaktadir. Bazi uygulamalar, açiklamaya göre bir mutein, 101 konumunda bir natif sistein kalintisinin bir serin kalintisi tarafindan bir amino asit ikamesini içerir. Ayrica, bazi uygulamalarda, açiklamaya göre bir mutein, 111 konumunda bir natif arjinin kalintisinin bir prolin kalintisi tarafindan bir amino asit ikamesini içerir. Bazi uygulamalarda, açiklamaya göre bir mutein. 114 konumunda bir natif lizin kalintisinin bir triptofan kalintisi tarafindan biramino asit ikamesini içerir. Bulusa göre insan gözyasi Iipokalininin bir muteini tipik olarak, olgun insan gözyasi asit, bir prolin, bir lizin, bir serin ve bir tirosinin birine sahiptir. Bazi uygulamalarda, bulusun bir muteini Arg 26 -› Pro ve Glu 34 -› Ser amino asit ikamelerini içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Pro ve Met 55 -› Ala amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Ser ve Glu 34 -› Val amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Ser, Glu 34 -› Asn, Met 55 -› Ala ve Ser 58 -› Lys amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Asn ve Glu 34 -› Asp amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Asn ve Met 55 -› Ala amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Tyr, Glu 34 -› His ve Met 55 -› Ala amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Tyr, Glu 34 -› His ve Ser 58 -› Ala amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Lys, Glu 34 -› Arg ve Met 55 -› Ala amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun bir muteini Arg 26 -› Lys, Glu 34 -› Arg ve Ser 58 -› Asn amino asit ikamelerin içeren bir diziye sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun Iipokalin muteini 26 konumunda asparajin, pirolin, lizin, serin ve tirosinden biri olan mutasyona ugratilmis bir amino asit kalintisina sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun Iipokalin muteini 32 konumunda histidin, lizin, tirosin ve valinden biri olan mutasyona ugratilmis bir amino asit kalintisina sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun Iipokalin muteini 34 konumunda arjinin, aspartik asit, asparajin, histidin, serin ve valinden biri olan mutasyona ugratilmis bir amino asit kalintisina sahiptir. Bulusun Iipokalin muteini 55 konumunda alanin olan biri olan mutasyona ugratilmis bir amino asit kalintisina sahiptir. Bulusun Iipokalin muteini 56 konumunda alanin, glutamin, histidin, metionin ve Iizinden biri olan mutasyona ugratilmis bir amino asit kalintisina sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun Iipokalin muteini 58 konumunda alanin, arjinin, asparajin, izolösin ve Iizinden biri olan mutasyona ugratilmis bir amino asit kalintisina sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusun Iipokalin muteini 63 konumunda glutamin, Iizin, prolin ve serinden biri olan mutasyona ugratilmis bir amino asit kalintisina sahiptir. Bazi uygulamalarda bulusa göre bir mutein, Met 31 -› Ala, Leu 33 -› Tyr, Cys 61 -› tamamini içerir. Bazi uygulamalarda bulusa göre bir mutein bir Val 53 -› Phe ikamesi içerir. Mutasyona ugratilmis amino asit kalintisi ayrica bir Val 64 -› Tyr ikamesi de içerebilir. Ayrica bir Ala 66 -› Leu veya Ala 66 -› Asp ikamesi de içerebilir. Burada ayrica, insan gözyasi Iipokalininin, 61 ve 153 konumunda ortaya çikan en azindan sistein kalintisinin bir baska amino asit tarafinda ikame edilen bir amino asidini mutasyonunu içeren bir mutein de açiklanmaktadir. 26-28 ve 30-34 konumlari AB özesinde yer alir, 53 ve 55 konumlari bir beta-katmaninin en ucunda yer alir ve konumlari bir beta-katmani (ßD) içerisinde bulunur ve 80 konumu bir ci-helikal bölgede yer alir. 83 konumu, bu ci-helikal bölgeyle bir beta-katani (ßF) arasinda bir tekli öze- tanimlayan amino asittir. 104-106 ve 108 konumlar, gözyasi Iipokalininin ß-haznesi yapisinin açik ucundaki baglanma alanindaki GH özesinde yer alir. Bu bölgelerin tanimlari burada Flower (Flower, 1996, supra, Flower, et al., 2000, supra) ve Breustedt et al. (2005, supra)'ya göre kullanilmaktadir. Bazi uygulamalarda, mutein, Cys 61 -› Trp ve Cys 153 -› Ser veya Ala amino asit ikamelerini içerir. Bu tip bir ikamenin, Cys 61 ve Cys 153'ü baglayan dogal olusumlu disülfit köprüsünün olusumunu engellemek ve böylelikle muteinin islenmesini kolaylastirmak için faydali oldugu kanitlanmistir. Bazi uygulamalarda mutein, Arg 111 -› Pro ve Lys 114 -› Trp'den seçilen en az bir ilave amino asit ikamesi içerir. Bulusun bir muteini ayrica, natif olgun insan gözyasi içerebilir. Bu ikame, örnegin, Cys 101 -› Ser veya Cys 101 -› Thr mutasyonu olabilir. Bazi uygulamalarda, mutein, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal polipeptit her birinde mutasyona ugratilmis bir amino asit kalintisina sahiptir. dizi konumlarindan farklilik gösteren bölgede, bulusun bir lipokalin muteini, mutasyona ugratilmis amino asit konumlarinin disinda dogal sus (dogal) amino asit dizisi içerebilir. Bazi uygulamalarda, bulusa göre bir lipokalin muteini ayrica, bir dizi konumunda/konumlarinda, bu tip bir mutasyon, en azindan esasen muteinin baglanma aktivitesini ve katlanmasini engellemedigi veya buna müdahale etmedigi sürece, bir veya daha fazla amino asit mutasyonu tasiyabilir. Bu tip mutasyonlar, yerlesik standart yöntemler kullanilarak DNA seviyesinde kolayca yapilabilir. Amino asit dizisinin degisikliklerinin resmedici örnekleri sokuntularin ve silintilerin yani sira amino asit ikameleridir. Bu tip ikameler konservatif olabilir, yani bir amino asit kalintisi, kimyasal olarak benzer, özellikle polaritenin yani sira boyutla ilgili benzer özelliklerde olan bir amino asit kalintisiyla degistirilir. Konservatif ikamelerin örnekleri, asagidaki gruplarin elemanlari arasindaki degistirmelerdir: 1) alanin, serin ve treonin; 2) aspartik asit ve glutamik asit; 3) asparajin ve glutamin; 4) arjinin ve Iizin; 5) izolösin, Iösin, metionin ve valin ve 6) fenilalanin, tirosin ve triptofan. Diger yandan, amino asit dizisinin içine konservatif-olmayan degisikliklerin eklenmesi de mümkündür. Ek olarak, tekli amino asit kalintilarinin degistirilmesinin yerine, gözyasi Iipokalininin primer yapisinin bir veya daha fazla kesintisiz amino asidinin ya sokulmasi veya silinmesi de, bu silintiler veya sokuntular bir stabil katli/fonksiyonel muteinle sonuçlandigi üzere mümkündür (bakiniz örnegin, budanmis N- ve C-uçlarina sahip muteinlerin olusturuldugu deney bölümü). Amino asit dizisinin bu modifikasyonlarina, mutasyona ugratilmis lipokalin geninin veya bunun parçalarinin, belirli kisitlama enzimleri için yarilma alanlari katilmasiyla basitlestirilmesi amaciyla tekli amino asit konumlarinin yönlendirilmis mutajenezi dahildir. Ek olarak, bu mutasyonlar ayrica, bir lipokalin muteininin belirli bir hedef için afinitesinin daha da gelistirilmesi için de katilabilir. Ayrica, mutasyonlar, muteinin, katlanma stabilitesinin, serum stabilitesinin, protein direncinin veya suda çözünürlügünün gelistirilmesi veya gerekirse agregasyon egiliminin indirgenmesi gibi belirli karakteristiklerini modüle etmek amaciyla eklenebilir. Örnegin, dogal olusumlu sistein kalintilari, disülfit köprüsü olusumunu engellemek için diger amino asitlere mutasyon edilebilir. Ayrica, yeni tepken gruplari eklemek amaciyla, örnegin, polietilen glikol (PEG), hidroksietil nisasta (HES), biyotin, peptitler veya proteinler gibi diger bilesiklere konjugasyon için veya dogal olusumlu-olmayan disülfit baglarinin olusumu için diger amino asit dizisi konumunun sisteine kasten mutasyon edilmesi de mümkündür. Bir insan gözyasi lipokalin muteininin amino asit dizisinin içine bir sistein kalintisi eklemek için bu tip bir mutasyonun emsal ihtimallerine Thr 40% Cys, Glu ?Ba ve/veya 131 amino asit konumlarinin herhangi birinin tarafinda olusturulan tiol bölütü, örnegin, ilgili bir gözyasi Iipokalini muteininin serum yari-ömrünü arttirmak amaciyla muteinin PEGiIatIanmasi veya HESiIatIanmasi için kullanilabilir. Mevcut bulus ayrica yukarida tanimlandigi üzere, olgun insan gözyasi lipokalininin dizisinin ilk dört N-ucu amino asit kalintilarinin (His-His-Leu-Leu; konumlar 1-4) ve/veya olgun insan gözyasi lipokalininin dizisinin son iki C-ucu amino asit kalintilarinin (Ser- Asp; konumlar 157-158) silinmis oldugu muteinleri de kapsamaktadir (karsilastiriniz, ayrica Örnekler ve ekli Dizi Listesi). Dogal sus dizinin bir baska olasi mutasyonu, 5 ila 7 arasindaki dizi konumlarindaki (Ala Ser Asp) amino asit dizisinin, PCT basvurusu WO Bulusa göre bir gözyasi Iipokalini muteini, olgun insan gözyasi lipokalininine kiyasla asagidaki amino asit ikamelerine sahiptir: Glu 27 -› Arg; Phe 28 -› Cys; Glu 30 -› Arg; uygulamalarda mutein ayrica, Val 53 -› Phe, Val 64 -› Tyr, Ala 66 -› Leu amino asit ikameleri kümesini de içermektedir. Bazi uygulamalarda bulusa göre bir gözyasi Iipokalini muteini olgun insan gözyasi a Gln; Glu 63 a Lys amino asit ikamelerinin kombinasyonunu içerir. Bazi uygulamalarda bulusa göre bir gözyasi Iipokalini muteini olgun insan gözyasi -› Ala; Ser 58 -› Ile; Glu 63 -› Ser amino asit ikamelerinin kombinasyonunu içerir. Bazi uygulamalarda bulusa göre bir gözyasi Iipokalini muteini olgun insan gözyasi -› Gln; Ser 58 -› Lys; Glu 63 -› Lys amino asit ikamelerinin kombinasyonunu içerir. Ala; Glu 63 -› Lys amino asit ikamelerinin kombinasyonunu içerir. Bazi uygulamalarda bulusa göre bir gözyasi Iipokalini muteini olgun insan gözyasi lipokalinine kiyasla Arg Glu 63 -› Pro amino asit ikamelerinin kombinasyonunu içerir. Bazi uygulamalarda bulusa göre bir gözyasi Iipokalini muteini olgun insan gözyasi Iipokalinine kiyasla Arg Glu 63 -› Lys amino asit ikamelerinin kombinasyonunu içerir. Bulusun insan gözyasi Iipokalininin muteini, SEQ ID NO`Iar: 4 ve 6-11'de ortaya konan amino asit dizilerinin herhangi birini veya bunun bir fragmanini veya varyantini içerebilir, esasen bunlardan olusabilir veya bunlardan olusabilir. Burada bulusun muteinleriyle ilgili olarak kullanildigi sekliyle "fragman" terimi, tam-boy olgun insan gözyasi Iipokalinininden türetilen, N-ucunda ve/veya C-ucunda kisaltilmis olan, yani N- ucu ve/veya C-ucu amino asitlerinin en az birinden yoksun proteinlerle veya peptitlerle ilgilidir. Bu tip fragmanlar, olgun insan gözyasi Iipokalininin primer dizisinin en az 10 veya daha fazla, mesela 20 veya 30 veya daha fazla ardisik amino asidini içerebilirler ve çogunlukla olgun insan gözyasi Iipokalininin bir immün-analizinde saptanabilirler. Mevcut bulusta kullanildigi üzere "varyant" terimi, bir protein veya peptidin, amino asit dizisinin, örnegin ikameyle, silintiyle, sokuntuyla veya kimyasal modifikasyonla modifikasyonlarini içeren türevleriyle ilgilidir. Bu tip modifikasyonlar bazi uygulamalarda, protein veya peptidin fonksiyonelligini indirgemez. Bu tip varyantlara proteinler dahil olup, burada bir veya daha fazla amino asit, ilgili D-steroizomerleriyle veya örnegin ornitin, hidroksiprolin, sitrulin, homoserin, hidroksilisin, norvalin gibi dogal olusumlu 20 amino asitten farkli amino asitlerle degistirilmistir. Ancak, bu tip ikameler ayrica konservatif de olabilir, yani bir amino asit kalintisi kimyasal olarak benzer bir amino asit kalintisiyla degistirilir. Konservatif ikamelerin örnekleri, asagidaki gruplarin elemanlari arasindaki degistirmelerdir: 1) alanin, serin ve treonin; 2) aspartik asit ve glutamik asit; 3) asparajin ve glutamin; 4) arjinin ve Iizin; 5) izolösin, lösin, metionin ve valin ve 6) fenilalanin, tirosin ve triptofan. Bulusun bir gözyasi Iipokalini muteini bir monomerik protein olarak var olabilir. Bazi uygulamalarda bulusa göre bir Iipokalin muteini spontan olarak dimerize veya oligomerize olabilir. Stabil monomerle olusturan Iipokalin muteinlerinin kullanimi, örnegin daha hizli difüzyon ve daha iyi doku nüfuzu yüzünden bazi uygulamalarda avantajli olabilir. Diger uygulamalarda, stabil homodimerleri veya multimerleri spontan olarak olusturan bir Iipokalin muteininin kullanimi, bu tip multimerler belirli bir hedefe (daha da) artan afinite ve/veya avidite saglayabildiginden avantajli olabilir. Ayrica, lipokalin muteininin oligomerik formlari daha yavas ayrisma hizlarina veya uzatilmis serum yari-ömrüne sahip olabilir. Stabil monomerle olusturan muteinlerin dimerizasyonu veya multimerizasyonu arzu edilirse, bu örnegin, jun-fos alanlari veya kaynastirilmasiyla veya "Duokalinlerin" kullanilmasiyla basarilabilir (ayrica bakiniz Mevcut bulusa göre bir lipokalin muteini, insan gözyasi lipokalininin bir dogal olusumlu formunun mutajenezi araciligiyla elde edilebilir. Burada kullanildigi sekliyle "mutajenez" terimi, deney kosullarinin, insan gözyasi lipokalininin belirli bir dizi konumundaki (Swiss-Prot veri bankasi girisi P31025) dogal olusumlu amino asidin, ilgili dogal polipeptit dizisindeki bu spesifik konumunda mevcut olmayan en az bir amino asitle ikame edilebilecegi sekilde seçildigi anlamina gelmektedir. "Mutajenez" terimi ayrica, dizi segmentlerinin boyunun, bir veya daha fazla amino asidin silinmesiyle veya sokulmasiyla (ilave) modifikasyonunu da içerir. Böylelikle, örnegin, seçili bir dizi konumundaki bir amino asidin, dogal sus proteinin ilgili segmentinin boyuna kiyasla iki amino asit kalintisinin bir sokuntusuna yol açacak sekilde üç rastgele mutasyonun bir germesiyle degistirilmesi bulusun kapsami dahilindedir. Bu tip bir sokuntu veya silinti, bulusta mutajeneze tabi tutulabilen peptit segmentlerinin herhangi birinde birbirinden bagimsiz olarak eklenebilir. Bulusun emsal bir uygulamasinda, çesitli mutasyonlarin bir sokuntusu, seçilen Iipokalin Iskelesinin AB öznesinin içine eklenebilir (karsilastiriniz bir dizi konumunda hiç önceden belirlenmis tekli amino asidin (mutasyonunun) mevcut olmadigi ancak en az iki amino asidin belirli bir olasilikla mutajenez esnasinda ön tanimli bir dizi konumunda katilabildigi anlamina gelmektedir. Insan gözyasi lipokalininin kodlama dizisi (Redl, B. et al. (1992) J. Bi'ol. Chem. 267, baslangiç noktasi olarak kullanilir. Anilan amino asit konumlarinin mutajenezi için, teknikte uzman kisi, alana-yönelik mutajenez için çesitli yerlesik standart yöntemlere sahiptir. Yaygin olarak kullanilan bir teknik, sentetik oligonükleotidlerin, istenen dizi konumlarinda dejenere bir baz bilesimi tasiyan karisimlari kullanilarak mutasyonlarin PCR (polimeraz zincir tepkimesi) araciligiyla eklenmesidir. Örnegin, NNK veya NNS kodonunun (burada N = adenin, guanin veya sitosin veya timin; K = guanin veya timin; S = adenin veya sitosin) kullanimi, mutajenez esnasinda 20 amino asidin tamaminin arti durdurma kodonunun katilmasina olanak saglarken, VVS kodonu, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val amino asitlerini polipeptit dizisinin seçilen konumunun içine katilmasindan hariç tuttugundan, muhtemel olarak katilan amino asitlerin sayisini 12er sinirlar; NMS kodonunun (burada M = adenin veya sitosin) kullanimi, Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val amino asitlerini seçili bir dizi konumunda katilmasindan hariç tuttugundan, örnegin, belirli bir seçili dizi konumundaki olasi amino asitlerin sayisini 11yle kisitlar. Bu açidan, (düzenli 20 dogal olusumlu amino asitten farkli) diger amino asitler için, selenosistein veya pirolizin gibi kodonlarin da bir muteinin bir nükleik asidinin içine katilabilecegi kaydedilmektedir. Ayrica, Wang, L., et al. (2001) Science edildigi üzere, diger olagandisi amino asitlerin, örnegin o-metiI-L-tirosin veya p- aminofenilalaninin sokulmasi amaciyla, çogunlukla durdurma kodonlari olarak taninan UAG gibi "suni" kodonlari kullanmak da mümkündür. indirgenmis baz çifti özgüllügüne sahip nükleotid insa bloklarinin, örnegin inosin, 8- okso-2'deoksiguanosin veya 6(2-deoksi-Ei-D-ribofuranosil)-3,4-dihidro-8H-pirimindo- mutasyonlarin seçilen bir dizi segmentinin içine eklenmesi için bir baska seçenektir. Bir diger olasilik, üçlü-mutajenez olarak adlandirilan mutajenezdir. Bu yöntem, kodlama dizlerinin içine katilma için, her biri bir amino asit için kodlama yapan farkli nükleotid 5607) Ilgili polipeptitlerin seçilen bölgelerinde mutasyonlarin eklenmesi için olasi bir strateji, her bir kismen, mutasyona ugratilacak karsilik gelen dizi segmentlerinin birinden türetilen dört oligonükleotidin kullanimina dayalidir. Bu oligonükleotidleri sentezlerken, teknikte uzman bir kisi, mutasyona ugratilacak amino asit konumlarina karsilik gelen bu nükleotid üçlülerinin sentezi için nükleik asit insa bloklarinin karisimlarini kullanabilir, böylece tüm dogal amino asitleri kodlayan kodonlar rastgele sekilde ortaya çikar ve bu da sonunda bir Iipokalin peptit kitapliginin olusturulmasiyla sonuçlanir. Örnegin, birinci oligonükleotid - mutasyona ugratilmis konumlardan ayri - dizisinde, Iipokalin polipeptidinin en N-ucu konumunda mutasyona ugratilacak peptit segmenti için kodlama sarmalina karsilik gelir. Dolayisiyla, ikinci oligonükleotid, polipeptit dizisinde takip eden ikinci dizi segmenti için kodlama-yapmayan sarmala karsilik gelir. Üçüncü oligonükleotid bu sayede, karsilik gelen üçüncü dizi segmenti için kodlama sarmalina karsilik gelir. Son olarak, dördüncü oligonükleotid, dördüncü dizi segmenti için kodlama-yapmayan sarmala karsilik gelir. Ilgili birinci ve ikinci oligonükleotidle ve gerekirse ayri olarak ilgili üçüncü ve dördüncü oligonükleotidle bir polimeraz zincir tepkimesi gerçeklestirilebilir. Bu tepkimelerin her ikisinin çogaltma ürünleri bilinen çesitli yöntemlerle, mutasyonlarin seçilen konumlarda eklenmis oldugu birinciyle dördüncü dizi segmentlerini içeren bir tekli nükleik asit olarak birlestirilebilir. Bu amaçla, ürünlerin her ikisi de örnegin, kusatan oligonükleotidlerin yani sira, ikinciyle üçüncü dizi segmenti arasindaki diziye katkida bulunan bir veya daha fazla araci nükleik asit molekülü kullanilarak yeni bir polimeraz zincir tepkimesine tabi tutulabilir. Mutajenez için kullanilan oligonükleotidlerin dizisi içerisindeki sayi ve düzenin seçiminde, teknikte uzman kisi sayisiz alternatife sahiptir. Yukarida tanimlanan nükleik asit molekülleri Iigasyonla, bir Iipokalin polipeptidi ve/veya vektörü kodlayan bir nükleik asidin eksik 5'- ve 3'-dizileriyle baglantilanabilir ve bilinen bir konak organizmaya klonlanabilir. Ligasyon ve klonlama için birden fazla yerlesik prosedür mevcuttur. Örnegin, klonlayici vektörün dizisinde mevcut olan kisitlama endonükleazlari için tanima dizileri, sentetik oligonükleotidlerin dizisinin içine islenebilir. Böylelikle, ilgili PCR ürününün ve enzimatik yarilmanin güçlendirilmesinden sonra ortaya çikan fragman, karsilik gelen tanima dizileri kullanilarak kolayca klonlanabilir. Mutajenez için seçilen protein için kodlama yapan gen içerisindeki daha uzun dizi segmentleri de bilinen yöntemler vasitasiyla, örnegin artan hata orani kosullari altinda polimeraz zincir tepkimesi kullanimiyla, kimyasal mutajenezle veya bakteriyel mutasyon yapici suslarin kullanilmasiyla rastgele mutajeneze tabi tutulabilir. Bu tip yöntemler ayrica, bir Iipokalin muteininin hedef afinitesinin veya özgüllügünün daha fazla optimizasyonu için de kullanilabilir. Muhtemelen deneysel mutajenezin segmentlerinin disinda olusan mutasyonlar siklikla tolere edilir veya, örnegin, Iipokalin muteininin gelismis bir yayilma etkililigine veya yayilma stabilitesine katkida bulunuyorsa avantajli olduklari kanitlanabilir. Açiklamaya göre bir yöntemde, bir insan gözyasi Iipokalini kodlayan bir nükleik asit molekülü ilk olarak, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal polipeptit dizisinin 27, 28, birinde veya daha fazlasinda mutajeneze tabi tutulur. Ikinci olarak, bir insan gözyasi lipokalini kodlayan nükleik asit molekülü, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal fazlasinda mutajeneze tabi tutulur. Mutasyona ugratilacak ikinci amino asit konumlarindan en az bir konum, 58 amino asit konumundan ve 63 amino asit konumundan seçilir. Açiklamanin bir uygulamasinda, insan gözyasi Iipokalininin bir muteininin olusturulmasi için yöntem, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal polipeptit dizisinin 26-28, 30-34, ugratilmasini içerir. Bir uygulamada, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal mutasyona ugratilir. Yukarida-belirtilen yöntemin bir uygulamasinda, ek olarak olgun insan gözyasi Açiklamanin bir diger uygulamasinda, yöntemler, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal polipeptit dizisindeki 61 ve 153 konumlarinda sistein kodlayan kodonlarin her ikisinin mutasyonunu içerir. Bir uygulamada, 61 konumu, birkaç ihtimal saymak gerekirse bir alanin, fenilalanin, lizin, arjinin, treonin, asparajin, tirosin, metionin, serin, prolin veya triptofan kodlamak için mutasyona ugratilir. 153 konumunun mutasyona ugratildigi uygulamalarda, bir serin veya alanin gibi bir amino asit 153 konumunda eklenebilir. Burada tarif edildigi üzere açiklamanin bir baska uygulamasinda, olgun insan gözyasi kodlayan kodonlar, örnegin 111 konumunda bir arjinin ve 114 konumunda bir triptofan kodlamak için mutasyona ugratilir. Açiklamanin yöntemlerinin baska bir uygulamasi, olgun insan gözyasi Iipokalininin dogrusal polipeptit dizisinin 101 konumunda sisteini kodlayan kodonun mutajenezini içerir, böylece bu kodon herhangi bir baska amino asidi kodlar. Bir uygulamada, 101 konumunu kodlayan mutasyona ugratilmis kodon bir serin kodlar. Dolayisiyla, bazi uygulamalarda, 61, 101 ve 153 konumundaki sistein kodonlarinin ya ikisi veya üçünün hepsi, bir baska amino asidin bir kodonuyla degistirilir. Yönteme göre, bir mutein, insan gözyasi lipokainini kodlayan bir nükleik asitten baslayarak elde edilir. Bu tip bir nükleik asit mutajeneze tabi tutulur ve rekombinan DNA teknolojisi araciligiyla uygun bir bakteriyel veya ökaryotik konak organizmanin içine eklenir. Gözyasi Iipokalininin bir nükleik asit kitapliginin elde edilmesi, teknikte antikor-benzeri özelliklere sahip Iipokalin muteinlerinin, yani belirli bir hedefe yönelik afiniteye sahip muteinlerin olusturulmasi için bilinen herhangi bir uygun teknik kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bu tip kombinatoryal yöntemlerin örnekleri ayrintili 2006/56464'te tarif edilmektedir. Mutajeneze tabi tutulmus olan nükleik asit dizilerinin uygun bir konakta ekspresyonundan sonra, birden fazla ilgili Iipokalin muteini için genetik bilgi tasiyan, belirli bir hedefe baglanan klonlar, elde edilen kitapliktan seçilebilir. Bu klonlarin seçimi için, faj görüntüleme (Kay, B.K. et al. (1996) supra; Lowman, HB. (1997) supra veya Rodi, D.J. ve Makowski, L. (1999) supra'da incelenmistir), koloni tarama (Pini, A. et al. (2002) Comb. Chem. High Throughput 2006/56464'te tarif edilen yöntemler gibi iyi bilinen teknikler kullanilabilir. Muteini kodlayan nükleik asit molekülü, herhangi bir uygun ekspresyon sistemi kullanilarak eksprese edilir. Elde edilen mutein veya muteinler seçim ve/veya izolasyon araciligiyla zenginlestirilir. Seçim örnegin rekabetçi kosullar altinda gerçeklestirilebilir. Burada kullanildigi sekliyle rekabetçi kosullar, muteinlerin seçiminin, insan gözyasi alfanin, muteinlerin IL 4 reseptörü alfaya baglanmasiyla rekabet eden ilave bir Iigand varliginda temas ettirildigi en az bir adimi kapsar. Bu ilave Iigand hedefin fizyolojik bir örtüsen epitopu bulusun muteinleri tarafindan taninan epitopa baglayan ve böylelikle muteinlerin hedef baglamasina müdahale eden herhangi bir diger fizyolojik-olmayan baglama alanindan farkli bir epitopun, hedefe allosterik etkilerle komplekslenmesiyle rekabet eder. Faj görüntüleme tekniginin temperan M13 faj kullanan bir uygulamasi (Kay, B.K. et al. supra'da incelenmistir), mevcut açiklamada kullanilabilen bir seçim yönteminin bir örnegi olarak verilmektedir. Faj görüntüleme teknolojisinin, açiklamanin muteinlerinin seçimi için kullanilabilen bir baska uygulamasi, Broders et al. (Broders et al. (2003) temperan faj veya T7 gibi litik faj da kullanilabilir. Emsal seçim yöntemi için, mutasyona ugratilmis lipokalin nükleik asit dizisinin N-ucunda bir sinyal dizisine, mesela OmpA- sinyal dizisine ve M13 fajinin veya bunun fragmanlarinin, C-ucunda faj kapsidinin içine eklenebilen kapsit proteini plll'e sahip bir füzyon proteini olarak ekspresyonuna olanak saglayan M13 fajmidleri üretilir. Faj kapsid proteininin, dogal sus dizinin 217 ila 406 arasindaki amino asitlerini içeren C-ucu fragmani Aplll, füzyon proteinlerinin üretilmesi için kullanilabilir. Bir uygulamada, plll'ün, 201 konumundaki sistein kalintisinin eksik oldugu veya bir baska amino asit tarafindan degistirildigi bir C-ucu fragmani kullanilir. Dolayisiyla, açiklamanin yöntemlerinin bir diger uygulamasi, insan gözyasi lipokalininin bir veya daha fazla muteini için kodlama yapan ve 3' ucundaki mutajenezden kaynaklanan bir nükleik asidin, belirli bir ligandin baglanmasi için en az bir muteinin seçilmesi amaciyla M13-familyasinin bir Ipliksi bakteriyofajinin kaplama protein plll veya bu kaplama proteininin bir fragmani için kodlama yapan bir genle uygun sekilde kaynastirilmasini içerir. Füzyon proteini, bir afinite etiketi gibi, füzyon proteinin veya bunun parçalarinin hareketsizlestirilmesine, saptanmasina ve/veya saflastirilmasina olanak saglayan ilave bilesenler içerebilir. Ayrica, lipokalini veya bunun muteinlerini kodlayan dizi bölgeleriyle faj kapsid geni veya bunun fragmanlari arasinda bir durdurma kodonu yer alabilmekte olup, burada durdurma kodonu, mesela bir kehribar durdurma kodonu uygun bir baskilayici sus içinde translasyon esnasinda en azindan kismen bir amino asidin içine transle edilir. Örnegin, artik burada tarif edilen pTIc27 olarak da adlandirilan fajmid vektörü pTLP027, insan gözyasi Iipokalini muteinlerini kodlayan bir fajmid kitapliginin hazirlanmasi için kullanilabilir. Gözyasi Iipokalini muteinleri için kodlama yapan bulusun nükleik asit molekülleri, iki BstXl kisitlama alani kullanilarak vektörün içine sokulur. Ligasyondan sonra, E. coli' XL1-Blue gibi bir uygun konak sus, çok sayida bagimsiz klon saglamak için ortaya çikan nükleik asit karisimiyla dönüstürülür. istenirse, bir hiperfajmid kitapliginin hazirlanmasi için ayri bir vektör olusturulabilir. Ortaya çikan kitaplik müteakiben sivi kültür içinde, fonksiyonel fajmidler üretmek amaciyla uygun bir M13-yardimci faj veya hiperfajla süper enfekte edilir. Rekombinan fajmid Iipokalin muteinini yüzeyi üzerinde, kaplama proteini pIII veya bunun bir fragmaniyla bir füzyon olarak görüntülerken, füzyon proteininin N-ucu sinyal dizisi normal olarak yarilarak atilir. Diger yandan, yardimci faj tarafindan tedarik edilen natif kapsid proteini plll'ün bir veya daha fazla kopyasini da tasir ve böylelikle bir aliciyi, genel olarak bir F- veya F'-plazmidi tasiyan bir bakteriyel susu enfekte edebilir. Hiperfaj görüntüleme durumunda, hiperfajmidler Iipokalin muteinlerini yüzeyleri üzerinde, enfektif kaplama proteini plll ile ancak natif kapsid proteinsiz sekilde bir füzyon olarak görüntüler. Yardimci faj veya hiperfajla enfeksiyon esnasinda veya sonrasinda, örnegin anhidrotetrasiklin eklenmesiyle indüklenebilir. Indükleme kosullari, elde edilen fajmidlerin önemli bir kesitinin yüzeyleri üzerinde en az bir Iipokalin muteini görüntüledigi sekilde seçilir. Hiperfaj görüntüleme durumunda, indükleme kosullari, proteini tasiyan hiperfajmidlerin bir popülasyonuyla sonuçlanir. Fajmidlerin izole edilmesi için, polietilen glikolle çökeltme gibi çesitli yöntemler bilinmektedir. Izolasyon tipik olarak 6-8 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra meydana gelir. izole edilen fajmidler daha sonra, arzu edilen hedefle inkübasyonla seçime tabi tutulabilecek olup, burada hedef, muteinleri tasiyan 0 fajmidlerin, kaplamalarinda füzyon proteinleri olarak istenen baglama aktivitesiyle en azindan geçici hareketsizlestirilmesine olanak saglayan bir biçimde sunulur. Teknikte uzman kisi tarafindan bilinen çesitli uygulamalar arasindan, hedef, örnegin, serum albümin gibi bir tasiyici proteinler konjuge edilebilir ve bu tasiyici protein vasitasiyla bu protein baglayici yüzeye, örnegin polistirene baglanabilir. Örnegin ELISA teknikleri için uygun olan veya "immün-çubuklar" olarak adlandirilan mikrotitre plakalari hedefin bu tip bir hareketsizlestirilmesi için kullanilabilir. Alternatif olarak, hedefin, biyotin gibi diger baglayici gruplarla konjugatlari kullanilabilir. Hedef daha sonra, bu grubu seçimli olarak baglayan bir yüzey, örnegin streptavidin, nötravidin veya avidinle kapli mikrotitre plakalari veya paramanyetik partiküller üzerinde hareketsizlestirilebilir. Hedef bir immünoglobülinin bir FC kISmina kaynastirilirsa, hareketsizlestirme, protein A veya protein G ile kapli yüzeylerle, örnegin mikrotitre plakalariyla veya paramanyetik Yüzeyler üzerinde mevcut olan özgül-olmayan fajmid-baglama alanlari, ELISA yöntemlerinde bilindikleri sekilde bloke edici solüsyonlarla doyurulabilir. Fajmidler daha sonra tipik olarak, fizyolojik bir tampon varliginda yüzey üzerinde hareketsizlestirilen hedefle temas ettirilir. Baglanmamis fajmidler birden fazla yikamayla yok edilir. Yüzey üzerinde kalan fajmid partikülleri daha sonra ayristirilir. Ayristirma için, çesitli yöntemler mümkündür. Örnegin, fajmidler proteazlarin eklenmesiyle veya asitlerin, bazlarin, deterjanlarin veya kaotropik tuzlarin varliginda veya ilimli densirme kosullari altinda ayristirilabilir. Bu tip bir yöntem, 2,2 pH'Iik tamponlar kullanilarak ayristirma olup, burada eluat müteakiben nötrlestirilir. Alternatif olarak, fajmidlere baglanma için hareketsizlestirilmis hedefle rekabet etmek amaciyla serbest hedefin bir solüsyonu eklenebilir veya hedefe-özgü fajmidler, ilgi konusu hedefe özgül olarak baglanan immünoglobülinlerle veya dogal ligand yapici proteinlerle rekabetle ayristirilabilir. Daha sonra, E. coli hücreleri ayristirilan fajmidlerle enfekte edilir. Alternatif olarak, nükleik asitler ayristirilan fajmidlerden ekstrakte edilebilir ve dizi analizi, çogaltma veya hücrelerin baska bir sekilde dönüstürülmesi için kullanilabilir. Bu sekilde elde edilen E. coli klonlarindan baslayarak, taze fajmidler veya hiperfajmidler, M13 yardimci fajlarla veya yukarida tarif edilen yönteme göre hiperfajla süper enfeksiyonla yeniden üretilir ve bu sekilde çogaltilan fajmidler bir kez daha hareketsizlestirilmis hedef üzerinde bir seçime tabi tutulur. Yeterince zenginlestirilmis biçimde bulusun muteinlerine sahip fajmidler elde etmek amaciyla siklikla birden fazla seçim döngüsü gereklidir. Seçim döngülerinin sayisi bazi uygulamalarda, müteakip fonksiyonel analizde, çalisilan klonlarin en %0,1'inin belirli hedef için saptanabilir afiniteye sahip muteinler ürettigi bir sekilde seçilir. Kullanilan kitapligin boyutuna, yani kompleksligine bagli olarak, bu amaçla tipik olarak 2 ila 8 döngü gereklidir. Seçilen muteinlerin fonksiyonel analizi için, bir E. coli susu, seçim döngülerinden elde edilen fajmidlerle enfekte edilir ve karsilik gelen çift sarmalli fazmid DNA izole edilir. Bu fazmid DNA'dan ve ayrica fajmidlerden ekstrakte edilen tek-sarmalli DNA'dan baslayarak, bulusun seçili muteinlerinin nükleik asit dizileri teknikte bilinen yöntemlerle belirlenebilir ve amin asit dizisi bundan çikarilabilir. Tüm gözyasi Iipokalini muteininin mutasyona ugratilmis bölgesi veya dizisi baska bir ek3presyon vektörü üzerinde alt klonlanabilir ve uygun bir konak organizmada eksprese edilebilir. Örnegin, artik pTI026 olarak da adlandirilan pTLPCZß vektörü, Eco/i TG1 gibi Eco/i suslarinda ekspresyon için kullanilabilir. Bu sekilde üretilen gözyasi Iipokalininin muteinleri çesitli biyokimyasal yöntemlerle saflastirilabilir. Örnegin pTI026 ile üretilen bir gözyasi Iipokalini muteini, örnegin C-ucunda afinite etiketi olarak adlandirilan bir afinite peptidi tasiyabilir ve bu nedenle afinite kromatografiyle saflastirilabilir. Bir afinite etiketinin örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, biyotin, Strep-etiketi, Strep-etiketi Il (Schmidt et al., supra), oligohistidin, polihistidin, bir immünoglobülin alani, maltoz-baglayici protein, glutation- S-transferaz (GST) veya kalmodulin baglayici peptit (CBP) dahildir. Bazi afinite etiketleri haptenlerdir, örnegin bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, dinitrofenol ve digoksijenindir. Bazi afinite etiketleri, FLAG®-peptidi (Asp-Tyr-Lys-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), T7 epitopu (Ala-Ser-Met-Thr-GIy-Gly-GIn-Gln-Met-Gly), maltoz baglayici protein (MBP), herpes simpleks virüsü glikoproteini D"nin GIn-Pro-GIu-Leu- AIa-Pro-Glu-Asp-Pro-GIu-Asp dizisinin HSV epitopu, Tyr-Pro-Tyr-Asp-VaI-Pro-Asp-Tyr- Ala dizisinin hemaglutinin (HA) epitopu, Veziküler Stomatit viral glikoproteinin (Cys-Tyr- The-Asp-IIe-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Lys) VSV-G epitopu, GIy-AIa-Pro-VaI-Pro-Tyr-Pro- Asp-Pro-Leu-GIu-Pro-Arg dizisinin E epitop etiketi, Gly-VaI-Ser-Ser-Thr-Ser-Ser-Asp- Phe-Arg-Asp-Arg dizisinin E2 epitop etiketi, GIu-GIu-Thr-AIa-Arg-Phe-Gln-Pro-Gly-Tyr- Arg-Ser dizisinin memeli MAPK/ERK kinazlarinin C-uçlarinin Etiket-100 epitop etiketi, Lys-GIu-Thr-AIa-AIa-AIa-Lys-Phe-Glu-Arg-GIn-His-Met-Asp-Ser dizisinin S-etiketi, Glu- Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-GIu-GIu-Asp-Leu dizisinin c-myc transkripsiyon faktörünün "myc" epitopu ve Simyan Virüsü 5'in (GIy-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-GIy-Leu-Asp-Ser- Thr) paramiksovirüsünün P ve V proteinleri üzerinde mevcut küçük V5 epitopu gibi epitop etiketleridir. Ek olarak, ancak genellikle bir tekli etiket olmayarak, NusA, tiyoredoksin (TRX), küçük ubikutin-benzeri modifiye edici (SUMO) ve ubikutin (Ub) gibi bir çözünme-güçlendirici etiket kullanilabilir. Haptenler ve epitop etiketleri, karsilik gelen bir antikorla veya baglayici partner olarak bir antikor benzeri proteinli molekülle kombinasyon halinde kullanilabilir. Lys-GIu-Thr-AIa-AIa-AIa-Lys-Phe-GIu-Arg-GIn-His- Met-Asp-Ser dizsinin S-peptit epitopu, ilgili bir antikorla birlikte veya bir baglayici partner olarak S-proteinle kombinasyon halinde bir epitop etiketi olarak kullanilabilir Seçim ayrica, diger yöntemler araciligiyla da gerçeklestirilebilir. Birçok karsilik gelen uygulama teknikte uzman kisi tarafindan bilinmektedir veya literatürde tarif edilmektedir. Üstelik, yöntemlerin bir kombinasyonu uygulanabilir. Örnegin, "faj görüntülemeyle" seçilen veya en azindan zenginlestirilen klonlar ek olarak "koloni taramaya" tabi tutulabilir. Bu prosedür, münferit klonlarin, bir hedef için saptanabilir baglanma afinitesine sahip bir gözyasi Iipokalini muteininin üretimiyle ilgili olarak dogrudan izole edilebilir. E. coli kullanimina ek olarak, diger bakteriyel suslar, maya veya ayrica böcek hücreleri veya memeli hücreleri de bu amaçla kullanilabilir. Bir gözyasi Iipokalini muteininin yukarida tarif edildigi üzere bir rastgele kitapliktan seçiminin yani sira, tekrarlanan tarama döngülerinden sonra hedef için afiniteyle veya özgüllükle ilgili olarak hedef için bir miktar baglanma aktivitesine çoktan haiz olan bir muteinin optimize edilmesi amaciyla sinirli mutajenez dahil olmak üzere evrimsel yöntemler de uygulanabilir. Teknikte uzman kisi tarafindan, kompleks olusumunun, baglayici partnerlerin konsantrasyonu, rekabetçilerin varligi, tampon sisteminin iyon siddeti vb. gibi birçok faktöre bagli oldugu kolayca anlasilmaktadir. Seçim ve zenginlestirme genellikle, istenen hedefle kompleks halinde, en az 200 nM'Iik bir ayrisma sabitine sahip lipokalin muteinlerinin izolasyonuna olanak saglayan kosullar altinda gerçeklestirilir. Ancak, yikama ve ayristirma adimlari degisen sertlik altinda gerçeklestirilebilir. Kinetik karakteristiklerle ilgili bir seçim de mümkündür. Örnegin, seçim, hedefin hedeften yavas bir ayrismasini veya diger bir deyisle düsük bir kOff hizi gösteren muteinlerle kompleks olusumunu kolaylastiran kosullar altinda gerçeklestirilebilir. Alternatif olarak, seçim, muteinle hedef arasindaki kompleksin hizli olusumunu veya diger bir deyisle yüksek bir kon hizini kolaylastiran kosullar altinda gerçeklestirilebilir. Bir diger örnekleyici alternatif olarak, tarama, (ya dogal sus gözyasi Iipokalinine veya çoktan ön-seçimli bir hedefe yönelik afiniteye sahip bir muteine kiyasla) muteinlerin gelismis termostabilitesini seçen kosullar altinda gerçeklestirilebilir. Belirli bir hedefe afiniteye sahip bir mutein seçilmis oldugunda, bu tip bir muteini, daha da yüksek afiniteli varyantlarin veya daha yüksek termostabilite, gelismis serum stabilitesi, termodinamik stabilite, gelismis çözünürlük, gelismis monomerik davranis, termal densirmeye, kimyasal densirmeye, proteolize veya deterjanlara vb. karsi gelismis direnç gibi gelismis özelliklere sahip varyantlarin müteakiben seçilmesi amaciyla bir baska mutajeneze ek tabi tutmak da ek olarak mümkündür. Daha yüksek afiniteyi hedefleme durumunda in vitro "afinite olgunlastirmasi" olarak degerlendirilebilen bu diger mutajenez, rasyonel tasarim veya rastgele bir mutasyona dayali alana özgü mutasyonla elde edilebilir. Daha yüksek bir afinite veya gelismis özellikler elde etmek için baska bir olasi yaklasim, Iipokalin muteininin dizi konumlarinin seçili bir araligi üzerinde nokta mutasyonlariyla sonuçlanan hata-egilimli PCR kullanimidir. Hata-egilimli PCR, Zaccolo et al. J. Mo!. Biol. 255, 589-603 tarafindan tarif edilen gibi bilinen herhangi bir protokole göre gerçeklestirilebilir. Bu amaçlar için uygun rastgele mutajenezin diger yöntemlerine, Murakami, H et al. (2002) Nat.BioteChn0l. 20, mutajenez veya Bittker, J. A et olmayan rastgele rekombinasyon (NRR) dahildir. istenirse, afinite olgunlastirmasi ayrica, digoksijenine yüksek afiniteye sahip bilin-baglayici proteinin muteinlerinin elde 1120'de tarif edilen prosedüre göre de gerçeklestirilebilir. Bulusun bir gözyasi lipokalini muteini, IL 4 reseptörü alfayla kompleks olusumu için kullanilabilir. Mutein ayrica, IL 4 reseptörü alfanin immünojenik bir fragmanina da baglanabilir. IL-4 reseptörü alfanin immünojenik bir fragmani, bir veya daha fazla epitopa, mimotopa veya diger antijenik determinantlara sahip olan ve böylelikle bir bagisiklik yaniti veya bir antikorun ortaya çikabildigi bir bagisiklik yaniti indükleyebilen bir fragmandir. immünojenik fragman tekbir epitop içerebilir veya birden fazla epitopa sahip olabilir. Bir antijen-sunucu sistem, Örnegin bir tasiyici protein, bir bagisiklik sistemi tarafindan taninma için gereken boyutu saglamak için kullanilabildiginden, immünojenik fragman için hiçbir belirli boyut sinirlamasi geçerli degildir. Dolayisiyla, immünojenik fragman ayrica bir "hapten", yani bizzat antijenik olmasi gerekmeyen veya özellikle küçük moleküler agirligi ve dolayisiyla boyutu nedeniyle düsük immünojenesiteye sahip olabilen bir fragmandir. Tipik olarak, immünojenik bir fragman, tek basina veya bir tasiyici üzerinde sunuldugunda, MHC molekülleri tarafindan sunulursa bir immünoglobülin tarafindan veya bir T hücresi reseptörü (TCR) tarafindan baglanabilir. Bir immünojenik fragman tipik olarak, tek basina veya antijen-sunucu sistem formunda sunuldugunda, örnegin 8- ve/veya T-Ienfositlerinin aktivasyonuna yol açan bir hümoral bagisiklik yanitini ve/veya hücresel bagisiklik yanitini indükleme kapasitesine sahiptir. Bulusun bir muteininin hedefi, bir transmembran protein olan, 207 amino asitlik bir hücre disi alan ihtiva eden interlökin-4 reseptörünün alfa zinciridir. Hücre disi alanin salgilanan bir formu olan, CD124 olarak da bilinen ve IL-4 aktivitelerini bloke edebilen sIL-4R alfa mevcuttur. Bulusun bir muteini sIL-4 reseptörü alfanin yani sira IL 4 reseptörü alfanin hücresel alaninin herhangi bir kismini baglayabilir. Bu baglamda, ilgili muteinle Iigandi arasindaki kompleks olusumunun, ilgili baglayici partnerlerin konsantrasyonlari, rekabetçilerin varligi, kullanilan tampon sisteminin pH'i ve iyon siddeti ve ayrisma sabitinin KD belirlenmesi için kullanilan deney yöntemi (birkaçini saymak gerekirse örnegin floresan titrasyon, rekabetçi ELISA veya yüzey plazmon rezonans) veya hatta deneysel verinin degerlendirilmesi için kullanilan matematiksel algoritma gibi birçok farkli faktörden etkilendigi de kaydedilmektedir. Bu nedenle, teknikte uzman kisi tarafindan burada verilen KD degerlerinin (ilgili muteinle Iigandi arasinda olusan kompleksin ayrisma sabiti), belirli bir Iipokalin muteininin belirli bir ligand için afinitesinin belirlenmesi için kullanilan yönteme ve deney düzenegine bagli olarak belirli bir deneysel aralik içerisinde degisebilecegi bilinmektedir. Bu da, örnegin, KD degerinin yüzey plazmon rezonansiyla mi (Biacore) yoksa rekabetçi ELlSA ile mi belirlendigine bagli olarak ölçülen KD degerlerinde hafif bir sapma veya bir tolerans araligi olabilecegi anlamina gelmektedir. Mevcut bulusun kapsaminda ayrica, yukaridaki muteinlerin, ilgili muteinin potansiyel immünojenesitesine göre degistirilmis veya modifiye edilmis oldugu biçimleri de yer almaktadir. Sitotoksik T-hücreleri, bir sinif l majör histokompatibilite kompleksiyle (MHC) iliskili bir antijen-sunucu hücrenin hücre yüzeyi üzerindeki peptit antijenlerini tanir. Peptitlerin MHC moleküllerine baglanma yetisi alele özgüdür ve immünojenesiteleriyle koreledir. Belirli bir proteinin immünojenesitesinin indirgenmesi amaciyla, bir proteindeki hangi peptitlerin belirli bir MHC molekülüne baglanma potansiyeline sahip oldugunu öngörme yetisi çok degerlidir. Potansiyel T-hücresi epitoplarinin tanimlanmasi için bilgisayimsal bir parça yaklasimi kullanan yaklasim önceden, belirli bir peptit dizisinin MHC sinif I moleküllerine baglanmasini öngörmek için tarif edilmistir (Altuvia et al. (1995) J. M0!. Bu tip bir yaklasimdan ayrica, bulusun muteinlerindeki potansiyel T-hücresi epitoplarinin tanimlanmasi için ve hedeflenen kullanimina bagli olarak öngörülen immünojenesitesi temelinde spesifik bir muteinin bir seçimini yapmak için faydalanilabilir. Ayrica, T-hücresi epitoplari ihtiva ettikleri öngörülmüs olan peptit bölgelerinin, bu T-hücresi epitoplarini indirgemek veya ortadan kaldirmak ve böylelikle immünojenesiteyi minimize etmek için ilave mutajeneze tabi tutmak da mümkündür. Amfipatik epitoplarin genetik olarak islenmis antikorlardan yok edilmesi tarif edilmistir uyarlanabilir. Bu sekilde elde edilen muteinler, asagida tarif edilenler gibi terapötik ve tanisal uygulamalarda kullanimlari için arzu edilen, minimize edilmis bir immünojenesiteye haiz olabilir. Bazi uygulamalar için, bulusun muteinlerini etiketli bir biçimde kullanmak da faydalidir. Dolayisiyla, bulus ayrica, enzim etiketleri, radyoaktif etiketler, renklendirilmis etiketler, floresan etiketler, kromojenik etiketler, lüminesan etiketler, haptenler, digoksijeninler, biyotin, metil kompleksleri, metaller ve koloidal altindan olusan gruptan seçilen bir etikete konjuge edilen Iipokalin muteinlerine yöneliktir. Mutein ayrica bir düsük moleküler agirlikli organik bilesige de konjuge edilebilir. Burada kullanildigi sekliyle bölütlere sahip olabilen bir monomerik karbon-esasli bilesigi ifade etmektedir. Tipik uygulamalarda, düsük moleküler agirlikli bilesik, en az iki karbon atomlu ve bazi uygulamalarda 7 veya 12'den fazla olmayan döner karbon bagina sahip bir ana zincire sahip bir organik bilesiktir. Bu tip bir bilesik, yaklasik 100 ila yaklasik 2000 Dalton arasinda, mesela yaklasik 100 ila yaklasik 1000 Dalton arasinda bir moleküler agirliga sahiptir. Opsiyonel olarak bir veya iki metal atomu içerir. Genel olarak, Iipokalin muteininin, bir kimyasal, fiziksel, optik veya enzimatik tepkimede dogrudan veya dolayli olarak saptanabilir bir bilesik veya sinyal olusturan herhangi bir uygun kimyasal madde veya enzimle etiketlenmesi mümkündür. Fiziksel bir tepkime ve ayni zamanda optik tepkime/markör için bir örnek, bir radyoaktif etiket kullanilirken X- isinlarinin isinlanmasi veya yayilmasi üzerine florisimanin yayilmasidir. Alkalin fosfataz, yaban turpu peroksidaz veya ß-galaktosidaz, kromojenik tepkime ürünlerinin olusumunu katalize eden enzim etiketlerinin (ve ayni zamanda optik etiketlerin) örnekleridir. Genel olarak, antikorlar için yaygin olarak kullanilan tüm etiketler (yalnizca immünoglobülinlerin Fc parçasindaki seker bölütüyle kullanilanlar hariç), mevcut bulusun muteinlerine konjugasyon için de kullanilabilir. Bulusun muteinleri ayrica, örnegin, bu tip ajanlarin, hücrelerin belirli bir hücreye, dokuya veya organa hedeflenmis aktarilmasi veya hücrelerin, örnegin, tümör hücrelerinin çevredeki normal hücreleri etkilemeden seçimli hedeflenmesi için herhangi bir uygun terapötik olarak aktif ajanla da konjuge edilebilir. Bu tip terapötik olarak aktif ajanlarin örneklerine, radyonüklidler, toksinler, küçük organik moleküller ve terapötik peptitler (mesela bir hücre yüzeyi reseptörünün agonistleri/antagonistleri görevi gören veya belirli bir hücresel hedef üzerindeki bir protein baglanma alani için rekabet eden peptitler) dahildir. Ancak, bulusun Iipokalin muteinleri ayrica, antisens nükleik asit moleküller, küçük etkilesen RNA'Iar, mikro RNA'Iar veya ribozomlar gibi terapötik olarak aktif nükleik asitlerle de konjuge edilebilir. Bu tip konjugatlar, teknikte iyi bilinen yöntemlerle üretilebilir. Bir uygulamada, bulusun muteinleri ayrica, bulusun muteinlerini vücut içerisinde arzu edilen bir bölgeye veya alana aktarmak amaciyla spesifik bir vücut bölgesini hedefleyen bir hedefleyici bölüte de eslenebilir. Bu tip modifikasyonlarin arzu edilebildigi bir örnek, kan-beyin-bariyerinin geçilmesidir. Kan-beyin bariyerini geçmek amaciyla, aktif tasima bu bariyeri geçer (bakiniz, Gaillard PJ, et al., Diphtheria-toxin 198 veya Gaillard PJ, et al. Targeted delivery across the blood-brain barrier. Expert altinda mümkündür (BBB technologies BV, Leiden, Hollanda)). Yukarida belirtildigi üzere, bulusun bir muteini bazi uygulamalarda, muteinin serum yari-ömrünü uzatan bir bölüte konjuge edilebilir (bu baglamda ayrica bakiniz, bu tip konjugasyon stratejilerinin, insan nötrofil jelatinaz-iliskili lipokalinin, CTLA-4 için baglanma afinitesine sahip muteinlerine istinaden tarif edildigi PCT yayini WO 2006/56464). Serum yari-ömrünü uzatan bölüt, birkaçini saymak gerekirse, bir polialkilen, glikol molekülü, hidroksietil nisasta, yag asidi molekülleri, mesela palmitik asit (Vajo & Duckworth 2000, Pharmacol. Rev. 52, 1-9), bir immünoglobülinin bir Fc parçasi, bir immünoglobülinin bir CH3 alani, bir immünoglobülinin bir CH4 alani, bunun albümini veya bir fragmani, bir albümin baglayici peptit veya bir albümin baglayici protein, transferin olabilir. Albümin baglayici protein bir albümin baglayici protein, bir antikor, alan antikorlari dahil olmak üzere bir antikor fragmani (bakiniz örnegin US patenti 6.696.245) veya albümin için baglanma aktivitesine sahip bir Iipokalin bölütü olabilir. Dolayisiyla, bulusun bir Iipokalin muteininin yari-ömrünün uzatilmasi için uygun konjugasyon partnerlerine albümin (Osborn, B.L. et al., 2002 supra J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548) veya bir albümin baglayici protein, örnegin, bir bakteriyel albümin baglayici alan, mesela streptokokal protein G'ninki (König, T., & Skerra, A. (1998) J. albümin baglayici peptitlerin diger örnekleri, örnegin, US patent basvurusu Xaaz-Xaas-Xaa4-Cys konsensüs dizisine sahip olanlar olup, burada Xaai Asp, Asn, Ser, Thr veya Trp'dir; X882 Asn, Gln, His, Ile, Leu veya Lys'dir; X883 Ala, Asp, Phe, Trp veya Tyr'dir ve Xaa4 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser veya Thr'dir. Diger uygulamalarda, albüminin kendisi veya albüminin bir biyolojik aktif fragmani, bulusun bir Iipokalin muteininin konjugasyon partneri olarak kullanilabilir. "Albümin" terimi, insan serum albümini veya bovin serum albümini veya siçan albümini gibi tüm memeli albüminlerini içerir. Albümin veya bunun fragmani US patenti 5.728.553lte veya rekombinan olarak üretilebilir. Rekombinan insan albümini (Recombumin®) Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, BK), muteinin yari-ömrünü uzatmak amaciyla bir lipokaline konjuge edilebilir veya kaynastirilabilir. Albümm-baglayici protein bir antikor fragmaniysa, bir alan antikoru olabilir. Alan Antikorlari (dAb'Ier), optimal güvenli ve etkililik ürün profili yaratmak için biyofiziksel özellikler ve in vivo yari-ömür üzerinde kesin kontrol saglamak için islenir. Alan Antikorlari, örnegin, Domantis Ltd. (Cambridge, BK ve MA, ABD) firmasindan temin edilebilir. Bulusun muteinlerinin serum yari-ömrünü uzatmak için bir bölüt olarak transferin kullanilarak, muteinler glikosilatIi-olmayan trasferinin N veya C ucuna veya her ikisine genetik olarak kaynastirilabilir. GIikosiIatli-olmayan transferin 14-17 günlük bir yari- ömre sahiptir ve bir transferin proteini benzer bir uzatilmis yari-ömre sahip olacaktir. Transferin tasiyici ayrica yüksek biyoyararlanim, biyodagilim ve dolasimda stabilite saglar. Bu teknoloji piyasada BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, ABD) firmasindan temin edilebilir. Bir protein stabilizörü/yari-ömür uzatma partneri olarak kullanim için rekombinan insan transferini de (DeltaFerrinTM) Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, BK) firmasindan satin alinabilir. Bir immünoglobülinin bir FC parçasi, bulusun muteinlerinin serum yari-ömrünü uzatmak amaciyla kullaniliyorsa, Syntonix Pharmaceuticals, Inc (MA, ABD) firmasindan satin alinabilen SynFusi'onTM teknolojisi kullanilabilir. Bu Fc-füzyonu teknolojisinin kullanimi daha uzun-etkili biyofarmasötiklerin yaratilmasina olanak saglar ve örnegin farmakokinetiklerin, çözünürlügün ve üretim etkililiginin gelistirilmesi için bir antikorun FC bölgesine bagli muteinin iki kopyasindan olusabilir. Bulusun bir muteininin yari-ömrünü uzatmak için yine baska bir alternatif, bulusun bir muteininin N- veya C-ucunu uzun, yapisi, esnek glisin-zengini dizilere (örnegin yaklasik ila 80 ardisik glisin kalintisina sahip poIi-glisin) kaynastirmaktir. Örnegin, W olarak da adlandirilmistir. Konjugasyon partneri olarak polialkilen glikol kullaniliyorsa, polialkilen glikol ikameli, ikamesi, dogrusal veya daIIi olabilir. Ayrica aktive edilmis bir polialkilen türevi de interferonla ilgili olarak US patenti 6.403.564'te tarif edildigi üzere veya PEG-modifiye asparajinaz, PEG-adenosin deaminaz (PEG-ADA) veya PEG-süperoksit dismutaz gibi diger proteinleri için tarif edildigi üzere polietilen glikol (PEG) molekülleridir (bakiniz örnegin, Fuertges et al. (1990) The Clinical Efficacy of P0Iy(Etherne GIycoI)-M0dified Proteins J. Control. Release 11, 139-148). Polietilen glikol gibi bu tip bir polimerin edildigi üzere, nisasta veya hidroksietil nisasta (HES) gibi karbohidrat oligo- ve polimerleri de, serum yari-ömrü uzatilmasi amaciyla bulusun bir muteinine konjuge edilebilir. Yukaridaki bölütlerin biri bulusun insan gözyasi lipokalini muteinine konjuge edilirse, bir amino asit yan zincirine konjugasyon avantajli olabilir. Uygun amino asit yan zincirleri, insan gözyasi Iipokalininin amino asit dizisinde dogal olarak olusabilir veya mutajenezle eklenebilir. Uygun bir baglanma alaninin mutajenez vasitasiyla eklenmesi durumunda, bir olasilik, bir amino asidin uygun konumda bir sistein kalintisiyla degistirilmesidir. Bir uygulamada, bu tip mutasyon, Thr 40-› Cys, Glu 73-› Cys, Arg 90-› Cys, Asp 95-› Cys veya Glu 131-› Cys ikamesinin en az birini içerir. Bu konumlarin herhangi birinde yeni yaratilan sistein kalintisi ardindan, muteinin, muteinin serum yari-ömrünü uzatan PEG veya bunun aktive edilmis bir türevi gibi bölüte konjuge edilmesi için kullanilabilir. Bir baska uygulamada, uygun amino asit yan zincirlerinin, bulusun muteinlerinin yukaridaki bölütlerinin birine konjuge edilmesini engellemek amaciyla, suni amino asitler mutajenezle eklenebilir. Genel olarak, bu tip suni amino asitler daha tepken olacaklari ve böylelikle istenen bölüte konjugasyonu kolaylastiracaklari sekilde tasarlanir. Bu tip bir suni amino asidin suni bir rRNA vasitasiyla eklenebilen bir örnegi para-asetiI-fenilalanindir. Burada açiklanan muteinlerin çesitli uygulamalari için, bunlari füzyon proteinleri biçiminde kullanmak avantajli olabilir. Bazi uygulamalarda, bulusun insan gözyasi lipokalini muteini N-ucunda veya C-ucunda bir protein alanina veya bir sinyal dizisi ve/veya bir afinite etiketi gibi bir peptide kaynastirilir. Farmasötik uygulamalar için bulusun bir muteini, muteinin in vivo serum yari-örünü uzatan bir füzyon partnerine kaynastirilabilir (yine bakiniz, uygun füzyon partnerlerinin, insan nötrofil jelatinaz-iliskili Iipokalinin, CTLA-4 için baglanma afinitesine sahip muteinlerine istinaden tarif edildigi PCT yayini WO 2006/56464). Yukarida tarif edilen konjugatlara benzer sekilde, füzyon partneri, birkaçini saymak gerekirse, bir immünoglobülinin bir Fc parçasi, bir immünoglobülinin bir CH3 alani, bir immünoglobülinin bir CH4 alani, albümin, bir albümin baglayici peptit veya bir albümin baglayici protein olabilir. Yine, albümin baglayici protein, bir bakteriyel albümin baglayici protein veya albümin için baglanma aktivitesine sahip bir Iipokalin muteini olabilir. Dolayisiyla, bulusun bir Iipokalin muteininin yari-ömrünün uzatilmasi için uygun füzyon partnerlerine albümin (Osborn, B.L. et al., (2002) supra J. Pharmaco!. Exp. Ther. 303, 540-548) veya bir albümin baglayici protein, örnegin, bir bakteriyel albümin baglayici alan, mesela streptokokal protein G'ninki (König, T., & Skerra, A. (1998) J. Y. G., Kadkhodayan, M., Kirchhofer, D., Combs, D. & Damico, L. A. (2002) J Bio! Chem Asp, Asn, Ser, Thr veya Trp; X882 Asn, Gln, His, Ile, Leu veya Lys; Xaa3 Ala, Asp, Phe, Trp veya Tyr ve Xaa4 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser veya Thr oldugu bir Cys-Xaa1-Xaa2- Xaag-Xaa4-Cys konsensüs dizisine sahip albümin baglayici peptitler de füzyon partneri olarak kullanilabilir. Ayrica, bulusun bir Iipokalin muteini için füzyon partneri olarak albüminin kendisini veya albüminin biyolojik olarak aktif bir fragmanini kullanmak da mümkündür. "AIbümin" terimi, insan serum albümini, bovin serum albümini veya siçan serum albümini gibi tüm memeli albüminlerini içerir. Albüminin veya bunun fragmanlarinin rekombinan üretimi teknikte iyi bilinmektedir ve örnegin US patenti edilmektedir. Füzyon partneri bulusun Iipokalin muteinine, enzimatik aktivite veya diger moleküller için baglanma afinitesi gibi yeni karakteristikler kazandirabilir. Uygun füzyon proteinlerinin örnekleri alkalin fosfataz, yaban turpu peroksidaz, glutation-S-transferaz, protein G'nin albümin-baglayici alani, protein A, antikor fragmanlari, oligomerizasyon alanlari, ayni veya farkli özgüllüge sahip ("Duokalinlerin" olusumuyla sonuçlanan, karsilastiriniz Schlehuber, S. ve Skerra, A. (2001), Duocalins, engineered Iigand- binding proteins with dual specificity derived from the Iipocalin fold. Bio!. Chem. 382, 1335-1342) veya toksinlerdir. Özellikle, bulusun bir Iipokalin muteinini, ortaya çikan füzyon proteinin her iki bir enzim aktif alaniyla kaynastirilmasi mümkün olabilir. Lipokalin muteininin baglanma alani, enzimin hedefin biyolojik fonksiyonunu ortadan kaldirmasina neden olarak, hastaliga-neden olan hedefe eklenir. Rekombinan proteinlerin kolay saptanmasina ve/veya saflastirilmasina olanak saglayan Strep-tag® veya Strep-tag® Il (Schmidt, T.G.M. et al. J. Mo!. Bio!. 255, 753- 766), myo-etiketi, FLAG-etiketi, Hise-etiketi veya HA-etiketi gibi afinite etiketleri veya glutation-S-transferaz gibi proteinler de uygun füzyon partnerlerinin diger örnekleridir. Son olarak, yesil floresan protein (GFP) veya sari floresan protein (YFP) gibi kromojenik veya floresan özelliklere sahip proteinler de bulusun bir Iipokalin muteini için uygun füzyon partnerleridir. Burada kullanildigi sekliyle "füzyon proteini" terimi ayrica, bir sinyal dizisi ihtiva eden bulusa göre Iipokalin muteinlerini de içerir. Bir polipeptidin N-ucundaki sinyal dizileri bu polipeptidi spesifik bir hücresel bölmeye, örnegin E. coli'nin periplazmina veya ökaryotik hücrelerin endoplazmik retikulumuna yönlendirir. Teknikte çok sayida sinyal dizisi bilinmektedir. Bir polipeptidin E. Gol/"nin periplazminin içine salgilanmasi için örnek bir sinyal dizisi OmpA-sinyal dizisidir. Mevcut bulus ayrica, burada tarif edildigi üzere muteinler için kodlama yapan nükleotid dizileri içeren nükleik asit molekülleriyle de (DNA ve RNA) ilgilidir. Genetik kodun esenerjililigi belirli kodonlarin, ayni amino asidi özgülleyen diger kodonlar tarafindan ikamelerine izin verdiginden, bulus, bulusun bir muteinini kodlayan spesifik bir nükleik asit molekülüyle sinirli degildir, bir fonksiyonel mutein kodlayan nükleotid dizilerin içeren tüm nükleik asit moleküllerini kapsar. Bu nedenle, mevcut bulus ayrica bulusa göre bir muteini kodlayan bir nükleik asit dizisi Burada tarif edildigi üzere bulus ayrica, gözyasi Iipokalini muteinlerini kodlayan, deneysel mutajenezin gösterilen dizi konumlarinin disinda ilave mutasyonlar içeren nükleik asit moleküllerini de içermektedir. Bu tip mutasyonlar siklikla tolere edilir veya, örnegin muteinin gelismis bir yayilma etkililigine, serum stabilitesine, termal stabiliteye veya Iigand baglanma afinitesine katkida bulunuyorsa avantajli çikabilir. Bu basvuruda açiklanan bir nükleik asit molekülü, bu nükleik asit molekülünün ekspresyonuna olanak saglamak için bir düzenleyici diziye (veya düzenleyici dizilere) DNA gibi bir nükleik asit molekülü, transkripsiyonel ve/veya translasyonel düzenlemeye dair bilgi ihtiva eden dizi ögeleri içerirse ve bu tip diziler polipeptidi kodlayan nükleotid dizisine "uygun sekilde bagliysa , bir nükleik asit molekülünü eksprese edebilen" veya bir baglanti, düzenleyici dizi ögelerinin ve eksprese edilecek dizinin, gen ekspresyonunu saglayan bir sekilde baglandigi bir baglantidir. Gen ekspresyonu için gereken düzenleyici bölgelerin kesin yapisi türler arasinda degisebilir, ancak genel olarak bu bölgeler, prokaryotlarda, hem bizzat promotörü, yani transkripsiyonun baslamasini yöneten DNA ögelerini ve ayrica, RNA içine transkribe edildiginde, translasyonun baslamasini sinyalleyecek olan DNA ögelerini ihtiva ettigi bir promotör içerir. Bu tip promotör bölgeleri normal olarak -, transkripsiyon ve translasyonun baslamasinda yer alan, -35/-10 kutulari ve prokaryotlarda Shine-Dalgarno elemani veya TATA kutusu, CAAT diziler ve ökaryotlarda 5'-capping elemanlari gibi 5' kodlayici- olmayan diziler içerir. Bu bölgeler ayrica, güçlendirici veya baskilayici elemanlarin yani sira natif polipeptidin, bir konak hücrenin spesifik bir bölmesine hedeflenmesi için transle edilen sinyal ve lider dizilerini de içerebilir. Ek olarak, 3' kodlayici-olmayan diziler, transkripsiyonel sonlandirma, poliadenilasyon veya benzerlerinde yer alan düzenleyici elemanlar ihtiva edebilir. Ancak, bu sonlandirma dizileri belirli bir konak hücrede tatmin edici sekilde fonksiyonel degilse, bu durumda 0 hücrede fonksiyonel olan sinyallerle ikame edilebilirler. Bu nedenle, bulusun bir nükleik asit molekülü, bir promotör dizisi gibi bir düzenleyici dizi içerebilir. Bazi uygulamalarda bulusun bir nükleik asit molekülü bir promotör dizisi ve bir transkripsiyonel sonlandirma dizisi içerir. Uygun prokaryotik promotörler, örnegin, tet promotörü, IacUV5 promotörü veya T7 promotörüdür. Ökaryotik hücrelerde ekspresyon için faydali promotörlerin örnekleri SV4O promotörü veya CMV promotörüdü r. Bulusun nükleik asit molekülleri ayrica bir vektörün parçasi veya bir plazmid, bir fajmid, bir faj, bir bakulovirüs, bir kozmid veya bir suni kromozom gibi herhangi bir baska türde klonlama araci da olabilir. Bir uygulamada, nükleik asit molekülü birfazmid içinde yer alir. Bir fazmid vektörü, M13 veya f1 gibi bir temperan fajin genler arasi bölgesini kodlayan bir vektörü veya bunun ilgi konusu cDNA'ya kaynastirilan bir fonksiyonel parçasini simgeler. Bakteriyel konak hücrelerin bu tip bir fajmid vektörüyle ve uygun bir yardimci fajla (örnegin M13KO7, VCS-M13 veya R408) süper enfeksiyonundan sonra, bozulmamis faj partikülleri üretilir, bu sayede kodlanan heterolog cDNA'nin, faj yüzeyi üzerinde görüntülenen karsilik gelen polipeptidine fiziksel eslenmesi saglanir (bakiniz örnegin Lowman, HB. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424 veya Rodi, D.J. ve Makowski, L. Bu tip klonlama araçlari, yukarida tarif edilen düzenleyici dizilerin ve bulusun bir konak hücreyle uyumlu bir türden türetilen replikasyon ve kontrol dizilerinin yani sira dönüstürülmüs veya transfekte edilmis hücreler üzerinde seçilebilir bir fenotip saglayan seçim markörleri içerebilir. Çok sayida uygun klonlama vektörü teknikte bilinmektedir ve piyasada mevcuttur. Bulusun Iipokalin muteinlerini kodlayan DNA molekülü ve özellikle bu tip bir Iipokalin muteininin kodlama dizisini ihtiva eden klonlama vektörü, geni eksprese edebilen bir konak hücre olarak dönüstürülebilir. Dönüstürme standart teknikler kullanilarak gerçeklestirilebilir. Böylelikle, bulus ayrica, burada açiklandigi üzere bir nükleik asit molekülü ihtiva eden bir konak hücreye de yöneliktir. Dönüstürülen konak hücreler, bulusun bir füzyon proteinini kodlayan nükleotid dizisinin ekspresyonu için uygun kosullar altinda kültürlenir. Uygun konak hücreler, Escherichia coli (E. coli) veya Baci/Ius subtilis gibi prokaryotik veya Saccharomyces cerevisiae, Pichi'a pastoris, SF9 veya High5 böcek hücreleri, ölümsüzlestirilmis memeli hücre çizgileri (örnegin HeLa hücreleri veya CHO hücreleri) veya primer memeli hücreleri gibi ökaryotik olabilir. Açiklama ayrica, bulusun bir muteininin üretilmesi için bir yöntemle de ilgili olup, burada mutein, muteinin bir fragmani veya muteinin bir füzyon proteini ve bir baska polipeptit, genetik isleme yöntemleri araciligiyla mutein için kodlama yapan nükleik asitten baslayarak üretilir. Yöntem in vivo gerçeklestirilebilir, mutein örnegin bir bakteriyel veya ökaryotik konak organizmada üretilebilir ve daha sonra bu konak organizmadan veya kültüründen izole edilebilir. Ayrica, bir proteini in vitro, örnegin bir in vitro translasyon sisteminin kullanimiyla üretmek de mümkündür. Mutein in vivo üretilirken, bulusun bir muteinini kodlayan bir nükleik asit (yukarida önceden genel hatlariyla verildigi üzere) rekombinan DNA teknolojisi araciligiyla uygun bir bakteriyel veya ökaryotik konak organizmanin içine eklenir. Bu amaçla, konak hücre ilk olarak, yerlesik standart yöntemler kullanilarak bulusun bir muteinini kodlayan bir nükleik asit molekülü içeren bir klonlama vektörüyle dönüstürülür. Konak hücre daha sonra, heterolog DNA'nin ekspresyonuna ve dolayisiyla karsilik gelen polipeptidin sentezine olanak saglayan kosullar altinda kültürlenir. Müteakiben, polipeptit ya hücreden veya yetistirme vasatindan geri kazanilir. Bulusun gözyasi lipokalin muteinlerinde, Cys 61 ila Cys 153 arasindaki dogal olusumlu disülfit bagi yok edilir. Dolayisiyla, bu tip muteinler (veya bir intramoleküler disülfit bagi içermeyen herhangi bir diger gözyasi lipokalin muteini), indirgeyici bir redoks ortama sahip bir hücre bölmesinde, örnegin Gram-negatif bakterilerin sitoplazmasinda üretilebilir. Bulusun bir lipokalin muteininin intramoleküler disülfit baglari içermesi durumunda, yeni olusan polipeptidi, uygun bir sinyal dizisi kullanilarak oksitleyici bir redoks ortamina sahip bir hücre bölmesine yönlendirmek istenebilir. Bu tip bir oksitleyici ortam, E. coli' gibi Gram-negatif bakterilerin periplazmasi tarafindan, Gram- pozitif bakterilerin hücre disi ortaminda veya ökaryotik hücrelerin endoplazmik retikulumunun Iümeninde saglanabilir ve çogunlukla yapisal disülfit baglarin olusumunu kolaylastirir. Ancak, bulusun bir muteinini, E co/i gibi bir konak hücrenin sitosolü içinde üretmek de mümkündür. Bu durumda, polipeptit ya dogrudan bir çözünür ve yayilmis durumda elde edilebilir veya inklüzyon cisimcikleri biçiminde geri kazanilabilir ve ardindan in vitro yeniden dogallastirilir. Bir diger opsiyon, oksitleyici bir hücre içi ortama sahip, böylelikle sitosol içinde disülfit baglarinin olusumuna olanak saglayan spesifik konak türlerin kullanimidir (Venturi M, et al. (2002) J. MoL Bio!. 315, 1-8). Ancak, bulusun bir muteininin yalnizca genetik mühendislik kullanilarak olusturulmasi veya üretilmesi gerekli olmayabilir. Daha ziyade, bir lipokalin muteini ayrica, Merrifield kati evre polipeptit sentezi gibi kimyasal sentezle veya in vitro transkripsiyon ve translasyonal da elde edilebilir. Örnegin, umut vaat eden mutasyonlari moleküler modelleme kullanilarak tanimlanmasi ve daha sonra istenen (tasarlanan) polipeptidin in vitro sentezlenmesi ve belirli bir hedef için baglanma aktivitesinin incelenmesi mümkündür. Proteinlerin kati evre ve/veya solüsyon evresi sentezi için yöntemler teknikte iyi bilinmektedir (bakiniz örnegin Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43). Bir baska uygulamada, bulusun muteinleri, teknikte uzman kisilerce bilinen iyi-oturmus yöntemler kullanilarak in vitro transkripsiyon/translasyonal üretilebilir. Bulus ayrica, en az bir adet bulusun insan gözyasi Iipokalininin muteinini veya bir füzyon proteini veya bunun bir konjugatini ve farmakolojik olarak kabul edilen bir eksipiyan içeren farmasötik bir bilesimle de ilgilidir. Bulusa göre lipokalin muteinleri, proteinli ilaçlar için terapötik olarak etkili olan herhangi bir parenteral veya parenteraI-olmayan (enteral) yol vasitasiyla verilebilir. Bulusun muteinleri sistemik olarak veya topikal olarak, istendigi sekilde konvansiyonel toksik- olmayan farmakolojik olarak kabul edilen eksipiyanlar veya tasiyicilar, katkilar ve araçlar ihtiva eden formülasyonlarda verilebilir. Mevcut bulusun bir uygulamasinda, farmasötik bir memeliye ve özellikle insanlara parenteral olarak verilir. Farmasötik bilesim bir sulu solüsyon, bir suda-yag emülsiyonu veya bir yagda-su emülsiyonu olabilir. edildigi üzere transdermal aktarim teknolojilerinin, örnegin iyontoforez, sonoforez veya mikro igne-güçlendirilmis aktarimin da, burada tarif edilen muteinlerin transdermal aktarimi için kullanilabilecegi de kaydedilmektedir. Bulusun muteinleri sistemik olarak veya topikal olarak, çesitli konvansiyonel toksik-olmayan farmakolojik olarak kabul edilen eksipiyanlar veya tasiyicilar, katkilar ve araçlar ihtiva eden formülasyonlarda verilebilir. Uygulanan muteinin dozaji, istenen engelleyici etkinin ya terapötik yanitin elde edilmesi için genis sinirlar içerisinde degisebilir. Örnegin, bilesigin seçilen bir Iigand için afinitesinin yani sira muteinle Iigand arasindaki kompleksin in vivo yari-ömrüne bagli olacaktir. Ayrica, optimal dozaj muteinin veya bunun füzyon proteinin veya konjugatinin biyodagilimina, verilis yoluna, tedavi edilmekte olan hastaligin/bozuklugun ciddiyetine ve ayrica hastanin tibbi durumuna bagli olacaktir. Örnegin, topikal uygulamalar için bir merhemde kullanildiginda, gözyasi lipokalini muteininin yüksek bir konsantrasyonu kullanilabilir. Ancak, istenirse, mutein ayrica bir sürekli salim formülasyonunda, örnegin lipozomal dispersiyonlar veya PolyActiveTM veya OctoDEXT'V' (karsilastiriniz Bos et al., Business Briefing: Pharmatech 2003, 1-6) gibi hidrojel-tabanli polimer mikroküreler olarak da verilebilir. Mevcut olan diger sürekli salim formülasyonlari örnegin PLGA tabanli polimerler (PR pharmaceuticals), PLA-PEG tabanli hidrojeller (Medincell) ve PEA tabanli polimerlerdir (Medivas). Dolayisiyla, mevcut bulusun muteinleri, farmakolojik olarak kabul edilen içeriklerin yani sira yerlesik hazirlama yöntemleri kullanilarak bilesimler halinde formüle edilebilir. Farmasötik bilesim ayrica, örnegin, dolgular, baglayicilar, islatici ajanlar, glidantlar, stabilizörler, koruyucular, emülgatörler gibi katki maddeleri ve ayrica çözücüler veya çözündürücüler veya bir depo etkisi elde etmek için ajanlar da ihtiva edebilir. Ikincisi, füzyon proteinlerinin, Iipozomlar ve mikrokapsüller gibi yavas veya sürekli salim veya hedeflenmis aktarim sistemlerinin içine de katilabilmesidir. Formülasyonlar, bir bakteri-tutucu filtre üzerinden filtrasyon dahil olmak üzere çesitli araçlarla veya kullanimdan hemen önce steril suda veya diger steril vasatta çözünebilen veya dagilabilen steril kati bilesimler biçiminde sterilize edici ajanlarin katilmasiyla sterilize edilebilir. Burada tarif edilen bir Iipokalin muteini, bizzat bir insan hasta dahil olmak üzere bir organizmaya veya farmakolojik olarak etken maddeler veya uygun tasiyicilar veya eksipiyan(lar) içerebilen veya bunlarla karistirilabilen bir farmasötik bilesim içinde verilebilir. Ilgili bir Iipokalin muteini bilesiminin formülasyonu ve verilisi için teknikler, teknikte iyi oturmus düsük moleküler agirlikli bilesikler için olanlara benzer veya bunlarla özdestir. Emsal yollara, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, oral, transdermal ve parenteral aktarim dahildir. Bulusun bir Iipokalin muteinini içeren bir bilesim örnegin deri üzerinde veya bir yara üzerine uygulanabilir. Bazi uygulamalarda bir Iipokalin muteini veya ilgili bir bilesim sistemik biçimden ziyade bir lokal biçimde, örnegin, enjeksiyon vasitasiyla verilebilir. Mevcut bulusun bir Iipokalin muteinini içeren farmasötik bilesimler kendiliginden bilinen bir biçimde, örnegin, konvansiyonel karistirma, çözündürme, granülleme, draje-yapimi, düzlestirme, emülsiyonlastirma, kapsülleme, yakalama veya liyofilize etme islemleri araciligiyla üretilebilir. Mevcut bulusa göre kullanim için bir farmasötik bilesim böylelikle, hidrojelin ve/veya peptidin/peptoidin farmasötik olarak kullanilabilen preparasyonlar olarak islenmesini kolaylastiran eksipiyanlar ve yardimci maddeleri dahil olmak üzere bir veya daha fazla fizyolojik olarak kabul edilen tasiyici kullanilarak konvansiyonel bir biçimde formüle edilebilir. Dogru formülasyon, seçilen verilis yoluna baglidir. Enjeksiyon için, Iipokalin mutinin veya ilgili bir bilesim sulu solüsyonlar olarak, örnegin Hanks solüsyonu, Ringer solüsyonu veya fizyolojik salin tamponu gibi fizyolojik olarak uygun tamponlar olarak formüle edilebilir. Transmukozal verilis için, nüfuz edilecek bariyere uygun penetranlar formülasyonda kullanilir. Bu tip penetranlar teknikte genel olarak bilinmektedir. Oral verilis için, Iipokalin muteinin veya ilgili bir bilesim, bunlarin teknikte iyi bilinen farmakolojik olarak kabul edilen tasiyicilarla birlestirilmesiyle kolayca formüle edilebilir. Bu tip tasiyicilar Iipokalin muteininin veya ilgili bir bilesimin yani sira mevcut oldugu durumda farmasötik olarak aktif bilesigin, tedavi edilecek olan bir hasta tarafindan oral sindirimi için tabletler, haplar, drajeler, kapsüller, sivilar, jeller, suruplar, bulamaçlar, süspansiyonlar ve benzerleri olarak formüle edilmesini saglar. Oral kullanim için farmasötik preparasyonlar, tabletler veya draje içleri elde etmek için, istenirse, uygun yardimci maddelerin eklenmesinden sonra bir kati eksipiyanin eklenmesiyle, opsiyonel olarak olusan bir karisimin ögütülmesiyle ve granüllerin karisiminin islenmesiyle elde edilebilir. Uygun eksipiyanlar, özellikle, Iaktoz, sükroz, manitol veya sorbitol dahil olmak üzere sekerler gibi dolgular; örnegin, misir nisastasi, bugday nisastasi, pirinç nisastasi, patates nisastasi, jelatin, gam tragasant, metil selüloz, hidroksipropiImetiI-selüloz, sodyum karboksimetilselüloz ve/veya polivinilpirolidon (PVP) gibi selüloz preparasyonlardir. istenirse, çapraz-bagli polivinil pirolidon, agar veya aljinik asit veya bunun sodyum aljinat gibi bir tuzu gibi parçalayici ajanlar eklenebilir. Draje içleri uygun kaplamalarla saglanir. Bu amaçla, opsiyonel olarak gam arabik, talk, polivinil pirolidon, karbopol jel, polietilen glikol ve/veya titanyum dioksit, lake solüsyonlari ve uygun organik çözücüler veya çözücü karisimlari ihtiva edebilen konsantre seker solüsyonlari kullanilabilir. Tanimlama için veya aktif bilesik dozlarinin farkli kombinasyonlarinin karakterize edilmesi için tabletlere veya draje kaplamalarina boyarmaddeler veya pigmentler eklenebilir. Oral olarak kullanilabilen farmasötik preparasyonlara, jelatinden yapilan siki-geçirme kapsüllerin yani sira jelatinden ve gliserol veya sorbitol gibi bir plastiklestiriciden yapilan sizdirmaz kapsüller dahildir. Siki-geçirme kapsüller, Iaktoz gibi dolgular, nisastalar gibi baglayicilar ve/veya talk veya magnezyum stearat gibi kaydiricilar ve opsiyonel olarak stabilizörlerle karisim halinde etken maddeleri ihtiva edebilir. Yumusak kapsüllerde, peptitler/peptoidler, yag asitleri, sivi parafin veya sivi polietilen glikoller gibi uygun sivilarda süspanse edilebilir. Ek olarak, stabilizörler eklenebilir. Oral verilis için tüm formülasyonlar, bu tip verilis için uygun dozajlarda olmalidir. Lipokalin muteini, enjeksiyonla, örnegin, intramusküler enjeksiyonlarla veya bolus enjeksiyonlarla veya sürekli infüzyonla parenteral verilis için formüle edilebilir. Enjeksiyon için formülasyonlar eklenen bir koruyucuyla birlikte birim dozaj formlarinda, örnegin, ampuller olarak veya çok-dozlu konteynirlar olarak formüle edilebilir. Ilgili bilesimler, yagli veya sulu araçlarda süspansiyonlar, solüsyonlar veya emülsiyonlar gibi formlarda olabilir ve süspanse edici, stabilize edici ve/veya dagitici ajanlar gibi formülatör ajanlar ihtiva edebilir. Bu tip bir tedaviye ihtiyaci olan süje, birkaç örnek saymak gerekirse bir insan, bir köpek, bir fare, bir siçan, bir domuz, sinomolgus gibi bir maymun gibi bir memeli olabilir. Mevcut bulusun bir muteini, bu tip bir hastalik veya bozuklugun gelismesinde mevcut açiklamanin bir nükleik asit kitapliginin ekspresyon ürününe görüntülenebilen veya diger sekillerde elde edilen gözyasi Iipokalini muteinlerine görüntülenebilen IL-4 reseptörü alfanin dahil oldugu herhangi bir hastalik veya bozuklugun tedavi edilmesi için kullanilabilir. Bu baglamda, çesitli tümör hücrelerinin normal hücrelerden daha yüksek bir sayida yüksek afiniteli IL-4 reseptörleri eksprese ettigi kaydedilmektedir. Bu tip hücrelere melanom, meme kanseri, yumurtalik karsinom, mezotelyom, gliyoblastom, astrositom, renal hücre karsinom, bas ve boyun karsinom, AIDS'Ie iliskili Kaposi sarkomu = AIDS KS, hormon bagimli ve bagimsiz prostat karsinom hücreleri ve prostat tümörlerinden primer kültürler gibi kati Insan tümörü içerir, örnegin (karsilastiriniz Örnegin Garland, L, hücrelerin spesifik örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Burkitt lenfoma hücre çizgisi Jijoye (B-hücresi Ienfom), prostat karsinom (LNCaP, DU145), bas ve boyun karsinom (SCC, KCCT, SCC-25: dahildir. IL4R alfa zinciri, kaynastirildiginda veya konjuge edildiginde, IL-4 Reseptörü alfa zincirine baglanan gözyasi Iipokalini muteinleri bu nedenle tümörlerin (kanser) tedavisi için de kullanilabilir. Uygun toksinlerin örneklerine Psödomonas eksotoksin, pertüsis-toksini, difteri toksini, risin, saporin, psödOmonas eksotoksin, kalikeamisin veya bunun bir türevi, bir taksoid, bir maytansinoid, bir tübülisin ve bir dolastatin analogu dahildir. Dolastatin analoglarinin örneklerine, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, auristatin E, monometilauristatin E, auristatin PYE ve auristatin PHE dahildir. Kanserin tedavisi için, IL-4 Reseptörü alfa zincirine baglanan muteinlerin sitostatik bir ajana konjuge edilmesi de mümkündür. Bu tip sitostatik ajanlarin örneklerine Sisplatin, Karboplatin, Oksaliplatin, 5-Florourasil, Taksoter (Dosetaksel), Paklitaksel, Antrasiklin (Doksorubisin), Metotreksat, Vinblastin, Vinkristin, Vindesin, Vinorelbin, Dakarbazin, Siklofosfamid, Etoposid, Adriamisin, Kamptotesin, Kombretastatin A-4 iliskili bilesikler, sülfonamidler, oksadiazolinler, benzo[b]tiyofenes sentetik spiroketal piranlar, monotetrahidrofüran bilesikleri, kurasin ve kurasin türevleri, metoksioestradiol türevleri ve Lökovorin dahildir. Yukaridaki açiklamadan görüldügü üzere, mevcut bulusun bir muteini veya bunun bir füzyon proteinin veya bir konjugati birçok uygulamada kullanilabilir. Genel olarak, bu tip bir mutein, spesifik olarak Fc parçasinin glikosilasyonuna dayananlar hariç antibiyotiklerin kullanildigi tüm uygulamalarda kullanilabilir. Bu nedenle, açiklamanin bir baska yönünde, bulusun insan gözyasi Iipokalini muteinleri, insan gözyasi Iipokalininin dogal-olmayan belirli bir Iigandinin saptanmasinda kullanilir. Bu tip kullanim, muteinin uygun kosullar altinda, belirli Iigandi ihtiva ettiginden süphelenilen bir numuneyle temas ettirilmesi, bu sayede muteinle belirli Iigand arasinda bir kompleksin olusturulmasina olanak saglanmasi ve komplekslenmis muteinin uygun bir sinyalle saptanmasi adimlarini içerebilir. Saptanabilir sinyale, yukarida açiklandigi üzere bir etiket veya kendisine baglanma, yani kompleks olusumunu nedeniyle fiziksel özelliklerde bir degisiklik neden olabilir. Bunun bir örnegi, degeri bir altin folyo gibi bir yüzey üzerinde hareketsizlestirilmis olandan baglayici partnerlerin baglanmasi esnasinda degisen plazmon yüzey rezonanstir. Burada açiklaman insan gözyasi Iipokalininin muteinleri ayrica, insan gözyasi kullanim, muteinin uygun kosullari altinda, söz konusu ihtiva etmesi gereken bir numuneyle temas ettirilmesi, bu sayede muteinle belirli Iigand arasinda bir kompleksin olusturulmasina olanak saglanmasi ve mutein/ligand kompleksinin numuneden ayrilmasi adimlarini içerebilir. Muteinin hem belirli bir dogal-olmayan Iigandin saptanmasi için hem belirli bir ligandin ayrilmasi için kullaniminda, mutein ve/veya hedef uygun bir kati faz üzerinde hareketsizlestirilebilir. Bulusun insan gözyasi Iipokalini muteinleri ayrica, bir bilesigin önceden seçilen bir alana hedeflenmesi için de kullanilabilir. Böyle bir amaç için, mutein, kompleks olusumuna olanak saglamak amaciyla ilgi konusu bilesikle temas ettirilir. Daha sonra, muteini ve ilgi konusu bilesigi içeren kompleks önceden seçilen alana aktarilir. Bu kullanim özellikle bir ilacin (seçimli olarak), ilaçla tedavi edilmesi gereken bir enfekte vücut parçasi, doku veya organ gibi bir organizmadaki önceden seçilen bir alana aktarilmasi için uygundur ancak bununla sinirli degildir. Muteinle ilgi konusu bilesik arasinda bir kompleks olusumunun yaninda, mutein ayrica, muteinin ve bilesigin bir konjugatinin saglanmasi için belirli bilesikle de tepkimeye sokulabilir. Yukaridaki komplekse benzer sekilde, bu tip bir konjugat, bilesigin önceden seçilen hedef alana aktarilmasi için uygun olabilir. Mutein ve bilesigin bu tip bir konjugati ayrica, muteini ve bilesigi birbirine esdegerli olarak baglayan bir baglayici da içerebilir. Opsiyonel olarak, bu tip bir baglayici kan dolasiminda stabildir ancak hücresel bir ortamda yarilabilir. Burada açiklanan muteinler ve türevleri böylelikle, antikorlara veya bunlarin fragmanlarina benzer birçok alanda kullanilabilir. Belirli bir muteinin veya bir konjugatin hedefinin veya bu hedefin bir füzyon proteininin hareketsizlestirilmesine veya ayrilmasina olanak saglayacak sekilde bir destege baglanma için kullanimlarina ek olarak, muteinler bir enzim, bir antikor, bir radyoaktif madde veya biyokimyasal aktiviteye veya tanimli baglama karakteristiklerine sahip herhangi bir diger grupla etiketleme için kullanilabilir. Bunu yaparak, bunlarin ilgili hedefleri veya bunlarin füzyon proteinlerinin konjugatlari saptanabilir veya bunlarla temas ettirilebilir. Örnegin, bulusun muteinleri, yerlesik analitik yöntemler (örnegin, ELISA veya Western Lekeleme) araciligiyla veya mikroskopi veya immünosensoriklerle kimyasal yapilarin saptanmasi görevini de görebilir. Burada, saptama sinyali ya dogrudan uygun bir mutein konjugatinin veya füzyon proteinin kullanilmasiyla veya dolayli olarak bagli muteinin bir antikor vasitasiyla immünokimyasal saptanmasiyla olusturulabilir. Tipta bulusun muteinleri için sayisiz olasi uygulamalar da mevcuttur. Bunlarin tanisal ve ilaç aktarimi için kullanimina ek olarak, bulusun, örnegin, dokuya- veya tümöre-özgü hücresel yüzeyi baglayan bir mutant polipeptidi olusturulabilir. Bu tip bir mutein, örnegin, "tümör görüntüleme" için konjuge formda veya bir füzyon proteini olarak veya dogrudan kanser terapisi için kullanilabilir. Dolayisiyla, mevcut bulus, bulusun bir muteinini ve eksipiyanlar, tamponlar (muteinlerin etiketlenmesi için kullanilabilen) etiketler gibi tani için araçlar içeren bir tanisal bilesim saglar. Böylelikle, mevcut bulus ayrica, bulusun insan gözyasi Iipokalini muteinlerinin, belirli bir dogal-olmayan Iigandla kompleks olusumu için kullanimini da içermektedir. Burada tarif edilen bir baska ilgili kullanimi hedef dogrulamadir, yani bir hastalik veya bozuklugun gelismesinde veya ilerleyisinde yer aldigi varsayilan bir polipeptidin gerçekten de bir sekilde o hastalik veya bozuklugun nedeni olup olmadigini analizidir. Bir proteinin farmakolojik ilaç hedefi olarak dogrulanmasi için bu kullanim, mevcut bulusun bir muteininin, natif konformasyonunda bir proteinin bir yüzey alanini özgül olarak tanima, yani natif bir epitopa baglanma yetisinden faydalanir. Bu baglamda, bu yetinin yalnizca sinirli bir sayida rekombinan antikorlar için bildirilmis oldugu kaydedilmektedir. Ancak, bulusun bir muteininin, bir ilaç hedefinin dogrulanmasi için kullanimi proteinlerin hedefler olarak saptanmasiyla sinirli degildir, ayrica protein alanlarinin, peptitlerin, nükleik asit moleküllerinin, organik moleküllerin veya metal komplekslerinin saptanmasini da içerir. Bulusun Emsal Uygulamasi Sekil 1, önceden açiklanan, IL-4 reseptörü alfa için baglanma afinitesi sergileyen bir kalinti (alti çizili), periplazmik ekspresyon üzerine yarilan sinyal dizisini olusturur. N-ucu T7-etiketi (italik) ve C-ucu Streptag-ll (koyu), karakterize edilen proteinin parçalaridir. Sekil 1 ayrica, dogal sus gözyasi lipokalininin 4 N-ucu amino asit kalintisinin (His1 His2 Leu3 Ala4) yani sira son iki C-ucu amino asit kalintisinin (Ser157 ve Asp158) bu muteinde silindigini de göstermektedir. Sekil 2, IL-4 reseptörü alfa için yüksek afiniteye sahip emsal muteinlerin polipeptit dizilerini (SEO ID NO'lar: 2-11) göstermektedir. 'SwissProt P31025' ile gösterilen sayilar, SwissProt veritabaninin girdisinin islenmemis öncül dizisinin karsilik gelen amino asit konumu numaralandirilmasini göstermektedir. Wt TL026 esasen, pTLc26 vektöründe dogal sus gözyasi lipokalininin dizisine karsilik gelmektedir. Ancak, wt TL026, olgun proteinin 61 ve 153 konumlarindaki sistein kalintilari serin kalintilariyla degistirildiginden, bir disülfit bagi içermez. Benzer sekilde, olgun proteinin 101 konumundaki bir serin kalintisi bir serin kalintisiyla degistirilir. Ek olarak, olgun proteinin 111 konumunda bir arjinin kalintisi bir prolinle degistirilmistir ve olgun proteinin 114 konumunda bir Iizin kalintisi bir triptofan ile degistirilmistir. Ayrica, SwissProt girisi P31025'in dizisinde yer alan iki C-ucu amino asit dizide yer almaz. ugratilmis konumlarin koyu olarak gösterildigi bir randomizasyon kitapligidir. Randomize diziler, 53 ve 55 konumu haricinde J14'e özdestir. M3-B24(PSM), PSM B24'ten sicak noktalari göstermektedir. Sekil 3, TF-1 hücresi proliferasyonu analizlerinin sonuçlarini göstermektedir. TF-1 eklenmesinden önce bir seyreltme serisinde inkübe edilmistir. Proliferasyon, 3H-timidin katilmasiyla ölçülmüstür. Sekil 4, Sekil 3"ün IC50 degerlerini ve IL-4 reseptörü alfa için afiniteye sahip insan gözyasi lipokalininin muteinlerinin Biacore ölçümlerinin sonuçlarini göstermektedir. Yaklasik olarak 400 RU lL-4 reseptörü alfa-FC, önceden bir anti insan-FC monoklonal antikorla kaplanmis olan bir CMS çipi üzerinde yakalanmistir. Müteakiben, 25 nMilik bir tekli konsantrasyondaki mutein akis hücresi üzerinden geçirilmis ve rezonans birimlerindeki degisiklikler kaydedilmistir. Herhangi bir IL-4 reseptörü alfa-Fc'ye sahip olmama disinda esit olarak muamele edilen bir akis hücresinden referans sinyalleri çikartilmistir ve ortaya çikan veriler, BIAevaIuation yazilimi kullanilarak bir 1:1 Langmuir modeline uydurulmustur. Yavas ayrisma kinetikleri nedeniyle, sinyallerin herhangi bir IL-4 reseptörü alfa-Fc'ye sahip olmama disinda esit olarak muamele edilen bir akis hücresinden sinyallerin çikartilmasi ve yalnizca numune tamponunun enjekte edilmis oldugu bir deneyden sinyalin çikartilmasi için çift referanslama kullanilmistir. Ortaya çikan veriler, BIAevaluation yazilimi kullanilarak kütle-tasima sinirlamasina sahip bir 1:1 Langmuir modeline uydurulmustur. Aksi belirtilmedigi sürece, teknikte rekombinan gen teknolojisinin yerlesik yöntemleri kullanilmistir. Örnekler Örnek 1: 8191.4-824 muteinin bir alana-yönelik rastqele yaklasik kullanilarak afinite olgunlastirilmasi PCT basvurusu WO dayali varyantlarin bir kitapligi, bu konumlar üzerindeki 20 amino asidin tamamina yapilandirildi. alfaya karsi rekabetçi bir monoklonal antikorla birlikte, sirasiyla, uzatilmis yikama süreleriyle (MABZSO, R&D Systems; 1 saat yikama) veya kisa inkübasyon süreleriyle (10 dakika) birlesik halde sinirli hedef konsantrasyon (IL-4 reseptörü alfanin 0,5 nM ve kullanilarak gerçeklestirildi. Üç veya dört tur seçim gerçeklestirildi. eKSpresyon vektörü üzerinde kodlanan ilgili muteini barindiran E. Coli K12 susu JM83 edildigi üzere ilgili ekspresyon vektörünü barindiran E. coli susu W3110 kullanilarak gerçeklestirildi. Örnek 2: Biacore kgllanilarak afinite ölçümü yerine) yaklasik olarak konsantrasyonlarda 40 ul numune saflastirilmis Iipokalin muteinlerinin yerine) 25 nM'lik bir konsantrasyonda 100 ul muteinin enjekte edilmesi modifikasyonlariyla gerçeklestirildi. Örnek 3: TF-1 hücresi proliferasyonu analizleri lL-4 ve lL-13-uyarilmis TF-1 hücresi proliferasyonu testleri esasen, Lefort et al. (Lefort S., et al., ('da tarif edildigi üzere ve PCT eklenmesinden önce bir seyreltme dizisinde inkübe edildi. Proliferasyon 3H-timidin katilmasiyla ölçüldü. Bir TF-1 proliferasyonu analizinden alinan sonuçlar Sekilde indüklenmis lL-3'ün kuvvetli antagonistlerini oldugunu göstermektedir. Bulus burada genis kapsamli ve jenerik olarak tarif edilmistir. Jenerik açiklama dahilinde yer alan daha dar türlerin ve alt jenerik gruplamalarin her biri de bulusun parçasini olusturmaktadir. Buna, kesilip çikartilmis materyalin burada spesifik olarak anilip anilmadigina bakilmaksizin, familyadan herhangi bir ana maddeyi çikartan bir sartla veya negatif kisitlamayla bulusun jenerik tarifnamesi de dahildir. Diger uygulamalar asagidaki istemlerde bulunmaktadir. Ek olarak, bulusun özelliklerinin veya yönlerinin Markush gruplari açisindan tarif edildigi yerlerde, teknikte uzman kisiler bulusun ayrica bu sayede, Markush grubunun herhangi bir münferit üyesi elemani veya üyelerinin alt grubu açisindan da tarif edildigini fark edecektir. TR TR TR TR TR TR TR