TARIFNAME KANSER TEDAVISI IçIN BIRLESIK PREPARASYONLAR Mevcut bulus birlesik preparasyonlar ve farmasötik bilesimlerle ve bunlarin ilaç olarak, özellikle de kanser tedavisine yönelik olarak kullanimlariyla ilgilidir. Kanser, standartlastirilmis bir rejimin parçasi olarak bir veya daha fazla sitotoksik anti-neoplastik ilaçla ("kemoterapötik ajanlar") tedavi edilebilir. Kemoterapi, bir hastayi iyilestirmeyi veya yasam süresini uzatmayi veya semptomlari hafifletmeyi hedefleyebilir. Geleneksel kemoterapötik ajanlar, çogu kanser hücresinin özelliklerinden birini kullanarak hizla bölünen hücreleri öldürerek etki eder. Bununla birlikte, kemoterapi normal kosullar altinda hizli bir sekilde bölünen hücrelere, örnegin kemik iligindeki hücrelere, sindirim sistemine ve saç köklerine de zarar verir. Bu, kemoterapinin en sik görülen yan etkilerine neden olur: miyelosupresyon (kan hücrelerinin üretiminde azalma, dolayisiyla immünosupresyon), mukozit (sindirim sistemi zarinin iltihabi) ve alopesi (saç dökülmesi). Daha etkili kanser tedavileri saglama ve azaltilmis yan etkileri olan etkili kanser tedavileri saglamaya Lenfosit aktivasyon geni 3 (LAG-3), dört hücre disi lg süper aile alani içeren bir CD4 homolog tip I membran proteinidir. CD4'e benzer sekilde, LAG-3, T hücrelerinin yüzeylerinde oligomerlesir ve antijen sunan hücrelerdeki (APC'Ier) MHC sinif II moleküllerine baglanir, ancak CD4'ten önemli ölçüde daha yüksek afiniteye sahiptir. LAG-3, ht'icre yüzeyindeki CDs-TCR kompleksi ile birlestigi ve sinyal iletimini negatif olarak düzenledigi aktif CD4-pozitif ve CD8-pozitif T lenfositlerinde ifade edilir. Sonuç olarak, T hücresi proliferasyonunu, fonksiyonunu ve homeostazini negatif olarak düzenler. LAG-S'ten türetilen çözünür füzyon proteinlerinin MHC sinif lI moleküllerini CD4'ten çok daha yüksek bir aviditeyle bagladigi, MHC sinif II pozitif makrofajlarin ve olgunlasmamis dallantili hücrelerin T hücreleri yanitlarini in vitro olarak uyarma kapasitesini arttirdigi ve viral ve tümöre özgü sitotoksik T hücrelerinin in vitro indüksiyonunu gelistirdigi gösterilmistir. Buna göre, bir LAG-3 füzyon proteini sistemik bir immün uyarici olarak ve kanser asilari için bir yardimci madde olarak kullanilir. kandaki monositlerin sayisinda bir artisa neden olmak için rekombinant LAG-3 proteininin veya bunun türevlerinin kullanimini tarif etmektedir. Sasirtici bir sekilde, LAG-3 proteininin veya bunun MHC sinif II moleküllerine baglanabilen bir türevinin ve platin bazli bir anti-neoplastik maddenin veya bir topoizomeraz I Inhibitörünün uygulanmasinin tümör büyümesini azaltmada sinerjistik bir etkiye sahip oldugu bulunmustur. Bulusa göre asagidakileri içeren kombine bir preparat saglanmistir: (a) LAG-S proteini veya bunun MHC sinif II moleküllerine baglanabilen bir türevi; ve (b) antineoplastik maddenin bir platin bazli anti- neoplastik madde veya bir topoizomeraz I inhibitörü oldugu bir anti-neoplastik madde. kombinasyon bilesenlerinin bagimsiz olarak dozlanabilecegi sekilde veya (a) ve (b) kombinasyon bilesenlerinin farkli miktarlariyla farkli sabit kombinasyonlarin kullanildigi bir "parça kiti"ni belirtir. Bilesenler eszamanli olarak veya birbirlerinin ardindan uygulanabilir. Bilesenlerin birbirlerinin ardindan uygulanmasi durumunda, tercihen, uygulamalar arasindaki zaman araligi, bilesenlerin birlikte kullaniminin terapötik etkisinin (a) ve (b) kombinasyon bilesenlerinden yalnizca herhangi birinin kullanimiyla elde edilecek olan etkiden büyük olacagi sekilde seçilir. Birlesik preparasyonun bilesenleri tek bir birlesik birim dozaj biçiminde veya (a) bileseninin bir birinci birim dozaj biçimi ve (b) bileseninin ikinci birim dozaj biçimi olarak sunulabilir. Kombinasyon bileseni (a) ile kombinasyon bileseni (b)'nin, birlesik preparasyonda uygulanacak olan toplam miktarlarinin orani, örnegin, tedavi edilecek olan bir hasta alt popülasyonunun ihtiyaçlarina veya tek bir hastanin, örnegin belirli bir hastalik, yas, cinsiyet veya kilosundan kaynakli ihtiyaçlarina yanit vermek amaciyla degisebilir. Tercihen, en az bir yararli etki, örnegin anti-neoplastik ajanin bir gelistirme etkisi veya kombinasyon bilesenleri (a) ve (b)'nin birlikte bir gelistirme etkisi, örnegin toplamsal bir etkiden fazlasi, ilave avantajli etkiler, daha az yan etkiler, daha az toksisite veya kombinasyon bilesenleri (a) ve (b)'den biri veya her ikisinin bir etkili dozaji ile karsilastirildiginda birlesik bir terapötik etki ve çok tercih edilen biçimde kombinasyon bilesenleri (a) ve (b)'nin bir sinerjisi bulunur. Bulusun birlesik bir preparasyonu, bir memeliye, tercihen bir insana uygulama için farmasötik bir birlesik preparasyon olarak saglanabilir. LAG-3 proteini veya bunun bir türevi istege bagli olarak farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici ile birlikte saglanabilir ve/veya anti-neoplastik ajan istege bagli olarak farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici ile birlikte saglanabilir. veya 6-30 mg molar esdegeri bir dozda mevcut olabilir. Derialti (s.c.) IMP321 enjeksiyonu basina 6-30 mg dozlarinin güvenli oldugu ve metastatik böbrek hücreli kanser hastalarinda elde edilen farmakokinetik verilerin sonuçlarina dayanan kabul edilebilir bir sistemik maruziyet sagladigi gösterilmistir. 6 mg'dan fazla IMP321 dozlari enjekte edilen hastalarda, subkütanöz enjeksiyondan en az 24 saat sonra IMP321'in 1 ng/ml'nin üzerindeki bir kan konsantrasyonu elde edilmistir. Bulusun bir birlesik preparasyonu, LAG-3 proteininin birçok dozunu veya bunun türevini içerebilir. Anti-neoplastik maddenin dozu, kullanilan belirli anti-neoplastik maddeye bagli olacaktir. Platin bazli anti-neoplastik ajanlar, kanser kemoterapisinde kullanilan platinin koordinasyon kompleksleridir. Hücre ölümü ile sonuçlanan DNA onarimini ve/veya DNA sentezini inhibe eden DNA'da çapraz baglar olusturduklarina inanilmaktadir. Platin bilesiklerini kullanarak kanser tedavisinin baslica sinirlandirici yan etkisi periferik nörotoksisitedir. Platin bazli anti-neoplastik ajanlarin örnekleri arasinda sisplatin, karboplatin, Oksaliplatin, satraplatin, pikoplatin, Nedaplatin ve Triplatin bulunur. Karboplatin ve cis-diammin(siklobütan-1,1-dikarboksilat-0,0')platin(II) (marka adlari Paraplatin ve Paraplatin-AO), bazi kanser biçimlerine karsi kullanilir (temel olarak yumurtalik karsinomu, akciger, bas ve boyun kanseri ve ayni zamanda endometriyal, özofajiyal, mesane, gögüs ve servikal; merkezi sinir sistemi ya da 'üreme hücresi tümörleri; osteojenik sarkom ve bir kök hücre ya da kemik iligi nakli için preparasyon olarak). Ana bilesik sisplatin ile karsilastirildiginda büyük ölçüde azaltilmis yan etkileri vardir. Karboplatin dozu ile ilgili talimatlar ABD Gida ve Ilaç ldaresi'nden (FDA) temin edilebilir. Oksaliplatin veya [(1R,2R)-sikloheksan-1,2-diamin](etandioato-0,0') platin (II) (ticari marka Eloxatin), kare düzlemsel bir platin(ll) merkezini içerir. Sisplatin ve karboplatinin aksine, oksaliplatin iki monodentat ammin Iigandinin yerine bidentat Iigand 1,2-diaminosiklohekzan içerir. Ayni zamanda bir bidentat oksalat grubuna sahiptir. Oksaliplatin kolon karsinomuna karsi anti-tümör aktivitesine sahiptir. Oksaliplatin, DNA'da hem iç hem de zincirler arasi çapraz baglar olusturarak islev görür. DNA'daki çapraz baglar DNA çogalmasini ve kopyalanmasini önleyerek hücre ölümüne neden olur. Oksaliplatinin bir adjuvan ortaminda tavsiye edilen dozu, 12 döngü boyunca her iki haftada bir tekrarlanan intravenöz olarak 85 mg/mz'dir. Metastatik kolorektal kanserin tedavisinde okzaliplatin için önerilen doz, hastaligin ilerlemesi ya da kabul edilemez toksisite olana kadar her iki haftada bir tekrarlanacak sekilde 85 mg/mz'dir. Topoizomeraz inhibitörleri, topoizomeraz enzimlerinin (topoizomeraz I ve Il) etkisine müdahale etmek üzere tasarlanan ve normal hücre döngüsü sirasinda DNA iplikçiklerinin fosfodiester omurgasinin parçalanmasini ve yeniden birlestirilmesini katalize ederek DNA yapisindaki degisiklikleri kontrol eden enzimlerdir. Topoizomeraz inhibitörlerinin, hücre döngüsünün ligasyon adimini bloke ederek, genomun bütünlügüne zarar veren tek ve çift sarmalli kopmalar meydana getirdigi düsünülmektedir. Daha sonra bu kirilmalarin baslatilmasi apoptoz ve hücre ölümüne yol açar. Insan DNA topoizomeraz I (T0p1), replikasyon ve transkripsiyon sirasinda DNA süper sargisini rahatlatan temel bir enzimdir. Topt, bölünmüs ipin çift sarmal ekseni etrafinda dönmesine izin veren DNA tek iplik kopuslari üretir. T0p1 ayrica, saglam dubleks DNA'yi yeniden olusturmak için bölünmüs ipligi yeniden baglar. Ayrilma kompleksi olarak bilinen Top1-DNA ara maddeleri geçicidir ve normal sartlar altinda düsük seviyelerde bulunurlar. Bununla birlikte, kamptotesinler gibi T0p1 inhibitörleri ile muamele, parçalanabilen kompleksleri stabilize eder, DNA baglanmasini önler ve öldürücü DNA iplik kopuslarini uyarir. Kanser hücreleri, bu DNA Iezyonlarinin olusumuna seçici olarak duyarlidir. b]ki-tetahidroizokinolin-B,14(4H,12H)-dion monohidroklor'ür (ticari isim Hycamtin), bir topoizomeraz I inhibitörü olan bir kemoterapötik maddedir. Suda çözünen bir kamptotesin türevidir. Diger kanser türlerinin yani sira yumurtalik kanseri ve akciger kanserini tedavi etmek için hidroklorür formunda kullanilir. Topotekan, kamptotesinin yari sentetik bir türevidir. Kamptotesin, Camptotheca acuminata agacinin kabugundan çikarilan dogal bir üründür. Topoizomeraz-I, tek iplik kopmalari açarak DNA'daki burulma susunu gideren bir nükleer enzimdir. Topoizomeraz-I tek bir iplik kopusu yarattiginda, DNA ilerleyen çogaltma çatalinin önünde dönebilir. Topotekan, DNA bazlari arasinda birlesir. Bu birlesme, topotekanin birlestigi bir bölgeye ulastiginda DNA çogaltma düzenegini bozar. Bu bozulma DNA replikasyonunu önler ve sonuçta hücre ölümüne yol açar. Memeli hücreleri bu çift sarmal kirilmalarini etkili bir sekilde onaramaz. Bu islem apoptoz ile sonuçlanacak sekilde DNA zincirinde kopmalara neden olur. Hycamtin kapsüllerinin tavsiye edilen bir dozu 2,3 mg/m2 vücut yüzey alani/gün olup, her bir sürecin baslangici arasinda üç haftalik bir ara olacak sekilde art arda bes gün boyunca uygulanir. Baska bir kamptotesin türevi olan irinotekan (CPT11) kolon kanseri tedavisi için onaylanmistir. Bulusun birlesik bir preparasyonu, anti-neoplastik ajanin birçok dozunu içerebilir. LAG-3 proteini izole edilmis bir dogal veya rekombinant LAG-3 proteini olabilir. LAG-3 proteini, primat veya fare LAG-3 proteini gibi uygun herhangi bir türden LAG-3 proteininin bir amino sekansini, fakat tercihen bir insan LAG-3 proteinini içerebilir. Insan ve murin LAG-3 proteininin amino asit sekansi, proteininin sekansi, asagidaki Sekil 13'te tekrarlanir (SEKANS ID NO: 1). Insan LAG-3'ün'ün dört hücre disi lg süperaile alanlarinin amino asit sekanslari da (D1, D2, D3 ve D4) ayrica Huard ve ark., Sekil 1'de, amino asit kalintilari: tanimlanmistir. LAG-3 proteinin türevleri, MHC sinif II moleküllerini baglayabilen fragmanlar, varyantlar veya LAG-3 proteininin mutantlarini içerir. MHC sinif Il moleküllerine baglanabilen birkaç LAG-3 proteini türevi bilinmektedir. Bu tür türevlerin birçok örnegi Huard ve ark. tarafindan tarif edilmektedir (Proc. Natl. LAG-3 mutantlarinin, sinif II-pozitif Daudi hücrelerini baglama kabiliyetini belirlemek için nicel bir hücresel yapisma deneyi açiklanmaktadir. LAG-3'ün çesitli mutantlarinin MHC sinif II moleküllerine baglanmasi belirlenmistir. Bazi mutasyonlar sinif Il baglanmasini azaltabilmis, bazi mutasyonlar LAG- 3`ün sinif II molekülleri için afinitesini arttirmistir. MHC sinif II proteinlerini baglamak için gerekli kalintilarin birçogu, LAG-3 Di alaninda 30 amino asitlik büyük bir ekstra halka yapisinin tabaninda kümelenir. Insan LAG-3 proteininin D1 alaninin ilmek disi yapisinin amino asit sekansi GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (SEKANS ID NO: 2) olup, Sekil 13`te alti çizili sekanstir. LAG-3 proteini türevi, insan LAG-3 D1 alaninin 30 amino asitlik ilmek disi sekansini veya bu tür sekansin bir veya daha fazla amino asit ornatimiyla birlikte bir varyantini içerebilir. Degisken, insan özdesligine sahip amino asit sekansini içerebilir. LAG-3 proteinin türevi, D1 alani ve istege bagli olarak LAG-S proteini, tercihen insan LAG-3 proteininin D2 alani olan bir amino asit sekansini içerebilir. LAG-3 proteinin türevi, LAG-3 proteininin, tercihen insan LAG-3 proteininin D1 alaniyla veya D1 ve D2 alani ile en az %70, %80, %90 veya %95 amino asit özdesligine sahip bir amino asit sekansi içerir. LAG-S proteinin türevi, LAG-3 proteinin, tercihen insan LAG-3 proteininin D1, D2, D3 ve istege bagli olarak D4 alanlarinin bir amino asit sekansini içerebilir. LAG-3 proteinin türevi, LAG-3 proteininin, tercihen insan LAG-3'ün D1, D2 ve D3 alaniyla veya D1, sekansini içerebilir. Amino asit sekanslari arasindaki sekans özdesligi, sekanslarin hizalanmasi karsilastirilarak belirlenebilir. Karsilastirilan sekanslardaki esdeger bir pozisyon ayni amino asit tarafindan isgal edildiginde, moleküller bu pozisyonda aynidir. Bir özdeslik yüzdesi olarak bir hizalamanin puanlanmasi, karsilastirilan sekanslar tarafindan paylasilan pozisyonlarda özdes amino asitlerin sayisinin bir fonksiyonudur. Sekanslari/Dizileri karsilastirirken, optimum dizilimler, sekanslardaki muhtemel yerlestirmeleri ve silmeleri göz önüne almak için sekanslarin bir veya daha fazlasina bosluklar yerlestirilmesini gerektirebilir. Sekans karsilastirma metotlarinda bosluk cezalari kullanilabilmekte olup, örnegin, karsilastirilmakta olan sekanslarda ayni sayida özdes molekül için, mümkün oldugunca az bosluklu bir sekans hizalamasi, karsilastirilan iki sekans arasinda yüksek iliskiyi yansitmakta olup, birçok boslugun oldugu duruma göre daha yüksek bir puan alir. Maksimum özdeslik yüzdesinin hesaplanmasi, bosluk cezalari göz önünde bulundurularak optimum bir uyumun Sekans karsilastirmalarini gerçeklestirmek için uygun bilgisayar programlari, ticari ve kamu sektöründe yaygin olarak bulunmaktadir. Örnekler arasinda MatGat (Campanella ve ark., 2003, BMC Bioinformatics 4: 29; http:l/bitincka.com/Iedi0nlmatgat adresinde mevcuttur), Gap (Needleman & http://www.ebi.ac.uk/fasta adresinde mevcuttur), Clustal W 2,0 and X 2,0 (Larkin ve ark., 2007, Pairwise Alignment Algorithms (Needleman & Wunsch, 1970, supra; Kruskal, 1983, In: Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, Sankoff 8. Kruskal (eds), pp 1-44, Addison Wesley; http:l/www.ebi.ac.uk/tooIs/emboss/align adresinde mevcuttur) bulunur. Tüm programlar varsayilan parametreler kullanilarak çalistirilabilir. Örnegin, EMBOSS Ikili Hizalama Algoritmalarinin "igne" yöntemi kullanilarak, tüm uzunluklari boyunca göz önüne alindiginda iki sekansin optimum bir hizalamasini (bosluklar dahil) belirleyen ve bir yüzde özdeslik skoru saglayan sekans karsilastirmalari yapilabilir. Amino asit sekansi karsilastirmalari için varsayilan parametreler ("Protein Molekülü" seçenegi) Gap Uzatma cezasi: 0,5, Gap Açik cezasi: ,0, Matrix: Blosum 62 olabilir. Sekans karsilastirmasi referans sekansin tam uzunlugu boyunca yapilabilir. LAG-3 protein türevi, istege bagli olarak bir baglayici amino asit sekansi ile Immunoglobulin Fc amino asit sekansina, tercihen insan IgG1 Fc amino asit sekansina birlestirilebilir. LAG-3 proteini türevinin MHC sinif II moleküllerine baglanma kabiliyeti Huard ve arkadaslarinda (yukarida) açiklandigi gibi nicel bir hücresel yapisma deneyi kullanilarak belirlenebilir. LAG-3 proteini türevinin MHC sinif II molekülleri için afinitesi, insan LAG-3 proteininin sinif II molekülleri için MHC sinif II molekülleri için bir LAG-3 proteini türevinin afinitesi, sinif II molekülleri için insan LAG-3 proteininin afinitesinin en az %50'sidir. MHC sinif II moleküllerini baglayabilen uygun LAG-3 proteini türevlerinin örnekleri, asagidakileri içeren türevleri içerir: insan LAG-3 sekansinin amino asit kalintilari 23 ila 448; LAG-3'ün D1 ve D2 alanlarindaki amino asit sekansi; LAG-3'ün D1 ve D2 alanlarinin, asagidaki pozisyonlardan bir ya da daha fazlasinda bir amino asit ornatimi olan amino asit sekansi: ARG'nin GLU ile ornatildigi 73 pozisyonu; ARG'nin ALA veya GLU ile ornatildigi 75 pozisyonu; ARG'nin GLU ile ornatildigi 76 pozisyonu; ASP'nin ALA ile ornatildigi 30 pozisyonu; HIS'nin ALA ile ornatildigi 56 pozisyonu; TYR'nin PHE ile ornatildigi 77 pozisyonu; ARG'nin ALA ile ornatildigi 88 pozisyonu; ARG'nin ALA ile ornatildigi 103 pozisyonu; ASP'nin GLU ile ornatildigi 109 pozisyonu; ARG'nin ALA ile ornatildigi 115 pozisyonu; LAG-3'ün D1 alaninin, amino asit kalintilari 64 ila 9363'da bir silinme oldugu amino asit sekansi; rekombinant çözünür bir insan LAG-Slg füzyon proteini (IMP321) - insan lgG1 Fc'ye kaynasik hLAG-S hücre disi alanini kodlayan bir plazmitle transfekte edilmis Çin hamsteri yumurtalik hücrelerinde üretilen bir 200-kDa dimer. Bulusa göre ayrica asagidakileri içeren farmasötik bir bilesim saglanmaktadir: (a) LAG-3 proteini veya bunun MHC sinif II moleküllerine baglanabilen bir türevi; (b) antineoplastik maddenin bir platin bazli anti-neoplastik madde veya bir topoizomeraz I inhibitörü oldugu bir anti-neoplastik madde; ve (c) farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici. Bulusa göre ayrica, bir ilaç olarak kullanilmak üzere, bulusun bir birlesik preparasyonunu veya farmasötik bir bilesimi saglanmaktadir. Mevcut bulus ayrica, kanseri önleme, tedavi etme veya iyilestirme için bulusa ait birlesik bir preparasyon veya farmasötik bilesim sunar. Bulusa uygun olarak, bulusa ait birlesik bir preparasyon veya farmasötik bilesimin, kanseri önleme, tedavi etme veya hafifletme amaçli bir ilacin imalatinda kullanimi da saglanmistir. Ayrica, kanserin önlenmesi, tedavi edilmesi veya iyilestirilmesine yönelik bir metotta kullanilmak üzere istemlerden belirtilen bilesim saglanmakta olup, bu bilesim, LAG-3 proteininin veya bunun MHC sinif II molekülleri baglayabilen bir türevinin ve bir anti-neoplastik ajanin, bu tür bir önleme, tedavi veya iyilestirmeye ihtiyaci olan bir hastaya uygulanmasini içerir, içerisinde anti-neoplastik madde bir platin bazli anti-neoplastik madde veya bir topoizomeraz I inhibitörüdür. LAG-3 proteini veya bunun türevi ve anti-neoplastik ajan hastaya sirali olarak uygulanabilmekte olup, yani, LAG-3 proteini veya bunun türevi, anti-neoplastik ajandan önce, sonra veya bununla birlikte uygulanabilir. LAG-3 proteini veya bunun türevi ve anti-neoplastik ajan, hastaya birbirinden 96 saat, 72 saat, 48 saat, 24 saat veya 12 saat arayla uygulanabilir. Alternatif olarak, LAG-3 proteini veya bunun türevi ve anti-neoplastik ajan hastaya birlikte uygulanabilmekte olup, örnegin LAG-3 proteini veya bunun türevi ve anti-neoplastik ajani içeren bir bilesim olarak uygulanabilir veya LAG-3 proteini veya bunun türevi ve anti-neoplastik ajanin ayri dozlarinin eszamanli uygulanmasiyla uygulanabilir. Bazi düzenlemelere göre, LAG-3 proteini veya bunun türevinin çoklu sayida dozlari ve/veya anti- neoplastik ajanin çoklu sayida dozlari hastaya uygulanir. Bazi düzenlemelere göre, LAG-3 proteini veya bunun türevinin bir dozu, anti-neoplastik ajanin iki veya daha fazla dozunun her bir uygulamasindan önce, sonra veya bununla birlikte uygulanir. Örnegin, LAG-3 proteini veya bunun türevinin bir dozu, anti-neoplastik ajanin iki veya daha fazla uygulanabilir. Mevcut bulusa göre kombinasyon terapisinde kullanilan bilesenlerin uygun dozajlarinin seçimi, teknikte uzman kisi tarafindan, örnegin hastanin genel sagligi dahil olmak üzere hastanin gözlenmesi ve kombinasyon tedavisine verilen cevap ile belirlenebilir ve optimize edilebilir. Örnegin, bir hastanin istenen terapötik etkiyi göstermedigi tespit edilirse veya bunun tersine, eger hasta sayisi çok fazla olan veya rahatsiz edici bir siddette olan istenmeyen yan etkilerle karsilasirsa optimizasyon gerekli olabilir. Bulusa göre kombinasyon terapisinde kullanilan bilesenlerin dozlari, kombinasyon halinde bilesenlerin terapötik olarak etkili bir miktarini saglayacak sekilde seçilmelidir. Kombinasyon tedavisinin "etkili bir miktari", kanserle iliskili en az bir patolojik parametrenin azalmasi ile sonuçlanan bir miktardir. Örnegin, bazi düzenlemelerde, kombinasyon terapisinin etkili bir miktari, parametrede kombinasyon terapisi olmaksizin kanserle iliskili olarak beklenen azalmayla karsilastirildiginda, parametrede en az Örnegin, parametre tümör büyümesi olabilir. Mevcut bulusa göre, kombinasyon tedavisi, anti-neoplastik ajan veya LAG-3 proteini veya bunun türevinin terapötik etkisinin, monoterapi olarak anti-neoplastik ajan veya LAG-S proteini veya bunun türevinin etkisiyle karsilastirildiginda arttirilmasi için veya her bir bileseninin istenmeyen veya zararli yan etki riskini önleyerek veya daha da azaltarak elde edilen kombinasyonlarin her bir bileseninin dozunun azaltilmasi için kullanilabilir. Bir düzenlemede LAG-3 proteini veya bunun türevi ve anti-neoplastik ajanin her biri, bir monoterapi olarak her bir bilesik için tipik olarak öngörülen bir doz araliginda olan bir dozda reçete edilir. Bilesikler, ayri dozajlar halinde veya bir kombinasyon dozu halinde verilebilir. Bu tür kombinasyonlar, herhangi bir bilesigin bir monoterapi olarak etkisine kiyasla daha yüksek etkinlik saglar. Baska bir düzenlemede, LAG-3 proteini veya bunun türevi ve anti-neoplastik ajanin her biri, bir monoterapi olarak her bir bilesen için tipik olarak öngörülen bir dozun altinda olan bir dozda, ancak kombinasyon halinde terapötik etkinlige sahip dozlarda reçete edilir. Bilesenler ayri dozajlar halinde veya bir kombinasyon dozu olarak verilebilir. Kombinasyondaki bilesenlerin dozajlari, LAG-3 proteini veya bunun bir türevi ile benzer bir terapötik etkinlik seviyesini veya bir monoterapi olarak anti- neoplastik ajani saglamak için seçilebilir, ancak avantaji, LAG-S proteini veya bunun türevi ve anti- neoplastik ajan, bir monoterapi olarak her bir bilesigin öngörülen dozajlari ile karsilastirildiginda, olumsuz yan etki riskini azaltmasidir. Baska bir düzenlemede, anti-neoplastik ajanin öngörülen dozu, monoterapi için tipik olarak öngörülen bir doz araligi içindedir ve LAG-3 proteini veya bunun türevi, monoterapi için tipik olarak öngörülen bir dozun altindaki bir dozajda verilir. Baska bir düzenlemede, anti-neoplastik ajanin öngörülen dozu, monoterapi için tipik olarak öngörülen bir doz araligin altindadir ve LAG-3 proteini veya bunun türevi, monoterapi için tipik olarak öngörülen bir doz araliginin içindeki bir dozajda verilir. Monoterapi için tipik olarak öngörülen dozun altinda tercih edilen dozajlar, tipik olarak verilen dozun Ayri dozajlarda uygulandiginda, LAG-3 proteini veya bunun türevi ve anti-neoplastik ajan büyük Ölçüde eszamanli olarak uygulanabilir (örnegin, birbirlerinden yaklasik 60 dakika, yaklasik 50 dakika, yaklasik 40 dakika, yaklasik 30 dakika, yaklasik 20 dakika, yaklasik 10 dakika, yaklasik 5 dakika veya yaklasik 1 dakika arayla) veya yaklasik 1 saat, yaklasik 2 saat, yaklasik 4 saat, yaklasik 6 saat, yaklasik 10 daha fazla aralikli olarak uygulanabilir. Uzman kisi, LAG-3 proteininin özel bir kombinasyonuna veya bunun türevine ve anti-neoplastik ajana bagli olarak sirali uygulama için uygun bir zaman seyrini belirleyebilir ve optimize edebilir. Süreç tercihen, en az bir yararli etki, örnegin, LAG-S proteini veya bunun türevinin veya anti-neoplastik ajanin bir gelistirme etkisi veya kombinasyon bilesenlerinin bir ortak gelistirme etkisi, örnegin toplamsal etkiden fazla bir etki, ilave avantajli etkiler, daha az yan etkiler, daha az toksisite veya kombinasyon bilesenlerinden bir veya her ikisinin etkili olmayan bir dozajiyla karsilastirildiginda birlesik bir terapötik etki ve çok tercihen kombinasyon bilesenlerinin bir sinerjisi olacak sekilde seçilir. Optimum zaman diliminin, uygulamadan sonra ulasilacak olan bilesigin tepe plazma konsantrasyonu için geçen zaman ve her bir bilesigin eliminasyon yari ömrü gibi faktörlere bagli olacagi takdir edilecektir. Tercihen zaman farki, uygulanacak ilk bilesenin yari ömründen daha azdir. Uzman kisi ayrica uygulama için uygun zamanlamayi belirleyebilecektir. Bazi düzenlemelerde, anti- neoplastik ajan, sabah uygulanabilir ve LAG-3 proteini veya bunun türevi gün içinde daha sonra en az bir kez uygulanabilir. Diger düzenlemelerde, anti-neoplastik ajan ve LAG-S proteini veya bunun bir türevi, büyük ölçüde ayni anda uygulanabilir. Bazi düzenlemelerde, anti-neoplastik ajan, hastaya, örnegin, bir tip doktoru tarafindan uygulanabilir ve hastaya LAG-3 proteini veya bunun türevinin bir dozu, örnegin önceden doldurulmus bir siringa içinde, daha sonra (örnegin, ayni gün içinde daha sonra veya sonraki gün) uygulanmak üzere saglanabilir. Hasta, haftalar, aylar veya yillar boyunca anti-neoplastik ajan ve LAG-3 proteini veya bunun türevinin ay, 11 ay, 1 yil, 2 yil, 3 yil, 4 yil, 5 yil veya daha fazla süreyle alabilir. Tercihen denek, bir memeli denek, daha tercihen bir insan denektir. Bulusa göre tedavi edilebilen kanserlerin örnekleri arasinda meme, yumurtalik, akciger, kafa, boyun, endometrial, özefageal, mesane, servikal, osteojenik sarkom, kolon, kolorektal kanser, Ienfoma ve merkezi sinir sistemi veya germ hücre tümörleri bulunur. Genel olarak, bulusun bir kombinasyonunun veya bulusun bir bilesiminin bilesenleri, bilinen yollarla, uygun herhangi bir formülasyonda, uygun herhangi bir yolla uygulanabilir. Bazi düzenlemelerde, LAG- 3 proteini veya bunun türevi, parenteral olarak uygulanir (deri alti, intravenöz veya intramüsküler enjeksiyon dahil). Bazi düzenlemelerde, anti-neoplastik madde intravenöz olarak uygulanir. Belirli düzenlemelerde, LAG-3 proteini veya bunun türevi subkütanöz olarak uygulanir ve anti-neoplastik ajan intravenöz olarak uygulanir. Uygun farmasötik bilesimler ve dozaj formlari, farmasötik formülasyon alaninda uzmanlar tarafindan bilinen ve ilgili metinler ve literatürde, örnegin Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Easton, Pa.: Mack Publishing Co., 1995) belgesinde açiklanan geleneksel yöntemler kullanilarak hazirlanabilir. Bulusun kombinasyonlarini veya bilesimlerini, uygulama kolayligi ve dozajin tek biçimliligi için birim dozaj formunda formüle etmek özellikle avantajlidir. Burada kullanildigi sekliyle "birim dozaj formlari" terimi, tedavi edilecek bireyler için tekli dozajlar olarak uygun fiziksel olarak ayri birimler anlamina gelir. Yani bilesimler, her biri önceden belirlenmis, "birim dozaj" miktarini, istenen farmasötik tasiyici ile birlikte istenen terapötik etkiyi üretmek üzere hesaplanan bir aktif ajan miktarini içeren ayri dozaj birimleri halinde formüle edilir. Bulusun birim dozaj formlarinin spesifikasyonlari, teslim edilecek aktif ajanin benzersiz özelliklerine baglidir. Dozajlar ayrica normal doza ve bilesenlerin verilis sekline referansla belirlenebilir. Dikkat edilecegi üzere, bazi durumlarda, iki veya daha fazla ayri dozaj birimi, kombinasyon halinde aktif ajanin terapötik olarak etkili bir miktarini saglamakta olup, örnegin, iki tablet veya kapsül, birlikte alindiklarinda, her bir tablet veya kapsüldeki birim dozajin, terapötik olarak etkili miktarin yaklasik olarak %SO'si kadar oldugu bir terapötik olarak etkili dozaj saglayabilir. Parenteral uygulamaya yönelik bulusa uygun preparasyonlar, steril sulu ve susuz çözeltileri, süspansiyonlari ve emülsiyonlari içerir. Enjekte edilebilir sulu çözeltiler, aktif maddeyi suda çözünür formda içerir. Susuz çözücüler veya vehiküllerin `örnekleri arasinda sabit yaglar, örnegin zeytin yagi ve misir yagi, sentetik yag asidi esterler, örnegin etil oleat veya trigliseritler, düsük moleküler agirlikli alkoller, örnegin propilen glikol, sentetik hidrofilik polimerler, örnegin polietilen glikol, Iipozom ve benzerleri bulunur. Parenteral formülasyonlar ayrica çözündürücüler, koruyucular, islatici maddeler, emülgatörler, dagiticilar ve dengeleyiciler gibi adjuvanlar içerebilir ve sulu süspansiyonlar, sodyum karboksimetil selüloz, sorbitol ve dekstran gibi süspansiyonun viskozitesini artiran maddeler içerebilir. Enjekte edilebilir formülasyonlar, bir sterilize edici ajanin dahil edilmesi, bir bakteri tutucu filtreden süzme, radyasyona maruz birakilma veya isi yoluyla steril hale getirilebilir. Steril enjekte edilebilir bir ortam kullanilarak da üretilebilirler. Etken madde ayrica, enjeksiyon yoluyla uygulamadan hemen önce uygun bir vehikülle yeniden sulandirilabilen, örnegin Iiyofilize edilmis formda da olabilir. Daha önce tarif edilen formülasyonlara ek olarak, aktif madde, aktif maddenin kontrollü salimi, tercihen uzun bir süre boyunca sürekli salimi için bir depo preparati olarak formüle edilebilir. Bu sürekli saliverme dozaj formlari genellikle implantasyonla (örnegin subkütanöz olarak veya intramüsküler olarak veya intramüsküler enjeksiyonla) uygulanir. Bulusun birlesik preparasyonlari, kombinasyon halinde bilesenlerin uygulanmasi için talimatlarla birlikte paketlenebilir. Talimatlar uygun bir kayit ortami veya substrat üzerine kaydedilebilir. Örnegin, talimatlar kagit veya plastik gibi bir alt tabaka üzerine basilabilir. Talimatlar, bir kabin veya bunlarin bilesenlerinin etiketinde bir paket eki olarak mevcut olabilir (yani, paketleme veya alt paketleme ile iliskili). Diger düzenlemelerde, talimatlar uygun bir bilgisayar tarafindan okunabilen depolama ortaminda, örnegin CD-ROM'da, diskette bulunan bir elektronik depolama veri dosyasi olarak mevcuttur. Birlestirilen preparasyonlarin bir kismi veya tamami, steriliteyi korumak için uygun bir ambalajda paketlenebilir. Bulusun düzenlemeleri, ekteki çizimlere atifta bulunularak asagidaki örneklerde tarif edilmistir: Sekil 1, LAG-3 türevinin ve Topotekanin kanser tedavisinde uygulanmasinin etkisini göstermektedir; Sekil 2, LAG-3 türevinin ve Karboplatinin kanser tedavisinde uygulanmasinin etkisini göstermektedir; Sekil 3, kanser tedavisinde (A) bir LAG-3 türevi ve Karboplatin veya (B) bir LAG-3 türevi ve Oksaliplatinin uygulanmasinin etkisini göstermektedir; Sekil 4, bir LAG-3 türevinin ve Oksaliplatinin kanser tedavisinde uygulanmasinin etkisini göstermekte olup: (A) tümör büyüklügü üzerindeki etkisini gösterir ve (B) hayatta kalma üzerindeki etkisini gösterir; Sekil 5, immünoglobulin Fc (IgFc) sekansina kaynasik LAG-3 proteini türevlerinin bir gösterimini göstermektedir; Sekil 6, LAG-3 türevlerinin MHC sinif lI-pozitif hücrelere baglanmasini göstermektedir; Sekil 7, bir LAG-3 türevinin MHC sinif Il-pozitif hücrelere baglanmasinin, LAG-3'ün MHC sinif Sekil 8, THP-1 hücrelerinin CCL4 salgilanmasi ile belirlenen LAG-3 türevleri tarafindan aktivasyonunu göstermektedir; Sekil 9, THP-1 hücrelerinin, TNF-d salgilanmasi ile belirlenen LAG-3 türevleri ile aktivasyonunu gösterir; Sekil 10, LAG-3'ün MHC sinif II moleküllerine baglanmasini bloke eden antikorlar tarafindan LAG türevine bagli monosit aktivasyonunun inhibisyonunu gösterir; Sekil 11, antijen sunan hücrelerin (APC'Ier) LAG-3 türevleri tarafindan aktivasyonunu gösterir; Sekil 12, CD8-pozitif T hücrelerinin LAG-3 türevleri ile aktivasyonunu gösterir; ve Sekil 13, olgun insan LAG-3 proteininin amino asit sekansini göstermektedir. Dört hücre disi lg süper aile alani: amino asit kalintilarindadir. Insan LAG-3 proteininin D1 bölgesinin ekstra halka yapisinin amino asit sekansi kalin harflerle gösterilmistir. LAG-3 türevinin ve bir topoizomeraz I inhibitörünün kanser tedavisinde uvqulanmasindaki Kolorektal adenokarsinom hücre sekansi CT26 kullanilarak bir murin singeneik (genetik olarak es) cilt tümör modeli olusturulmustur. Gün O'da, tümör hücrelerinin minimum tümörijenik dozunun (MTD) (0,5 x 105 hücre) çeyregi dört grup BALB/c farelerinin (5 haftalik) sag yanindan subkütanöz (5.0) enjeksiyonla implant edilmistir. Farelere fosfat tamponlu salin (PBS) (Grup 1 fareler), LAG-3 türevi IMP, IMP321 ve Topotekan (Grup 3 fareler) veya tek basina Topotekan (Grup 4 fareler) asagidaki plana göre enjekte edilmistir: Tümör büyümesi, kumpaslar kullanilarak iki dikey tümör çapi ölçülerek haftada iki kez izlenmistir. Sonuçlar Sekil 1'de gösterilmistir. Tümör boyutu mm2 cinsinden enine kesit alani anlamina gelmektedir. Sonuçlar IMP321'in tek basina tümör büyümesi üzerinde bir etkisinin olmadigini, topotekanin tümör büyümesini azaltmada bazi etkileri oldugunu, ancak IMP321 ve topotekan ile kombine tedavinin daha büyük (yani sinerjistik) bir etkiye sahip oldugunu göstermektedir. LAG-3 türevi ve platin bazli bir anti-neoplastik ajgnin kanser tedavisinde uvqulanmasinin etkisi Lenfoma hücre hatti EL4 kullanilarak bir murin sinjeneik cilt tümör modeli olusturulmustur. Gün 0'da, tümör hücrelerinin minimum tümörijenik dozu (MTD) (5 x 105 hücre) CSTBIIG farelerinin (5 haftalik) sag yanindan subkütanöz (s.c) enjeksiyonla implant edilmistir. Farelere, asagidaki çizelgeye göre fosfat tamponlu salin (PBS) (Grup 1 fareler), IMP, IMP321 ve Karboplatin (Grup 3 fareler) veya sadece Karboplatin (Grup 4 fareler) enjekte edilmistir: Tümör büyümesi, kumpaslar kullanilarak iki dikey tümör çapi ölçülerek haftada iki kez izlenmistir. Sonuçlar, Sekil 2'de gösterilmistir. Tümör boyutu mm2 cinsinden enine kesit alani anlamina gelmektedir. Sonuçlar, IMP321'in tek basina tümör büyümesi üzerinde bir etkisinin olmadigini, sadece karboplatinin çok az etkisinin oldugunu, ancak IMP321 ve karboplatin ile kombine tedavinin, tümör büyümesini azalttigini ve böylece kombine uygulamanin sinerjik bir etkisini gösterdigini gösterir. LAG-3 türevi ve farkli platin bazli anti-neoplastik aianlarin kanser tedavisinde uvqulanmasinin Lenfoma hücre hatti EL4 kullanilarak bir murin sinjeneik cilt tümör modeli olusturulmustur. Gün O'da, tümör hücrelerinin minimum tümörijenik dozu (MTD) (5 x 105 hücre) CSTBl/6 farelerinin (5 haftalik) sag yanindan subkütanöz (s.c) enjeksiyonla implant edilmistir. Farelere, asagidaki çizelgeye göre fosfat tamponlu salin (PBS) (Grup 1 fareler), IMP, IMP321 ve Karboplatin (Grup 3 fareler), sadece Karboplatin (Grup 4 fareler), IMP321 ve Oksaliplatin (Grup 5 fareler) veya sadece Oksaliplatin (Grup 6 fareler) enjekte edilmistir: mg/ml), arti G6 ve G10'da Oksaliplatin i.p. enjeksiyonu (54 pg, 3 mg/kg); Grup 6 (10 fare): G6 ve G10'da Oksaliplatin i.p. enjeksiyonu (54 ug, 3 mg/kg). Tümör büyümesi, kumpaslar kullanilarak iki dikey tümör çapi ölçülerek haftada iki kez izlenmistir. Sonuçlar Sekil 3A'da (Karboplatin için) ve Sekil BB'de (Oksaliplatin için) gösterilmektedir. Tümör boyutu mm2 cinsinden enine kesit alani anlamina gelmektedir. Sonuçlar, IMP321'in tek basina çok az etkisinin oldugunu veya herhangi bir etkisinin olmadigini, tek basina karboplatinin bir miktar etkisinin oldugunu ve IMP321 ve karboplatin ile kombine tedavinin daha büyük (yani sinerjistik) bir etkiye sahip oldugunu göstermektedir. Tek basina oksaliplatin bir etkiye sahiptir, ancak IMP321 ve oksaliplatin ile kombine tedavi daha büyük (yani sinerjistik) bir etkiye sahip olup, tümör büyümesi 17. günde tamamen inhibe edilmistir. LAG-3 türevi ve platin bazli bir anti-neoplastik gjgnm kanser tedavisinde uvqulanmasinin etkisi C38 kolon adenokarsinom tümör modelinde LAG-3 türevi IMP321 (ayrica hLAG-3Ig olarak da adlandirilir) ve oksaliplatin ile kombine islemin etkisi degerlendirilmistir. Bu modelde, tümör parçalari cerrahi olarak subkutan olarak implante edilir. Tedavi baslandiginda (Gün 12'de, ortalama tümör hacmi 200 mm3 oldugunda), tümör nispeten olgundur ve böylece gerçek hayattaki tümörler için iyi bir model saglar. Fare kolonu 38 (C38) tümör fragmanlari, Kanser Tedavisi, Tümör Deposu, NCI (Frederick, MD, ABD) Bölümünden dondurulmus halde elde edilmistir. 038 fragmanlari, DMSO/SVF/RPMI 1640 ortaminda (10/10/80) dondurularak kullanilana kadar sivi azot içinde depolanmistir. Parçalar 37 °C'de 5 dakika boyunca eritilmis, farelere subkutan (SC) implantasyonundan önce RPMI 1640 ortaminda iki kez çalkalanmistir. C38 tümörleri seri olarak 057BI/6 farelerinde transplante edilmistir. edilmistir. Tümör boyutlari 500-1000 mm3'e ulastigi zaman, tümörler cerrahi eksizyon yapilmis ve küçük C38 tümör fragmanlari (20-30 mg), subkütanöz olarak, alici CSYBL/ö farelerinin sag tarafina im plante edilmistir. Tümörler 200-300 mm3 ortalama hacme ulastiklarinda tedavi baslamistir. Tedavi programi asagidaki Grup 1 (10 fare): arka arkaya 4 hafta boyunca haftada bir kez SC PBS enjeksiyonu; Grup 2 (10 fare): arka arkaya 4 hafta boyunca 5 mg/kg/enjeksiyon düzeyinde haftada bir kez Grup 3 (10 fare): arka arkaya 4 hafta boyunca haftada bir kez 20 ug IMP321 enjeksiyonu; Grup 4 (10 fare): arka arkaya 4 hafta boyunca, haftada bir kez 5 mg/kg/enjeksiyon düzeyinde oksaliplatin ile kombinasyon halinde 20 pg IMP321'in haftada bir kez SC enjeksiyonu. Farkli gruplar 200 mms'lük bir ortalama tümör hacmine sahip oldugunda tedavi 12. günde (G12) mm3'lük bir maksimum hacme sahip oldugu zaman hayvanlar öldürülmüstür: Grup lslem Doz Uygulama yolu Tedavi programi 1 PBS - SC Q7Dx4 2 Oksaliplatin 5 mg/kg/eni IV Q7Dx4 3 IMP321 20 ug/fare/enj SC Q7Dx4* 4 Oksaliplatin 5 mg/kg/enj IV Q7Dx4 oksaliplatin ile islemden bir gün sonra yapilmistir Sonuçlar, Sekil 4A'da gösterilmistir. Sonuçlar, IMP321'in tek basina tümör büyümesini geciktirmede etkisi olmadigini göstermektedir. Oksaliplatin hafif bir etkiye sahiptir. Oxaliplatin ve IIVIP321'in kombinasyonu daha büyük bir etkiye sahiptir. Ayni sinerjik etki, Sekil 4B'de gösterilen hayatta kalma egrilerinde görülür. LAG-3 türevlerinin MHC sinif lI-pozitif hücrelere baglanmasi Birkaç LAG-3 türevi, MHC sinif II pozitif hücrelere baglanma yetenekleri açisindan test edilmistir: i) bir birinci baglayici (LAG-3 D ile immünoglobulin Fc (lg Fc) sekansina baglanan LAG-3'ün D1-D4 alanlari; ii) ikinci bir baglayiciyla (LAG-3 D, lg FC sekansina baglanan LAG-3'ün D1-D4 alanlari; iii) ikinci baglayici (LAG-3 D tarafindan lg Fc sekansina baglanan LAG-3'ün D1 ve D2 alanlari; ve iv) birinci baglayicinin lg Fc sekansina baglanan LAG-S'ün D1-D4 alanlari, ancak LAG-3'ün D1 alaninin MHC sinif II baglama bölgesinde, R75 pozisyonunda (R75A), MHC sinif II moleküllere baglanmayi üç kat veya daha fazla oranda gelistiren bir mutasyon bulunur (Huard ve ark., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, . Türevler Sekil 5'te gösterilmektedir. MHC sinif Il + Raji hücreleri, LAG-3 türevlerinin çesitli konsantrasyonlarinda veya negatif bir kontrol olarak bir insan IgG1 antikoru (hlgG1) ile 4 °C`de 45 dakika boyunca inkübe edilmistir. Hücre yüzeyine bagli LAG-3 molekülleri, bir FITC konjuge keçi anti-fare lg (Coulter) ile açiga çikarilmistir. Hücreler akis sitometrisi ile analiz edilmistir. Floresan yogunlugu birimleri olarak ifade edilen sonuçlar, Sekil 6`da gösterilmistir. Sonuçlar, tüm LAG-3 türevlerinin MHC sinif II-pozitif hücrelere bagli oldugunu göstermektedir. LAG-3 türevi IMP321'in MHC sinif Il-pozitif hücrelere. LAG-3'ün MHC sinif ll moleküllerine baglanmasini bloke eden antikorlarla bag lanmasinin inhibisyonu 1784 ve 11E3, LAG-3`ün MHC sinif ll moleküllerine baglanmasini bloke ettigi bilinen anti-LAG-3 monoklonal antikorlaridir. Bir IMP MHC sinif II-pozitif B hücrelerine (Raji hücreleri) baglanmasi, konjügatin 1784 veya 11E3 bloke edici antikorla veya bir izotip eslesmis negatif kontrol monoklonal antikorla (mIgG1) ön inkübasyonunun (4 ug/ml, 4 °C) ardindan belirlenmistir. Hücreye bagli flüoresansin analizi flüoresansla aktiflestirilmis hücre siniflandirma (FACS) kullanilarak yapilmistir. Sonuçlar Sekil 7'de gösterilmektedir. Sonuçlar, IMP321'in Raji hücrelerine baglanmasinin, LAG-3'ün MHC sinif Il moleküllerine baglanmasini bloke eden LAG-3'e özgü monoklonal antikor tarafindan inhibe edildigini gösterir. LAG-3 türevleri ile monositlerin aktivasyonu THP-1 hücreleri, 4 °C'de 4 saat boyunca, Sekil 5'te gösterilen LAG-3 türevleri veya negatif kontrol olarak insan IgG1 ile inkübe edilmistir. Kemokin CCL4 ve sitokin Tümör Nekroz Faktörü-d, TNF-oi'nin THP-1 hücreleri tarafindan salgilanma miktari belirlenis ve bir monosit aktivasyonu ölçüsü olarak kullanilmistir. CCL4 ve TNF-a salgilanmasi, bir Sitometrik Boncuk Sekansi (Cytometric Beads Array) kullanilarak hücre süpernatanlarinda ölçülmüstür. CCL4 tespitlerinin sonuçlari, Sekil 8'de ve TNF-d tespitlerinin sonuçlari, Sekil 9'da gösterilmistir. Sonuçlar, LAG-3 türevlerinin THP-1 monositik hücrelerini aktive edebildiklerini göstermektedir. baglanmasini bloke eden antikorlar tarafindan inhibisyonu 11E3 antikoruyla (+37 °C'de) önceden inkübe edilmistir. Monosit aktivasyon seviyesini belirlemek için THP-1 hücreleri tarafindan CCL4 salgilanma miktari kullanilmistir. Iki deneyin sonuçlari, Sekil 10'da gösterilmistir. Sonuçlar, IMP321'in neden oldugu monosit aktivasyonunun bloke edici anti-LAG-3 mAbs 1784 ve 11E3 tarafindan inhibe edildigini gösterir. Bu, IMP321'in monositleri aktive etme yeteneginin, Primer antiien sunan hücrelerin (APC'Ier) LAG-3 türevleri ile aktivasyonu Insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC'Ier), 4 saat boyunca, Sekil 5'te gösterilen LAG-3 türevleri veya bir salgi inhibitörü olan brefeldin varliginda, negatif bir kontrol olarak insan IgG1 ile inkübe edilmistir. PBMC'Ierde bulunan APC'Ierin sitokin tepkisi, Th1 ve CDs-pozitif yaniti destekledigi bilinen bir kemokin olan CCL4'ün hücre içi boyanmasi ve tümörijenezi dogrudan engelleyen çok islevli bir sitokin olan TNF-or ile belirlenmistir. Sonuçlar sitometri ile analiz edilmistir. MHC sinif II-pozitif hücrelerde CCL4 ve/veya TNF-ci ifade eden hücrelerin yüzdesiyle temsil edilen sonuçlar, Sekil 11'de gösterilmektedir. Sonuçlar, test edilen tüm LAG-3 türevlerinin CCL4 ve TNF-d üretimini indükledigini göstermektedir. T hücrelerinin LAG-3 türevleri ile aktivasyonu Insan PBMC'Ieri, Sekil 5'te gösterilen LAG-3 türevleri ile veya negatif kontrol olarak insan IgG1 ile 18 saat boyunca inkübe edilmistir. Brefeldin, inkübasyonun son 16 saatinde mevcut olmustur. LAG-3 türevlerine 18 saat maruz kaldiktan sonra CD8+ pozitif T hücrelerinin sitokin tepkisi, CCL4, IFN-v ve TNF-d'nin hücre içi boyanmasi ile takip edilmis ve sitometri ile analiz edilmistir. CD3 pozitif/CDS pozitifT hücrelerinde CCL4, IFN-y ve/veya TNF-d ifade eden hücrelerin yüzdesi olarak gösterilen sonuçlar, Sekil 12'de gösterilmistir. Sonuçlar, test edilen tüm LAG-3 türevlerinin Tip 1 sitotoksik CDs-pozitif T hücrelerinin (Tc1 hücreleri) aktivasyonunu indükledigini göstermektedir. APC'Ier tarafindan ifade edilen MHC sinif II moleküllerine baglanma yoluyla, LAG-3 türevlerinin Tc1 hücrelerinin aktivasyonunu indükledigi sonucuna varilmistir. Tc1 hücrelerinin aktivasyonu, ana anti-tümör immün tepkisini olusturur. TR TR TR TR TR TR TR