TW200423933A - Dosage forms and methods of treatment using VEGFR inhibitors - Google Patents

Description

200423933 玖、發明說明·· 本專利申請案申請的是於2003年4月3曰提出申請之美國 #申凊案第6〇/460,695號以及於2003年7月31日提出申嘖 之吴國臨時申請案第60/491，77 1號，其中所揭示之内容皆以 王文引用的方式併入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本發明提供式1化合物··

或其醫藥上可接受之鹽類、 、溶劑合物或前藥之劑型。本發

生長（如癌症）之方法。 【先前技術】 本發明係關於一可 可用於哺乳動物體内之VEGFR抑制劑，

方法，及含有該化合物之醫藥組合物

如症）之治療。本發明亦關 (特別是人類）之異常細胞 醫藥組合物。 硫 91828.doc 200423933

為在大腸癌、黑色瘤、乳癌和肺癌之異種移植物（xenograft) 模型中具有廣泛潛伏期活性之VEGFR/PDGFR酪胺酸激酶 的有效及具選擇性抑制劑（Hu-Lowe D，Heller，D，Brekken J， Feeley R，Amundson K，Haines M，Troche G，Kim Y，Gonzalez D，

Herrman M，Batugo M，Vekich S，Kania R，McTigue M，Gregory S， Bender S， Shalinsky D.， Pharmacological Activities of AG013736, a Small Molecule Inhibitor of VEGF/PDGF Receptor

Tyrosine Kinases; Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2002: abstract #5357)。利用動力性對比強化MRI(dceMRI)測得之潛伏期腫 瘤血管反應顯示符合腫瘤生長指數（Wilmes LJ，Hylton NM， Wang D，Fleming LM Gibbs J，Kim Y，Dillon R，Brasch RC， Park JW，Li K-L，Henry RG，Partridge SC，Shalinsky DR， Hu-Lowe D，McShane TM，and Pallavicini MG·，AG013736，a Novel VEGFR TK Inhibitor, Supresses Tumor Growth and Vascular Permeability in Human BT474 Breast Cancer Xenografts in Nude Mice?,; Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2003: Abstract #3772·) 〇 【發明内容】 本發明提供利用式1之化合物之劑型及治療方法： 9l828.doc 200423933

[2-(吼唆-2-基）乙烯基]0弓|。坐。 在-具體實例中’本發明提供用以投藥予哺乳動物之劑 型，此劑型包含式1之化合物 劑合物或前藥，或其混合物 、醫藥上可接受之鹽類、其溶 此為在給藥予一哺乳動物之 後，以一有效量提供一 24小時Auc血漿值不超過45〇〇叫· hr/mL之式1化合物，或其活性代謝物。24小時auc血漿值 可如本文實施方式中所描述之方法來加以決定。 在本具體貫例之特定方面中，24小時AUC血漿值之上限 不超過4000 ng.hr/mL或不超過3⑽〇叫化二或不超過25〇〇 ng · hr/mL或不超過2000 ng · hr/m]L或不超過15〇〇吨· hr/mL或不超過looo ng · hr/mL或*超過8〇〇叫·心/社或 不超過700 ng· hr/mL。較佳為結合上述之任何上限，以小 時AUC血漿值為至少10 %· hr/mL或至少25 ng· hr/mL或 至少 50 ng · hr/mL 或至少 75 ng · hr/mL 或至少 100 ng · hr/mL或至少125 ng · hr/mL。24小時AUC血漿值之預期範 圍包括從上述較低限之任何值至上述較高限之任何值。特 定而言，較佳範圍之非限制實例包括從25至4500 ng · hr/mL、從 50至 2500 ng · hr/mL、從 75至 1000 ng · hr/mL、 從 100 至 800 ng· hr/mL和從 125 至 700 ng · hr/mL。 9l828.doc 200423933 在另一具體實例中，本發明提供一劑型包含如上述定義 之式1化合物、一醫藥上可接受之鹽類、其溶劑合物或前 藥，或其混合物，其量不超過3〇mg。應了解，當所有或部 分化合物係以一鹽類、溶劑合物或前藥之劑型給藥時，其 里為與式1之化合物等量，此已經由一熟習此項技藝者以莫 耳質量為基準計算而得。 在本實例之特定方面中，此量之上限不超過20 mg或不超 過15 rng或不超過12 mg或不超過1〇 mg或不超過8 mg或不 超過7 mg。較佳地，是結合任何上述之上限，此量為至少 〇·5 mg或至少1 mg或至少15 mg或至少2 mg或至少2·5 或 至少3 mg。預期範圍包括從上述較低限之任何值至上述較 问限之任何值。特定而言，較佳範圍之非限制實例包括從 〇·5 至 30 mg、從 1至 2〇 mg、從 15至 15 mg、從 2至 1〇 mg、從 2.5 mg至 8 mg和從 3 至 7 mg。 本發明更利用給藥予一哺乳動物如上定義之式1化合 物、一醫藥上可接受之鹽類、其溶劑合物或前藥或其混合 物’提供治療哺乳動物（包括人類）異常細胞生長之方法，此 為在給藥予一哺乳動物之後，以一有效量提供一 24小時 AUC血漿值不超過4500 ng.hr/mL之式1化合物，或其活性 代谢物。24小時AUC血聚值可如本文實施方式中所描述之 方法來加以決定。 在本具體實例之特定方面中，24小時AUC血漿值之上限 不超過4000 ng*hr/mL或不超過3000 ng/mL或不超過2500 ng · hr/mL 或不超過 2000 ng · hr/mL 或不超過 1500 ng · 91828.doc -9- 200423933 hi7mL或不超過looo ng · ^/社或不超過8〇〇 · h/社或 不超過700 ng· hr/mL。較佳地，是結合上述之任何上限， 24小時AUC血漿值為至少10 ng · hr/mL或至少25叩· hr/mL或至少50 ng · hr/mL或至少乃吨· hr/mL或至少 l〇〇ng · hr/mL或至少 125 ng · hr/mL·。24 小時 AUC血漿值之 預期fe圍包括從上述較低限之任何值至上述較高限之任何 值。特疋而吕，較佳範圍之非限制實例包括從25至45⑻吨 • hr/mL、從 50 至 2500 ng · hr/mL、從 75至 1000 ng · hr/mL、 從 100至 800 ng · hr/mL和從 125至 700 ng · hi7mL。 在另一具體實例中，本發明提供一劑型包含如上述定義 之式1化合物、一醫藥上可接受之鹽類、其溶劑合物或前 藥，或其混合物，每次劑量不超過3〇mg。應了解，當所有 或部分化合物係以一鹽類、溶劑合物或前藥之劑型給藥 時，其量為與式1之化合物等量，此已經由一熟習此項技藝 者以莫耳質量為基準計算而得。 在本貫例之特定方面中，此量之上限不超過2〇 mg或不超 過15 mg或不超過12 mg或不超過1〇 mg*不超過8 mg或不 超過7 mg。較佳地，是結合任何上述之上限，此量為至少 〇·5 mg或至少1 mg或至少15 mg或至少2叫或至少2 5邮或 至少3 mg。預期範圍包括從上述較低限之任何值至上述較 问限之任何值。特定而言，較佳範圍之非限制實例包括從 〇·5 至 3〇 mg、從 1至 20 mg、從 1.5 至 15 mg、從 2至 10 mg、從 2.5 mg 至 8 mg 和從 3至 7 mg。 91828.doc -10- 200423933 在本文描述之發明方法之任何特定實例中，異常細胞生 長為癌症，包括（但不限於）肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、 '㊉或4癌皮膚黑色素瘤或眼球内黑色素瘤、子宮癌、 印巢癌、直腸癌、肛門部位之癌症、胃癌、大腸癌、乳癌、 輸印管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、陰道癌、女陰癌、霍 吉金氏病（Hodgkin's Disease，惡性淋巴肉芽腫）、食道癌、 小腸癌、内分泌系統癌、甲狀腺癌、@甲狀腺癌、腎上腺 癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急 性白血病、淋巴細胞淋巴瘤、膀胱癌、腎臟癌或輸尿管癌、 腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS)資瘤、主要⑽淋 巴瘤、脊髓中軸腫冑、腦幹神經膠瘤' 腦下垂體腺瘤、或 一或多種前述癌症之組合。在該方法之另一實例中，該異 :細胞成長為良性增生性疾病，包括(但不限於)乾癖、良性 攝護腺肥大症或傷疤組織重建。 在另-具體實财，本發明制給藥予—哺乳動物一治 療性可接受量之式合物’提供哺乳動物一抑制ρ_ BB調節癌細胞轉移之方法。 在另一實例中，本發明利用給藥予一 ^ 带丁 唷礼動物一治療性 可接受置之式1化合物，提供哺多丨說％ 初敌t、醇礼動物一抑制^套組活性之 方法。

在本文描述之發明方法之任何特定實例中，此方法更告 含給予哺乳動物-或多種藥物量’此藥物係選自抗編 物、抗血管生成藥物、信號傳送抑制劑和抗增生劑，該量 能共同有效治療該異常細胞之生長，藥物包括揭示在PC 91828.doc -11 - 200423933 公告第 WO 00/38715號、第 WO 00/387 16號、第 00/38717號 、第 WO 00/38718號、第 WO 00/38719號、第 WO 00/38730號 、第 WO 00/38665號、第 WO 00/3 71 07號以及第 WO 00/38786 號中之該等物質，其中所揭示之内容係以全文引用之方式 併入本文中。 抗腫瘤藥物之實例包括有絲分裂抑制劑，例如長春鹼衍 生物，例如維柏拉斯汀長春驗（vinblastine)、長春瑞賓 (vinorelbine)、維德辛長春驗（vindescine)和長春新鹼 (vincristine);秋水仙鹼（c〇lchines)、異膽秋水仙鹼 (allochochine)、鹽軟骨素（halichondrine)、N -苄醯基三曱基 —甲基醚秋水仙酸、度爾絲達；:丁 1 〇(dolastatin 1 0)、黴史坦 辛（maystansine)、根素（rhizoxine)、紫杉醇（taxanes)例如太 平洋紫杉醇（TaxolTM)、多西紫杉（docetaxel)(TaxotereTM)、 2’-N-[3-(二曱基胺基）丙胺]麩胺酸鹽（TaxolTM衍生物）、硫秋 水仙鹼、三苯甲基半胱胺酸、替泥泊苷（teniposide)、胺基 甲基葉酸、硫唾嗓σ令、氟尿喊唆（fluorouricil)、胞嘴σ定阿拉 伯糖苷、2’2’-二氟去氧胞苷（gemcitabine)、阿德利亞黴素 (adriamycin)(俗稱小紅莓）和米塔徽素（mitamycin)。烧基化 劑例如順鉑、卡鉑、氧鉑、異丙鉑、N-乙醯-DL-肌胺酸基 -L-白胺酸[阿莎利（Asaley)或阿莎雷斯（Asalex)]之乙g旨、 1，4-環己二烯-l，4-二胺基甲酸、2,5-雙（1-吖丙烷基）-3, 6-二 氧-醋、二乙酯（地吖醌）、1，4-雙（甲磺醯氧）丁烷（二磺胺或 白石黃胺）氣臭氧托辛（chlorozotocin)、克羅門松 (clomesone)、氰嗎淋（cyanomorpholinodoxorubincin)、環二 91828.doc -12- 200423933 权（cyclodisone) 一 脫水葛萊替托（dianhydroglactitol)、氟 多潘（fluorodopan)、絲裂黴素c、海甘宋絲裂黴素c (hycantheonemitomycin c)、絲裂唑醯胺（mit〇z〇lamide)、 1-(2-氣乙基）-4-(3-氣丙基）哌畊二氣化氫、哌畊二酮、哌泊 '/臭烧、晋法洛黴素（porfiromycin)、螺乙内醯脲芥 (spirohydantoin mustard)、替囉昔隆（ter〇xir〇ne)、四鉑、塞 替派（thiotepa)、三乙烯蜜胺、尿嘧啶氮芥、雙甲磺醯基 丙基）胺氯化氫、絲裂徽素（mitomycin)，亞硝脲劑例如環己 基一氣乙基亞硝脲、甲基環己基一氯乙基亞硝脲1β(2-氯乙 基）-3-(2,6-二氧-3-哌啶基）-1_亞硝脲、雙氯乙基）亞硝 脲、丙卡巴肼（procarbazine)、達卡巴肼（dacarbazine)、氮芥 相關化合物’例如氯乙基甲胺（mechi〇roethamine)、異環填 酰胺（ifosamide)、美法侖（meiphalan)、苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、雌莫司、;丁 填酸鈉（estramustine sodium phosphate)、鏈左因（strptozoin)和替莫唾胺（temozolamide) 。DNA抗代謝產物例如5 -氟尿。密咬、胞嘴。定阿拉伯糖苷、 經基尿素、2-[(3羥基-2-°比喏啶基）甲烯]-肼碳硫醯胺、去氧 氟尿苷、5-羥基-2-曱醯基吡啶硫半卡腙、α-2，-去氧-6-硫鳥 糞°票呤核普、甘胺酸虫牙腸徽素（aphidicolin glycinate)、5 -氮 去氧胞嘧啶核苷、β-硫鳥糞嘌呤去氧核酸糖苷、環胞嘧啶 核皆、曱脒峻（guanazole)、肌核苦甘二酸（inosine glycodialdehyde) 、馬貝辛 II(macbecin II)、°比 σ圭口米吐（pyrazolimidazole)、克 拉利負（cladribine)、喷司他丁（pentostatin)、硫鳥嗓吟 (thioguanine) > 巯嘌呤（mercaptopurine)、平陽黴素 9l828.doc -13 - 200423933 (bleomycin)、2-氯去氧腺苷酸，胸苷酸合成酶抑制劑例如 雷替曲塞（raltitrexed)和培美曲塞二鈉（pemetrexed disodium；) 、克羅法拉賓（clofarabine)、氟尿苷（fl〇xUridine)和氟達拉 濱（fludarabine)。DNA/RNA抗代謝物，例如左旋阿拉諾新 (L-alanosine)、5-氮雜胞苷（5-azacytidine)、阿西維辛 (acivicin)、胺基喋啶（aminopterin)及其衍生物，例如N-[2-氣-5-[[(2,4 -二胺基-5-甲基-6 - 口奎嗤琳基）甲基]胺基]苄醯 基]-L-天門冬胺酸、N-[4-[[(2,4-二胺基-5-乙基-6-喹唑啉基） 曱基胺基]苄醯基]-L-天門冬胺酸、N-[2氯-4-[[(2,4-二胺基 嗓σ定基）甲基]胺基]苄酿基]-L-天門冬胺酸、可溶性貝克葉 酸拮抗劑（Baker’s antifol)、二氣烯丙基散沫花素 (dichloroallyl lawsone)、布喹那（brequinar)、脫洛福（ft〇raf) 、二氫-5-氮胞嘧啶核苷、甲胺喋，（meth〇trexate)、N_(膦乙 醯基）-L-天門冬胺酸四鈉鹽、吡唑呋喃（pyraz〇furan)、三甲 曲沙（trimetrexate)、普卡黴素（plicamycin)、阿西諾黴素 D(actin〇mycin D)、克來普拓素（crypt〇phycin)及類似物，例 如克來晋拓素-52或例如揭示在歐洲專利申請案第239362 5虎中較佳抗代謝物之一，如1(5-[1(3,4-二氫_2_曱基_4_氧 喹唑啉-6-基甲基）_过-甲基胺基卜2_吩噻甲醯基）_L_天門冬 月女I ’生長因素抑制劑，細胞環抑制劑、插入（inkrCaiating) 抗生素，例如亞德利亞黴素（adriamycin，羥柔毛黴素）和博 萊Μ素（bleomycin);蛋白質，例如干擾素；和抗激素，例 如抗雌性素，例如Nolvadex™[他莫西芬（tam〇xifen)]或例如 抗雄性素，如CasodexTM(4、氰_3-(4_氟苯基磺醯基羥基 91828.doc -14- 200423933 -2-曱基-3’-(三氟曱基）丙醯胺苯。如連合治療可利用同時、 連續或分開給予本治療之個別成分劑量而達成。 抗血管生成劑包括MMP_2(基質—金屬蛋白酶2)抑制劑、 MMP-9(基質-金屬蛋白酶9)抑制劑，和c〇x_H(環氧酶η)抑 制劑。可用之COX-II抑制劑實例包括CELEBREXirM[愛雷昔 布（alecoxib)]、代地昔布（valdec〇xib)和囉非昔布 (i*ofec〇xlb)。可用之基質金屬蛋白酶抑制劑之實例描述在 WO 96/3 3 172(1996年 1〇月 26 日公告）、W〇 96/27583(1996年 J月7日公告）、歐洲專利申請案第973〇497ιι號（1997年7月$ 曰歸杬）、歐洲專利申請案第993〇8617·2號（1999年1〇月Μ 曰歸檔）、WO 98/07697(1998年2月26日公告）、W0 98/035 16(1998年 1 月 29 日公告）、w〇 98/3491 8(1 998年 8月 13 曰公告）、WO则州叩"8年8月π日公告）、w〇 Mm· (1998年8月6日公告）、W〇98/3〇566〇998年7月16日公告）、 歐洲專利申請案第606,046號（1994年7月13日公告）、歐洲專 利公告 931，788( 1999 年 7 月 28 日公告）、W0 90/05719(1990 年5月31日公告 99/52889(1999年 1〇月 21 日公告）、w〇 99/29667(1999年6 月 17日公告）、PCT國際專利申請案第pc 丁/IB98/〇m3(i998年 7月21日歸檔）、歐洲專利申請案第993〇2232 1號（1999年3 月25日歸檔）、大英專利申請案第9912961 1號（1999年^月3 曰歸檔）、美國臨時專利申請案第6〇/148,464號（1999年8月 I2曰歸檔）、美國專利申請案第5,863,949號（1999年%曰 頒予）、美國專利申請案第5,861，51〇號（1999年1月19日頒予） 91828.doc -15- 200423933 和歐洲專利公告7δ0,3δ6(1997^月25曰公告），所有皆以全 文引用之方式併入本文中。較佳2ΜΜρ_2和ΜΜρ_9抑制劑 為该等具有少許或毫無抑制ΜΜΡ-1活性者。更佳地，為。 選擇性抑制與其他基質一金屬蛋白質酶有關 ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-4, ΜΜΡ-5, ΜΜΡ-6, ΜΜΡ-7, ΜΜΡ-8, ΜΜΡ-10 ΜΜΡ-11，ΜΜΡ-12和 ΜΜΡ-13)之 ΜΜΡ-2和/或 ΜΜΡ-9者。 ΜΜΡ抑制劑之實例包括AG-3340、R〇32-3555、RS 13-0830以及下列所提及之化合物： 3-[[4-(4 -氟-苯氧基）-苯績驢基]-(1 _經基胺甲酸基-環戊 基）-胺基]-丙酸； 3- 氧-3-[[4-(4-氟-苯氧基）-苯磺醯基]_8_崎-二環氧[3.21] 癸烷-3-羧酸羥醯胺； (211，311)1-[4-(2-氣-4-氟-甲苯基氧基）-苯磺醯基]-3-羥基 -3 -甲基-派σ定-2 -叛酸經酿； 4- [4-(4 -氣-本氧基）-苯續酷基]-四氣-派喃-4-竣酸翻·酉进， 3- [[4-(4-氟-苯氧基）-苯磺醯基]-(1 -羥基胺甲醯基-環丁 基）-胺基]-丙酸； 4- [4-(4-氯-苯氧基）-苯磺醯基]_四氫-哌喃-4-羧酸羥醯； 3-[4-(4-氣-苯氧基）-苯磺醯基]-四氫-哌喃-3-羧酸羥酸； (211，311)1-[4-(4-氟-2-曱基-甲苯基氧基）-苯磺醯基]-3-羥 基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羥醯； 3-[[4-(4-氟-苯氧基）-苯磺醯基Η1-羥基胺甲醯基曱基 -乙基）-胺基]-丙酸， 3_[[4-(4-氟-苯氧基）-苯磺醯基]-(心羥基胺甲醯基-四氫一 9l828.doc -16- 200423933 σ底喃-4 _基）-胺基]-丙酸； >外-3-[4-(4 -氯-苯氧基）_笨石黃醯基]_8_噚_二環氧[3.2 . ^ 癸烷-3-羧酸羥醯胺； 3-内_3-[4-(4-氟-苯氧基）_苯磺醯基]_8_,号_二環氧[3 21] 癸烷-3-羧酸羥醯胺；和 3-[4-(4-氟-苯氧基）—苯磺醯基]-四氫_吱喃|羧酸羥醯 胺； 及該化合物之醫藥上可接受之鹽類、溶劑合物和前藥 (prodrug) 〇 信號傳導抑制劑之實例包括可抑制EGFR(内皮細胞生長 因素受體）反應，如EGFR抗體、EGF抗體和下列分子：EGFR 抑制劑；VEGF(血管内皮細胞生長因素）抑制劑；和erbB2 受體抑制劑，如可與erbB2受體結合之有機分子或抗體，如 HERCEPTIN™(Genentech? Inc. of South San Francisco, California，USA) 〇

EGFR抑制劑描述在例如W〇95/19970( 1995年7月27日公 告）、W〇 9 8/1445 1(1998年 4月 9 曰公告）、W〇 9 8/0243 4(199 8 年1月22曰公告）和美國專利5,747,498(1998年5月5曰頒 予）。EGFR-抑制劑包括但不限於單株抗體C225和抗-EGFR 22Mab(ImClone Systems Incorporated of New York, New York，USA)、化合物 ZD-1 839(AstraZeneca)、BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim)、MDX-447(Medarex Inc. of Annandale， New Jersey，USA)和〇LX-103(Merck & Co. of Whitehouse Station，New Jersey，USA)、VRCTC-3 10(Ventech Research) 91828.doc -17- 200423933 和 EGF融合毒素（Seragen Inc. of Hopkinton，Massachusetts)。 VEGF抑制劑例如 SU-5416和 SU-6668(Sugen Inc. of South San Francisco，California，USA)可和式1之化合物組合或合 併給藥。VEGF抑制劑描述在例如w〇99/24440( 1999年5月 20曰公告）、PCT國際申請案PCT/IB99/00797(1999年5月3日 歸檔）、在 WO 95/2 1613( 1995年8 月 17 日頒予）、WO 99/61422 (1999年12月2日公告）、美國專利5,834,504(1998年11月1〇 曰頒予）、WO 98/50356(1998年11月12日公告）、美國專利 5,883，1 13(1999年3月16日頒予）、美國專利 5,886,020(1999 年3月23日頒予）、美國專利5,792,783(1998年8月11曰頒 予）、WO 99/1 0349(1999年3月 4 日公告）、WO 97/3 285 6(1997 年9月12日公告）、W〇97/22596( 1997年6月26日公告）、WO 98/54093(1998年 12月 3 日公告）、WO 98/02438(1 998年 1 月 22 日公告）、WO 99/1675 5(1999年 4月 8 日公告）和 WO 98/02437 (1998年1月22日公告），以上所有皆以全文引用之方式併入 本文中。一些特定VEGF抑制劑之其他實例為IM862(Cytran Inc· of Kirkland，Washington，USA);抗-VEGF單株抗體貝 維西馬（bevacizumab)(Genentech，Inc. of South San Francisco, California);和 angiozyme1™，一 來自萊博新（Ribozyme) (Boulder，Colorado)和齊隆（Chiron)(Emeryville，California) 之合成核酵素（ribozyme)。

ErbB2 受體抑制劑，例如 GW-282974(Glaxo Wellcome pic) 和單株抗體抑制劑 AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc· of The Woodlands，Texas，USA)和 2B-1 (Chiron)可和式 1之化合 91828.doc -18- 物組合給藥。該erbB2抑制劑包括該等描述在w〇98/〇2434 (1 998年1月22日公告）、〜^〇 99/35146(1999年7月15日公 告）、W0 99/35132(1999年 7 月 15 日公告）、W〇 98/02437(1998 年1月22日公告）、W〇97/13760(1997年4月17日公告）、W〇 95/19970(1995 年7月27日公告）、美國專利 5,587,458(1996 年12月24日頒予）和美國專利5,877,3〇5(1999年3月2日頒予） 之抑制劑，每一個皆以全文引用之方式併入本文中。用於 本文中之ErbB2受體抑制劑亦描述在美國臨時申請案第 60/1 17,341唬（1999年1月27日歸檔）和美國臨時申請案第 6〇/117,346號（1999年1月27日歸檔），兩者皆以全文引用之 方式併入本文中。 其他可使用之抗增生藥劑包括酵素法尼基（famesyl)蛋白 質轉移酶之抑制劑和受體酪胺酸激酶pDGFr2抑制劑，包 括下列美國專利申請案所揭示和申請專利範圍之化合物： 09/221 946(1 998 年 12 月 28 日歸槽）；09/454058(1999 年 12 月 2 曰歸才田），09/501163(2000年 2月 9 日歸檔）；09/539930(2000 年3月31日歸檔）；09/202796(1997年5月22日歸檔）； 09/3 84339(1 999 年 8 月 26 日歸檔）和 〇9/3 83755(1999 年 8 月 26 曰歸檔）；以及下列美國臨時申請專利案所揭示和申請專利 範圍之化合物：60/168207(1999年11月30日歸檔）； 60/1701 19(1999年12月10日歸檔）；⑼/^^^汕⑼年丨月21 曰歸檔）；60/168217(1999年Η月3〇曰歸檔）和 60/200834(2000年5月丨日歸檔）。前述之專利申請案和臨時 專利申請案中每一個皆以全文引用之方式併入本文中。 9l828.doc -19- 200423933 式1之化合物亦可和其他藥劑一起用於治療癌症之異常 細胞生長，包括但不限於能夠加強抗腫瘤免疫反應之藥 劑’例如CTLA4(細胞毒素淋巴抗原4)抗體，以及其他能夠 阻斷CTLA4之藥劑·，以及抗增生藥劑，例如其他抗 蛋白質轉移酶抑制劑。可用於發明之特定(^几以抗體包括 描述在美國臨時申請案60/1 13,647(1998年12月23日歸檀） 之该等抗體’此申請案係以全文引用之方式併入本文中。 在另一具體實例中，本發明提供一包含Si化合物之醫藥 組合物，或一醫藥可接受鹽類、溶劑合物或其前藥，以及 一治療上有效量之克癌易（docetaxel)。 在另一具體實例中，本發明利用給予哺乳動物式i之化合 物，或醫藥可接受之鹽類、溶劑合物或其前藥以及一治療 上有效量之克癌易，以提供哺乳動物（包括人類）身上異常細 胞生長之/σ療方法。式1之化合物和克癌易可分開給藥或在 同一組合物中，且必要時可依照同樣給藥時間表或不同給 藥時間表給藥。 定義 本文中使用之「異常細胞生長」，除非另有說明，否則意 指細胞的生長並非依照正規的機制（如失去接觸抑制），包 括下列各項之異常生長·（ 1)因絡胺酸激酶之突變表現或受 體路胺酸之過度表現而造成增生之腫瘤細胞；（2)因異常酿 胺酸激酶出現活性所造成之其他增生性疾病的良性或惡性 細胞；以及（3)由於受體酪胺酸激酶造成增生之任何腫瘤。 本文中使用之術語「治療」（treating)，除非另有說明， 9l828.doc -20- 200423933 否M d日1U冑減I! '抑制或預防使用該術語之疾病或症 狀之進行，或該疾病或症狀之症狀。本文中使用 之術扣/σ療」（treatment)，除非另有說明，否則意指治療 之^于為，在此治療如上所定義。 本文中使用之名詞「醫藥上可接受之鹽類」，除非另有說 明，否則包括存在於一化合物中之酸性基或鹼性基之鹽 類本貝上疋鹼性化合物可和各種無機和有機酸鹽類形成 廣泛之夕種鹽類。可用以製備該鹼性化合物之醫藥上可接 受之酸加成鹽類的酸為該等可形成無毒酸加成鹽類之化合 物，亦即含有醫藥可接受陽離子之鹽類，如醋酸鹽、苯磺 酸鹽、苯曱酸鹽、碳酸氫鹽、二硫酸鹽、二酒石酸鹽、硼 酉义鹽、溴化物、依地酸弼（calcium e(jetate)、樟腦續酸鹽、 石炭酸鹽、氯化物、克拉維酸鹽（clavulanate)、檸檬酸鹽、二 獻i化鼠 依地酸鹽、依地西鹽（edislyate)、伊司托鹽 (estolate)、依西鹽（esyiate)、乙基琥珀酸鹽、延胡索酸鹽 (fumarate)、葡萄庚糖酸鹽（giuceptate)、葡萄糖酸鹽 (gluconate)、麩胺酸鹽、甘胺酸胺基苯胂酸鹽 (glycolylarsanilate)、己基雷瑣新酸鹽（heXyiresorcinate)、 氫阿巴胺（hydrabamine)、溴化氫、氣化氫、碘化物、異硫 鹽（isothionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽（lactobionate)、月桂酸 鹽、顏果酸鹽、順丁烯二酸鹽（maleate)、曼德拉鹽 (mandelate)、曱磺酸鹽、曱基硫酸鹽、黏液酸鹽、萘磺酸 鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、帕莫酸鹽（pamoate)恩柏酸 (embonate)、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半 91828.doc -21- 200423933 乳糖醛酸鹽、水揚酸鹽、硬脂酸鹽、次醋酸鹽、琥轴酸越 革柔酸鹽、酒石酸鹽、替歐克酸鹽（teoclate)、托西酸鹽二 乙基碘酸鹽（triethiociode)和戊酸鹽（vaierate)鹽類。 一本文中使用之「前藥」，除非另有說明，否則意指可作為 ㈣先質之化合物’其在後續之給藥之後可於活體内藉由 一些化學過程或生理過程釋放出藥物（例如將—可調節9生 理PFi值之前藥轉變成期望之藥物形式）。 °。即 本發明亦包括同位素標記化合物，此有別於式 該等化合物，作是塞奋 捉及之 & 疋事，上-或多個原子可由—原子所取 代’此原子具有之原子量或皙 々広 卞里次貝里數不同於它在自然情況存 在下之原子量或質量數。可 素實例包括氫、碳、氣、“ 物中的同位 八別9 3 " 夕牛、石爪、鼠和氯之同位素， 刀別例如3H 13r·丨4门 μ 1 〇 36c|〇, ^ 5 d。本發明之化合你、 A — 可接总g * ο則樂以及該化合物該前藥之醫藥 妾又風痛和溶劑合物，豆 之1士 /、3有刖逑同位素和/或其他原子 tc*问位素，皆太士 务月之涵蓋範圍内。本發明之竿此 同位素標記化合物，例 月之某二 如3H和tt Μ。亥專併入文中之放射性同位素， 白可用於藥物和/或受曾八 化之同位素，如3Η丨4 —又貝、，且、，哉刀佈4驗中。經氚 備及偵蜊。再者，二C:特定而言較佳，因為它們容易製 到治療好處，得到如氣（即2Η)之取代反應可得 生期或，減少劑量兩炎 性’例如增加活體内半 之同位抑7…且111此對某些情況而言較佳。式1 裏知圮化合物和兮I — 製備方法進A , 口 Μ則樂一般可利用非標記化合物之 订’只要用一可々呈士 J诗之同位素標記試劑取代一非 91828.doc -22- 200423933 同位素標記試劑即可。 【實施方式】 式！之化合物可利用美國專利第6,53ι，49ι號和第 6,534,524號（分別於2003年3月u日和2 ° 丁 J月8曰頌予、 中描述之方法製備’並以全文引用之方式併入本文中。某 些起始物質可根據熟習此項技藝者熟知之方法製備，且某 些合成改良方法可根據熟習此項技藝者熟知知方法為之 式1之化〇物可形成帶有各種無機和有機酸之多種不同 鹽類。儘管該鹽類必須為可給藥予哺乳動物之醫藥上可接 受之鹽類’但實務上經常希望最初即可從反應混合物令分 離出式1之化合物以當成-醫藥不可接受之鹽類，之後簡： 地利用-驗性試劑處理之後將後者轉變回游離驗化合物， 再接著將後者之游離驗化合物轉變成—醫藥可接受之酸加 :鹽類。本發明之鹼性化合物的酸加成鹽類，可利用—實σ 質上等量之選擇礦物質或有機酉楚，在一水溶劑介質或在2 :用之有機溶劑中’如甲醇或乙醇，處理驗性化合物而製 二。經由溶劑之小心蒸發後即可獲得期望之固體鹽類。期 =之酸性鹽類亦可從一游離驗的有機溶劑溶液中加入—適 田之礦物質或有機酸之後沉澱得到。 式1之化合物之給藥可因任何能夠傳遞化合物至作用部 秤方法而％到影響。該方法包括口服途徑、十二指腸途 y g '主射（包括靜脈注射、皮下注射、肌肉内注射 血管内Λ , 、^輸液注射）、局部給藥以及直腸给荜。 舉例而+ , 1 Μ 3，此化合物之提供可利用適用於口服給藥之形 91828.doc -23 - 200423933 =如如劑、膠囊、藥丸、粉末、持續釋放調配物、溶液、 于液’適用於非腸逞注射之形式，如無菌溶液、懸浮液 或乳化液；適用於局部給藥之形式，如軟膏或乳液；或適 用於j腸給藥之形式，如栓劑。化合物可為適合精確劑量 之單-給藥之單位劑量形式。。較佳的劑量形式包括習知 之•藥載劑或賦形劑，且式κ化合物可當成一活性成分。 卜β丨里形式可包括其他藥物或製劑、載劑、佐劑等。 、 腸逼給藥形式包括在無菌水溶液中之溶液或懸浮 液’例如丙烯乙二醇或葡萄糖溶液。該劑量形式若須要可 適當地加以緩衝。 適用之-要載劑包括鈍氣稀釋劑或充填劑、水和各種有 機溶劑。醫藥組合物若須要可含有其他成分，如調味劑、 ^ ㈣形劑及其類似物。因此對口服給藥，含有各種 賦形劑（如檸檬酸)之鍵劑可和各種崩解劑（如殿粉、藻酸和 某二複合石夕酸鹽）及黏合劑（如簾糖、明膠和阿拉伯膠）。此 外，潤滑劑（例如硬脂酸鎂、月桂硫酸鈉和滑石）經常用於錠 劑用途。-相似類型之固體組合物亦可用於軟和硬充填明 :膠囊，目此較佳物質包括乳糖或牛乳糖以及高分子量之 水乙缔乙二醇。當期望將水性懸浮液或藥液酿⑽㈣作為 口服給藥時’該活性化合物可和各種甜味劑或調味劑、色 素或染劑以及如有需要還有乳化劑或懸浮劑組合，並加上 稀釋劑，如水、乙醇、兩哈 ^ ^ . 合物。 '烯、乙一醇、丙三醇（甘油）或該組 本發明劑型之較佳具體實例中，該劑型為口服劑型，更 91828.doc -24- 200423933 佳為一錠劑或一膠囊。 本發明方法之較佳具體實例中，式1之化合物係為口服給 本’例如使用本文中描述之口服劑型。 本發明包括給予任何期望劑量配方之式1化合物。在一特 疋具體貫例中，此化合物每日給藥一次（quaque die，QD)， 較佳為每曰兩次（bis in die，BID)，儘管更頻繁或更少給藥 仍在本發明之範圍内。化合物可給藥予一哺乳動物，包括 人類，較佳為禁食狀態（給藥前後兩小時内不進食或喝飲 料）°在一特定較佳具體實例中，劑量為每日兩次，禁食。 利用一特定量之式1化合物來製備各種劑型之方法為該 等热習此技藝者所熟知或顯而易見。例如，可參見麥克出 版公司出版之雷鳴噸醫藥科學一書（Remingt〇n,s

Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa·，15 th Edition，1975) 〇 AUC血漿值可直接測量式j化合物或其活性代謝物之血 漿派度而決定，例如利用液相層析儀一坦頓（tandem)質譜儀 (LC-MS/MS)在各時間區段中計算血漿濃度對時間曲‘下 知，例 如可利用梯形近似法（trapez〇ida][ app而—） 就㈣

其中η為數據點數目，ti和，士 旧示i数艨點之時間和濃度以和} 值）。24小時之AUC值可利用根據认 少豕、，σ樂恰間表測得之血漿濃 度標準化（normalize)而決定。在 仕丹組成浴液中可加入二硫 9I828.doc -25- 200423933 化鈉當成一穩定劑，以製備標準濃度。 式1之化合物具有與激酶活性（與VEGF-R、FGF-R、CDK 複合物、CHK1、CSF-R和/或LCK有關）之調節和/或抑制有 關之有利性質。

如下例中所示，式1之化合物係能在活體内引發HUVEC 凋零（apoptosis)、在HUVEC中抑制VEGF調節Akt和eN〇S磷 酸化、在HUVEC中在化合物排除後證實其在VEGFR-2磷酸 化之持續抑制作用，以及抑制PDGF BB引發癌症細胞轉移 基質蛋白質纖維結合素。式1之化合物可利用抑制轉移和侵 入而具有抗PDGFR-誘發腫瘤進展之活性。 式1之化合物證實當其和Taxol™(較佳為克癌易）組合之 後’對於腫瘤生長之抑制具有更有效之活性。共同治療比 單獨使用單一藥劑來治療，可觀察到較重要之腫瘤退化。 本發明更指明利用給予式1之化合物來調節或抑制蛋白 質激酶活性之方法，例如在哺乳動物組織内。可當成一蛋 白質激酶活性調節物之本發明化合物之活性，如激酶活 性，可利用任何熟習此項技藝者可得之方法測得，包括活 體内和/或活體外測定。適用於活性測量之測定法實例包括 Parast C. et al.? Biochemistry, 37? 16788-16801(1998)；

Jeffrey et al·，376, 3 13_32〇 (1995); WIp〇 國際專利 公告第WO 97/34876號以及WIP〇國際專利公告第w〇 9 6 /1 4 8 4 j號所描述之該等方法。例如，該等性質可利用下 列貫例中說明之一或多種生物試驗過程來評估。 下列供之貫例和製備更說明並舉例本發明之劑型和方 91828.doc -26- 200423933 法。應了解本發明之範圍不以任何方式受 八又哏於下列實例之 範圍中。 實例1 式1之化合物經測試可用於：（1)在數種給藥時間行程之活 體内效力：每日一次、假日之週末劑量和間歇性給藥；（2) 異種移植物（xenograft)模型中當其與克癌易組合之效力；（3) 活體内内皮細胞中eNOS和Akt之磷酸化；（4)氧化气及相關 產物在細胞培養基和活體内之濃縮；以及（5)c-套組訊號在 全血細胞中當成此化合物之潛在性生物標記物之用途。 生物試驗；酵素測定 利用如VEFG、FGF和其他生長因素刺激細胞增生視該等 個別受體酪胺酸激酶之每一個的自動碟酸化之引入而定。 因此，一用以阻斷（由該等生長因素引發之）細胞增生的蛋白 質激酶抑制劑之能力係與其阻斷受體自動磷酸化作用直接 相關。為了測量該化合物之蛋白質激酶抑制活性，建議可 使用下列之構成物（construct)。 用以測定之VEGF-R2構成物：該構成法決定一試驗化合 物用以抑制酪胺酸激酶活性之能力。缺乏激酶插入區中⑽ 個殘基中50個中心殘基之人類血管内皮生長因素受體 2(VEGF-R2)的胞質液區之構成物（VEGF-R2A5〇)表現在趕 狀病毒/昆蟲細胞系統中。全長从^0?-112之13 56個殘基中， ¥£0?-112八50含有殘基806-93 9和909-1171，且在相關於野 生種VEGF-R2之激酶插入區中亦有一個點突變（E990V)。經 純化之構成物的自動磷酸化可利用在一濃度為4 μΜ(在1 〇〇 91828.doc -27- 200423933

mM HEPES 中含有 3 mM ATP和 40 mM MgCl2之存在下）、pH 值為7.5且含有5%甘油和5 mM DTT之酵素培養方式於4°c 下進行培養2小時。自動磷酸化之後，該構成物已經顯示具 有本質上與野生種自動磷酸化激酶區構成物之催化活性相 等之催化活性。參見 pareast et al.，㈣37, 16788_ 16801 (1998)。 用以測定之FGF-R1構成物··人類FGF-R1之細胞内激酶區 可利用桿狀病毒載體（vector)表現系統表現出來，此系統起 始於内生性甲硫胺酸殘基456至麩胺酸鹽766，此係根據 Mohammadi等人之殘基排序系統而定（M〇hammadi以al， Mol· CW/· 5w/·，16, 977_989，1996)。此外，此構成物亦具 有下列3個胺基酸取代反應：L457V、C488A和C584S。 用以測定之LCK構成物·· LCK酪胺酸激酶表現在昆蟲細 胞中當成一 N-端缺失，此起始自胺基酸殘基223至蛋白質位 於殘基509之末端，並有下列兩種位於端之胺基酸取代反 應：P223M和 C224D。 用以測定之CHK-1構成物：C_端組織胺標記全長人類 CHK-l(FL-CHK-l)可利用桿狀病毒/昆蟲細胞系統表現出 來。它在476個胺基酸人類CHK-1iC-端上含有6個組織胺 酸殘基（6xHiS-tag)。該蛋白質可利用熟知之層析法技術加 以純化。 用以測定之CDK2/Cyclin A構成物：CDK2可利用公告之 方法（Rosenblatt ey al·，J. •扪〇/，23〇, 1317-13 19 (1993)) 從受到桿狀病毒表現載體感染之見蟲細胞中加以純化。 91828.doc -28- 200423933 C y c 1 i η A可從大腸囷細胞表現全長重組體c y c 1丨η A中純化而 得，且一截斷cyclin A構成物可由受限之蛋白質溶解作用產 生並可由上述之方法加以純化（Jeffery et al。 313-320 (1995)) 〇 用以測定之CDK4/Cyclin D構成物：人類cdK4和cyclin D3之複合物或一 cyclin D 1和一人類CDK4與麵胺基硫轉 移酶之融合蛋白質（GST-CDK4)之複合物，可利用傳統生物 化學層析技術從曾經受到對應之桿狀病毒表現載體共同感 染之昆蟲細胞中純化而得。 VEGF-R2測定：偶合分光光度（FLVK-P)測定法 由ATP產生ADP且伴隨發生填酸基轉移之作用可利用碟 酸烯醇丙酮酸鹽（PEP)和一具有丙酸J酸激酶（ρκ)和乳酸脫 氫酶（LDH)，偶合至NADH之氧化反應。NADH之氧化反應 可由下列利用貝克曼（Beckman)DU 650光错光度計於340 nm之吸光度（e34〇 = 6.22 cnT1 nM )減少而偵剩到。用於鱗酸 化VEGF-R2A50(在下列表格中顯示為FLVIC-P)之測定條件 如下：1 mM PEP ; 250 μΜ NADH ;每毫升5〇單位之LDH ; 每毫升 20單位之PK ; 5 mM DTT ; 5.1 mM聚（E,Yl) ; 1 mM ATP ;以及在 200 mM HEPES 中之 25 mM MgCl2，pH值為 7.5。用於未磷酸化VEGF-R2A50(在下列表格中顯示為FLVK) 之測定條件如下：1 mM PEP ; 250 μΜ NADH ;每毫升50單 位之LDH ;每毫升20單位之PK ; 5 mM DTT ; 20 mM聚 (E4YQ; 3 mM ATP;以及在 200 mM HEPES 中之 60 mM MgCl2 和2 mM MnCl2，pH值為7.5。此測定可利用5至40 nM之酵 91828.doc -29- 200423933 素起始進行，值可藉由測量試驗化合物中各種濃度存在 0寺之酵素活性而決定，數據可利用酵素動力軟體(Enzyme 〖11^1(：)和凱達緣圖（}^16丨(^£^口}1)軟體進行八析 ELISA測定：石粦酸胃泌素之幵> 成可 k取J利用經過生物素基化 (bi〇tinyiated)之胃泌素胜肽（1_17)當成受質而偵測到。經過 生物素基化之磷酸胃泌素可利用塗佈有抗生蛋白鏈菌素 ㈣eptavidln)之96孔微滴定盤加以固定，接著利用抗填酸酷 胺酸-抗體絲至山葵過氧化酶（h⑽⑽dish _xidase)之 方法加以偵測。山葵過氧化酶之活性可利用2,2，_伸氧氣基- 二-[3-乙基苯嗟唾琳石黃酸⑹]二録鹽（abts)進行㈣。典型 之測定溶液含有：2 μΜ生物辛基化之田、,主

瓦巷化之月泌素胜肽；5 mM DTT , 20 μΜ ATP ; 26 mM MgCl ·丨、/ >

gU2，以及在 200 mM HEPES 中之2 mM MnCl2，pH值為7·5。此制宁 此測疋可利用0·8 ηΜ之磷酸 化VEGF-R2A50起始進行。山茂 山夭過乳化鉍活性可利用ABTs 10 mM加以測定。山葵過氧 乳化每反應可利用酸（H2S04)加成 反應使之淬火，接著可讀到苴 貝玉I、及光度在405 nm 〇 &值可藉 由測量試驗化合物中各籀嘈库六士士 习甲各種/辰度存在時之酵素活性而決定， 數據可利用酵素動力赴辦 . 體（Enzyme Kinetic)和凯達繪圖 (Kaleidagraph)軟體進行分析。 FGH則疋·光譜光产 、 又'則疋可由上述用以測定VEGF-R2 之方法進订’除了在濃度上做出下列之改變：FGF-R=50 nM、ATP = 2mM及聚（E4Yi)=i5mM。 L C K測定·光譜光声丨 、 又“丨疋可由上述用以測定VEGF-R2之 方法進行，除了在濃声 又上做出下列之改變·· LCK>60 ηΜ、 91828.doc -30- 200423933

MgCl2 = 0 mM 及聚（EJOdO mM。 CHK-1測定：由ATP產生ADP且伴隨發生磷酸基轉移至合 成受質胜肽Sytide-2(PLARTLSVAGLPGKK)之作用可利用 磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP)並經由丙酮酸激酶（PK)和乳酸脫 氫酶（LDH)之作用，偶合至NADH之氧化反應。NADH之氧 化反應可由下列利用HP8452光譜光度計於340 nm之吸光度 (e 340 = 6_22 cm·1 ηΝΓ1)減少而偵測到。典型之反應溶液包 含：4 mN PEP ; 0.15 mM NADH ;每毫升28單位之 LDH ; 每毫升 16單位之PK ; 3 mM DTT ; 0·125 mM Syntide-2 ; 0·15 mM ATP ;在 50 mM TRIS 中之 25 mM MgCl2，pH值為 7.5 ; 以及400 mM NaCn。此測定可利用10 nM之FL-CHK-1起始進 行，&值可藉由測量試驗化合物中各種濃度存在時之起始 酵素活性而決定，數據可利用酵素動力軟體（Enzyme Kinetic)和凯達、纟會圖（Kaleidagraph)軟體進行分析。 HUVEC增生測定：此測定可決定一試驗化合物對於人類 臍靜脈内皮細胞（nHUVECn)生長因子一刺激增生之抑制能 力。HUVEC細胞（通行3-4，Clonetics公司）被溶解到一 T75 燒瓶之EGM2培養基（Clonetics公司）中。24小時之後在燒瓶 中加入新的EGM2培養基。4或5天後，將細胞放置在另一培 養基（補充有1〇%胎牛血清（？88)、6〇48/]111^内皮細胞生長因 補充物（ECGS)和10 gg/m肝素之F12K培養基）中。指數成長 之HUVEC細胞可用於此後之實驗中。將10000至12000個 HUVEC細胞放置在一含豐富培養基之96個孔盤中（如上 述），讓細胞貼附在此培養基中24小時，之後利用吸氣法將 91828.doc -31- 200423933 培養基除去並加入115 pL之凱餓培養基（starvation media)(F12K+l% FBS)到每一個孔盤中。18小時之後，將飢 餓培養基中溶解在1 % DMS0之測試劑1 5 pL或該媒劑單獨 加入每一個處理孔盤中；最終之DMS0濃度為0.1%。一小 時之後，將叙餓培養基中20 pL之150 ng/mL hrVEGF165加入 所有孔盤中，除了該等含有未處理之控制組之孔盤；最終 之VEGF濃度為20 ng/mL。細胞之增生在72小時之後利用 MTT染劑還原反應加以定量，此時細胞將被暴露在 MTT(Pr〇mega公司）中4_5小時。染劑還原反應利用添加一終 止溶液（Promega公司）使反應停止，並在一 96_孔光譜吸光計 之孔盤讀計上測得其吸光度在57〇和63〇 nm。 癌細胞增生（MV522)測定：為了決定一蛋白質激酶抑制劑 對於組斷血管生成以治療癌症是否應具有治療用途，重要 的是證明該抑制劑在細胞中並不會特定性地阻斷細胞增 生，这些細胞沒有表現出激酶受體。此可藉由使用癌細胞 增生測定之進行而完成。用以評估癌細胞中細胞增生之方 法相似於用於評估HUVEC細胞中所❹之方法。鳩個肺 癌細胞（線MV522，由UCSD取得）被接種至生長培養基中（補 充有2 mM麩醯胺和1〇% FBSiRpMI164〇培養基）。在加入 馳試劑和/或媒劑前讓細胞貼附一小時。利用在HUVEC測 定中所使収相同試驗試劑同步處理細胞 劑之後例再利用晴劑還原測定法定量： C-套組能力之決定：NCI_H526(ATCC)細胞可用以決定該 抑制劑對抗c_套έ 各、，且之此力。讓細胞成長至尚未全部長滿 91828.doc -32- 200423933 (sub-confluency)並在凱餓培養基 下並在2.3%白蛋白和1 mM Na3V〇4

劑並讓細胞在3 7 °C (Sigma)存在下培養45分鐘。 最終濃度50 ng/mL之培養基。 中培養1 8小時。加入抑制 將c-套組生長因素SCF加入一 五分鐘之後用冷PBS清洗細胞 兩次 並用溶解緩衝液（5〇 mM Tris

' 150 mM NaCM、1 mM PMSF、1% NP40、

mM

Na3 V04和—蛋白酶抑制劑之混合 溶液）加以溶解。免疫沉殿法之進行係利用來自每個溶解產 物且總量為i mg之蛋白質在4t下與4叫/紅cDn7 ab-3(K45 ’ Ne〇markers公司）—起培養隔夜。次日早晨讓抗 體複合物與蛋白質Α小珠進行共概作用。SDS pAGE和西方 點潰分析法係利用抗磷酸酪胺酸抗體4G丨〇(Upstate生技公 司）用以作為填酸化受體，或抗_c_套組受體抗體.Μ% (C-i4, Santa Cruz)以丨：1000之比例來進行。點潰可利用化學 發光試劑ECLPlus使之顯影。磷光影像計（St〇rm 846，分子 動力公司）可用於點潰中信號之定量。 在一動物或哺乳動物之週邊總血液細胞中c_套組正細胞 族群之還原可用以當成式1化合物活性之生物標記物。 ENOS和Akt麟酸化之測量：HUVEC(Cl〇netics)可用以決 定該抑制劑對抗eNOS和Akt之能力。讓細胞成長至尚未全 部長滿（sub-confluency)並在飢餓培養基中培養以小時。加 入抑制劑並讓細胞在37t下並在2.3%白蛋白和} mMNa3v〇4 (Sigma)存在下培養45分鐘。將VEGF加入一 50 ng/mL之培養 基中。五分鐘之後用冷PBS清洗細胞兩次，並用溶解緩衝液 (50 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM PMSF、l〇/0 NP40、1 一> 一> -JJ - 91828.doc 200423933

NasVO4和一蛋白酶抑制劑之混合溶液）加以溶解。一 3〇_4〇 ug之總蛋白質可利用西方點潰法分析。eN〇s* Akt磷酸化 可利用下列方法汗估：鱗酸_En〇s (ser #9571或碟酸

Akt (Ser 473) #9271抗體（皆來自 Cell Signaling)。蛋白質偵 測可利用下列方法達成·· NOS3 (C-20) sc-654 (Santa Cruz) 或Akt抗體#92 72 (Cell Signaling)。所有皆需要一連接次級 抗體之抗兔HRP，使用1:3〇〇〇之比例。點潰可利用化學發光 文貝Super Signal West Dura(Pierce公司）使之顯影。一來自 Alpha Irmotech公司之Aipha Imager 88〇〇可用於點潰中信號 之定量。 老鼠之PK測定：一藥物在老鼠身上之藥物動力學（即吸收 和排出）可利用下列實驗進行分析。試驗化合物被調配成一 在0·5/〇 CMC載體之懸浮液或一在一 3〇:7〇(pAGE4〇〇 :酸化 出〇）載體之溶液。該懸浮液或溶液可經由口服給藥（厂〇.)或 腹膜内給藥（i.P·)予該C3H雌鼠（n=4) 經由一眼眶出血 (orbital bleed)在下列時間點上收集其血液樣本：〇小時（給 樂两）、給藥後0.5小時、1.0小時' 2·〇小時和4〇小時。將每 個血液樣本經由2500 rpm和5分鐘之離心得到血漿。利用一 有機蛋白質沉澱法從血漿中萃取出試驗化合物。將每次流 出的50 μΧ血漿與丨.0 mL乙腈結合旋渦攪動2分鐘，並於4〇⑽ 啊離心15分鐘’以沉殿出蛋白f並萃取出試驗化合物。接 著’將乙腈上清液（此萃取物含有試驗化合物）倒入新試管中 並在加熱板（25。^上和通入氮氣流中進行蒸發。在每個含有 經過乾燥之試驗化合物萃取物之試管中加入125叫移動相 91828.doc -34- 200423933 (6峨⑽5 Μ ΝΗ4Η2Ρ〇4 + 2·5社几似：乙猜）。例用旋 渴使該試驗化合物再㈣浮在移動相中，制用侧— 離^ 5刀釦除去更多蛋白質。將每個樣本倒入用以進行試驗 化合物分析之HPLC小玻瓶中，此為惠普公司u⑻系列之 肌C，並附有紫外線彳貞測。由每個樣本中，取出％叫打 入一 ？11印〇1^11以彳1*0(^7逆相。18型儀器之ΐ5〇χ3·2 管 柱中，亚用45-50%乙腈梯度洗出，約進行1〇分鐘。試驗化

合物血漿濃度（jig/mL)可經由將其和標準曲線（尖峰面積比 濃度Mg/mL)並利用由上述方法中萃取自血漿樣本之試驗化 合物之已知濃度進行比較之後得知。對於標準值和未知值 而 a ’ 有二組（n=4)品質控制組（〇·25 pg/mL、1.5 pg/mL和 7.5 pg/mL)進行分析以確保分析之一致性。標準曲線有一 R2>0.99且品質控制皆在該等預測值之1 以内。經過定量 試驗之樣本利用凱達（Kaleidagraph)軟體點繪出來以做出視 覺顯示，該等藥物動力參數值可利用溫諾林（WIN n〇nlin) 軟體決定。

人類肝臟微粒（HLM)之測定：人類肝臟微粒中之化合物 代謝可利用下列LC-MS分析測定方法進行測量。首先，將 人類肝臟微粒（HLM)溶解並用1〇〇 mM冷碟酸鉀（ΚΡ04)緩衝 溶液稀釋至5 mg/mL。將適量之ΚΡ04緩衝液、NADPH-再生 溶液（含有B-NADP、葡萄糖-6-鱗酸、葡萄糖-6-填酸去氫酶 和MgCl2)和HLM放置在13支100 mm玻璃管中於37°C預先 培養1 0分鐘（每個試驗化合物有3支試管一做成三份）。將試 驗化合物（終濃度5 μΜ)加入每支試.管中以起始反應，並例 91828.doc -35- 200423933 用溫和旋渦攪拌使其混合，接著放置在37t：下進行培養。 在t = 0、2小時，將一 250_uL樣本從每一支培養管中除去， 以分離出12支75 mm含有1 mL冰；一冷乙腈和〇〇5 μΜ利血 平（reserpine)之玻璃管。將樣本以4〇〇〇rpm離心20分鐘，以 沉殿出蛋白質和鹽類（Beckman Allegra 6kr，S/N ALK9 8D06, #63 4)。將上清液轉移至新的12支75 mm的試管 中’利用Speed-Vac離心真空蒸發器進行蒸發。將樣本重新 組合放入200 (iL 0.1%甲酸/乙腈（90/10)中並用強力旋渦使 之/谷解。之後將樣本轉移至一分開之聚丙烯微離心管並在 14000xg離心 1〇分鐘（Fisher Micro 14, S/N M00175 80)。針對 每個時間點（0和2小時）的每次複製（#1-3)，將每個試驗化合 物之可等分量樣本結合起來放入一單一 HPLC插入玻管中 (總共6個樣本）以便進行LC-MS分析，此將在下列加以說明。 將結合之化合物樣本打入LC-MS系統，此包含一惠普公 司HP 1100二極管陣列HPLC以及一以正電噴霧SIR模式操作 之Micromass Quattro II三倍四倍質譜儀（程式特別設定用以 掃描每個試驗化合物之分子離子）。每個試驗化合物之波峰 皆出現在每個時間點上。針對每個化合物，將每個時間點 (n = 3)之波峰面積計算出平均值，亦即在2小時之波峰面積 除以0小時之平均波峰面積，以得到試驗化合物在2小時之 剩餘百分比。 活體外HUVEC〉周零（Apoptosis)測定 利用ELISA進行凋零（Apoptosis)之定量：HUVEC細胞之 凋零可利用Cell Death Detection Elisa PLUS儀器（德國羅傑 91828.doc -36- 200423933

生 4匕公司，Roche Biochemicals，Mannheim，Germany，型錄 # 1 775425)進行測量，此可定量出細胞溶解產物中胞體漿組 織蛋白相關DN A片段。此過程之進行和製造廠商之操作指 示有些微修正。簡而言之，將仇餓之HUVEC細胞利用各種 濃度之化合物A在VEGF(20 ng/mL)存在下進行處理。收集 各時間點之細胞胞質液片段，用以在一由ELISA和一主要 的利用抗組織蛋白mAb塗佈之微滴定盤以及由一次要之抗 DNA mAb偶合至過氧化酶組成之三明治組合物中當成一抗 原來源。凋零細胞之數目則可利用加入產色過氧化酶受質 而得知，並利用一光譜光度計於405 nm(參考波長為490nm) 之吸收進行測量。 利用TUNEL進行凋零作用（Apoptosis)之顯影：凋零細胞 之當場偵測可利用TdT-調節dUTP鍵之破損端標記（TUNEL) 技術來完成。簡單地，使在8孔Lab-Tek鉛室玻片生長之 HUVEC細胞飢餓0/N，之後以各種濃度之化合物A處理6小 時。之後細胞將固定在4%對甲酸中，利用Triton X-1 00使之 通透化並在一終端轉移酶和核苷包括螢光素-dUTP(終端螢 光（Deadend Fluorometric) TUNEL 系統，Promega，型錄 #G3250)之混合物中培養1小時，此係根據製造商之操作指 示。將細胞用蛾化丙。定（Propidium iodide ; PI)容易進行對 比染色。經過正染螢光素和PI標記之細胞可利用螢光顯微 鏡顯現並照相。 PDGF調節細胞轉移之測定：U87MG細胞可用在此測定 中。將六孔盤和0.5 ng/mL纖維結合素預培養隔夜。隔天將 91828.doc -37- 200423933 U87MG細胞放入每個孔中並使其成長至可流動。將細胞和 含有0· 1 % FB S之仇餓培養基培養隔夜。利用一吸量管尖端 製造一小於1公分之刮痕並用飢餓培養基清洗細胞。之後讓 培養盤用0.5 iig/mL纖維結合素培養1小時，之後再清洗一 次。此處將介紹含有100 ng/U rhPDGF BB以及在飢餓培養 機中化合物A之實驗用培養基。在〇和丨5小時之間進行細胞 拍照並顯現出細胞移動。 細胞VEGFR-2和下游分子磷酸化測定：將HUVECs (Clonetics)培養至尚未全部長滿（su|3_C0nfiuenCy)並在饥餓 培養基（F12K加上0.1% FBS)中培養18小時。在37°C下並在 2.3%白蛋白和1 mM Na3V04(Sigma)存在下，將化合物A加 入細胞中’ 45分鐘之後，將VEGF加入此培養基中，使其最 終濃度為50 ng/mL。五分鐘之後用冷PBS清洗細胞兩次，並 用溶解緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM PMSF、 1% NP40、1 mM Na3V04和一蛋白酶抑制劑之混合溶液）加 以溶解。將來自溶解產物中總蛋白質中的一毫克利用抗 -Flk-1 C-1158(Santa Cruz)使之產生免疫沉澱。讓抗體複合 物與蛋白質A小珠進行共軛作用。磷酸化VEGFR-2和蛋白質 可分別由抗磷酸酪胺酸抗體4G10(Upstate生技公司）和抗 -Flk-1 C-20(Santa Cruz)加以伯測。對eN〇S和Akt而言，以 上述相同之方法處理細胞。利用一總量為3 0 - 4 0 μ g之蛋白質 進行西方點潰分析。eN〇S和Akt磷酸化可利用磷酸〜 eN〇S(Ser* 1177，#9571)或磷酸-Akt(Ser 473，#9271)抗體（皆 來自Cell Signaling)進行探測。蛋白質可利用NO S3 C-20 91828.doc -38- 200423933 (sc-65 4, Santa Cruz)或 Akt抗體 #9272(Cell Signaling)進行評 估。並使用一HRP連接抗兔IgG當成一次級抗體。所有點潰 可利用化學發光受質Super Signal West Dura(Pierce公司）使 之顯影。一來自 Alpha Innotech公司之 Alpha Imager 8800 可 用於點潰中信號之定量。 >月洗貝驗·將HUVEC細胞如上述方式處理。和化合物 A(10 nM) —起培養45分鐘之後，用VEGF(50 ng/mL)刺激5 分鐘，除去上清液，使用含有VEGF和Na3V04之飢餓培養基 清洗並取代。將細胞溶解之前先培養一段預期時間，並利 用免疫沉澱法和西方點潰法進行磷酸化作用和總VEGFR-2 (見上述）。在另一實驗中，細胞可利用VEGF處理，處理總 時間如上述，VEGFR-2磷酸化和總VEGFR-2同樣在預期時 間點上進行測量。清洗期間之信號可用密度描記法定量。 來自每個實驗之最大刺激（5分鐘）之強度互相標準化 (Normalized)，且將兩實驗中每個時間點之磷酸—VEGFR-2 之強度交叉比較，以決定VEGFR-2磷酸化相對於未經處理 但經VEGF-刺激之細胞之修復情形。 腫瘤模型：對於人類MV522(大腸癌）和MDA-MB-231(乳 癌）模型來說’在昏迷之老氣（n = 8〜12)身上每個部位植入 (s.c.)5 xlO6個細胞；對於老鼠路易士肺癌模型，則是將腫瘤 片段（1-2 mm2)以套針植入B6D2F1老鼠之右脇腹。通常於第 7天（MV522)或當平均腫瘤大小達到150-200 mm3 (MDA-MB-23 1)時開始給藥。 式1之化合物調配到0.5% CMC/H2〇中並以口服方式給 91828.doc -39- 200423933 藥，一天兩次。克癌易則是味 疋调配在7% Et〇H/3%聚sorbate/ 90% H2〇，並且每個星期以趋_ 靜脈注射給樂。治療通常持續 3-4週。腫瘤之長度和寬度可士 、 X』利用一電子測徑器測量得之， X寬 一個星期測量三次。腫瘤體并—，一 也知之計算如下：〇.4χ(長 漿收集起來以進行藥物濃度 數據記錄為平均值±SEM。將& 之分析。 結果顯不在表1 - 3。 I 1 4匕&物1之致力和選擇性 標的 VEGFR-2(KDR) VEGFR-l(Flt-l) VEGFR-3(Flt-4) PDGFR-β c-套組 FGFR-1 1.1 ^8.3 id•3 ---- nd

Ki(nM) 受體麟酸化，IC5〇(nM)a 0.25 1.2b 0.29 2.5 2 218 nd :尚未決 ^細胞增«定«而得12·、蛋自存在下糊画測量得到； 定 其他經過篩檢但沒有列出Ki計算值的酵素有：cMet、 LCK、c-Src、FAK、Pyk2、IRL、BTK、CDIU、CDK2、CDK4、 PKA、PKC、PLK和 Chkl。 表2在MDA-MB-231人類乳癌模型中，式1和克癌 易共同給藥之研究設計 化合物l(mg/kg)a 多西紫杉(docetaxel)b 劑量選擇原理 25 0 ED% 5 0 ed5〇 91828.doc -40- 200423933 1 0 低劑量 0 20 給老鼠70%MTD 0 10 計算等量人類MTD 0 2 低劑量 25 20 耐藥性和DDI 5 10 加成性和DDI 5 2 加成性和DDI 1 10 加成性和DDI 1 2 加成性和DDI a口服，一天兩次，每天給藥；5靜脈注射，一星期一次 表3 多西紫杉（docetaxel)和化合物1之組合治療可在 MDA-MB-231異種移植物模型中產生較大之抗腫瘤活性 化合物l(mg/kg)a 多西紫杉 (docetaxel)b PR* CR** 0 0 0 0 25 0 3 0 5 0 3 0 1 0 0 0 0 20 4 0 0 10 6 0 0 2 0 0 25 20 12 0 5 10 10 2 1 10 7 2 5 2 0 0 1 2 0 0 a口服，一天兩次，每天給藥；5靜脈注射，一星期一次 組合組證實全部或部分腫瘤退化之發生率增加。將藥劑 91828.doc -41 - 200423933 結合使用時’腫瘤生長速率 ,,αα ^ 季父大幅度地降低。組合治療 比早一樂劑具有同樣的耐藥性。 牙 將式1之化合物，6 L△(甲基胺曱醯基）苯磺醯 胺]-3-E-[2-(^ 啶基）攻 )乙基]°弓丨唑，以各種劑量給藥予罹 患固體腫瘤之疝人。二— 一十们病人（丨3個男性，17個女性）以式 1之化合物治療，口服’錠劑形式，-天兩次或一天四次。 28天為-次循環。特定腫瘤診斷有乳癌（⑴、甲狀腺癌⑺、 “田胞癌(5)和其他癌症(5)。利用液相層析儀一坦頓 (^andem)貝邊儀（LC-MS/MS)測量藥物動力數據。在循環期 第15天給藥時間之後1/2小時、i小時、2小時、4小時、$小 時和12小時進行血液採樣。 藥物動力結果（第15天平均值）顯示在表4。除非另有說明 否則病人不用禁食。括號内的數字為變異係數，以百分比 表示在表中，Cmax為式1化合物之最大觀察血漿濃度， AUC(0-24)是24小時AUC血漿濃度，且Τι/2為半生期，由濃 度對時間圖中決定此值。表中載入之「附有ΡΚ之病人數#」 代表可獲得藥物動力資料之病人數。 表4 給藥時間和劑量 病人數#/附有 PK之病人數# Cmax(ng/mL) AUC(0-24) (ng · hr/mL) 丁 i/2(hr) 5 mg ’ 一天兩次 6/6 27.1(36) 257(39) 2.2(16^^ 5 mg，一天兩次，禁食 8/6 54.5(48) 311(76) 2.7(39)' 15 mg，一天四次 6/6 78.6(54) 797(96) 3.5(46)~ 2〇mg，一天兩次 4/3 129.4(86) 1 1524(87) 3·1(51「 91828.doc -42 - 200423933 此外，在第一個群體（n = 6)中夕、广；〆 1 ) T之病人接受個別劑量，範圍 從每天四次’每次W mg至每天兩次每次川㈣未顯示 PK)。在禁食狀態與未禁食狀態比較中，血聚暴露較高(約 49%)且病人内之交異減少。最大耐藥劑量（町〇)定為$ mg ’母天兩次’禁食。在劑量上劑量限制毒性（DLh)大於 ^丁二直時為冑血壓（HTN)、㈣、肝功能試驗值上升、騰臟 炎、窒息和胃炎。此外，2位有反應之NSCLC病人再停止化 合物治療後三星期出現致命之咳血，亦可觀察到出現非劑 量限制蛋白尿。當劑量少於或等於MTD時，DLT在一位病 人身上出現一、、及月k。在14位病人中有7位可觀察到出現非 背J里限制咼血壓且以傳統鬲血壓藥物治療。在這個沉重地 預先治療族群中有五位病人，在利用RECIS丁標準時可觀察 到兩個可容忍部分反應（在腎臟細胞和上頜竇之腺樣囊腫） 以及穩定疾病持續大於或等於4個月（範圍從‘13個月）利用 dceMRI，可進行21位病人之預先分析，以便測量在基線上 且在第2、28和56天時’由式1之化合物引發之血管影響。 此百分比改變在平均 K_s上（p.s. Tofts，g.J.M. Parker，R.E.

Port，J. Taylor and R.M. Weisskoff，Estimating Kinetic

Parameters from Dynamic Contrast-Enhanced Ti-Weighted MRI of a Diffusable Tracer: Standized Quantities and Symbols, Journal of Magnetic Resonance Imaging, 10:223-232 (1999)) ’並且在相對強度與時間曲線下之初面積（IAUC)都針對每 個指標腫瘤而予以計算（每個病人n=1-4)。腫瘤血管反應定 義為到了第二天大於或等於減少50%的基準參數值。在i 8 91828.doc -43 - 200423933 可評估病人中有6位可觀察到出現急性（第二天）腫瘤血管反 應（其KtranS和1AUC大於或等於減少50%)，且18位中有1Hi 經證實其Ktrans和IAUC皆大於或減少40%。基於掃描的技術 問題，2 1張影像中有3張無法評估。此實例顯示，經由臨床 反應和急性腫瘤血管改變之證實，式j之化合物為一高活性 藥劑。 實例3 在口服給予式1之[C]-標記化合物之每公斤劑量3 〇 mg 游離鹼，給予無傷或是膽管中裝入套管之小獵犬之後，可 觀察到廣泛之代謝反應。生化轉化途徑包括加氧反應（單或 二）、葡萄糖醛酸化反應、葡萄糖基化反應和加氧反應之後 接著進行；^化反應或葡萄糖基化反應。圖1顯示不同之代謝 物在血漿中，M12( — N-氧化物）是唯一可偵測到之代謝 物。在尿液中，M5(一去吡啶羧酸)為主要代謝物。主要之 膽囊代謝物包括M8( 一硫化物)和M12。主要之糞便代謝物 Mil之化學結構仍然未知。 在小楓犬口服該化合物之單一劑量之後出現之[Mc]_衍 生幸田射活1±之排泄板式，&狗和母狗具有相似才莫式，其輻 射活f生主要是經由糞便排出體外。無傷之公狗之平均回收 率在糞便中為85.5%且在尿液中為5.3%，相較於無傷之母狗 ”糞便中之回收率為8"%且在尿液中為7 〇%。膽管中裝入 套吕之a狗在膽汁中排泄出相當少量之射活性物（Μ%回 收率），其他輻射活性回收出現在糞便中（52 7%)和尿液中 (m)。來自膽管中裝入套管之狗所結合之總尿液和總膽 91828.doc -44- 200423933 汁輻射活性得知’輻射活性給荜 ^ τ有大約20%被腸道所吸 。斤有樣本之總平均时㈣於無傷之公料母狗分別 桃4%和92.6%，且對膽管中裝人套管之公狗為89.6%。所 有代謝物之情形和結構之說明，可利用和無線電册⑽ 測器連線（β-RAM)之HPLC偶合以及帶有電子嘴霧剛和 大乳屢化學離子化（ΑΡα)來源以正或負模式加以進行。 實例4 式1之化合物在給予[MC]_標記化合物之單一口服仏藥之 叫老鼠體内遭遇到廣泛之代謝作用。未改變之藥:在尿 液和糞便中具有低回收百分比，且可觀察到如和相Η代謝 物之多樣性。生化轉化途徑包括加氧反應（單或二）、葡萄糖 搭酸化反應1萄糖基化反應和加氧反應之後接著進行硫 化反應或葡萄糖基化反應。圖2顯示不同之代謝物。在血漿 中，未改變之藥物和Μ12卜Ν_氧化物）代表兩種主 M7(-葡萄糖醛酸化合物)代表尿液和糞便中最重要之代謝 物0 在母公斤[14C]AG-013736之劑量口服給予5〇 mg/kg之游 離驗予-雄性CD]老鼠之後，大部分的[14c]_衍生轄射活性 物都回收至糞便+。幸昌射活性（劑量之。/〇)在、給予劑量Μ小 時後之平均回收率在糞便中為65篇，在尿液中為12.7%。 輻射活性之排泄速率相當快速，在給藥24小時内劑量可回 收72 /〇輻射活性代謝物之情形和結構可利用lC_ram_ms 方法得知。 除了顯示在圖1和圖2之代謝物外，其他已知代謝物包括 91828.doc -45 - 200423933 式1 a顯示之活性去甲基代謝物。

實例5 藉由使用免疫組織化學來測量腫瘤微血管密度（MvD)可 評估動脈生成反應。將冰凍之腫瘤部分利用血管表面標記 物CD-3 1加以染色，且以人工定量出數個組織部位的血管 量。研究證實，式1之化合物之口服給藥（一天兩次）持續2_3 星期’和控制腫瘤比較起來，可減少需治療腫瘤之血管數 量達70%。此經過治療之後的微血管密度之減少在所有使 用之腫瘤模型（包括LLC、MV522和M24met)中皆可觀察 到。在LLC模型中，當持續經由一滲透Alzet幫浦傳送時， 式1之化合物會產生一明顯之生長抑制。來自三項研究之數 據顯示，在LLC模型中可由此級之藥劑達成之最大腫瘤生 長抑制為78%。在血漿濃度達到55±17 ng/mL(N=3)如此低 時’即可達成90%之最大生長抑制。此濃度被指定微生物 活性濃度（BAC)。50%之最大生長抑制和一血漿濃度28土丄！ ng/mL(N=3)有關，此濃度被指定為最低效力濃度（με〇。 在一研究群中，利用化合物之連續注入所產生之70% MGI 和一 AUC(0-24)5 74 ng · hr/mL有關，然而在相同研究中， 在口服給藥一天兩次之後，一 720 ng· hr/mL之AUC(0-24) 可得到40%之最大生長抑制（MGI)。此結果建議，此模型中 91828.doc -46- 200423933 可見之抗腫瘤效力係經由濃度所驅動，且 合物之-連續低濃度可有效產生最大抗腫瘤效力。 式1之化合物在人類乳癌異種移植物（xen〇graft)模型 MDA-MB-231中可當成一古^ 田成有效之早一樂劑。為了製備此模 型中一具有式1化合物和克癌易組合以作為一有效研究，必 須進行一項天生無毛老鼠之預先研究，以決定藥物一藥物 潛在交互作用對於藥物動力ρκ^σ耐藥性之影響。在以克癌 易治療之動物身上，經由靜脈注射給藥，一個星期給予一 次1 5或30 mg/kg克癌易之後，和控制組比較後發現其體重 降低（分別為7%和11%)。動物在接受單獨使用克癌易治療或 給予克癌易和式1之化合物組合治療（口服3 〇 mg/kg/day，i 6 天），兩者之間的體重並沒有明顯差異。給予克癌易並不會 影響到式1化合物之AUC，其中AG_0137362Cmax值在組合 組中，與單獨使用式1之化合物比較起來，明顯降低 選擇之組織（肝臟、腎臟、心臟、脾臟、胃、小腸和大腸、 卵巢、胸骨、關節）的組織學檢驗揭示，在接受式i之化合 物（在本研究中當成一單一藥劑）治療之老鼠身上沒有標的 器官影響。在接受克癌易治療之老鼠身上注意到的改變包 括卵巢濾泡壞死和最小至輕微骨髓細胞過少。式1化合物和 克癌易之組合治療並不會使克癌易對於卵巢之影響更加惡 化，而是可以在接受式1化合物/克癌易組合治療之動物身 上注意到骨髓細胞過少之強度增加（最小至輕微）。此外，在 組合治療動物身上可觀察到骨髓出血，猶如細胞過少強度 增加之續發性影響。 9l828.doc -47- 將式1之化合物和券病 ㈤易、、且5以進行MDA-MB-23 1腫瘤

杈型之效力評估。式H 一 °物早獨使用（25、5和1 mg/kg，口 克二=，給予三週)可造成劑量依賴腫瘤生長抑制。 ^早獨使她週靜脈注射）給予脚lGmg/kg，但是不 給予2 mg/kg ’亦同樣有 r ^扣 文由此可見，式1之化合物和克 癌易之間可能具有一有刹 Λ 有利之/σ療性交互作用，此益處在二 組合藥劑皆為高和中劑量時較為明顯。部分退化（腫瘤大小 減夕1土6:至97%)之發生率以及在高和中劑量組合之完全反 應，遠昂於單獨給予相同劑量之個別藥劑之群組。由於此 研究之受限群组和相當短之時間’此並非一決定性之最終 叙現。式1之化合物在所有劑量上皆具有極佳之耐受性。和 其他所有群組比較後，在高劑量組合群組（25mg/kg化合物工 和20 mg/kg克癌易）中給予三次化學治療藥劑之劑量之後， 發現平均體重降低3%至7%。藥物動力分析證明Μ化合物 之AUC值在克癌易存在時不會受到影響，但在組合群組中 和单獨使用式1化合物之群組比較起來’值明顯降低。 針對式1之化合物和克癌易之組合在LLC模型中之抗腫 瘤效力進行調查。LLC模型為高度抗克癌易。在記錄之 MTD(每週劑量30 mg/kg，靜脈注射）中可看見有細胞毒素劑 (TGD= 3·2天）存在時小腫瘤生長延遲（丁 GD)。因為大型主要 腫瘤使得所有老鼠皆在實驗的28天内痛苦死亡。相反地， 式1化合物之單一藥劑產生劑量依賴和統計上明顯之 TGD(10 mg/kg為 13.4天，且 30 mg/kg 為 15.4天，口服，一天 兩次）。然而，此藥劑僅僅是延遲，並非停止腫瘤轉移至肺 91828.doc -48- 200423933 部。高劑量組合群組之卿(20.4天），而不是低劑量組合群 、、且（TGD 1 5 ·2天）’纟統什上明顯不同於兩種藥劑之單獨使 用（分別為1-0.0079和卜〇·254)。在高劑量組合群組中，有 較多動物（3/Η))達到目標終點，但在低劑量組合群財並沒 有。總而言之，式i之化合物和克癌易之高劑量組合治療， 對於主要之腫瘤生長和轉移，比兩者之單一藥劑治療，能 產生較大之延遲，但是它並沒有造成完全治癒。 一利用MV522腫瘤模型之研究證明，每日口服（一天四次） 式1化合物之單一劑量60mg/kg，會得到與一天兩次口服％ mg/kg相似之腫瘤生長抑制（ρ=〇· 154)。此外，當口服劑量一 天兩次30 mg/kg，連續五個工作天之後接著兩天假日不給 藥，與每曰口服一天兩次使用相同濃度比較起來，抗腫瘤 效力並沒有出現差異㈣.223)。此結果建議，在此非臨床 腫瘤模型中，可能可以給予式i之化合物一天四次或中間具 有某些暫停給藥之時間，並預期可達到一明顯抗腫瘤效力。 在MV5 22異種移植物（xen〇graft)模型中，針對用以產生抗 腫瘤效力所需要之式i化合物之受體抑制時間量和濃度加 以凋查。此結果顯示口服給藥（一天四次或一天兩次），要達 到-50%之抗腫瘤效力，必須約24小時每日暴露在£<^〇之 上。為了達到90%之腫瘤生長抑制，每曰最少4小時之暴露 在血桌/辰度—40-60°/〇g是有必要的。上述時間之外的暴露並 >又有保證可以獲得其他的效力。在一天兩次和一天四次之 群組中皆有相似之體重減輕；兩者皆低於。因此，給予 適當劑量和暴露時間，一天四次之配方效力與一天兩次之 9l828.doc -49- 200423933 配方效力相同。 此亦證明’利用式1之化合物經由Alzet幫浦之連續暴露， 和規律給藥比較起來，會產生較大之抗腫瘤效力。利用幫 浦輸送10 mg/mL會產生一固定30 mg/mL之平均系統性暴 露，因此造成腫瘤之停滯。相反地，可產生式i化合物之血 聚濃度在注射ECm之上的飽和劑量（口服，一天兩次），可能 只產生腫瘤生長延遲。因此，式j化合物之連續系統性暴露 顯示出比一天兩次口服給藥配方對於治療腫瘤而言更為有 效。 使用間歇給藥配方之式i化合物之抗腫瘤效力亦在此進 行研究。治療群組如下：每曰給藥媒劑、間歇媒劑、每曰 劑量3〇mg/kg(每日兩次）和一 3〇mg/kg之間歇劑量。間歇給 藥日守間表如下.循環-1 (第i]〜；[8天給藥且第！9〜28天不給藥） 以及循環-2(第29〜36天給藥且第37〜44天不給藥）。當平均腫 瘤大小為250 〇^3時開始給藥；所有都給予八(}_〇13736(口服 、’°藥，一天兩次）。總之，在間歇給藥和一天兩次給藥之間 有明顯不@，和連續每日給藥配方在產生生長延遲上較為 有效。對於間歇給藥群組而言，在停止給藥3_4天之内，腫 瘤重新正常生長。然而，在循環_2給藥之2天内腫瘤生長抑 制重新開始。如預期’在任何群組中皆無腫瘤之退化。 當本發明以引用特定騎佳之具體實例之方式加以說明 時，熟習本技藝者將了解，隨著本發明之規律實驗和實務 練:’做出改變和修正是可能的。因A，本發明並不僅限 於削述之a兄明’而是藉由附加之中請專利範圍及該等同等 91828.doc -50- 200423933 意義之内容加以定義。 【圖式簡單說明】 圖1顯示狗接受14C-標記化合物之單一口服劑量測定後 之式1化合物之代謝物。 圖2顯示老鼠接受14C-標記化合物之單一 口服劑量測定 後之式1化合物之代謝物。 91828.doc -51 -

Claims (1)

1. 200423933 拾、申請專利範圍： 1. 一種投予哺乳動物之劑型，該劑型包含有效量之式玉化 合物：

   其醫藥可接受之鹽類，或溶劑合物，或纟混合物，該有 效量係當其投予哺乳動物之後，提供自25至45〇〇 ng.hr/mL之式i化合物或其活性代謝物之2心小時auc 血漿值之量。 2·如申請專利範圍第丨項之劑型，其中該小時auc血漿 值係從 1 〇〇至 8〇〇 ng.hr/mL。 3. 如申請專利範圍第丄項之劑型，其中該劑型為口服劑型。

   5. 6. 如申請專利11圍第1項之劑型，其中該量為自2至10叫 如申請專利範圍第4項之劑型，其中該劑型為口服劑型 91828.doc 1 種自〇.5至30叫之包含式1化合物 '其醫藥上可接受 之鹽顯或浴劑合物、或其混合物之劑型： 200423933 7. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之㈣，其係用於治 療異常細胞生長。 8. 如申請專利範圍p項之劑型，其中該劑型係為口服給 藥。 9·如申凊專利範圍第7項之劑型，其中該劑型係以一天至 少一次之劑量頻率給藥。 1 0.如申明專利範圍第7項之劑型，其中該劑型以一天至少 一次之劑1頻率給藥。 11.如申請專利範圍第7項之劑型，其中該哺乳動物在給藥 步驟珂至少禁食兩小時，在給藥步驟之後至少禁食兩小 時’或在給藥步驟前和後都至少禁食兩小時。 1 2·如申請專利範圍第7項之劑型，其中該異常細胞生長為 癌症。 13·如申請專利範圍第12項之劑型，其中該癌症係選自肺 癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭癌或頸癌、皮膚黑色素 瘤或眼球内黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門 部位之癌症、胃癌、大腸癌、乳癌、輸卵管癌、子宮内 膜癌、子宮頸癌、陰道癌、女陰癌、霍吉金氏病（H〇dgkin，s disease，惡性淋巴肉芽腫）、食道癌、小腸癌、内分泌 糸統癌、曱狀腺癌、副曱狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉 瘤、尿道癌、陰1癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、 淋巴細胞淋巴瘤、膀胱癌、腎臟癌或輸尿管癌、腎細胞 癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS)贅瘤、主要CNS淋巴 9l828.doc 200423933 瘤、脊中軸腫瘤、腦幹神經膠瘤、腦下垂體腺瘤、或 其組^^。 14.如申請專利範圍第7項之劑型，其中該方法進一步包含 共同投予選自有絲分裂抑制劑、烷基化劑、抗代謝產 物、插入抗生素、生長因素抑制劑、細胞週期抑制劑、 酵素、拓樸異構酶（topoisimerase)抑制劑、生物反應修 飾物、抗體、細胞毒素、抗激素、抗雄性素及其混合物 所組成之群之抗腫瘤藥劑，。 15·如申請專利範圍第14項之劑型，其中該抗腫瘤藥劑為多 西紫杉（docetaxel)。 91828.doc