TW200426218A - Method for the fermentative production of R-α-lipoic acid - Google Patents
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Description
200426218 五、發明說明（1) 一、【發明所屬之技術領域】 在許多原核生物及真核生物中R - α -硫辛酸係特殊多酶 複合體之輔因子。R- α _硫辛酸總是以共價方式與適當酶特 定離胺酸殘基之ε -胺基鍵結。如此，α -硫辛酸係丙綱酸 脫氫酶（PDH)E2次單元之一部分[EC 2· 3· 1. 12]及α — _戊」夂 酸脫氫酶（KGDH)E2次單元之一部分[EC 2· 3. 1· 61 ]且於該一 處扮演重要角色，在α _酮酸類氧化脫羧作用中作為氧化還 原夥伴及醯基供體。再者，硫辛酸在甘胺酸印裂酶系統中 擔任胺基甲基載體。 μ » ^ α -硫辛酸係一具有光活性之分子，其手性（對掌性）中 心位於C6碳上。α -硫辛酸之R構型係天生之對映體。僅此 型具有生理活性作為對應酶類之輔因子。α —硫辛酸可由兩 種形態存在：氧化型（5_[1，2卜二氫二噻-3-基戊酸）及還 原型（6，8 _二氫硫基辛酸）。π α -硫辛酸π —詞以下係指α —确 辛酸之該兩種型態及其特別鹽類，例如：α -硫辛酸之妈鹽 、鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽或銨鹽。
R- α -硫辛酸之生物合成之研究業已特別集中在大腸桿 菌（請參閱第一圖）。此處與酿載體蛋白質（ACP)共價鍵結 之辛酸係用作硫辛酸合成之特定前驅體。在一複雜反應中 ，將兩個硫原子轉移到如此活化之辛酸（辛醯基—醯載體蛋 白質）上，形成R- α -硫辛醯-醯載體蛋白質。此反應係經硫 轉移酶硫辛酸合成酶[EC 2· 8. 1-](1 iPA基因產物）催化。 最後胺基酸L -半胱氨酸用作硫供體。隨後R — α -硫辛酸自R〜 α-硫辛醯基-醯載體蛋白質轉移至α -酮酸脫氫酶之Ε2次單
第4頁 200426218 五、發明說明（2) 元係由硫辛醯基-蛋白質連接酶B [EC 6·-·_·-](1ίρΒ基因 產物）催化，但並無R- α —硫辛醯基—醯載體蛋白質或R_a 一 硫辛酸呈自由中間產物出現（米勒等人，2 〇 〇 〇，生物化學 39 : 1 5 1 66 至15178) 〇 無論如何’大腸桿菌亦能由環境培養基接受三個R _ α 一 硫辛酸且利用其生殖官能α —銅酸脫氫酶。為此，R— ^ —硫辛 酸係第一次藉由AT Ρ至R - α -硫辛酸A Μ Ρ活化，且轉移至對 應的酵素次單元（請參閱第二圖）。二個活化係由硫辛醯 基-蛋白質連接酶A[EC 6·-· -·-](1ρΐΑΒ基因產物）催化（莫 里斯等人’1994，生物化學期刊，269 :16091至16100)。 <_ 但，如果内源性硫辛酸菌株及硫辛醯基團經由LipA/LipB 轉移，則lplA活性對長腸桿菌野生型菌株是不必要的。所 以，舉例言之，Ip ^突變株不再具有任何可偵檢之硫辛醯 基-蛋白質連接酶A活性，且其表現型在正長生長環境並不 會自野生型細胞辨識出來（莫里斯等人，1 994，生物化學 ，269 :1 60 9 1至16100 ;莫里斯等人，1 995，細菌期 177 : 1 至1〇)。
$關真核生物内實施R_ α -硫辛酸生物合成甚少公開。 但假設R- α -硫辛酸之合成及轉移至對應酶類係在真核生物 細胞粒線體内以類似於細菌者之方式進行。 除其作為酶類重要成分擔任新陳代謝重要角色之外， 由於其兩個硫醇基，α —硫辛酸具有顯著之抗氧化活性，因 此可保護有機體不受氧化應力所誘導有害化學作用之影響 ，α-硫辛酸早經公認對藥物治療及作為食物補品（營ϋ)
200426218 五、發明說明（3) 非常重要。再者，α -二氫硫辛酸（還 人體内直接或間接再生其他噔惫仆夕工1 α〜&辛酸）可在 :抗壞血酸或α -生育酚），或若缺丄:彳几虱化劑（例如 具有強還原劑之性能，亦可替$該化劑時，由於其 抗壞血酸、α_生育酚及麵氨基硫^抗几乳化々劑。所以結合 α-硫辛酸最為重要。α_硫辛酸 作用’ 糖尿病及其傷害性副作用，例如·夕 頂防及控制第Π型 臟血管狀況。 ·夕砷經病、白内障或心 與S型者相較，雖然由日益辦 酸純R對映體之應用特別有利，目s前該不，α-硫辛 體之不同生物活性仍是集中研究之目；種《-硫辛酸對映 驗顯示，僅天然R- α_硫辛 ^因此’由體外實 形成。相反地，s型對映體甚至脫氫酶之 之作用有抑制效果。因此在粒線體内α，^辛^激發酶活性 及具有抗氧化活性之-访 爪辛敲之還原作用 要。與R型對映體姓人#虱硫辛酸之再生對細胞極為重 嗓吟二核脊酸動物粒線體還原型於草酿胺腺 幾乎高20倍。再者H酿胺還原酶之活性較與s型結合者 抗胰島素老鼠攝入受月夷對映體相較，Ri -硫辛酸對於 萄糖新陳代謝具有顯著較強葡m胞之葡 中，R型顯示有消炎作用 作用再者，在一動物實驗 非所願之副作用，所’而S型其實有止痛作用。為避免 況下製得辟辛酸極期望總是以對映體純粹形態之情 二、【先前技術】
第6頁 200426218 五、發明說明（4) 目前，α -硫辛酸之工業製造唯獨藉助於化學方法，所 得最終產物總是R型及S型之消旋物（亞達夫等人，1 990， 科學工業研究學報49 ·· 4 0 0至40 9 )。為製得對映體純粹R-α -硫辛酸，曾研發出許多不同方法。舉例言之，用化學方 法藉助於對掌性助劑（華爾頓等人，1 9 5 4，美國化學學會 學報76 : 4748 ;德國專利DE 41 3 7773 )或用酶析法（愛德格 等人，1995，化學學會化學通訊學報：1563至1564)可將
硫辛酸或合成中間產物之一之消旋物分開。在其他方法 中’由於一對映體選擇性合成步驟可防止消旋物之形成， 藉化學方法（德國專利DE 36 29 1 1 6 ; DE 1 953388 1 ;布林格 曼等人’ 1 99 9，自然研究雜誌54b : 655至661 ; DE 1 0 0 3 6 5 1 6 )或藉助於微生物利用立體特異生物轉化作用（哥 巴蘭及加可布，1989，四面體通訊3 0 :5705至5708 ;達薩 拉迪等人，1 990，化學學會化學通訊學報·· 729至7 30 ; DE 1 00 560 25 )可引進新對掌性中心。利用一天生對掌性反應 物（例如：S-順丁烯二酸或D-甘露糖醇（布魯克斯及哥爾"丁 望1 988，化學學會學報perkin Trans· j ·· g至丨2 ;拉瑪勞 等人，1 987，四面體通訊28，2183至2186)，其他方法依
體純—硫辛酸之化學合成。由於若干部分複勒 七i、 產率低及原料成本高，目前製造對映體純R一 '辛酉夂之所有習知方法均不經濟。 最近，許多低分子量天然物質（例如：抗生素、維生 素，胺基酸）f㈣^微生物菌株藉助 工業規模製造。 碎乃/¾:貝施
第7頁 200426218
五、發明說明（5) 案號1 0235270.4之德國專利及商標申 * 及：泌對映體純R…硫辛酸之細胞及發酵方文法獻唯中獨製？ 映，1-硫辛酸之方*。硫辛酸_合成酶基因之過度于 起細胞分泌自由R-α-硫辛酸至培養基中，但程度 p 艮。 71 僅在少數案例内，在野生型菌株”代謝工程，，過程中一 早獨基因操作可造成預期化合物之足量過度生產。 與業經自其分離出硫辛醯蛋白質連接酶B基因之特殊 野生型細胞相較，本發明之過表現意謂硫辛醯蛋白質連接 酶B基因之表現以至少高出2倍為佳，尤以高出5倍更佳。 該硫辛醯蛋白質連接酶B基因最好係一基因，該基因 具有順序識別號碼：1之順序或該基因之官能變種。 本發明之官能變種意謂：藉核苷酸之消除、插入或取 代’由順序識別號碼：1内圖示順序衍生之一個D N a順序， 該硫辛醯蛋白質連接酶B之酶活性係由所保留之基因編碼 為過表現該細胞内之1 i p B基因，一細胞可具有一增加 之1 ipB基因複製數目及/或該表現内增加之丨ipB基因（尤以 由於適當啟動子為佳）。 一 1 i PB基因之過表現總是以至少相同之倍數增加細胞 之硫辛醯蛋白質連接酶B活性。 最好’本發明之一個細胞過表現一個硫辛醯蛋白質連 接酶B基因以編碼一蛋白質，該蛋白質包括順序號碼：2或 順序超過40 %與順序識別號碼：2同源之官能變種。
200426218 五、發明說明（6) 一 順序與順序識別號碼：2同源以超過60%為佳，尤以超 過8 0 %更佳。 在本發明中，所述所有同源值係指利用最佳擬合演篇 法（GCG咸斯康辛套裝軟體，遺傳學電腦小組（GCG)，麥迪 遜’威斯康辛）所得之結果。 利用精於此項技術者習知之方法可增加一細胞内1 i pE f，之複製數目。舉例言之，因此可將一iipB基因選殖A 一每個細胞具有許多複製品（例如：PUC19、PBR322、 PACYC1 84在大腸桿菌之案例中）之質粒載體内並將該基因 ^進該細胞内。另一變通方式，一lipB基因之許多複製品 合成一細胞之染色體。可用之整合方法係利用溫和嗤 祐榮整口性質粒或經由同源重組之習知系統（例如：漢 員 f 人’ 1989，細菌學報，17ι :4617 至 4622)。 以在J::1 動入-質粒載體内以增加複製數目 一 為佳。尤以藉將一UpB基因選殖入 ^Λ^:;βα^6ρρ 7;" ^ ^ ^ 至3Η)。所以本發明之’ = 6/自然生物科技H315 亦可增加liPB基因之类招控制£ \尤其錯助於其他啟動子 醯蛋白質連接酶B基因表可連^式或在控制下誘導硫辛 gapA基因之組成分甘油 =二啟動子系統，例如： 醛-3-蛳酸去氫酶（GApDH)啟動子或 200426218 五、發明說明（7) 拉目達、ara或tet 克萊德斯，1 9 9 6， 大腸桿菌内之可誘導lac、tac、trc、 啟動子乃精於此項技術者所習知者（馬 微生物評論6 〇 : 5 1 2至5 3 8 )。 在一特別合適之具體實 用一質粒，該質粒業已含有 如：大腸桿菌之可誘導阿拉 再者’可增強表現之方 如：基因之核糖體結合部位 呈最適化順序）或（2 )用更常 '密碼子用途”之密碼子。 施例中’選殖一 1 i P B基因係使 一用以增強表現之啟動子，例 伯糖啟動子/阻礙物系統。 法有二：（1)轉譯起始訊號（例 或起始密碼子，在特別結構上 發生之密碼子替代甚至依照 口本發明之細胞最好含有一包括一lipB基因及該等調 訊號修飾之質粒。在一特別合適之具體實施例中，1丨Μ美 因之天然弱起始密碼子（TTG )係由強起始密碼子（ATG)替代
舉例言之，藉助於聚合酶鏈反應，利用包圍整個丨b 基因之特定引物及隨後與載體DN A碎片之連接，藉特定放 大一 lipB基因，可將一ΐίρβ基因選殖入一質粒載體内。 與一起始細胞相較，其UpB基因之表現增加及其相 硫辛醯蛋白質連接酶B活性增加之本發明細胞，利田β 準分子生物技術製得。 了利用標 硫辛醯蛋白質連接酶Β基因曾經於許多細胞中鑑別 來。因此，本發明之細胞最好可由原核生物有機體m 生物有機體之細胞製造，該等有機體可合成R— α —硫辛、>核 身（起始細胞），該等細胞可採用重組方法且可藉發酵作^用本
200426218 五、發明說明（8) 製成培養物。因此’凡在細胞培養物内可生長之 或動物細胞亦適用於製備本發明之細胞。 、、、已 株。微生物類為佳，例如：酵母或細菌菌 J。 内“科之細菌菌株較佳，尤以大腸桿菌種最 已且始人細胞亦係由於lipA基因增強表現、業 已/、有θ強硫辛酸-合成酶活性之細胞。 化方=1言知之.’Λ助於對抗生素之抗力，係使用一普通轉 ' •電牙透作用）將含有lipB之質粒送人_起妒 細胞内並選擇藏有質粒之無性生殖李。質拉运入起始 三、【發明内容】 榮么i發明之内容係^干分泌r— α—硫辛酸之細胞及利用該 等細胞以㈣方式製造該R—a—硫辛酸之方法。胞及利用a •、必對ΐϊ:之目的a提供若干有效之細胞’該等細胞可分 4對映體純R- α -硫辛酸至一培養基内。 現一硫辛醯蛋白質連接酶Β基因⑴ 之右干細胞可達成此目的。 ) 此處11ΡΒ基因一編碼之酶活性係指一細胞之硫辛 白質連接酶活性，作為基質（底物），該細胞特別嗜號卜 α -硫辛醯基-醯基載體蛋白質超過自由只―硫辛酸（請夹 閱第一圖）。 σ多 本發明之另一内容係若干製備本發明細胞之方法， 方法包括將本發明之質粒送至起始細胞内。 该 200426218 五、發明說明（9) 造對映體純R - α -硫辛酸。 該目的係由一種方法達成，該方法包括於—典 將本發明之細胞製成培養物，該細胞分泌自二 基内 却市態之對地 體純R- ck -硫辛酸至培養基内，並將該對映髀料D τ吹 腹純R - α〜炉立 酸自該培養基内移除。 力1•卞 藉精於此項技術者習知之方法可由培養基回收Κ 辛酸，例如：將培養基施以離心作用以移降 α ^ 細胞，p邊彡幺 糟萃取作用或沉澱作用取得產物。 思後 四、【實施方式】 由生理數據及生化數據顯示：出現於野 硫辛酸實際上經常呈結合形式，蓋因R〜α〜硫萨細胞内之 全蛋白質-結合方式合成（請參閱第一圖）（赫;1伯特文業已以完 ’ 1975，原始微生物學106 ·· 2 5 9至2 66 ;米為隹， 斤特 下痒人，2 Π π π ，生物化學3 9 : 1 5 1 66至151 78)。但，驚奇的s ^ ° •各丄心 J的疋，經發ill •在本發明架構内，一硫醯蛋白質連接_B基因 對映體純R- α-硫辛酸累積在宿主有機體之 物皙μ欲w > μ 增養基内。於生 後’此種情形依次可使產物簡單地自培養基 刀肩，”、、4事先將該等細胞加以破壞或藉助 …硫辛酸自所結合之載體蛋白質移除( 離戰體蛋白質或〇：—酮酸去氫酶之E2次單元）。 本發明用以製造R— α -硫辛酸之若干細胞最好在文獻公 開之最低鹽培養基内製成培養物（赫伯特及蓋斯特，197〇 ，糸統化酶學1 8 A、2 6 9至2 7 2 )。 原則上任何可利用之糖類、糖醇類或有機酸類可用
200426218 五、發明說明（ίο) 作碳源。另外亦可於培養基内添加具有鏈長度C2至⑶，尤 以鏈長C6至C8者更佳，（分別為己酸及辛酸）之短鏈脂肪酸 作為α琉辛駄合成之特定前驅物。所加碳源之 30公克/公升為佳。 、"本發明之細胞最好在需氧培養條件下、對特定細胞最 適當之生長溫度範圍内保溫1 6至丨5 〇小時。 最適溫度範圍以15至55。〇為佳，尤以溫度為3〇至371： 更佳。 曰牛例σ之，本發明方法内所製R - α -硫辛酸之偵檢及數 量測定係藉助於生物檢定利用硫辛酸指示菌株營養缺陷 (ΠΡΑ突變體）。此型R_a-硫辛酸之濁度計定量法係由文獻 公開者（赫伯特及蓋斯特，197〇，系統化酶學l8A，'269至 2，?2i L除葡萄糖之外，若培養基亦含有乙酸脂及琥轴酸酉旨 ’本^明架構内所用之指示菌株，wl 485 Hp2 (ATcc ^5 645)在無補充R_ α -硫辛酸之情況下亦將生長。測定 硫辛酸時’旨在防止生物檢定中該指示菌株之假-正、 菌i所：R;a_硫辛酸之外’該生長係由於葡萄糖及生產體 ίΠ 乙酸及號轴酸之引進，即使Ri-硫辛酸產體之 细泸二f珀酸酯為唯一之碳源。該菌株係補充以本發明 之上清：；隨後可以指示菌株生長為基準以 、j疋培養基内之硫辛酸含量。 等杏：r:用下列諸實驗例將本發明作進一步說明。實施該 用之細菌菌株大腸桿㈣11“1…業已依照布 條約以編唬DSM 1 529 9寄存在德國微生物及培養細
200426218 五、發明說明αυ 胞收集公司（1)8%2)(0-38 1 42，勃朗希威格，德國）。 實驗例1 :pBAD-lipB載體建造 Α. ΠρΒ基因放大 依照精於此項技術者習知常用之方法利用pwo DNΑ聚 合酶藉助於聚合酶鏈反應（PCR)將大腸桿菌lipB基因放大 。所用模板係大腸桿菌W311 0 (ATCC 27325 )野生型菌株之 染色體DNA。所用引物係5,-磷酸化低聚核苷酸1 ipB-fwd及 具有下列順序之1 i pB-rev 1 ipB-fwd :(順序識別號碼：3) 5 ' " cg2_GAT_CCC tat ctg cgc ctg aca ctc GAC -3 *
BamHl lipB-rev :(順序識別號碼：4) 5·- CGG GAT CCT TTA TCT GAA CCG CCA TTT GCG CTG -3·
Baititil 後藉助於QI Aprep旋轉小型製備套具（奇亞根公司、 希爾頓，德國）DNA吸收柱、依照製造商說明書方法將聚合 酶鏈反應所製約〇· 68仟鹼基之])NA碎片加以純化。 Β· 將ΠρΒ基因選殖入該ρκΡ477載體内 經由引物諸順序將Nde I限制核酸内切酶之印裂部位（ 在寡核脊酸内強調（劃底線）之識別引物順序）送入該pCR碎 片内。在製造商所示條件下，用Nde ;[限制核酸内切酶將經 、、、屯化之PCR碎片加以卵裂，隨後於一璦脂糖凝膠上將其加 以分館，之後藉助於GENECLEAN套具（BI〇 1〇1公司，拉荷 拉，加州），依照製造商說明書方法將其自該瓊脂糖凝膠
200426218 五、發明說明（12) 分離出來。 該無性生殖及表現载體pKP477係由載MpBAD —GFp(克 拉瑪利等人，1 9 9 6，天然生物技術丨4 ·· 3 1 5至31 9 )(係載體 PBAD18之一個衍生物）製得如下··首先，用核酸内切酶 Nhel及EcoRI藉載體PBAD-GFP之限制作用將GFP基因移除。 之後用克倫諾酶將其餘部分之5, _突出端（約466仟鹼基載 體碎片）填入，最後利用T4連接酶將該載體加以再連接。 以精於此項技術者習知之方式、藉助於電穿透作用、用該 連接此合物將該菌株之大腸桿菌細胞加以轉化。將該轉化 混合物塗敷在LB-安比西林瓊脂培養瓜上（1〇公克/公升胰 蛋白酶水解腺，5公克/公升酵母萃取液，1〇公克/公升 Nagl、’15公克/公升瓊脂，1〇〇毫克/公升安比西林）並在 37 C狐度下保溫過夜。藉助於一以Aprep轉動小型製備套 具（奇亞根公司出品，希爾頓，德國）分離出該等質粒之 ，用限制作用分析法將預期之轉化物加以如 之載體稱作PKP476。 表传 複製載之第二個NdeI印裂部位（位於接近 複1原點處），用Ndel以精於此項技術者習知之 將該載體pKP476加以部分限制。依照以上所述方法 化（亦即僅單獨切割）之載體碎片分離出來。隨 利用支 儉諾酶將該碎片之5’_突出端填人，並依照上述方法、用克 助於限制作用分析法，將該載體加以再連接、轉化及曰 。於距-最適化核糖體結合部位之最佳距贺 負粒ΡΚΡ477現在含有該單獨NdeI印裂部位。該f _ = 第15頁 200426218 五、發明說明（13) ' "—"'~" 含有容許任何基因實施控制表現之各種基因要素。此係一 載體’該載體具有一衍生自pBR質粒科之複製原點。該經 無性生殖基因之表現係受AraC阻遏物之阻遏且可由阿拉伯 糖加以誘導。 該ΙιρΒ基因係在製造商所示條件下、用限制酶NdeI及 Sma I、藉印裂該載體ρκρ477而無性生殖者，隨後用鹼性磷 酸化酶加以處理將該載體之5,終端加以脫磷酸化，之後藉 助於GENECLEAN法，如同1 ipB PCR碎片，將該載體加以純 化。 如以上所述實施：用經卵裂及經脫磷酸化之載體 PKP477連接PCR碎片、轉化物之轉化作用及抑制作用。所 製質粒稱作？8八0-1丨邱（第二圖）。 實驗例2 : R_ α -硫辛酸產體之製備 藉助於電穿透作用將實驗例1内所述pBAD-1 ipB質粒轉 化為大腸桿菌W3 110，於含有1〇〇毫克/公升安比西林之^ 瓊脂培養皿上選擇之後，將該質粒自轉化物之一再分離出 來’用限制核酸内切酶加以卵裂並加以抑制。用類似之方 式將該比較質粒（PKP477 )加以處理。 實驗例3 : R- α -硫辛酸之發酵法製造
R- α -硫辛酸之發酵法製造係使用菌株W31 ipB 。為作比較，含有”空” pKP477比較質粒之菌株係在完全 相同之條件下培養者。 作為產體培養之前培養菌種，首先將5毫升、含有1〇〇 毫克/公升安比西林之LB液體培養基與各個菌株加以接種
第16頁 200426218 五、發明說明（14) ，並於一振盪器上、在溫度37X：及轉速16〇轉/分鐘之 下保溫16小時。之後藉離心作用將該等細胞 用對f體積之消毒鹽水（〇.9% NaCl)清洗兩次。最後利用 如此製得之細胞接種15毫升BS培養基（？公克" ;3公克7公升KH2P〇4 ; 1公克/公升⑽4)2S〇4 1 i公克/ 1升 MgS〇4x 7 H20 ;0.5公克/公升檸檬酸鈉χ 3 Η』；〇 2%酸水 解赂蛋白（不含維生素）；13.5公克/公升玻錢納χ Wo ，用阢1將酸度值調節至6.8)其中另外含有1〇〇毫克/公升 安比西林’依照以1 : 1 〇 〇比例。於一振盪器上，在溫度 37 t及轉速16〇轉/分鐘之情況下，將該等產體培養物加以 接種，歷Ν·24小時。保溫約4小時之後，添加〇. 2公克/公 升L-阿拉伯糖以誘導硫辛醯蛋白質連接酶8基因之表現。 24小時之後，將該等試樣取下，並藉離心作用將該等細胞 自培養基取出。其中所含R- α _硫辛酸之數量係藉助於習知 濁度計生物檢定法（赫伯特及蓋斯特，丨97〇，系統化酶學 18八，2 69至2 72)加以測定。表1所示係保溫；24小時之後該 特別培養物上清液内所達成之自由R _ α _硫辛酸含量： 表1 :
菌 株 R-a-硫辛酸[微克/公升] W3110 一·---- 0 muoAipiA 25 W311〇ApKP477 0 W311〇AlplA pKP477 27 W3110pBAD-lipB 25 W311〇AlplA pBAD-lipB 191 第17頁 200426218 五、發明說明（15)
SEQUENCE LISTING
<110> Consortium fuer elektrochemische 工ndustrie GmbH 5 <120> Cells and a method for the fermentative production of R-alpha- lipoic acid <130〉 Co 10227 10 <140> <141> <160> 4 15 <170> Patentln Ver. 2.0
<210> 1 <211> 1017 <212> DNA 20 <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1014) 25 <300> <301> Morris, Timothy W.
Reed, Kelynne E.
Cronan Jr., John E. 30 <302> 工dentification of the Gene Encoding Lipoate-Protein
Ligase A of Escherichia coli <303> J. Biol. Chem. <304> 269 <305〉 23 ' 35 <306> 16091-16100 <307> 1994 <400> 1 atg tcc aca tta cgc ctg etc ate tet gac tet tac gac ccg tgg ttt 48 40 Met Ser Thr Leu Arg Leu Leu lie Ser Asp Ser Tyr .Asp Pro Trp Phe 1 5 10 15 aac ctg geg gtg gaa gag tgt att ttt cgc caa atg ccc gcc aeg cag 96
Asn Leu Ala Val Glu Glu Cys lie Phe Arg Gin Met Pro Ala Thr Gin 45 20 25 30 cgc gtt ctg ttt etc tgg cgc aat gcc gac aeg gta gta att ggt cgc 144
Arg Val Leu Phe Leu Trp Arg Asn Ala Asp Thr Val Val lie Gly Arg geg cag aac ccg tgg aaa gag tgt aat acc egg egg atg gaa gaa gat 192
Ala Gin Asn Pro Trp Lys Glu Cys Asn Thr Arg Arg Met Glu Glu Asp 50 55 60 lilBl 第18頁 200426218 五、發明說明（16) aac gtc cgc ctg geg egg cgc agt age ggt ggc ggc geg gtg ttc cac 240 Asn Val Arg Leu Ala Arg Arg Ser Ser Gly Gly Gly Ala Val Phe His 65 70 75 80 5 gat etc ggc aat acc tgc ttt acc ttt atg get ggc aag ccg gag tac 288 Asp Leu Gly Asn Thr Cys Phe Thr Phe Met Ala Gly Lys Pro Glu Tyr 85 90 95 gat aaa act ate tee aeg teg att gtg etc aat geg ctg aac geg etc 336 10 Asp Lys Thr lie Ser Thr Ser lie Val Leu Asn Ala Leu Asn Ala Leu 100 105 110 ggc gtc age gcc gaa geg tee gga cgt aac gat ctg gtg gtg aaa acc 384 Gly Val Ser Ala Glu Ala Ser Gly Arg Asn Asp Leu Val Val Lys Thr 15 115 120 125 gtc gaa ggc gac cgc aaa gtc tea ggc teg gee tat cgc gaa acc aaa 432 Val Glu Gly Asp Arg Lys Val Ser Gly Ser Ala Tyr Arg Glu Thr Lys 130 135 140 20 gat cgc ggc ttc cac cac ggc acc ttg eta etc aat gcc gac etc age 480 m Asp Arg Gly Phe His His Gly Thr Leu Leu Leu Asn Ala Asp Leu Ser 145 150 155 160 25 cgc ctg gca aac tat etc aat ccg gat aaa aag aaa ctg geg geg aaa 528 Arg Leu Ala Asn Tyr Leu Asn Pro Asp Lys Lys Lys Leu Ala Ala Lys 165 170 175 ggc att aeg teg gta cgt tee cgc gtg acc aac etc acc gag ctg ttg 576 30 Gly lie Thr Ser Val Arg Ser Arg Val Thr Asn Leu Thr Glu Leu Leu 180 185 190 ccg ggg ate acc cat gag cag gtt tgc gag gcc ata acc gag gcc ttt 624 Pro Gly lie Thr His Glu Gin Val Cys Glu Ala lie Thr Glu Ala Phe 35 195 200 205 ttc gcc cat tat ggc gag cgc gtg gaa geg gaa ate ate tee ccg aac 672 Phe Ala His Tyr Gly Glu Arg Val Glu Ala Glu lie lie Ser Pro Asn 210 215 220 40 aaa aeg cca gac ttg cca aac ttc gcc gaa acc ttt gcc cgc cag agt 720 Lys Thr Pro Asp Leu Pro Asn Phe Ala Glu Thr Phe Ala Arg Gin Ser 225 230 235 240 45 age tgg gaa tgg aac ttc ggt cag get ccg gca ttc teg cat ctg ctg 768 Ser Trp Glu Trp Asn Phe Gly Gin Ala Pro Ala Phe Ser His Leu Leu 245 250 255 gat gaa cgc ttt acc tgg ggc ggc gtg gaa ctg cat ttc gac gtt gaa 816 50 Asp Glu Arg Phe Thr Trp Gly Gly Val Glu Leu His Phe Asp Val Glu 260 265 270 aaa ggc cat ate acc cgc gcc cag gtg ttt acc gac age etc aac ccc 864 Lys Gly His lie Thr Arg Ala Gin Val Phe Thr Asp Ser Leu Asn Pro ^ 55 275 280 285 liim 第19頁 200426218 五、發明說明（π) gcg ccg ctg gaa gcc etc gee gga ega ctg caa ggc tgc ctg tac ege Ala Pro Leu Glu Ala Leu Ala Gly Arg Leu Gin Gly Cys Leu Tyr Arg 290 295 300 5 gca gat atg ctg caa cag gag tgc gaa gcg ctg ttg gtt gac ttc ccg Ala Asp Met Leu Gin Gin Glu Cys Glu Ala Leu Leu Val Asp Phe Pro 305 310 315 320 10 gaa cag gaa aaa gag eta egg gag tta teg gca tgg atg gcg ggg get 1008 Glu Gin Glu Lys Glu Leu Arg Glu Leu Ser Ala Trp Met Ala Gly Ala 325 330 335 15 gta agg tag 1017 Val Arg 912 960 20 <210> 2 <211> 338 <212〉 PRT <213> Escherichia coli 25 <400> 2 Met Ser Thr Leu Arg Leu Leu lie Ser Asp Ser Tyr Asp Pro Trp Phe 1 5 10 15 Asn Leu Ala Val Glu Glu Cys lie Phe Arg Gin Met Pro Ala Thr Gin 30 20 25 30 Arg Val Leu Phe Leu Trp Arg Asn Ala Asp Thr Val Val lie Gly Arg 35 40 45 35 Ala Gin Asn Pro Trp Lys Glu Cys Asn Thr Arg Arg Met Glu Glu Asp 50 55 60 Asn Val Arg Leu Ala Arg Arg Ser Ser Gly Gly Gly Ala Val Phe His 65 70 75 80 40
Asp Leu Gly Asn Thr Cys Phe Thr Phe Met Ala Gly Lys Pro Glu Tyr 85 90 95
Asp Lys Thr lie Ser Thr Ser lie Val Leu Asn Ala Leu Asn Ala Leu 45 100 105 HO Gly Val Ser Ala Glu Ala Ser Gly Arg Asn Asp Leu Val Val Lys Thr 115 120 125 50 Val Glu Gly Asp Arg Lys Val Ser Gly Ser Ala Tyr Arg Glu Thr Lys 130 135 140 55
Asp Arg Gly Phe His His Gly Thr Leu Leu Leu Asn Ala Asp Leu Ser 145 150 155 160 第20頁 200426218 五、發明說明（18)
Arg Leu Ala Asn Tyr Leu Asn Pro Asp Lys Lys Lys Leu Ala Ala Lys 165 170 175
Gly lie Thr Ser Val Arg Ser Arg Val Thr Asn Leu Thr Glu Leu Leu 5 180 185 190
Pro Gly lie Thr His Glu Gin Val Cys Glu Ala lie Thr Glu Ala Phe 195 200 205 10 Phe Ala His Tyr Gly Glu Arg Val Glu Ala Glu lie lie Ser Pro Asn 210 215 220
Lys Thr Pro Asp Leu Pro Asn Phe Ala Glu Thr Phe Ala Arg Gin Ser 225 230 235 240 15
Ser Trp Glu Trp Asn Phe Gly Gin Ala Pro Ala Phe Ser His Leu Leu 245 250 255
Asp Glu Arg Phe Thr Trp Gly Gly Val Glu Leu His Phe Asp Val Glu 20 260 265 270
Lys Gly His lie Thr Arg Ala Gin Val Phe Thr Asp Ser Leu Asn Pro 275 280 285 25 Ala Pro Leu Glu Ala Leu Ala Gly Arg Leu Gin Gly Cys Leu Tyr Arg 290 295 300
Ala Asp Met Leu Gin Gin Glu Cys Glu Ala Leu Leu Val Asp Phe Pro 305 310 315 320 30
Glu Gin Glu Lys Glu Leu Arg Glu Leu Ser Ala Trp Met Ala Gly Ala 325 330 335
Val Arg 35
<210> 3 <211> 30 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence： Oligonucleotide 45 lplA-fwd <400> 3 cgggatccct atctgcgcct gacactcgac 30 50
<210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence 55 llIHIl 第21頁 200426218 五、發明說明（19) <220> <223> Description of Artificial Sequence： Oligonucleotide lplA-rev 5 <400> 4 33 cgggatcctt tatctgaacc gccatttgcg ctg
Bill 第22頁 200426218 圖式簡單說明 第一圖：R- α -硫辛酸在大腸桿菌中之合成； 第二圖··用硫辛醯蛋白質連接酶Α之大腸桿菌活化及建構 R- α-硫辛酸。
第23頁
Claims (1)
- 200426218 六、申請專利範圍1· 一種製造對映體純R- α-硫辛酸之方法，其包括在培 基中培養弱化硫辛醯蛋白質連接酶Α活性細胞，其特徵為 ，該細胞分泌對映純R- α -硫辛酸至培養基内）並將該對…映 體純R- α -硫辛酸自該培養基内移除。 、 2· 一種分泌對映體純R- α-硫辛酸至培養基内的細胞，該 細胞具有弱化硫辛醯蛋白質連接酶Α活性，且該細胞具有μ 一 lplA對偶基因而不是野生型lplA基因，在鹼基對範圍 3 6 7-46 5，鹼取代之結果：ιρ1Α蛋白質活性減少至5〇%，或 在lplA基機中有一缺失。 _ 3·如申請專利範圍第2項之細胞，其中每一個lpU蛋白 質活性不再是可偵檢的。 4 ·如申清專利範圍第2或3項之細胞，其中該細胞具有更 夕的硫辛S文合成酶活性或更多的硫辛酿蛋白質連接酶b活 性。 ' 5 ·如申請專利範圍第2、3或4項之細胞，其中該細胞係 該細胞係一微生物，例如：一酵母或細菌菌株。 6 · 如申請專利範圍第5項之細胞，其中該細胞係一屬於 腸内桿菌科之細菌菌株，尤以大腸桿菌種之菌株更佳。 7 · 如申請專利範圍第1項之方法，其中細胞係如申請專 利範圍第1、2、3、4、5或6項所用者，具有弱化硫辛醯蛋 白質連接酶A活性細胞。 8· 如申請專利範圍第1、2、3、4、5、6或7項之方法， 其中對映體純R- α -硫辛酸係藉將培養基施以離心作用而移 除，繼之將該R- α -硫辛酸加以萃取或沉澱。第24頁 200426218 六、申請專利範圍 9 ·如申#專利範圍第1、7或8之方法，其中培養基所用 之碳源係選自可用的糖類、糖醇類或有機酸類。 10·如申請專利範圍第1、7、8或9項之方法，其中可於培 養基内添加具有C2至C8鏈長度，尤以鏈長C6至C8者更佳° (分別為己酸及辛酸）之脂肪酸。 11·如申請專利範圍第9或1 0項，其中碳源之濃度為〇 · 1至 30公克/公升。 1 2 ·如申請專利範圍第1、7、8、9、1 0或11項之方法，其 中該等細胞係於一以最低鹽介質製成之培養基内、在需氧 培養條件下及特別細胞最佳生長溫度範圍内實施保溫，歷1_ 時1 6至1 5 0小時。
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