EP1570059A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von r-alpha-liponsäure - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von r-alpha-liponsäure

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Publication number
EP1570059A1
EP1570059A1 EP03799471A EP03799471A EP1570059A1 EP 1570059 A1 EP1570059 A1 EP 1570059A1 EP 03799471 A EP03799471 A EP 03799471A EP 03799471 A EP03799471 A EP 03799471A EP 1570059 A1 EP1570059 A1 EP 1570059A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lipoic acid
activity
cell
culture medium
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03799471A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tobias Dassler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Original Assignee
Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH filed Critical Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Publication of EP1570059A1 publication Critical patent/EP1570059A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers

Definitions

  • the invention relates to a method for the fermentative production of the R- ⁇ -lipoic acid and cells particularly suitable for the method.
  • R- ⁇ -lipoic acid is an essential cofactor of certain multienzyme complexes in a large number of pro and eukaryotes.
  • the R- ⁇ -lipoic acid with its carboxyl group is covalently bound to the ⁇ -amino group of a specific lysine residue of the corresponding enzyme to form a so-called lipoa id.
  • R- ⁇ -lipoic acid is part of the E2 subunit of pyruvate dehydrogenase (PDH) [EC 2.3.1.12] or ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3.1.61] and plays there as Redox partners and acyl group carriers play a crucial role in the oxidative decarboxylation of ⁇ -keto acids.
  • PDH pyruvate dehydrogenase
  • KGDH ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase
  • R- ⁇ -lipoic acid also acts as an aminomethyl carrier in glycine-cleavage enzyme systems.
  • ⁇ -Lipoic acid is an optically active molecule with a chiral center at the carbon atom C ⁇ .
  • the R configuration of ⁇ -lipoic acid is the naturally occurring enantiomer. Only this form shows physiological activity as a cofactor of the corresponding enzymes.
  • ⁇ -Lipoic acid can occur both in an oxidized (5- [1, 2] -dithiolan-3-yl-pentanoic acid) and in a reduced form (6, 8-dimercapto-octanoic acid).
  • ⁇ -lipoic acid such as. B. to understand the calcium, potassium, magnesium, sodium or ammonium salt.
  • octanoic acid which is covalently bound to the acyl carrier protein (ACP) serves as a specific precursor in lipoic acid synthesis.
  • ACP acyl carrier protein
  • two sulfur atoms are activated on the octanoic acid (octanoyl- ACP) transfer, whereby R- ⁇ -Lipoyl-ACP arises.
  • This reaction is catalyzed by the lipoic acid synthase [EC 2.8.1.-], the lip ⁇ gene product.
  • the amino acid L-cysteine ultimately serves as the sulfur donor.
  • the subsequent transfer of the R- ⁇ -lipoic acid from R- ⁇ -lipoyl-ACP to the E2 subunit of the ⁇ -keto acid dehydrogenases is carried out by the lipoyl protein ligase B [EC 6.-.-.-], the lipS Gene product, catalyzed, but without R- ⁇ -lipoyl-ACP or R- ⁇ -lipoic acid occurring as free intermediates (Miller et al., 2000, Biochemistry 39: 15166-15178).
  • E. coli can also take up free R- ⁇ -lipoic acid from the surrounding medium and use it for the formation of functional ⁇ -keto acid dehydrogenases.
  • R- ⁇ -lipoic acid is first activated by ATP to R- ⁇ -lipoyl-AMP and then transferred to the corresponding enzyme subunits (see FIG. 2). Both activities are catalyzed by Lipoyl protein ligase A [EC 6.-.-.-], the IpI ⁇ gene product (Morris et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 16091-16100).
  • this LplA activity is not essential for wild-type strains of E.
  • ⁇ -lipoic acid Due to its two thiol groups, ⁇ -lipoic acid has a pronounced effectiveness as an antioxidant and can therefore protect the organism from harmful processes that are induced by oxidative stress.
  • ⁇ -dihydro-lipoic acid the reduced form of ⁇ -lipoic acid, due to its property as a strong reducing agent, is able to regenerate other oxidized natural antioxidants in the body, such as ascorbic acid or ⁇ -tocopherol, directly or indirectly, or if they are deficient, too replace.
  • ⁇ -lipoic acid is of central importance in interaction with ascorbic acid, ⁇ -tocopherol and glutathione, the so-called “network of antioxidants”.
  • ⁇ -Lipoic acid is also used for the prevention and control of type II diabetes mellitus and its consequential damage, such as. B. polyneuropathy, cataract or cardiovascular disease.
  • the mitochondrial NADH-dependent lipoamide reductase of mammals shows an almost 20-fold higher activity with the R enantiomer than with the S form. Furthermore, compared to the S enantiomer, R- ⁇ -lipoic acid has a significantly stronger effect on insulin-mediated glucose uptake and the glucose metabolism of skeletal muscle cells in insulin-resistant rats. The R-shape also showed in animal experiments an anti-inflammatory effect, while the S-shape had an analgesic effect. In order to avoid undesirable side effects, it is therefore extremely desirable to apply ⁇ -lipoic acid only in the enantiomerically pure form.
  • ⁇ -lipoic acid takes place exclusively by means of chemical processes, the racemate always being formed from the R and S forms as the end product (Yadav et al., 1990, J. Sei. Ind. Res. 49: 400-409 ).
  • Various processes have been developed to obtain enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid.
  • the racemate of ⁇ -lipoic acid or one of the synthetic intermediates can either be chemically by means of chiral auxiliary substances (Walton et. Al. 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76: 4748; DE 4137773) or enzymatically (Adger et al., 1995, J. Chem.
  • This object is achieved by a method which is characterized in that a cell which has an attenuated lipoyl protein ligase A activity is cultured in a culture medium, the cell being enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid in the free form Culture medium excretes and the enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid is separated from the culture medium.
  • an attenuated lipoyl protein ligase A activity is preferably to be understood to mean that the intracellular activity of the LplA protein in the cell is 25 to 100%, particularly preferably around, compared to a wild-type cell 75 to 100%, is reduced. Completely the intracellular activity of the LplA protein is particularly preferably completely switched off.
  • Lipoyl protein ligase A is not involved in the de novo synthesis of R- ⁇ -lipoic acid, rather the activity of this enzyme is the coupling of free R- ⁇ -lipoic acid to the E2 subunits of ⁇ -keto acid dehydrogenases .
  • reducing or completely switching off the lipoyl protein ligase A activity in a wild-type strain leads to the accumulation of free, enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid in the culture medium of these cells, although both in an E.
  • the elimination of free R- ⁇ -lipoic acid from the cells allows simple isolation of the product from the culture medium after separation of the biomass, without the cells having to be broken up beforehand or without the R- ⁇ -lipoic acid being expensive and lossy Hydrolysis step from the bound carrier protein (ACP or the E2 subunit of the ⁇ -keto acid dehydrogenases) must be split off.
  • the lipoyl protein ligase A activity encoded by the IplA gene is to be understood as that lipoyl protein ligase activity of a cell which has a clear substrate preference for free R- ⁇ -lipoic acid in comparison to R- ⁇ -lipoyl-ACP having.
  • the LplA protein has about 100 times higher activity with free R- ⁇ -lipoic acid than with R- ⁇ -lipoyl-ACP.
  • the lipoyl protein ligase A activity of a cell thus clearly differs from the lipoyl protein ligase B activity, which R- ⁇ -lipoyl-ACP prefers as the substrate over free R- ⁇ -lipoic acid (see FIG. 1 and 2).
  • the lipoyl protein ligase A gene is preferably a gene with the sequence SEQ ID NO: 1 or a functional variant of this gene.
  • a functional variant is to be understood as a DNA sequence which is derived from the sequence shown in SEQ ID NO: 1 by deletion, insertion or substitution of nucleotides, the enzymatic activity and specificity of the sequence shown by the Gene encoded lipoyl protein ligase A is preserved.
  • the lipoyl protein ligase A gene encodes a protein comprising the sequence ID NO: 2 or functional variants with a sequence homology to SEQ ID NO: 2 greater than 35%.
  • sequence homology to SEQ ID NO: 2 is preferably greater than 60%, particularly preferably the sequence homology to SEQ ID NO: 2 is greater than 80%.
  • a downturn chung can be achieved, for example, by reducing the expression of the corresponding gene or by replacing the chromosomal wild-type gene with a mutated allele which codes for an enzyme with a reduced activity. In extreme cases, the enzyme activity can also be switched off completely.
  • the expression of a gene can be reduced or prevented, for example, by the following measures: - weakening of the promoter by means of suitable base substitutions
  • Mutated alleles of a gene that code for an enzyme with a reduced activity can be generated, for example, by the following measures:
  • Mutated alleles of the Ipl ⁇ gene can be generated using standard molecular biology methods. A preferred way of doing this is to introduce specific base substitutions into the gene. This can take place, for example, in that during the amplification of the 2pl gene by means of the polymerase chain reaction (PCR) by using special mutagenic primers, the base sequence of the gene or its promoter are specifically changed at one or more positions (site-specific mutagenesis).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the introduction of a deletion into the Ipl ⁇ gene is particularly preferred. This can be achieved by first cloning the gene into a plasmid vector (e.g. pUC18, pBR322, pACYC184) after amplification by means of PCR using specific primers which detect the complete Ipl ⁇ gene. By restricting the plasmid obtained in this way with suitable restriction endonucleases which only cut in the region of the Ipl ⁇ gene, internal regions of the gene can be removed. In this way, after religation of the restricted plasmid, an internal deletion can be introduced into the Ipl ⁇ gene. As an alternative to religation of the plasmid restricted in the Ipl ⁇ gene, an antibiotic resistance cassette can also be cloned into the Ipl ⁇ gene.
  • a plasmid vector e.g. pUC18, pBR322, pACYC184
  • cells are used which secrete enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid in a culture medium and have an attenuated lipoyl protein ligase A activity, where they have an IplA allele instead of a wild-type IplA gene , which has a base substitution in the region of base pairs 367-465, which leads to the LplA protein having at least 50% reduced activity, or a deletion in the Ipl ⁇ gene.
  • the present invention thus also relates to a cell with the aforementioned properties.
  • the activity of the LplA protein is preferably reduced by 50 to 100%, particularly preferably by 75% to 100%.
  • base substitution in the gene region mentioned means that no more activity of the LplA protein can be detected.
  • the cells according to the invention there is only one fragment of the IplA gene generated by an internal deletion on the chromosome of the host organism, which fragment can no longer code for a functional lipoyl protein ligase A activity.
  • Cells with weakened lipoyl protein ligase A activity can be produced by replacing the Ipl ⁇ wild-type gene with an Ipl ⁇ allele coding for an LplA protein with an at least 50% compared to the wild-type Protein reduced activity is introduced.
  • cells according to the invention can thus preferably be produced from cells of pro- or eukaryotic organisms which are able to synthesize R- ⁇ -lipoic acid themselves (starting cell), which are accessible to recombinant processes and which can be cultivated by fermentation. Plant or animal cells that can be grown in cell culture are thus also suitable for producing cells according to the invention. Starting cells which have not previously been manipulated can be used to produce cells according to the invention.
  • those cells according to the invention are particularly suitable which, by virtue of an increased expression of the lipA gene compared to the wild type, already have an increased lipoic acid synthase activity compared to the wild type and / or already an increased expression of the lipB gene compared to the wild type have increased lipoyl protein ligase B activity compared to the wild type.
  • the production of cells with an increased lipoic acid synthase compared to the wild type is particularly suitable which, by virtue of an increased expression of the lipA gene compared to the wild type, already have an increased lipoic acid synthase activity compared to the wild type and / or already an increased expression of the lipB gene compared to the wild type have increased lipoyl protein ligase B activity compared to the wild type.
  • the invention thus also relates in particular to cells which, in addition to the activity of the LplA protein which is reduced or absent by at least 50%, by an increased expression of the lipA gene via an increased lipoic acid synthase activity or by an increased expression of the lipB gene have increased lipoyl protein ligase B activity.
  • the cells are preferably microorganisms, such as, for example, yeast or bacterial strains.
  • the strains of the Enterobacteriaceae family are particularly preferred, and strains of the type Escherichia coli are very particularly preferred.
  • R- ⁇ -lipoic acid can be obtained from the culture medium by methods known to those skilled in the art, such as, for example, centrifuging the cell-containing culture medium in order to separate the cells and by subsequent extraction and / or precision of the product.
  • the cells according to the invention for the production of R- ⁇ -lipoic acid are preferably cultivated in a minimal salt medium known from the literature (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).
  • a minimal salt medium known from the literature (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).
  • all usable sugars, sugar alcohols or organic acids or their salts can be used as the carbon source.
  • Aspartic acid malic acid, succinic acid, pyruvic acid, fumaric acid, glutamic acid, glucose, glycerol or oxaloacetic acid are preferably used. Succinic acid and oxaloacetic acid are particularly preferred. Combined feeding of several different carbon sources is also possible. Furthermore, short-chain fatty acids with a chain length of C2-C8, preferably with a chain length of C6-C8 (hexanoic or octanoic acid), can be added to the medium as specific precursors for the ⁇ -lipoic acid synthesis. The concentration of the carbon source added is preferably 0.1-30 g / l.
  • the cells according to the invention are preferably incubated under aerobic cultivation conditions over a period of 16-150 h and in the range of the optimal growth temperature for the respective cells.
  • 15 - 55 ° C is preferred as the optimal temperature range.
  • a temperature between 30 and 37 ° C. is particularly preferred.
  • the detection and quantification of the R- ⁇ -lipoic acid produced in the method according to the invention is carried out, for example, by means of a bioassay using a lipoic auxotrophic indicator strain (lip ⁇ mutant).
  • lipoic auxotrophic indicator strain lip ⁇ mutant
  • This type of turbidimetric quantification of R- ⁇ -lipoic acid is known from the literature (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).
  • the indicator strain W14851ip2 (ATCC 25645) used in the context of the present invention would also grow without supplemented R- ⁇ -lipoic acid if the medium also contains acetate and succinate in addition to glucose.
  • the R- ⁇ -lipoic acid producer is preferably grown with sucrose as the only carbon source.
  • This strain is supplemented with the culture supernatant of a cell culture according to the invention; The lipoic acid content in the culture medium can then be determined on the basis of the growth of the indicator strain.
  • the bacterial strain Escherichia coli W3110 ⁇ lpl ⁇ which was used for the execution of the examples, was deposited with the DSMZ (German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH, D-38142 Braunschweig) under the number DSM 15299 in accordance with the Budapest Treaty.
  • the plasmids pKP477 and pBAD-lipB are described in patent application DE 10245993.
  • Example 1 Construction of a chromosomal mutation in the Ipl ⁇ gene of the host organism A) Amplification of the IplA gene
  • the Ipl ⁇ gene from E. coli was amplified by means of the polymerase chain reaction (PCR) using the Pwo DNA polymerase according to common practice known to the person skilled in the art.
  • the chromosomal DNA of the E. coli wild-type strain 3110 (ATCC 27325) served as the template.
  • the 3'-phosphorothioate-protected oligonucleotides lplA-fwd and lplA-rev were used as primers with the following sequences:
  • the DNA fragment with a length of approx. 1.6 kb obtained during the PCR was then analyzed by means of a DNA adsorption column of the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) cleaned according to the manufacturer's instructions.
  • the purified PCR fragment was cut with the restriction endonuclease BamHl under the conditions specified by the manufacturer, then separated on an agarose gel and then isolated from the agarose gel using the GENECLEAN kit (BIO 101 Inc., La Jolla, California, USA) according to the manufacturer's instructions .
  • the vector pUC18 was cut with the restriction enzyme BamHl under the conditions specified by the manufacturer, then dephosphorylated by treatment with alkaline phosphatase at the 5 'ends and then like the PCR Fragment cleaned using the GENECLEAN method.
  • the ligation of the PCR fragment with the cut and dephosphorylated vector was carried out according to the manufacturer's instructions using the T4 DNA ligase.
  • the transformation of E. coli cells of the DH5 ⁇ strain with the ligation mixture was carried out by means of electroporation in a manner known to the person skilled in the art. The transformation approach was on
  • LB ampicillin agar plates (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 10 g / 1 NaCl, 15 g / 1 agar, 100 mg / 1 ampicillin) were applied and incubated overnight at 37 ° C.
  • the desired transformants were identified by means of a restriction analysis after plasmid isolation using a QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden). The plasmid obtained in this way is called pUCl8-Ipl ⁇ .
  • the vector pUC18-lpIA was digested with the restriction enzymes Nrul and Stul, which each cut once within the IplA gene, and the vector was described using T4-D ⁇ A- as described above. Ligase religated, then transformed and checked. This deleted a central region of the IplA gene by 197 base pairs and at the same time introduced a reading frame shift, whereby the gene was inactivated.
  • the resulting plasmid pUC18- ⁇ lpl ⁇ which now contains the shortened reading frame "AlplA”
  • the plasmid obtained in this way is called pK03- ⁇ lpl ⁇ .
  • the lipB overexpression plasmid pBAD-lipB was transformed into the E. coli strains W3110 ⁇ lplA and W3110 by electroporation and, after selection on LB agar plates with 100 mg / 1 ampicillin, the plasmid was reisolated from one of the transformants in each case and cleaved with restriction endonucleases and checked.
  • the control plasmid pKP477 which in addition to the ampicillin resistance gene contains only the regulatory sequences of the ara binose operon from E. coli (araC gene, araBAD promoter region), was carried out in an analogous manner.
  • Example 3 Fermentative production of R- ⁇ -lipoic acid
  • the strains mentioned in Example 2 were used both with and without a plasmid.
  • 5 ml of LB liquid medium containing 100 mg / 1 ampicillin were inoculated with the respective strain and incubated for 16 h at 37 ° C. and 160 rpm on a shaker.
  • the cells were then harvested by centrifugation and washed twice with the appropriate volume of sterile saline (0.9% NaCl).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von R-alpha-Liponsäure mittels Fermentation, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zelle, die eine abgeschwächte Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweist, in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-alpha-Liponsäure in freier Form in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-alpha-Liponsäure von dem Kulturmedium abgetrennt wird.

Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von R-α-Liponsäure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung der R-α-Liponsäure und für das Verfahren besonders geeignete Zellen.
R-α-Liponsäure ist in einer Vielzahl von Pro- und Eukaryonten ein essentieller Cofaktor bestimmter Multienzymkomplexe. Dabei ist die R-α-Liponsäure jeweils mit seiner Carboxylgruppe unter Bildung eines sogenannten Lipoa ids kovalent an die ε-Amino- gruppe eines spezifischen Lysin-Rests des entsprechenden Enzyms gebunden. Auf diese Weise ist die R-α-Liponsäure ein Teil der E2-üntereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) [EC 2.3.1.12] bzw. der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3.1.61] und spielt dort als Redoxpartner und Acylgrup- pen-überträger eine entscheidende Rolle bei der oxidativen De- carboxylierung von α-Ketosäuren. Außerdem fungiert R-α-Liponsäure als Aminomethyl-Carrier in Glycin-Cleavage Enzymsystemen.
α-Liponsäure ist ein optisch aktives Molekül mit einem Chira- litätszentrum am Kohlenstoffatom Cβ. Dabei stellt die R-Konfi- guration der α-Liponsäure das natürlich vorkommende Enantiomer dar. Nur diese Form zeigt physiologische Aktivität als Cofak- tor der entsprechenden Enzyme. α-Liponsäure kann sowohl in einer oxidierten (5- [1, 2] -Dithiolan-3-yl-Pentansäure) als auch in einer reduzierten Form (6, 8-Dimercapto-Oktansäure) vorkommen. Im Folgenden sind unter der Bezeichnung "α-Liponsäure" beide Formen sowie die jeweiligen Salze der α-Liponsäure, wie z. B. das Calcium-, Kalium-, Magnesium-, Natrium- oder das Ammoniumsalz, zu verstehen.
Die Biosynthese von R-α-Liponsäure wurde besonders an dem Bak- terium Escherichia coli intensiv untersucht (s. Fig. 1). Hier dient Oktansäure, die an das Acyl-Carrier-Protein (ACP) kovalent gebunden ist, als spezifische Vorstufe bei der Lipon- säure-Synthese. In einer komplexen Reaktion werden zwei Schwefelatome auf die derart aktivierte Oktansäure (Oktanoyl- ACP) übertragen, wobei R-α-Lipoyl-ACP entsteht. Diese Reaktion wird von der Liponsäure-Synthase [EC 2.8.1.-], dem lipΛ-Gen- produkt, katalysiert. Als Schwefeldonor dient dabei letztendlich die Aminosäure L-Cystein. Der anschließende Transfer der R-α-Liponsäure von R-α-Lipoyl-ACP auf die E2-Untereinheit der α-Ketosäure-Dehydrogenasen wird von der Lipoyl-Protein- Ligase B [EC 6.-.-.-], dem lipS-Genprodukt , katalysiert, ohne dass dabei jedoch R-α-Lipoyl-ACP oder R-α-Liponsäure als freie Zwischenprodukte auftreten (Miller et al., 2000, Biochemistry 39:15166-15178) .
E. coli kann aber auch freie R-α-Liponsäure aus dem umgebenden Medium aufnehmen und für die Bildung funktioneller α-Ketosäure-Dehydrogenasen verwenden. Dazu wird R-α-Liponsäure zu- nächst mittels ATP zu R-α-Lipoyl-AMP aktiviert und anschließend auf die entsprechenden Enzym-Untereinheiten übertragen (s. Fig. 2). Beide Aktivitäten werden von der Lipoyl- Protein-Ligase A [EC 6.-.-.-], dem IpIΛ-Genprodukt , katalysiert (Morris et al . , 1994, J. Biol. Chem. 269: 16091-16100). Diese LplA-Aktivität ist für Wildtypstämme von E. coli allerdings nicht essentiell, wenn die endogene Liponsäure-Synthese und der Transfer der Lipoyl-Gruppe über den LipA/LipB-Weg erfolgt. So wurden beispielweise IplΛ-Mutanten beschrieben, die keine nachweisbare Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität mehr be- sitzen, deren Phänotyp aber unter normalen Wachstumsbedingungen nicht von einer Wildtyp-Zelle zu unterscheiden ist (Morris et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 16091-16100; Morris et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 1-10).
Über die, Biosynthese von R-α-Liponsäure in Eukaryonten ist wenig bekannt. Es wird aber vermutet, dass die R-α-Liponsäure- Synthese sowie der Transfer auf die entsprechenden Enzyme in den Mitochondrien eukaryontischer Zellen auf ähnliche Weise wie in Bakterien erfolgt.
Neben ihrer Relevanz als essentieller Bestandteil von Enzymen mit einer zentralen Rolle im Stoffwechsel, wurde schon früh die Bedeutung der α-Liponsäure für die Pharmakotherapie sowie für die Nahrungsmittelergänzung (Nutraceutical) erkannt: α-Liponsäure besitzt aufgrund ihrer beiden Thiolgruppen eine ausgeprägte Wirksamkeit als Antioxidans und kann deshalb den Organismus vor schädlichen Prozessen, die durch oxidativen Stress induziert werden, schützen. Außerdem ist α-Dihydro- liponsäure, die reduzierte Form der α-Liponsäure, aufgrund ihrer Eigenschaft als starkes Reduktionsmittel in der Lage, andere oxidierte natürliche Antioxidationsmittel im Körper wie Ascorbinsäure oder α-Tocopherol direkt oder indirekt zu regenerieren Oder bei deren Mangel diese auch zu ersetzen. Entsprechend kommt der α-Liponsäure im Zusammenspiel mit Ascorbinsäure, α-Tocopherol und Glutathion, dem sogenannten "Netzwerk der Antioxidantien", eine zentrale Bedeutung zu. α-Liponsäure wird außerdem zur Prävention und Bekämpfung von Diabetes mellitus Typ II und dessen Folgeschäden, wie z. B. Polyneuropathie, Cataract oder Kardiovaskularleiden, eingesetzt.
Die unterschiedliche biologische Aktivität beider Enantiomere der α-Liponsäure ist derzeit Gegenstand intensiver Untersuchungen, wobei sich allerdings immer mehr herauskristallisiert, dass die Applikation des reinen R-Enantiomers der α- Liponsäure deutliche Vorteile gegenüber der S-Form aufweist. So wurde im in vitro-Versuch gezeigt, dass nur die natürliche R-α-Liponsäure zur Bildung funktioneller α-Ketosäure-Dehydro- genasen führt. Das S-Enantiomer hatte dagegen sogar einen inhibierenden Effekt auf die Stimulierung der Enzymaktivität durch R-α-Liponsäure. Die Reduktion von α-Liponsäure und damit die Regeneration der antioxidativ wirksamen α-Dihydrolipon- säure in den Mitochondrien ist für die Zelle von essentieller Bedeutung. Die mitochondriale NADH-abhängige Lipoamid- Reduktase von Säugern zeigt mit dem R-Enantiomer eine fast 20- fach höhere Aktivität als mit der S-Form. Des weiteren hat R- α-Liponsäure verglichen mit dem S-Enantiomer einen deutlich stärkeren Effekt auf die insulin-vermittelte Glucose-Aufnahme und den Glucose-Metabolismus von Skelettmuskelzellen insulin- resistenter Ratten. Im Tierversuch zeigte die R-Form außerdem einen antiphlogistischen Effekt, während die S-Form eher eine analgetische Wirkung hatte. Um unerwünschte Nebeneffekte zu vermeiden, ist es daher äußerst wünschenswert, α-Liponsäure jeweils nur in der enantiomerenreinen Form zu applizieren.
Derzeit erfolgt die großtechnische Herstellung von α-Liponsäure ausschließlich mittels chemischer Verfahren, wobei immer das Razemat aus R- und S-Form als Endprodukt gebildet wird (Yadav et al., 1990, J. Sei. Ind. Res. 49: 400-409). Zur Ge- winnung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Beispielsweise kann das Razemat der α-Liponsäure oder eines der Syntheseintermediate entweder chemisch mittels chiraler Hilfssubstanzen (Walton et. al, 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76: 4748; DE 4137773) oder enzymatisch (Adger et al., 1995, J. Chem. Soc, Chem. Commun.: 1563-1564) aufgespalten werden. In anderen Verfahren unterbleibt die Entstehung eines Razemats aufgrund eines enantioselektiven Syntheseschritts, wobei das neue Chiralitätszentrum entweder chemisch (DE 3629116; DE 19533881; Bringmann et al., 1999, Z. Naturforsch. 54b: 655-661; DE 10036516) oder durch eine stereospezifische Biotransformation mittels Mikroorganismen eingeführt werden kann (Gopalan und Jacobs, 1989, Tetrahedron Lett. 30: 5705-5708; Dasaradhi et al . , 1990, J. Chem. Soc, Chem. Commun. : 729-730; DE 10056025) . Andere Prozesse wiederum starten die chemische Synthese von enantiomerenreiner α-Liponsäure mit einem natürlich vorkommenden chiralen Edukt wie z. B. S-Maleinsäure oder D-Mannitol (Brookes und Golding, 1988, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I: 9-12; Rama Rao et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28, 2183-2186) . Wegen z. T. aufwendiger Syn- theseschritte, geringer Ausbeuten und hoher Materialkosten sind alle bekannten Methoden zur Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure derzeit nicht wirtschaftlich.
Die großtechnische Herstellung vieler niedermolekularer Natur- stoffe, wie z.B. Antibiotika, Vitamine oder Aminosäuren erfolgt heute oftmals mittels eines fermentativen Verfahrens unter Verwendung verschiedener Stämme von Mikroorganismen. Die Anmeldungen am Deutschen Patent- und Markenamt mit den Aktenzeichen 10235270.4 und 10245993.2 beschreiben ein Verfahren, bei dem die Produktion von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure ausschließlich in einem Fermentationsprozeß erfolgt. Dabei werden Zellen eingesetzt, die ein Liponsäure-Synthase- Gen bzw. ein Lipoyl-Protein-Ligase B-Gen einzeln oder auch in Kombination überexprimieren. Die Produktion von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure erfolgt allerdings in noch sehr beschränktem Ausmaß, so dass diese fermentativen Verfahren derzeit -noch nicht mit der chemischen Synthese konkurrieren können.
Nur in seltenen Fällen führt jedoch eine einzige genetische Manipulation im Zuge des sogenannten "metabolic engineering" eines WildtypStammes- zur Überproduktion der gewünschten Verbindung in ausreichendem Umfang. Vielmehr ist dazu eine Kombination von gezielten genetischen Manipulationen notwendig, oftmals noch ergänzt durch klassische Mutagenese/Screening-An- sätze .
Entsprechend ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein leistungsfähigeres Verfahren zur fermentativen Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zelle, die eine abgeschwächte Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweist, in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-α- Liponsäure in freier Form in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-α-Liponsäure vom Kulturmedium abgetrennt wird.
Unter einer abgeschwächten Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zu ver- stehen, dass die intrazelluläre Aktivität des LplA-Proteins in der Zelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Zelle um 25 bis 100 %, besonders bevorzugt um 75 bis 100 %, verringert ist. Ganz be- sonders bevorzugt ist die intrazelluläre Aktivität des LplA- Proteins völlig ausgeschaltet.
Aus physiologischen und biochemischen Daten geht hervor, dass Liponsäure in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in gebundener Form vorkommt, da bereits die Synthese der R-α-Liponsäure vollständig proteingebunden erfolgt (vgl. Fig. 1) (Herbert und Guest, 1975, Arch. Microbiol. 106: 259-266; Miller et al., 2000, Biochemistry 39:15166-15178). Die Lipoyl-Protein-Ligase A ist nicht an der de novo-Synthese von R-α-Liponsäure beteiligt, vielmehr besteht die Aktivität dieses Enzyms in der Kopplung von freier R-α-Liponsäure an die E2-Untereinheiten von α-Ketosäure-Dehydrogenasen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass eine Verringerung oder die vollständige Aus- Schaltung der Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität in einem Wildtyp-Stamm zur Anhäufung freier, enantiomerenreiner R-α- Liponsäure im Kulturmedium dieser Zellen führt, obwohl sowohl in einem E . coli Wildtyp-Stamm als auch in einer IplÄ-Mutante alle Lipoyl-Bindestellen der E2-Untereinheiten mit R-α- Liponsäure abgesättigt sind (Packman et al., 1991, Biochem. J. 277: 153-158; Morris et al., 1995, J. Bacteriol . 177: 1-10) und somit das Substrat des LplA-Proteins (eine unbeladene E2- Untereinheit) fehlt. Darüber hinaus ist die Expression des IplÄ-Gens in einem E. coli Wildtyp-Stamm ohnehin nur äußerst schwach. Entsprechend kommen nur wenige Moleküle (< 10) der Lipoyl-Protein-Ligase A in einer Zelle vor (Green et al., 1995, Biochem. J. 309: 853-862). Es ist daher umso erstaunlicher, dass nun eine Verringerung oder vollständige Ausschaltung der Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität die Exkretion von R-α-Liponsäure zur Folge hat.
Die Ausscheidung freier R-α-Liponsäure aus den Zellen erlaubt eine einfache Isolierung des Produkts aus dem Kulturmedium nach Abtrennung der Biomasse, ohne dass die Zellen zuvor auf- gebrochen werden müssen bzw. ohne dass die R-α-Liponsäure durch einen aufwendigen und verlustreichen Hydrolyseschritt vom daran gebundenen Trägerprotein (ACP oder die E2-Unterein- heit der α-Ketosäure-Dehydrogenasen) abgespalten werden uss. Unter der vom IplA-Gen codierten Lipoyl-Protein-Ligase A- Aktivität ist diejenige Lipoyl-Protein-Ligase-Aktivität einer Zelle zu verstehen, welche eine deutliche Substratpräferenz für freie R-α-Liponsäure im Vergleich zu R-α-Lipoyl-ACP aufweist. Das LplA-Protein hat mit freier R-α-Liponsäure etwa eine 100-fach höhere Aktivität, als mit R-α-Lipoyl-ACP. Damit unterscheidet sich die Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität einer Zelle eindeutig von der Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität, welche R-α-Lipoyl-ACP gegenüber freier R-α-Liponsäure als Substrat bevorzugt (s. Fig. 1 und 2).
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Lipoyl-Protein-Ligase A- Gen um ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder um eine funk- tionelle Variante dieses Gens.
Unter einer funktioneilen Variante ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine DNA-Sequenz zu verstehen, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz ableitet, wobei die en- zymatische Aktivität und Spezifität der durch das Gen codierten Lipoyl-Protein-Ligase A erhalten bleibt.
Das Lipoyl-Protein-Ligase A-Gen codiert für ein Protein umfas- send die Sequenz ID NO: 2 oder funktionelle Varianten mit einer Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 2 größer 35 %.
Vorzugsweise ist die Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 2 größer 60 %, besonders bevorzugt ist die Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 2 größer 80 % .
In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle erwähnten Homologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Algorithmus GAP (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wis- consin) erhalten werden.
Dem Fachmann sind zur Abschwächung einer Enzymaktivität in einer Zelle eine Reihe von Möglichkeiten bekannt. Eine Abschwä- chung kann beispielsweise durch Verminderung der Expression des entsprechenden Gens erzielt werden oder durch Austausch des chromosomalen Wildtyp-Gens gegen ein mutiertes Allel, das für ein Enzym mit einer verminderten Aktivität codiert. Im Ex- tremfall kann die Enzymaktivität auch völlig ausgeschaltet werden.
Die Expression eines Gens kann zum Beispiel durch folgende Maßnahmen verringert oder verhindert werden: - Abschwächung des Promotors durch geeignete Basensubstitutionen
- Inaktivierung/Veränderung eines für die Expression nötigen Transkriptionsaktivators
-Abschwächung von Translationsstartsignalen (z. B. Ribosomen- bindestelle, Startcodon) durch geeignete Basensubstitutionen
- Entfernung von mRNA-stabilisierenden Regionen des Gens
- Überexpression von für spezifische Antisense-RNA codierenden DNA-Bereichen
- Deletion des gesamten Gens oder zumindest eines wichtigen Teils davon
- Zerstörung des Gens durch Insertion von beispielsweise einer Antibiotikumsresistenzkassette
Mutierte Allele eines Gens, die für ein Enzym mit einer ver- minderten Aktivität codieren, können beispielsweise durch folgende Maßnahmen erzeugt werden:
- Einführung von Leserasterverschiebungen in das entsprechende Gen aufgrund von Nukleotid-Deletionen oder -Insertionen
- Einführung spezifischer Basensubstitutionen im Gen, welche den Austausch von konservierten oder von für die Aktivität essentiellen Aminosäuren zur Folge haben
Mutierte Allele des IplΛ-Gens können mit Standardmethoden der Molekularbiologie erzeugt werden. Eine bevorzugte Möglichkeit dafür besteht in der Einführung spezifischer Basensubstitutionen in das Gen. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass während der Amplifikation des 2pl--Gens mittels der Poly- merase-Kettenreaktion (PCR) durch Verwendung von speziellen mutagenen Primern die Basensequenz des Gens oder seines Promotors an einer oder mehreren Positionen spezifisch verändert werden (ortspezifische Mutagenese) .
Besonders bevorzugt ist die Einführung einer Deletion in das IplÄ-Gen. Dies kann dadurch erreicht werden, dass das Gen nach der Amplifikation mittels PCR unter Einsatz von spezifischen Primern, die das komplette IplÄ-Gen erfassen, zunächst in einen Plasmid-Vektor (z.B. pUC18, pBR322, pACYC184) kloniert wird. Durch Restriktion des so erhaltenen Plasmids mit geeig- neten Restriktionsendonukleasen, die nur im Bereich des IplÄ- Gens schneiden, können interne Regionen des Gens entfernt werden. Auf diese Weise kann nach Religation des restringierten Plasmids eine interne Deletion in das IplÄ-Gen eingeführt werden. Alternativ zur Religation des im IplÄ-Gen restringierten Plasmids kann auch eine Antibiotikumsresistenzkassette in das IplÄ-Gen kloniert werden.
Methoden zum Austausch einer beliebigen chromosomalen DNA- Sequenz gegen eine zwar homologe, aber durch Baseninsertionen, -deletionen oder -Substitutionen veränderte Sequenz sind dem Fachmann bekannt. So kann in Escherichia coli beispielsweise das von Link et al. (1997, J. Bacteriol. 179: 6228-6237) beschriebene System verwendet werden, um mittels integrativer Plasmide über den Mechanismus der homologen Rekombination die chromosomale Wildtyp-Sequenz des IplA-Gens gegen ein mutiertes IplÄ-Allel auszutauschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfin- düng werden Zellen eingesetzt, die enantiomerenreine R-α- Liponsäure in ein Kulturmedium sekretieren und eine abgeschwächte Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweisen, wobei sie anstelle eines Wildtyp IplA-Gens ein IplÄ-Allel besitzen, das eine Basensubstitution im Bereich der Basenpaare 367-465 aufweist, welche dazu führt, dass das LplA-Protein eine um mindestens 50 % verminderte Aktivität hat, oder eine Deletion im IplÄ-Gen aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch eine Zelle mit vorgenannten Eigenschaften.
Vorzugsweise ist die Aktivität des LplA-Proteins um 50 bis 100%, besonders bevorzugt um 75% bis 100%, vermindert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zellen führt eine Basensubstitution in dem genannten Genbereich dazu, dass keine Aktivität des LplA-Proteins mehr nachweisbar ist.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zellen befindet sich auf dem Chromosom des Wirtsorganismus nur noch ein durch eine interne Deletion erzeugtes Fragment des IplA-Gens, welches nicht mehr für eine funktio- nelle Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität codieren kann.
Zellen mit abgeschwächter Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität lassen sich dadurch herstellen, dass in eine Ausgangszelle an- stelle des IplÄ-Wildtyp-Gens ein IplÄ-Allel codierend für ein LplA-Protein mit einer um mindestens 50 % im Vergleich zum Wildtyp-Protein verminderten Aktivität eingebracht wird.
In einer Vielzahl von pro- und eukaryontischen Zellen bzw. Or- ganismen konnten Gene, die für eine Lipoyl-Protein-Ligase A codieren, sowie Gene, die für die de nσvo-Synthese von R-α- Liponsäure benötigt werden (z.B. lipÄ, lipB) , identifiziert werden. Erfindungsgemäße Zellen lassen sich somit vorzugsweise aus Zellen von pro- oder eukaryontischen Organismen herstel- len, die in der Lage sind, R-α-Liponsäure selbst zu synthetisieren (Ausgangszelle) , die rekombinanten Verfahren zugänglich sind und die durch Fermentation kultivierbar sind. Auch pflanzliche oder tierische Zellen, die in Zellkultur züchtbar sind, sind somit zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen ge- eignet. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen können Ausgangszellen verwendet werden, die bisher noch keinerlei Manipulation unterzogen wurden.
Des weiteren ist es jedoch möglich, die erfindungsgemäßen Zellen auch mit Maßnahmen zu kombinieren, die bereits zu einer verbesserten Produktion von R-α-Liponsäure führen. So sind beispielsweise solche Zellen besonders geeignet, die durch eine im Vergleich zum Wildtyp verstärkte Expression des lipA- Gens bereits eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Liponsäure- Synthase-Aktiviät aufweisen und/oder durch eine im Vergleich zum Wildtyp verstärkte Expression des lipB-Gens bereits über eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B- Aktivität verfügen. Die Herstellung von Zellen mit einer im Vergleich zum Wildtyp verstärkten Liponsäure-Synthase-
Aktivität und/oder einer im Vergleich zum Wildtyp verstärkten Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktiviät sind in den Patentanmeldungen DE 10235270 und DE 10245993 beschrieben.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere auch Zellen, die zusätzlich zur um mindestens 50 % verminderten oder fehlenden Aktivität des LplA-Proteins durch eine verstärkte Expression des lipA-Gens über eine erhöhte Liponsäure-Synthase-Aktivität oder durch eine verstärkte Expression des lipB-Gens bereits über eine erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität verfügen.
Bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefe- oder Bakterienstämme. Besonders bevorzugt handelt es sich um Bakterienstämme aus der Familie der Enterobacteriaceae, ganz besonders bevorzugt um Stämme der Art Escherichia coli .
Die Gewinnung von R-α-Liponsäure aus dem Kulturmedium kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie beispielsweise Zentrifugation des zellhaltigen Kulturmediums zur Abtrennung der Zellen und durch anschließende Extraktion und/oder Präzi- pitation des Produkts, erfolgen. Die Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellen zur Produktion von R-α-Liponsäure erfolgt vorzugsweise in einem aus der Literatur bekannten Minimalsalzmedium (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272). Als Kohlenstoffquelle können prinzipiell alle verwertbaren Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dabei werden bevorzugt Asparaginsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Bernsteinsäure und Oxalessigsäure. Auch ist eine kombinierte Fütterung mehrerer verschiedener Kohlenstoffquellen möglich. Des weiteren können kurzkettige Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit einer Kettenlänge von C6-C8 (Hexan- bzw. Oktansäure) , als spezi- fische Vorstufen für die α-Liponsäure-Synthese dem Medium zugesetzt werden. Dabei beträgt die Konzentration der zugesetzten Kohlenstoffquelle vorzugsweise 0,1-30 g/1.
Die Inkubation der erfindungsgemäßen Zellen erfolgt vorzugs- weise unter aeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeitraum von 16 - 150 h und im Bereich der für die jeweiligen Zellen optimalen Wachtumstemperatur .
Als optimaler Temperaturbereich werden 15 - 55 °C bevorzugt. Besonders bevorzugt ist eine Temperatur zwischen 30 und 37 °C.
Der Nachweis und die Quantifizierung der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten R-α-Liponsäure erfolgt beispielsweise mittels eines Bioassays unter Verwendung eines liponsäure- auxotrophen Indikatorstammes (lipÄ-Mutante) . Diese Art der turbidimetrischen Quantifizierung von R-α-Liponsäure ist aus der Literatur bekannt (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272) . Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Indikatorstamm W14851ip2 (ATCC 25645) würde allerdings auch ohne supplementierte R-α-Liponsäure wachsen, wenn das Medium neben Glucose auch noch Acetat und Succinat enthält. Um ein falschpositives Wachstum des Indikatorstammes im Bioassay bei der Bestimmung der produzierten R-α-Liponsäure zu ver ei- den - beispielsweise verursacht durch einen Eintrag von Glucose und den vom Produktionsstamm zusätzlich zur R-α-Liponsäure ausgeschiedenen Säuren Acetat und Succinat - erfolgt bereits die Anzucht des R-α-Liponsäure-Produzenten bevorzugt mit Suc- cinat als einziger Kohlenstoffquelle. Dieser Stamm wird mit dem Kulturüberstand einer erfindungsgemäßen Zellanzucht supplementiert; anhand des Wachstums des Indikatorstammes kann dann der Liponsäure-Gehalt im Kulturmedium bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der
Erfindung. Der Bakterienstamm Escherichia coli W3110ΔlplÄ, der für die Ausführung der Beispiele verwendet wurde, wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 15299 ge- maß Budapester Vertrag hinterlegt. Die Plasmide pKP477 und pBAD-lipB sind in der Patentanmeldung DE 10245993 beschrieben.
Beispiel 1 : Konstruktion einer chromosomalen Mutation im IplÄ- Gen des Wirtsorganismus A) Amplifikation des IplA-Gens
Das IplÄ-Gen aus E. coli wurde mittels der Polymerase-Ketten- reaktion (PCR) unter Verwendung der Pwo-DNA-Polymerase nach gängiger, dem Fachmann bekannter Praxis amplifiziert. Als Matrize diente die chromosomale DNA des E. coli-Wildtypstam es 3110 (ATCC 27325). Als Primer wurden die 3 ' -phosphorothioat- geschützten Oligonukleotide lplA-fwd und lplA-rev mit folgenden Sequenzen verwendet:
lplA-fwd: (SEQ ID NO: 3) 5'- CGG GAT CCC TAT CTG CGC CTG ACA CTC GAC -3' Ba HI
lplA-rev: (SEQ ID NO: 4)
5'- CGG GAT CCT TTA TCT GAA CCG CCA TTT GCG CTG -3' BamRI
Das bei der PCR erhaltene DNA-Fragment mit einer Länge von ca. 1,6 kb wurde anschließend mittels eines DNA-Adsorptions- säulchens des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt.
B) Konstruktion des Plasmids pK03-ΔlplÄ In das PCR-Fragment wurden über die Primer-Sequenzen Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease BamHl (Erkennungssequenz in den Oligonukleotiden unterstrichen) eingeführt. Das gereinigte PCR-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHl unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen ge- schnitten, anschließend über ein Agarosegel aufgetrennt und dann mittels des GENECLEAN Kits (BIO 101 Inc . , La Jolla, Kalifornien, USA) nach Herstellerangaben aus dem Agarosegel isoliert. Zur Klonierung des IplA-Gens wurde der Vektor pUC18 (Amersham Biosciences GmbH, Freiburg, Deutschland) mit dem Restriktionsenzym BamHl unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten, anschließend durch Behandlung mit Alkalischer Phosphatase an den 5 ' -Enden dephosphoryliert und dann wie das PCR-Fragment mittels der GENECLEAN-Methode gereinigt. Die Ligation des PCR-Fragments mit dem geschnittenen und dephosphorylierten Vektor erfolgte nach Herstellerangaben unter Verwendung der T4-DNA-Ligase. Die Transformation von E. coli-Zellen des Stammes DH5α mit dem Ligationsansatz wurde mittels Elektroporation in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise durchgeführt. Der Transformationsansatz wurde auf
LB-Ampicillin-Agarplatten (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar, 100 mg/1 Ampicillin) ausgebracht und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die gewünschten Transformanden wurden nach einer Plasmidiso- lierung mittels eines QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) durch eine Restriktionsanalyse identifiziert. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid trägt die Bezeichnung pUCl8-IplÄ.
Um nun eine interne Deletion in das IplÄ-Gen einzuführen, wurde der Vektor pUC18-lpIA mit den Restriktionsenzymen Nrul und Stul , die jeweils einmal innerhalb des IplA-Gens schneiden, verdaut und der Vektor wie oben beschrieben mittels T4-DΝA- Ligase religiert, anschließend transformiert und überprüft. Dadurch wurde ein zentraler Bereich des IplA-Gens um 197 Basenpaare deletiert und gleichzeitig eine Leserasterverschiebung eingeführt, wodurch das Gen inaktiviert wurde. Das resultierende Plasmid pUC18-ΔlplÄ, das nun den verkürzten Leserahmen "AlplA" enthält, wurde mit dem Enzym BamWl geschnitten und das 1,4 kb DNA-Fragment, welches das ΔIplÄ-Genfragment beinhaltet, wurde in den ebenfalls mit BamHl geschnittenen Vektor pK03 (Link et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 6228-6237) kloniert. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid trägt die Bezeichnung pK03-ΔlplÄ.
C) Austausch des chromosomalen IplÄ-Wildtyp-Gens gegen das deletierte IplÄ-Allel aus pK03-ΔlplÄ Das Plasmid pK03-ΔlplÄ wurde wie oben beschrieben mittels Transformation in den Stamm W3110 eingebracht, wobei plas- midtragende Klone über die dadurch erworbene Chloramphenicol- Resistenz (20 mg/1 Chloramphenicol) selektiert werden konnten. Der Austausch des chromosomalen IplÄ-Wildtyp-Gens gegen das deletierte ΔlplA-Allel aus pK03-ΔlplÄ erfolgte mittels homologer Rekombination entsprechend der Prozedur von Link et al. (1997, J. Bacteriol. 179: 6228-6237), wobei durch Ausplattieren der Zellen auf LB-Saccharose-Agarplatten gleichzeitig auf Auflösung der Cointegrate sowie auf Verlust des Plasmids, wel- ches nun das IpIA-Wildtyp-Gen enthielt, selektiert werden konnte. Saccharose-resistente Einzelkolonien wurden mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide lplA-fwd (SEQ ID NO: 3) und lplA-rev (SEQ ID NO: 4) überprüft, ob der chromosomale Austausch des IplÄ-Wildtyp-Gens gegen die deletierte Variante AlplA erfolgreich war. Der auf diese Weise erzeugte Stamm trägt die Bezeichnung W3110ΔlplÄ.
Beispiel 2 : Herstellung von R-α-Liponsäure-Produzenten
Das lipB-Überexpressionsplasmid pBAD-lipB wurde mittels Elektroporation in die E. coli-Stämme W3110ΔlplA und W3110 transformiert und nach Selektion auf LB-Agarplatten mit 100 mg/1 Ampicillin wurde das Plasmid aus jeweils einer der Transformanden reisoliert, mit Restriktionsendonukleasen gespalten und überprüft. Mit dem Kontrollplasmid pKP477, das neben dem Ampicillin-Resistenzgen nur die Regulationssequenzen des Ara- binose-Operons von E. coli (araC-Gen, araBAD-Promotorregion) enthält, wurde in analoger Weise verfahren.
Beispiel 3 : Fermentative Produktion von R-α-Liponsäure Für die fer entative Produktion von R-α-Liponsäure wurden die in Beispiel 2 genannten Stämme sowohl mit als auch ohne Plasmid verwendet. Als Vorkultur für die Produktionsanzucht wurden zunächst 5 ml LB-Flüssigmedium, das 100 mg/1 Ampicillin enthielt, mit dem jeweiligen Stamm beimpft und für 16 h bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit dem entsprechenden Volumen steriler Saline (0,9 % NaCl) gewaschen. Mit den auf diese Weise vorbereiteten Zellen wurden schließlich 15 ml BS-Medium (7 g/1 KHP04; 3 g/1 KH2P04; 1 g/1 (NH4)2S04; 0,1 g/1 MgS04 x 7 H20; 0,5 g/1 Na3Citrat x 3 H20; 0,2% säurehydrolysiertes Casein (vitaminfrei); 13,5 g/1 Na2Succinat x 6 H20; pH 6,8 mit HC1 eingestellt), das außerdem 100 mg/1 Ampicillin enthielt, im Verhältnis 1:100 angeimpft. Die Inkubation der Produktionskulturen erfolgte bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler. Die Expression des Lipoyl- Protein-Ligase B-Gens auf dem Plasmid pBAD-lipB wurde durch Zugabe von 0,2 g/1 L-Arabinose nach ca. 4 h Inkubation indu- ziert. Nach 24 h Inkubation wurden Proben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt. Die darin enthaltene R-α-Liponsäure wurde mittels des bekannten turbidimetrischen Bioassays (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A: 269-272) quantifiziert. Tabelle 1 zeigt die er- zielten Gehalte freier R-α-Liponsäure im jeweiligen Kulturüberstand nach 24 h Inkubation:
Tabelle 1:
Original (für EINREICHUNG ) - gedruckt am 13.11.2003 12:31 :59 PM -1 Formular - PCT/RO/134 (EASY) Angaben zu einem hinterlegten Mikroorganismus und/oder anderem hinterlegten biologischen Material -1-1 erstellt durch Benutzung von PCT-EASY Version 2 . 92 (aktualisiert 01 . 07 . 2003) -2 Internationales Aktenzeichen.
-3 Aktenzeichen des Anmelders oder Co 10227 Anwalts
Die nachstehenden Angaben betreffen den Mikroorganismus und/oder anderes biologisches Material, der/das in der Beschreibung genannt ist -1 Seite 13 -2 Zeile 7-11 -3 Angaben betr. Hinterlegung -3-1 Name der Hinterlegungsstelle DS Z -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -3-2 Anschrift der Hinterlegungsstelle Mascheroder Weg lb , D-38124
Braunschweig , Germany -3-3 Datum der Hinterlegung 15 November 2002 (15 . 11 . 2002 ) -3-4 Eingangsnummer DSMZ 15299 -4 Weitere Angaben KEINE -5 Bestimmungsstaaten, für die alle Bestimmungsstaaten besondere Angaben gemacht werden -6 Gesondert eingereichte Angaben KEINE
Diese Angaben werden dem Internationalen Büro später übermittelt
VOM ANMELDEAMT AUSZUFÜLLEN
VOM INTERNATIONALEN BÜRO AUSZUFÜLLEN -5 Dieses Formular ist an folgendem Datum beim internationalen Büro eingegangen -5-1 Bevollmächtigter Bediensteter

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner R-α-Liponsäure, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zelle, die eine abgeschwächte Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweist, in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-α-Liponsäure in freier Form in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-α- Liponsäure von dem Kulturmedium abgetrennt wird.
2. Zelle, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretiert und eine abgeschwächte Lipoyl-Protein- Ligase A-Aktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass sie anstelle eines Wildtyp IplA-Gens ein IplÄ-Allel be- sitzt, das eine Basensubstitution im Bereich der Basenpaare 367-465 aufweist, welche dazu führt, dass das LplA-Protein eine um mindestens 50 % verminderte Aktivität hat, oder eine Deletion im IplÄ-Gen aufweist.
3. Zelle nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass keine Aktivität des LplA-Proteins mehr nachweisbar ist.
4. Zelle nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie über eine erhöhte Liponsäure-Synthase-Aktivität oder über eine erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität verfügt.
5. Zelle nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Mikroorganismus wie zum Beispiel ein Hefe- oder Bakterienstamm ist.
6. Zelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienstamm aus der Familie der Enterobacteriaceae, bevorzugt die Art Escherichia coli , ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Zelle, die eine abgeschwächte Lipoyl-Protein-Ligase A- Aktivität aufweist, eine Zelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 6 eingesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der enantiomerenreinen R-α-Liponsäure durch Zentrifugation des zellhaltigen Kulturmediums und anschließende Extraktion oder Präzipitation der R-α-Liponsäure aus dem zellfreien Kulturmedium erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 7 oder 8 dadurch gekennzeichnet, dass im Kulturmedium eine Kohlenstoffquelle ausgewählt aus der Gruppe der verwertbaren Zucker, Zuckeralkohole oder organischen Säuren eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit einer Kettenlänge von C6-C8 (Hexanbzw. Oktansäure), dem Kulturmedium zugesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von 0,1- 30 g/1 verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 7 bis 11, da- durch gekennzeichnet, dass eine Inkubation der Zellen über einen Zeitraum von 16 - 150 h im Bereich der für die jeweiligen Zellen optimalen Wachstumstemperatur erfolgt.
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