TW200427695A

TW200427695A - Use of antisense oligonucleotides or sirna to suppress expression of eif-5a1

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Publication number: TW200427695A
Application number: TW093105908A
Authority: TW
Inventors: John E Thompson; Catherine Taylor; Diane Michelle Senchyna; John Gerard Flanagan
Original assignee: Senesco Technologies Inc
Priority date: 2003-03-05
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2004-12-16
Also published as: EP1601767A2; WO2004078940A2; US20120129910A1; US20110098460A1; US8242256B2; NZ542665A; US8754057B2; WO2004078940A8; CA2517974A1; JP2006520611A; AU2004217437B2; US7662796B2; WO2004078940A3; KR20050098954A; EP1601767B1; US20060094677A1; US20100168047A9; US20130066058A1; AU2004217437A1; US20060178330A1

Description

200427695 九、發明說明：相關申請案本申請案為2003年3月10曰申請之美國專利申請案序號 10/383,614之部分接續申請案，其為2002年10月23日申請之 10/277,969之部分接續申請案，其為2002年7月23日申請之 10/200,148之部分接續申請案，其為2002年5月7日申請之美國專利申請案序號10/141，647之部分接續申請案，其為2001 年7月23曰申請之美國專利申請案序號9/909,796之部分接續申請案，將其所有全文併入本文中。本申請案也主張2003 年5月5曰申請之美國臨時申請案第60/45 1，677號、2003年6 月6曰申請之美國臨時申請案第60/476,194號、及2003年9月 22曰申請之美國臨時申請案第60/504,731號之權利，將其所有全文併入本文中。【發明所屬之技術領域】本發明係關於細胞凋亡專一的真核細胞起始因子 5A(eIF-5A，eucaryotic initiation factor 5A)或稱為細胞凋亡因子5A或因子5A1及去氧腐離胺酸合成酶（DHS， deoxyhypusine synthase) 〇本發明係關於細胞凋亡因子5 A及 DHS核酸及多胜肽及抑制細胞凋亡因子5A及DHS的表現之方法。【先前技術】細胞凋亡為遺傳學上有計劃的細胞事件，其特徵為界限清楚的形態特徵，如細胞收縮、染色質凝聚、核碎裂、及細胞膜氣泡化（membrane blebbing) 〇 Kerr 等人（1972)Br· J. 91763.doc 200427695

Cancer，26, 239-257; Wyllie 等人（1980)Int· Rev. Cytol·，68, 251-306。其於正常組織發育及體内平衡上扮演重要角色，且將細胞凋亡計劃之缺陷視為促成廣泛人類疾病範圍包括神經退化及自體免疫失調至腫瘍。Thompson( 1995)Science， 267，1456-1462; Mullauer 等人（2001)Mutat. Res，488, 211 -23 1。雖然凋亡細胞的形態特徵為已熟知，調控此過程之分子途徑僅已開始被闡明。吾人認為在細胞调亡中扮演關鍵角色的一群蛋白質為半胱胺酸水解酶（Cysteine protease)家族，稱為半胱天門冬胺酸蛋白酶（caspase)，其似乎對細胞凋亡的大部分途徑皆需要。Creagh & Martin(2001)Biochem. Soc· Trans，29, 696-701; Dales 等人（2001 )Leuk. Lymphoma，41，247-253。半胱天門冬胺酸蛋白酶藉由切斷許多細胞蛋白質啟動細胞凋亡以回應細胞凋亡刺激，其造成細胞凋亡之典型表現，包括細胞收縮、細胞膜氣泡化及DNA碎裂。Chang & Yang(2000)Microbiol_ Mol. Biol. Rev·，64，821-846 〇前細胞凋亡（？1*〇-&卩〇卩1:〇1::1(：)蛋白質，如6&1或6&]<:，也於細胞凋亡途徑中扮演關鍵角色，其藉由釋放活化半胱天門冬胺酸蛋白酶分子如粒線體細胞色素c，因而經由鈿胞凋亡促進細胞死亡。Martinou & Green(2001)Nat· Rev. Mol· Cell. Biol·，2, 63_67; Zou等人（1997)Cell，90, 405-413。抗細胞凋亡蛋白質，如Bcl-2,藉由對抗前細胞凋亡蛋白質（Bax或Bak) 促進細胞存活。Tsujimoto(1998)Genes Cells，3，697-707; Kroemer(l 997)Nature Med·，3，614-620。將 Bax:Bcl-2 的比例 91763.doc 200427695 視為一個決定細胞命運的方式；過量Bax促進細胞凋亡而過量 Bcl-2促進細胞存活。Salomons 等人（1997)Int· J. Cancer， 71, 959-965; Wallace-Brodeur & Lowe(l999)Cell Mol. Life Sci·，55, 64-75 ° 另一牽涉入細胞凋亡的關鍵蛋白質為由腫瘤抑制基因 ρ53編碼者。此蛋白質為受損及遺傳上不穩定之調控細胞生長及引發細胞凋亡的轉錄因子，可能經由向上調節Bax。 Bold 等人（1997)Surgical Oncology，6，133-142; Ronen 等人，1996; Schuler & Green(2001)Biochem. Soc. Trans·，29, 684_688; Ryan 等人（2001)Curr· Opin. Cell Biol·， 13, 332-337; ZOrnig 等人（2001)Biochem. Biophys. Acta，1551， F1-F37 。描繪細胞進行細胞凋亡的特徵之不同形態特性已產生評估細胞凋亡的開始及發展之許多方法。可利用於其偵測之凋亡細胞的一個特性為翻轉酵素（flippase)的活化，其造成填脂醯絲胺酸（phosphatidylserine)的外表化，此填脂質正常是位於細胞膜的内層。Fadok等人（1992)J· Immunol·，149, 4029-4035 〇攜帶外表化的麟月旨酿絲胺酸之〉周亡細胞可由以磷脂醯絲胺酸結合蛋白質膜聯蛋白V (Annexin V)聯結至螢光染料染色而偵測。於細胞凋亡過程期間發生之獨特DNA 碎裂可由以螢光標記的去氧核苷酸標記DNA片段暴露的 3’-OH端而偵測。可使用結合核酸的螢光染料如Hoescht 33258來偵測凋亡細胞中的染色質凝聚及核碎裂。細胞族群中細胞凋亡的程度也可由細胞萃取物中存在半胱天門冬胺 91763.doc 200427695 酸蛋白酶之蛋白質分解力之程度而推論。作為遺傳上界定的過程，細胞凋亡，類似任何其他發育程序，可受突變中斷。吾人相信細胞凋亡途徑中的改變於許多疾病過程中扮演關鍵角色，包括癌症。Wyllie等人 (1980)Int. Rev. Cytol.? 68? 251-306; Thompson( 1995)

Science，267，1456-1462; Sen & D’Incalci (1992)FEBS Letters，307，122-127; McDonnell 等人（1995)Seminars in Cancer and Biology，6，53_60。研究癌症發育及發展傳統上已集中於細胞增殖。然而，細胞凋亡於腫瘤形成中扮演的重要角色近來已變為明顯。事實上，許多現在關於細胞凋亡所知之事項係利用腫瘤模型所習知，因為細胞凋亡的控制於腫瘤細胞中總是以某種方式改變。Bold等人 (1997)Surgical Oncology，6，133_142 〇於腫瘤發育期間藉許多訊號可將細胞凋亡引發。細胞外訊號包括生長或存活因子用盡、組織缺氧及游離輻射。可引發細胞凋亡之内部訊號包括DNA受損、染色體終端 (telomeres)縮短、及致癌基因突變產生不適當增殖訊號。 Lowe & Lin(2000)Carcinogenesis，21，485-495。吾人認為游離輻射及幾乎所有用來治療惡性腫瘤之細胞毒素化學療法藥劑之作用係藉由啟動内生細胞凋亡機制而引發細胞死亡。Rowan & Fisher(1997)Leukemia，11，457-465; Kerr等人 (1994)Cancer，73，2013-2026; Martin & Schwartz(1997) Oncology Research，9，1-5 o 證據暗示癌症發展的早期，腫瘤細胞對引發細胞凋亡的 91763.doc 200427695 藥劑（如游離輻射或化學療法藥物）敏感。然而，隨著腫瘤發展，細胞形成對細胞〉周亡刺激的抵抗力。Naik等人 (1996)Gene and Development，10, 2105-2116。此可能解釋為何早期癌症比更晚期病變對治療反應較佳。晚期癌症形成對化學療法及輻射療法抵抗體的能力似乎關聯至細胞凋亡途徑之改變，其限制腫瘤細胞對細胞凋亡刺激反應之能力。Reed等人（1996)Journal of Cellular Biology，60，23-32; Meyn 等人（1996)Cancer Metastasis Reviews，15，119-131; Hannun( 1997)Blood，89，1845-1853; Reed(1995)Toxicology Letters，82-83，155-158; Hickman(1996)European Journal of Cancer, 32A，921-926。曾將對化學療法的抵抗力分別關聯至慢性淋巴球性白血病及結腸癌中過量表現抗細胞凋亡基因bcl-2及前細胞凋亡bax基因的刪除或突變。腫瘤細胞成功地建立散播的轉移之能力也似乎包含細胞 >周亡途徑之改變。Bold 等人（1997)Surgical Oncology，6, 133-142。例如，吾人認為腫瘤抑制基因p53中的突變發生於 70% 腫瘤中。Evan 等人（1995)Curr· Opin. Cell Biol.，7, 825-834。鈍化p53之突變限制細胞回應DNA損害而引發細胞凋亡之能力，使得細胞易受更多突變。Ko & Prives(1996) Genes and Development，10，1054-1072。所以，細胞凋亡密切地涉及腫瘤變性及轉移的發育及進展，牽涉的細胞凋亡途徑之更佳了解可能藉由經基因療法方式調節細胞凋亡途徑而導致治療癌症之新的可能目標。 Bold等人（1997)Surgical Oncology，6，133-142。 91763.doc •10- 200427695 义本發明係關於eIF-5A cDNA之選殖，其在細胞〉周亡引發之雨一刻受到向上調控。此細胞計專—的eIF_5A可能為介入細胞凋亡引起的疾病狀態之適當目標，因其似乎作用於涉及細胞祠亡途徑<下游作用+及轉隹彔因子之轉錄後調控之1。明確而言，細胞凋亡專一的eIF_5A似乎選擇性促進編碼下游作用子及細胞凋亡的轉錄因子之mRNA自細胞核至、、’田版> 貝之易位，隨後於此將其轉譯。起始細胞凋亡的最終決定似乎起源於内部及外部前_及抗_細胞凋亡訊號之間複雜的交互作用。Lowe & Lin(2〇〇〇)Carcin〇genesis，21， 485 495經由其促進下游細胞凋亡作用子及轉錄因子轉譯之能力，細胞凋亡相關的eIF-5A似乎傾斜此等訊號之間的平衡朝向細胞凋亡。如前述，已熟知抗癌藥劑引發細胞凋亡及細胞凋亡途徑之改變可減弱藥物引發的細胞死亡。Schmiu & L_(1999)J· Pathol·，187, 127_13?。例如，許多抗癌藥物向上調控p53，已失去p53之腫瘤細胞對此等藥物形成抵抗力。然而’幾乎所有化學療法試劑若劑量足夠可引發細胞 /周亡無關P 5 3 ’代表即使於抗藥物腫瘤中，細胞〉周亡的途么未元全被阻斷。Wallace-Brodeur & Lowe(1999)Cell Mol. Life Sci·，55，64-75。此暗示細胞凋亡eiF_5A之引發，即使其可能不會校正突變的基因，可能可以規避p53_相關的途徑及藉由促進其他途徑而引發細胞凋亡。細胞/周亡相關的eIF-5A之引發具有選擇性瞄準癌症細胞同時具有極少或無作用於正常相鄰細胞的潛力。此因表現 91763.doc -11 - 200427695 於腫瘤細胞中的有絲分裂性致癌基因以不存在於正常細胞之特定mRNA種類的形式提供細胞凋亡訊號而產生。L〇we等人 (1993)Cell，74，954-967; Lowe & Lin (2000) Carcinogenesis， 21，485-495。例如，於"弘突變的腫瘤細胞中恢復野生型p53 可直接引發細胞凋亡以及增加腫瘤細胞株及生命異種製版 (xenographs)中的藥物敏感度。（Spitz等人，1996 ; Badie等人，1998)。細胞凋亡eIF-5 A之選擇性起因於其藉由調節下游細胞凋亡作用子及轉錄因子之mRNA自細胞核易位至細胞質而選擇性促進其轉錄之事實。因此，為了細胞凋亡eIF_5 A要有作用，此等作用子及轉錄因子2mRNA必須被轉錄。由於此等 mRNA會於癌症細胞中被轉錄，但不會於鄰近正常細胞中，預期細胞凋亡eIF-5A會促進癌症細胞中的細胞凋亡但具有最小（若有的話）作用於正常細胞。因此，以細胞凋亡相關的 eIF-5 A恢復腫瘤細胞中的細胞凋亡潛力可降低癌症患者感受的毒性及副作用，因為腫瘤細胞的選擇性瞄準。細胞凋亡eIF-5A的引發也具有潛力強化腫瘤細胞對抗癌藥物的反應因而改善此等藥劑對抗藥物腫瘤之效果。此轉而可造成抗癌藥物有效的更低劑量及對病患的降低毒性。吾人也認為細胞凋亡途徑的改變於因為青光眼造成失明之視網膜神經節細胞（retinal gangli〇n cell)的退化扮演某角色。青光眼說明一群眼睛疾病，其中增加的眼壓（I〇p, intra-ocular pressure)導致視神經的損害及逐漸失明。雖然青光眼目前以藥物或手術控制IOP以降低對視神經的損害 91763.doc -12- 200427695 或利用神經保護劑來控制，仍有需要保護視網膜神經節細胞免於受青光眼的眼睛中細胞凋亡而退化。 P巧也W將細胞激素包含於細胞凋亡途徑中。生物系統兩細胞的交互作用作為調控，而細胞之間的交互 π ~般包含多種細胞激素。細胞激素為由許多不同細胞類型回應廣泛不同刺激產生的介質（Mediator)。細胞激素為多效性 (pleiotropic)分子，其可施加許多不同作用於許多不同細胞類型，但特別重要於調控免疫反應及造血細胞增殖及= 化。細胞激章於目標細胞的作用可促進細胞生存、增殖、活化、分化、或細胞凋亡，視特定細胞激素、相對濃度、及其他介質的存在而定。運用抗細胞激素來治療自體免疫疾病（牛皮癣、風濕性關節炎、克隆氏病（Crohn’s disease))漸漸得到普及。促炎性細胞激素IL-1及TNF扮演重要角色於此等慢性疾病的病理學且降低此兩種細胞激素的生物活性之抗細胞激素療法可提供治療好處（Dinarello及 Abraham，2002)。白介素·1(1Χ-1，interleukin-Ι)為重要的細胞激素，其調節局部及全身發炎反應且其可與TNF協同於許多疾病的發病，包括血管炎（Vasculitis)、骨質疏鬆、神經退化性疾病、糖尿病、紅斑性狼瘡腎炎（lupus nephritis)、及自體免疫疾病如風濕性關節炎。IL-l/J於腫瘤血管新生（Angi〇genesis：) 及侵入的重要性最近也由][L-l/?剔除小鼠當以黑色素瘤細胞注射’其對轉移及血管新生之抵抗力而證實（v〇r〇n〇v等人， 2003) 〇 91763.doc -13- 200427695 白介素_18(IL-1 8, interleukin-18)為IL-1家族最近發現的一員，其結構、受體、及功能相關於IL-1。由於其能夠引發干擾素7(INF_X)、TNF-α、及IL_1，IL-18為涉及發炎及自體免疫疾病之核心細胞激素。IL-ljS及IL-18兩者皆能夠引發 TNF_a之製造，其為於心肌局部缺血（myocardiai ischemia) 期間促成心臟功能障礙的已知細胞激素（Maekawa等人， 2002)。已發現於上方灌流的人類心房心肌之局部缺血/恢復灌流模型中藉由與IL-1 8結合蛋白質中和而抑制il- 1 8可降低局部缺血引發的心臟功能障礙（Dinarello，2001)。利用小鼠IL-18結合蛋白質中和IL_18也能夠減少IFN-λ、TNF_a、及 IL-1 /3轉錄量及於膠原蛋白引發的關節炎小鼠模型中降低關節損害（Banda等人，2003)。降低IL-18製造或可利用性也可能提供幫助於控制轉移性癌症因於小鼠黑色素瘤模型中注入IL-18結合蛋白質成功地抑制轉移（carrascal等人， 2 0 0 3)。作為其重要性作為促炎性細胞激素之另一個指示， IL18的血漿濃度於具有慢性肝病的患者中升高且增加的量關聯於疾病的嚴重性（Ludwiczek等人，2002)。類似地，il-18 及TNF-α於具有腎病的糖尿病患者的企清中升高（M〇riwaki 專人’ 2003)。創傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury)後的神經炎症也受促炎性細胞激素調控且由IL-18結合蛋白質抑制IL-18改善小鼠中腦創傷後神經復原（Yatsiv等人，2〇〇2)。 TNF-om細胞激素之TNF家族之一員，為具有多效性作用的促炎性細胞激素，範圍自對造血細胞的共同促有絲分裂效果、引發發炎反應、及引發細胞死亡於許多細胞類型。 91763.doc -14- 200427695 TNF-α正常由細菌脂多醣、寄生蟲、病毒、惡性細胞及細胞激素引發且通常有利地作用以保護細胞免於感染及癌症。然而，TNF-α的不適當引發為急性及慢性發炎如自體免疫疾病所致的疾病之主要成因並也可促成癌症、AIDS、心臟病、及敗血症（見 Aggarwal及 Natarajan，1996; Sharma及 Anker， 2002)。疾病之實驗動物模型（即敗血性休克及風濕性關節炎）以及人類疾病（即炎症性腸道疾病及急性移植物對抗宿主疾病（graft-versus_host disease))已證實阻斷TNF-o:的有利作用（Wallach等人，1999)。TNF-α的抑制也有效於提供患有自體免疫疾病如克隆氏病（van Deventer，1999)及風濕性關節炎（Richard_Miceli 及 Dougados，2001)之患者緩解。TNF-a 促進B淋巴細胞的生存及生長之能力也被視為在B細胞慢性淋巴球性白血病（B-CLL，B-cell chronic lymphocytic leukemia)的發病扮演某角色且由B-CLL中的T細胞表現的 TNF-α量與腫瘤大小及疾病階段正相關（Bojarska-Junak等人，2002)。白介素-l/5(IL-l/5，interleukin-l]3)為已知引發 TNF-α製造的細胞激素。已知去氧腐離胺酸合成酶（DHS，deoxyhypusine synthase) 及含腐離胺酸真核轉譯起始因子-5 A(eIF-5 A)於許多細胞過程中扮演重要角色，包括細胞生長及分化。腐離胺酸，一種獨特胺基酸，見於所有檢視的真核生物及古細菌類 (archaebacteria)，但不於真細菌類（eubacteria)中，且 eIF-5A 為唯一已知含腐離胺酸的蛋白質。Park( 1988)J. Biol. Chem·， 263，7447-7449; Schumann & Klink(l 989)System. Appl. 91763.doc -15- 200427695

Microbiol·，11，103-107; Bartig 等人（1990)System. Appl. Microbiol·，13，112-116; Gordon 等人（1987a)J. Biol. Chem·，262, 165 85-165 89 〇活性eIF_5A係形成於兩個轉譯後步驟：第一步為藉由去氧腐離胺酸合成酶催化藉轉移亞精胺（spermidine)的4-胺丁基部分至前驅物eIF-5 A特定離胺酸的〇：-胺基基團而形成去氧腐離胺酸基團；第二步包含藉由去氧腐離胺酸羥化酶羥基化此4-胺丁基部分而形成腐離胺酸。 eIF-5A的胺基酸序列於物種間相當守恆，且於elF-5A中腐離胺酸基團周圍的胺基酸序列有嚴格的守恆，其暗示此修飾可能對生存重要。Park等人（1993)Biofactors，4, 95-104。此假設進一步由觀察到迄今於酵母菌發現eIF-5 A的兩種異構體之去活化（或DHS基因（其於其活化中催化第一步）之去活化）阻斷細胞分裂而支持。Schnier等人（1991)Mol. Cell. Biol·，11，3105-3114; Sasaki 等人（1996)FEBS Lett” 384, 151-154; Park等人（1998)J. Biol. Chem·，273, 1677-1683。然而，於酵母菌中消除eIF-5 A蛋白質僅造成小量減少總蛋白質合成，暗示可能需要eIF-5 A於特定子集mRNA之轉譯而非蛋白質總體合成。Kang等人（1993)「起始因子eIF-5A消除於細胞增殖及蛋白質合成之作用」於Tuite，M·(編著），Protein Synthesis and Targeting in Yeast，NATO Series Η。最近發現結合eIF-5 Α的配體共有高度守恆的基序（motif)也支持 eIF-5A的重要性。Xu & Chen(2001)J. Biol· Chem·，276, 2555-2561。此外，發現修飾後eIF-5A的腐離胺酸對RNA之序列專一結合為重要，且結合並不提供保護免於核醣核酸 91763.doc -16- 200427695 酶0 此外，eIF-5A的細胞内消除造成特定mRNA於細胞核中顯著累積，代表eIF-5A可能負責運送特定mRNA類別自細胞核至細胞質。Liu & Tartakoff(1997)Supplement to Molecular Biology of the Cell，8, 426a.摘要編號 2476,第 37屆美國協會細胞生物學年會。累積eIF-5A於細胞核孔組合的核内絲及其與一般核輸出受體之交互作用進一步暗示eIF-5 A為核質運送蛋白質，而非多核糖體的成分。Rosorius等人（1999)J. Cell Science，112, 2369-2380 〇 eIF-5A的第一個cDNA係由Smit-McBride等人於1989年自人類選殖，自此之後eIF-5A的cDNA或基因已由許多真核細胞選殖，包括酵母菌、大鼠、小雞胚胎、苜蓿（alfalfa)、及蕃茄。Smit-McBride 等人（1989a)J· Biol. Chem·，264, 1578-1583; Schnier 等人（1991)(酵母菌）；Sano，Α·(1995)於 Imahori，Μ·等人（編著）Polyamines，Basic and Clinical Aspects，VNU Science Press，The Netherlands，81_88(大氣）; Rinaudo & Park(1992)FASEB J·，6，A453(小雞胚胎）;Pay等人（1991)Plant Mol. Biol.，17，927-929(苜蓿）；Wang 等人 (2001)J. Biol. Chem·，276, 17541-17549(蕃茄）。 eIF-5A mRNA的表現已於許多人類組織及哺乳類細胞株中探索過。例如，在血清去除後加入血清後於人類纖維 (fibroblast)細胞中觀察到eIF-5A表現的改變。Pang & Chen(1994)J· Cell Physiol·，160，53 1-538。老化相關的降低去氧腐離胺酸合成酶活性及大量前驅物eIF-5A也曾被觀察 91763.doc -17- 200427695 於老化的（senescing)纖維細胞中，雖然此反射異構體中平均分化改變的可能性尚未決定。Chen & Chen(1997b)J. Cell Physiol·，170, 248-254。研究已顯示eIF-5A可能為病毒蛋白質的細胞目標，如人類免疫不全病毒類型1 Rev蛋白質及人類T細胞白血病病毒類型 1 Rex蛋白質。Ruhl 等人（1993)J. Cell Biol·，123, 1309-1320; Katahira等人（1995)J· Virol·，69, 3125-3 133。初步研究指出eIF-5A可能藉由與其他RNA結合蛋白質如Rev 交互作用而瞄準RNA，暗示此等病毒蛋白質可能吸收eIF-5A 作為病毒 RNA 處理。Liu 等人（1997)Biol. Signals, 6, 166-174 。因此，雖然eIF-5A及DHS為已知，仍有需要了解此等蛋白質如何牵連於細胞凋亡途徑中以及細胞激素刺激能夠調控細胞凋亡及細胞激素表現。本發明滿足此等需要。【發明内容】本發明係關於細胞凋亡專一的真核細胞起始因子 5A(eIF-5A，eucaryotic initiation factor 5A)，稱為細胞〉周亡因子5A1或簡稱因子5A1。本發明亦關於細胞凋亡因子5A1 核酸及多胜肽及利用反意義核苷酸或siRNA以抑制因子5A1 的表現而抑制或阻止細胞凋亡之方法。本發明亦關於藉由抑制細胞凋亡因子5 A1的表現而阻止或抑制促炎性細胞激素（pro-inflammatory cytokine)的表現。再者，本發明係關於藉由抑制細胞凋亡因子5A1的表現而抑制或阻止p53的表現。本發明亦關於利用反意義核苷酸或siRNA藉由抑制或阻 91763.doc -18- 200427695 止細胞凋亡因子5A1的表現增加Bcl_2表現的方法。本發明亦提供抑制細胞激素製造的方法，特別是11^7_〇^於人類上皮細胞中。於本發明的另一具體實施例中，藉由利用反意義核苷酸瞄準細胞凋亡專一的eIF5A1而阻止細胞凋亡專一的 eIF5 A1的表現提供於青光眼的眼睛中避免視網膜神經節細胞死亡的方法。真核細胞起始因子5a(eIF-5A)之數種異構體曾被分離及存在於發表的資料庫中。吾人認為此等異構體為功能上重複。本發明人已發現一種異構體在引發細胞凋亡之前一刻受到向上調控，其已記為細胞凋亡因子5a或因子5a1或 eIF-5Al °本發明的主題為細胞凋亡因子5A以及dhs，其涉及eIF-5A之活化。細胞凋亡因子5A可能為介入細胞凋亡引起的疾病狀態之適當目標’因其似乎作用於涉及細胞凋亡途徑之下游作用子及轉錄因子之轉錄後調控之量。明確而言，細胞凋亡因子5 A似乎遥擇性促進編碼下游作用子及細胞〉周亡的轉錄因子之mRN A自細胞核至細胞質之易位，隨後於此將其轉譯。起始細胞洞亡的最終決定似乎起源於内部及外部前-及抗· 細胞〉周亡訊號之間複雜的交互作用。L〇we &

Lin(2000)Caixinogenesis，21，485-495。經由其促進下游細胞/周亡作用子及轉錄因子轉譯之能力，細胞凋亡因子5 A似乎傾斜此等訊號之間的平衡朝向細胞凋亡。於疋’本發明提供藉由給予抑制或降低細胞凋亡因子5 A 或DHS之表現的藥劑抑制或降低細胞中的細胞凋亡之方 91763.doc > 19- 200427695 可抑制或降低細胞凋亡因子5 A或dhS之表現的一種藥劑為反意義寡核苷酸。反思義券核苷酸已成功地用於達到試管中以及活體内兩者基因專一的抑制。反意義寡核苷酸為短的、合成DNA股（或 DNA類似物）其對特定〇1^八或1^八目標為反意義（或互補）。將反意義募核普酸設計來藉由結合至目標並於轉錄、轉岸、或勇接的層次中止表現而阻擋由Dna或RNA目標編碼的蛋白質之表現。藉由利用修飾的骨架抵抗分解（Blake等人’ 1985) ’如置換寡核苷酸中的磷酸二酯鍵成為硫代磷酸酉曰連結以阻止核酸酶分解丨撾以別^及^匕沈丨…^⑽^已成功地使用反意義募核苷酸於疾病之細胞培養及動物模型兩者中（Hogrefe，1999)。較佳的是’本發明之反意義募核苷酸具有編碼部分細胞凋亡因子5A多胜肽或細胞凋亡專一的dhS多胜肽的核苷酸序列。本發明人已用編碼部分細胞凋亡因子5 A多胜肽之反意義寡核普酸如下述轉染許多細胞株並測量進行細胞凋亡的、、、田胞數目。以反意義募核苷酸轉染的細胞相較於未以反意義募聚體轉染的類似細胞顯示進行細胞凋亡的細胞數目減少。圖54-58顯示受反意義細胞凋亡因子5A募核苷酸處理的細胞中進行細胞凋亡的細胞百分比相較於未以反意義細胞〉周亡因子5 A募核苷酸轉染的細胞之減少。

本發明片s彳利用终多編碼細胞〉周亡因子5 a多胜肽或dhS 多胜肽之適當的核酸序列。例如，SEQ ID NOS:l、3、4、5、 11、15、19、20、及21(細胞〉周亡因子5八核酸序列）、SEQ ID 91763.doc -20- 200427695 NOS:6及8(細胞凋亡專一的DHS核酸序列）、SEQ ID NOS: 12 及16(細胞凋亡因子5A序列）、及SEQ ID NO:7(細胞凋亡專一的DHS多胜肽序列）（或其部分）提供適當的序列。其他較佳細胞凋亡因子5A序列包括SEQ ID NO:35、37、及39。其他的反意義核苷酸包括具有實質上序列一致於上面列舉的序列（即90%相似）者或具有於高度嚴格的條件下與列舉的SEQ ID NOS雜交之序列者。此外，利用已知序列作為探針，根據技藝中已知的方法，可發現其他適當的序列。本發明的反意義寡核苷酸可為單股、雙股、DNA、RNA 或雜交體。可將寡核苷酸藉技藝中已知的方法修飾以增加安定性、增加對核酸酶分解的抵抗力等。此等修飾為技藝中已知且包括（但不限於）修飾寡核苷酸的骨架、修飾糖部分、或修飾鹼基。同時包括於此等修飾中的是許多DNA-RNA 雜交體或構體，通稱為「間距」寡核苷酸。本發明提供可抑制或降低細胞凋亡因子5A或DHS表現之其他藥劑。一種此藥劑為siRNAs。小抑制性RNAs(siRNA) 已脫穎而出成為對反意義募核苷酸之可行的另一選擇，因為需要較低濃度以達到相當或優於以反意義寡核苷酸達到的抑制程度（Thompson，2002)。已使用長的雙股RNA來壓制特定基因的表現於許多生物中如植物、線蟲、及果蠅。一種RNase_III家族酵素稱為Dicer處理此等長的雙股RNA成為 21-23個核苷酸小的干擾RNA，而後將其併入RNA-引發的壓制複合物（RISC，RNA-induced silencing complex)。siRNA的解開活化RISC並允許單股siRNA藉由鹼基配對指導複合物 91763.doc -21 - 200427695 至内生mRNA。由RISC辨識内生mRNA造成其切斷並結果使其不能用於轉譯。導入長的雙股RNA於哺乳類細胞中造成有效抗病毒反映，藉由利用siRNA可取代。（Elbashir等人， 2001)。已廣泛地使用siRNA於細胞培養中且普通達到特定基因表現降低90%或以上。於動物疾病模型中，利用siRNA也已得到普及於抑制基因表現。最近研究證實由共同轉染的質體於廣泛不同器官中利用流體力學注射傳遞技術於產後小鼠中，針對螢光素酶（luciferase)的siRNA能夠阻擋螢光素酶表現（Lewis等人，2002)。流體力學注射針對Fas(TNF家族中的受體）之 siRNA進入小鼠的尾靜脈，最後注射後10天後能夠轉染超過80%肝細胞並降低肝臟中90% Fas表現（Song等人， 2003)。Fas siRNA也能保護小鼠免於肝纖維化及猛暴性肝炎。藉由利用針對TNFa之siRNA抑制以致命劑量之脂多醣處理的小鼠中敗血症的發展（Sorensen等人，2003)。鑒於其持久有效於細胞培養及活體内，其於活體内轉染細胞的能力，及於血清中其對分解的抵抗力，siRNA具有成為非常有效活體内抑制特定基因表現之藥物的潛力（Bertrand等人，2002)。本發明人已以細胞凋亡因子5 A siRNA轉染細胞並研究對細胞凋亡因子5A表現的作用。圖64顯示以細胞凋亡因子5a siRNA轉染的細胞產生較少細胞凋亡因子5a蛋白質。圖 ό4_ό7顯示以細胞〉周亡因子5 A siRNA轉染的細胞相較於未受細胞凋亡因子5A siRNA轉染的細胞在暴露至喜樹鹼及 91763.doc -22- 200427695 TNF - α後具有較低進行細胞凋亡之細胞百分比。較佳的 siRNA包括具有 SEQ ID ΝΟ:30、31、32、33、及 34 者。其他的siRNA包括具有實質上序列一致於列舉的序列 (即90%相似）者或具有於高度嚴格的條件下與列舉的SEQ ID NOS雜交之序列者。圖64顯示以細胞凋亡因子5A siRNA 轉染的細胞產生較少細胞凋亡因子5 A蛋白質。許多重要的人類疾病係由異常細胞凋亡之控制而引起。此等異常可造成病理上增加細胞數目（如癌症）或細胞之損壞損失（如退化性疾病）。作為非限制性實例，可使用本發明之方法及組合物來預防或治療下列細胞凋亡相關的疾病及失調：神經學/神經退化性失調（如阿茲海默症（Alzheimer^ disease)、帕金森氏病（Parkinson's Disease)、亨丁頓舞蹈症（Huntington’s Disease)、肌萎縮性侧索硬化症 (Amyotrophic Later el Sclerosis)(魯蓋瑞格氏（Lou Gehrig’s) 病））、自體免疫失調（如風濕性關節炎、全身紅斑性狼瘡 (SLE，Systemic Lupus Erythematosus)、多發性硬化症）、杜馨氏肌肉萎縮症（DMD，Duchenne Muscular Dystrophy)、運動神經元疾病、局部缺血、心臟局部缺血、慢性心臟衰竭、中風、嬰兒脊鏞性肌肉萎縮症、心臟猝停、腎衰竭、異位性皮膚炎、敗血症及敗血性休克、AIDS、肝炎、青光眼、糖尿病（第1型及第2型）、氣喘、色素性視網膜炎（retinitis pigmentosa)、骨質疏鬆、異種移植（xenograft)排斥、及灼傷。由異常細胞凋亡之控制而引起的一種此類疾病為青光眼。細胞凋亡為導致青光眼患者失明的關鍵因素。青光眼 91763.doc -23- 200427695 為一群由視神經的損害引起的眼睛疾病而造成逐漸失明。已證實細胞凋亡為此視神經損害的直接原因。

青光眼研究領域中早期工作已指出增加的IOP導致干擾於視神經底盤（一個穿孔、膠原結缔組織）之層的軸突運輸，之後視網膜神經節細胞死亡。Quigley及 Anderson( 1976)Invest. Ophthalmol. Vis. Sci·，15，606-16; Minkler，Bunt，及 Klock，（1978)Invest· Ophthalmol. Vis. Sci·， 17， 33-50; Anderson 及 Hendrickson，（l974)Invest.

Ophthalmol. Vis. Sci” 13，771-83; Quigley 等人， (1980)Invest. Ophthalmol. Vis· Sci·，19，505-17。青光眼的動物模型及死後人類組織的研究指出青光眼中視網膜神經節細胞的死亡因細胞凋亡產生。Garcia-Valenzuela等人， (1995)Exp. Eye Res·，61，33-44; Quigley等人，（1995)Invest. Ophthalmol. Vis· Sci·，36，774-786; Monard，（1998)於： Haefliger 10，Flammer J(編著）於青光眼發病中之一氧化氮及内皮素（endothelin)(Nitric Oxide and Endothelin in the Pathogenesis of Glaucoma)，New York，NY，Lippincott-Raven， 213-220。增加IOP之結果造成軸突運輸的干擾可能藉喪失營養因子促成視網膜神經節細胞的死亡。Quigley，（1995)Aust N Z J Ophthalmol，23(2)，85·91。也已發現青光眼的眼睛中視神經盤星細胞產生增量之某些神經毒性物質。例如，已發現增加產生腫瘤壞死因子_ce (TNF_ce，tumor necrosis factor_a〇(Yan等人（2000)Arch· Ophthalmol·，118，666-673)及一氧化氮合成酶（Neufeld等人，（1997)Arch. Ophthalmol·，115, 91763.doc -24- 200427695

497-503)(產生一氧化氮的酵素）於青光眼的眼睛之視神經盤中。再者，於遺傳性視網膜疾病的大鼠模型中曾觀察到一氧化氮合成酶的可誘導形式（iNOS)之增加的表現及受視網膜神經節細胞活化的TNF-α。Cotinet等人，（1997)Glia，20, 59-69; de Kozak等人，（1997)Ocul· Immunol. Inflamm·，5, 85-97; Goureau等人，（1999)J. Neurochem，72，2506-2515 o 於青光眼的視神經盤中，已將過量一氧化氮聯結至視網膜神經節細胞的軸突退化。Arthur及Neufeld，（1999)Surv Ophthalmol，43(Suppl 1)，S129-S135。最後，由視網膜神經節細胞增加製造TNF-0：以反應模擬的局部缺血或升高的靜水壓力已證實引發培養的視網膜神經節細胞之細胞凋亡。 Tezel及 Wax，（2000)J. Neurosci.，20(23)，8693-8700。

保護視網膜神經節細胞免於受細胞凋亡而退化為研究中作為由於青光眼失明之可能新療法。已由幾個團隊利用反意義寡核苷酸來瞄準細胞凋亡過程中關鍵蛋白質，以便保護視網膜神經節細胞免於細胞凋亡的細胞死亡。反意義募核苷酸為短的合成DNA股（或DNA類似物）其為反意義（或互補）於特定DNA或RNA目標。將反意義募核苷酸設計來藉由結合至目標並於轉錄、轉譯、或剪接的層次中止表現而阻擋由DNA或RNA目標編碼的蛋白質之表現。利用反意義募核苷酸作為藥物的一個困難為於血液中及細胞中募核苷酸受核酸酶快速分解。此問題已藉由利用修飾的骨架抵抗分解而解決（Blake 等人，（1985) Biochemistry，24，6139-6145)，如置換寡核苷酸中的磷酸二酯鍵成為硫代磷酸酯連 91763.doc -25- 200427695 結以阻止核酸酶分解。Matzura及Eckstein，（1968) Eur. J. Biochem·，3，448-452 〇已成功地使用反意義寡核苷酸於眼睛疾病之動物模型中。於瞬間總體視網膜局部缺血的模型中，於局部缺血期間半胱天門冬胺酸蛋白酶2的表現增加，主要於視網膜的内核及神經節細胞層中。利用反意義寡核苷酸抑制半胱天門冬胺酸蛋白酶導致顯著組織病理學及功能上改善，如由網膜電圖所測定。Singh等人，（2001)J· Neurochem.，77(2)， 466-75。另一研究證實，在橫切視神經時，視網膜神經節細胞向上調節前細胞凋亡蛋白質Bax及進行細胞凋亡。反覆注射Bax反意義寡核苦酸進入大鼠的顳上視網膜抑制Bax 的局部表現並增加橫切視神經後存活視網膜神經節細胞的數目。Isenmann 等人，（1999)Cell Death Differ·，6(7)， 673-82 。傳遞反意義寡核苷酸至視網膜神經節細胞已由將寡核苷酸裝入微脂粒中，而後將其以去活性日本凝血病毒（HVJ， hemagglutinating virus of Japan;仙台病毒（Sendai virus))藉融合而塗佈（HVJ微脂粒）而改善。玻璃體内注射裝入HVJ微脂粒的FITC-標記的反意義寡核苷酸進入小鼠造成44%於神經節層中的細胞内高螢光，其持續三天，而裸FITC·標記的反意義寡核苷酸一天後即消失。HanSai等人’（1998)Arch Ophthalmol，116(7)，976。本發明預防或調控細胞凋亡的方法係針對調控眼睛細胞中的細胞凋亡，如但不限於星細胞、視網膜神經節、視網 91763.doc -26- 200427695 膜神經膠質細胞及視神經底盤。f光眼中視網膜神經節細胞的死亡因細胞社產生。因此，提供抑制細胞〉周亡於視網膜神經節細胞中的方法或藉由保護視網膜神經節細胞免於受細胞凋亡退化提供預防青光眼引起的失明之新穎療法。本發明藉由抑制細胞凋亡專一的eIF5A1之表現，提供預防月光眼的眼睛中視網膜神經節細胞死亡之方法。抑制細胞凋亡專一的eIF5Al之表現降低細胞凋亡。細胞凋亡專一的eIF5Al為有力的基因，其似乎調節整個細胞凋亡的過程。因此，控制於視神經盤的細胞凋亡代表阻止細胞凋亡專一的eIF5Al之表現提供青光眼的治療。藉由給予目標針對人類細胞凋亡專一的eIF5A1之反意義寡核苷酸至眼睛的細胞如（但不限於;)視神經底盤、星細胞、視網膜神經節、或視網膜神經膠質細胞，達到抑制細胞凋亡專一的eIF5Al之表現。反意義募核苷酸為如上述定義，即具有編碼至少部分細胞凋亡專一的eIF5 A1多胜肽之核芽酸序列。目標針對人類細胞凋亡專一的eIF5A1之反意義寡核苷酸具有編碼至少部分人類細胞凋亡專一的eIF5Al多胜肽之核苷酸序列。較佳的反意義寡核苷酸包含SEQ ID NO:26或27或於高嚴格條件下結合至互補於SEQ ID NO:26 或2 7序列之寡核普酸。本發明的另一具體實施例提供抑制細胞凋亡專一的 eIF5 A1表現之方法於視神經底盤細胞、星細胞、視網膜神經節細胞或視網膜神經膠質細胞。將目標針對人類細胞凋 91763.doc -27- 200427695 亡專一的eIF5Al之反意義募核苷酸（如但不限於SEq m ΝΟ··26及27)給予視神經底盤細胞、星細胞、視網膜神經節細胞或視網膜神經膠質細胞。細胞可為人類的。除了於細胞凋亡中具有作用，eIF5 Α也可能於免疫反應上有功用。本發明人已發現於局部缺血心臟組織中細胞凋亡因子5A量與兩種細胞激素（白介素「IL-ljg」及白介素_18 「IL-1 8」）升高的量有關聯，因此進一步證實細胞凋亡因子 5 A涉及細胞死亡，因其存在於局部缺血的心臟組織中。再者’此細胞调亡因子5A/白介素關聯未曾見於非局部缺血心臟組織中。見圖50A-F及5 1。利用PCR測量，於不同局部缺血的心臟組織中（來自冠狀動脈繞道移植及心瓣（二尖瓣及心房瓣）更換病患）測量細胞凋亡因子5A、增殖 eIF-5a(eIF-5A2-另一已知異構體）、IL-ljg、& IL_18之量及比較。細胞调亡eIF-5a對此等有效白介素之關聯更暗示於局部缺血中發炎及細胞凋亡途徑可經由控制細胞凋亡因子5 A之量而控制。由人類周邊血液單核細胞（PBmc，peripheral blood mononuclear cells)正常表現非常低量eIF_5A，但在以 T-淋巴細胞專一的刺激刺激時，eIF_5 a的表現大幅增加的事實為暗示細胞凋亡因子5 A涉及免疫反應之另一證據。此建議細胞凋亡因子5A於T-細胞增殖及/或活化中的功用。因為活化的T細胞能夠產生廣泛不同之細胞激素，也可能需要細胞〉周亡因子5 A作為細胞激素mRNA的核質運送。另一研究看eIF-5 A mRNA及細胞表面標記物表現於以不 91763.doc -28- 200427695 同成熟刺激劑處理之人類周邊血液單核細胞（PBMC， peripheral blood mononuclear cells)及血液細胞株中（Bevec 等人，Proc· Natl. Acad. Sci· USA，91:10829-10833.(1994))。於PBMC中eIF-5 A mRNA表現受許多刺激引發，其也引發T 細胞活化（Bevec等人，1994)。於HIV-1病患中比於健康捐贈者中觀察到更高量之PBMC eIF-5 A mRNA表現。此研究之作者解釋其結果為建議eIF-5A mRNA受引發所以其可作用為對T細胞活化及同時對HIV-1複製所需重要mRNA的核質運送（Bevec等人，1994)。已證實eIF5A為HIV Rev蛋白質的細胞結合因子及HIV複製必須（Ruhl等人，1993)。最近研究已建議eIF-5A於細胞分化及活化中重要的角色。當將不成熟樹突細胞引發至分化及成熟，eIF-5 A mRNA 量之引發與CD83蛋白質表現之提高同時發生（Kruse等人，J· Exp· Med· 191(9):1581-1589(2000))。樹突細胞為抗原呈遞細胞（antigen presenting cell)，其使輔助及殺手T細胞敏感而引發T細胞調控的免疫性（Steinman，1991)。不成熟樹突細胞缺乏刺激T細胞的能力且需要適當刺激（即發炎性細胞激素及/或微生物產物）以成熟至能夠活化T細胞的細胞。CD83之合成及表面表現於成熟樹突細胞上重要地涉及使輔助及殺手T細胞敏感與引發T細胞調控的免疫性。當將不成熟樹突細胞以腐離胺酸化抑制劑（GC7)且因而為eIF-5A活化的抑制劑預先處理，將CD83的表面表現避免（Kmse等人， 2000) 〇此研究之作者解釋其結果為eIF - 5 A對CD83 mRNA的核質易位為必須及藉由阻止腐離胺酸化及因而eIF-5A，阻止 91763.doc -29- 200427695 CD83的表現及樹突細胞成熟（Kruse等人，2000)。於此兩個研究中（Bevec等人，1994 ; Kruse等人，2000)意味eIF5 A於免疫系統中的角色，作者們並未指明或確認他們檢視的是eIF5 A的何種異構體，他們也沒有理由如此做。如上簡短地敘述，已知人類具有兩種eIF5A的異構體， eIF5Al(細胞凋亡因子5A1)及eIF5A2，兩者編碼於不同染色體上。於本發明人發現之前一般認為此二種異構體功能上重複。由Bevec等人說明用來偵測受刺激的PBMC中eIF5A mRNA的寡核苷酸具有與人類eIF5Al 100%—致性且研究早於elF5 A2之選殖。類似地，由Kruse等人說明用來藉反轉錄聚合酶鏈反應於樹突細胞成熟的期間偵測eIF5A的引子具有與人類eIF5Al 100% —致性。本發明係關於控制eIF-5Al之表現以控制樹突細胞成熟及PBMC活化的速率，其轉而可控制T細胞調控的免疫性之速率。本發明人利用U-937細胞株研究eIF-5Al於單核球分化成為有粘著力的巨噬細胞中之角色，因已知U-937表現 eIF-5AmRNA(Bevec等人，1994)。U-937為生長於懸浮液中之人類單核球細胞株且在以PMA刺激時將變成有黏著力及分化成為巨噬細胞。當將PMA藉改變培養液而去除時，細胞變成休眠及而後能夠製造細胞激素（Barrios-Rodiles等人，J· Immunol. 163:963-969(1999))。對脂多醣（LPS， lipopolysaccharide)反應，於許多細菌的外膜上發現一因子已知引發一般發炎反應，巨噬細胞產生TNF-o:及IL-1沒兩者 (Barrios-Rodiles等人，1999)。見圖78顯示幹細胞分化及形 91763.doc -30- 200427695 成的細胞激素製造之表。LPS刺激後U-937細胞也產生IL_6 及 IL-10(lzeboud 等人，J. Receptor & Signal Transduction Research，19(1-4):191-202(1999))。利用U-937細胞，證實於單核球分化及TNF-α分泌期間 eIF-5Al受到向上調節。見圖77。於是，本發明的一個觀點提供抑制或延遲巨噬細胞成熟的方法以抑制或降低細胞激素的製造。此方法包含提供能夠降低DHS或eIF-5Al表現的藥劑。藉由降低或消除DHS的表現，將會降低或消除eIF-5Al 的活化。因為單核球分化及TNF-α分泌期間eIF-5Al受到向上調節，吾人相信此等事件必須發生。因此，藉由降低或消除eIF-5Al的活化或藉由直接降低或消除eIF-5Al的表現，可將單核球分化及TNF-o:分泌降低或消除。可使用任何能夠降低DHS或eIF-5Al表現的藥劑，包括（但不限於）本文中所述之反意義寡核苷酸或siRNAs。本發明人利用已知可預見製造細胞激素以回應特定刺激之細胞株於試管中研究eIF5Al藉由作用為核質運送細胞激 -素mRNAs促進細胞激素轉譯的能力。一些最近的研究已發現人類肝細胞藉由引發其他細胞激素的製造可反應細胞激素刺激。HepG2為已知對細胞激素敏感的已熟知人類肝細胞癌細胞株。反應IL-1/3，HepG2細胞以劑量相關的方式快速地製造TNF-ce mRNA及蛋白質（Frede等人，1996 ; Rowell等人，1997 ; Wordemann等人，1998)。因此，使用 HepG2細胞作為模型系統來研究TNF-α製造的調控。本發明人已證實在已以針對細胞凋亡因子5 A的反意義寡核苷酸轉染後於 91763.doc -31 - 200427695

HepG2細胞中eIF-5Al表現的抑制引起細胞製造較少 TNF-ce 〇本發明的一個具體實施例提供降低細胞中細胞激素量之方法。此方法包含給予細胞能夠降低細胞〉周亡因子5 A1表現的藥劑。降低細胞凋亡因子5A1的表現引起降低細胞激素的表現，因而導致由細胞製造的細胞激素量減少。細胞激素較佳為促炎性細胞激素，包括但不限於IL-1、IL-18、IL-6 及 TNF-o: 〇能夠降低細胞凋亡因子5A1表現的藥劑可能為具有與細胞凋亡因子5 A互補序列之反意義核苷酸。較佳的是，反意義核苷酸具有由SEQ ID NO:35、37、及39組成的族群選出之序列或為於高度嚴格條件下與由SEQ ID NO:35、37、及 3 9組成的族群選出之序列雜交之反意義核苷酸。此藥劑也可能包含具有與細胞凋亡因子5A互補序列之 siRNA。較佳的是，siRNA具有由 SEQ ID NO:30、31、32、及32組成的族群選出之序列或為於高度嚴格條件下與由 SEQ ID NO: 30、31、32、及32組成的族群選出之序列雜交之siRNA。圖65-67顯示以細胞凋亡因子5a siRNA轉染的細胞在暴露至喜樹鹼及TNF- α後具有較低進行細胞凋亡之細胞百分比。藥劑也可能包含反意義DHS核苷酸。本發明也針對聚核苷酸，其具有由SEQ ID ΝΟ:35、37、及39組成的族群選出之序列或為於高度嚴格條件下與由 SEQ ID ΝΟ:35、37、及39組成的族群選出之序列雜交之反意義核苦酸。 91763.doc -32- 200427695 本叙明也針對slRNA，其具有由SEq ID N〇:3〇、31、、及32組成的族群選出之序列或為於高度嚴格條件下與由 Q D NO.30、31、32、及32組成的族君_選出之序列雜交之 siRNA。本發明也針對降低p53表現的方法。此方法包含給予能夠降低細胞計因子从表現的藥劑，如上述之反意義聚核皆酉文或siRNA。降低細胞凋亡因子5A1表現降低p53的表現，如圖5 2及實例11中所示。本叙月也针對增加Bel-2表現的方法。此方法需要給予能夠降低細胞凋亡因子5 A表現的藥劑。較佳的試劑包括上述之反意義养核苷酸或siRNA。降低細胞凋亡因子5A1的表現增加Bel-2的表現，如圖63及實例13中所示。圖63顯示以細胞凋亡因子5a siRNA轉染的細胞產生較少細胞凋亡因子 5A1蛋白質，此外並且產生更多Bcl_2蛋白質。細胞凋亡因子5A1表現的降低與BCL-2表現的增加有關聯。本發明也提供降低TNF-α量於需要的病患之方法，包含給予該病患上述之反意義聚核苷酸或siRNA。如圖69及實例 14中所不，以本發明之反意義細胞凋亡因子5A轉染的細胞比未以此反意義寡核苷酸轉染的細胞在以IL_丨引發後產生較少TNF - α。本發明提供降低人類上皮細胞中TNF- α量之方法。如圖 74Α及Β及圖75及實例15中所示，降低或抑制eIF5A1的表現造成降低（若未完全抑制）人類上皮細胞株中TNF- α的製造。使用針對eIF5Al的siRNA來抑制eIF5Al的表現。此表現 91763.doc -33- 200427695 之抑制不僅降低或抑制TNF-α的製造，且也保護細胞免於細胞激素引發的細胞凋亡。藉由降低eIF5A1的表現，將 TNF_ «的製造減少。此雙重效果提供治療患有炎症性腸道疾病如克隆氏病及潰瘍性結腸炎（ulcerative c〇litis)病患之方法’其與由TNF- α引起增加的發炎有關。因此，本發明提供治療特徵為增加IL_i、TNF_ a、或IL-18量之病理疾病的方法，包含給予具有該病理疾病之哺乳類一藥劑以降低細胞凋亡因子5 A的表現。已知特徵為增加IL-1、ΤΝ；ρ·α、或IL-6量之病理疾病包括但不限於風濕性關節炎及骨關節炎、氣喘、過敏、動脈發炎、克隆氏病、炎症性腸道疾病（IBD，infiamma_ owel disease)、/貝瘍性結腸炎、冠心病、纖維囊腫（cyac 版叫、糖尿病、狼瘡、多發性硬化症、葛瑞夫兹氏病 (Graves dlsease)、牙周炎、青光眼及黃斑部退化、眼表疾病包括圓錐角膜、器官局部缺也_心臟、腎臟、再灌注損知' 敗血症、多發性骨髓瘤、器官移植排斥、牛皮癬及渴療0 …、如本文中使用，使用用詞「實質上序列-致」或「實併 :似」來指示一序列呈現實質結構或功能與另一序歹二二上序列—致或實質相似之序列間任何結構或將為微量；亦即，其將不會影響戈中指定的作用之能力、，田里心連用子使用的“ I兴可能由於例如不同物種間密碼田生不同。若於二或更多不同序列間有明顯旦、㈣次右不同序列呈現類似物理特徵即使序 91763.doc -34- 200427695 列不同於長度或結構，將結構差異視為微量。此特徵包括，例如，於界定的條件下雜交的能力，或於蛋白質的情：中: ，疫學上交又反應性、類似的酵素活性等。熟悉本技藝者可輪易地藉技藝已知的方法決定各此等特徵。此外，若序列具有至少約70%或以上，更佳8〇%或以上，再更佳約90%或以上，及最佳約95%或以上序列相似性於其間，兩核苦酸序列$「實質上互補」。若於多胜月太的活性二或功能上有意義的部分之間具有至少5〇%，較佳至少， ^佳至少8〇%，再更佳至少90%，最佳至少95%類似性，°兩胺基酸序列為實質上相似。為了決定兩序列之一致性比例，將序列排列作為最佳比較目的（如可將缺口導入第一及第二個胺基酸或核酸序列之一或二者中作為最適比對且可忽視不相似的序列作為比較目的）。於較佳的具體實施例中，將參考序列長度之至少 30%、4G%、5G%、6G%、7G%、嶋、或 9()%或以上排列作為比較目的。而後比較胺基酸基團或核苷酸於相對應胺基酉文位置或核苷酸位置。當第一個序列中的位置由第二個序列中相對應位置相同胺基酸基團或核苷酸佔據，則分子於該位置為相同（如本文中使用胺基酸或核酸「一致性」相當於胺基酸或核酸「相似性」）。兩序列間的一致性比例為序列共有的相同位置數目的函數，考慮缺口數目、及各缺口的長度，需要將其導入以做兩序列的最佳比對。序列之比較及兩序列間一致性比例及類似性之決定可利用數學演算法達成。（Computational Molecular Biology， 91763.doc -35- 200427695

Lesk，A.M·，編著 Oxford University Press，New York，1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects，Smith，D· W.，編著，Academic Press，New York，1993; Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，Α·Μ·，及 Griffin， H.G·，編著，Humana Press，New Jersey，1994; Sequence

Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G·，Academic Press, 1987;及 Sequence Analysis Primer, Gribskov，M·及 Devereux，J·，編著，M Stockton Press，New York，1991)。可將本發明之核酸及蛋白質序列進一步作為「詢問序列」以針對序列資料庫進行搜尋，例如，以辨識其他家族成員或相關序列。利用Altschul等人（1990)J· Mol. Biol. 215:403誦10之耶1^丁及又61^丁程式（2.0版）可進行此等搜尋。以NBLAST程式可進行BLAST核苷酸搜尋。以XBLAST 程式可進行BLAST蛋白質搜尋以得到相似於本發明蛋白質之胺基酸序列。為了得到作為比較目的之缺口比對，可使用缺口 BLAST，如說明於 Altschul 等人（1997)Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402。當利用 BLAST及缺口 BLAST程式，可使用各程式（如XBLAST及NBLAST)之隱含參數。本文中使用核酸之用詞「功能衍生物」來意指基因或核苷酸序列之同源物或類似物。功能衍生物可保留特定基因功能的至少一部份，允許其根據本發明運用。如本文中所述細胞凋亡因子5 A多胜肽的「功能衍生物」為保留細胞凋亡因子5 A活性或與針對細胞凋亡因子5 A抗體之免疫學交叉反應性之至少一部份之細胞凋亡因子5 A的片段、變體、類 91763.doc -36 - 200427695 似物、或化學衍生物。細胞凋亡因子5 a多胜肽的片段意指分子的任何子集合。功能變體也可包含類似胺基酸的置換造成功能上無變化或不顯著變化。對功能有重要性的胺基酸可由技藝中已知的方法辨β ’如定點突變（site-(jirecte(j mUtagenesis)或丙胺酸掃描突變（Cunningham等人（1989)Science 244:1081-1085)。後者程序導入單一丙胺酸突變於分子中的每個基團。而後測试形成的突變分子之生物活性如激酶活性或於如試管中增殖活性之分析法中。藉由結構分析如結晶、核磁共振或光親和性標記（Smith 等人（1992)J· Mol. Biol. 224:899-904; de V0S等人（1992)Science 255:3〇6_312)也可決定對於結合夥伴/受質結合關鍵的位置。「變體」意指實質上類似整個基因或其片段的分子，如核苷酸置換變體具有一或多個置換的核苷酸，但其保持與特疋基因雜交或編碼與天然DNA雜交的mRNA轉錄體的能力。同源物」意指來自不同動物屬或種類之片段或變體序列。「類似物」意指一非天然分子實質上類似或功能上相關於整個分子、其變體或片段。麦體胜肽包括自然發生的變體以及由技藝中已熟知的方法製造者。利用分子技術及揭示於本文中的序列資訊可輕易地將此變體辨認/製造。H，基於序列及/或結構相似性於本發明的elF-SA或DHS蛋自質，可將此變體輕易地與其他蛋白質區％。呈現的相似性/一致性程度將主要基於是否蛋白貝為功能變體或非功能變體、存在於同物種同源基因 91763.doc -37- 200427695 (Paralog)家族中相異量及異物種同源基因（Ortholog)間演化距離。利用重組技術可輕易地產生本發明之eIF-5A或DHS蛋白質的非自然發生的變體。此變體包括（但不限於）如蛋白質的胺基酸序列中之刪去、插入及置換。例如，一類置換為守恆胺基酸置換。此置換為由另一類似特性之胺基酸置換蛋白質中特定胺基酸者。典型可見為守恆置換者為於脂肪族胺基酸Ala，Val，Leu，及lie之間彼此取代；經基團Ser及Thr 之互換；酸基團Asp及Glu之交換；醯胺基團Asn及Gin之間的置換；驗基團Lys及Arg之交換；及芳香族基團Phe及Tyr 之間的取代。關於何種胺基酸改變可能為表現型無影響之指導見於Bowie等人，Science 247:1306-1310(1990)。如本文中使用的用詞「雜交」一般用來意指核酸於適當嚴格條件之雜交，如熟悉本技藝者視探針序列及目標序列的特性輕易地明白。雜交及清洗的條件為技藝中已熟知，條件的調整視理想的嚴格性藉由改變培養時間、溫度及/或溶液的離子強度輕易地達到。見，如Sambrook，J.等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2版，Cold Spring Harbour Press，Cold Spring Harbor，New York，1989 o 條件的選擇受被雜交的序列長度，特別是探針序列的長度、核酸的相對G-C含量及允許的錯配量而支配。當希望具有較少程度之互補的股間部分雜交，低嚴格條件為較佳。當希望完美或近乎完美互補，高嚴格條件為較佳。對於典型高嚴格條件，雜交溶液含有6xS.S.C.、0.01M EDTA、lx 91763.doc -38 - 200427695 登哈特溶液（Denhardt，s solution)及〇·5% SDS。將雜交於約 8 C對殖DNA的片段實施約3至4小時，對總真核dnA實施、力12至16小時。對於較低嚴格性，將雜交溫度降低至約 42C於雙股的熔點（Tm)以下。Tm已知為G_c含量及雙股強度以及溶液離子強度的函數。如本文中使用，片語與DNA或RNA分子之「相對應部分 ,、父」w 4日雜父如券核苦酸、聚核普酸、或任何核普酸序列（以有意義或反意義方向）之分子辨認及雜交至另一核酸刀子的序列’其為大約相同大小及與其具有足夠序列相似性以於適當條件下實行雜交。例如，1〇〇個核苷酸長有意義刀子將辨涊及雜父至核苷酸序列之大約丨⑽個核苷酸部刀，/、要兩序列間有約70%或以上之序列相似性。應了解「相對應邛分」的大小將允許一些雜交中的錯配，使得「相對應部分」可比與其雜交的分子小或大，例如更大或更小 20-30%，較佳不超過更大或更小12_15%。此外，多胜肽的功能變體也可包含類似胺基酸的置換，其造成功能上無變化或不顯著變化。對功能有重要性的胺基酸可由技藝中已知的方法辨認，如定點突變或丙胺酸掃描犬變（Cunningham等人，Science 244:1081-1085(1989))。後者程序導入單一丙胺酸突變於分子中的每個基團。而後測試形成的突變分子之生物活性或於分析法中。例如，細胞凋亡因子5八的類似物意指非天然蛋白質或模擬胜肽實質上類似於整個蛋白質或其片段。細胞凋亡因子 5A的化學衍生物含有正常不是胜肽或胜肽片段一部份之額 91763.doc -39- 200427695 外化學部分。藉由使胜肽的目標胺基酸基團與能夠與選定的側鏈或末端基團反應的有機衍生化試劑反應，可將修飾導入胜肽或其片段。應知本發明之核酸及多胜肽，在為了預防或治療用於動物時，將以另外含有醫藥上可接受的載體之組合物的形式給予。適當的醫藥上可接受的載體包括，例如，水、鹽水、磷酸緩衝的鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等之一或多種，以及其組合物。醫藥上可接受的載體可進一步包含少量辅助物質如濕潤或乳化劑、防腐劑或緩衝液，其增強耐儲時間或結合蛋白質的效力。如技藝中已熟知，可將注射的組合物配製以便在給予哺乳類後提供快速、持續或緩釋的活性成分。本土月的組合物可為不同之形式。此等包括，例如，固 =、、半固體及液體劑量形式’如藥片、藥丸、粉末、液體洛=、分散體或懸浮液、微脂粒、检劑、可注射及可灌注的各液。較佳的形式視預計的給予形式及治療運用而定。可將此組合物以醫藥技藝中已熟知的方式製備。組合物中，通常將活性成分與載體混合、或以載體稀釋、二或裝入載體内，其可於例如膠囊、小袋、紙或其他容器的形式中。當載體擔任稀釋劑，纟可為固體、半固體 :«材料，其作為活性成分的媒介、賦型劑或基質。因此， ’:。物可為藥片、錠劑、小袋、膠囊、藥水、懸浮液、煙 :峨固體或於液體基質中)、含有例如高達丨。重量%活：。物之油貧、軟及硬明勝缪囊、拾劑、注射溶液、懸浮 91763.doc -40- 200427695 液、無菌包裝的粉末及作為局部貼片。現已普遍地說明本發明，經由參照下列藉由舉例提供之實例將更佳輕易地了解上述說明。提出實例來幫助了解本發明但不預期，且不應理解為以任何方式限制其範圍。實例不包括習見方法的詳細說明。此類方法對普通熟悉本技藝者為已熟知且說明於許多文獻中。習見方法的詳細說明，如用於建立載體及質體的方法、插入編碼多胜肽的核酸進入此載體及質體、導入質體進入宿主細胞、及表現及決定基因及基因產物的方法，可自許多文獻得到，包括 Sambrook，J.等人，（1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版，Cold Spring Harbour Press。將本文中提到的所有參考資料以其全文併入本文中。【實施方式】實例1 由DNA梯形條帶檢視大鼠黃體中之細胞凋亡藉DNA梯形條帶決定細胞凋亡的程度。利用QIAamp DNA 血液試劑組（Qiagen)根據製造商的操作說明，將基因組DNA 自分散的黃體細胞或自切除的黃體組織分離。在藉由以 PGF_2〇!處理弓1發細胞凋亡前，引發細胞凋亡後1及24小時，將黃體組織切除。藉由於室溫培養500 ng DNA與0.2 pCi|>-32P]dCTP、1 mM Tris、0.5 mM EDTA、3單位克歹|J 諾夫（Klenow )酵素、及各0.2 pM 之 dATP、dGTP、及 dTTP 30 分鐘，將分離的DNA末端標記。根據Sambrook等人，藉由將樣品通過1 ml Sepadex G-50管柱將未併入的核苦酸移 91763.doc -41 - 200427695 除。而後將樣品藉Tris-醋酸鹽-EDTA(1.8%)膠體電泳解析。將膠體於室溫真空下乾燥30分鐘並於-8(TC曝光至χ_光底片 24小時。於一個實驗中，以PGF-2a注射後〇、1、或24小時檢視過度排卵的大鼠黃體中細胞凋亡的程度。於〇小時控制組中，將卵巢取出而無PGF-2a注射。反應伴隨細胞凋亡的核酸酶活性之低分子量DNA片段的梯形條帶於以PGF-20；處理前切除的控制組黃體組織中不明顯，但是在引發細胞凋亡後1小時内可識別，在引發細胞凋亡後24小時内顯著，將其示於圖16中。於此圖中，上圖為以32P_dCTP標記大鼠黃體細胞凋亡專一的DHS cDNA的3，-未轉譯區域為探針之北方墨點放射線照相。下圖為總RNA之溴化乙啶染色的膠體。各行含有10微克RNA。資料顯示血清取出後有eiF_5A轉錄體的向下調節。於另一實驗中，將相對應控制組動物以鹽水取代PGF-20；處理。以鹽水或PGF-2ce處理後十五分鐘，自動物取出黃體。在自動物取出組織後3小時及6小時時將基因組DNA自黃體分離。DNA梯形條帶及基因組DNA之增加的末端標記在自 PGF-20：處理的動物取出組織後6小時為明顯，但不在取出組織後3小時時。見圖π。當在以PGF-2a處理後15分鐘將黃體取出並於試管中條件下於EBSS(Gibc〇)中維持6小時5反映細胞〉周亡的DNA梯形條帶也為明顯。由基因組dna之更大里末ί%彳示s己也顯示伴隨細胞〉周亡的核酸酶活性。於另一實驗中，藉由皮下注射500微克PGF-2a引發過度排 91763.doc -42- 200427695 印。將控制組大等體積鹽水溶液處理。十五至三十分 4里後卵巢取出並以膠原蛋白酶切碎。將來自以PGF-2a處理的大机之为散的細胞於丨〇 mm麵胺酸醯胺+丨〇 mm亞精胺中培養1小日守及於10 mm麩胺酸醯胺無亞精胺中再5小時（第 2行）或於10 mm麵胺酸醯胺+ 1〇mm亞精胺中培養丨小時及於 10 mm麩胺醯胺+ 1〇 mm亞精胺中再5小時（第3行）。將來自以鹽水處理的大鼠之控制組細胞以膠原蛋白酶分散並培養丄小時並於僅有麩胺酸醯胺中再5小時（第ut)。將來自各樣品之五百奈克I^NA利用克列諾夫酵素以標記，分離於1.8%脂糖凝膠，及曝光至底片24小時。將結果示於圖 18中。於再另一實驗中’將過度排卵的大鼠皮下注射1毫克n〇〇克體重之亞精胺，以0.333毫克/100克體重之三等量給予， 24、12、及2小時之後皮下注射500微克PGF_2a。將控制組大鼠分成三組：無注射、三次注射亞精胺但無PGF-2a、及以三等體積鹽水注射之後PGF_2a處理。前列腺素處理後1小時及35分鐘或3小時及45分鐘，將卵巢自大鼠取出，並用來分離DNA。將來自各樣品之五百奈克DNA利用克列諾夫酵素以[a-32P]-dCTP標記’分離於1.8%脂糖凝膠，及曝光至底片24小時：第1行’無注射（將動物於相同於第3-5行之時間殺死），弟2行，二次注射亞精胺（將動物於相同於第3 _ 5行之時間殺死）；第3行，三次注射鹽水後注射PGF-2a(將動物於 PGF-2ce處理後1小時及35分鐘殺死）；第4行，三次注射亞精胺後注射PGF-2o:(將動物於PGF-2a:處理後1小時及35分鐘殺 91763.doc -43- 200427695 死）；第5行，三次注射亞精胺後注射PGF-2a(將動物於 PGF-2a處理後1小時及35分鐘殺死）；第6行，三次注射亞精胺後注射PGF-2a(將動物於PGF-2a處理後3小時及45分鐘殺死）；第7行，三次注射亞精胺後注射PGF-2ce(將動物於 PGF-20；處理後3小時及45分鐘殺死）。將結果示於圖19中。 RNA分離在PGF-2a引發細胞凋亡後不同時間自大鼠取出的黃體組織將總RNA分離。簡而言之，將組織（5克）於液態氮中研磨。將研磨粉末與30毫升脈（guanidinium)缓衝液（4M異硫氰酸胍、2.5 mM NaOAc pH 8.5、0·8% β-巯基乙醇）混合。將混合物通過四層Miracloth過濾、並於4°C l〇,〇〇〇g離心30分鐘。而後將上層清液經過氯化鉋密度梯度離心於ll，200g 20小時。將沉澱的RNA以75%乙醇清洗，重新懸浮於600毫升 DEPC處理的水中，RNA於-70°C以1.5毫升95%乙醇及60毫升 3M NaOAc沉殿。基因組DNA分離及梯形條帶利用QIAamp DNA血液試劑組（Qiagen)根據製造商的操作說明，將基因組DNA自切除的黃體組織或分散的黃體細胞分離。藉由於室溫培養500 ng DNA與0.2 pCi[a-32P]dCTP、1 mM Tris、0·5 mM EDTA、3單位克列諾夫酵素、及各0·2 pM 之dATP、dGTP、及dTTP 30分鐘，將DNA末端標記。根據 Maniatis等人說明的方法，藉由將樣品通過1 ml Sepadex G-50管柱將未併入的核苷酸移除。而後將樣品藉Tris-醋酸鹽-EDTA(2%)膠體電泳解析。將膠體於室溫真空下乾燥30 91763.doc -44- 200427695 分鐘並於-80°C曝光至χ-光底片24小時。質體DNA分離、DNA定序使用由Sambrook等人同上參考資料所述之驗溶裂 (Alkaline lysis)法來分離質體DNA。利用雙去氧定序法將全長正 cDNA純系定序。Sanger等人，Proc. Natl· Acad· Sci· USA，74:5463-5467。利用BLAST搜尋將開放讀碼區（open reading frame)收集及分析（GenBank，Bethesda，MD)並利用 BCM搜尋發射器：多重序列比對模式引發的多重比對方法 (見 F· Corpet，_ Nuc· Acids Res” 16:10881-10890，（1987))達到序列比對。將序列及序列比對示於圖5-11中。大鼠黃體RNA之北方墨點雜交將20毫克自不同細胞凋亡階段的大鼠黃體分離的總RNA 於1 %變性甲醛脂糖凝膠上分離並固定於尼龍膜上。使用以 32P-dCTP標記的全長大鼠細胞洞亡專一的eIF-5A cDNA(SEQ ID ΝΟ:1)利用隨機引子試劑組（Boehringer)來探測膜7xl〇7。或者，使用以32p_dCTP標記的全長大鼠細胞凋亡專一的DHS cDNA(SEQ ID NO:6)利用隨機引子試劑組 (Boehringer)來探測膜（7x107cpm)。將膜以 lxSSC，0.1% SDS 於室溫清洗一次，0.2xSSC，0.1% SDS於65°C洗三次。將膜乾燥30分鐘並於_70°C曝光至χ-光底片隔夜。如可見，於細胞凋亡的黃體組織中elF-5 A及DHS兩者皆受向上調節。藉由以PGF-2oj處理引發細胞凋亡後細胞凋亡專一的eIF_5A表現顯著增加--於時間零時低，處理1小時内相當多增加，於處理8小時内更加增加，及處理小時内猶微 91763.doc -45- 200427695 增加（圖14)。DHS的表現於時間零時低，處理1小時内相當多增加’於處理8小時内更加增加，及處理24小時内稍微增加（圖15)。利用基於酵母菌、黴菌及人類^?_5人序列之引子產生細胞调亡的大鼠黃體RT-PCR產物利用一對自酵母菌、黴菌及人類eiF-5A序列設計之寡核苷酸引子藉RT-PCR自細胞凋亡的大鼠黃體rnA模版產生相當於基因的3’端之部分長度細胞凋亡專一的eiF-5A序列 (SEQ ID ΝΟ:11)。用來分離大鼠eiF-5A基因的3,端之上游引子為20個核苷酸退化引子：5fTCSAARACHGGNAAGCAYGG 3，(SEQ ID NO:9)，其中S係選自C及G ; R係選自A及G ; Η係選自A、Τ、及C ; Υ係選自C及Τ ;及Ν為任意核酸。用來分離大鼠eIF-5A基因的3f端之下游引子含有42個核苷酸： 5OCGAAGCTTCCATGG CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’(SEQ ID NO:10)。實施反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR， reverse transcriptase polymerase chain reaction) 〇簡而言之，利用5毫克下游引子，將第一股cDNA合成。而後利用上游及下游引子兩者，使用第一股作為RT_PCR中的模版。於脂糖凝膠上分離RT-PCR產物顯示存在一 900 bp片段，將其利用鈍端連接次選殖進入pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems，LaJo 11a，C A)及定序（SEQ ID NO: 11)。3’端的cDNA序列為SEQIDNO:ll，3’端的胺基酸序列為SEQID NO:12。見圖 1-2。 91763.doc -46- 200427695 藉由RT-PCR自細胞凋亡的大鼠黃體RNA模版產生相對應基因的5’端且與3f端重疊的部分長度細胞凋亡專一的eIF-5A 序列（SEQ ID NO:15) 。 5’引子為具有序列 5，CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC 3’(SEQ ID NO:13)之 24聚體，其係由人類eIF-5 A序列設計而來。3’引子為具有序列 5，ATATCTCGAGCCTT GATTGCAACAGCTGCC 3，(SEQ ID NO:14)之30聚體，其係根據3’端RT_PCR片段而設計。實施反轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR，reverse transcriptase polymerase ghain reaction)。簡而言之，利用5毫克下游引子，將第一股cDNA合成。而後利用上游及下游引子兩者，使用第一股作為RT-PCR中的模版。於脂糖凝膠上分離RT-PCR產物顯示存在一 500 bp片段，將其利用分別存在於上游及下游引子中的Xbal及Xhol選殖位置次選歹直進入 pB lues crip tTM(Str at agene Cloning Systems， LaJolla，CA)，及定序（SEQ ID NO:15)。5’端的 cDNA序列為 SEQ ID NO: 15，5’端的胺基酸序列為SEQ ID NO:16。見圖2。大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之3’及5’端序列（分別為SEQ ID ΝΟ:11及SEQ ID NO:15)重疊及產生全長cDNA序列（SEQ ID NO: 1)。將此全長序列與基因庫中序列的資料庫比對及比較。見圖1-2。cDNA純系編碼154個胺基酸的多胜肽（SEQ ID NO:2)，其具有16·8 Kda之計算的分子量。將由RT-PCR得到的大鼠細胞凋亡專一的黃體eIF-5A基因之全長cDNA的核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)繪於圖3中，相對應得到的胺基酸序列為SEQ ID NO:9。將得到的eIF-5A之全長胺基酸序列與人類 91763.doc -47- 200427695 及小鼠eIF-5a序列比對。見圖7-9。利用基於人類DHS序列之引子產生細胞凋亡的大鼠黃體 RT-PCR產物利用一對自人類DHS序列設計之募核苷酸引子藉RT-PCR 自細胞凋亡的大鼠黃體RNA模版產生相當於基因的3’端之部分長度細胞凋亡專一的DHS序列（SEQ ID NO:6)。51丨子為具有序列 5’ GTCTGTGTATTATTGGGCCC 3’(SEQ ID NO:17)之20聚體；3’引子為具有序列 5’ GCGAAGCTTCCATGGC TCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3f(SEQ ID NO:18)之42聚體。實施反轉錄酶聚合酶鏈反應 (RT-PCR，reverse transcriptase polymerase chain reaction) 〇簡而言之，利用5毫克下游引子，將第一股cDNA合成。而後利用上游及下游引子兩者，使用第一股作為RT-PCR中的模版。於脂糖凝膠上分離RT-PCR產物顯示存在一 606 bp片段，將其利用純端連接次選殖進入pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)及定序（SEQ ID NO:6)。將由 RT-PCR得到的大鼠細胞凋亡專一的黃體DHS基因之部分長度cDNA的核苷酸序列（SEQ ID NO:6)繪於圖4中，相對應得到的胺基酸序列為SEQ ID NO:7。基因組DNA的分離及南方分析自切除的大鼠卵巢將做南方墨點的基因組DNA分離。將大約100毫克卵巢組織分成小塊並置入15毫升試管内。將組織藉輕柔搖動組織懸浮液及而後利用吸管移去PBS以1毫升 91763.doc -48- 200427695 PBS清洗兩次。將組織重新懸浮於2.06毫升DNA緩衝液（0.2 M Tris-HCl pH 8.0及 0_1 mM EDTA)及加入 240微升 1〇% SDS 及 100微升蛋白酶K(Boehringer Manheim; 10 mg/ml)。將組織置於搖動的45°C水浴中隔夜。第二天將另外100微升蛋白酶K(10 mg/ml)加入並將組織懸浮液於45°C水浴中再培養4 小時。培養後將組織懸浮液以等體積酚：氯仿··異戊醇（25 : 24: 1)萃取一次及以等體積氯仿：異戊醇（24: 1)萃取一次。萃取後，將1/10體積之3M醋酸鈉（pH 5.2)及2倍體積乙醇加入。使用利用本生燈密封及形成鉤狀的玻璃吸管來拉DNA 絲出溶液及轉移DNA進入乾淨微量離心管内。將DNA於70% 乙醇中清洗一次及風乾10分鐘。將DNA沉澱溶解於5〇〇微升 10 mM Tris-HCl(pH 8·0)，將 10 微升 RNase A(l〇 mg/ml)加入，並將DNA於37°C培養1小時。將DNA以酚：氯仿：異戊醇（25 ·· 24 : 1)萃取一次，藉由加入1/10體積之3M醋酸鈉（PH 5.2)及2倍體積乙醇將DNA沉澱。於4°C 13,000xg離心1〇分鐘將DNA沉澱。將DNA沉澱於70%乙醇中清洗一次並藉旋轉 DNA於4°C 隔夜溶解於200微升 10 mM Tris-HCl(pH 8·〇)中。為了南方墨點分析，以於内生基因中不切割或僅切割一次之不同限制酶消化自大鼠卵巢分離的基因組DNA。為了達到此，將10微克基因組DNA、20微升10Χ反應緩衝浪及100 U限制酶於200微升總反應體積中反應五至六小時。將消化的DNA入料至0.7%脂糖凝膠上並經過6小時於40伏特或於 15伏特隔夜之電泳。電泳後，將膠體於0.2 N HC1中1〇分鐘去嘌呤化接著兩次15分鐘於變性溶液（〇·5 M NaOH，I·5 Μ 91763.doc -49- 200427695

NaCl)中清洗及兩次15分鐘於中和緩衝液（1.5 M NaCl，0.5 M Tds-HCl pH 7.4)清洗。將DNA轉移至尼龍膜，並將膜於雜交溶液（40%甲醯胺，6xSSC，5x鄧哈特（Denharfs))溶液（1 X鄧哈特溶液為0.02%葡聚糖（Ficoll)，0.02% PVP，及0_02% BSA)、0.5% SDS，及1.5毫克變性鮭魚精子DNA )中預先雜交。將大鼠 eIF-5AcDNA之 3’ UTR 之 700 bp PCR 片段（650 bp 之3f UTR及50 bp之編碼）藉隨機引發以〇-32P]-dCTP標記並以 1x106 cpm/ml力口至膜。類似地，將大鼠DHS cDNA之606 bp PCR片段（450 bp編碼及156 bp 3，UTR)以〇-32P]_dCTP隨機引發標記並以1x106 cpm/ml加至第二個相同的膜。將墨點於42°C雜交隔夜及而後以2\38€及0.1%3〇3於42。(：清洗兩次及以1父33(：及0.1% 8〇8於42它清洗兩次。而後將墨點曝光至底片3-10天。

如圖20上指示，將大鼠體基因組DNA限制酶切割並以 32P-dCTP-標記的全長eIF-5A cDNA偵測。於高嚴格條件下雜交顯示全長cDNA探針對各限制酶消化的DNA樣品之數個限制片段雜交，代表eIF-5A之數種異構體的存在。其中特別要注意的是，當將大鼠基因組DNA以EcoRV消化時，其於細胞凋亡專一的eIF-5 A之開放讀碼區内具有一個限制酶切割位置，於南方墨點中偵測到eIF-5A之細胞凋亡專一的異構體之兩個限制片段。於圖20中將兩片段以雙箭頭指出。相當於eIF-5A之細胞凋亡專一的異構體之限制片段於標示 EcoRl及BamHl的行中以單箭頭指出，此二限制酶於開放讀碼區内沒有切割位置。此等結果暗示細胞凋亡專一的eIF-5 A 91763.doc -50- 200427695 於大鼠中為單一備份基因。如圖5至13中所示，eIF-5 A基因於不同物種間為高度守恆，且因此預期於任何物種内的異構體之間有顯著量之守恆。圖21顯示大鼠基因組DNA以32P-dCTP-標記的部分長度大鼠黃體細胞凋亡專一的DHS cDNA偵測的南方墨點。將基因組以EcoRV切割作為探針，此限制酶不切割部分長度 cDNA。明顯有兩個限制片段代表基因有兩個備分或基因含有具有EcoRV位置之内含子。實例2 本實例說明以細胞凋亡因子5A及DHS調控細胞凋亡。 COS-7細胞的培養及RNA的分離使用COS_7(以編碼野生型T抗原之突變SV40轉化的非洲綠狼腎纖維狀細胞株）於所有轉染為基本的實驗。將C Ο S - 7 細胞培養於具有0.5 84克/升L-麩胺酸醯胺、4.5克葡萄糖/ 升、及 0.37%石炭酸氫納之 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium )培養基中。將培養基補充10%胎牛血清（FBS，fetal bovine serum)及100單位青黴素/鏈黴素。將細胞生長於37 °C於5% C02及95%空氣之潮濕環境。每3至4天藉以0.25%胰蛋白及1 mM EDTA之溶液脫離黏著的細胞，將細胞次培養。將脫離的細胞以1 : 10之分開比例分配於具有新鮮培養基的新培養中。將要用來分離RNA的COS-7細胞生長於150-mm組織培養處理皿（Corning)中。藉以胰蛋白-EDTA之溶液脫離之而收集細胞。將脫離的細胞收集於離心管中，將細胞於3〇〇〇 rpm 91763.doc -51 - 200427695 離心5分鐘沉澱。將上層清液移除，將細胞沉澱於液態氮中急速冷凍。利用GenElute哺乳類總RNA小量製備套組 (Sigma)根據製造商的使用說明，自冷凍的細胞分離rnA。重組質體的建造及COS-7細胞的轉染利用說明於圖21中之哺乳類抗原決定位標示（epitope tag) 表現載體-pHM6(Roche Molecular Biochemicals)，建造帶有大鼠細胞凋亡eIF-5A之全長編碼序列以有意義方向及大鼠細胞凋亡 eIF-5A之3’-未轉譯區域（UTR，untranslated region) 以反意義方向之重組質體。載體含有下列：CMV啟動子-人類巨細胞病毒極早期啟動子/促進子；HA-來自流行性感冒血球凝集素之九肽抗原決定位標示；BGHpA-牛生長贺爾蒙多腺苷信號；flori-fl起點；SV40ori-SV40早期啟動子及起點；新黴素·耐新黴素（G418)基因；SV40pA-SV40多腺苷信號；Col El-ColEl起點；安比西林（Ampicillin)-耐安比西林基因。由pBluescript中原始大鼠eIF-5 A RT-PCR片段（SEQ ID NO: 1)藉PCR放大大鼠細胞凋亡eIF-5A之全長編碼序列及大鼠細胞凋亡eIF-5A之3’ UTR。為了放大全長eIF_5A，使用的引子為如下列：正向 5’ GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG 3f(SEQ ID NO:59) (Hind3)及反向 5’ CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG 3，(SEQ ID NO:60)(EcoRl)。為了放大 3, UTR大鼠eIF-5A，使用的引子為如下列：正向5’ AAT GAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC 3，(SEQ ID NO:61) (EcoRl)及反向 5’ GCGAAGCTTCCATGGCTCGAG ΤττττΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΊΤΤΤΤ 3，（SEQ ID NO:62)(Hind3)。 91763.doc -52- 200427695 在脂糖凝膠電泳後分離的全長大鼠eiF-5 A PCR產物為長度430 bp而3’ UTR大鼠eiF-5A PCR產物為長度697 bp。將兩個PCR產物皆次選殖進入phM6的Hind3及EcoRl位置以建立pHM6-全長eiF-5A及pHM6-反意義3, UTR eIF_5A。將全長大鼠eIF-5 A PCR產物次選殖於具有來自流行性感冒血球凝集素（HA，hemagglutinin)存在於多重選殖位置的上游之九肽抗原決定位標示的區域中以允許利用抗_[HA]_過氧化酶抗體偵測重組蛋白質。藉人類巨細胞病毒極早期啟動子/促進子驅動表現以確保於哺乳類細胞株中的高量表現。質體也具有耐新黴素（G418)基因，其允許選擇穩定轉染的細胞，及SV40早期啟動子及起點，其允許於細胞表現SV40大T抗原，如COS-7中之游離型複製。將要用於轉染實驗中的COS-7細胞培養於24孔細胞培養盤（Corning)作為用於蛋白質萃取用之細胞，或4腔培養玻片 (Falcon)作為用於染色的細胞。將細胞生長於補充i〇%FBS 但缺少青黴素/鏈黴素之DMEM培養基中至50至70%緻密度 (confluency)。藉由稀釋0.32微克質體DNA於42.5微升無血清DMEM及於室溫培養混合物15分鐘，將24孔盤之一孔或培養玻片足夠之轉染培養基製備。將1.6微升轉染試劑 (LipofectAMINE(Gibco，BRL))稀釋於 42.5 微升無血清 DMEM及於室溫培養5分鐘。5分鐘後將LipofectAMINE混合物加至DNA混合物並一起於室溫培養30至60分鐘。將欲轉染的細胞以無血清DMEM清洗一次之後舖上轉染培養基並將細胞放回生長室4小時。 91763.doc -53- 200427695 培養後，將0.17毫升DMEM+20% FBS加至細胞。將細胞再培養40小時之後引發進行細胞凋亡之後染色或收集做西方墨點分析。作為控制組，也進行模擬轉染，其中將質體 DNA自轉染培養基中省略。蛋白質萃取及西方墨點藉由於PBS(8 g/L NaCl，0·2 g/L KC1，1.44 g/L Na2HP045 及0_24 g/L KH2P〇4)中清洗細胞兩次及而後加入150微升熱 SDS 膠體-填入緩衝液（50 mM Tris-HCl pH 6.8，100 mM 二硫秀克糖醇Cdithiothreitol)、2% SDS、0.1%溴酚藍，及 10% 甘油）自轉染的細胞分離西方墨點用的蛋白質。將細胞溶解物收集於微量離心管中，於95 °C加熱10分鐘，及而後於 13,000xg離心10分鐘。將上層清液轉移至新鮮微量離心管中並於-20°C儲存直到預備使用。為了西方墨點，將2.5或5微克總蛋白質分離於12% SDS-聚丙烯醯胺膠體上。將分離的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜。而後將膜於阻斷液（blocking solution)(5%脫脂奶粉， 0.02%疊氮化鈉於PBS中）中培養一小時並於 PBS-T(PBS + 0.05% Tween-20)中清洗15分鐘三次。將膜於 PBS-T中於4〇C儲存隔夜。第二天回溫至室溫後，將膜於1 微克/毫升聚乙烯醇中阻斷30秒。將膜於去離子水中清洗5 次及而後於5%牛奶於PBS之溶液中阻斷30分鐘。將初級抗體於5%牛奶於PBS之溶液中預先培養30分鐘之後與膜培養。使用數種初級抗體。使用以1 : 5000稀釋之抗-[HA]-過氧 91763.doc -54- 200427695 化酶抗體（Roche Molecular Biochemicals)來债測重組蛋白質之表現。因為此抗體聯結至過氧化酶，不需二級抗體，將墨點清洗並由化學冷光顯影。使用的其他初級抗體為來自 Oncogene辨識 p53(Ab-6)、Bcl-2(Ab-l)、及 c-Myc(Ab-2) 之單株抗體。以0.1微克/毫升之稀釋使用對p53之單株抗體，而以0.83微克/毫升之稀釋使用對Bcl-2及c-Myc之單株抗體兩者。與初級抗體培養60至90分鐘後，將膜於pBs_T中清洗15分鐘三次。而後將二級抗體稀釋於PBS中之1%牛奶中並與膜培養60至90分鐘。當使用p53(Ab-6)作為初級抗體，使用的二級抗體為1 : 1000稀釋之羊-抗小鼠IgG聯結至鹼性磷酸酶（Rockland)。當使用 Bcl-2(Ab-l)& c_Myc(Ab_2) 作為初級抗體，以1 : 5000之稀釋使用兔-抗小鼠IgG聯結至過氧化酶（Sigma)。與二級抗體培養後，將膜於pbs_t中清洗三次。使用兩種偵測方法來顯影墨點，色度法及化學冷光法。色度法僅當使用p53(Ab-6)作為初級抗體並與鹼性磷酸酶聯結的二級抗體結合時才使用。藉由於黑暗中培養墨點於〇.33 毫克/毫升氮藍四銼（nitro blue tetrazolium)、0.165毫克/毫升 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽、1〇〇 mM NaCl、5 mM MgCl2、及 10〇1111^丁148-11(31(卩119.5)之溶液顯現結合的抗體。顏色反應由培養墨點於2 mM EDTA於PBS中而停止。使用化學冷光偵測法於所有其他初級抗體，包括抗-[HA]-過氧化酶、 Bcl-2(Ab-l)、及c-Myc(Ab_2)。使用ECL加西方墨點偵測套組（Amersham Pharmacia Biotech)來偵測過氧化酶聯結的結 91763.doc -55- 200427695 合抗體。簡而言之，將膜輕輕地吸乾及而後於黑暗中以4〇 ·· 1混合之试劑A及試劑B培養5分鐘。將膜吸乾，置於醋酸膜之間，及曝光至X光底片1〇秒至1〇分鐘之不同時間期間。引發COS 7細胞中的細胞〉周亡使用兩種方法來引發轉染的cos_7細胞中的細胞凋亡，去除血清及以放線菌素（Actin〇niycin D)處理，放射菌 (Streptomyces sp)(Calbi〇chem)。為了兩種處理，轉染後40 小時將培養基移除。對於血清飢餓實驗，將培養基以無血清及抗生素PMEM取代。使用生長於無抗生素dmeM補充 10%FBS的細胞作為控制組。對於放線菌素引發細胞凋亡，將培養基以無抗生素DMEM補充10% FBS及1微克/毫升放線菌素溶解於甲醇取代。控制組細胞係生長於於無抗生素 DMEM補充10% FBS及等體積甲醇中。對於兩種方法，細胞洞亡細胞的百分比皆於48小時後藉H〇escht或Annexin V-Cy3染色而決定。細胞凋亡的引發也由北方墨點分析確認’如圖22中所示。

Hoescht 染色使用核染色Hoescht來標示轉染的C0S-7細胞之細胞核以便基於形恶學特徵如核碎裂及聚集確認細胞〉周亡的細胞。將由3 : 1混合物之絕對曱醇及冰醋酸組成的固定劑於使用前新鮮製備。將等體積固定劑加至生長於培養玻片上的 COS-7細胞的培養基並培養2分鐘。自細胞取出培養基/固定劑混合物並丟棄，將1毫升固定劑加至細胞。5分鐘後將固定劑丟棄，將1毫升新鮮固定劑加至細胞並培養5分鐘。將 91763.doc -56- 200427695 固定劑丟棄’將細胞風乾4分鐘之後，加入1毫升Hoescht染色劑（0.5微克/毫升Hoescht 33258於PBS)。於黑暗中培養10 分鐘後’將染色溶液丟棄並將玻片以去離子水清洗1分鐘孓次。清洗後’將1毫升麥吉爾維恩緩衝液（Mcllvaine’s buffer)(0.021 Μ檸檬酸，〇·〇58 M Na2HP04.7H20;pH 5.6)加至細胞，將其於黑暗中培養20分鐘。將緩衝液丟棄，將細胞於黑暗中風乾5分鐘並將分開培養玻片孔的室移開。將數滴螢光用Vectashield封片膠（Vector Laboratories)加至玻片並以蓋玻片覆蓋。將染色的細胞於利用UV濾光鏡的螢光顯微鏡下觀看。將具有明亮染色或碎裂的核之細胞記為細胞凋亡。

Annexin V-Cy3 染色使用Annexin V-Cy3細胞凋亡偵測套組（Sigma)來螢光標記細胞凋亡的細胞上外表化的磷脂醯絲胺酸。根據製造商的步驟及下列修改使用套組。簡而言之，將生長於四腔培養玻片上的轉染COS-7細胞以PBS清洗兩次及以lx結合緩衝液清洗三次。將150微升染色溶液（1微克/毫升AnnCy3於 1X結合緩衝液）加入，將細胞於黑暗中培養丨〇分鐘。而後將染色溶液去除，將細胞以1X結合緩衝液清洗5次。將腔壁自培養玻片取出，並將數滴1X結合緩衝液置於細胞上並以蓋玻片覆蓋。將染色的細胞藉利用綠色濾光鏡的螢光顯微鏡觀看正染色（細胞凋亡）細胞之紅色螢光。藉於可見光下計算細胞數量決定全部細胞總數。實例3 91763.doc -57- 200427695 本實例說明以細胞凋亡因子5 A及DHS調控細胞凋亡。利用前述實例中說明的一般程序及方法，圖23為一流程圖說明瞬間轉染C〇S-7細胞之程序，其中將於無血清培養基中的細胞培養於質體DNA中於lipofectAMINE 4小時，將血清加入’並將細胞再培養4〇小時。而後將細胞培養於含有血清之正常培養基中再48小時後再分析（即無進一步處理）、去除血清48小時以引發細胞凋亡之後再分析、或以放線菌素D處理48小時以引發細胞凋亡之後再分析。圖22為一西方墨點，說明以pHM6轉染後於C0S-7細胞中外來蛋白質的瞬間表現。在模擬轉染、或以pHM6_LacZ、 pHM6-反意義3’ rF5A(pHM6-反意義3’ UTR大鼠細胞凋亡 eIF-5A)、或pHM6-有意義rF5A(pHM6_全長大鼠細胞凋亡 eIF-5A)轉染後48小時自c〇S-7細胞分離蛋白質。將來自各樣品之五微克蛋白質藉SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜，以抗-[HA]-過氧化酶做西方墨點。藉化學冷光偵測結合的抗體並曝光至Χ-光底片30秒。LacZ(第2行）及有意義大鼠細胞凋亡eIF_5A(第4行）之表現為清楚可見。如上述’將COS-7細胞模擬轉染或以pHM6-有意義 rF5A(pHM6-全長大鼠eiF-5A)轉染。轉染後四十個小時，藉由撤除血清48小時引發細胞進行細胞凋亡。利用螢光量測同質半脱天門冬胺酸蛋白酶分析套組（Roche Diagnostics)測量轉染細胞萃取中半胱天門冬胺酸蛋白酶蛋白質分解的活性。利用FragEL DNA斷裂細胞〉周亡债測套組（Oncogene)也測量DNA斷裂，其以螢光素標記的去氧核苷酸標示DNA片 91763.doc -58- 200427695 段露出的3’-〇H端。將其他COS-7細胞模擬轉染或以pHM6-有意義 rF5A(pHM6-全長大鼠eIF-5A)轉染。轉染後四十個小時，將細胞生長於含有血清之正常培養基中再48小時（無進一步處理）、藉撤除血清48小時以引發進行細胞凋亡或藉0.5微克/ 毫升放線菌素處理48小時以引發進行細胞凋亡。將細胞以 Hoescht 33258染色，其描述伴隨細胞凋亡之核碎裂，或以 Annexin V-Cy3染色，其描述伴隨細胞凋亡之磷脂醯絲胺酸暴露。藉由利用綠色濾光鏡的螢光顯微鏡也觀看染色的細胞並計數以決定進行細胞凋亡的細胞百分比。於可見光下計算全部細胞總數。圖25說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的半胱天門冬胺酸蛋白酶活性反映增加的細胞〉周亡。大鼠細胞凋亡引發的eIF-5A之表現造成半胱天門冬胺酸蛋白酶活性增加 60%。圖26說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的DNA碎裂反映增加的細胞凋亡。大鼠細胞凋亡引發的eIF-5A之表現造成DNA碎裂增加273%。圖27說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的細胞核碎裂反映細胞凋亡的偵測。於表現大鼠細胞凋亡引發的elF-5 A之細胞中有較大碎裂細胞核之發生率。圖28說明當將C0S-7細胞以含有意義方向之全長大鼠 91763.doc -59- 200427695 細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的細胞核碎裂反映增加的細胞凋亡。大鼠細胞凋亡引發的elF-5A之表現造成無血清飢餓的及血清飢餓的樣品中超過控制組分別 27%及63%增加細胞核碎裂。圖29說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由磷脂醯絲胺酸露出反映細胞凋亡的偵測。圖30說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的elF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的磷脂醯絲胺酸露出反映增加的細胞凋亡。大鼠細胞凋亡引發的eIF-5 A之表現造成無血清仇餓的及血清叙餓的樣品中超過控制組分別140%及198%增加磷脂醯絲胺酸露出。圖31說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的細胞核碎裂反映增加的細胞凋亡。大鼠細胞凋亡引發的eIF-5A之表現造成未處理及經處理樣品中超過控制組分別115%及62%增加細胞核碎裂。圖32說明於將以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染的COS-7細胞未給予進一步處理及給予引發細胞凋亡處理的條件下增加的細胞〉周亡之比較。實例4 本實例說明給予細胞凋亡因子5 A及DHS後調控細胞凋亡的活性。將COS-7細胞模擬轉染、以pHM6-LacZ轉染或以pHM6-有 91763.doc -60- 200427695 意義rF5A(pHM6-全長大鼠eIF-5A)轉染及培養40小時。將來自各樣品之五微克蛋白質萃取樣品藉SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜，及以辨識Bcl-2的單株抗體做西方墨點。使用兔 -抗小鼠IgG聯結至過氧化酶作為二級抗體，藉化學冷光偵測結合的抗體並曝光至X-光底片。將結果示於圖32中。在以 pHM6-有意義rF5A轉染的細胞中比以pHM6-LacZ轉染者可偵測到較少Bcl-2 ;所以Bcl-2為向下調節。將其他COS-7細胞模擬轉染、以pHM6_反意義1 rF5A(pHM6-大鼠細胞凋亡eIF-5A之反意義3’ UTR)或以 pHM6-有意義rF5A(pHM6-全長大鼠細胞凋亡eIF-5A)轉染。轉染後四十個小時，將細胞藉撤除血清48小時以引發進行細胞凋亡。將來自各樣品之五微克蛋白質萃取樣品藉 SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜，及以辨識Bcl-2的單株抗體做西方墨點。使用兔-抗小鼠IgG聯結至過氧化酶作為二級抗體，藉化學冷光偵測結合的抗體並曝光至X-光底片。同樣另外地，將COS-7細胞模擬轉染、以pHM6-LacZ轉染或以pHM6-有意義rF5A(pHM6-全長大鼠eIF-5A)轉染及培養40小時。將來自各樣品之五微克蛋白質萃取樣品藉 SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜，及以辨識p53的單株抗體做西方墨點。使用羊-抗小鼠IgG聯結至鹼性磷酸酶作為二級抗體，藉色度偵測結合的抗體。

最後，將COS-7細胞模擬轉染、以pHM6-LacZ轉染或以 pHM6-有意義rF5A(pHM6-全長大鼠eIF-5A)轉染及培養40 小時。將來自各樣品之五微克蛋白質萃取樣品藉SDS-PAGE 91763.doc -61 - 200427695 分離，轉移至PVDF膜，及以辨識p53的單株抗體偵測。以抗-[HA]過氧化酶將相對應的蛋白質墨點偵測以決定大鼠細胞凋亡專一的eIF-5 A表現之程度。使用羊-抗小鼠IgG聯結至鹼性磷酸酶作為二級抗體，藉化學冷光偵測結合的抗體。圖33說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡引發的eIF-5 A之pHM6瞬間轉染時Bcl-2的向下調節。上圖說明考馬斯藍（Coomassie Blue)染色的蛋白質墨點；下圖說明相對應的西方墨點。在以pHM6-有意義rF5A 轉染的細胞中比以pHM6-LacZ轉染者可偵測到較少Bcl-2。圖34說明當將COS_7細胞以含反意義方向之全長大鼠細胞凋亡引發的eIF-5 A之pHM6瞬間轉染時Bcl-2的向上調節。上圖說明考馬斯藍染色的蛋白質墨點；下圖說明相對應的西方墨點。在以pHM6-反意義3’ rF5A轉染的細胞中比模擬轉染或以pHM6-有意義rF5A轉染者可偵測到更多 Bcl-2。圖35說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡引發的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時c-Myc的向上調節。上圖說明考馬斯藍染色的蛋白質墨點；下圖說明相對應的西方墨點。在以pHM6-有意義rF5A轉染的細胞中比以 pHM6-LacZ轉染或模擬控制組者可偵測到更多c-Myc。圖36說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡引發的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時p53的向上調節。上圖說明考馬斯藍染色的蛋白質墨點；下圖說明相對應的西方墨點。在以pHM6-有意義rF5A轉染的細胞中比以 91763.doc -62- 200427695 PHM6-LacZ轉染或模擬控制組者可偵測到更多p53。圖37說明於COS-7細胞中p53的向上調節有賴於phm6-全長大鼠細胞凋亡引發的elF-5A之表現。以抗-[HA]-過氧化酶偵測之西方墨點中，上圖說明考馬斯藍染色的蛋白質墨點，而下圖說明相對應的西方墨點。於第一個轉染中比第一個轉染中可偵測到更多大鼠細胞〉周亡引發的eIF-5A。以抗 -[HA]-過氧化酶偵測之西方墨點中，上圖a中說明相對應的考馬斯藍染色的蛋白質墨點及下圖說明以p53之西方墨點。對於第一個轉染，在以PHM6-有意義rF5A轉染的細胞中比以pHM6-LacZ轉染或模擬控制組者可债測到更多 p53。對於第二個轉染，其中大鼠細胞凋亡引發的a有較少表現，於以pHM6-有意義rF5A、pHM6_LacZ或模擬控制組轉染的細胞之間p 5 3量沒有可彳貞測的差異。實例5 圖47描述於心臟組織上進行的實驗以模擬人類心臟之跳動及隨後引發的心臟病猝發（heart attack)。圖49顯示實驗桌裝備。將心瓣更換手術期間取出的一片人類心臟組織鉤在電極上。將小砝碼連接至心臟組織以緩和測量心臟跳動的力量。電極提供電刺激以使組織開始跳動。在局部缺血引發前，測量心臟組織中細胞凋亡專一的elF-5A(eIF5a)及增殖eIF-5A(eIF5b)兩者之基因表現量。見圖46。於局部缺血前的心臟組織中，產生低量之eIF5a及eIF5b，且其量為相對平衡。於此時期間，將氧及二氧化碳分別以92.5%及7.5%於緩衝液中傳遞至心臟。之後，將氧濃度降低及將氮含量增 91763.doc -63- 200427695 加，以引發局部缺血及最終「心臟病猝發」。心臟組織停止、動而後將氧濃度回復正常，以電刺激使心臟組織再度脈衝以再次開始心臟跳動。在「心臟病猝發」後，再度測罝細胞凋亡專一的eIF_5a及增殖eIF-5A(eIF5b)之表現量。此 τ 、’、田胞凋亡專一的eIF_5A量之表現量有顯著增加，而增殖 elF 5A(eIF5b)之表現量增加顯著地較少。見圖46。「心臟病猝發」後，心臟跳動不若以往強烈，如藉連接的石去碼之較小|縮/移動指示，因此代表心臟組織細胞由於洞亡專一的eIF巧A之存在而被快速地殺死。將EKG結果描述於圖48中。圖的右側顯示正常心臟跳動 (局部缺血前的心臟組織）。「心臟病猝發」（直線）後，及心臟跳動之再次開始，EKG顯示由於肌肉細胞死亡降低的活性。EKG顯示心臟跳動力量之相對損失。實例6 ··人類細胞株培養條件人類視神經底盤（lamina cribr〇sa)及星細胞培養成對的人類眼睛係於死後48小時内得自加拿大眼睛銀行安大略分行。將視神經盤（具有連接的軸極）取出並置於 DMEM補充抗生素/抗黴素、麩胺酸醯胺、及1〇%FBS之培養基中3小日$。視神經盤（〇nh，optic nerve head)姐係由各組織樣品取回並以精細的解剖剪刀切碎成四小片。將外植片體培養於12.5平方公分塑膠培養皿中於〇μεΜ培養基中。於能生長的外植片體於一個月内看到生長。一旦細胞達到9〇%高緻密度（confluence)，將其胰蛋白消化及經過區分次培養以產生人類視神經底盤（LCJaxnina cribrosa)及星細胞族群。明 91763.doc -64- 200427695 確而言，將LC細胞次培養於25平方培養孤中於補充慶大黴素（gentamycin)、麩胺酸驢胺、及10%FBS之DMEM培養基中，而使星細胞發展於25平方培養皿中不含FBS之EBM完全培養基（Clonetics)。次培養10天後將FBS加至星細胞培養。如按照此程序將細胞保持及次培養。利用差別螢光抗體染色於8孔培養玻片上將由區分次培養得到的細胞族群定性及確認族群純度。將細胞固定於1 〇% 福馬林溶液中並以杜貝可磷酸緩衝鹽水（DPBS，Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)清洗三次。在以2%脫脂牛奶於 DPBS中阻斷後，將抗體稀釋於1%BSA於DPBS中並施加至其中6孔之細胞中。將剩餘兩孔僅以1%牛血清白蛋白（BSA， bovine serum albumin)溶液及無初級抗體處理作為控制組。將細胞與初級抗體於室溫培養一小時，而後以DPBS清洗三次。將適當二級抗體稀釋於1%BSA於DPBS中，加至各孔，及培養1小時。以DPBS清洗後，將分開培養玻片孔的室自玻片移開，並將玻片浸入二次蒸餾水中，而後使之風乾。將螢光用封片膠（Vector Laboratories)加至各玻片並以22x60 mm蓋玻片覆蓋。將免疫螢光染色於具有適當濾光鏡的螢光顯微鏡下觀看並與未以初級抗體處理的控制組孔比較。除非另外說明，所有的初級抗體皆購自Sigma。所有的二級抗體皆購自 Molecular Probes。用來嫁認LC細胞的初級抗體為：抗-膠原蛋白I、抗-膠原蛋白IV、抗-層黏蛋白（Laminin)、抗-細胞纖維結合素結合蛋白（fibronectin)。用來確認星細胞的初級抗 91763.doc -65- 200427695 體為··抗-半乳糖腦苷月旨（galactocerebroside)(Chemicon International)、抗-A2B5(Chemicon International)、抗-NCAM、抗-人類溫韋伯氏因子（Von willebrand Factor)。用於兩種細胞族群之其他抗體包括抗-膠質纖維（GFAP，glial fibrillary) 及抗· α -平滑肌肌動蛋白。若其對膠原蛋白I、膠原蛋白IV、層黏蛋白、細胞纖維結合素結合蛋白、α -平滑肌肌動蛋白正染色而對膠質纖維（GFAP，glial fibrillary)為負，則將細胞族群決定為由LC細胞組成。若其對NCAM、膠質纖維（GFAP， glial fibrillary)正染色而半乳糖腦苷脂、A2B5、人類溫韋伯氏因子、及抗-α -平滑肌肌動蛋白為負，則將細胞族群決定為由星細胞組成。於此預備的研究中，使用三組人類眼睛以開始培養。分別由83歲男性、17歲男性、及26歲女性之視神經盤建立LC 細胞株#506、#517、及#524。所有的LC細胞株皆已完全定性及發現含有大於90% LC細胞。 RKO細胞培養 RKO(American Type Culture Collection CRL-2577)，為一種表現野生型p53之人類結腸癌細胞株，用它來測試反意義募核苷酸抑制eIF5Al蛋白質表現之能力。將RKO培養於具有非必須胺基酸、埃利鹽（Earle’s salts)及L-麩胺酸醯胺之最低必需培養基Eagle(minimum essential medium，MEM)中。將培養基補充10%胎牛血清（FBS，fetal bovine serum)及100 單位青黴素/鏈黴素。將細胞生長於37°C於5% C02及95%空氣之潮濕環境。每3至4天藉以0.25%胰蛋白及1 mMEDTA之 91763.doc -66- 200427695 溶液脫離黏著的細胞，將細胞次培養。將脫離的細胞以1 : 10至1 : 12之分開比例分配於具有新鮮培養基的新培養孤中〇

Hep G2細胞培養

HepG2為一種人類肝癌細胞株，用它來測試反意義募核苷酸針對人類eIF5Al回應以IL-1泠治療阻斷TNF- α製造之能力。將HepG2細胞培養於補充慶大黴素（gentamycin)、麩胺酸醯胺、及10% FBS之DMEM培養基中，並生長於37°C於5% C02及95%空氣之潮濕環境。實例7 細胞凋亡之引發分別利用放線菌素（Actinomycin D)(—種RNA聚合酶抑制劑）及喜樹驗（Camptothecin)(—種拓樸異構酶 (topoisomerase)抑制劑）將細胞凋亡引發於RKO及視神經底盤細胞中。使用放線菌素於0.25微克/毫升之濃度而使用喜樹鹼於20、40、或50 μΜ之濃度。利用喜樹鹼（50 μΜ)&TNF-α (10 ng/ml)之組合也將細胞凋亡引發於視神經底盤細胞中。發現喜樹鹼及TNF- α之組合比喜樹鹼或TNF- α單獨更有效於引發細胞凋亡。反意義募核苷酸一組三個目標針對人類eIF5Al之反意義寡核苷酸係由 Molecula Research Labs設計及售出。目標針對人類eIF5Al 之第一個反意義寡核苷酸序列（# 1)為5’ CCT GTC TCG AAG TCC AAG TC 3’（SEQ ID NO:63)。目標針對人類 eIF5Al 91763.doc -67- 200427695 之第二個反意義寡核苷酸序列（#2)為5’ GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC 3’（SEQ ID ΝΟ_·64)。目標針對人類 eIF5Al 之第三個反意義寡核苷酸序列（# 3)為5，CTC GTA CCT CCC CGC TCT CC 3’（SEQ ID NO:65)。控制組寡核苷酸具有序歹|J 5，CGT ACC GGT ACG GTT CCA GG 3f(SEQ ID NO:66)。使用異硫氰酸鹽螢光素（FITC，fluorescein isothiocyanate)標記的反意義寡核苦酸（Molecula Research Labs)來監測轉染效果及具有序列5’ GAA CCT TGG CGT GGC CGT GCX 3f(SEQ ID NO:67)，其中 X為 FITC標記。所有反意義寡核苷酸皆被完全硫代磷酸酯化。反意義寡核苷酸之轉染於RKO細胞中測試eIF5Al反意義寡核苷酸阻斷eIF5Al蛋白質表現之能力。將RKO利用轉染試劑 Oligofectamine(Invitrogen)以反意義寡核普酸轉染。轉染前二十四小時，將細胞以每孔157,000個細胞分入24孔盤上於補充10%FBS但缺少青黴素/鏈黴素之MEM培養基中。二十四小時後，細胞普遍達到大約50%緻密度。將RKO細胞模擬轉染、或以100 nM或200 nM反意義寡核苷酸轉染。對24孔盤的一孔充分的轉染培養基係由以無血清MEM稀釋0、 1.25、或2.5微升20 μΜ反意義寡核苷酸原液至最終體積42·5 微升並於室溫培養混合物1 5分鐘而製備。將1 ·5微升 Oligofectamine稀釋於6微升無血清MEM中並於室溫培養7·5 分鐘。5分鐘後將稀釋的Oligofectamine混合物加至DNA混合物並一起於室溫培養20分鐘。將細胞以無血清MEM清洗一 91763.doc -68- 200427695 次之後加入200微升MEM至細胞並舖上50微升轉染培養基。將細胞放回生長室4小時。培養後，將125微升 MEM+30%FBS力口至細月包。而後將細胞再培養48小時，以Θ.25 微克/毫升放線菌素處理24小時，而後收集細胞萃取物做西方墨點分析。利用100及200 nM反意義寡核苷酸及Oligofectamine利用為RKO細胞所述之相同程序也測試視神經底盤細胞的轉染。然而，藉由僅加入反意義寡核苦酸（於無血清培養基中稀釋成1 μΜ至10 μΜ)至細胞24小時及之後每24小時以稀釋於含血清培養基中的新鮮反意義寡核苷酸置換培養基總計二至五天，達到視神經底盤細胞之有效轉染。藉由以具有與eIF5Al反意義寡核苷酸#2相同序列但於3’ 端連接至FITC之FITC標記的反意義寡核苷酸進行轉染將反意義寡核苷酸轉染的效果最佳化及監測。將RKO及神經底盤細胞以FITC標記的反意義寡核苷酸於8孔培養玻片上轉染。四十八小時後將細胞以PBS清洗並於3.7%甲醛於PBS中固定1〇分鐘。將孔移除並將封片膠（\^(^&811丨61(1)加入，並以蓋玻片覆蓋。而後將細胞於UV光下於利用螢光素濾光鏡（綠色H546，濾光鏡組489 15)之螢光顯微鏡下觀看，將具有螢光明亮綠色之細胞決定為已攝入寡核苷酸。細胞凋亡之偵測以反意義寡核苷酸轉染視神經底盤細胞及以喜樹鹼引發細胞凋亡後，決定以控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸61卩5八18迟(^10 1^〇:26處理的細胞中進行細胞凋亡的細 91763.doc -69- 200427695 胞百分比。使用兩種方法來偵測細胞凋亡的視神經底盤細胞-Hoescht 染色及 DeadEndTM Fluorometric TUNEL。使用核染色法（Hoescht)標記視神經底盤細胞的細胞核以便基於形態學特徵如核碎裂及聚集確認細胞凋亡的細胞。將由3 : 1 混合物之絕對甲醇及冰醋酸組成的固定劑於使用前新鮮製備。將等體積固定劑加至生長於培養玻片上的細胞的培養基並培養2分鐘。自細胞取出培養基/固定劑混合物並丟棄，將1毫升固定劑加至細胞。5分鐘後將固定劑丟棄，將1毫升 0 新鮮固定劑加至細胞並培養5分鐘。將固定劑丟棄，將細胞風乾4分鐘之後，加入1毫升Hoescht染色劑（0.5微克/毫升 Hoescht 33258於PBS)。於黑暗中培養10分鐘後，將染色溶液丟棄，並將分開培養玻片孔的室移開，並將玻片以去離子水清洗1分鐘3次。清洗後，將數滴麥吉爾維恩缓衝液 (Mcllvaine’s buffer)(0.021 Μ 擦樣酸，0·058 Μ Na2HP04.7H20;pH5.6)加至細胞並以蓋玻片覆蓋。將染色的細胞於利用UV濾光鏡的螢光顯微鏡下觀看。將具有明亮染 -φ 色或碎裂的核之細胞記為細胞凋亡。每孔最少計算到200個細胞。使用 DeadEndTM Fluorometric TUNEL(Promega)來偵測 DNA碎裂，其為細胞凋亡的細胞之特徵。Hoescht染色後，將培養玻片以蒸餾水短暫清洗，並以浸入玻片兩次於 PBS(137 mM NaCl，2.68 mM KC1，1.47 mM KH2P〇4, 8.1 mM Na2HP04)中5分鐘進一步清洗，清洗之間於紙巾上將玻片吸乾。藉由將其浸入0.2% Triton X-100於PBS中5分鐘使細胞 91763.doc -70- 200427695 可滲透。而後再度藉浸入玻片於PBS中5分鐘清洗兩次，清洗之間於紙巾上將玻片吸乾。將25微升平衡緩衝液[200 mM 二甲砷酸鉀（pH 6.6)，25 mM Tris-HCl(pH 6.6)，0_2 mM二硫秀克糖醇，0.25 mg/ml牛血清白蛋白，及2.5 mM氯化始]加至每孔及培養5至1 0分鐘。於平衡期間，藉由混合平衡緩衝液··核苷酸混合[50 μΜ螢光素-12-dUTP，100 μΜ dATP，10 mM Tris-HCl(pH 7.6)，及1 mM EDTA]:末端去氧核苷酸轉移酶酵素（Tdt，25 U/ μΐ)為45 : 5 : 1之比例，將30微升反應混合物為每孔製備。於平衡緩衝液中培養後，將30微升反應混合物加入每孔，並以蓋玻片覆蓋。使反應於黑暗中37°C 進行1小時。藉由浸入玻片於2xSSC [0.3 M NaCl及30 mM檸檬酸鈉（pH 7.0)]中並培養15分鐘，將反應終止。而後將玻片藉浸於PBS中5分鐘清洗三次。藉以拭鏡紙揩拭孔附近將 PBS 移除，將一滴封片膠（Oncogene reasearch project, JA1750-4ML)加至各孔，並將玻片以蓋玻片覆蓋。將細胞於利用UV濾光鏡（UV-G 365,濾光鏡組487902)的螢光顯微鏡下觀看以便計算Hoescht染色的核。具有明亮染色或碎裂的核之任何細胞記為細胞凋亡。利用相同視野，而後將細胞利用螢光素濾光鏡（綠色H546，濾光鏡組48915)觀看，將任何核呈螢光明亮綠色記為細胞凋亡。視野中細胞凋亡的細胞百分比由利用螢光素濾光鏡計算的明亮綠色核之數目除以於UV濾光鏡下計算的核總數計算而得。每孔最少計算到200個細胞。圖5 4 - 5 7描述此等研究之結果。於以細胞〉周亡專一的 91763.doc -71 - 200427695 eIF5Al5轉染的樣品中細胞凋亡的細胞百分比清楚地比以控制組寡核苷酸轉染的細胞中所見少許多。蛋白質萃取及西方墨點藉由以PBS清洗細胞，每孔加入40微升熱溶解緩衝液 [0.5% SDS，ImM二硫秀克糖醇，50 mM Tris-HCl(pH 8·0)]，將來自轉染的RKO細胞收集西方墨點分析用的蛋白質。將細胞刮下並將形成的萃取物轉移至微量離心管中，煮沸5分鐘，及儲存於-20°C。利用Bio-Rad蛋白質分析（Bio-Rad)根據製造商的操作說明，將蛋白質定量。為了西方墨點，將5微克總蛋白質分離於12% SDS-聚丙烯醯胺膠體上。將分離的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜。而後將膜於阻斷液（5%脫脂奶粉於PBS中）中培養一小時並於 0·05% Tween-20/PBS中清洗15分鐘三次。將膜於PBS-T中於 4°C儲存隔夜。第二天回溫至室溫後，將膜於1微克/毫升聚乙烯醇中阻斷30秒。將膜於去離子水中清洗5次及而後於5% 牛奶於0.025%丁^^611-20/?38之溶液中阻斷30分鐘。將初級抗體於5%牛奶於0.025% Tween-20/PBS之溶液中預先培養 30分鐘之後與膜培養。使用數種初級抗體。來自Oncogene辨識p53(Ab-6)之單株抗體及針對合成胜肽（胺基-CRLPEGDLGKEIEQKYD-羧基）（SEQ ID N〇：68)類似於人類eIF5Al之c端於雞内培養的多株抗體（Gasllus Immunotech)。也使用抗-/3 -肌動蛋白抗體 (Oncogene)來證實相等蛋白質入料量。以0.05微克/毫升之稀釋使用對p53之單株抗體，以1 : 1000之稀釋使用對eIF5Al 91763.doc -72- 200427695 之抗體，而以1 : 20,000之稀釋使用對肌動蛋白之抗體。與初級抗體培養60至90分鐘後，將膜於0.05% Tween-20/PBS 中清洗15分鐘3次。而後將二級抗體稀釋於0.025% Tween-2 Ο/PBS中之1%牛奶中並與膜培養60至90分鐘。當使用p53(Ab-6)作為初級抗體，使用的二級抗體為以1 : 5000 稀釋之兔-抗小鼠IgG聯結至過氧化酶（Sigma)。當使用抗 -eIF5Al作為初級抗體，以1 : 5000之稀釋使用兔-抗雞IgY 聯結至過氧化酶（Gasllus Immunotech)。與肌動蛋白使用的二級抗體為以1 : 5000之稀釋使用的羊抗·小鼠IgM聯結至過氧化酶（Calbiochem)。與二級抗體培養後，將膜於PBS_T中清洗3次。使用ECL力cr西方墨點债測套組（Amersham Pharmacia Biotech)來偵測過氧化酶聯結的結合抗體。簡而言之，將膜輕輕地吸乾及而後於黑暗中以40 : 1混合之試劑A及試劑B 培養5分鐘。將膜吸乾，置於醋酸膜之間，及曝光至X光底片10秒至30分鐘之不同時間期間。藉浸入膜於脫附緩衝液 [100 mM 2-巯基乙醇，2 % SDS，及62.5 mM Tris-HCl(pH6.7) 中，及於50°C培養30分鐘，將膜脫附。而後將膜於取離子水中清洗及於大體積0.05%Tween-20/PBS中10分鐘清洗兩次。將膜脫附及重新墨點達三次。實例8 siRNA的建造使用針對人類eIF-5 A1之小抑制性RNAs(siRNA)來專一地抑制eIF-5Al於RKO及視神經底盤細胞中eIF-5Al的表現。利 91763.doc -73- 200427695 用Sz7e/2cerTM siRNA建造套組（Ambion Inc_)藉由試管中轉錄產生六種siRNA。四種siRNA係針對人類eIF5Al產生（siRNA #1 至 #4)(SEQ ID NO:30-3 3)。見圖 70。使用兩種 siRNA作為控制組；一個siRNA針對套組中提供的GAPDH，及siRNA (siRNA #5)(SEQ ID N〇:34)具有 eIF5Al 專一的 siRNA #1(8五(^1〇>1〇:30)之反向序列但其本身不針對61?5人1。根據製造商的使用說明，將siRNA產生。簡而言之，在煉合T7 啟動子引子及與克列諾夫片段填入反應後，使用編碼理想 siRNA股的DNA寡核苷酸作為Τ7 RNA聚合酶的模版以產生 siRNA的個別股。在對有意義及反意義股兩者之轉錄反應後，將反應合併，並將兩siRNA股煉合，以DNase及RNase 處理，及而後管柱純化。用來產生siRNA之DNA募核苷酸（T7 引子煉合處下面化線）為：siRNA #1反意義 5，AAAGGAATGACTTCCAGCTGACCTGTCTC 3，(SEQ ID NO:69)及 siRNA #1 有意義 5’AATCAGCTGGAAGTC ATTCCTCCTGTCTC 3f(SEQ ID NO:70) ; siRNA #2反意義 —

5fAAGATCGTCGAGATGTCTACTCCTGTCTC 3，(SEQ ID NO:71)及 siRNA #2 有意義 5’AAAGTAGACATCTC GACGATCCCTGTCTC 3f(SEQ ID NO:72) ; siRNA #3反意義 5，AAGGTCCATCTGGTTGGTACCTGTCTC 3，(SEQ ID NO:73)及 siRNA #3 有意義 5’AAAATACCAACCAGAT GGACCCCTGTCTC 3’（SEQ ID NO:74) ; siRNA #4反意義 5，AAGCTGGACTCCTCCTACACACCTGTCTC 3，(SEQ ID NO:75)及 siRNA #4 有意義 5’AATGTGTAGGAGGAGTC 91763.doc -74- 200427695 CAGCCCTGTCTC 3’（SEQ ID NO:76) ; siRNA #5 反意義 5fAAAGTCGACCTTCAGTAAGGACCTGTCTC 3，(SEQ ID NO:77)及 siRNA #5 有意義 5，AATCCTTACTGAAGGTC GACTCCTGTCTC 3f(SEQ ID NO:78)。

使用 siRNA標記套組-FAM(Ambion)來以 FAM 標示GAPDH以便監測siRNA攝入RKO及視神經底盤細胞。於8孔培養玻片上轉染後，將細胞以PBS清洗並於3.7%甲醛於PBS中固定10分鐘。將孔移除並將封片膠（Vectashield)加入，並以蓋玻片覆蓋。於UV光下於利用螢光素濾光鏡之螢光顯微鏡下觀看FAM-標示的siRNA之攝入。根據製造商的使用說明，將GAPDH siRNA標記。 siRNA的轉染將RKO細胞及視神經底盤細胞利用相同轉染程序以 siRNA轉染。轉染前一天將RKO細胞分別以每孔46,000及 105,800個細胞之密度植入8孔培養玻片或24孔盤上。當視神經底盤細胞的緻密度為40至70%及普通於轉染前三天以每孔7500至10,000個細胞植入8孔培養玻片上，將視神經底盤細胞轉染。藉由於Opti-Mem(Sigma)中稀釋25.5皮莫耳 siRNA原液至最終體積21.2微升，製備8孔培養玻片的一孔所須之轉染培養基。將0.425微升1^9〇£6(^&111丨1^ 2000稀釋至最終體積21.2微升於Opti-Mem中及於室溫培養7至10分鐘。而後將稀釋的Lipofectamine 2000混合物加至稀釋的 siRNA混合物並一起於室溫培養20至30分鐘。將細胞以無血清培養基清洗一次之後加入135微升無血清培養基至細胞 91763.doc -75 - 200427695 並舖上42.4微升轉染培養基。將細胞放回生長室4小時。培養後，將65微升無血清培養基+30%FBS加至細胞。將欲用來做西方墨點分析的轉染siRNA進入細胞利用相同於8孔玻片的轉染條件實施，除了將體積增加2.3倍。轉染後，將RKO及視神經底盤細胞培養72小時之後收集細胞萃取物做西方墨點分析。為了決定針對eIF5Al的 siRNA阻斷細胞凋亡的效果，轉染後48或72小時，將視神經底盤細胞以 50 μΜ喜樹鹼（Sigma)及 10 ng/ml TNF - a (Leinco Technologies)處理以引發細胞凋亡。24或48小時後將細胞以Hoescht染色以便決定進行細胞凋亡的細胞百分比。實例9 細胞凋亡之偵測以反意義寡核苷酸轉染視神經底盤細胞及以喜樹鹼引發細胞凋亡後，決定以控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸eIF5 A1 #2處理的細胞中進行細胞凋亡的細胞百分比。使用兩種方法來偵測細胞凋亡的視神經底盤細胞 -Hoescht 染色及 DeadEnd™ Fluorometric TUNEL。使用核染色法（Hoescht)標記視神經底盤細胞的細胞核以便基於形態學特徵如核碎裂及聚集確認細胞凋亡的細胞。將由3 : 1混合物之絕對甲醇及冰醋酸組成的固定劑於使用前新鮮製備。將等體積固定劑加至生長於培養玻片上的細胞的培養基並培養2分鐘。自細胞取出培養基/固定劑混合物並丟棄，將1毫升固定劑加至細胞。5分鐘後將固定劑丟棄，將1 毫升新鮮固定劑加至細胞並培養5分鐘。將固定劑丟棄，將 91763.doc -76- 200427695

細胞風乾4分鐘之後，加入1毫升Hoescht染色劑（0.5微克/毫升11(^8^^ 3325 8於？38)。於黑暗中培養10分鐘後，將染色溶液丟棄，並將分開培養玻片孔的室移開，並將玻片以去離子水清洗1分鐘3次。清洗後，將數滴麥吉爾維恩缓衝液 (Mcllvaine's buffer)(0.021 Μ 檸檬酸，0.058 Μ Na2HP04.7H20;pH5.6)加至細胞並以蓋玻片覆蓋。將染色的細胞於利用UV濾光鏡的螢光顯微鏡下觀看。將具有明亮染色或碎裂的核之細胞記為細胞凋亡。每孔最少計算到200 個細胞。

使用 DeadEndTM Fluorometric TUNEL(Promega)來偵測 DNA碎裂，其為細胞凋亡的細胞之特徵。Hoescht染色後，將培養玻片以蒸餾水短暫清洗，並以浸入玻片兩次於 PBS(137 mM NaCl5 2.68 mM KC1? 1.47 mM KH2P04? 8.1 mM Na2HP04)中5分鐘進一步清洗，清洗之間於紙巾上將玻片吸乾。藉由將其浸入0.2% Triton Χ·100於PBS中5分鐘使細胞可滲透。而後再度藉浸入玻片於PBS中5分鐘清洗兩次，清洗之間於紙巾上將玻片吸乾。將25微升平衡緩衝液[200 mM 二甲石申酸鉀（pH 6.6)，25 mM Tris-HCl(pH 6.6)，0.2 mM二硫秀克糖醇，0.25 mg/ml牛血清白蛋白，及2.5 mM氣化鈷]加至每孔及培養5至10分鐘。於平衡期間，藉由混合平衡緩衝液：核苷酸混合[50 μΜ螢光素-12-dUTP，100 μΜ dATP，10 mM Tris_HCl(pH 7.6)，及 1 mM EDTA] ··末端去氧核苷酸轉移酶酵素（Tdt，25 U/ μΐ)為45 : 5 : 1之比例，將30微升反應混合物為每孔製備。於平衡緩衝液中培養後，將30微升反 91763.doc -77- 200427695 應此合物加入母孔，並以蓋玻片覆蓋。使反應於黑暗中3 7 C進行1小時。藉由浸入玻片於2xSSc [0·3 M NaCl及30 mM 檸檬酸納（pH 7·0)]中並培養15分鐘，將反應終止。而後將玻片藉浸於PBS中5分鐘清洗三次。藉以拭鏡紙揩拭孔附近將 PBS 移除，將一滴封片膠（〇nc〇gene reasearch pr〇ject， JA1750-4ML)加至各孔，並將玻片以蓋玻片覆蓋。將細胞於利用UV濾光鏡（UV-G 3 65,濾光鏡組487902)的螢光顯微鏡下觀看以便計算Hoescht染色的核。具有明亮染色或碎裂的核之任何細胞記為細胞凋亡。利用相同視野，而後將細胞利用螢光素濾光鏡（綠色H546，濾光鏡組48915)觀看，將任何核呈螢光明亮綠色記為細胞凋亡。視野中細胞〉周亡的細胞百分比由利用螢光素濾光鏡計算的明亮綠色核之數目除以於UV濾光鏡下計算的核總數計算而得。每孔最少計算到200個細胞。蛋白質萃取及西方墨點藉由以PBS清洗細胞，每孔加入4〇微升熱溶解緩衝液

[0.5% SDS，ImM 二硫秀克糖醇，50 mM Tris_HCl(PH 8·〇)] ’將來自轉染的RKO細胞收集西方墨點分析用的蛋白質。將細胞刮下並將形成的萃取物轉移至微量離心管中，煮沸5分鐘，及儲存於-20°C。利用Bio-Rad蛋白質分析 (Bio-Rad)根據製造商的操作說明，將蛋白質定量。為了西方墨點，將5微克總蛋白質分離於12% SDS-聚丙稀醯胺膠體上。將分離的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜。而後將膜於阻斷液（5%脫脂奶粉於PBS中）中培養一小時並於 91763.doc -78- 200427695 0.05%Tween-20/PBS中清洗15分鐘三次。將膜於PBS-Τ中於 4°C儲存隔夜。第二天回溫至室溫後，將膜於1微克/毫升聚乙烯醇中阻斷30秒。將膜於去離子水中清洗5次及而後於 5%牛奶於0.025%Tween-20/PBS之溶液中阻斷30分鐘。將初級抗體於5%牛奶於0.025% Tween-20/PBS之溶液中預先培養30分鐘之後與膜培養。使用數種初級抗體。來自Oncogene辨識p53之單株抗體 (Ab-6; Oncogene)、辨識人類 bcl-2之單株抗體（Oncogene)、及針對合成胜肽（胺基-CRLPEGDLGKEIEQKYD•綾基）（SEQ ID NO:68)類似於人類eIF5Al之c端於雞内培養的多株抗體 (Gasllus Immunotech)。也使用抗-泠-肌動蛋白抗體 (Oncogene)來證實相等蛋白質入料量。以0.05微克/毫升之稀釋使用對p53之單株抗體，以1 : 3500之稀釋使用對bcl-2 之單株抗體，以1 : 1000之稀釋使用對eIF5Al之抗體，而以 1 : 20,000之稀釋使用對肌動蛋白之抗體。與初級抗體培養 60至90分鐘後，將膜於0.05%Tween-20/PBS中清洗15分鐘3 次。而後將二級抗體稀釋於0.025%Tween_20/PBS中之1%牛奶中並與膜培養60至90分鐘。當使用p53(Ab-6)作為初級抗體，使用的二級抗體為以1 : 5000稀釋之兔-抗小鼠IgG聯結至過氧化酶（Sigma)。當使用抗-eIF5Al作為初級抗體，以1 : 5000之稀釋使用兔·抗雞IgY聯結至過氧化酶（Gasiius Immunotech) 〇與肌動蛋白使用的二級抗體為以1 : 5000之稀釋使用的羊抗-小鼠IgM聯結至過氧化酶（Calbiochem)。與二級抗體培養後，將膜於PBS-T中清洗3次。 91763.doc -79- 200427695 使用ECL力σ西方墨點横測套組（Amersham Pharmacia Biotech)來偵測過氧化酶聯結的結合抗體。簡而言之，將膜輕輕地吸乾及而後於黑暗中以40 : 1混合之試劑A及試劑B 培養5分鐘。將膜吸乾，置於醋酸膜之間，及曝光至X光底片10秒至30分鐘之不同時間期間。藉浸入膜於脫附緩衝液 [100 mM 2-巯基乙醇，2 % SDS，及 62·5 mM Tris-HCl(pH 6.7)中，及於50°C培養30分鐘，將膜脫附。而後將膜於取離子水中清洗及於大體積0.05% Tween-20/PBS中10分鐘清洗兩次。將膜脫附及重新墨點達三次。實例10

HepG2 TNF- a製造之定量將HepG2細胞以每孔20，000個細胞植入4 8孔盤上。七十二小時後將培養基移去並將含有2.5 μΜ控制組反意義募核苷酸或2.5 μΜ之反意義募核苷酸eIF5Al #2之新鮮培養基加至細胞。二十四小時後將含反意義寡核苷酸之新鮮培養基加入。與寡核苷酸培養總計48小時後，將培養基以含白介素-1/3 (IL-ly5，1000 pg/ml; Leinco Technologies)之培養基取代並培養6小時。將培養基收集並冷凍（-20°C)做TNF-α 之定量。使用其他平行的培養未處理細胞（無反意義募核苷酸及IL-1 /5 )及僅以IL-1 /3處理的細胞作為控制組。將所有處理皆以二重複進行。藉由ELISA分析法（Assay Designs Inc.)根據製造商的使用說明測量釋放入培養基中的TNF-α 〇實例11 91763.doc -80- 200427695 下列實驗顯示反意義細胞凋亡因子寡核苷酸能夠抑制細胞凋亡因子5A之表現以及p53。使RKO細胞未轉染、模擬轉染或以200 nM反意義募核苷酸eIF5Al #1、#2、或#3轉染。也將RKO細胞以100 nM反意義募核苷酸eIF5A1 #2轉染。轉染後四十八個小時，將細胞以0.25微克/毫升放線菌素處理。二十四小時後，收集細胞萃取物並將來自各樣品之5微克蛋白質分離於SDS-PAGE膠體上，轉移至PVDF膜，並以抗-eIF5Al抗體做西方墨點。化學冷光偵測後，將膜脫附並以抗p53之抗體重新偵測。化學冷光偵測後，將膜再度脫附並以抗肌動蛋白之抗體重新偵測。見圖52。圖52顯示在以反意義寡核苷酸1、2及3(對細胞凋亡因子5A)(分別為SEQ ID NO:25、26及27)處理後由 RKO細胞製造的蛋白質量。在以反意義細胞凋亡因子5 A核苷酸轉染後，RKO細胞製造較少細胞凋亡因子5A以及較少 p53 ° 實例12 下列實驗顯示反意義細胞凋亡因子寡核苷酸能夠降低細胞凋亡。於一個實驗中，將視神經底盤細胞株#506(A)利用 Oligofectamine轉染試劑以100 nM FITC-標示的反意義寡核苷酸轉染或（B)以直接稀釋於無血清培養基中之10 μΜ裸 FITC-標示的反意義寡核苷酸轉染。24小時後，將含10%FBS 之培養基及稀釋至10 μΜ之新鮮反意義寡核苷酸加至細胞。總計48小時後將細胞（(A)及（Β))固定及於利用螢光素濾 91763.doc -81 - 200427695 光鏡之UV光下螢光顯微鏡中檢視。圖53顯示螢光標示的反意義寡核苷酸之攝入。於另一實驗中，將視神經底盤細胞株#506以10 μΜ控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸eIF5Al #2(SEQ ID NO:26)轉染總計4天。開始反意義寡核苷酸處理後四十八個小時，將細胞以20 μΜ或40 μΜ喜樹鹼處理48小時。每曰更換含反意義寡核苷酸及喜樹鹼之培養基。由以Hoescht及 TUNEL標示細胞決定細胞凋亡的細胞百分比。見圖54。於另一實驗中，將視神經底盤細胞株#506以10 μΜ控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸eIF5Al #2(SEQ ID NO:26)轉染。二十四小時後，將培養基更換，將新鮮反意義寡核苷酸加入。開始反意義寡核苷酸處理後四十八個小時，將反意義寡核苦酸移除，將細胞以20 μΜ喜樹驗處理3 天。每日更換含喜樹鹼之培養基。由以Hoescht及TUNEL標示細胞決定細胞凋亡的細胞百分比。見圖5 5。於再另一實驗中，將視神經底盤細胞株#5 17以1 μΜ控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸eIF5Al #2(SEQ ID NO:26)轉染總計5天。開始反意義寡核苷酸處理後四十八個小時，將細胞以20 μΜ喜樹鹼處理3或4天。每日更換含反意義寡核苷酸及喜樹鹼之培養基。由以Hoescht及TUNEL標示細胞決定細胞祠亡的細胞百分比。見圖5 6。於再另一實驗中，將視神經底盤細胞株#517以2·5 μΜ控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸eIF5Al #2(SEQ ID NO:26)轉染總計5天。開始反意義寡核苷酸處理後四十八個 91763.doc -82 - 200427695 小時，將細胞以40 μΜ喜樹鹼處理3天。每日更換含反意義寡核苦酸及喜樹驗之培養基。由以Hoescht標示細胞決定細胞凋亡的細胞百分比。見圖57。於再另一實驗中，將視神經底盤細胞株#5 17以1 μΜ或2.5 μΜ控制組反意義寡核苷酸或反意義募核苷酸eIF5Al #2(SEQIDNO:26)轉染總計5天。開始反意義寡核苷酸處理後四十八個小時，將細胞以40 μΜ喜樹驗處理3天。每日更換含反意義寡核苷酸及喜樹鹼之培養基。由以Hoescht標示細胞決定細胞凋亡的細胞百分比。見圖58。於再另一實驗中，使視神經底盤細胞株#5 17未處理、或以 10 ng/ml TNF - α、50 μΜ喜樹驗、或 10 ng/ml TNF - α 及 50 μΜ喜樹驗處理。由以Hoescht標示細胞決定細胞凋亡的細胞百分比。見圖5 9。於再另一實驗中，將視神經底盤細胞株#506及#5 17以2.5 μΜ或5 μΜ控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸 eIF5Al #2(SEQ ID ΝΟ:26)轉染總計兩天。24小時後加入含反意義募核苷酸之新鮮培養基。開始反意義募核苷酸處理後四十八個小時，將細胞以50 μΜ喜樹驗及10 ng/ml TNF-α處理2天。由以Hoe scht標示細胞決定細胞调亡的細胞百分比。見圖60。於再另一實驗中，將視神經底盤細胞株#506、#517、及 #524以2.5 μΜ控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸 eIF5Al #2(SEQ ID ΝΟ:26)轉染總計兩天。24小時後加入含反意義寡核苷酸之新鮮培養基。開始反意義寡核苷酸處理 91763.doc -83- 200427695 後四十八個小時，將細胞以50 μΜ喜樹驗及10 ng/ml TNF-α處理2天。由以Hoescht標示細胞決定細胞〉周亡的細胞百分比。見圖61。實例13 下列實驗顯示以針對細胞凋亡因子5A的siRNA轉染的細胞表現較少細胞凋亡因子5 A。此實驗也顯示針對細胞凋亡因子5A的siRNA能夠降低細胞凋亡。於一個實驗中，將視神經底盤細胞株#5 17於轉染期間有血清（A)或無血清（B)，利用Lipofectamine 2〇00轉染試劑以 100 nMFAM-標示的siRNA轉染。總計24小時後將細胞（(A) 及（B))固定及於利用螢光素濾光鏡之UV光下螢光顯微鏡中檢視。見圖62。於另一個實驗中，將RKO細胞於轉染期間有或無血清存在下，以100 nM siRNA轉染。將六種siRNA轉染，兩種控制組 siRNA(siRNA #5(SEQ ID NO:34)及一個目標針對 GAPDH)及四種目標針對eIF5Al(siRNA #1 至 #4) (SEQ ID NO:30-34)。轉染後七十二個小時，收集細胞萃取物並將來自各樣品之5微克蛋白質分離於SDS-PAGE膠體上，轉移至 PVDF膜，並以抗-eIF5Al抗體做西方墨點。化學冷光偵測後，將膜脫附並以抗bcl-2之抗體重新偵測。化學冷光偵測後，將膜再度脫附並以抗肌動蛋白之抗體重新偵測。見圖 63 ° 於另一實驗中，將視神經底盤細胞株#506及#517以100 nM siRNA轉染。將六種siRNA轉染，兩種控制組 91763.doc -84- 200427695 siRNA(siRNA #5(SEQ ID NO:34)及一個目標針對GAPDH) 及四種目標針對eIF5Al(siRNA #1至#4) (SEQ ID NO:3 0-34)。轉染後七十二個小時，收集細胞萃取物並將來自各樣品之5微克蛋白質分離於SDS-PAGE膠體上，轉移至 PVDF膜，並以抗-eIF5Al抗體做西方墨點。化學冷光偵測後，將膜脫附並以抗肌動蛋白之抗體重新偵測。見圖64。於另一實驗中，將視神經底盤細胞株#506以100 nM siRNA轉染。將六種siRNA轉染，兩種控制組siRNA(siRNA #5(SEQ ID NO:34)及一個目標針對GAPDH)及四種目標針對 eIF5Al(siRNA#l 至 #4) (SEQ ID NO:30-33)。轉染後四十八個小時，將培養基以含有50 μΜ喜樹鹼及10 ng/ml TNF-α之培養基置換。二十四小時後，由以Hoescht標示細胞決定細胞凋亡的細胞百分比。見圖65。於另一實驗中，將視神經底盤細胞株#506以100 nM siRNA轉染。將六種siRNA轉染，兩種控制組siRNA(siRNA #5(SEQ ID NO:34)及一個目標針對GAPDH)及四種目標針對 eIF5Al(siRNA#l 至 #4) (SEQ ID ΝΟ:30·33)。轉染後七十二個小時，將培養基以含有50 μΜ喜樹鹼及10 ng/ml TNF-α之培養基置換。二十四小時後，由以Hoescht標示細胞決定細胞洞亡的細胞百分比。見圖6 6。

於另一實驗中，使視神經底盤細胞株#506未轉染或以100 nM siRNA轉染。將六種siRNA轉染，兩種控制組 siRNA(siRNA #5(SEQ ID NO:34)及一個目標針對GAPDH) 及四種目標針對eIF5Al(siRNA #1至#4) (SEQ ID 91763.doc -85- 200427695 ΝΟ··30-33)。轉染後七十二個小時，將培養基以含有50 μΜ 喜樹鹼及10 ng/ml TNF-α之培養基置換。也將新鮮培養基加至未轉染、未處理的控制組細胞。四十八小時後，由以 Hoescht標示細胞決定細胞〉周亡的細胞百分比。見圖67。來自說明於圖67及實例13中的實驗，以siRNA轉染及以喜樹驗及TNF- α處理的Hoescht染色的視神經底盤細胞株 #506之照片。見圖68。實例14 此實驗顯示以針對細胞凋亡因子5A的反意義寡核苷酸處理人類細胞株造成細胞製造較少TNF- α。將HepG2細胞以2.5 μΜ控制組反意義寡核苷酸或反意義寡核苷酸eIF5A1 #2處理總計兩天。24小時後將含反意義寡核苷酸之新鮮培養基加入。使其他細胞未處理兩天。開始處理後四十八個小時，將細胞以IL_1 /5 (1000 pg/ml)於新鮮培養基中處理6小時。實驗終了時，將培養基收集並冷凍（-20 °C)做 TNF-α 之定量。利用購自 Assay Designs Inc.之 ELISA 分析法測量釋放入培養基中的TNF-α。見圖69。實例15 將HT-29細胞（人類結腸腺癌）以針對eIF5Al的siRNA或以具有反向序列之控制組siRNA轉染。使用的siRNA為如下列：位置 690(3fUTR)%G/C=48 5，AAGCUGGACUCCUCCUACACA 3，（SEQ ID NO:79) 使用的控制組siRNA為如下歹J : 91763.doc -86- 200427695 %G/C=39 5fAAACACAUCCUCCUCAGGUCG 3f(SEQ ID NO:80) 48小時後，將細胞以干擾素-r (INF- r )處理16小時。16小時後，將細胞以新鮮培養基清洗並以脂多醣（LPS， lipopolysaccharide)處理8或24小時。於各時間點（8或24小時）將細胞培養基自細胞取出，冷;東，並由ELISA定量存在於培養基中之TNF- α。同時收集細胞溶解物，定量蛋白質，並用來調整TNF- α值至pg/mg蛋白質（以調整不同孔中細胞數目之差異）。將西方墨點及ELISA的結果提供於圖74A及B 中。圖75為除了細胞於較高密度以外，相同實驗之結果。實例16 U-937細胞株的組織培養條件 U-9 37為人類單核球（monocyte)細胞株，其生長於懸浮液中且於受到PMA刺激時變成附著性且分化成巨噬細胞 (ATCC號碼CRL-1 5 93.2)(細胞未由ATCC直接取得）。將細胞保持於具有2 mM L-麩胺酸醯胺、1.5 g/L碳酸氫鈉、4·5 g/L 葡萄糖、10 mM HEPES、1.0 mM丙酮酸鈉及1〇%胎牛血清之RPMI 1640培養基中，於37°C C02(5%)培養箱中。每週兩次將細胞分入新鮮培養基中（1 : 4或1 : 5分開比例）並將細胞密度永遠保持於105及2xl06個細胞/ml之間。將細胞以懸浮培養於組織培養處理的塑膠T-25瓶中5將實驗實行於24 孔盤中。時程實驗實驗開始之前兩天，將細胞密度調整至3xl〇5個細胞/ml 91763.doc -87- 200427695 培養基。於實驗當天，將於對數期的細胞收集。將細胞懸浮液轉移至15ml試管並於室溫下於4〇〇xg離心1〇分鐘。將上層清液吸出並將細胞沉澱以新鮮培養基清洗/重新懸浮。再度將細胞於400xg離心10分鐘，將上層清液吸出，並最後將細胞沉殿重新懸浮於新鮮培養基中。將等體積細胞懸浮液及錐蟲藍（trypan blue)溶液（〇·4%錐蟲藍染料於PBS中）混合並利用血球計數器及顯微鏡將活細胞計數。將細胞稀釋成4 X105個細胞/ml。藉由加入PMA或DMSO(媒介控制組）至各孔準備24孔盤。將1毫升細胞懸浮液加至各孔使得各孔含有4〇〇,〇〇〇個細胞，0.1%DMSO+/-162 nM PMA。將細胞保持於37°C C02(5%)培養箱中。於時間〇、24、48、72、96、99及 102 小時時收集不同孔之細胞。見圖76摘要實驗時間點及加入。於72小時時將培養基更換。因為一些細胞為黏著性而其他為於懸浮中，小心避免破壞黏著的細胞。將來自各孔的培養基小心地轉移入相對應的微量離心管並將試管於 14,000Xg離心3分鐘。將試管吸出，將細胞沉澱物重新懸浮於新鮮培養基中（1 ml，（-)DMSO,（-)PMA)，並回到其原來的孔中。於此無PMA的新鮮培養基中，細胞變成靜止。於96 小時時，將LPS(l〇〇ng/ml)加入並於3小時（99小時時）及6小時（102小時時）後收集細胞。於此等時間點，將懸浮細胞及培養基自各孔轉移至微量離心管中。將細胞於14,〇〇〇xg離心3分鐘沉澱。將培養基（上層清液）轉移至乾淨試管並儲存（-20 °C )以做ELISA/細胞激 91763.doc -88- 200427695 )清洗並將此跑沉澱。將細胞於素分析。將孔中剩餘的細胞以PBS(1 ml，37 PBS也用來洗相對應微量離心管中的細 14,000xg離心3分鐘再度沉澱。用煮沸溶鮭 Μ 液（50 mM Tris pH 7·4及2% SDS)將細胞溶解。將來自各子i ~的黏著細胞及懸浮細胞倒在一起。將樣品煮沸及而後儲存 w 1予於、2〇°c。西方墨點藉二辛可寧酸（BCA，bicinchoninc acidVi & 去利用牛血清白蛋白（BSA，bocine serum albumin)作為標準蛋白質，決定各細胞樣品中的蛋白質濃度。將蛋白質樣品（5微克總蛋白質）藉12% SDS-PAGE電泳分離及轉移至PVDF膜。將膜以聚乙烯醇（1微克/毫升，30秒）及以5%脫脂奶粉於PBS-t(l小時）阻斷。將膜以針對人類eIF-5 A培養的小鼠單株抗體（BD Biosciences cat #611976; 1:20,000於 5%脫脂奶粉中）镇測。將膜清洗3x10分鐘PBS-t。二級抗體為山葵過氧化酶連接的抗小鼠抗體（Sigma，1:5000於1 %脫脂奶粉中）。將膜清洗3x 10分鐘PBS-t。藉化學冷光（ECL偵測系統’ Amersham Pharmacia Biotech)觀察蛋白質帶。為了證實各膠體行皆放入類似量之蛋白質’將膜脫附並重新偵測肌動蛋白。將膜脫附（1〇〇 2-魏基乙醇，2% SDS，62:5 mM Tris-HCl pH 6.7 ; 50°C 培養 3〇分鐘）’清洗’ 及而後如上述阻斷。將膜以肌動蛋白初級抗體（於小鼠中製成的肌動蛋白單株抗體；Oncogene，Ab_l; 1:2〇,〇〇〇於5。/〇脫脂奶粉中）偵測。二級抗體、清洗、及偵測皆如上述相同。圖77顯示於單核球（U-397)分化及隨後TNF- α分泌的期 91763.doc -89- 200427695 間將eIF-5Al向上調節。實例17 :由eIF5A siRNA反應干擾素r之11-8製造之抑制將HT-29(人類結腸腺癌）細胞以針對細胞凋亡eIF5 A的 siRNA轉染。轉染後大約48小時將培養基改變，使得部分測試樣品具有含干擾素T的培養基而部分樣品具有無干擾素 T的培養基。干擾素T加入後1 6小時，將細胞清洗，將有或沒有TNF- α的培養基置於細胞上。8或24小時後，收集培養基（用來做ELIS Α偵測IL-8)及細胞溶解物。圖79及80顯示產生IL-8以反應TNF-α以及反應干擾素。在TNF處理前以干擾素r前處理細胞使得細胞比單獨處理產生更多IL-8。此可能是由於TNF受體1反應干擾素之已知向上調節，所以以干擾素「前處理」細胞使其反應TNF較佳，因細胞具有較多受體。針對eIF5 A1的siRNAs在反應TNF 單獨無作用於IL-8製造（前面的實驗），然而，siRNA阻擋幾乎所有反應干擾素產生的IL-8以及顯著量產生的IL-8為干擾素及TNF合併處理的結果。此等結果顯示藉由利用針對細胞凋亡eIF-5A的siRNAs，本發明人始干擾素訊號途徑導致IL-8，但非TNF途徑。圖81為西方墨點顯示HT-29細胞中反應干擾素r，細胞凋亡eIF5A之向上調節（於8小時4倍）。實例18 : 人類視神經底盤培養成對的人類眼睛係於死後48小時内得自加拿大眼睛銀行安大略分行。將視神經盤（具有連接的軸極）取出並置於 DMEM補充抗生素/抗黴素、麩胺酸醯胺、及10% FBS之培 91763.doc -90- 200427695 養基中3小時。視神經盤（ONH，optic nerve head)钮係由各組織樣品取回並以精細的解剖剪刀切碎成四小片。將外植片體培養於12.5平方公分塑膠培養孤中於DMEM培養基中。於能生長的外植片體於一個月内看到生長。一旦細胞達到 90%高緻密度（confluence)，將其胰蛋白消化及經過區分次培養以產生人類視神經底盤（LC，lamina cribrosa)及星細胞族群。將LC細胞次培養於25平方公分培養皿中於補充慶大黴素（gentamycin)、麩胺酸醯胺、及10% FBS之DMEM培養基中。如按興此程序將細胞保持及次培養。利用差別榮光抗體染色於8孔培養玻片上將由區分次培養得到的細胞族群定性及確認族群純度。將細胞固定於 10%福馬林溶液中並以杜貝可磷酸緩衝鹽水（DPBS， Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)清洗三次。在以 2%脫脂牛奶於DPBS中阻斷後，將抗體稀釋於1%BSA於DPBS中並施加至其中6孔之細胞中。將剩餘兩孔僅以1%牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin)溶液及無初級抗體處理作為控制組。將細胞與初級抗體於室溫培養一小時，而後以 DPBS清洗三次。將適當二級抗體稀釋於1% BSA於DPBS 中，加至各孔，及培養1小時。以DPBS清洗後，將分開培養玻片孔的室自玻片移開，並將玻片浸入二次蒸餾水中，而後使之風乾。將螢光用封片膠（Vector Laboratories)加至各玻片並以22x60 mm蓋玻片覆蓋。將免疫螢光染色於具有適當濾光鏡的螢光顯微鏡下觀看並與未以初級抗體處理的控制組孔比較。除非另外說明，所有的初級抗體皆購自 91763.doc -91 - 200427695

Sigma。所有的二級抗體皆購自Molecular Probes。用來確認LC細胞的初級抗體為：抗-膠原蛋白I、抗-膠原蛋白IV、抗層黏蛋白（Laminin)、抗-細胞纖維結合素結合蛋白 (fibronectin)、抗-膠質纖維（GFAP，glial fibrillary)、及抗-α-平滑肌肌動蛋白。若其對膠原蛋白I、膠原蛋白IV、層黏蛋白、細胞纖維結合素結合蛋白、-平滑肌肌動蛋白正染色而對膠質纖維（GFAP，glial fibrillary)為負，則將細胞族群決定為由LC細胞組成。於此研究中，使用兩組人類眼睛以開始培養#。分別由83歲男性及17歲男性之視神經盤建立 LC細胞株#506及#5 17。所有的LC細胞株皆已完全定性及發現含有大於90%LC細胞。 LC細胞的處理利用 50 μΜ 喜樹驗（Sigma)及 10 ng/ml TNF- a (Leinco Technologies)之組合將細胞凋亡引發於視神經底盤細胞中。發現喜樹鹼及TNF- α之組合於引發細胞凋亡時比單獨喜樹鹼或TNF-α更為有效。 siRNA的建造及轉染使用針對人類eIF5A之小抑制性RNAs(siRNA)來專一地抑制視神經底盤細胞中eIF5A的表現。利用⑼cerTM siRNA建造套組（Ambion Inc.)藉由試管中轉錄產生六種 siRNA。四種siRNA係針對人類eIF5Al產生（siRNA #1至 #4)。使用兩種siRNA作為控制組；一個siRNA針對套組中提供的 GAPDH，及 siRNA (siRNA #5)具有 eIF5A 專一的 siRNA#l之反向序列但其本身不針對eIF5A。根據製造商的 91763.doc -92- 200427695

使用說明，將siRNA產生。eIF5A及控制siRNA目標具有下列序列：siRNA #1 5’AAAGGAATGACTTCCAGCTGA 3，（SEQ ID NO:81) ； siRNA #2 5fAAGATCGTCGAGATGTCTACT 3f (SEQ ID NO:82) ； siRNA #3 5，AAGGTCCATCTG GTTGGTATT 3，(SEQ ID NO:83) ； siRNA #4 5’AAGCTGGACTCCTCCTACACA 3，(SEQ ID NO:84); siRNA #5 5，AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA 3丨(SEQ ID NO:85)。利用LipofectAMINE 2000以siRNA轉染視神經底盤細胞。當細胞的緻密度為40至70%及普通於轉染前三天以每孔7500個細胞植入8孔培養玻片上，將視神經底盤細胞轉染。藉由於 Opti-Mem(Sigma)中稀釋25_5皮莫耳siRNA至最終體積21.2 微升，製備8孔培養玻片的一孔所須之轉染培養基。將0.425 微升Lipofectamine 2000稀釋至最終體積21.2微升於 Opti-Mem中及於室溫培養7至10分鐘。而後將稀釋的 Lipofectamine 2000混合物加至稀釋的siRNA混合物並一起於室溫培養20至30分鐘。將細胞以無血清培養基清洗一次之後加入135微升無血清培養基至細胞並舖上42.4微升轉染培養基。將細胞放回生長室4小時。培養後，將65微升無血清培養基+30%FBS加至細胞。將欲用來做西方墨點分析的轉染siRNA進入細胞利用相同於8孔玻片的轉染條件實施，除了將體積增加2 · 3倍。轉染後，將視神經底盤細胞培養72小時之後以50 μΜ喜樹鹼（Sigma)及10 ng/ml TNF-a (Leinco Technologies)處理以引發細胞凋亡。而後收集細胞萃取物做西方墨點分析或將細胞檢視細胞凋亡。 91763.doc -93- 200427695 細胞凋亡之偵測將已受TNF- α及喜樹鹼處理24小時之轉染的細胞以 Hoescht 33258染色以便決定進行細胞凋亡的細胞百分比。簡而言之，將細胞以3 : 1之絕對甲醇及冰醋酸混合物固定及而後與Hoescht染色劑（0.5微克/毫升Hoescht 33258於 PBS)培養。於黑暗中培養10分鐘後，將染色溶液丟棄，並將分開培養玻片孔的室移開，並將玻片以去離子水清洗1 分鐘3次。清洗後，將數滴麥吉爾維恩緩衝液（Mcllvaine’s buffer)(0_021 Μ檸檬酸，0.058 M Na2HP04.7H20;pH 5.6)加至細胞並以蓋玻片覆蓋。將染色的細胞於利用UV濾光鏡的螢光顯微鏡下觀看。將具有明亮染色或碎裂的核之細胞記為細胞凋亡。每孔最少計算到200個細胞。也使用DeadEnd™ Fluorometric TUNEL(Promega)來摘測 DNA碎裂，其為細胞凋亡的細胞之特徵。Hoescht染色後，將培養玻片以蒸德水短暫清洗，並以浸入玻片兩次於PBS(137 mM NaCl，2.68 mM KC1，1·47 mM KH2P〇4, 8.1 mM Na2HP04)中 5分鐘進一步清洗，清洗之間於紙巾上將玻片吸乾。藉由將其浸入0.2% Triton X-100於PBS中5分鐘使細胞可滲透。而後再度藉浸入玻片於PBS中5分鐘清洗兩次，清洗之間於紙巾上將玻片吸乾。將25微升平衡緩衝液[200 mM二甲砷酸鉀（pH 6.6)，25 mM Tris-HCl(pH 6.6)，0.2 mM二硫秀克糖醇，0.25 mg/ml牛血清白蛋白，及2.5 mM氯化鈷]加至每孔及培養5至10分鐘。於平衡期間，藉由混合平衡緩衝液：核苷酸混合[50 μΜ 螢光素-12-dUTP，100 μΜ dATP，10 mM Tris_HCl(pH 7·6)，及 91763.doc -94- 200427695 1 mM EDTA]:末端去氧核苷酸轉移酶酵素（Tdt，25 U/ μΐ) 為45 : 5 ·· 1之比例，將30微升反應混合物為每孔製備。於平衡緩衝液中培養後，將30微升反應混合物加入每孔，並以蓋玻片覆蓋。使反應於黑暗中37°C進行1小時。藉由浸入玻片於2xSSC [0.3 M NaCl及30 mM檸檬酸鈉（pH 7·0)]中並培養15分鐘，將反應終止。而後將玻片藉浸於PBS中5分鐘清洗三次。藉以拭鏡紙揩拭孔附近將PBS移除，將一滴封片膠（Oncogene reasearch project，JA1750-4ML)加至各孔，並將玻片以蓋玻片覆蓋。將細胞於利用UV濾光鏡（UV-G 365, 濾光鏡組487902)的螢光顯微鏡下觀看以便計算Hoescht染色的核。具有明亮染色或碎裂的核之任何細胞記為細胞凋亡。利用相同視野，而後將細胞利用螢光素濾光鏡（綠色 H546，濾光鏡組48915)觀看，將任何核呈螢光明亮綠色記為細胞凋亡。視野中細胞凋亡的細胞百分比由利用螢光素濾光鏡計算的明亮綠色核之數目除以於UV濾光鏡下計算的核總數計算而得。每孔最少計算到200個細胞。蛋白質萃取及西方墨點藉由於PBS(8 g/L NaCl, 0.2 g/L KC1，1.44 g/L Na2HP045 及0.24 g/L KH2P04)中清洗細胞兩次及而後加入50微升溶解緩衝液[2%SDS、50 mM Ti*is-HCl(pH 7.4)]自生長於 24 孔盤上的視神經底盤細胞分離西方墨點用的蛋白質。將細胞溶解物收集於微量離心管中，煮沸5分鐘，而後於-20°C儲存直到預備使用。利用二辛可寧酸套組（BCA，bicinchoninc acid ; Sigma)決定蛋白質濃度。為了西方墨點，將5微克總 91763.doc -95- 200427695 蛋白質分離於12% SDS-聚丙烯醯胺膠體上。將分離的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜。而後將膜於阻斷液（5%脫脂奶粉，0.02%疊氮化鈉於PBS中）中培養一小時並於 PBS-T(PBS + 0.05%Tween-20)中清洗15分鐘三次。將膜於 PBS-T中於4°C儲存隔夜。第二天回溫至室溫後，將膜於1 微克/毫升聚乙烯醇中阻斷30秒。將膜於去離子水中清洗5 次及而後於5%牛奶於PBS之溶液中阻斷30分鐘。將初級抗體於5%牛奶於PBS之溶液中預先培養30分鐘之後與膜培養。使用的初級抗體為使用以1 : 20,000稀釋之抗-eIF5A(BD Transduction Laboratories)及抗-/5 -肌動蛋白（Oncogene)。將膜於PBS-T中清洗三次及與稀釋於1%牛奶於PBS中的適當HRP-聯結的二級抗體培養一小時。將墨點清洗並使用 ECL力口西方墨點债測套組（Amersham Pharmacia Biotech)來偵測過氧化酶聯結的結合抗體。結果由男性捐贈者年齡範圍為83歲（#506)至17歲（#5 17)所得的視神經盤建立兩個視神經底盤（LC，lamina cribrosa)細胞株。自人類視神經底盤分離的細胞具有相同寬平形態及具有於其他研究中觀察到的顯著細胞核（Lambert等人， 2001)。與其他團隊描述一致，LC細胞顯示對α -平滑肌肌動蛋白以及許多細胞外基質蛋白質包括細胞纖維結合素結合蛋白（圖82b)、層黏蛋白（圖82c)、膠原蛋白I、及膠原蛋白IV(資料未示）的免疫反應性（Clark等人，1995 ; Hernandez 等人，1998 ; Hernandez及 Yang，2000; Lambert 等人，2001)。 91763.doc -96- 200427695 LC細胞對膠質纖維酸性蛋白質（GFAP，glial fibrillary acidic protein)的負免疫反應性觀察也與先前發現一致（圖 82d)(Lambert等人，2001)。此等發現支持確認分離的細胞為LC細胞而非視神經盤興細胞。因為吾人相信TNF- α於青光眼的過程期間扮演重要角色，檢視LC細胞對TNF- α細胞毒性作用的敏感性。將緻密的LC細胞暴露至喜樹鹼、TNF-α、或喜樹鹼及TNF-α之組合48小時（圖83)。Hoescht染色顯示單獨TNF-α對LC細胞並非細胞毒素，以喜樹鹼處理造成LC細胞大約30%細胞死亡。然而，當將LC細胞以喜樹鹼及TNF-α兩者處理，觀察到協同增加於細胞凋亡，此處理48小時造成LC細胞之45% 死亡。此等結果代表當以喜樹鹼預先為細胞凋亡處理時， LC細胞能夠反應TNF- α的細胞毒性效果。 eIF5 Α已知為一種細胞分裂所必須之核質運送蛋白質且最近建議也包含於細胞凋亡期間。吾人檢視藉由喜樹鹼、或喜樹鹼加上TNF-α引發進行細胞凋亡的LC細胞中eIF5A 蛋白質的表現。eIF5A的表現在以喜樹鹼處理時未顯著改變，甚至或許稍微降低（圖84A)。然而，於8及24小時之喜樹鹼加上TNF- α處理後觀察到eIF5A蛋白質之顯著向上調節（圖84B)。此等結果代表eIF5A表現受暴露TNF- α而顯著引發且表現關聯至細胞凋亡的引發。此指出eIF5Α於TNF-α受體結合之細胞凋亡途徑下游中之角色。為了檢視LC細胞中TNF- α引發的細胞凋亡期間eIF5A表現的重要性，設計及藉試管中轉錄合成一系列四種針對 91763.doc -97- 200427695 eIF5A 的 siRNAs(siRNA#l 至 #4)。為了決定 siRNA於抑制 eIF5A蛋白質表現的效果，將LC細胞株#506及#517以各 siRNA轉染並於72小時後檢視細胞溶解物中eIF5A蛋白質的表現（圖85)。作為比較，也將細胞以針對GAPDH的siRNA 及/或具有與siRNA#l相同的化學組合物但不辨識eIF5A之控制組siRNA(siRNA#5)轉染。所有針對eIF5A的siRNAs於兩個LC細胞株中皆能夠顯著抑制eIF5A表現（圖85)。使用 GAPDH siRNA作為另一控制組，因為其不像控制組 siRNA#5僅异有siRNA#l的反向序列及不具有細胞目標，其為能夠抑制其目標蛋白質GAPDH表現之活性siRNA(資料未示）。所有四種針對eIF5A的siRNAs也能夠保護轉染的LC 細胞（#506)免於受TNF-α及喜樹鹼24小時處理引發的細胞凋亡（圖86)。利用Hoescht染色以偵測細胞死亡，發現 siRNAs(siRNA#l至#4)能夠降低LC細胞的細胞凋亡 59%(siRNA#l)、35%(siRNA#2)、50%(siRNA#3)、及 69%(siRNA#4)。有趣的是，針對GAPDH的siRNA也能夠降低LC細胞的細胞凋亡42%(圖86)。GAPDH已知除了其作為醣解酵素之角色，具有細胞功能包括於小腦神經元的細胞凋亡期間提議的功能（Ishitani及Chuang，1996; Ishitani等人，1996a ; Ishitani等人，1996b)。於類似實驗中，吾人也證實8^^八#1能夠降低1^細胞株#517反應1^1^«及喜樹鹼之細胞凋亡53%，代表eIF5 A siRNA對由不同神經盤分離的 LC細胞有保護性（圖87)。此等結杲指出eIF5A確實於細胞凋亡期間具有功能且可能於LC細胞中導致TNF- α引發的細 91763.doc -98- 200427695 胞凋亡之途徑中為重要的中間體。為了確認暴露至TNF- α及喜樹鹼之LC細胞死於典型細胞凋亡，利用末端脫氧核苷醯基轉移酶介導性dUTP-地高辛切口末端標記（TUNEL， terminal deoxynuedeotiodyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling)法原位評估DNA碎裂。以eIF5A siRNA(siRNA#l)或控制組 siRNA(siRNA#5)轉染後 3 天，將 LC 細胞（#506)以 TNF-α 及喜樹鹼處理24小時。也將細胞以Hoescht染色以幫助觀察細胞核。以控制組siRNA轉染的LC細胞有46%為對TUNEL染色為正反應，而以eIF5A siRNA#l轉染的LC細胞僅有8%為對正標記，代表eIF5AsiRNA提供大於80%保護免於細胞凋亡（圖88)。以eIF5AsiRNA#4得到類似的結果，其提供相對於控制組siRNA大於60%保護免於細胞凋亡（資料未示）。【圖式簡單說明】圖1描述大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A 3f端之核皆酸序列 (SEQ ID NO: 11)及衍生的胺基酸序列（SEQ ID NO: 12)。圖2描述大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A cDNA 5’端之核苷酸序列（SEQ ID NO:15)及衍生的胺基酸序列（SEQ ID NO:16)。圖3描述大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A全長cDNA之核苷酸序列（SEQ ID ΝΟ:1)。其胺基酸序列如（SEQ ID NO:2) 所示。圖4描述大鼠細胞凋亡專一的DHS cDNA 3’端之核苷酸序列（8£(^10 1^0:6)及衍生的胺基酸序列（8丑(^10 1^0:7)。圖5為大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A cDNA之全長核苷 91763.doc -99- 200427695 酸序列（SEQ ID NO:20)與人類elF-5A之核苷酸序列（SEQ ID NO:3)(登錄號 BC000751 或 NM—001970, SEQ ID NO:3)之比對。圖6為大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A cDNA之全長核：g：酸序列（SEQ ID NO:20)與人類eIF-5A之核苷酸序列（SEQ ID NO:4)(登錄號NM—020390, SEQ ID NO:4)之比對。圖7為大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A cDNA之全長核普酸序列（SEQ ID NO:20)與小鼠eIF-5A之核苷酸序列（登錄號 BC003 889)之比對。小鼠核苷酸序列（登錄號BC003889)為 SEQ ID NO:5。圖8為大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A衍生的全長胺基酸序列（SEQ ID NO:2)與人類eIF-5A衍生的胺基酸酸序列 (SEQ ID NO:21)(登錄號BC000751或NMJ)01970)之比對。圖9為大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5 A衍生的全長胺基酸序列（SEQ ID NO:2)與人類eIF-5A衍生的胺基酸酸序列 (SEQ ID NO:22)(登錄號NM—020390)之比對。圖10為大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A衍生的全長胺基酸序列（SEQ ID NO:2)與小鼠eIF-5A衍生的胺基酸酸序列 (SEQIDNO:23)(登錄號 BC003889)之比對。圖11為大鼠黃體細胞凋亡專一的DHS cDNA之部分長度核苷酸序列（SEQ ID NO:6之1-453殘基）與人類DHS之核苷酸序列（SEQ ID NO:8)(登錄號 BC000333，SEQ ID NO:8)之比對。圖12為大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A cDNA之限制酶 91763.doc -100- 200427695 圖譜（restriction map)。圖13為部分長度大鼠黃體細胞凋亡專一的DHS cDNA之限制酶圖譜。圖14為總RNA以32P-dCTP-標記的3’端之大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A cDNA债測之北方墨點（Northern blot)(上圖）及溴化乙啶（Ethidium bromide)染色的膠體（下圖）。圖15為總RNA以32P-dCTP-標記的3,端之大鼠黃體細胞凋亡專一的DHS cDNA偵測之北方墨點（上圖）及溴化乙啶染色的膠體（下_圖）。圖16描述一 DNA梯形條帶實驗，其中在以PGF-2ce注入後檢視過度排卵的大鼠黃體中細胞凋亡的程度。圖17為自細胞凋亡中大鼠黃體分離的基因組DNA之脂糖凝膠，顯示以PGF_2a處理大鼠後之DNA梯形條帶。圖18描述一 DNA梯形條帶實驗，其中於暴露至前列腺素 F-2a(PGF_2a，prostaglandin F_2o〇前以亞精胺處理大鼠中檢視過度排卵的大鼠黃體的分散細胞中細胞凋亡的程度。圖19描述一 DNA梯形條帶實驗，其中於以亞精胺及/或 PGF-2a處理的大鼠中檢視過度排卵的大鼠黃體中細胞凋亡的程度。圖20為大鼠基因組DNA以32P-dCTP-標記的部分長度大鼠黃體細胞凋亡專一的eIF-5A cDNA偵測之南方墨點 (Southern blot) 〇圖21描述pHM6，一哺乳類抗原決定位標示（epitope tag) 表現載體（Roche Molecular Biochemicals)。 91763.doc -101 - 200427695 圖22為自藉移除血清引發細胞凋亡之COS-7細胞分離的總RNA以32P-dCTP-標記的3’-未轉譯區域之大鼠黃體細胞凋亡專一的DHS cDNA偵測之北方墨點（上圖）及溴化乙啶染色的膠體（下圖）。圖23為一流程圖，說明瞬間轉染COS-7細胞之程序。圖24為COS-7細胞中以pHM6轉染後瞬間表現外來蛋白質之西方墨點。圖25說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的半胱天門冬胺酸蛋白酶活性反映增加的細胞凋亡。圖26說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的DNA碎裂反映增加的細胞〉周亡。圖27說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的細胞核碎裂反映細胞凋亡的偵測。圖28說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的細胞核碎裂反映增加的細胞祠亡。圖29說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由磷脂醯絲胺酸露出反映細胞凋亡的偵測。圖30說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的磷脂醯 91763.doc -102- 200427695 絲胺酸露出反映增加的細胞〉周亡。圖31說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時由增加的細胞核碎裂反映增加的細胞〉周亡。圖32說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞〉周亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時增加的細胞调亡。圖33說明當將COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染時Bcl-2的向下調節。上圖為考馬斯藍（Coomassie Blue)染色的蛋白質墨點；下圖為相對應的西方墨點。圖3 4為C Ο S - 7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞调亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染，利用Bcl-2作為探針之考馬斯藍染色的蛋白質墨點及相對應的西方墨點。圖35為COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染，利用c-Myc作為探針之考馬斯藍染色的蛋白質墨點及相對應的西方墨點。圖36為COS-7細胞以含有意義方向之全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A之pHM6瞬間轉染，當使用p53作為探針之考馬斯藍染色的蛋白質墨點及相對應的西方墨點。圖37為於COS-7細胞中表現pHM6-全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A利用抗-[HA]-過氧化酶探針之考馬斯藍染色的蛋白質墨點及相對應的西方墨點及於COS-7細胞中表現 pHM6-全長大鼠細胞凋亡專一的eIF-5A利用p53探針之考馬斯藍染色的蛋白質墨點及相對應的西方墨點。 91763.doc -103 - 200427695 圖38為自RKO細胞（SEQ ID NO:24)分離之人類eIF-5A2與人類eIF-5A2序列（SEQ ID NO:22)(基因庫登錄號 XM_ 113401)之比對。一致之序列亦示於SEQ ID NO:28。圖39為一圖表描述瞬間轉染後RKO及RKO-E6細胞中發生細胞凋亡的百分比。將RKO及RKO- E6細胞以pHM6-LacZ 或pHM6_eIF5Al瞬間轉染。以放線菌素（Actinomycin D)處理並以pHM6-eIF5Al轉染的RKO細胞顯示相對於未以放線菌素處理並受pHM6-LacZ轉染的細胞增加240%細胞凋亡。以放線菌素處理並以pHM6-eIF5Al轉染的RKO-E6細胞顯示相對於未以放線菌素處理並受pHM6-LacZ轉染的細胞增加10 5 %細胞洞亡。圖40為一圖表描述瞬間轉染後RKO細胞中發生細胞凋亡的百分比。將 RKO 細胞以 pHM6-LacZ、pHM6-eIF5Al、 pHM6_eIF5A2、或pHM6-截短的eIF5Al瞬間轉染。以 pHM6-eIF5Al轉染的細胞顯示相對於以pHM6-LacZ轉染的控制組細胞增加25%細胞凋亡。此增加對以pHM6-eIF5A2 或pHM6-截短的eIF5Al轉染的細胞不明顯。圖41為一圖表描述瞬間轉染後RKO細胞中發生細胞凋亡的百分比。將RKO細胞未轉染或以pHM6_LacZ或 pHM6-eIF5Al瞬間轉染。在校正轉染效率後，以 pHM6_eIF5Al轉染的細胞之60%呈細胞凋亡。圖42提供瞬間轉染後RKO細胞細胞凋亡之流式細胞儀 (flow cytometry)分析結果。將RKO細胞未轉染或以 pHM6-LacZ、pHM6_eIF5A卜 pHM6-eIF5A2、或 pHM6_截短 91763.doc -104- 200427695 的eIF5Al瞬間轉染。表中說明基於各閘波峰下面積計算進行細胞凋亡之細胞百分比。在校正未轉染細胞中背景細胞凋亡及轉染效率後，以pHM6-eIF5Al轉染的細胞之80%呈現細胞〉周亡。以 pHM6-LacZ、pHM6-eIF5 A2 或 pHM6 -截短的 eIF5Al轉染的細胞僅呈現細胞凋亡之背景量。圖43提供自RKO細胞以0.25微克/豪升放線菌素處理0、 3、7、24、及48小時萃取的蛋白質之西方墨點。上圖描述利用抗p-53作為初級抗體之西方墨點。中圖描述利用抗 eIF5Al作為初級抗體之西方墨點。下圖描述用於抗eIF5Al 墨點的膜以考馬斯藍染色之後用化學冷光偵測 (chemiluminescent detection)以證實等入料量。ρ53 及 eIF5Al皆受放線菌素處理向上調節。圖44為長條圖顯示胞凋亡專一的eIF-5A(eIF5a)及增殖 eIF-5A(eIF5b)兩者皆於心臟組織中表現。將心臟組織自接受冠狀動脈繞道移植（CABG，Coronary Artery Bypass Grafts)的病患取出。比較eIF5a(淡灰色長條）與eIF5b(深灰色長條）之基因表現量。X-轴為病患辨識編號。Y-軸為pg/ng 之 18s(皮克（picogram)之傳訊 RNA(message RNA)/毫微克之（nanogram)核糖體 RNA(Ribosomal RNA)18S) 〇

圖45為長條圖顯示胞凋亡專一的eIF-5 A(eIF5a)及增殖 eIF-5 A(eIF5b)兩者皆於心臟組織中表現。將心臟組織自接受心瓣更換的病患取出。比較elF5a(淡灰色長條）與 eIF5b(深灰色長條）之基因表現量。X-轴為病患辨識編號。 Y_軸為pg/ng之18s(皮克之傳訊RNA/毫微克之核糖體RNA 91763.doc -105 - 200427695 18S)。圖46為長條圖顯示局部缺血前心臟組織及局部缺血後心臟組織中由即時PCR測量細胞凋亡專一的6117_5入01?5幻對增殖eIF-5A(eIF5b)之基因表現量。γ-軸為pg/ng之18s(皮克之傳訊RNA/毫微克之核糖體rna 18S)。圖47概略地描述於心臟組織上進行的實驗。將心臟組織暴露至正常氧氣濃度並測量細胞凋亡專一的eIF_5A(eIF5a) 及增殖eIF-5A(eIF5b)之表現量。隨後，將傳遞至心臟組織之氧氣量降低，因此引發低氧症及局部缺血，及最後，於〜臟組織中心臟病猝發（Heart Attack)。將細胞〉周亡專一的 eIF_5A(eIF5a)及增殖eiF_5A(eIF5b)之表現量測量並與受局部缺血損害前心臟組織的表現量比較。圖48顯示引發局部缺血之前及之後心臟組織的ekGs。圖49顯示具有圖47中描述的實驗設計之實驗桌。圖50A-F報告病患資料，其中細胞凋亡因子eIF_5a(也記為 eIF-5al或於表中為iF5al)之量與IL_1 /3及IL-18之量比較。圖50A為由冠狀動脈繞道移植（cabG，Coronary Artery

Bypass Grafts)病患所得的資料表。圖50B為由心瓣更換病患所得的資料表。圖50C為曲線圖描述於CABG病患中細胞凋亡因子eIF-5a(因子5al)關聯至IL-18。圖50D為曲線圖描述於CABG病患中增殖eiF-5a(因子a2)關聯至IL-18。圖50E 為曲線圖描述於心瓣更換病患中細胞凋亡因子eiF-5a(因子 5al)關聯至IL-18。圖50F為曲線圖描述於心瓣更換病患中增殖eIF_5a(因子a2)關聯至IL-18。 91763.doc -106- 200427695 圖51為病患資料之表，由此得到圖50A_F使用的病患資料。圖52顯示以反意義細胞凋亡因子5a募聚體1、2、3處理後

由RKO細胞產生的蛋白質量。在以反意義細胞凋亡因子5 A 核普酸轉染後’ RK〇細胞產生較少細胞凋亡因子5 A以及較少 p53 〇圖53顯示螢光標記的反意義寡核苷酸之攝入。圖54-58顯示受反意義細胞凋亡因子5A寡核苷酸處理的細胞中進行細胞凋亡的細胞百分比相較於未以反意義細胞〉周亡因子5 A寡核苷酸轉染的細胞之減少。圖59顯示以TNF- α及/或喜樹驗（Camptothecin)處理視神經底盤（lamina cribrosa)細胞造成進行細胞凋亡的細胞數目增加。圖60及61顯示受反意義細胞凋亡因子5A募核苷酸處理的細胞中進行細胞凋亡的細胞百分比相較於未以反意義細胞调亡因子5 A暴核普酸轉染的細胞之減少。圖62顯示於金清存在或無血清下視神經底盤細胞攝入標記的siRNA。圖63顯示以細胞凋亡因子5a siRNA轉染的細胞產生較少細胞凋亡因子5a蛋白質，此外並且產生更多Bcl-2蛋白質。細胞洞亡因子5A表現的降低與BCL-2表現的增加有關聯。圖64顯示以細胞凋亡因子5a siRNA轉染的細胞產生較少細胞〉周亡因子5 a蛋白質。圖65-67顯示以細胞凋亡因子5a siRNA轉染的細胞在暴 91763.doc -107- 200427695 露至喜樹鹼及TNF- α後具有較低進行細胞凋亡之細胞百分比。圖68為來自說明於圖67及實例13的實驗中以siRNA轉染並以喜樹鹼及TNF- α處理後Hoescht-染色的視神經底盤細胞株# 5 0 6之照片。；周亡細胞為較鮮明染色的細胞。〉周亡細胞因染色質之濃縮使其具有較小之細胞核並形狀不規則。

圖69顯示經IL-1暴露的以細胞凋亡因子5A轉染的HepG2 細胞比未轉染細胞分泌較少TNF- α。 I 圖70顯示人類細胞凋亡因子5a之序列（SEQ ID ΝΟ:29)及本發明之 5 siRNAs之序列（SEQ ID ΝΟ:30、3 卜 32、33及 34)。圖71顯示人類細胞凋亡因子5a之序列（SEQ ID ΝΟ:29)及本發明之5 siRNAs之序列（依出現順序，分別為SEQ ID NO:35_40)。圖72顯示三個反意義寡核苷酸（SEQ ID NO:25-27)瞄準針對人類eIF5Al之結合位置。其核苷酸全長為SEQ ID NO: 19。圖73a及b顯示人類eIF5Al(細胞凋亡因子5A)對人類 -φ eIF5A2(增殖eIF55A)之核苷酸比對（依出現順序，分別為 SEQIDNO:41及42)及胺基酸比對（依出現順序，分別為SEQ ID NO:43及 22) 〇圖74A提供西方墨點之照片，其中若未抑制製造TNF- α 於轉染的ΗΤ-29細胞中，針對eIF5Al的siRNAs已降低。圖 74B提供ELISA的結果。圖75提供ELISA的結果。相較於控制組細胞，以針對 eIF5Al的siRNAs處理的細胞中TNF- α製造減少。 91763.doc -108- 200427695 圖76顯示U-937分化實驗之時程。見實例16。圖77顯示西方墨點的結果，顯示於單核球（monocyte)分化及隨後TNF-α分泌的期間將eIF-5Al向上調節。圖78描述幹細胞分化及利用針對eIF5Al的siRNAs抑制細胞激素製造。圖79為長條圖顯示產生IL-8以反應TNF-6K以及反應干擾素。本圖顯示針對eIF5 A的siRNAs阻擋幾乎所有反應干擾素產生的IL_8以及顯著量產生的IL-8為干擾素及TNF合併處理的結果。圖80為另一個長條圖顯示產生IL-8以反應TNF- α以及反應干擾素。本圖顯示針對eIF5 Α的siRNAs阻擋幾乎所有反應干擾素產生的IL-8以及顯著量產生的IL-8為干擾素及TNF 合併處理的結果。圖8 1為以INF r處理8及24小時之HT-29細胞的西方墨點。此墨點顯示HT-29細胞中反應干擾素τ，細胞凋亡eIF5A 之向上調節（於8小時4倍）。圖82為藉免疫瑩光（immunofluorescence)定性視神經底盤細胞。自8 3歲老男性的視神經盤分離的視神經底盤細胞 (#506)藉免疫螢光定性。初級抗體為a)肌動蛋白；b)纖維結合素結合蛋白（fibronectin) ; c)層黏蛋白（laminin); d)GFAP。所有照片皆於400倍放大拍攝。圖83 :視神經底盤細胞株#506之細胞凋亡以反應用喜樹鹼及TNF- α處理。將視神經底盤細胞株#506細胞以每孔 40，Θ00個細月包植入8孑L培養片上。三天後將融合性IX細胞以 91763.doc -109- 200427695 1 0 ng/ml TNF- a、50 μΜ喜樹驗、或 10 ng/ml TNF - α 加上 50 μΜ喜樹鹼處理。將等體積DMSO(喜樹鹼的媒介控制組）加至未處理的控制組細胞。處理後48小時將細胞以Hoescht 33258染色並以利用UV濾光鏡的螢光顯微鏡觀看。將具有明亮染色的聚集或碎裂的核之細胞記為細胞凋亡。圖84 :於喜樹鹼或TNF- α加上喜樹鹼處理期間eIF5A之表現。將視神經底盤細胞株#506細胞以每孔40,000個細胞植入24孔盤上。三天後將LC細胞以50 μΜ喜樹鹼或10 ng/ml TNF-α加上50 μΜ喜樹鹼處理並於1、4、8、及24小時後收集蛋白質溶解物。將等體積DMSO加至控制組細胞作為媒介控制組並於1及24小時後收集細胞溶解物。藉SDS-PAGE將來自各樣品之5微克蛋白質分離，轉移至PVDF膜，並以抗 -eIF5 Α抗體做西方墨點。藉化學冷光偵測結合的抗體並曝光至X_光底片。而後將膜脫附並重新以抗-/5-肌動蛋白墨點作為内部入料量控制。圖85 :以siRNA轉染後於視神經底盤細胞株#506及#5 17 中eIF5A之表現。將視神經底盤細胞#506及#517細胞以每孔 10，000個細胞植入24孔盤上。三天後將LC細胞以GAPDΗ siRNA、eIF5A siRNAs #1-4、或控制組siRNA #5轉染。轉染後三天，收集蛋白質溶解物並藉SDS-PAGE將來自各樣品之5微克蛋白質分離，轉移至PVDF膜，並以抗-eIF5A抗體做西方墨點。藉化學冷光偵測結合的抗體並曝光至X-光底片。而後將膜脫附並重新以抗-/S -肌動蛋白墨點作為内部入料量控制。 91763.doc -110- 200427695 圖86 :以eIF5 A siRNAs轉染並以TNF- α及喜樹鹼處理的視神經底盤細胞株#506細胞之細胞凋亡。將視神經底盤細胞株#5 06細胞以每孔75 00個細胞植入8孔培養片上。三天後將 LC細胞以 GAPDH siRNA、eIF5A siRNAs #1-4、或控制組 siRNA #5轉染。轉染後72小時，將轉染的細胞以10 ng/ml TNF- α加上50 μΜ喜樹驗處理。二十四小時後將細胞以 Hoescht 3 3258染色並以利用UV濾光鏡的螢光顯微鏡觀看。將具有明亮染色的聚集或碎裂的核之細胞記為細胞凋亡。此圖代表平均n=4獨立實驗。圖87 ··以eIF5 A siRNAs轉染並以TNF_ α及喜樹鹼處理的視神經底盤細胞株#5 17細胞之細胞凋亡。將視神經底盤細胞株#517細胞以每孔75 00個細胞植入8孔培養片上。三天後將LC細胞以eIF5A siRNAs #1或控制組siRNA #5轉染。轉染後72小時，將轉染的細胞以10 ng/ml TNF- α加上50 μΜ喜樹鹼處理。二十四小時後將細胞以Hoescht 33258染色並以利用UV濾光鏡的螢光顯微鏡觀看。將具有明亮染色的聚集或碎裂的核之細胞記為細胞凋亡。將兩次獨立實驗的結果代表於此。圖88 :以eIF5A siRNAs #1轉染並以TNF- α及喜樹鹼處理的視神經底盤細胞株#506細胞之TUNEL標記。將視神經底盤細胞株#5 06細胞以每孔7500個細胞植入8孔培養片上。三天後將LC細胞以eIF5 A siRNAs #1或控制組siRNA #5轉染。轉染後72小時，將轉染的細胞以10 ng/ml TNF- α加上 50 μΜ喜樹驗處理。二十四小時後將細胞以Hoescht 33258 91763.doc -Ill - 200427695 染色並利用末端脫氧核苷醯基轉移酶介導性dUTP-地高辛切口末端標記（TUNEL， terminal deoxynuedeotiodyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling) 法原位評估DNA碎裂。圖A代表藉螢光顯微鏡利用螢光濾光鏡觀察的玻片以看見細胞凋亡的碎裂DNA之TUNEL-標記。圖B代表相同玻片藉經由UV濾光鏡觀察以看見Hoescht 染色的核。結果代表兩次獨立實驗。所有照片皆於400倍放大拍攝。圖89描述針對eIF5Al的siRNAs之設計（依出現順序依順為 SEQ ID N〇:44-5 8)。該 siRNAs具有 SEQ ID NO:45、48、 51、54及56。該核甞酸序列全長示於SEQ ID NO :29。 91763.doc -112- 200427695 序列表 <110> SENESCO TECHNOLOGIES, INC. <12Q>反意義寡核苷酸或siRNA於抑制eIF-5Al之用途

<130> 13.947-P <140> 093105908 <141> 2004-03-05 <150〉 10/383,614 <151> 2003-03-10 <150> 10/277,969 <151> 2002-10-23 <150> 10/200,148 · <151> 2002-07-23 <150> 10/141,647 <151> 2002-05-07 <150> 09/909,796 <151> 2001-07-23 <150> 60/451,677 <151> 2003-03-05 <150> 60/476,194 <151> 2003-06-06 <150> 60/504,731 <151> 2003-09-22 <160> 85 <170> 軟體Patentln 3.2版

<210> 1 <211> 1139 <212> DNA <213>大鼠 <220> <221> CDS <222> (33)..(494) <400> 1 caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5 91763.doc 53 200427695 gag aca gga gat gca ggg gcc tea gee acc etc cca a匕g cag tgc tea

Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser 10 " 15 20 gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg etc aag ggc egg cca tgt aag

Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lvs Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35 at:c gtc gag atg tet act teg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55 gtc cat eta gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gac

Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 50 65 70 ate tgc ccg teg act cat aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat

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Gly L*/s Glu Ils Glu Gin Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie 120 125 130 135 aca gtg ctg tee gcc atg aca gag gag gca get gtt gca ate aag gcc

Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 140 145 150 atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc Met Ala Lys atgagcctac agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat: agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgaccc ctcctcaggc 91763.doc 101 14 9 197 245 293 341 339 437 485 534 594 654 714 774 834 894 954 1014 200427695 acctgggaag gccttgcccc catgggctct accctttcct gtgggctttc tccccgacac 1074 atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa 1134 aaaaa 1129 <210> 2 <2X1> 154 ' ' * "

<212> PRT <213>大鼠 <400> 2

Met Ala Asp As-p Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 ·’.— ·： 5 10 15

Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly He Asp lie Phe 50 55 60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 - 70 75 80

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly lie Gin Asp 85 、 90 95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu 工le Glu Gin Lys Tyr Asp 115 120 125

Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met: Thr Glu Glu 130 135 140

Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 145 150

<210> 3 <211> 462 <212> DNA <213>獄人 <400> 3 atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaacggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 91763.doc 200427695 gtcgagatgt attgacatct: gtccccaaca ctgctccagg aaggagattg atgacagagg ctacttcgaa ttactgggaa tcaaaaggaa acagcgggga agcagaagta aggcagctgt gactggcaag gaaatatgaa tgacttccag ggtacgagag cgactgtgga tgcaatcaag cacggccacg gatatctgcc ctgattggca gaccttcgtc gaagagatcc gccatggcaa ccaaggtcca cgtcaactca tccaggatgg tccctgaggg tgatcacggt aa tctggttggt 130 taatatggat 240 gtacctatca 300 agaccttggc 360 gctgtctgcc 420 462 <210> 4 <211> 460

<212> DNA <213>現代人 <400> 4 atggcagacg cagtgctcgg gtggagatgt attgatattt gttccaaata ctgctgacag aaagaaatag atgagtgaag aaattgattt cctcgcgcaa caacttccaa tcacgggcaa ttaagagaaa. aaactggtga agggaaaata aatatgctgt cactactgga aaacggcttc aactggaaag aaaatatgaa tgattatcaa agttcgtgag caatgcaggt agccataaaa gatgccgggg gtggtgctca catggtcatg gatatttgtc ctgatatgca gatcttaaac gaagatgtac ccctgcaaat cttccagcac aaggacgacc ccaaggttca cttctactca ttcaagatgg tgccagaagg aggtgtctgt ttaccctatg 60 atgcaaaata 120 ccttgttgga 180 caacatggac 240 ttacctttcc 300 tgaactaggc 360 catgtgtgca 420 460

<210> 5 <211> 462 <212> DNA <213>大鼠 <400> 5 atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc 180 attgacattt: ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 <210> 6 <211> 606 <212> DNA <213〉大鼠 <220> <221> CDS <222> (1) . . (453)

<400> S get gtg tat: tat egg gee cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48

Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His lie Pro Val Leu Ser Pr。 1 5 10 15 -4- 91763.doc 96 200427695 gca etc aca gac ggc tea ctg ggt gac atg ate ttt ttc cat tee tat

Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met lie Phe ?he His Ser Tyr 20 25 30 ^ aaa aac cca ggc ttg gtc ctg. gac ate gtt gaa gac ctg egg etc ate

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Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gin Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140 aga get gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggettetg Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150 ccacaccttt: atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa aaa <210> 7 <211> 151 <212> PRT <2i3>大鼠 <400> 7

Ala Val Tyr Tyr Trp Ala Kis Lys Asn His lie Pro Val Leu Ser Pro 15 10 15

Ala Leu Thr Asp Gly Ser.Leu Gly Asp Met lie Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30 91763.doc 144 192 240 283 336 384 432 483 543 603 606 200427695

Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp lie Val Glu Asp Leu Arg Leu 工Is 35 40 45

Asn Met Gin Ala lie Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 50 55 60

Gly Gly Val Val Lys His Kis lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 70 75 80

Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly 35 90 95

Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu A丄a Val Ser Trp Gly Lys lie 100·一 .. 105 110

Arg Met Asp Ala Gin Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ssr Leu Val 115 - 120 125

Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gin Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140

Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150 <210> 8 <211> 453 <212> DNA 獄人 <400> 8 tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac 60 ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac 120 atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg 180 atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac 240 ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt 300 gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag 360 gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag 420 atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453

<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213>人造序列· <220> . <223>人造序列之說明：合成的引子 91763.doc 200427695 <220> <221>修飾的驗基 <222> (12) <223> a, c, c or g <400> 9 tcsaarachg gnaagcaygg <210> 10 <211> 42

<212> DMA <213 >人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的引子 <400> 10 - gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt <210> 11 <211〉 972 <212> DNA <213>大鼠 <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 11 teg aag acc ggt aag cac ggc cat gee aag gtc cat ctg gtt ggt att

Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie 1 5 10 15 gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat ate tgc ccg teg act cat

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50 55 SQ gag gac ett cgt ctg cct gag gga gac ett ggc aag gag att gag cag

Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin 6S 70 75 80 91763.doc 200427695 aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate aca gtg ctg tee gee atg 283

Lvs Tyr Asp Cys Gly Glu Glu 工Is Leu 工le Thr Val Leu Ser Ala Met " " 85 90 95 aca gag gag gca get gtt gca ate aag gee atg gca aaa taactggctt 337

Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 100 105 ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc 397 tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggtttccct 457 caccccttca aactgtcggg gagaccccgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga 517 gggagccatg gccctggt.ga agctacctgc ctcttctctc gcagccccga tgggggaaag 577 ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggtccc cctctccctt tttcttttta attcaatttg 637 gaatcagaaa gctgtggatt-ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca 697 tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca 757 gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat: aggggtgaca agaagaggag 817 999999a999 gacacgatcc ctcctcaggc atctigggaag gcctitgcccc catgggcttt 877 accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact 937 acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213>大鼠 <400> 12

Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie 15 10 15

Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 工le Cys Pro Ser Thr His 20 25 30

Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly 35 40 45 lie Gla Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60

Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu 工le Glu Gin S5 70 75 80

Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95 91763.doc 200427695

Ala Met: Ala Lys 24

Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys 100 105

<210> 13 <211> 24 <212> DNA <213>人齡列 <220> <223>人造序列之說明：合成的引子 •-二 <400> 13 · caggtctaga gttggaatcg aagc <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223 >人造序列之說明：合成的引子 <400> 14 atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc 30

<210> 15 <211> 489 <212> DNA 大鼠 <220> . <221> CDS <222> (33〉. .（485) <400> 15 caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5 gag aca gga gat gca ggg gcc tea gcc acc ttc cca atg cag tgc tea 101

Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser 10 15 20 * gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg geg etc aag ggc egg cca tgt aag 149

Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35 ^ 91763.doc 197 200427695 197 acc gtc gag atg tct act teg aag act ggc aag cat ggc cat gee aag IIs Val Glu Met. Ser Thr Ser Lvs Thr Gly Lys His Gly Kis Ala Lys 40 45 50 55 gtc cat ctg gtt ggt att gat act ttt act ggg aag aaa tat gaa gat Val His Leu Val Gly lie Asp Ila Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 60 65 70 ate tgc ccg teg act cat aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn 75 80 35 gat ttc cag ctg att ggc ate cag gat ggg tac eta tee ctg etc cag Asp Phe Gin Leu lie Gly lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser* Leu Leu Gin 90 - 95 100 gac agt ggg gag gta ega gag gac ett cgt ctg cct gag gga gac ett Asp Ser Gly Glu \^al Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu 105 - 110 115 ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie 120 125 130 135 aca gtg ctg tee gee atg aca gag gag gca get gtt gca ate aag get: Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 140 145 150 egag 245 293 341 389 437 485 489

<210> 16 <211> 151 <212> PRT <213>大鼠 <400> 16

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 15 10 15

Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys He Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe

50 55 SO

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly lie Gin Asp 85 90 95 10- 91763.doc 200427695

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu A 100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu 工le Glu Gin Lys Tyr Asp 115 120 125

Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140

Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 145 150 <210> 17 <211> 20 <212> DNA . 。…人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的引子 <400> 17 gtctgtgtat tattgggccc 20

<210> 18 <211> 42 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的引子 <400> 18 . gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42

<210> 19 <211> 1299 <212> DNA <213>現代人 <400> 19 ggcacgaggg cggcggcggc ggtagaggcg gcggcggcgg cggcagcggg ctcggaggca 60 gcggttgggc tcgcggcgag cggacggggt cgagtcagtg cgttcgcgcg agttggaatc 120 gaagcctctt aaaatggcag atgacttgga cttcgagaca ggagatgcag gggcctcagc 180 caccttccca atgcagtgct cagcattacg taagaatggc tttgtggtgc tcaaaggccg 240 gccatgtaag atcgtcgaga tgtctacttc gaagactggc aagcacggcc acgccaaggt 300 ccatctggtt ggtattgaca tctttactgg gaagaaatat gaagatatct gcccgtcaac 360 tcataatatg gatgtcccca acatcaaaag gaatgacttc cagctgattg gcatccagga 420 -11 - 91763.doc 200427695 tgggtaccca gggagacctt: ggtgctgcct ggctcccagg cgagcctggc cgttttattt gctcccttgg cctcacacta tttttttctt aaatggtcct ttaccctgag tcactgctcc ggcaaggaga gccatgacag atggcggtgg ctggctctgg tggttttccc ccaggagcga cagccctggt tttttttttt tgtgccctcc caccacccca aggacagcgg ttgagcagaa aggaggcagc tggcagcagt cccggtccta caccccctca gcgaagctgt gggggagaag tttaaaCcca ccactcaccc acagactggg ggaggtacga gtacgactgt tgttgcaatc gatcctctga agctggactc atctgtcggg ggccttggtg ggggtgggtg acctggaatc ctggtctggt gaccagcccc gaggaccttc ggagaagaga aaggccatgg acctgcagag ctcctacaca gagcccctgc aagctgccct ctgcttgtgg agaaagcggt cccctgttgc ctcgcctgcc gtctccctga tcctgatcac caaaataact gccccctccc atttatttga ccttcaccca cctcttctcc ggattctggc ccatagccct tgtgtctctc 480 540 500 660 720 730 840 900 960 1020 1080 cccaaacccc tctagatggg gagggaagag gaggagaggg gaggggaccc gccccctcct 1140 caggcatctg ggagggccct gcccccatgg gctttaccct tccctgcggg ctctctcccc 1200 gacacatttg ttaaaatcaa acctgaataa aactacaagt ttaatatgaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1299 <210> 20 -<211> 462 -

<212> DNA <213>大鼠 <400> 20 atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca agggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggt 180 attgatattt; ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taacatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa tgatttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaggg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtccgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462

<210> 21 <211> 154 <212> PRT <213>現代人 <400> 21 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5 Thr Phe ?ro Met Gin Cys Ser 20 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 35 Gly Lys Kis Gly His Ala Lys 50 55 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 65 70

Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 10 15

Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 25 30

He Val 40 Val His lie Cys

Glu Met Ser Thr 45 Leu Val Gly lie 60 Pro Ser Thr His 75

Ser Lys Thr

Asp Ils Phe

Asn Met Asp 80 12- 91763.doc 200427695

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp ?he Gin Leu Ila Gly lie Gin Asp 85 90 95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu ' 100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu 工le Glu Gin Lys Tyr Asp 115 120 125

Cys Gly Glu Glu 工le Leu lie Thr V*al Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140

Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 22 <211> 153 -

<212> PRT 現代人 <400> 22

Met Ala Asp Glu lie Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15

Thr Tyr Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val ^ 20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys lie Val Glu Mst Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp 工le Phe 50 55 60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 工le Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80

Val Pro A,sn lie Lys Arg Asn Asp Tyr Gin Leu lie Cys lie Gin Asp 85 90 95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110

Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu lie Glu Gly Lys Tyr Asn 115 120 125

Ala Gly Glu Asp Val Gin Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 135 140

Tyr Ala Val Ala lie Lys Pro Cys Lys 145 150 -13 - 91763.doc 200427695

<210> 23 <211> 154 <212> PRT <213>小鼠 <400> 23

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 15 10 15

Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Giy Phe Val Val 20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys L*/s lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 :.一.-

Gly Lys His Gly'His Ala Lys Val His Leu Val Gly 工le Asp lie Phe 50 55 SO

Thr Gly Lys Lys Tyr Gl-u Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly 工le Gin Asp 85 90 95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu 工le Glu Gin Lys Tyr Asp 115 120 125

Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140

Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 145 150

<210> 24 t <211> 153 <212> PRT <213>現代人 <400> 24

Met Ala Asp Glu lie Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15

Thr Tyr Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe 50 55 60 14- 91763.doc 200427695

Thr Glv hys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Tyr Gin Leu lie Cys lie Gin Asp 35 90 95

Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110

Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu lie Glu Gly Lys Tyr Asn 115 120 125

Ala Glv Glu Asp Val Gin Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 _ 135 140

Tyr Ala Val Ala lie Lys Pro Cys Lys 145 _ 150

<210> 25 <211> 20 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 25 gacttggact tcgagacagg 20

<210> 26 <211> 19 <212> DNA <213>人造序列„ <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 26 19 15 - gcacggccac gccaaggtc

<210> 27 <2il> 20 <212> DNA <213>人造序列 <220> <U3>人造序列之說明：合成的寡核昔酸 91763.doc 200427695 <400> 27 ggacagcggg gaggtacgag 20

<210> 28 <211> 153 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：舉例之共有序列 <400> 28 ..

Met Ala Asp Glu 'lie Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 " * 15

Thr Tyr Pro Met Gin Cys Ser Ala Lau Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe 50 55 60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Tyr Gin Leu 工le Cys lie Gin Asp 85 90 95

Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110

Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu lie Glu Gly Lys Tyr Asn 1X5 120 125 *

Ala Gly Glu Asp Val Gin Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 135 140

Tyr Ala Val Ala lie Lys Pro Cys Lys 145 150

<210> 29 <211> 1309 <212> DNA <213>現代人 <400> 29 ggcacgaggg tagaggcggc ggcggcggcg gcagcgggct cggaggcagc ggttgggctc 60 gcggcgagcg gacggggtcg agtcagtgcg ttcgcgcgag ttggaatcga agcctcttaa 120 16- 91763.doc 200427695 aatggcagat gcagtgctca cgtcgagatg tattgacatc tgtccccaac gacttggact gcattacgta tctacttcga tttactggga atcaaaagga tcgagacagg agaatggctt: agactggcaa agaaatatga atgacttcca agatgcaggg tgtggtgctc gcacggccac agatatctgc gctgattggc gcctcagcca aaaggccggc gccaaggtcc ccgccaactc atccaggatg ccttcccaat 130 catgtaagat 240 atctggttgg 300 ataatatgga 360 ggtacctatc 420 actgctccag gacagcgggg aggtacgaga ggaccttcgt ctccctgagg gagaccttgg 480 caaggagatt gagcagaagt acgactgtgg agaagagatc ctgatcacgg tgctgtctgc 540 catgacagag gaggcagctg ttgcaatcaa ggccatggca aaataactgg ctcccaggat 600 ggcggtggtg gcagcagtga tcctctgaac ctgcagaggc cccctccccg agcctggcct 6〇0 ggctctggcc cggtcctaag ctggactcct cctacacaat: ttatttgacg ttttattttg 720 gttttcccca ccccctcaat ctgtcgggga gcccctgccc ttcacctagc tcccttggcc 780 aggagcgagc gaagctgtgg ccttggtgaa gctgccctcc tcttctcccc tcacactaca 840 gccctggtgg gggagaaggg ggtgggtgct gcttgtggtt tagtcttttt ttttttcttt 900 tttttttttt aaattcaatc tggaatcaga aagcggtgga ttctggcaaa tggtccttgt 960 gccctcccca ctcatccctg gtctggtccc ctgttgccca tagcccttta ccctgagcac 1020 caccccaaca gactggggac cagccccctc gcctgcctgt gtctctcccc aaaccccttt 1080 aga匕ggggag ggaagaggag gagaggggag gggacctigcc ccctcctcag gcatctggga 1140 gggccctgcc cccatgggct ttacccttcc ctgcgggctc tctccccgac acatttgtta 1200 aaatcaaacc tgaataaaac-tacaagttta atatgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1309 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213>獄人 <400> 30 " aaaggaatga cttccagctg att 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213>現代人 <400> 31 aagatcgtc,g agatgtctac ttc 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213>現代人 <400> 32 aaggtccatc tggttggtat tga 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213>現代人 91763.doc 17- 200427695 <400> 33 aagctggact cctcctacac aat 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA<213>現代人 <400> 34 aaagtcgacc ttcagtaagg act 23 <210> 35 <211> 20 .:-: .. <212> DNA<213>現代人 <400> 35 cctgtctcga agtccaagtc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA<213>現代人 <400> 36 gacttggact tcgagacagg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA<213>現代人 <400> 37 ggacct：{：gg.c gtggccgtgc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA<213>現代人 <400> 33 gcacggccac gccaaggtcc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA<213>現代人 91763.doc 18- 200427695 <400> 39 ctcgtacctc cccgctctcc 20

<210> 40 <211> 19 <212> DNA <213>現代人 <400> 40 ggacagcggg gaggtacga 19

<210> 41 <211> 465 <212> DNA <213>現代人 <400> 41 - atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 130 attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300 ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420 acgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aataa 465

<210> 42 <211> 462 <212> DNA <213>現代人 cttccagcac ttaccctatg 60 aaggacgacc atgcaaaata 120 ccaaggttca ccttgttgga 180 cttctactca caacatggat 240 ttcaagatgg ttacctttcc 300 tgccagaagg tgaactaggc 260 aggtgtctgt catgtgtgca 420 aa 462 <400> 42 atggcagacg aaattgattt cagtgctcgg ccttgcgcaa gtggagatgt caacttccaa attgatattt tcacgggcaa gttccaaata ttaagagaaa ctgctgacag aaactggtga aaagaaatag agggaaaata atgagtgaag aatatgctgt cactactgga gatgccgggg aaacggcttc gtggtgctca aactggaaag catggtcatg aaaatatgaa gatatttgtc tgattatcaa ctgatatgca agttcgtgag gatcttaaac caatgcaggt gaagatgtac agccataaaa ccctgcaaat

<210> 43 <211> 154 <212> PRT <213>現代人 <400> 43

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 " 5 10 15 19- 91763.doc 200427695

Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gl'/ Phe Val Val 20 25 30

Leu Lys Gly Trp Pro Cys Lys 工le Val Glu Met Ser Ala Ser L»ys Thr 35 40 45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe * 50 * 55 60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 30

Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly lie Gin Asp 85 90 95 · ·一 .-

Gly Tyr Leu Ser-Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Pro Glu Asp Leu 100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly* Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp 115 120 125

Cys Gly Glu Glu lie Leu 工le Thr Leu Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140

Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 145 150 ^ -

<210> 44 <211> 21 <212> DNA <2]*3>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 44 , aaaggaatga cttccagctg a <210> 45 <211> 23 <212> DNA' <213>人造賴 <220> <223>合併的DNA/RNA分子之說明··合成的寡核苷酸 <220> <223>人造序列之說明··合成的寡核苷酸 20- 91763.doc 200427695 <400> 45 aaaggaauga cuuccagcug att <210> 46 <211> 23

<212> DNA <213〉人造序列 <220> 合倂的DNA/RNA分子之說明：合成的寡核苷酸 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 46 - ucagcuggaa gucauuccuu-utt

<210> 47 <211> 21 <212> DNA <213>人造序列 <220> <22 3〉人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 47 aagatcgtcg agatgtctac t

<210> 48 <211> 23 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>合倂的DNA/RNA分子之說明：合成的寡核苷酸 <220> 人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 48 aagaucgucg agaugucuac utt -21 - 91763.doc 200427695 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213 >人造序列 <220> <22 3>合倂的dna/rna分子之說明：合成的寡核苷酸 <220> _ <223 >人造序列之說明：合成的寡核音酸 <400> 49 aguagacauc ucgacgaucu utt 23 <210> 50 - <211> 21 ' <212> DNA <2i3>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 50 - aaggtccatc tggttggtat t 21 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223>合倂的DNA/RNA分子之說明：合成的寡核苷酸 <220><22 3〉人造序列之說明·合成的寡核苷酸 <400> 51 aagguccauc ugguugguau utt 23

<210> 52 <211> 23 <212> DNA ⑴人造序列 91763.doc 22- 200427695 <220 > <223>合併的DNA/RNA分子之說明：合成的寡核音酸 <220> 人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 52 aauaccaacc agauggaccu utt

<210> 53 <211> 21 <212> DNA <213>人造序列 * <220> - <223>人造序列之說明··-合成的寡核苷酸 <400> 53 aagctggact ccccctacac a

<210> 54 <211> 23 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>合併的DNA/RNA分子之說明：合成的寡核苷酸 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 54 aagcuggacu ccuccuacac att <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213〉人造序列 <220> 合倂的DNA/RNA分子之說明：合成的寡核苷酸 <220 > <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 -23- 91763.doc 200427695 <400> 55 uguguaggag gaguccagcu utt

<210> 56 <211> 21 <212> DNA <213>人造序列 <220> 人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 56 . aaagtcgacc ttcagtaagg a

<210> 57 <211> 23 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>合倂的DNA/RNA分子之說明··合成的寡核苷酸 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 57 aaagucgacc uucaguaagg att <210> 58 <211> 23 <212 > DNA. <213>人造序列 <220> 合倂的DNA/RNA分子之說明：合成的寡核苷酸 <220> 人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 58 uccuuacuga aggucgacuu utt 24- 91763.doc 200427695 <210> 59 <211> 26

<212> DNA <213>人造序列 <220> 人造序列之說明：合成的引子 <400> 59 gccaagctta atggcagatg atttgg 26

<210> 60 <211> 25 <212〉 DNA 人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明合成的引子 <400> 60 ctgaattcca gttattttgc catgg 25 <210> 61 <211> 27 "

<212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的引子 <400> 61 aatgaattcc gccatgacag aggaggc 27

<210> 62 <211> 42 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的引子 <400> 62 gcgaagcttc catggctcga gttttttttt ttttttttztt tt 42 25- 91763.doc 200427695

<210> 63 <211> 20 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 62 cccgtctcga agtccaagtc

<210> β4 <211> 20 <212> DNA <213>人造序列— <220> - <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 64 ggaccttggc gtggccgtgc <210> 65 <211> 20 "

<212> DNA <213 >人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 65 ctcgtacctc cccgctctcc

<210> 66 <211> 20 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 〇6 cgtaccggta cggttccagg 26- 91763.doc 200427695

<210> 67 <211> 20 <212> DNA <213〉人造序列 <2 2 0 > — <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 6Ί ggaccttggc gtggccgtgc 20

<210> 63 <211> 17 <212> PRT <213>人造觸 <220> -<223>人造序列之說明：合成的生月太 <400> 63

Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr 1 5 10 15

Asp

<210> 69 <211> 29 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 69 aaaggaatga cttccagctg acctgtctc 29

<2i〇> 70 <211> 29 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 70 aatcagccgg aagtcattcc tcccgtctc 29 27- 91763.doc 200427695 <210> <211> <212> <213>

71 29 DNA

人造序歹U <220>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 71 aagatcgtcg agatgtctac tcctgtctc 29

<210> 72 <211> 29 <212> DMA <213 >人造序列 <220><223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 72 aaagtagaca tctcgacgat ccctgtctc 29 <210> 73 <211> 29 <212> DNA<213 >人造序列 <220><223>人造序列之說明合成的寡核苷酸 <400> 73 . aaggtccatc tggttggtat tcctgtctc 29 <210> 74

<211> 29 <212> DNA <213>人造序列 <220><223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 74 aaaataccaa ccagatggac ccctgtctc 91763.doc 28- 29 200427695 <210> 75 <211> 29 <2i2> DNA <213：人造序列 <220><223>人造序列之說明合成的寡核苷酸 <400> 75 aagctggact cctcctacac acctgtctc 29 <210> <211> <212>

<213>人造序列 <220> -<223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 16 aatgtgtagg aggagtccag ccctgtctc 29

<210> 77 <211> 29 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明··合成的寡核苷酸 <400> 77 aaagtcgacc ttcagtaagg acctgtctc 29

<210> 78 <211> 29 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 78 aatccttact gaaggtcgac tcctgtctc 29 29- 91763.doc 200427695

<210> 79 <211> 20 <212> RNA <2 13 >人造序列 . <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 79 aagcuggacu ccuccuacac 20 <210> 80 <211> 21 <212> RNA - <213 >人造序列 <220> ，<223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 80 aaacacaucc uccucagguc g 21 .-ί <210> 31 . <211> 21 '

<212> DNA <Η3>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 31 aaaggaatga cttccagctg a 21

<210> 82 <211> 21 <212> DNA <213>人造序列.. <220> . 人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <4〇0> 82 aagatcgtcg agatgtctac t 21 30- 91763.doc 200427695

<210> 33 <211> 21 <212> DMA <213>人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 83

aaggtccatc tggttggtat t <210> 84 <211> 21 <212> DNA <2 13 >人造序列 <220> <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 84

aagctgaact cctcctacac a <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213>人造序列 <220> _ <223>人造序列之說明：合成的寡核苷酸 <400> 85 aaagtcgacc ttcagtaagg a 91763.doc

Claims

200427695 十、申請專利範圍： 1 · 一種降低細胞中細胞激素量之方法，包含有給予能夠降低細胞凋亡因子5 A1之藥劑，其中降低細胞凋亡因子5 A1 之表現降低該細胞激素的表現，因而降低細胞中細胞激素的量。 2·根據申請專利範圍第1項之方法，其中細胞激素為促炎性細胞激素。

3·根據申請專利範圍第2項之方法，其中細胞激素為IL-1、 IL-18、IL-6 或 TNF- α。 4.根據申請專利範圍第丨項之方法，其中藥劑包含具有互補於細胞凋亡因子5 Α1之序列的反意義核苷酸。 5·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中藥劑包含具有互補於細胞凋亡因子5Α1之序列的siRNA。 6·根據申請專利範圍第4項之方法，《中反意義核苦酸具有由SEQ ID NO:35、37、及39組成的族群選出的序列。

7·根據中請專利範圍第4項之方法，其中反意義核㈣於高度嚴格的條件下與由SEQ m N〇:35、37、及39組成的族群运出的序列雜交。 8. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中^να具有由& IDNO:30、31、32、及32組成的族群選出的序列。 9. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中d麗於高度嚴的條件下與由㈣、3卜32、及32組成的族選出的序列雜交。 1〇· 一種聚核苷酸具有由SEQ ID N〇:35、37、及39組成的族 91763.doc 200427695 11. 12, 13. 14. 15. 16. 17. 群選出的序列。一種siRNA具有由SEQ ID NO:30、3；1、32及32組成的族群選出的序列。一種降低P53表現之方法，包含有給予能夠降低細胞凋亡因子5A表現之藥劑，其中降低細胞凋亡因子5A1之表現降低p53表現。種&加B c 1 - 2表現之方法，包含有給予能夠降低細胞〉周亡因子5A表現之藥劑，其中降低細胞凋亡因子5A1之表現增加Bcl-2表現。一種於需要的患者中降低TNF-α量之方法，包含有給予該患者申請專利範圍第6或7項之反意義聚核苷酸。一種於需要的患者中降低TNF_ ^量之方法，包含有給予該患者申請專利範圍第8或9項之siRNA。一種冶療4寸彳政為增加的IL-i、TNF- α、或IL-6量之病理症狀之方法，包含給予具有該病理症狀之哺乳類一藥劑以降低因子5 a 1的表現。根據申請專利範圍第16項之方法，#中該病理症狀係由風濕性關節炎及骨關節炎、氣喘、過敏、動脈發炎'克隆氏病、炎症性腸道疾病（IBD，inflammat〇ry b〇wei disease)、潰瘍性結腸炎 '冠心病、纖維囊腫（叮仙 fibrosis)、糖尿病、狼瘡、多發性硬化症、葛瑞夫兹氏病 (Graves disease)、牙周炎、青光眼及黃斑部退化、眼表疾病包括圓錐角膜、器官局部缺血·心臟、腎臟、再灌注損傷、敗血症、多發性骨髓瘤、器官移植排斥、牛皮癬及 91763.doc 200427695 濕療組成的族群選出。 18·根據中請專利範圍第1項之方法，其巾細胞為上皮細胞。 19·種抑制或消除單核球分化的方法，&含有、給予能夠降低、、、田胞/周亡因子5 A i表5見之藥劑，#中降低細胞调亡因子 5 A1之表現抑制或消除單核球分化。 2〇·根據申凊專利範圍第19項之方法，其中藥劑包含具有互補於細胞〉周亡因子5al之序列的反意義核苦酸。 21. 根據申請專·圍第19項之方法，其中藥劑包含具有互補於細胞凋亡因子5al之序列 22. 根據申請專利範圍第2〇項之方法，其中反意義核普酸具有由SEQ ID N〇:35、37、及39組成的族群選出的序列。 23. 根據申請專利範圍第2〇項之方法，其中反意義核普酸於高度嚴格的條件下與由SEQ ID觸:35、37、及％組成的族群選出的序列雜交。 24·根據申請專利範圍第21項之方法，其中siRNA具有由SEq ID NO.30、31、32及32組成的族群選出的序列。裙據申明專利範圍第21項之方法，其中siRNA於高度嚴格的條件下與由SEQ ID N〇:3G、31、32及32組成的族群選出的序列雜交。種預防月光眼的眼睛中視網膜神經節細胞死亡的方去，遠方法包含抑制細胞瑪亡專一的eIF5Ai表現於視網臈神經節細胞中。 27.:據申請專利範圍第⑽之方法，其中抑制細胞凋亡專的eIF5Al表現包含給予反意義寡核芽酸至該視網腹神 91763.doc 200427695 經郎細胞，其中該反意義募核苷酸目標針對人類細胞凋亡專一的eIF5Al。 28.根據申請專利範圍第27項之方法，其中該反意義募核普酸為SEQ ID N〇:26或27。 29·根據中請專利範圍第28項之方法，其中該反意義募核普酉文為SEQ ID NO:26或於嚴格條件下與互補於SEq ID NO:26的序列雜交之募核苷酸。 30.根據申請專利範圍第28項之方法，其中該反意義募核苦酉文為SEQ ID NO:27或於嚴格條件下與互補於SEQ NO:27的序列雜交之募核苷酸。 -種於視神經底盤細月包中抑制胞〉周亡# 一的表現之方法"亥方法包含以目標針對人類細胞凋亡專一的 eIF:Al之反意義寡核苷酸轉染視神經底盤細胞，其中該反意義寡核酸於該細胞巾抑制細胞社專—的仙5Μ 表現。 32.根射請專利範圍第31項之方法，#中視神經底盤細胞為人類的。 R根據申請專利範圍第31項之方法，其中該反意義募们酉夂為SEQ ID ν〇:26或於嚴格條件下與互補於卿^ NO:26的序列雜交之寡核苷酸。 34·㈣申請專利範圍第31項之方法，其中該反意義寡核$ -夂為SEQ id n〇:27或於嚴格條件下與互補於工 NO:27的序列雜交之寡核苷酸。法 35.種於生細胞中抑制胞〉周亡專一的⑽表現之方 91763.doc 36. 36.200427695 w亥方法包含以目標針對人類細胞〉周亡專一的elF5 A1之反思義秦核苷酸轉染星細胞，其中該反意義募核苷酸於該細胞中抑制細胞凋亡專一的eiF5Ai表現。根據申請專利範圍第35項之方法，其中該星細胞為人類的。 91763.doc