TW200909577A - Single-chain circular RNA and method of producing the same - Google Patents

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200909577 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種單股環狀RNA，其製造方法以及使用 單股環狀RNA之醫藥組合物。 【先前技術】 目前為止之RNA干擾法，大致可劃分為使用化學合成之 雙股RNA之方法、以及使用質體載體之方法。後者之使用 質體載體之RNA干擾技術，通常作為生物技術而使用，主 要用於基礎生物學實驗。然而，將RNA干擾技術應用於醫 藥品開發時，使用質體載體之方法對人體的安全性造成問 題，因此較理想的是前者之使用化學合成之雙股RNA的方 法。 然而，化學合成之雙股RNA存在如下問題：在生物體内 不穩定，即，由於細胞内之酶（核酸酶）作用而易於分解。 因此，為了提高細胞内的雙股RNA之穩定性，而開發出導 入有非天然核酸之RNA股，從而穩定性得到提高，但出現 生物活性下降之問題。進而，非天然核酸所產生之毒性亦 未知，因此難以應用於醫藥品。 RNA干擾法中所使用之雙股RNA之形態有如下：具有平 滑末端或突出末端之雙股RNA，具有雙股RNA末端的一端 成環狀之髮夾結構之RNA(專利文獻1)，具有約19個鹼基對 與2個環，且具有任意化學修飾聚核苷酸之環狀核酸（專利 文獻2)等。但，該環狀核酸，於RNA干擾效應方面未經試 驗。 131248.doc 200909577 又，揭示有RNA-DNA嵌合體之啞鈴型核酸（專利文獻 3)，該核酸並非用於RNA干擾，而是於細胞内啞鈴型核酸 之RNA部分藉由酶而被切割，從而阻礙反義DNA部分結合 於細胞内之mRNA上。專利文獻3中揭示：由於核酸具有啞 鈴型結構，故對細胞内的核酸分解酶之耐性高，並於核糖 核酸酶Η發揮作用之前穩定地存在於細胞内，藉由核糖核 酸酶Η之作用而切除互補RNA部分，首次，含有反義dna 部分之單股募核苷酸游離於細胞内，因此一般認為單位投 予量之反義效果會提高。 又，關於啞鈴型結構之環狀核酸之合成方法，例如揭示 如下：將寡核苷酸合成為線狀，形成莖部分與髮夾環部 分，而獲得目標環狀啞鈐型寡核苷酸之丨個部位（上述髮夾 %邛分之相對側的末端）未被結合之鏈裂的啞鈴型寡核苷 酸，其5’末端藉由連接酶而接合，藉此而製備環狀啞鈐型 環狀核酸（專利文獻3)。 專利文獻1日本專利特表2〇〇3_5〇2〇 12號公報 專利文獻2曰本專利特開2〇〇6_271387號公報 專利文獻3曰本專利特開平！〗_丨3 726〇號公報 【發明内容】 本發明之目的在於提供一種單股環狀RNA以及其製造方 法。 本發明者等人發ί見，藉纟分別合成於兩端具有不形成互 補股之驗基序列之義股與反義股，使連接酶同時作用於兩 鈿之鹼基而可思外獲得高產率之單股環狀rna ;並且發 131248.doc 200909577 現，所獲得之單股環狀RNa持續地、緩釋地發揮^^八干擾 作用；從而完成本發明。 即，本發明包含以下之發明。 (1) 一種具有持續性或緩釋性rna干擾作用之單股環狀 RNA，其特徵在於：含有義股序列、與該義股序列互補之 反義股序列、於該義股與該反義股之間結合二者之相同或 不同的2個環序列，且該義股與該反義股配對而形成莖。 (2) 如（1)中所揭示之單股環狀RNA，其中將對照細胞中 之b無RNA之表現設為i時，導入至真核細胞24小時後之 標靶RNA之表現顯示為〇 4以下。 (3) 如⑴或(2)中所揭示之單股環狀RNA，其係於人類血 清中經過8小時之時、保持7〇%以上。 ()#如(1)〜(3)中任一項所揭示之單股環狀rna之製 造方法，其包括：分別合成在5,末端以及3,末端具有不形 成補股之驗基序列之義股以及反義股，義股所具有的不 形成互補股之鹼基序列之5,末端的驗基、與反義股所具有 的不形成互補股之鹼基序列之3,末端的驗基，以及義股所 具有的不形成互補股之驗基序列之3，末端的驗基、與反義 股所具有的不形成互凡少私並产=丨 肖叙之驗基序列之5,末端的鹼基，藉 由連接酶同時連接， =義股於5末端所具有的不形成互補股之鹼基序 列石^義股於3,末端所具有的不形成互補股之驗基序列 ^ , 不輛所具有的不形成互補股 之驗基序列、與反義股 、禾鳊所具有的不形成互補股之 131248.doc 200909577 驗基序列相互結合而形成環，以及義股與反義股配對而形 成莖。 (5) 如⑷中所揭示之製造方法，其中進而包括：將義股 所具有的不形成互補股之鹼基序列、以及反義股所具有的 不形成互補股之鹼基序列之5，末端進行磷酸化。 (6) 如⑷或（5)中所揭示之製造方法，其中上述環之序列 相互相同或不同。 ⑺如（4)至（6)中任—項所揭示之製造方法，其中上述環 之長度為2〜20個驗基。 ⑻如(4)至(7)中任一項所揭示之製造方法，其中上述莖 之長度為1 9〜3 1個驗基。 (9) 一種於體外抑制編碼該蛋白質之基因的表現之方 法，其包括：將如⑴〜(3)中任一項所揭示之單股環狀讓 導入至來自於人類之細胞後，使標把職失去功能而持續 地阻礙其轉譯為蛋白質。 (1〇) 一種抑制編碼該蛋白質之基因的表現之方法，其包 括.將如⑴〜（3)中任—項所揭示之單股環狀rna導入至非 人類動物、植物或該等之細胞後’使標乾RNA失去功能而 持續地阻礙其轉譯為蛋白質。 ⑴）-種醫藥組合物，其含有如（1)〜(3)中任—項所揭示 之單股環狀RNA作為有效成分。 本說明書中，單股環狀RNA亦稱為啞鈴型RNA。所謂啞 鈐型RNA，係指義股與反義股互補配對而形成莖，於莖之 兩側由不形成互補股之驗基序列形成環，單股環狀RNA之 131248.doc 200909577 整體形狀成為啞鈐狀。 本說明書包含作為本申請案之優先權基礎的日本國專利 申請案2007-125045號之說明書及/或圖式上所記载之内 容。 【實施方式】 本發明之單股環狀RNA包含：與標靶RNA之鹼基序列或 者其一部分同源之義股序列、以及與該義股序列互補且可

Ο 配對之反義股序列，及於義股與反義股之間不形成互補股 之環序列。 義股與反義股配對而形成莖。莖之長度並無特別限定， 根據標靶RNA之種類或結構決定長度即可，例如含有 19〜31個鹼基對，較好的是21〜25個鹼基對更好的是 22〜24個鹼基對，特別好的是23個鹼基對。 不形成互補股之鹼基序列，位於義股與反義股各自之5, 末端與3末端上，義股所具有的不形成互補股之驗基序列 之5末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基 序列之3,末端的驗基連結而形成環，義股所具有的不形成 互補股之驗基序列之3·末端的驗基、與反義股所具有的不 /成互補股之驗基序列之5’末端的驗基連結而形成環。環 之長度較好的是含有2〜2G個驗基，更好的是含有㈣個驗 土因此整個單股味狀⑽八較好的是由心〜⑽個驗基形 右將義股之5,末端之不形成互補股之鹼基序列設為A， 義股之3末端之不形成互補股之驗基序列設為b，將 131248.doc 10 200909577 義股之3'末端之不形成互補股之驗基序列設為c，將 股之5末端之不形成互補股之驗基序列設為d，則例如^ 之長度為20個驗基時，A具有卜19個驗基之長度，心 19〜1個驗基之長度，C具有叫個驗基之長度，心右 1 19㈣基之長度’八之51末端之驗基與末端之驗義 連結而形成2G個驗基之環，C之3,末端之驗基與，末: 之驗基連結而形成2〇個鹼基之環。

較好的是’不形成互補股之序列於之間、〔與〇之 間，長度相差例如！個驗基，2個驗基或3個驗基，或者長 度相同。因此，例如環之長度為8個鹼基時，較好的是八之 長度為3〜5個鹼基，B之長度為5〜3個鹼基，C之長度為5〜3 個驗基，D之長度為3〜5個驗基。環之長度為9個驗基時， 較好的是A之長度為3〜6個驗基，3之長度為6〜3個驗基，C 之長度為6〜3個驗基，0之長度為3〜6個驗基。環之長度為 1〇個驗基時，較好的是人之長度為4〜6個驗基，8之長度為 6〜4個鹼基，C之長度為6〜4個鹼基，〇之長度為私6鹼基。 再者由A B所形成之環與由C、D所形成之環的鹼基 序列既可相同，亦可不同。 本發明之單股環狀RNA可用於RNA干擾法。 所謂RNA干擾，亦稱為RNA interference (RNAi)，係具 有與標靶RNA互補之序列的小RNA分子與標靶rna結合， 並將其分解或抑制轉譯的現象。 亞鈴型RNA之反義股，具有與成為標靶之rna(例如 mRNA或其前驅物RNA)互補之序列。χ，不形成互補股之 131248.doc 200909577 鹼基序列並無特別限定，例如可列舉：UUCAAGAGA、或 UGUGCUGUC (M. Miyagishi等人，Oligonucleotides 2003, 13:1-7)等。 進而，σ亞鈴型RN A之環可進行化學修飾，例如若藉由分 子量約為2000〜5000之聚乙二醇修飾，則可提昇啞鈴型 RNA於生物體内之穩定性。因於細胞内藉由Dicer酶等酶 而切割並去除啞鈴型RNA之環，故莖作為siRNA或miRNA 而發揮RNA干擾作用時，可認為聚乙二醇幾乎不產生影 響。 至於本發明之啞鈴型RN A，較好的是將對照細胞（未導 入啞鈴型RNA)中之標靶RNA之表現設為1時，導入有該啞 鈴型RNA之細胞中的細胞導入24小時後之標靶RNA之表現 顯示為0.4以下。本發明中，細胞為真核細胞，較好的是 動物細胞以及植物細胞。 至於標靶RNA之表現，例如使報告基因（螢光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、綠色螢光蛋白（green fluorescence protein，GFP)等）於細胞内轉形，將報告基因 之mRNA作為標靶RNA，而該標靶RNA之表現在多大程度 上受到啞鈐型RNA的阻礙，可藉由測定來源於報告基因之 蛋白質的發色及螢光來確認。 進而，本發明之啞鈐型RNA具有如下特徵：於人類血清 中經過8小時之時70%以上未被分解而得以保持。例如可 於人類血清中培養啞鈴型RNA，藉由電泳等測定分子量來 確認其是否經時分解。 131248.doc -12- 200909577 至於本發明之啞鈴型單股環狀Rna之製造方法，包括： 分別合成於5,末端以及3,末端具有不形成互補股之驗基序 列的義股以及反義股，義股所具有的不形成互補股之鹼基 序列之5’末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之 鹼基序列之3,末端的鹼基，以及義股所具有的不形成互補 版之鹼基序列之3’末端的鹼基、與反義股所具有的不形成 互補股之鹼基序列之5,末端的鹼基，藉由連接酶同時連 結。 為了可抑制成為標靶之基因，而根據標靶基因之鹼基序 列設计義股以及反義股。至於設計，係可製作多個義股以 及反義股並分別確認抑制效率，例如可利用根據siRNA設 計用演算法等之設計（參照文獻：j A Jaeger等人， Methods in Enzymology (1989) 183:281-306; D. H.

Mathews等人，J. Mot. Biol, (1999) 288:911-940)。設計 時，較理想的是不用抑制具有與標靶基因類似之序列的、 標靶基因以外的基因之表現（脫靶（〇ff target)效應）。義股 以及反義股並無特別限定，設計之長度例如為19〜31個鹼 基，較好的是21〜25個鹼基，更好的是22〜24個鹼基，特別 好的是23個鹼基。 標靶基因並無特別限定，例如可列舉：白血病之abl/bcr 基因’老年性黃斑部病變之VEGf基因，肝炎之HCv基 因。 其後將形成環之序列，例如上述序列UUCAAGAGA於任 忍部位切割成2組，而獲得不形成互補股之鹼基序列（該序 131248.doc -13· 200909577 列為9個驗基’切割成2組時，較好的是如上所述，長声相 差卜玲驗基之範圍），並設計成將—組連結於反義股^ 末端’將另一組連結於義股之5，末端的序列，以相同之方 式，設計成將-組連結於義股之3,末端，將另一組連結於 反義股之5末端的序列。分别八p,人上、 刀別刀開合成所設計之該等2個序 列之單股核酸。此時，較好的是使用化學性磷酸化試劑對 Ο Ο 5,末端進行《化。再者，較好的是將形成環時之長度設 汁成例如2〜20個鹼基，較好的是6〜丨2個鹼基。 核酸合成方法有如下各種方法：體外轉二合成方法使 用質體、病毒載體之方法’藉由pcR盒之方法等，並無特 別限定，就純度之高低’能否大量合成，於體内之使用安 全性之高低，能否化學修料方面而言，較好的是化學八 成方法。化學合成方法有膦酸氫法，亞磷酿胺法等，並益 特別限定，可使用市售之自動核酸合成機。 …' 位於義股以及反義股之兩端的不形成互補股之驗基序列 之末端，藉由連接酶（例如T4RNA連接酶，丁4舰連接酶 專）連結，同時形成2個環。至於反應條件，例如於含有聚 乙二醇（PEG)，牛血清白蛋白師ne Serum Albumin， bsa)專之緩衝液中於低溫下培養2〇小時即可。所合成之口亞 =型單股環狀舰，可用通常之方法進行回收.純化（例如 尚效液相層析法，PAGE法等）。 進而’可藉由聚乙二醇（PEG)等對單股環狀rna進行化 學修都，較好的是對環部分進行化學修飾。為了結合，而 改變PEG之兩末端，並導入例如甲醯基、n老基琥㈣亞 131248.doc •14. 200909577 胺酯基等與驗基之胺基具有反應性之官能基。 以下，就使用由上述方法製造的讀型rna之謝干擾 法進行說明。 根據本發明，可將本發明之單股環狀RNA導入至細胞’ 使標靶RNA失去功能而持續阻礙其轉譯為蛋白質，上述細 胞可使用人類細胞或非人類細胞。 於體外進行RNA干擾法時，藉由例如電穿孔法，顯微注 射法月曰轉染法，碗酸約法等將π亞铃型導人至細胞。 ,;體内進行RNA干擾法時’首先對含有。亞鈐型rna之試 料進行透析、調節pH值等，而調整成適合於生物體。將試 料導入至動物或植物<方法並無特別ρ艮定，命以可列舉： 局部投予，靜脈内投予，使用基因搶之方法等，應用於人 類時就安全性方面而言，較好的是不使用微生物等之方 法。 導入至細胞内之啞鈴型RNA，於細胞内藉由酶而 被切割並於細胞内產生具有RNA干擾作用之rna雙股 (siRNA)(圖1}。siRNA之末端可為平滑末端或突出末端。 SlRNM成單股，形成RNA-核酸酶複合體（RNA誘導沉默 …_體（RISC))，熾別並分解與siRNA互補之序列的標乾 mRNA，從而抑制標靶基因之表現。 本發明之單股環狀RNA，可用於植物、動物（包括例如 ;頁龍物、豕畜之哺乳動物等）、該等之細胞之任— 種’特別期待於醫學' 農學領域中得到廣泛應用。為了弄 月】士植物或動物水平、植物或動物細胞水平下之特定基 131248.doc -15- 200909577 =:白質的功能，弄清例如藉由剔除法所得基因之功能 種目的，可使用本發明之單股環狀RNA。 又，本發明包括醫藥組合物’該醫藥組合物含有單股環 狀RNA作為有效成分。 單股環狀RNA於醫藥組合物之調配量，可根據組合物之 f'

Cj 曰。類或目的進行調整，相對於組合物之總量，例如為！重 置/〇、3重量％、5重量％、1〇重量％、2〇重量％、3 %、40重量％、50重量％、6〇重量％、7 %，重”…0。重量但並不限定於該等。〇重置 作為本發明之醫藥組合物之劑形，例如可列舉：液體製 劑（溶液劑、懸浮劑、乳濁劑等卜固體製劑（使用時製備之 冷束乾燥劑等）、脂質體（較好的是陽離子性 劑等’又，作為投予途徑，較好的是非經口投予，例= 括·直接投予至患部之局所投予、經肺投予、經鼻投予等 經黏膜投予以及靜脈内投予等。 本發明之醫藥組合物根據製劑化’劑形等，可含有賦形 劑(生理鹽水、滅菌水、林葛爾氏溶液等）、緩衝劑 劑、穩定劑等。 、 又，本發明之醫藥組合物之投予量可根據病人之性別、 體重、年齡、嚴重程度、症狀等進行變更。 本發明之醫藥組合物之應用並無特別限定，例如可列 舉/σ療癌症等疾病，例如抑制癌細胞中異常表現之夷因 或蛋白質之功能等。 土 以下，藉由實施例更具體說明本發明，但該等實施例並 131248.doc -16 · 200909577 不限定本發明。 實施例1 啞鈐型RNA之製作 成為啞鈴型RNA之原料的5'磷酸化RNA，係完全基於亞 磷醯胺法，藉由DNA合成機（GeneWorld H8-SE)合成。 RNA亞磷醯胺係使用TBDMS保護體（Proligo公司），5'磷酸 化係使用化學磷酸化試劑（Chemical Phosphorylation Reagent)(Glen Research公司）。脫保護係根據常法進行 D PAGE純化。將所合成之RNA序列、序列編號1(義股28 mer)，序列編號2(反義股28 mer)、序列編號3 (56 mer)示 於圖2。再者，圖2之RNA序列中，有下劃線之序列係形成 啞鈐型RNA之環部的序列。 繼而，以 2 μΜ 之 RNA 雙股（RNA double strand)、2.0 units/μΐ 之 T4 RNA 連接酶、0.006% 之 BSA、25% 之 PEG6000、50 mM之 Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM之 MgCl2、 10 mM之DTT、1 mM之ATP的組成，於反應規模25 μΐ中進 ^ 行酶反應。 具體而言，首先，將5'磷酸化RNA雙股溶解於含有1〇〇 mM之 Tris-HCl (pH 7.5)、20 mM之 MgCl2、20 mM之 DTT、 2 mM之ATP的緩衝液（2x緩衝液）12,5 μΐ中，以使5'磷酸化 RNA雙股達到4 μΜ，於65°C下加熱5分鐘後，慢慢冷卻至 室溫。其後，添加BSA水溶液、PEG6000水溶液、T4 RNA 連接酶（TAKARA BI0公司），以使達到上述組成與反應規 模，於11°C下培養20小時。藉由乙醇沈澱，使用PAGE解 131248.doc -17- 200909577 析所回收之RNA。 圖2之PAGE之各區帶的樣品如下所示。 區帶1 : 28個鹼基之義股以及28個鹼基之反義股的混合 物（標記物） 區帶2: 57個驗基之RN A(標記物）

區帶3:由28個鹼基之義股與28個鹼基之反義股所形成 之啞鈴型RNA 區帶4:由56個鹼基（單股）所形成之啞鈐型rna 區帶5 :藉由RNA連接酶處理之28個鹼基之義股（參考） 區帶6 :藉由RNA連接酶處理之28個鹼基之反義股（參 考） 至於區帶4之》亞鈴型RNA ’係藉由如下方式製作：合成 序列編號3之56個鹼基之單股並形成莖部分以及髮夾環部 分，藉由T4連接酶結合最前之鹼基與最後之鹼基。 區帶3之圓圈所圈起之帶係藉由本發明之方法製作而成 之租鈴型RNA，其產率約為80%。區帶4之啞鈐型rNA之 產率約為5 %以下。 實施例2 疫铃型RNA之莖之長度的研究 藉由上述DNA合成機合成序列編號4〜13所示之RNA。序 列編號4與5形成含有18個鹼基對之雙股RNA (siRNA-Ι)， 序列編號6與7形成莖之長度為19個鹼基之啞鈴型rnA (Db-1 9) ’序列編號8與9形成莖之長度為23個鹼基之啞鈐型 RNA (Db-23) ’序列編號10與11形成莖之長度為27個鹼基 131248.doc -18- 200909577 之啞鈐型RNA (Db-27)，序列編號12與13形成莖之長度為 31個鹼基之啞鈴型RNA (Db-31)(圖3)。 以2 μΜ之RNA雙股、1.0 units/μΐ之T4 RNA連接酶、 0.006% 之 BSA、25% 之 PEG6000、50 mM 之 Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM 之 MgCl2、10 mM之 DTT、1 mM之 ATP之組 成，於反應規模1.5〜2.5 ml下進行酶反應。 具體而言，將5'磷酸化RNA雙股溶解於含有100 mM之 Tris-HCl (pH 7.5)、20 mM之 MgCl2、20 mM之 DTT、2 mM D 之ATP的緩衝液（2x緩衝液，最終反應液量的一半）中，於 65°C下加熱5分鐘後，慢慢冷卻至室溫，以使5'磷酸化RNA 雙股達到4 μΜ。其後，添加BSA水溶液、PEG6000水溶 液、Τ4 RNA連接酶（TAKARA ΒΙΟ公司），以使達到上述組 成與反應規模，於11°C下培養20個小時。 藉由乙醇沈澱自反應液中回收RNA，使用PAGE離析環 化體。藉由UV shadowing法使含有目標物之帶可視化並切 出，粉碎成細小狀態後，以溶析緩衝液（0.2 Μ之NaCM、1 mM之EDTA (pH 8.0)) 4 ml萃取3次。使用Sep-Pak濾筒進行 脫鹽（以50%乙腈水6 ml進行溶析），並使用離心蒸發器進 行濃縮，進而於醋酸銨存在下進行乙醇沈澱。測定UV光 譜，從而將所獲得之目標物定量。 於上述各啞鈴型RNA 2 pg中添加含有20 mM之Tris-HCl (pH 8.5)、150 mM 之 NaCl、2.5 mM 之 MgCl2 之緩衝液中的 ColdShock-DICER酶（TAKARA BIO公司）2 units(反應液量 20 μΐ)，並於37°C下進行培養。於1、6、18個小時後對反 131248.doc -19· 200909577 應液取樣3 μΐ，與120 mM之EDTA水溶液2 μΐ混合，並停止 酶反應。藉由未變性PAGE (10% PAGE、lx ΤΒΕ)對其進行 解析（藉由 lx SYBR Green I 染色後，用 BioRad Molecular Imager FX進行圖像化·定量）。 圖4係表示各啞鈴型RNA之PAGE。作為對照，亦同樣研 究以啞鈴化反應前之雙股RNA為基質的切割反應。其結 果，Db-1 9之切割反應於1小時後進行了約5%，從而可確 認生成20個鹼基長度的雙股RNA。Db-19之20個鹼基前後 f) 之切割片段於6、18個小時後維持幾乎同樣程度的濃度。 另一方面，對照之19個鹼基之直股（Liner)，於1小時後幾 乎1 00%被切割而觀察到20個鹼基長度之RNA雙股。其 後，隨著時間推移該產物之RNA雙股分解並消失。Db-23 於1小時後約8%被切割而生成20個鹼基長度之雙股。隨著 莖之長度變長，可確認Db-27，Db-3 1於1小時後之切割速 度分別增速1 0%，20%。1 8個小時後，Db-19之原料剩下約 75°/。，相對於此，Db-3 1之原料完全消失。由此可明確莖 之長度較短，則其對酶較穩定。 實施例3 啞鈐型RNA之RNA干擾效應 藉由螢火蟲螢光素酶報告基因pGL3之表現阻礙實驗， 來評價上述啞鈴型 RNA (Db-1 9、Db-23、Db-27、Db-3 1)之 RNA干擾效應。

於含有10% FCS之DMEM (GIBCO公司）培養基中，於37 °C、5% C02之條件下，培養NIH 3T3細胞（RIKEN CELL 131248.doc -20· 200909577 BANK)，於96孔培養盤中，每孔分注100 μΐ，以使達到1·6 xlO4細胞/孔。進而於37°C、5% C02之條件下培養39小 時，於約70%融合之狀態下，使用轉染試劑之 GeneSilencer (Genlantis公司），並根據轉染試劑所附之操 作說明，對2種質體載體（pGL3-對照，pRL-TK(内部標準 用），皆為Promega公司生產）與各種RNA進行轉染。轉染 時之濃度條件如下所示。 0_2洋吕之pGL3-對照/0.02洋呂之pRL-TK/25 nM之RNA(最 D 終量 ΙΟΟμΙ)

GeneSilencer 1 μΐ DMEM培養基 25 μΐ siRNA稀釋液 2.5 μΐ DMEM培養基 15 μΐ RNA (5 pmol/μΐ) 0.5 μΐ pGL3-對照(1 μθμΐ) 0.2 μΐ pRL-TK (0.1 μ^μΐ) 0.2 μΐ 44.4 μΐ 轉染後，於37°C、5°/。C〇2之條件下培養4小時，將含有 20%血清之DMEM培養基100 μΐ添加至各個孔中。於37°C 下進一步培養20小時後，使用雙螢光素酶報告檢測系統 (Dual-luciferase Reporter Assay System)(Promega公司）， 根據所附之操作說明使細胞可溶化，而定量螢光素酶表現 量（條件：試劑量為30 μΐ，延遲時間為2秒鐘，讀取時間為 10 秒鐘。機器為 Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter)，作為比較，於僅為緩衝液（對照）之條件下同樣 地進行評價。至於螢火蟲螢光素酶之發光強度，係根據作 131248.doc -21- 200909577 為内部標準之海腎螢光素酶之發光強度進行校正。其結果 示於圖5。24小時後，啞鈐型RNA中，Db-23之活性最高， 阻礙效果顯示至0.24。根據該結果，將最合適之雙股長度 設為2 3個驗基。 實施例4 RNA干擾效應之持續性 就Db-23與siRNA-1之RNA干擾效應之持續性進行比較。 於含有10%小牛血清（FCS、Invitro/Gibco公司）之杜貝可 氏改良伊格爾氏培養基（Dulbeco's modified Eagle's medium, DMEM, Gibco公司）中，於5% C〇2加濕室中培養 NIH 3T3細胞。於約70%融合之狀態之轉染的40個小時 前，於96孔培養盤中，每孔分注細胞1 00 μΐ，以使達到1.6 X 104細胞/孔。使用GeneSilencer(基因治療系統（Gene Therapy Systems))，並根據NIH 3T3細胞之製造者所作的 說明對報告質體與RNA進行轉染。與實施例3相比，於孔 中使用100 μΐ之用轉染試劑稀釋10倍而得的16 ng/ml之 pGL3-對照（Promega公司）、1.6 ng/ml之pRL-TK (Promega公 司）以及25 nM之RNA。培養4小時後，添加100 μΐ之含有 20% FCS之DMEM。進而培養3日以上，隨時交換培養基。 使用雙螢光素酶報告檢測系統（Promega公司），並根據 Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter (Perkin-Elmer公 司）所附之說明書，分別於24個小時、72個小時、120個小 時後監測螢光素酶之表現（圖6)。將不含有RNA者作為對 照。 131248.doc -22- 200909577 至於螢光素酶之活性，於24小時後Db-23與siRNA-l顯示 出幾乎相同之活性，於120小時後，Db-23顯示出更高的基 因表現抑制作用。由此顯示"亞鈴型RN A之緩釋作用及長期 活性效果。 實施例5 人類血清中之啞鈐型RNA之穩定性

〇

就Db-23與siRNA於人類血清中之穩定性進行比較。 於退火緩衝液（1〇〇 mM之醋酸鉀、30 mM之HEPES-KOH (pH 7.4)、2 mM之醋酸鎂）中，添加退火前之dsRNA (siRNA-l、20 μΜ)或啞鈴型 RNA (Db-23、20 μΜ)，將所得 之溶液4…與^ μ12ΡΒ8、以及正常人類血清（Chemic〇n

International公司）4 μΐ混合，並於37。(：下培養。於〇 5、j、 1_5、3、8以及20個小時後採集等分試樣5 μ1，用15%之未 變性PAGE，並以SYBR Green〗染色，使用M〇iecuiar Imager FX (Bi〇Rad公司）進行分析。 其結果，siRNA於3小時後分解至50%，相對於此， 23依然存在80%以上，即便於8小時後亦存在以上。因 此’可期待Db_23於生物體内具有高穩定性。 產業上之可利用性 根據本發明，可高效率地製作穩定性，持續性以及缓釋 性優異之啞鈴型合成RNA。 特別是用於RNA干擾法之哑鈴型職，藉由環化雙股 糧而製作，並且兩端閉合成環狀’因此RNA末端消失， 於細胞内’除Dicer酶等特異性酶以夕卜，難以成為分解酶 131248.doc -23- 200909577 外切核酸酶（RNase)等的基質，因此難以藉由酶分解，從 而於細胞内之穩定性飛躍增長。因此，無須使用用以提高 穩定性之非天然型核酸。 又，啞鈴型RNA於細胞内可被生物體内Dicer酶等特異 性識別，並切割兩側之環部而成為天然型RN A雙股（圖1)， 因此可保持與雙股RNA相同之活性，又，與由先前之雙股 RNA而產生之RNA干擾作用相比，亦具有持續性，缓釋性 之效果。 ^ 本發明之啞鈴型RNA與先前之雙股RNA相比，於人類血 清中較穩定，且可用作可應用於生物體之核酸分子。 本說明書所引用之全部的出版物、專利以及專利申請案 直接作為參考列入本說明書。 【圖式簡單說明】 圖1係模式性表示本發明之啞鈴型RNA。 圖2係表示rna之結構以及各種RNA之電泳圖。 圖3係表示siRNA以及啞鈴型RNA之結構。

J 圖4係表示藉由Dicer酶切割之啞鈐型rna以及雙股 RNA(Liner)之電泳圖。 圖5係表示轉染24小時後之各啞鈴型rna之干擾效應。 圖6係表示啞鈴型rna之持續性RNA干擾效應。 圖7係表示啞鈴型RNA於人類血清中之穩定性。 131248.doc •24- 200909577 序列表 <110>獨立行政法人理化學研究所 曰商大塚製藥股份有限公 日商林化成股份有限公司 <120>單股環狀RNA及其製造方法

<130> PH-3542PCT <140〉 097117329 <141> 2008-05-09 <150> 2007-125045 <151> 2007-05-09 <160〉 13

<170〉 Patentln 第 3.4 版 <210〉 1 <211〉 28 <212> RNA <213〉人工 <220〉 <223〉合成 <400〉 1 28 gagacuuacg cugaguacuu cgauucaa G <210〉 2 <211〉 28 <212> RNA <213〉人x <220> 〈223>合成 <400> 2 gagaucgaag uacucagcgu aaguucaa 28 <210〉 3 131248.doc 200909577 <211> 56 <212〉 RNA <213> 人工 <220〉 〈223〉 合成 <400> 3 gagacuuacg cugaguacuu cgauucaaga gaucgaagua cucagcguaa guucaa 56 <210> 4 <211> 21 <212> RNA 〈213> 人工 <220〉 <2M>合成 <400> 4 gugcgcugcu ggugccaacu u <210〉 5 <211〉 21 <212> RNA <213〉人工 €./ <220> 〈223〉合成 <400〉 5 ' guuggcacca gcagcgcacu u 21 21 <210> 6 <211〉 28 〈212〉 RNA <213〉 人工 〈220〉 <223〉 合成 131248.doc 2- 200909577 <400〉 6 gagagugcgc ugcuggugcc aacuucaa <210〉 7 <211〉 28 <212> RNA <213〉人工 〈220〉 <223〉合成 <400〉 7 gagaguuggc accagcagcg cacuucaa

<210〉 8 <211〉 32 <212> RNA <213〉人工 <220〉 〈223〉合成 <400〉 8 gagaagugcg cugcuggugc caacccuuuc

<210〉 9 〈211〉 32 <212> RNA <213〉人工 <220〉 〈223〉合成 <400〉 9 gagaagggug ggcaccagca gcgcacuuuc <210> 10 131248.doc 200909577 <211〉 36 <212> RNA <213〉人工 <220〉 <223〉合成 <400> 10 gagaaaagug cgcugcuggu gccaacccua uuucaa

<210〉 11 <211> 36 <212> RNA 〈213〉人工 <220〉 〈223〉合成 <400〉 11 gagaauaggg uuggcaccag cagcgcacuu uuucaa <210> 12 <211〉 40 <212〉 RNA <213〉 人工 <220> <223〉 合成 <400〉 12 gagaucaaag ugcgcugcug gugccaaccc uauucuucaa <210〉 13 <211〉 40 <212> RNA <213〉人工 <220〉 〈223〉合成 4- 131248.doc 200909577 <400〉 13 gagagaauag gguuggcacc agcagcgcac uuugauucaa

131248.doc

Claims (1)

1. 200909577 十、申請專利範圍： 1 _ 一種具有持續性或緩釋性RNA干擾作用之單股環狀 RNA ’其特徵在於：含有義股序列、與該義股序列互補 之反義知序列、於該義股與該反義股之間結合二者之相 同或不同的2個環序列，且該義股與該反義股配對而形 成莖。 2.如明求項丨之單股環狀RNA，其中將對照細胞中之標靶 NA之表現设為i時，導入至真核細胞μ小時後之標靶 RN A之表現顯示為〇4以下。 月求項1或2之單股環狀RNA，其係於人類血清中經過 8小時之時、保持70%以上。 、種如明求項1至3中任一項之單股環狀RNA之製造方 、、其包括’分別合成在5’末端以及3,末端具有不形成 〈、股之驗基序列的義股以及反義股，義股所具有的不 =成互補股之驗基序列之51末端的驗基、與反義股所具

   的不形成互補股之驗基序列之3,末端的驗基，以及義 =，有的不形成互補股之驗基序列之3,末端的驗基、 驗義股所具有的不形成互補股之驗基序列之51末端的 鹼基，藉由連接酶同時連接； 此時’義股於5丨末端 列、盥斤八有的不形成互補股之鹼基序 列相二，3,末端所具有的不形成互補股之驗基序 歹J相互結合而形成環， 補股之鹼Α序列“ 末端所具有的不形成互 補股之驗I床 η反義股於5’末端所具有的不形成互 "列相互結合而形成環，以及義股與反義股 131248.doc 200909577 配對而形成莖。 5.二請求項4之製造方法’其中進而包括：將 :不形成互補股之驗基序列、以及反義股所具有的；升 成互補股之驗基序列之5,末端進行磷酸化。 " 6+ =項4或5之製造方法’其中上述環…相一 7. 如請求項4至ό中任一項之製诰 ^… 法，其中上述環之長戶 為2〜20個鹼基。 贫度 8. 如請求項4至7中任一項之製 方法’其中上述莖 為19〜31個鹼基。 w二之長度 9. 一種於體外抑制編碼該蛋白皙夕A m & * 貧白頁之基因的表現之方法，装 包括·•將如請求項1〜3中任一 、 仕項之早股％狀RNA導入至 來自於人類之細胞後，作辦細D μ α l 傻使‘靶RNA失去功能而持續地 礙其轉譯為蛋白質。 10. -種抑制編碼該蛋白質之基因的表現之方法其包括. 將如請求項1〜3中任-項之單股環狀RNA導人至非人類 動物、植物«等之細胞後，使㈣跳失去功能而持 續地阻礙其轉譯為蛋白質。 U. 一種醫藥組合物’其含有如請求項⑴中任一項之單股 環狀RNA作為有效成分。 131248.doc -2-