TW200914041A - Conjugates of insulin-like growth factor-I and poly(ethylene glycol) - Google Patents

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200914041 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於類姨島素生長因子-聊F-υ與聚乙二醇 (peg)之軛合物、含有該等軛合物之醫藥組合物及生產及 使用該等輛合物之方法。 【先前技術】 阿兹海默氏症（AD)係、日益普遍形式之神經退化症，其造 成65歲以上年齡人群中癡呆症總病例的約5Q屬％。當前在 世界範圍内約一千五百萬人受仙影響，且由於人口中老 年人相對增加其流行程度在未來二十至三十年内可能增 加AD為在發生臨床症狀與死亡之間平均持續時間約為 8.5年之進行性病症。腦部與高級智力功能相關區域之錐 开y神經兀之死亡及神經元突觸之喪失導致以認知功能的總 體及進行性損傷為特徵的典型症狀（Francis, ρ τ.等人，
Neurol. Neurosurg. Psychiatry 66(1999)137-147)。AD為世 界上老年癡呆症與早老性癡呆症之最常見形式，且臨床上 公s忍其為伴隨有記憶、智力功能日益喪失及語言障礙的無 情進行性癡呆症（Merritt，A Textbook of Neurology，6th edition ’ Lea & Febiger，Philadelphia，第 484-489 頁， 1979)。在神經病理學上，aD之主要標誌為兩個特徵性病 變之出現：澱粉樣老年斑及神經纖維纏結（NFT)。雖然斑 在神經元外沈積時，在死亡後大腦的神經元内可觀察到纏 結。該澱粉樣斑核之一種主要成分為病理學上沈積之小澱 粉樣P-肽（Αβ) ’其由分泌酵素自澱粉樣前驅蛋白（APP)分 135792.doc 200914041 解（Selkoe，D. J. Physiol. Rev. 81(2001)741-766; Hardy，J及 Selkoe，D J. Scinece 297(2002)353-356; Bush，A_I及 Tanzi， R. E.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(2002)7317-73 19)。Αβ (39-43個殘基之自聚集肽（分子量約4 kDa))可經合成為較 大APP(110-120 kDa)之部分。APP為具有大N-終端細胞外 區域、單一跨膜區域及短細胞漿尾之I型完整細胞膜糖蛋 白。該Αβ區域橫跨APP跨膜區及細胞外區之部分。對APP 參與AD中神經細胞死亡之最普遍假設為澱粉樣假設。該 假設假定澱粉樣沈積或部分聚集之可溶Αβ激發神經毒性級 聯，因此導致類似於AD病理學之神經退化（Selkoe, D. J. Physiol· Rev. 81 (2001) 741-766; Hardy, J·及 Selkoe，D.J.，Science 297 (2002) 353-356)。 類胰島素生長因子-I(IGF-I)為結構上與胰島素相關之循 環激素。傳統上認為IGF-I為生長激素對邊緣神經組織作 用之主要介體。IGF-I由70個胺基酸組成且亦命名為生長 介素（somatomedin C)且由SwissProt第P01343號定義。其用 途、活性及生產在例如le Bouc, Y.等人，FEBS Lett. 196 (1986) 1 08-1 12; de Pagter-Holthuizen, P.等人，FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A.C.等人，Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H. 等人，31〇〇116111.81〇卩11丫8.1168.(1；〇111]111111.175 (1991) 507-514; Tanner, J.M.等人，Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne，K.等人，J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554 ;歐洲專利第0 123 228號；歐洲專利第 135792.doc 200914041 0 128 733號；美國專利第5,861，373號；美國專利第 5,714,460號；歐洲專利第 〇 597 033 號；W〇 〇2/32449 ; WO 93/02695 中提及。 IGF-I功月b之调節相當複雜。在循環中，僅〇 2%之igf-I 以游離形式存在而大部分與IGF-結合蛋白（igfbP's)結合， 該蛋白對IGF’s具有很強的親和力且可調整jgfj功能。該 因子可由诸如藉由蛋白酶對IGFBP’s之蛋白水解作用釋放 IGF-I之機制局部釋出。 IGF_I在腦的發育及成熟中具有旁分泌作用（Werther， G.A·等人 ’ Mol. Endocrinol. 4(1990)773-778)。活體外研 究表明IGF-I為中樞神經系統（CNS)中若干類型神經元之 有效非選擇性營養動因劑（Knusel, B.等人，j.
Neurosci.10(1990)558-570; Svrzic，D.及 Schubert, D., Biochem. Biophys. Res_ Commun. 172(1990)54-60)，包括 多巴胺能神經元（Knusel, B.等人，J, Neurosci. 10(1990) 55 8-5 70)及养樹突神經膠質細胞（]^。]^〇〇48,?.八.及〇1113〇13-Dalcq, M, J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris,
F.A.等人 ’ Proc. Natl· Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R.L.及 McMorris, F.A.，J· Neurosci. Res· 30 (1991) 3 82-390)) ° US 5,093,3 1 7提到膽鹼能神經細胞之存活可藉 由投予IGF-I而增強。進一步已知IGF_i刺激周邊神經再生 (Kanje，M·等人 ’ Brain Res. 486 (1989) 396-398)且增強 鳥胺酸脫羧酶活性（美國專利5,〇93,317)。US 5,861，373及 WO 93/02695提到一種藉由增加患者中樞神經系統中IGF-I 135792.doc 200914041 及/或其類似物之活性濃度治療主要影響神經膠質及/或非 膽鹼能神經細胞之中樞神經系統的損傷或疾病的方法。 彻一係關於藉由對哺乳動物鼻腔投予包含治療有 效量之哪或其生物學活性變異體的醫藥組合物來減輕 或預防哺乳動物中樞神經系統缺血性損傷之方法。跡一 或其變異體通過鼻腔吸收且以減輕或預防與缺血事件相關 之缺血損傷的有效量傳送至哺乳動物中樞神經系統。Ep 0874641中用於製造供治療或預防中樞神經系統神經元 損傷之藥物的IGF]或IGF_„的用途，該神經元損傷係歸因 於與aids相關之癡呆症、阿茲海默氏病、帕金森氏病 (Parkinson’s Disease)、畢克氏病（pickls Disease)、亨丁頓 氏舞蹈症（HimtingWs Disease)、肝性腦病（}1—以 encephalopathy)、皮層-基底神經節徵候群（c〇rtieal basal ganglionic syndromes)、進行性性癡呆症（pr〇gressive deinentia)、 家族性痙攣性截癱癡呆症（familial dementia with spastic
parapavresis)、進行性核上麻痒（progressive supranudear palsy)、多發性硬化症（multiple sclerosis)、Schilder氏腦硬 化（cerebral sclerosis of Schilder)或急性壞死性出血腦脊髓 炎（acute necrotizing hemorrhagic encephalomyelitis)，其中 藥物為非經腸投予有效量該IGF於血-腦屏障或血-脊髓屏 障外之形式。 大腦及血清中游離IGF-I含量之減少與家族形式及偶發 形式之AD的發病機理相關。此外，IGF-I保護神經元不受 Αβ誘導之神經毒性作用的影響（Niikura, T.等人，J. 135792.doc 200914041
Neurosci. 21 (2001) 1902-1910; Dore，S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777; Dore，S.等人，Ann. NY Acad· Sci. 890 (1999) 356-364)。最近顯示向邊緣神經 投予IGF-I能夠減少大鼠及小鼠的腦中Αβ含量（Carro，E.等 人，Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397)。此外，研究證明在轉 殖基因AD小鼠模型上延長IGF-Ι治療可顯著減輕大腦澱粉 樣斑負載。該等資料有力支持IGF-i能夠藉由自腦中清除 Αβ減少腦中Αβ含量及減輕與斑相關之大腦癡呆症的觀 點。 已證明以聚乙一醇（PEG)對蛋白進行共價修飾是一種延 長蛋白質在體内循環半衰期之有益方法（Hershfield，M.S等 人，N. Engl. J. Med. 316 (1987) 589-596; Meyers，F.J.等 人。Clin. Pharmacol· Ther. 49 (1991) 307-313; Delgado, C. #A°Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.9 (1992) 249-304; Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10 (1993) 91; EP-A 0 400 472; Monfardini，C.等人。Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69; Satake-Ishikawa，R·等人。〇〇118加(^· Funct. 17 (1992) 157-160; Katre，N.V.等人。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 1487-1491; Tsutsumi，Y.等人。 Jpn. J. Cancer Res. 85 (1994) 9-12; Inoue，H.等人。J. Lab. Clin. Med. 124 (1994) 529-536; Chamow, S.M.等人。 Bioconjugate Chem· 5 (1994) 133-140) 〇 乙·一 化之其匕益處為增加〉容解性且降低蛋白質之致 免疫性（Katre，N.V.，J· Immunol· 144 (1990) 209-213)。蛋 135792.doc -10· 200914041 白質聚乙二醇化之普遍 {ΝΗ8)^^λ 日過方法疋採用以如Ν-羥基琥珀醯亞胺 (NHS)之胺基反應性試劑活 奄r # 之枭乙二醇。藉由該等試劑 聚乙一醇在诸如尺_終 胺基及離胺酸殘基之£ _胺基之 游離第一胺基處連接於蛋白質上。然而，該方法之主要偈 限於蛋白質通常含有大量離胺酸殘基且因此聚乙二醇基 以非特定方式在所有游離£_胺基處連接於蛋白質上，產生 Ik機聚乙一醇化蛋白質之不同產物之混合物。因此，許多 NHS-PEG化蛋白質由於其低特異活性不適於商業用途。生 物活性所需之N'終端胺基殘基或—或多個離胺酸殘基之共 價修飾作用、或在蛋白質活性位點或臨近活性位點之聚乙 二醇殘基之共價附接作用可產生滅活作用。例如，已發現 採用NHS-PEG化試劑對人類生長激素之修飾可使蛋白質之 生物活性減小ίο多倍（Ciark，R_等人。Bi〇h Chem. 271 (1996) 21969-21977)。人類生長激素除含有N_終端胺基酸 外還含有9個離胺酸。某些該等離胺酸位於蛋白質中已知 用於受體結合之關鍵區域（Cunningham, B.C.等人。Science 254 (1991) 821-825)。此外，採用胺基反應性聚乙二醇試 劑對紅血球生成素之修飾亦可導致生物活性幾乎完全喪失 (Wojchowski，D.M.等人，Biochim. Biophys. Acta 910 (1987) 224-232)。以胺基反應性聚乙二醇化試劑對干擾素_ α2之共價修飾可導致40-75%生物活性喪失（美國專利第 5,3 82,657號）。對G-CSF之類似修飾導致大於6〇%活性之喪 失（Tanaka，Η_等人，Cancer Res. 51 (1991) 3710-3714)且對
介白素-2之修飾導致大於90%生物活性之喪失（Goods〇n，R 135792.doc -11 - 200914041 J.及 Katre，N. V.，BioTechnology 8 (1990) 343-346)。 WO 94/12219及WO 95/32003申請包含PEG及IGF或半胱 胺酸突變IGF之聚乙二醇軛合物，該PEG於該突變體之N-終端區域之游離半胱胺酸處連接於該突變體上。wo 2004/603 00描述>^-終端聚乙二醇化1〇?-1。 【發明内容】 本發明包含IGF-I變異體，其特徵在於該變異體在野生 型IGF-I胺基酸序列之胺基酸位置27、37、65及/或68具有 胺基酸改變，以使胺基酸37、65、68中之一或兩者為離胺 酸（K)且胺基酸27為極性胺基酸而非離胺酸。 胺基酸27較佳為精胺酸。 該等IGF-I變異體作為中間體（IGF-I中間體）用於生產離 胺酸-PEG化 IGF-I。 已驚奇地發現離胺酸-PEG化IGF-I變異體（胺基-反應性 PEG化IGF-I變異體），較佳為20 kDa至100 kDa之PEG化 IGF-I變異體且尤其較佳為單PEG化IGF-I變異體，其具有 關於治療適用性之優良特性。 本發明之另一實施例係根據本發明之離胺酸-PEG化IGF-I變異體及N-終端PEG化之IGF-I變異體的組合物。其分子 比率較佳為9 : 1至1 : 9。另一較佳實施例為莫耳比率為至 少1 : 1(每份N-終端PEG化IGF-I變異體至少一份離胺酸-PEG化IGF-I變異體），較佳為至少6 : 4(每4份N-終端PGE化 IGF-I變異體至少6份離胺酸-PEG化IGF-I變異體）之組合 物。離胺酸-PEG化IGF-I變異體及N-終端PEG化IGF-I變異 135792.doc -12- 200914041 體兩者較佳為單PEG化。該組合物中離胺酸-PEG化IGF-I 變異體及N-終端PEG化IGF-I變異體兩者中之該變異體較佳 是相同的。該變異體較佳選自由RRKK、RRKR、RRRK、 RKRR組成之群。PEG較佳具有30至45 kDa，尤其30 kDa 或40 kDa之平均分子量。離胺酸-PEG化IGF-I變異體及N-終端PEG化IGF-I變異體在IGF結合蛋白（例如BP4及BP5)之 結合方面表現出相當之親和力，但具有不同IEG-IR構酸化 作用活性。 本發明提供了 一種由IGF-I變異體（IGF-I軛合物或軛合 物）及聚乙二醇基組成之軛合物’其特徵在於該IGF-I變異 體在野生型IGF-I胺基酸序列之胺基酸位置27、37、65及/ 或68具有胺基酸改變以使胺基酸37、65、68之一或多者為 離胺酸（K)，胺基酸27為極性胺基酸但非離胺酸且該PEG經 由第一胺基，較佳經由離胺酸之第一胺基軛合至該IGF-I 變異體上。 該（等）聚乙二醇基較佳具有至少20 kDa，更佳自約20至 100 kDa且尤其較佳自20至80 kDa之總分子量。 該（等）聚乙二醇基經由一個或多個胺基酸位置37、65、 68的離胺酸之第一胺基輛合至該1 GF-1變異體（胺基-反應性 PEG化作用）且視情況在N-終端胺基酸處pEG化。耗合物較 佳在一個或多個胺基酸位置37、65、68的離胺酸殘基處單 PEG化或二PEG化且視情況在N-終端胺基酸處PEG化。進 一步較佳地’輕合物在K65、K68或K37早PEG化或在K65 及K68二PEG化且視情況在N-終端胺基醆PEG化。較佳至 135792.doc • 13 - 200914041 多20%之PEG化IGF-Ι變異體額外N_终端pEG化。 IGF-I變異體係指定如下：Κ65意謂胺基酸65為離胺酸， R27意謂胺基酸27為精胺酸等。具有胺基酸R27、K37、 K65、K68之變異體指定為rkkK。IGF-I野生型係指 定為KRKK。 尤其較佳的IGF-I變異體及輛合物中之變異體為： RRKK、RRKR、RRRK、RKRR。 進一步較佳地’根據本發明之（PEG化）IGF-I變異體為其 中N-終端處至多三個（較佳全部三個）胺基酸截短之變異 體。各野生型突變體稱為Des(l-3)-IGF-I且在N-終端缺乏 甘胺酸、脯胺酸及麩胺酸胺基酸殘基（Kunirner，A.等人。
Int. J. Exp. Diabesity Res. 4 (2003) 45-57)。 該（等）聚乙二醇基為線性或分支的。 本發明進一步包含採用IGF-I中間體製備根據本發明之 軛合物之方法。該方法包含藉由IGIM中間體與活化聚乙 二醇在使得該聚乙二醇藉由IGF-I變異體之第一離胺酸胺 基化學結合至该IGF-I中間體的條件下反應來製備由igu 變異體及一或兩個聚乙二醇基組成之輛合物，該（等）聚乙 二醇基較佳具有至少20 kDa，更佳自約2〇至1〇〇 kDa且尤 其較佳自20至80 kDa之總分子量。 本發明進一步包含含有根據本發明軛合物較佳連同醫藥 學上可接受之載劑之醫藥組合物。 本發明進一步包含含有根據本發明軛合物之醫藥組合物 之製備方法。 135792.doc •14· 200914041 本毛明進步包含根據本發明之輛合物用於製備供治療 AD之藥物之用途。 I發月it纟包含治療AD之方法，其特徵在於對需要 。玄/α療之心者杈予醫藥學上有效量之胺基_反應性PEG化 IGF-I變異體，較佳每週施用一次至兩次。 【實施方式】 本文所用之"PEG化IGF-I變異體"或"胺基_反應性_pECHb 作用思e 變異體藉由胺基反應性偶合於IGF-I變異體 分子中之一或兩個離胺酸而共價結合至一或兩個聚乙二醇 基團。該（等）PEG基連接於犯!^變異體分子中離胺酸側鏈 之第一 ε-胺基之位點。PEG化作用又可能在N終端α_胺基上 發生。歸因於所用之合成方法及變異體，PEG化igf-I變異 體可由具有或無N-終端PEG化作用之在K65、K68及/或K37 處PEG化之IGF-I變異體的混合物組成，其中peg化作用之 位點在不同分子内不同或關於每個分子中聚乙二醇側鏈之 f 量及/或分子中PEG化作用之位點可大體上相似。；[GF-I變 異體較佳為單PEG及/或二PEG化且特別自N-終端PEG化 IGF-I變異體純化。 本文所用之胺基-反應性PEG化作用表示藉由使用反應性 (活化）聚乙二醇、較佳藉由使用N-羥基琥珀醯亞胺酯（較佳 地，曱氧基聚乙二醇之N-羥基琥珀醯亞胺酯）隨機將聚乙 二醇鏈連接於IGF-I變異體第一離胺酸胺基之方法。該偶 合反應使聚乙二醇連接至離胺酸殘基之反應性第一 ε-胺基 且視情況至IGF-I之Ν-終端胺基酸之α-胺基上。PEG與蛋白 135792.doc - 15- 200914041 質之該胺基輛合在此項技術中已為吾人所熟知。例如， Veronese, F.M·, Biomaterials 22 (2001) 405-417 中已給出該 等方法之評論。根據Veronese之觀點，PEG與蛋白質第一 胺基之軛合可藉由使用對該等第一胺基進行烷化作用之活 化PEG進行。對於該反應，可採用活化烷基化PEG，例如 PEG醛、PEG三氟乙磺基氯或PEG環氧化物。進一步可用 之試劑為諸如叛化PEG之經基琥珀酸亞胺酯或末端經基由 氯曱酸酯或羰基咪唑活化之PEG的醯化PEG。進一步可使 用之PEG試劑為具有胺基酸臂之PEG。該等試劑可含有所 謂分支PEG，其中至少兩個相同或不同PEG分子藉由肽間 隔基（較佳為離胺酸）連接在一起，且例如作為離胺酸間隔 基之活化羧酸鹽與IGF-I變異體結合。單-N-終端偶合亦由 Kinstler，0.等人描述於 Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 477-485 中 ° 本文所用之”PEG或聚乙二醇”意謂可市售或可根據此項 技術中已知方法自乙二醇開環聚合作用製備之可溶於水之 聚合物（Kodera，Y.等人 Progress In Polymer Science 23(1998)1233-1271; Francis, G.E·等人 Int. J. Hematol. 68 (1998)1-18)。廣泛使用之術語"PEG"包含任何聚乙二醇分 子，其中乙二醇單元之數目至少為460，較佳為460至2300 且尤其較佳為460至1 840(230個PEG單元指約10 kDa之分子 量）。PEG單元之上限數目僅受輛合物之可溶性限制。通常 不使用大於含有23 00個單元之PEG的PEG。本發明所使用 之PEG較佳為一末端為羥基或甲氧基（曱氧基PEG，mPEG) 135792.doc -16- 200914041 且另一末端經由醚氧鍵共價連接至一鍵聯部分。該聚合物 為線性或分支的。分支PEG已描述於例如Veronese, F· M.等 人Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12(1997)196-207 中。有益PEG試劑例如可自Nektar Therapeutics (www.nektar.com)獲得。 可使用實務上期望之例如自約20 k道爾頓（Da)至100 kDa(n為460至2300)之任何分子量之PEG。對於以道爾頓描 述之分子量而言約計PEG中重複單元數目"η"。例如，若兩 個PEG分子連接至鍵聯，其中每一PEG分子具有10 kDa之 相同分子量（每個η約為230)，則該鍵聯處PEG之總分子量 約為20 kDa。連接至鍵聯的PEG之分子量亦可不同，例 如，一個鍵聯上之兩個分子中一個PEG分子可為5 kDa且一 個PEG分子可為1 5 kDa。分子量總是意謂平均分子量。 在如下實例中，將描述某些用於製備胺基-反應性PEG化 IGF-I變異體之較佳試劑。已理解只要該方法產生根據本 發明之輛合物，例如可基於Veronese, F.M.在Biomaterials 22(2001 )405-417中描述之方法在程序中進行改造。 目標蛋白質中至多三個潛在反應性第一胺基（至多兩個 離胺酸及一個末端胺基酸）之出現導致一系列聚乙二醇鏈 連接點不相同之PEG化IGF-I變異體之異構體。 本發明提供改良特性之IGF-I變異體之PEG化形式。該等 PEG化IGF-I變異體輛合物含有一個或兩個線性或分支及隨 機連接至彼處之PEG基，其中軛合物中所有PEG基之總分 子量較佳為約20至80 kDa。熟習此項技術者顯然已知只要 135792.doc -17· 200914041 PEG化IGF-Ι變異體確實表現降低腦中Abeta肽含量活性， 則可能發生自該分子量範圍之小準差。具有大於80 kDa分 子量之PEG之IGF-Ι變異體PEG化亦可產生較高生物利用 率。然而，當分子量增加時由於降低IGF-Ι受體活性及減 少血-腦屏障運輸該活性可期望降低。因此，必須理解自 20至100 kDa之PEG分子量範圍作為用於有效治療罹患AD 患者之PEG及IGF-Ι變異體軛合物之最佳範圍。 本文所用之”分子量"意謂PEG之平均分子量。 下列IGF-Ι變異體之PEG化形式為本發明軛合物之實例及 本發明之涵蓋實施例： -單PEG化IGF-Ι變異體，其中該PEG基具有20至80 kDa(460至1840個PEG單元）之分子量； -二PEG化IGF-Ι變異體，其中各PEG基具有約10-50 kDa(230至1150個PEG單元）之分子量； 及其混合物。 選自由RRKK、RRKR、RRRK及RKRR組成之群之單PEG 化IGF-Ι尤其較佳，其中分支PEG基具有30-45 kDa之分子 量，較佳為40-45 kDa(約920個PEG單元）。例如，基於PEG 44 kDa之平均分子量及IGF-Ι 7·6 kDa之分子量，計算該單 卩丑040?-1之平均分子量為約51.6 1!：0&。單？£0化10?-1選 自由RRKK、RRKR、RRRK及RKRR組成之群亦較佳，其 中PEG具有30或40 kDa之平均分子量。 根據本發明"PEG或PEG基"意謂含有作為必需部分之聚 乙二醇之殘基。該PEG可進一步含有對結合反應必需之化 135792.doc -18- 200914041 學基團；其由該分子化學合成產生；或為彼此分子部分最 佳距離之間隔基。此外，該PEG可含有連接在一起之一個 或多個PEG側鏈。具有一個以上PEG側鏈之PEG基團稱為 多臂或分支PEG。分支PEG可藉由例如向各種多元醇（包括 甘油、異戊四醇及山梨糖醇）中加入聚環氧乙烷製備。例 如，四臂分支PEG可自異戊四醇及環氧乙烷製備。分支 PEG通常具有2至8個臂且描述於例如歐洲專利A 0 473 084 及美國專利第5,932,462號中。具有兩個經由離胺酸第一胺 基相連之PEG側鏈（PEG2)之PEG尤其較佳（Monfardini, C.等 人，Bioconjugate Chem. 6(1995)62-69) 〇 本文所用之”大體上均勻”意謂所產生、包含或使用之 PEG化IGF-I變異體分子僅為具有一個或兩個所連接之PEG 基之彼等。該製備可包含少量未反應（意即，缺乏PEG基） 蛋白質。藉由肽圖譜及N-終端序列所確定，下列一個用於 製備之實例提供至少90% PEG-IGF-I變異體軛合物及至多 5%未反應蛋白質。該PEG化IGF-I變異體之均勻製備物之 分離及純化可使用常規純化方法進行，較佳為尺寸排除層 析。 本文所用之”單PEG化”意謂IGF-I變異體僅在每個IGF-I 變異體分子之一個離胺酸處PEG化，其中僅一個PEG基在 此位點共價相連。該單PEG化IGF-I可在一定程度上在N-終 端額外PEG化。該純單PEG化IGF-I變異體（無N-終端PEG 化）至少為製備物之80%，較佳為90%，且最佳單PEG化 IGF-I變異體為製備物之92%或更多，其餘為例如未反應 135792.doc •19- 200914041 (未PEG化）IGF-I及/或N-終端PEG化IGF-Ι變異體。根據本 發明之單PEG化異體之製備物因此足夠均勻以顯示 出均勻製備物之例如在醫藥應用上之益處。二PEG化物質 同樣適用。 ”活化PEG或活化PEG試劑”在此項技術發展水平中已為 吾人所熟知。較佳使用諸如聚乙二醇之烷氧丁酸琥珀醯亞 胺酉旨（低碳烷氧基-PEG-SBA)或聚乙二醇烷氧丙酸琥珀醯亞 胺酯（低碳烷氧基-PEG-SPA)或N-羥基琥珀醯亞胺活化peg 之親電子活化PEG。可使用任何活化酯與胺反應形成醯胺 之習知方法。在活化PEG與IGF-Ι反應中，該例示性琥珀醯 亞胺酯係導致醯胺形成之脫離基團。採用琥珀醢亞胺酯產 生具有蛋白質之軛合物係描述於美國專利第5,672,662號 中。 使用之反應條件對不同PEG化IGF-Ι變異體之相對量有影 響。藉由控制反應條件（例如，試劑比率、pH、溫度、蛋 白質浪度、反應時間等），可改變不同pEG化物質之相對 量。該反應較佳在含有5_15%(v/v)乙醇及〇5_4%(v/v)乙二 醇’ pH 8-10之緩衝水溶液下進行。若產生單pEG化變異 體’蛋白質：PEG比例較佳為i : 〇 5至i : 2且若產生二 PEG化變異體，該比例為！ · ？， _ _ „ , □ w马1 . 2.2至1 : 5。根據熟習此項技 術者之知識可改變反鹿、、田庙H C rfc 應/JBL度及反應時間，藉此高溫及長反 應時間導致PEG化增加。甚姦斤 9 右產生早PEG化變異體，因此在4 °C及至多3 〇分鐘反應較私。木p , 。平义k。§PEG化之試劑與IGF-Ι變異體 在反應缓衝液（該緩衝液勤社士 ς Λ J從较佳由5〇 mM硼酸鈉、10%乙醇及 135792.doc -20- 200914041 10/〇二（乙二醇）(DEG)組成）中在pH約為9、蛋白質：PEG之 比例約為1 : 1.5且反應溫度自4 °C時組合時，將產生單 PEG-、二_PEG &微量三—peg化物質之混合物。當蛋白 質：ΡΕϋ比率為約1 : 3時，主要產生二peg化及寡聚-PEG 化物質。 根據本發明該IGF-I變異體軛合物可藉由igF-I變異體之 第一離胺酸胺基與雙官能試劑共價反應以形成含有醯胺鍵 聯之中間體且該含有醯胺鍵聯之中間體與活化聚乙二醇衍 生物共價反應形成IGF-I變異體辆合物製備。在前述方法 中’該雙官能試劑較佳為N-琥珀醯亞胺-s_乙醯硫代丙酸 酯或N-琥珀醯亞胺-S-乙醯硫代乙酸酯，且活化聚乙二醇 衍生物較佳選自由碘基-乙醯基-曱氧基_peg、曱氧基_ PEG-乙烯砜及甲氧基-PEG-順丁烯二醯亞胺組成之群。 使用分子量為40 kDa之N-羥基琥珀醯亞胺活化之分支 PEG S旨（mPEG2-NHS)尤其較佳（M〇nfardini，c 等人，
Bi〇conjUgate Chem. 6 (1995) 62-69; Veronese，F.M.等人， J’ Bioactive Compatible p〇lymers I〗（1997) 197.207 ;美國 專利 5,932,462號）。 s亥IGF-I變異體軛合物可藉由硫醇基與tgfj變異體之胺 基-反應性共價連接（活化作用）及將所得活化jGFd變異體 與聚乙一醇（PEG)衍生物偶合製備。第一步包括經由 變異體之離胺酸NHy基之硫醇基共價連接。該π。〗變異 體之活化作用較佳以具有保護硫醇基及額外反應基團之雙 官能試劑進行，諸如為磺酸活性酯（例如，琥拍醯亞胺 135792.doc •21 · 200914041 醋）、續酸酐、磺酸酯及分別羧酸_化物及磺酸鹵化物。 硫醇基由此項技術中已知之基團（如乙醯基）保護。該等雙 官能試劑能夠藉由形成醯胺鍵聯與離胺酸胺基酸之ε -胺 基反應。該雙官能試劑之製備在此項技術中已知。雙官能 NHSS旨之前驅物已描述於DE 39 24 705中，而乙醯硫基化 〇物之竹生化作用係由March, J.描述於Advanced Organic Chemistry(1997)375-376中。該雙官能試劑SATA可購得 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rockford, IL) 且描述於 Duncan, R.J.，Anal. Biochem. 132 (1983) 68-73 中o 該反應在例如pH 6.5-8.0水緩衝溶液（例如在10 磷酸 鉀、300 mM NaCl，pH 7.3中）中進行。雙官能試劑可在 DMSO中加入。反應完成後，較佳在3〇分鐘後，該反應藉 由加入離胺酸停止。過量雙官能試劑可藉由此項技術中已 知之方法（例如透析或柱過濾法）分離。加入IGF_〗變異體中 之硫醇基之平均數目可藉由例如Grasetti，D.R及Murray， J.F_在 Arch. Biochem Biophys. 119( 1967)41-49 中描述之光 度測定法測定。上述反應之後係活化聚乙二醇（PEG)衍生 物共價偶合。 活化PEG衍生物在此項技術中已知且用於peg-乙烯砜描 述於例如 Morpurgo，M.等人之 J_ Bioconjugate Chem. 7 (1996) 3 63-3 68中。線性鏈及分支鏈pEG物質適合於製備式 I化合物。反應性PEG試劑之實例為碘基-乙醯基-甲氧基_ PEG及甲氧基-PEG-乙烯礙。該等碟基-活化物質之用途在 135792.doc -22- 200914041 此項技術中已知且例如由Hermans on，G.T.描述於
Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996)第 147-148頁中。 根據本發明包括單-PEG及/或二PEG化IGF-I變異體及較 佳自N-終端PEG化形式分離之該等化合物之進一步純化可 藉由此項技術中已知之方法進行，例如柱層析、較佳為離 子交換層析尤其是陽離子交換層析。 該單-PEG軛合物之百分率及單—peg及二-PEG物質之比 率可藉由收集溶離峰周圍較廣泛溶離份以降低較窄溶離份 中單-PEG之百分率以增加組合物中單_pEG百分率來控 制。約90%之單-PEG軛合物為產量及活性之較好平衡。有 時可期望其中例如軛合物之至少95%或至少98%為單_PEg 物質的組合物。在本發明之實施例中單peg化軛合物之百 分率為自90%至98%。 本文所用之"極性胺基酸"指選自由半胱胺酸（c)、天冬胺 酸（D)、麵胺酸（E)、組胺酸（H)、天冬醯胺酸（N)、麩醯胺 酸（Q)、精胺酸（R)、絲胺酸（S)及酥胺酸（τ)之胺基酸。離 胺酸亦為極性胺基酸，但是不包括在内，因為根據本發明 可置換離胺酸。精胺酸為較佳使用之極性胺基酸。 醫藥調配物 根據本發明之PEG化犯^丨提供在循環中之改良穩定性， 在短施用間隔内能夠持續接近遍及全身之受體。 PEG化IGF-I變異體可作為混合物或作為離子交換層析或 尺寸排除層析分離之不同peg化物質投藥。本發明之化合 135792.doc -23- 200914041 ,可根據製備醫藥組合物之方法調配，其中該等方法為熟 習此項技術者所習知。為生產該等組合物，根據本發明: PEG化IGF-Ι變異體可與醫藥學上可接受之載劑、較佳藉由 相對於含有所期望醫藥組合物成分之水溶液透析來混合性 組合。該等可接受載劑係描述於例如由Oslo等人編輯之 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 199〇j Mack Publishing Company(例如第 1432_1712頁）中。典型組 合物含有有效量之根據本發明之物質（例如自約〇1至ι〇〇 mg/ml)與適量載劑。組合物可非經腸投藥。根據本發明之 PEG化IGF-I較佳經由腹膜内、皮下、靜脈内或鼻腔内施用 投藥。 根據本發明之醫藥調配物可根據此項技術中已知方法製 備。通常，PEG化IGF-I變異體溶液相對於用於醫藥組合物 之緩衝液來透析且可藉由濃縮作用或稀釋作用調整所期望 之最終蛋白質濃度。 醫藥組合物可用於注射或輸注，較佳經由腹膜内 '皮 下、靜脈内或鼻腔内施用投藥且含有有效量peg化IGF_Lf 異體與醫藥學上可接受之稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化 劑、佐劑及/或載劑。組合物包括各種緩衝成分（例如精胺 酸、醋酸鹽、磷酸鹽）、pH及離子強度之稀釋劑、諸如清 潔劑及增溶劑（例如吐溫TM 8〇/聚山梨醇酯，聚醚TM F68)之 添加劑、抗氧化劑（例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉）、防腐 劑（TimersolTM、苯甲醇）及增積物質（例如蔗糖、甘露糖 醇）、併入該物質於諸如聚乳酸、聚乙醇酸等之聚合化合 135792.doc -24- 200914041 物之微粒製備物中或於脂質體中。該等組合物可影響根據 本發明之單-PEG化IGF-Ι之物理狀態穩定釋放速率及清除 速率。 劑量及藥物濃度 通常在標準療法中，在一定的時間期間以每天每公斤體 重自0.001至3 mg較佳0.01至3 mg之劑量範圍之peg化IGF-Ϊ變異體治療患者，可持續一天至約30天或更長。藥物可 以單一每日皮下或iv(靜脈注射）或ip(腹膜内）大丸劑注射或 輸注每宅升含有〇·1至1〇〇 mg PEG化IGF-I之醫藥調配物施 用。該治療可藉由在標準治療之前、期間或之後施用peg 化IGF-I而與任何標準（例如化學療法）治療組合。此與單獨 使用標準療法相比導致改良結果。 已發現根據本發明之PEG化IGF-I每週投藥僅一次或兩次 就可用於成功治療。因此本發明之另一實施例係用於治療 阿兹海默氏症之方法，其包含對需要此治療之患者投予治 療有效量之根據本發明之PEG化IGF-I，一次投藥劑量範圍 在每公斤及每3-8天’較佳每7天0.001至3 mg，較佳0.01至 3 mg之範圍内之pEG化IGF-I變異體。因為使用之PEG化 IGF-I較佳為單peg化IGF-I，較佳使用根據本發明之離胺 酸-PEG化IGF-I變異體及N-終端PEG化之IGF-I變異體之組 合物，其莫耳比至少為i : 1。 本發明之另一實施例係根據本發明之PEG化IGF-I用於製 備治療阿茲海默氏症之藥物之用途，其以其治療有效量對 需要此治療之患者投藥，且一次或兩次給藥劑量在每公斤 135792.doc -25- 200914041 及每6 8天，較佳每7天〇 〇〇1至3叫，較佳〇別至]那之範 圍内之PEG化IGF-I變異體。因為使用之卩即化工证]較佳 為單〇化IGF I ’較佳使用根據本發明之離胺酸_peg化 卿-旧異體及N.終端㈣化之咖小變異體之組合物，其 莫耳比至少為1 : 1。 提（、下列實例、參照案及圖以助於理解本發明，其實際 範可陳述於附加申請專利範圍中。應理解在不偏離本發明 精神情況下可對陳述之程序進行修改。 序列清單 人類IGF-I之SEq ID N〇 : j胺基酸序列（根 據 SwissProt P01343 IGF-I之1-70位胺基酸；71_1〇5位胺基酸為原生 肽）。 實例 材料及方法 重組人類類姨島素生長因子（rhIGF-I)經由Celi Concepts (Umkirch ’ Germany)購自 pepr〇Tech(R〇cky Hill，NJ， USA)且 Des(l-3)-IGF-I 自 GroPep(Adelaide，Australia)獲 知·。聚乙二醇（PEG)試劑由 Nektar Ltd.(San Carlos，CA， US A)交貨。所有其它用於此研究之化學物品及溶劑具有 可獲得之最高純度。IGiM變異體可根據此項技術發展水 平重組生產’例如藉由採用定位突變結合例如在美國專利 6,5 09,443或美國專利6,4〇3,764中所述較佳在大腸桿菌中之 表現方法。 IGF-I 之 PEG 化 135792.doc -26- 200914041 可生產在單位點PEG化之IGF-Ι異構體（單PEG-IGF-Ι)。 單PEG-IGF-I可藉由離胺酸ε -胺基在IGF-I分子表面或N-終 端與分子量為40 kDa之活化分支PEG部分共軛來製備。 P£G化反應混合物含有在50 mM硼酸鈉缓衝液（10〇/〇乙醇及 1% DEG)，pH 9.0 中莫耳比率為 1 : 1.5之 rhIGF-I及 40 kDa PEG-NHS試劑。該反應在4 〇C進行30分鐘。基於使用之 PEG部分之44 kDa的平均分子量及用於IGF-Ι之7.6 kDa的 分子量，計算單PEG-IGF-Ι的平均分子量預期約為51.6 kDa。 藉由離子交換層析法之PEG-IGF-Ι位置異構體之分離 採用製備強陽離子交換柱（TOSOH-BIOSEP，SP-5PW， 内徑30 mm且長75 mm)之純化流程以製備純單PEG-IGF-I 異構體。該緩衝系統由7.5 mM醋酸鈉、10%乙醇及1%二乙 二醇’調整pH至4.5(缓衝液A)及20 mM磷酸鉀、10%乙醇 及1%二乙二醇，調整pH至6.5(緩衝液B)所組成。 以25%緩衝液B預平衡該柱。在負載PEG-IGF-Ι樣品後， 以35%緩衝液B洗滌該柱，隨後以線性梯度增加緩衝液B至 65%以分離異構體。對非PEG化IGF-Ι之溶離，轉換系統至 pH 8.0之改良缓衝液B。流動速率為8 ml/min且在218 nm處 進行偵測。手工收集所得之蛋白質樣品且在-20°C等分儲 存以藉由各種蛋白質之化學及生物學檢定（見下文）進行分 析。 採用分析強陽離子交換柱（TOSOH-BIOSEP，SP-NPR， 2.5 μηι粒徑，直徑4.6 mm，長3.5 cm)以研究分離位置異構 135792.doc •27- 200914041 體之純度。對此分析柱，吾人採用與製備柱相同之移動 相，但減小流動速率且縮短流動時間。單PEG-IGF-I異構 體之蛋白質濃度可藉由分光光度技術基於單PEG-IGF-I蛋 白質部分在28〇 nm處吸收（E28〇img/mI = 0·584)測定。 單PEG-IGF-I純度之分析 藉由4-12% Tris-甘胺酸SDS-PAGE在非還原或還原條件 下對各單PEG-IGF-I異構體進行分析。固定該蛋白質且採 用 Simple Blue SaveStain(Invitrogen, Basel，Switzerland)染 色。 單PEG-IGF-I異構體之質譜鑒別 以Asp-N裂解經純化之單PEG-IGF-I異構體以鑑定在Ν·終 端、K27、K65或K68之四個可能PEG化位點。該裂解緩衝 液由含有 0.04 pg/μΐ之 Asp-N (Roche Diasnostics GmbH, DE) pH 8.0之 100 mM Tris/HCl组成。將 20 單 PEG-IGF與 1 gg Asp-N在裂解緩衝液中在37°C培育16小時。16小時後 向該反應混合物中加入TCEP(10 mM)在37°C還原1.5小時。 隨後藉由加入1/20體積之10% TFA使該反應混合物淬火以 終止該裂解反應。所獲得之肽混合物可藉由在線-HPLC ESI質譜、HPLC直接分析或在-80°C儲存。 對ESI-LC-MS分析’狀混合物可在配備有流動速率為40 μΐ/min 之 Phenomenex Jupiter C18反相柱（1 x250 mm，5 μηι，300人）之 Agilent 1100 HPLC 系統上分離。亦在 220 nm 處記錄該紫外（UV)訊號。一 Q-ToF II或LCT質譜儀 (Micromass)可直接偶合至HPLC系統。EST-ToF光譜可在 135792.doc • 28 - 200914041 200-2000 m/z質譜範圍内以1 scan/s記錄。可估算UV及TIC 光譜值且各肽可指定為層析圖中之單峰。 對PHLC分析，肽混合物可在配備有流動速率為40 μΐ/min之Phenomenex Jupiter C18反相柱（1x250 mm，5 μηι， 30〇Α)之Agilent 1100 HPLC系統上分離。亦在220 nm處記 錄UV訊號。PEG肽在滯留時間内可向較高乙腈濃度移動且 可手工收集且經受N-終端Edman降解。 HPLC運作之條件（溶劑A : 0.1% TFA水溶液，溶劑B : 0.1 % TFA乙腈溶液）係顯示於表1中： 表1 : 梯度： 時間 %B 0 0 10 0 30 20 60 28 70 48 80 100 85 100 86 0 96 0 將N-終端Edman降解測序在根據N-終端Edman降解測序 之Applied Biosystems Procise系統上進行，且根據廠家說 明書在具有Procise系統控制軟體之Applied Biosystems Proteinsequencer Procise 492上進行。自 HPLC運行收集之 20 μΐ溶離份可直接施用於BioBrene卩丨旧^調整之微TFA過 濾器。該過濾器在氬下盒式密閉乾燥且引入蛋白質胺基酸 序列分析儀中。採用自動標準化程式進行多肽序列降解。 135792.doc -29- 200914041 以Applied Biosystems資料評估軟體61〇A對來自各降解循 環之HPLC層析圖之分析揭示各胺基酸之位置。半胱胺酸 及如PEG化離胺酸之修飾胺基酸呈現為層析圖中之一間 隙。 寡核苷酸陣列轉錄分析 對不同單PEG-IGF-I異構體之活體外轉錄分型，以igf_ IR穩定轉染之NIH-3T3細胞血清不足維持2小時且在無血清 下以0.1或1 pg/mlrhIGF及1 pg/mi各單PEG_IGFI異構體或 未分離之所獲所有異構體混合物培育24小時。隨後收集培 養之細胞且以RNA-BeeTM提取全部細胞RNA。藉由採用 商業上可獲得之套組（Invitr〇gen, Basel，8讀26山_ Ambion, Huntingdon，UK)根據供應者說明書對來自各樣品 中10 RNA進行反轉錄、標記及處理。用於鹼化熱斷裂 之方法及用於MOE 430A GeneChip陣列之雜交條件為由製 造商（Affymetrix，US)提供之標準化程序。 以共焦雷射掃描器記錄陣列之螢光（細胞密度）且採用 mas 5.〇軟體（Affymetrix ’ us)分析資料。各基因之表現量 以與錯配募核苷酸之雜交相比之螢光強度之標準平均差計 异，其以平均差（AD)表示。各試驗進行三次以慮及生物學 變異。 對不同表現基因之選擇採用下列兩個標準：”處理細胞 之mRNA 3里值必須至少高於未處理細胞值之五倍或低於 ，五倍，ii)標準差必須顯著小於平均差之絕對改變且所計 算之基因置信水平設定為大於97%(p<〇.〇3)。 135792.doc -30- 200914041 IGF-IR磷酸化檢定 該等試驗以2至4次繼代採用以人類IGF_IR穩定轉染之 NIH-3T3細胞。在未塗覆24-或96-孔板上培養細胞且生長 至70%融合。隨後’細胞血清不足培養隔夜且而後以 rhIGF-I或各PEG-IGF-I峰（或混合峰）培育3〇分鐘。然後在 Laemmli緩衝液中將細胞溶解用於西方分析或以4%三聚甲 路固定30分鐘用於IGF-IR磷酸化之細胞内分析。對西方分 析’以10% Bis-Tris SDS-PAGE分離蛋白質提取物且轉潰 於破化纖維膜上。轉潰物與小氣-抗-磷酸化酪胺酸 (4G10，1 : 1〇〇〇 ; Upstate)及兔-抗 _IGF-IR(c_2〇，j : 1000 ; Santa Cruz)第一抗體共同培育且以抗_小鼠_ Alexa68〇(1 : 10000 ; Molecular Pr〇bes)及抗-兔 _iRDye8〇〇 第二抗體（1 : 10000 ; jackson)標記。對細胞内分析將固 定細胞阻滯且以2%山羊血清及Trit〇n χ·1〇〇(〇1%)滲透化 處理且以相同第一及第二抗體培育。以Ο — —成像系統 (Licor Biosciences)進行蛋白質帶的螢光偵測。從數位圖像 看，蛋白質帶之像素強度可定量且可採用Graphpad pdsm 軟體分析劑量反應曲線。磷酸化酪胺酸含量可以自所關注 相同區域獲得之IGF_ir值標準化以獲得正確igf_ir活性變 化。，驗雙重進行且重複3次以獲得每—劑量之6個獨立研 究。資料以平均值± SEM表示。 rhIGF-I及ρΕ(ϊ·ι〇ιμ異構體之活體内試驗 採用由單-轉殖基因App小鼠及雙-轉殖基因pMAAp小鼠 組成之用於阿茲海默氏症之小鼠模型㈢咖他，j g，等人， 135792.doc -31 - 200914041 J. Neurosci· 23 (2003) 8989-9003)研究最近已在其它小鼠 及大鼠模型中表現出之rhIGF-I(及單PEG-IGF-I)對腦部澱 粉樣變性之影響（Carro，E·等人，Nat·Med.8 (2002) 1390 13 97)。PS2APP小鼠模型已顯示出在2月大時出現具有可量 測Abeta含量之澱粉樣變性且在8月年齡時發生斑沈積 (Richards，J.G.等人，J. Neurosci. 23 (2003) 8989-9003)。 單-轉殖基因APP小鼠在此年幼時顯示出非常相似之Abeta 含量且因此包括在該等組内。吾人分析成斑前年齡（2-3月） 以研究rhIGF-I及PEG-IGF-I異構體對可溶性腦部Abeta含量 之影響。所有試驗遵守瑞士動物保護權利進行且對動物之 傷害保持在最小程度。自1 mM HCl(rhlGF-I)或含有10%甘 油之PBS儲備液在溶劑少於1%之0.9% NaCl中製備（單PEG-IGF-I異構體）注射液。對照組注射0.9% NaC卜在輕微的異 氟烷麻醉下進行腹膜内注射。注射後不同時間點（2 h、6 h、 24 h、48 h或72 h)在異氟烷麻醉下處死動物。小鼠斷頭且 移除腦以便分離端腦（包括海馬體之皮層）。在具有蛋白酶 及磷酸酶抑制劑混合物（均來自Sigma)之含有4 mM Tris pH 7·4及32〇 mM Sucrose (均來自Fluka)低渗溶解缓衝液中製 備皮層蛋白質提取物。樣品緩衝液為含有8 Μ尿素（Fluka) 之 Laemmli。以4-12% Bis-Tris SDS-PAGE分離蛋白質且轉 潰於硝化纖維膜上。轉潰物與檢測APP、C99片段及A冷之 小鼠-抗-澱粉樣前驅蛋白（APP)(WO-2純系，1:5000; The Genetics Company)及山羊-抗-肌動蛋白（C-11，1:5000; Santa Cruz)第一抗體共同培育且以抗-小鼠- 135792.doc -32- 200914041
Alexa680(l:i〇000 ; M〇lecular pr〇bes)及抗山羊 _iRDye8〇〇 第一杬體（1:10000 ; jacks〇n)標記。以〇dyssey成像系統 (Uc〇r Biosciences)進行蛋白質帶之螢光偵測。從數位圖像 看，蛋白質帶之像素強度可採用Graphpad pHsm軟體分 析。資料以平均值± SEM表示。 所有值以肌動蛋白（或作為對照蛋白之白蛋白）標準化且 计算特定比率（C99/APP，Αβ/ΑΡΡ，C99/Ap)。C99/APP 比 率可提供關於β-及γ _分泌酵素之活性狀態之資訊，因為 C99為β-分泌酵素之產物且為分泌酵素之受質；此度量 之改變將表示獨立於Αβ之稍後結局的對於該等分泌酵素中 的一者的調節作用。以特定處理後恆定C99/App之含量， C99/AP比率監控獨立於其生產之Αβ清除，其生產在清除 速率增加時較高且在清除速率降低時減低。此外，人@以 ΑΡΡ標準化’因為其生產依賴於個別小鼠間不同之轉殖基 因ΑΡΡ表現。對各個動物進行此比率計算。所有獲得資料 ( 以包括在各試驗中之未處理對照組值之％表現。每-劑量/ 時間間隔具有2·5隻動物之各試驗重複2_4次。採用未配對 檢驗以Ρ<0.05表示顯著統計學差異來分析平均值±seM2 統計學差異。 實例1 單PEG-IGF-I位置異構體之層析分離 IGF-I含有4個胺基作為潛在pEG化位點且預期4個可能之 單PEG化之IGF](單咖挪…異構體。期望另夕卜衍生物 視反應條件而定經寡PEG化。強陽離子高壓液相層析方法 135792.doc -33 - 200914041 (IEC-HPLC)基於其局部電荷差異用於分離PEG-IGF-Ι或-Des(l-3)-IGF-I異構體。5 mg PEG-IGF-I之製備性溶離曲線 顯示於圖1中。此方法之結果為分離成5個主要峰，3個峰 具有基線分離且2個具有部分分離。層析圖末端基線吸收 之減少表明無額外單PEG化IGF-I物質在更長滯留時間下溶 離。由於變換至具有不同pH之改良緩衝液B，在峰3及4之 間出現一額外峰。分析性IEC-HPLC用於評估IEC溶離份中 個體異構體之純度及藉由其他位置異構體之污染。所有單 PEG化之峰具有>99%之純度。 實例2 單PEG-IGF-Ι異構體之SDS-PAGE分析 在非還原及還原條件兩者下進行SDS-PAGE以評估不同 IGF-I分子經由分子間雙硫橋之潛在非所要交聯。兩種條 件產生類似結果表明無顯著量蛋白質異常交聯（圖2)。 SDS-PAGE分析顯示峰0具有>100 kDa之表觀分子量，然而 偵測之最大帶為約70 kDa下之峰1-3 ;此外，峰4經偵測於 約7 kDa處（在預期為未PEG化IGF-I之尺寸下）（圖2)。自 HPLC中獲得之此運行曲線及滯留時間，吾人斷定峰0最可 能由二-及寡PEG-IGF-Ι組成。相反，峰1-3指定為3個不同 單PEG-IGF-Ι異構體。單PEG-IGF-Ι預期之分子量（51.6 kDa)與約70 kDa之表觀尺寸之間具有差異；然而，觀察之 更高表觀分子量可藉由更大之PEG流體動力學體積解釋， 因為水結合相當地減慢PEG-IGF-Ι之電泳運動性且增加表 觀分子量（Foser, S.等人，Pharmacogenomic J. 3 (2003) 135792.doc -34- 200914041 319)。總之’ IEC-HPLC及SDS_PAGE試驗表明可認為肌 溶離份之純度足夠純可用於進一步特徵化。 單PEG-Des(l-3)-IGF·〗之PEG化及分離對應rhiGF i進行 且產生類似3個主要單PEG-Des(l-3)-IGF-I峰。 實例3 單PEG-IGF-I異構體之分析 以Asp-N裂解rhIGF-I釋放藉由HPLC在3〇與45分鐘滯留 時間之間分離之6個獨立肽片段（圖3A，上面板）。在裂解 純化之峰1至3之後（圖3A，下面板），觀察到6個片段之不 同分配且出現額外片段（片段7)在約70分鐘滯留時間溶離。 對於峰1，特定肽片段4隨著片段7之同時增加而減少。對 於峰2，吾人觀察到片段3明顯減少且片段5輕微減少及主 要及次要PEG片段（7及7·)之出現。類似地，峰3之Ηριχ分 析產生片段3及5隨著片段7及7,之同時出現而明顯減少。圖 11B顯示藉由rhIGF-I之Asp-N裂解獲得之各片段之肽序 列。使用Edman N-終端肽降解，吾人分析經pEG化之峰 1、2及3獲得之主要片段7之肽序列。因此，半胱胺酸及 PEG化之胺基酸造成肽序列之間斷。使用此分析，峰}可 明顯定位為在K27經PEG化之rhIGF-I(圖3C)。對於峰2，主 要片段7(>90%)定位為經PEG化之K65，因為K68藉由
Edman降解證實為未經修飾之離胺酸（κ)。相反，峰3之溶 離份在K68(序列中之間隙）造成PEG化，且K65導致Edman 降解HPLC層析圖中之訊號（圖3C)。次要峰7，不可藉由 Edman降解測序表明Ν·終端最不可能藉由pEG化實現反 135792.doc -35- 200914041 應。總之，該等資料表明峰1由K27 PEG化之異構體組 成，峰2係在K65經PEG化之IGF-I且峰3為K68 PEG化且經 顯著量N-終端PEG化之IGF-I。 實例4 rhIGF-I及單PEG-IGF-I異構體之轉錄分型 使用DNA微陣列，吾人測定經人類IGF-IR穩定轉染之 NIH-3T3細胞經以rhIGF-I或PEG-IGF-I異構體24h處理之轉 錄反應。因此，吾人以0.1及1 pg/ml之IGF-I或以自PEG化 反應獲得之1 pg/ml單PEG-IGF-I峰或峰混合物刺激細胞。 吾人使用含有探針組之市售晶片型（MOE 430A ; Affymetrix Inc.)比較經刺激之細胞與對照組培養物之整體 轉錄活性，該等探針組用於包括所有已知IGF-I反應基因 之約I4,000種小鼠基因。mRNA豐度表達為最佳匹配之募 核苷酸探針及在中心位置具有錯配之相應探針之間之平均 差異（AD)。吾人僅考慮三個生物學複本中具有大於5之變 化因子及97°/。再現性（p-值<〇.〇3)之基因。此分析藉由所有 IGF-I變異體產生總共162個基因，86個經上調節及76個經 下調節。不同單PEG-IGF-I異構體之轉錄活性之一般相關 性曲線以圖4中之上及下調節之階層架構叢集形式說明。 0.1 pg/ml及1.0 pg/mi IGF-I個體基因之誘導含量之檢查顯 示所選之叢集十分類似。峰3產生與相同濃度之未PEG化 之IGF-I類似之表達曲線且其較之PEG-IGF混合物及其它峰 更有效。令人關注地，峰2引發如PEG-IGF混合物之類似 轉錄反應。與生物學活性一致，峰1顯示最弱轉錄反應， 135792.doc -36- 200914041 表明PEG化干預受體相互作用。 實例5及6 藉由rhIGF-I及單PEG-IGF-I活體外IGF-IR破酸化 對於IGF-IR活化之活體外分析，使用穩定表達人類ι〇ρ_ IR之NIH-3T3細胞。血清不足隔夜之後，細胞經増加劑量 之 rhIGF-I 或各 PEG-IGF-I 異構體（〇·〇〇3·10 μ§/ηι1)處理。磷 酸化IGF-IR之西方分析根據上文所述進行且獲得之劑量反 應曲線擬合包括Hill係數（nH)之一位點結合動力學；締八 曲線之定量資料顯示於圖6之表中。rhIGF-I之劑量反應（圖 5A)產生6_3 nM之ECm且幾乎以卟為2.27之全有或全無方式 出現（圖6)。相反，單PEG-IGF-I之峰1對不飽和、〇·34之叫 及91.5 nM之評估ECm不顯示明顯劑量反應（圖5b、6)。峰2 及3(圖5C及5D)顯示分別具有13.4及21.5 nM ECm值之類似 結合親和力（圖6)。在兩者情況下，nH正常分別為丨及 1.19。峰混合物以28.8 nM之ECm及1.28之正常邱之輕微較 低親和力展示類似IGF-IR活化模式（圖5E、7)。最終， PEG-Des(l-3)-IGF-I峰 3 以 10.8 nM 之 EC5〇 及 1_〇8 之正常叫具 有所有PEG異構體之最高親和力（圖5F、7)。資料表明，除 了蜂1之外之所有峰以與rhIGF-I相比之2-5倍親和力損失來 特異活化人類IGF-IR。 實例7 藉由rhIGF-I降低2個月大PS2APP小鼠之活體内Abeta 雙轉瘦基因PS2APP小鼠用於分析rhIGF-I對腦Abeta負载 之短期作用。吾人以50 pg/kg rhIGF-I腹膜内處理該等小鼠 135792.doc -37- 200914041 且在注射之後2 h分析皮層Αβ。圖7A顯示自2個月大小鼠之 腦提取物之西方轉潰物。而ΑΡΡ、C99及對照組蛋白質（白 蛋白）含量似乎未藉由rhIGF-I而變化，Abeta含量在rhIGF-I 注射之後2 h降低。進行定量分析且計算各像素強度之比 率以獲得關於rhIGF-I對Abeta產生之潛在作用之資訊。此 分析揭示APP/對照組蛋白質（97·5±5·7%對照組）及 099/八？？（87.2+9.8%對照組）比率不變化表明轉殖基因入？卩 表現或ΑΡΡ處理在經rhIGF-I處理之後2 h均不變化（圖7Β)。 相反，Abeta/APP顯著下降至68.4±7.1%對照組（p<0.01)且 C99/Abeta增加至 157.9±16.6%對照組（ρ<0·01)，表明 rhlGF-I降低Abeta。總之，該等資料表明經rhIGF-I處理年幼 PS2APP小鼠2 h主要增加Abeta自腦部之清除。 實例8 藉由rhIGF-I降低PS2APP小鼠中活體内Abeta之時程 對於評估rhIGF-I對可溶性腦部Abeta之此短期作用之時 程，缺乏腦斑之年幼PS2APP小鼠（2個月年齡）藉由腹膜内 注射50 pg/kg rhIGF-I處理且之後2、6或24 Μ貞測皮層 APP、C99、Abeta及肌動蛋白含量。ΑΡΡ/白蛋白及 C99/APP比率在研究之任何時間點不藉由rhIGF-I顯著變 化。在注射之後2 h觀察到藉由rhIGF-I降低Abeta/APP，而 此作用在6及24 h之後消失（圖8A)。類似地，藉由 C99/Abeta比率監測之Abeta減少量之增力口僅在2 h可摘測且 在6及24 h消失（圖8B)。此表明rhIGF-I對Abeta清除之作用 可能由於血流中分離之IGF-I之短半衰期而具有短持續時 135792.doc -38- 200914041 間。 實例9 2月大APP及PS2APP小鼠中峰1-3活體内Abeta清除效能之 比較分析 在此實例中，一起顯示PEG-IGF-I峰1-3之資料以直接比 較Abeta降低及Abeta清除之效能。與rhIGF-I類似，APP/肌 動蛋白（肌動蛋白本文用作對照組蛋白質）或C99/APP比率 未藉由峰1、2或3之任何濃度而變化。峰3在腹膜内注射之 後6 h對減少Abeta/APP具有最高效能（圖9A)。相反，峰1在 測試之整個濃度範圍無活性且峰2僅在所用之最高濃度 (500 pg/kg)對Abeta/APP之降低發揮顯著作用。類似地， 如圖9B所示，峰3為在低劑量（15-50 pg/kg)具有增加 C99/Abeta比率（表示增力σ Abeta之清除）之活性的唯一化合 物。在此評估中，峰1亦無活性且峰2僅在500 pg/kg發揮顯 著作用。總之，該等資料表明在此活體内實驗性範例中峰 3為最大活性之單PEG-IGF-I異構體。圖11顯示單獨雙轉殖 基因PS2APP小鼠模型中之結果。 實例10 PS2APP小鼠中藉由峰3降低活體内Abeta時程 腹膜内注射之後6 h，50 pg/kg峰3在減少腦部Abeta含量 中發揮顯著作用。為了測試此作用維持多長時間，吾人分 析自經50 pg/kg峰3處理2、6、24、48及72 h之PS2APP小 鼠的腦提取物。整個時期内APP/肌動蛋白或C99/APP比率 未觀察到顯著變化。相反，Abeta/APP含量在腹膜内注射 135792.doc -39- 200914041 之後6、24及48 h顯著減少（分別ρ<0·05、p<0.001及 ρ<0·0 1 )，指示在至少48 h内峰3之Abeta降低作用（圖 10A)。獨立於Abeta產量（因為C99/APP保持恆定）地表示 Abeta清除之C99/Abeta比率在注射之後至少24 h較好維持 之十分類似時程中顯著增加（圖10B)。總之，該等資料論 證峰3能夠減少PS2APP小鼠腦部Abeta。圖12顯示單獨雙 轉殖基因PS2APP小鼠模型中之結果。 實例11 至IGF結合蛋白質IGFBP4(BP4)及IGFBP5(BP5)之結合 鐾別 IGFBP4(SwissProt 22692)且藉由 Shimasaki，S.，Mol· Endocrinol. 4 (1990) 1451-1458 選殖。鑒別 IGFBP5 (SwissProt 24593)且藉由 Kiefer, M_C., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176 (1991) 219-225選殖。兩種結合蛋白質 於大腸桿菌中重組產生。 對於蛋白質相互作用之表面電漿共振（SPR)分析’使用 Biacore 3000設備。運行及反應緩衝液為25°CTiHBS-P(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0_005%聚界面活性劑， pH 7.4)。所有樣品在12°C下預冷卻。IGFBP4及IGFBP5在5 pg/ml濃度下胺偶合。CM5晶片上之偶合導致約700 RU之 負載訊號。PEG化之IGF-I樣品（分析物）以在1.23 nM及1〇〇 nM之間之5種濃度注射5分鐘（締合相）且在50 μΐ/min之流動 速率下以HBS-P洗滌5分鐘。晶片表面藉由一次注射1〇〇 mM HC1 達 1 min再生。 注射物之晶片、檢定格式及序列對應於表2中描述。資 135792.doc -40- 200914041 料評估藉由使用1:1朗缪爾（Langmuir)結合模型進行。 表2 : 晶片 配位體 分析物 ka(l/Ms) kd(l/s) KD(M) CM5 BP4 IGF-I 4.0 x 106 7.2 χ ΙΟ·4 1.8 χ 10'1ϋ CM5 BP4 40 kDa/NT-RRRK 5.4 x 104 1.5 χ ΙΟ'3 2.8 χ ΙΟ'8 CM5 BP4 40 kDa/RRRK 7.1 χ 104 6.8 χ ΙΟ'4 9.5 χ ΙΟ·9 CM5 BP4 組合物 6.9 χ ΙΟ4 5.3 χ ΙΟ'4 7.7 χ ΙΟ·9 CM5 BP5 IGF-I 9.6 χΙΟ6 1.6 χ ΙΟ'3 1.7 χ 10-10 CM5 BP5 40 kDa/NT-RRRK 1.1 χΙΟ5 2.1 χ 10_j 2.0 χ ΙΟ'8 CM5 BP5 40 kDa/RRRK 1.5 χΙΟ5 2.0χ1〇·3 1.3xlO's CM5 BP5 組合物 1.1 χ ΙΟ5 2.5 χ 10'j 2.3 χ ΙΟ'8 < 縮寫： 40 kDa ： 40kDaPEG分支
40 kDa/NT-RRRK ：以 40 kDa PEG N-終端 PEG化之RRRK 40 kDa/RRRK ： 在K68 以 40 kDa PEG離胺酸PEG化之RRRK 組合物：40 1^&/>^-111〇^及40]^&/111111尺（1:1)之組合物 該等結果顯示所有PEG化之IGF樣品在類似範圍中有效 結合至IGFBP4及IGFBP5。與未PEG化之IGF相比，所有 PEG化之樣品顯示顯著減少之締合速率常數。 1 陰性對照資料（例如緩衝液曲線）自樣品曲線減去以校正 系統固有基線浮動且用於訊號雜訊減少。 實例12 IGF-IR藉由配位體之自動磷酸化 為了測定本發明之多肽活化IGF-IR且誘導IGF-IR磷酸化 之能力，IGF-IR過度表現細胞藉由本發明之多肽刺激且 IGF-IR磷酸化狀態隨後藉由ELISA分析。 對於ELISA，96-孔抗生蛋白鏈菌素塗覆之聚苯乙烯平板 135792.doc •41 - 200914041 (Nunc)用以1:350稀釋於具有3% BSA之PBST中之100 μΐ抗 人類IGF-IRa之單株抗體（0.5 mg/ml)塗覆。在室溫下於平 板震盪器上培育1小時之後，移除塗覆溶液且平板以每孔 200 μΐ PBST洗滌三次。 IGF-IR轉染之ΝΙΗ-3Τ3細胞塗布於補充2 mM L-麩醯胺 酸（Gibco，CatNo. 25030_024)及 0.5% 熱滅活之 FCS(PAA， CatNo. A15-771)之具有高葡萄糖（PAA，CatNo. E15-009) 的MEM Dulbecco培養基（DMEM)中。對於測定EC5〇值，以 每孔1.3*104細胞接種之96孔板在37°C及5% C02下培養兩 天。 以低血清培養基培養48小時之後，小心移除培養基且藉 由不同濃度的稀釋於50 μΐ相應培養基中之本發明多肽置 換。在37°C及5% C02下培養10分鐘之後，藉由抽吸法小心 移除培養基且每孔添加120 μΐ冷溶解緩衝液（50 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA、1 mM EGTA、20%甘油、1%丁出〇11-X100、100 mM NaF、1 mM NaV〇4、Complete™蛋白酶抑 制劑）。平板在4°C下於平板震盪器上經溶解緩衝液培養15 分鐘且100 μΐ孔内容物隨後轉移至塗覆抗人類IGF-IRa之單 株抗體之ELISA平板上。溶解產物在室溫下於平板震盪器 上培養1 h以允許IGF-IR結合至捕捉抗體且隨後小心抽吸。 未結合之材料藉由經各200 μΐ PBST/孔之三次洗滌步驟移 除。 為了偵測結合之磷酸化IGF-IR，於3% BSA/PBST中稀釋 1:12650之100 μΐ抗人類IGF-IRa之多株IgG兔抗體添加至各 135792.doc -42- 200914041 孔，繼之在室溫下於平板震盪器上培養達1小時之另一段 時間。再次小心移除孔内容物且孔以200 μΐ PBST/孔洗滌3 次。對於偵測多株兔抗體，於3% BSA/PBST中稀釋1:6000 之 100 μΐ偶合至 HRP(Cell Signaling Technology Inc. USA) 之抗兔IgG之多株抗體添加至各孔。室溫下於震盪器上培 養1小時之後，未結合之偵測抗體藉由以200 μΐ PBST/孔洗 滌平板6次移除。作為用於抗體偶合之HRP的受基，1〇〇 μΐ 3,3’-5,5’-四曱基聯苯胺添加至各孔，繼之在室溫下震盡器 上再培養〇. 5小時。 以25 μΐ/孔1Μ H2S04停止反應後藉由量測450 nm波長下 之吸收進行量化。 樣品獲得之OD45 0值使用10 nM IGF-I作為100%(最大）且 w/o IGF-I作為0%(最小）對照藉由下式轉化成％活化：％活 化=(樣品-最小）/(最大-最小）。所得EC5G(IGF-IR半數最大 活化之多肽濃度）值概述於表3中。 表3 樣品 EC50[nM] ”標準差” K68-RRRK 20 kDa線性 2.1 0.2 NT-RRRK 20 kDa線性 29.6 1.9 組合物20 kDa線性 7.6 K68-RRRK 30 kDa線性 4.7 0.9 NT-RRRK 30 kDa線性 44.5 5.0 組合物30 kDa線性 9.2 1.1 組合物40 kD分支 16.4 0.7 K68-RRRK20kD 分支 1.5 1.1 組合物20 kD分支 5.1 0.5 NT-RRRK 40 kD分支 19.9 1.1 縮寫參見實例11 135792.doc -43 - 200914041 參照案清單
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Wojchowski，D.M.等人，Biochim. Biophys. Acta 910 (1987) 224-232 【圖式簡單說明】 圖1 : PEG-IGF之IEC-HPLC。採用製備強陽離子交換柱 (TOSOH-BIOSEP, SP-5PW)將純位置異構體自PEG化混合 物中分離出來。分離五個不同峰溶離份（編號為0-4)且進行 I35792.doc 47- 200914041 處理以用於進一步分析。 圖2 :單PEG-IGF-Ι峰之SDS-PAGE分析。將五個經純化 峰溶離份（編號為0-4)藉由4· I2% Tris-甘胺酸SDS-PAGE在 非還原（A)及還原（B)條件下電泳且以考馬斯亮藍 (Coomassie blue)對凝膠染色以用於蛋白質。MW，分子量 標記。 圖3 :單PEG化IGF-I峰1、2及3之肽分析。以Asp-N對經 純化單PEG化峰1、2及3進行消化且藉由HPLC對多肽片段 進行分離。PEG化片段之肽序列可如所述之Edman N-終端 肽降解獲得。A，HPLC分析在30與45分鐘滯留時間之間產 生6個rhIGF-I不同肽片段且在約70分鐘滯留時間内產生 PEG化峰之主要片段7(及一次要片段7’）。箭頭表示與 rhIGF-I相比在不同峰中肽片段主要相對改變。B，自Asp-N裂解rhIGF-I獲得之6個片段之肽序列。離胺酸（K)以粗體 標出且出現在片段3及4中。片段5說明N-終端肽。C， Edman降解後PEG化肽片段7之肽序列。半胱胺酸及PEG化 離胺酸殘基造成多肽序列之間斷。 圖4 :自IGF-I及單PEG化異構體之不同整體表現圖之AD 之階層架構叢集。IGF-I及PEG化變異體之培養時間為24小 時；採用小鼠NIH-3T3細胞株。資料分析條件係描述於文 中。（A)下調節基因叢集。（B)上調節基因叢集。 圖5:藉由rhIGF-I及單PEG-IGF-Ι之IGF-IR磷酸化作用。 以人類IGF-IR穩定轉染之NIH-3T3細胞血清不足隔夜且以 rhIGF-I或單PEG-IGF-Ι異構體（峰1、2、3，混和峰， 135792.doc • 48- 200914041
Des(l-3)峰3)逐漸增加之劑量（0.01-10 pg/ml)培養30分鐘。 隨後，細胞進行西方處理或如方法中所述進行細胞内分 析。分別為rhlGF-I(A)、峰1(B)、峰2(C)、峰3(D)、混和峰 (E)及Des( 1-3)峰3(F)之劑量反應曲線。磷酸化作用訊號 在各自阱内以IGF-IR含量標準化。資料點表示自3個獨立 培養物中6個量測平均值土SEM。 圖6 : NIN-3T3細胞中IGF-IR磷酸化作用之定量分析。自 實例7之試驗中獲得之劑量反應曲線擬合單位點結合動力 學以獲得特定結合（BMax)、半數最大結合濃度（EC5G)及Hill 係數（nH)。資料代表自3個獨立培養物之6個量測平均值 土SEM。 圖7 : PS2APP小鼠中rhIGF-I降低活體内腦部Abeta。2-3 月之雙轉殖基因PS2AAP小鼠（n=10)以rhIGF-I(50 gg/kg腹 膜内注射）處理2小時。製備皮層提取物且以方法所述估算 APP、C99、Abeta及對照蛋白（白蛋白）含量。自白蛋白標 準化之值可以計算出C99/APP、Abeta/APP及C99/Abeta之 比率且以％之未處理對照組表示且表示為平均值土SEM。 A，2月大之皮層提取物之代表性西方轉漬轉潰。注意到以 rhIGF-I處理之Abeta含量明顯減少而其它含量未改變。B， 自PS2APP小鼠皮層提取物之定量分析（**，與未處理對照 組相比p<0.01)。 圖8 :以rhIGF-I處理之PS2APP小鼠活體内Abeta降低之 時程。兩月大小鼠以rhIGF-I(50 pg/kg腹膜内注射）處理2、 6或24小時。隨後估算出Abeta/APP及C99/Abeta含量且如 135792.doc -49- 200914041 所述計算比率。資料以％之未處理對照組表示且表示為平 均值土SEM(n=10-13)。A且B分別表示注射後2、6及24小時 之Abeta/PP及C99/Abeta(**，與未處理對照組相比 p<0.01)。 圖9 :藉由峰1-3在AAP中及PS2APP小鼠活體内Abeta降 低。在單轉殖基因APP及雙轉殖基因PS2APP小鼠之混和群 體中進行試驗。將峰1、2及3之Abeta/APP及C99/Abeta比 率一起表示以直接對比其對Abeta降低及清除之相對影響 (n=8-10)。A，Abeta/APP比率顯示峰1-3對腦部Abeta負載 之影響。B，峰1-3之C99/Abeta比率證明自腦部之Abera清 除（與未處理對照組相比，*，ρ<〇.〇5;**，ρ<0·01;*** ’ ρ<0.00 1)。 圖10 :藉由峰3在AAP及PS2APP小鼠之活體内Abeta降低 之時程。以峰3(50 pg/kg腹膜内注射）處理兩月大APP及 PS2APP之混和群體小鼠2、6、24、48或72小時。隨後， 估算出APP、C99、Abeta及肌動蛋白含量且如所述計算比 率。資料以％之未處理對照組表示且表示為平均值 土SEM(n=10-15)。A及B表示注射後6、24及48小時之 Abeta/APP及C99/Abeta比率（與未處理對照組相比，*， ρ<0·05;"，ρ<〇_〇1;*"，ρ<〇_〇〇1) 〇 圖11 :藉由PEG-IGF峰1-3在PS2APP小鼠活體内Abeta降 低。峰1、2及3之Abeta/APP比率一起顯示以直接對比其對 Abeta降低及清除之相對影響（n=3-13) ;(*，與未處理對照 系且才目t匕ρ<0·05)。 135792.doc -50- 200914041 圖12 :藉由峰3在PS2APP小鼠活體内Abeta降低之時 程。以峰3單一注射處理兩月大PS2APP小鼠2、6、24、48 或72小時（50 pg/kg腹膜内注射）。隨後，如所述估算 Abeta/APP比率。資料以％之未處理對照表示且表示為平 均值土SEM(n=4-13 ; *，與未處理對照組相比p<0.05，**， ρ<0·0 1)。 135792.doc -51 - 200914041 序列表 <110>瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120>類胰島素生長因子及聚乙二醇之軛合物 <130> 22904 <140> 094145672 < 141 > 2005-12-21 < 150 > EP 04030415 < 151 > 2004-12-22 <160> 1 <170〉patentin 版本 3.2 <210> 1 <211> 105 <212> PRT <213>智人 <400> 1
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe 1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly He Val Asp Glu Cys Cys 35 40 . 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gin Arg His Thr Asp 65 70 75 80
Met Pro Lys Thr Gin Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly 85 90 95
Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met 100 i〇5 135792.doc

Claims (1)

  1. 200914041 十、申請專利範圍： 1. 一種由類胰島素生長因子-I(IGF-I)變異體及聚乙二醇 (PEG)組成之軛合物，其特徵在於該IGF-I變異體在野生 型IGF-I胺基酸序列之胺基酸位置27、37、65、68處具有 胺基酸改變以使胺基酸37、65、68之一或多者為離胺酸 (K)，胺基酸27為極性胺基酸但非離胺酸且該PEG經由第 一胺基軛合至該IGF-I變異體， 其限制條件為該IGF-I變異體不為R27、R37、R65、 K68(RRRK)或 R27、R37、K65、R68(RRKR)。 2·如請求項1之軛合物，其特徵在於該PEG具有自20至100 kDa之總分子量。 3. 如請求項1或2之軛合物，其特徵在於該IGF-I變異體在N-終端胺基酸處另外經PEG化。 4. 如請求項1或2之軛合物，其特徵在於在K65、K68或K37 處經單PEG化或在K65及K68處經二PEG化。 5_如請求項1或2之軛合物，其特徵在於該IGF-I變異體為 R27、R37、K65、K68(RRKK)或 R27、K37、R65、 R68(RKRR)。 6. 如請求項1或2之軛合物，其特徵在於該IGF-I變異體之N-終端處至多三個胺基酸截短。 7. 如請求項5之輛合物，其特徵在於該IGF-I變異體之N-終 端處至多三個胺基酸截短。 8. 如請求項1或2之軛合物，其特徵在於該（等）聚乙二醇基 團為分支聚乙二醇基團。 135792.doc 200914041 9. 如請求項1或2之軛合物，其特徵在於該（等）聚乙二醇基 團具有20 kDa至100 kDa之總分子量。 10. —種IGF-I變異體’其特徵在於在該野生型胺基酸 序列之胺基酸位置27、37、65、68處具有胺基酸改變以 使胺基酸37、65、68之一或多者為離胺酸（κ)且胺基酸27 為極性胺基酸但非離胺酸， 其限制條件為該IGF-I變異體不為R27、R37、R65、 K68(RRRK)或 R27、R37、K65、R68(RRKR)。 11. 一種如請求項1〇之IGF-I變異體作為產生PEG化^[厂變 異體之中間體的用途。 12· —種製備包含一 IGIM變異體及一或兩個聚乙二醇基團之 輛合物之方法’該（等）聚乙二醇基團具有自約2〇至約1〇〇 kDa之總分子量，該方法包含將如請求項1 〇之igf_i變異 體與活化之聚乙二醇在使該聚乙二醇經由1(317_1變異體之 第一離胺酸胺基化學性結合至該IGIM變異體之條件下反 應。 13. 如請求項12之方法，其特徵在於該聚乙二醇經由1(^_1變 異體之N_終端胺基額外地化學性結合至該IGF-I變異體。 14. 一種醫藥組合物其包含如請求項1至9中任一項之軛合物 及醫藥上可接受之載劑。 15. —種如請求項丨至9中任一項之軛合物在製備供治療阿茲 海默症（Alzheimer's Disease)之藥物上之用途。 16. —種組合物，其包含：離胺酸-pE(Ht 變異體，其 在该野生型IGF-I胺基酸序列之胺基酸位置27、37、65、 135792.doc 200914041 68處具有胺基酸改變以使胺基酸37、65、68之一或多者 為離胺酸（K) ’胺基酸2 7為極性胺基酸但非離胺酸且該 PEG經由第一胺基軛合至該IGF_I變異體；及…終端Peg 化之IGF-I變異體。 17. —種醫藥組合物，其包含：離胺酸_PEg化IGF-Ι變異 體’其在該野生型IGF-I胺基酸序列之胺基酸位置27、 37、65、68處具有胺基酸改變以使胺基酸37、65、68之 一或多者為離胺酸（K)，胺基酸27為極性胺基酸但非離胺 酸’且該PEG經由第一胺基軛合至該IGF-I變異體；及N-終端PEG化之IGF-I變異體；及醫藥上可接受之載劑。 18. —種如請求項16或17之組合物在製備供治療阿茲海默症 之藥物上之用途。 135792.doc
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