TW200914830A - Genes relating to gastric cancer metastasis - Google Patents

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TW200914830A
TW200914830A TW097132402A TW97132402A TW200914830A TW 200914830 A TW200914830 A TW 200914830A TW 097132402 A TW097132402 A TW 097132402A TW 97132402 A TW97132402 A TW 97132402A TW 200914830 A TW200914830 A TW 200914830A
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Tsung-Fan Tuan
Heng-Liang Lin
Chiung-Tong Chen
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Nat Health Research Institutes
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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Description

200914830 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大致係關於診斷及治療胃癌，特別是關於鑑別 出與轉移性胃癌有關的基因以及由該基因所編碼產生的多 胜肽，和以所鑑別出來的基因及多胜肽作為標記物來偵 測、診斷和/或監控患有癌症，特別是轉移性胃癌，之個體。 【先前技術】 胃癌是一項嚴重的健康問題且位居全球最常見癌症種 類第二名。可從組織學上將胃癌區分成兩大類：（丨）完全分 化型或稱腸型（intestinal type)，和（2)未分化型或稱擴散型 (diffuse type)(參見 Best Pract Res CHn 2〇〇6 20(4):651-674)。腸型胃癌盛行於諸如東南亞、東歐和中南美 洲之類的地理高風險區；相反的，擴散型胃癌的發生則不 限於特定地理區域（參見w〇rld j 2_ 12(3):354-362)。依據一份最近的研究報告指出，台灣地區胃 癌的發病率和死亡率均高於美國（參見CA ―咖】· cUn，2〇〇6 56:106-130)。 這些年，已有多起大型研究利用陣列式雜合和表現基 因系列分析（serial analysis of gene expressi〇n, sage)來分 析基因表現’並因而鑑別出相當多的基因（參見〇福。防薦 69:17-22)。這些結果也為胃癌的早期診斷和治療提供不少有 用的知識與工具。但是’ 一旦癌細胞開始遷移或移轉，癌 症的預斷及治療將變得極為困難。以人類為例，當胃癌轉 200914830 移到肝臟和腹膜時，患者5年内的存活率遽降至ι〇·ι%(參 見Cancer Cell，2004 5:121-125)。因此，亟需鑑別出與轉移性胃 癌相關的基因並以之作為標記物，來偵測、診斷和/或監控 胃癌，特別是那些具有轉移傾向的胃癌。 【發明内容】 本揭示内容提供偵測轉移性胃癌的方法，包含：a)自 一個體取得一或多組織樣本；b)測量該組織樣本中一或多 聚核普酸的量’該些聚核糾包含與選自序列編號：P〜53 中之核苦酸序列至少90%相同的核普酸序列；c)決定該一 或多聚核苦酸的表現量是否低於正常組織樣本中該一=多 聚核苦酸的表現量’其中較低的表現量代表有轉移性胃癌。 在一實施方式中，該一或多聚核苦酸包含 號;37〜53之核她。在另-實施方式中，該—= 核普酸的表現量是由—選自以下之方法來決定 該—或多聚核苦酸雜合，並測量與該-或多聚： 初扪重，C)表現基因系列分析（SAGE); 口 c)大規模平行測序法⑽油办S如卿
Sequencing，MPSS)。在另一眚竑古々士 丄 节…❶ “方式中，在該組織樣本中 邊-或多聚核芽酸的表現量比正常組織中該一或 酸的表現量至少低3倍。在另—實施方式中，續樣 是選自該個體的初始胃癌組 '、織樣本 * Β „ ^ ^ ^ ^ 捋杪『生胃癌組織及體液。 在另一實施方式中’該體液是選自血液、血漿、血清、腹 200914830 膜/腹腔液、尿液、和唾液。 本揭示内容提供偵測轉移性胃癌的方法，包含：a)自 一個體取得一或多組織樣本；b)測量該組織樣本中一或多 多胜肽的表現量，該些多胜肽包含與選自序列編號：58〜73 中之氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列；c)決定該一 或多多胜狀的表現里疋否低於正常組織樣本中該__ <多多 胜肽的表現量’其中較低的表現量代表有轉移性胃癌細胞 存在。 在另一實施方式中，該一或多多胜肽包含選自序列編 號；58〜73之氨基酸序列。在另一實施方式中，該一或多多 胜肽的量是由一選自以下之方法來決定：a)使該一或多多 胜肽與一或多抗體接觸，並測定包含該一或多多胜肽與該 一或多抗體之一或多複合物的量；b)質譜儀；c)與一蛋 白質陣列雜合。在另一實施方式中，該組織樣本是選自該 個體的初始胃癌組織、轉移性胃癌組織及體液。在另一實 她方式中，該體液是選自血液、血漿、血清 '腹膜/腹腔液、 尿液、和唾液。 本揭示内容提供偵測轉移性胃癌的方法，包含：a)自 -個體取得-或多組織樣本；b) ^量該組織樣本中一或多 聚核苦酸的表現量，其中該一或多聚核普酸包含與選自序 H虎.54〜57中之核苦酸序列至少、90%相同的核普酸序 列；Ο決定該-或多聚核㈣的表現量是否高於正常組織 ，本中以或夕來核苷酸的表現量，其中較高的表現量代 表有轉移性胃癌細胞存在。 200914830
在實施方式中，該一或多聚核苷酸包含選自序列編 號；54〜57之核普酸序列。在另一實施方式中，豸一或多聚 核普酸的表現量是由一選自以下之方法來決定：a)使-或 多探針與該-或多聚核芽酸雜合，並測量與該—或多聚核 苦酸結合之該-或多探針的量；b)以pCR擴增該些聚核皆 酸並測量該PCR產物的量；c)表現基因系列分析（sage); 和c)大規模平行測序法（Massively ρ·1Μ叫⑽阶 Sequencing，MPSS)。在另一實施方式中，在該組織樣本中 該-或多聚核㈣的表現量比正常組織中該__或多聚核普 酸的表現量至少高3倍。 本揭示内容提供偵測轉移性胃癌的方法，包含：句自 一個體取得一或多組織樣本；b)測量該組織樣本中一或多 多胜肽的表現量，該些多胜肽包含與選自序列編號：74〜77 中之氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列；c)決定該— 或多多胜肽的表現量是否低於正常組織樣本中該一或多多 胜肽的表現罝，其中較高的表現量代表有轉移性胃癌細胞 存在。 在另一實施方式中，該一或多多胜肽包含選自序列編 號；74〜77之氨基酸序列。在另一實施方式中，該一戋多多 胜肽的量是由一選自以下之方法來決定：a)使該—戍多多 胜肽與一或多抗體接觸，並測定包含該一或多多胜狀與ζ 一或多抗體之一或多複合物的量’· b)質譜儀；c)與一蛋 白質陣列雜合。在另一實施方式中，該組織樣本是選自該 個體的初始胃癌組織、轉移性胃癌組織及體液。在另— 實 200914830 施方式中，該體液是選自血液、血漿、血清、腹膜/腹腔液、 尿液、和唾液。 本揭示内容提供一套組，其包含一選自以下之組合 物：a)—或多聚核苷酸，其與一選自序列編號：37〜57中 之核苷酸序列至少90%相同的核苷酸序列互補；和b) —或 多抗體’該些抗體是與選自序列編號：58〜77中之多胜肽序 列至少90°/。相同的一多胜肽的專一性抗體。 本揭示内容提供一癌細胞株，其係選自：MKN45-GFP TW4 (寄存編號·· BCRC960366)、MKN45-GFP TW10 (寄存 編號：BCRC960367)和 MKN45-GFP TW12 (寄存編號： BCRC960368)。 【實施方式】 本發明係與新穎基因之鑑別有關，特別是那些可在高 度轉移性胃癌細胞株中表現的基因，以及以所鑑別出來的 新穎基因作為標記物，來偵測、診斷和/或監控胃癌細胞。 正常細胞為回應發炎反應，以及腫瘤細胞在轉移過程 中，都會出現所謂的「細胞侵入（cell invasion)」現象。在 本研究中，利用習知的細胞遷移（cell migration)、化學趨向 性（chemotaxis)和侵入性分析作業（invasion assay protocol) 建立出侵入性胃癌細胞株。侵入性分析作業是透過使用化 學性吸引物（例如，血清或生長因子）來篩選出具有侵入性能 力的細胞。對化學性吸引物有反應的細胞會從一培養槽跨 越一通透性支架到達另一培養槽，因此將這類細胞歸類為 200914830 「侵入性細胞（invasive cells)」或是「具轉移力的細胞（cells that metastasize)」° 在一實施方式中，以上述試管内（或體外）細胞侵入性分 析作業，於商用 TranswellTM 培養盤（Corning，Acton, MA) 中，篩選出數種侵入性胃癌的子細胞株，特別是 MKN45-GFP子細胞株。將經過4、5、8、10及12次篩選 循環的MKN45細胞，分別稱為MKN45-GFP TW4、 MKN45-GFP TW8、MKN45-GFP TW5、MKN45-GFP TW10 及MKN45-GFP TW12細胞。每一篩選出來的子細胞株都具 有高度侵入性和類似的生長速率，其細胞數目倍增時間並 無太大差異。因此，這些侵入性子細胞株就成為可用來篩 選轉移性胃癌基因的最佳標的。 利用所篩選出來具備高侵入潛力的MKN45_GFP子細 胞株以及微陣列技術，可鑑別出具高度轉移力之細胞株中 的轉移性胃癌基因。 利用RNA微陣列可鑑別出76條轉移性基因’其在轉 移性胃癌細胞中的表現量比正常細胞至少高或低3倍。在 此76條基因中，有22條基因是新找到的’先前公開文獻 中從未揭示或建議此22條基因與胃癌的轉移有關。在本文 中也揭示這些新找到基因的聚核苷酸序列及其相對應蛋白 質的多胜肽序列。 因此，本發明可提供多條與轉移性胃癌細胞有關之單 離的聚核苷酸，包含與選自序列編號；37〜57之核苷酸序列 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98% 10 200914830 或99%相同之核苷酸序列。 在此提供多種純化的多胜肽，包含與選自序列編號； 58〜77之胺基酸序列或其之一部份至少85〇/。、86〇/。、87〇/〇、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97°/〇、98%或99°/。相同的胺基酸序列。 可利用監控所鑑別出來之基因的表現量來偵測和診斷 轉移性胃癌細胞。因此，本發明也提供一種用以在一組織 樣本中偵測、診斷和/或監控轉移性胃癌細胞之方法，包含 測量該組織樣本中一基因之一產物的表現量，該基因包含 一核皆酸序列’其與選自序列編號；37〜57之一核苷酸序列 至少 90〇/〇、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98% 或99°/〇相同。當一组織樣本所表現出來的基因產物（即，序 列編號；37〜53之任一核苷酸序列的基因產物）量比一控制 組樣本或一正常組織樣本中相對應基因產物的量至少低3 倍時’該組織樣本即被歸類為「轉移性樣本」。相反的，當 一組織樣本所表現出來的基因產物（即，序列編號；54〜57 之任一核苷酸序列的基因產物）量比一控制組樣本或一正 常組織樣本中相對應基因產物的量至少高3倍時，該組織 樣本也被歸類為「轉移性樣本」。可透過檢測一基因之 mRNA的表現量或是其之蛋白質的表現量來決定上述基因 產物的表現量。上述之組織樣本可以是一疑似罹患胃癌之 個體的初始胃癌組織、轉移性胃癌組織或是體液，例如血 液 ' 也漿、A清、尿液、唾液、腹膜/腹腔液或其他身體分 泌液。 200914830 除了上述之單離的聚核苷酸或純化的多胜肽外，本發 明更提供一或多抗體，此一或多抗體可認得一或多條多胜 肽’該一或多條多胜肽包含選自序列編號；58〜77之胺基酸 序列或其之一部份。 如上述’當選自序列編號；3 7〜5 3之任一序列的表現 產物量減少或選自序列編號；54〜57之任一序列的表現產物 置增加時，即表示有轉移性胃癌細胞存在。因此，可研發 出一檢測套組，依據雜合分析、西方墨潰分析或免疫連接 酵素分析（ELISA)測試結果來偵測或診斷轉移性胃癌細 胞。這些分析乃是習知技術。此檢測套組中可包含，在不 同的谷益内，分別包含一或多探針，該一或多探針包含可 與選自序列編號；37〜57之核苷酸序列至少90%、910/〇、 92%、93%、94%、95%、96。/。、97、98%或 99%相同之核苷 酸序列彼此互補的核苷酸序列。或者，此檢測套組中可包 含多個抗體，該些抗體可認得一或多條由選自序列編號； 5 8〜7 7之胺基酸序列產生的多胜肽或其之一部分。此檢測套 組可更包含多種探針或多個抗體，控制配方（正反應或負反 應），和/或一檢測標籤；以及用以執行該檢測套組内各種試
驗的指示用單’例如書面說明、錄影帶、VCR、CD/DVD-ROM 等等。 在另一實施方式中，本發明提供一種用以在一或多組 織樣本中偵測 '診斷和/或監控轉移性胃癌細胞之方法，包 含測量該組織樣本中一或多聚核苷酸之表現量，該聚核苷 酸包含m酸序列，其與選自序_號；37〜57之一核芽 12 200914830 酸序列至少 9〇〇/0、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、 98°/。或99%相同。當一組織樣本中該聚核苷酸之表現量高於 或低於該相對應聚核苷酸在一控制組樣本或一正常組織樣 本中之表現量時’則將該組織樣本歸類為「轉移性」。可透 過檢測該聚核苷酸之mRNA的表現量或是由該一或多聚核 苦酸所編碼產生之蛋白質的表現量，來決定該聚核苷酸的 表現里。該組織樣本可以是一疑似罹患胃癌之個體的初始 胃癌組織、轉移性胃癌組織或是體液。 在另一實施方式中，本發明提供多個可與一或多多胜 肽專一性地結合之抗體’該一或多多胜肽包含一氨基酸序 列，其與選自序列編號；58〜77之一氨基酸序列或其之一部 份至少 850/0、、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96°/〇、97%、98%或 99%相同的氨基酸序 列。製造這些抗體的方法包括以該些多胜肽來使一除人類 以外的哺乳動物免疫。該些抗體可用來偵測、診斷和/或監 控轉移性胃癌細胞，其中該一或多抗體是與一組織樣本接 觸以偵測該一或多多胜肽，其包含如上述之選自序列編 號；58〜77之一氨基酸序列。 在另一實施方式中，本發明提供一種用來偵測或診斷 轉移性胃癌的套組，包含一或多抗體，其可與一或多多胜 肽專一性地結合’該一或多多胜肽包含與選自序列編號； 58〜77之一氨基酸序列或其之一部份至少85%、、86〇/〇、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96°/。、97°/。、98%或99°/〇相同的氨基酸序列。或者，該套組 13 200914830 可包含一或多探針，其包含與選自序列編號；37〜57之-核 賴序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、燃、 98/。或99%相同之核普酸序列互補的核㈣序列。 口此本發明提供多個聚核苷酸和多胜肽，其可當做 來伯利0斷和/或監控轉移性胃癌細胞的標記物。 以下實施方式中將詳述本發明之其他目的及優點，直 可由相關說明中輕易得知，或可藉由實施本發明而得到:、 可利用附隨申請專利範圍中明確指出之方法及元件實踐並 獲致本發明之目的及優點。可以理解，上述發明說明以及 :文實施方式僅為示範及說明，而非用以限制由中請專利 範圍界定之本發明。附隨圖式係作為說明書之一部分，其 闡明本發明之具體實施例，且連同書面說明可用以解釋本 發明之原理。 I.定義 在本文中，「偵測（detecting)」和「診斷⑷吨細_)」 兩名詞可彼此交替使用。藉由比較—曾經羅患胃癌或可能 發，出轉移性胃癌之個體組織樣本中轉移性胃癌基因的表 現量與-正常組織樣本中相同基因的表現量，可決定出、 診斷出或監控該個體體内胃癌細胞是否已經轉移:、如果個 體組織樣本中表現基因產物的表現量比正常組織樣本的表 現量高或低’即代表「伯測到」該個體中的轉移性胃癌細 胞或是該個體被「診斷出」患有轉移性胃癌。 ;預後（〜糾叫」意指依據所揭示基因產物表現量的 增加或減少’來預測疾病的進展。如果偵測到增加或減少， 14 200914830 即可考慮進行進一步的治療，如化療、放射線療法或手術。 「正常組織樣本（normal tissue samples)」係指對照於 冒經罹患胃癌之一個體的胃癌組織樣本來說，從同一個體 的胃組織和/或體液所取得的樣本被鑑定為沒有胃癌，則稱 其為正常組織樣本。 「基因產物（gene product)」或「表現產物（expressi〇n product)」包括（但不限於）由一基因所編碼產生之相對應多 胜肽或基因相對應的！nRNA。 「監控（monitoring)」意指定期比較一曾經罹患胃癌或 可能發展出轉移性胃癌之個體組織樣本中轉移性胃癌基因 的表現量與正常組織中相對應基因產物的表現量，並決定 出胃癌是否已經轉移，以及是否須對受測個體進行更進一 步的治療，例如化學療法、放射線治療或手術治療。 「聚核苷酸」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」、「聚 核苷酸序列」、和「核苷酸序列」等名詞可彼此交替使用， 以指明任一長度之聚合物形式的核苷。這些名詞也涵蓋其 之變異物，包括插入、添加、刪除或取代所致之變異物。 「專一地雜合（hybridizes specifically)」一詞對聚核皆 酸而言’意指在嚴謹條件下雜合。提高dna/dna和 DNA/RNA兩雜合反應之嚴謹度，已為此領域公知且熟悉的 知識。嚴謹雜合條件的實例包括在約65_7〇。〇下，於4倍氯 化鈉/# 檬酸鈉（sodium chloride/sodium Citrate, SSC)中雜 合；或是在約仏⑽下’於4倍SSC中雜合，接著在約 65-70°C下以1倍ssc清洗一或多次。 15 200914830 抗體」-詞係指具有一特定結構之免疫球蛋白分 子’該特定結構可與用來合成此抗體之抗原彼此專一性地 結合。此外，「抗體」一詞在此也指一抗體之片段或是指— 修飾過的抗體’只要所述抗體可與由上述_或多聚核普酸 所編碼產生的-或多多胜肽結合即可。舉例來說，上述抗 體之片段可以是？化4(仏，)2士或是單鏈的1^，其中來 自重鏈或輕鏈之Fv斷片是由適當的連接子加以連結。詳言 之’可透過諸如木瓜酵素或胰蛋白酶之類的酵素來處理該 抗體，而獲得一抗體之片段。或者，建構出能編碼產生此 抗體之片段的基因，將其插入表現載體中，並在適當的宿 主細胞中表現。該些抗體可包括一或多放射性、螢光、生 物冷光標記物。這些抗體也可包括一酵素，例如，山葵過 氛化酶。 癌症」一 §司意指任一不正常細胞或組織（例如，腫 瘤，無淪是惡性、惡性前或良性）的生長。其特徵是不受控 制的細胞增生，其可此會或可能不會侵入周圍組織，且因 此可能會或可能不會轉移到身體其他部位。癌涵蓋上皮細 胞癌瘤（carcinomas)，癌瘤包括鱗狀細胞瘤、腺瘤、黑色素 細胞瘤和肝癌。癌也涵蓋源自間葉細胞的肉瘤（sarc〇mas)， 肉瘤包括骨癌、白血癌和淋巴癌。癌症可能涉及一或多種 類性的細胞增生。癌在此涵蓋胃癌。 「轉移（metastasis)」意指癌細胞從一初始癌遷移到身 體其他位置處。由遷移的癌細胞所致之腫瘤被稱為轉移性 癌或癌轉移。 16 200914830 純化的（purified)」分子係指一分子實質不含有來自 細胞、組織或體液的細胞材料或其他污染性分子。
單離的（isolated)」一詞在此係指所述材料被從其原 先環境（例如，如果是天然物的話，意指其天然環境）中移 出。舉例來說，天然存在於一活體中的天然聚核苷酸或多 胜肽並非處於「單離的」狀態，從一天然系統内同時存在 的某些或所有其他材料中分離出來後的聚核苷酸或多胜 肽，始為本文所指「單離的」聚核普酸或「單離的」多胜 肽。這類聚核苷酸可為一載體的一部份，或是這類聚核苷 酸或多胜肽可為一組合物的一部份，且仍然以這類載體或 組合物之一部分自其天然環境中被分離出來。 一 II. 診斷和預後 偵測疾病之專一性標記物可提供一種有效的疾病㈣ 策略。早期_不只提供早期診斷，#癌症來說，還可提 供基因多型篩檢’和偵測手術後是否尚有癌細胞殘留或轉 移，其為癌症復發的早期徵死。因此，早期偵測出代表轉 移的疾病專-性標記物’可改善患者在診斷前、治 及疾病緩解期間的生存率。制所揭示基因產物可做為— 種疾病，包括轉移性胃癌，之診斷或預後。 III. 分析方式 A.多胜肽之偵測 可透過抗體’利用包括但不限於免疫連接酵素 (ELISA)、西方墨潰、螢光、免疫登光、免疫組織化學或自 動放射顯影等多種方式’來備測由所揭示基因所產生的基 17 200914830
產物。用於上述這些分析試驗中的抗體可以直接加標 以有標定物標定的第二抗體來進行偵測 三明治式分析試射 T 標定物可包括FITC、生物素、和放射性同位素，包括 51 131· 但不限於 “Cu、67Cu、90Y、99mTc' mIn^ 丄 :7:、、、2"At、-Bi、2"Bi、、24、和 244。二 標定物也可包括具有可積測產物的酵素，如冷光素酶 (luciferase)、過氧化酶、驗性鱗酸酶、^半乳糖|酶等。標 定物f2包括發光物及螢光性標記物，可發螢光的金屬，: 如，Eu或其他鑭系金屬、電化學螢光化合物、化學螢光 化合物’如盧米諾（luminol)、異盧米諾（is〇iumin〇i卜或 <鹽’特定結合分子’如磁性顆粒、微球體及奈米球體。 可將這類標記物連接到包括抗體的蛋白質分子上，也可連 接到核酸上，以做為探針或引子來使用。 製備可認得一特定抗原之抗體的方法已屬該技術領域 中的習知技術。一般來說，是以一種含有抗原性多胜肽之 未、、二杀X菌處理的製備物，將一實驗動物免疫，然後對實驗 動物施以環鱗醯胺（Cycl〇ph〇Sphamide)處理，接著再對實驗 動物注射一已經殺菌處理的製備物，以加強其免疫反應。 接著，將實驗動物犧牲，製備出融合瘤，並以習知方法篩 選出單株抗體。接著，以親和性管柱層析法純化出抗體。 或者’以一種包含有一特定抗原的組合物對對諸如兔子的 動物免疫，並因而可得多株性抗血清。 以抗體來债測所揭示蛋白質的方法，可被用在以一專 18 200914830 一性抗體來偵測一單一蛋白質上。或者，可使用抗體混合 物來同時偵測多種蛋白質，其中每一抗體是對一不同蛋白 質具有專一性。在一實施方式中，利用一西方墨潰分析來 偵測出多種蛋白質，且每一蛋白質是由其表面分子量來鑑 別。在另一實施方式中，可以免疫連接酵素分析（ELISA) 偵測出一蛋白質，並以自動放射顯影偵測出另一蛋白質。 可將不會因轉移而發生改變之一或多基因產物（例如，甘油 輕-3-填酸脫氫酶（GAPDH))的一或多抗體納入混合物中，做 為控制組。 可認得所揭示基因之蛋白質產物的抗體可以是專一性 單株抗體，或是可與相關蛋白質交互反應的多株抗體。因 此，所揭示方法包括偵測由所揭示基因之變異物所產生的 蛋白質。 也可利用一蛋白質陣列來偵測所揭示蛋白質。相關蛋 白質陣列技術的回顧，可參見Kingsmore，“Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays”，Nat Rev Discov·，5:310-321 (2006). 或可利用質譜儀在一細胞萃出物中來偵測所揭示的蛋 白質。參見 Oshiro et al·, “Parallel Identification of New Genes in Saccharomyces cerevisiae”，Genome Research, 12:1210-1220 (2002). B. 核苷酸之偵測 可利用多種方式來偵測由所揭示基因編碼產生的核苷 19 200914830 酸，這些方式包括反轉錄聚合酶鏈反應（RT_PCR)、即時 RT-PCR、多重 PCR (multiplex PCR)、TAQMAN®分析北 方墨潰法 '原位雜合和微陣列技術。 在北方墨潰法中，偵測手段包括有同位素和非同位素 標定的探針。習知技藝人士可以組合多種探針以同時偵測 所揭示的聚核苷酸，其中每—探針包含一種獨特的標記 物。在-實施方式中，每-探針包含—具有獨特發射光譜 之螢光性標記物。或者，每-探針具有相同的標記物且利 用電泳移動力來鑑別出該些聚核苷酸。 在使用PCR的方法中，可使用對該些聚核苷酸具有專 -性的引子。或者，可❹會與相關聚核㈣交互反應的 引子。舉例㈣，可選擇嚴謹雜合條件使得能與所揭示基 因的變異物產生雜合。 可利用P C R方式偵測出所揭示之一單一聚核苦酸，或 =時偵測出多㈣核苦酸（多f PCR)。#用電泳，包括毛細 管電泳，並以諸如漠化乙錢行染色來偵測pcR的擴增產 物。可利用電泳來鑑別出每—對應本發明基因之產 物H可在PCR引子中加人標記物，並依據該標記物 來偵測PCR產物。舉例來說，可使用包含有螢光標記物的 引子，並利用偵測該標記物來偵測該pcR產物。 當同時谓測到多個聚核苷酸時，可在一 pCR反應中使 用由多個引子組成的混合物，其中每—引子都具有一獨特 的標記物。依據該標記物來偵測出由每—聚料酸擴增出 來的產物。舉例來說’可使用具有獨特發射光譜之標記物 20 200914830 的引子。 也可利用習知的微陣列技術來偵測所揭示的聚核苷 酸。微陣列分析已被廣泛用來在基因層級上進行快速基因 表現監控與序列分析。「微陣列」一詞係指依次在一空間中 陣列排列於一固體支持基板上的固定的生物分子探針。一 般來說，這類陣列為寡核苷酸陣列，包含一核苷酸序列， 其可和存在或預期會存在在一樣本中之至少一序列彼此互 補。這類微陣列包括點狀cDNA陣列、包含寡核苷酸之陣 列、和由光微影银刻所產生的陣列（例如，購自Affymetrix® 者）。有關微陣列技術的詳細說明，可參見DNA Microarrays， Edited by M. Schena, In 4tThe Practical Approach Series,Series Editor: B. D. Hames (2000) Oxford University Press Inc., New York ° 也可利用 SAGE和大規模平行測序法（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)來偵測由揭示基因產 生的聚核苦酸。參見 Brenner et al.，“Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays，’’ Nature Biotechnology 18:630-34 (2000). IV. 類似序列的鑑別 存在於一個體序列與一參考標準物兩者間的鑑別百分 比，係利用將兩段序列同時呈送給一電腦分析程式並以任 一可能產生比對結果的參數進行分析而決定的。在某些情 況下，一個體序列與一參考標準物兩者，可在無須於此一 或兩條序列中引入間隙（gaps)即可進行比對並獲得所求的 21 200914830 鑑別百分比。此外，在許多其他情況下，因刪除、取代、 插入和/或加入一或多胺基酸於欲求蛋白質之胺基酸序列 中所產生的多胜肽，可能具有和欲求蛋白質相同的功能。 因此，編碼產生這類多胜肽的基因也屬於本發明範疇，並 涵蓋其天然存在的基因及人為基因序列。關於功能性等效 物，一般來說，基因的編碼產物彼此具有同源性。因此， 可與本發明基因產生雜合且功能類似的基因，亦屬本發明 範疇。 以下將參照實施例來說明本發明，然其用意僅為說明 本發明，因為習知此技術者可對其進行各種修飾及改變。 實施例 下列實施例僅係為了闡述本發明特定特徵之用，以幫 助習知技藝人士實施本發明之用，本發明範疇並不侷限於 所揭示的實施例。 統計分析 本研究中的數據均以ANOVA進行顯著性分析，接著 再以Student-Neuman-Keul測試進行多重比對。群組間若 ;?<〇.〇5則被認定為有顯著差異。 實施例1:篩選高度侵入性之MKN 45子細胞株 A.可表現EGFP的MKN45細胞株 以可編瑪產生強化綠螢光蛋白（enhanced green fluorescence protein, EGFP)的載體來轉染人類胃癌細胞株 22 200914830 (MKN45 細胞株）。以 LipofectAMINETM (Invitrogen，Carisbad, CA)進行基因轉染並利用G418在培養基中和限制系列稀釋 法（limited dilution)挑選出穩定的細胞群落。EGFP係由細 胞病毒啟動子所驅動，並可利用螢光顯微鏡觀察整顆細胞 所發出的綠色螢光。由顯微鏡下觀察發現所有MKN45-GFP 細胞均穩定表現綠色螢光蛋白（第1圖）。 B.產生MKN45-GFP細胞株的流鋥 人類胃癌細胞株（MKN45細胞株）係購自日本的研究生 物資源總集/人類科學研究資源庫（Osaka，Japan)。依據之前 的研究，將細胞培養在RPMI 1640培養基中（GibcoBRL, Grand Island，N.Y.)，培養基中並添加有 10%胎牛血清 (FBS)(Invitrogen, Carisbad，CA)和 2mML-穀醯胺，培養在 37°C、5% C02 的環境下（Proc. Natl. Acad. Sci. 1994: 91:1858-62)。以 LipofectAMINETM (Invitrogen，Carisbad，CA) 進行基因轉染。轉染前一天，將MKN45細胞種在24-孔的 培養盤中並於其中生長約16-24小時，直到其覆蓋率約 70〜90%為止。轉染時，將EGFP表現載體（pEGFP-Cl, Cat-No. 6084-1， from Invitrogen)與内含 LipofectAMINETM 的 OPTI-MEM (Invitrogen, -Carisbad， CA)以 pEGFP : OPTI-MEM : LipofectAMINE = 2pg : 2μ1 : 100μ1 的比例混 合。之後，將此混合物直接加到培養基中，再將細胞送回 到37°C、5% C02的環境下繼續培養。48小時後，收集細 胞並以購自Invitrogen之G418和限制稀釋法兩者，來篩 選出能穩定表現GFP的MKN45細胞群落（MKN45-GFP)。 23 200914830 C. 建立具差異性韓蒋潛力的MKN45-GFP細胞抶 由於MKN45癌細胞株基因不安定，因此經體外長期 培養後，細胞株會變成具有異質性。因此，可分離出MKN45 細胞子株的差異特性。為建立出具高轉移性的細胞株，將 MKN45-GFP 細胞種在塗佈有 MATRIGELTM的 Transwell™ 盤中。經過72小時培育後，收集侵入MATRIGELtm的細胞 並將之命名為MKN45-GFPTW1，代表穿過底膜基質之第一 代細胞。接著，將這些細胞擴增並重覆進行此侵入篩選流 程共12次。如果必要的話，也可讓細胞通過超過12次以 上的此侵入篩選流程。經過4、5、8、10及12次篩選循環 的MKN45-GFP細胞分別被命名為MKN45-GFP TW4、 TW5、TW8、TW10 和 TW12 細胞。 D. 以TranswellTM盤來籂選侵入性細胞 以 1^3113\^111'1^盤（匚〇1'11丨11§，Acton, MA)來對上述可表 現GFP的MKN45細胞株（即MKN45-GFP細胞）進行侵入性 能力的篩檢。簡言之，以50 μΐ購自BD Biosciences之重組 基底膜基質（MatrigelTM與完整培養基以1:1的比例稀釋） 來塗佈TranswellTM盤内由半通透性聚碳酸醋膜（孔隙大小 為8微米）製成的24-孔插入件。將MKN45-GFP細胞重新懸 浮在内含10% FBS之RPMI 1640培養基中，並種在塗覆有 MatrigelTM膜的上表面上。接著在37°C下培育72小時，移 除插入件，細胞即開始遷移並穿過聚碳酸酯膜侵入且最終 貼附至接受孔的底部表面上，接著收獲這些入侵的細胞， 經過培養後進行下一步篩選。經第一次篩選所收穫的 24 200914830 MKN45-GFP細胞被命名為MKN45-GFP TW1細胞，來自同 一篩選流程但已經過4、10及12次篩選的MKN45-GFP細 胞則分別被命名為 MKN45-GFP TW4、MKN45-GFP TW10、 和 MKN45-GFP TW12 細胞。 E. MKN45子細胞株之試營內f成被外）侵入性分析 與細胞生長 以塗佈有 MatrigelTM (BD Biosciences，San Jose, CA 之 6 -孔的 TranswellTM盤來測量 MKN45母細胞、 MKN45-GFP、MKN45-GFP TW5、和 MKN45-GFP TW8 細 胞之間侵入能力的差異。侵入潛力係以細胞是否能入侵包 含支架膜主要成分之一支架阻障（a matrix barrier)來決定。 以每一子細胞株分別重覆10次篩選，結果顯示MKN45-GFP TW5與MKN45-GFP TW8子細胞株的入侵能力分別比 MKN45-GFP細胞增加了 2倍及4倍。至於，MKN45-GFP 細胞的入侵能力則與其母細胞株相同（第2A圖，下方小 圖）。第2A圖上方小圖顯示在一侵入性分析中，以顯微微 鏡觀察經蘇木素（hematoxylin)染色後，位於1^118\¥6117'1^盤 下方側之細胞的結果。在MKN45-GFP TW5與TW8子細胞 株中均有較多的細胞侵入支架膜下方。細胞增生實驗也顯 示具高入侵能力的MKN45-GFPTW子細胞株的細胞生長情 形（即，細胞數目倍增的時間）與其他細胞株間並無明顯差異 (第2B圖）。 G. 試管内（或體外）侵入性分析 利用來定性腫瘤細胞入侵能力的試驗已 25 200914830 屬習知技術（Proc. Natl. Acad· Sci. 1994 91:1858-62)。將以 1 : 30 比例稀釋過的 MatrigelTM(BD Biosciences，San Jose， CA)塗佈在有6個培養孔的TranswellTM盤上。將細胞以1 x 106/ml的濃度懸浮在TranswellTM盤之上方培養孔内的1毫 升RPMI 640培養基中，培養基中還添加有10% FBS。下方 培養孔内則有2毫升RPMI 640培養基，同樣添加有10% FBS。在37°C下培育24小時後，將穿過Matrigel™塗層和 支架膜而侵入至支架膜下表面及培養孔底部的細胞，以 3.7%之曱醛PBS溶液加以固定。並以棉花球刮除支架膜上 方側的細胞。細胞固定後，以蘇木素（hematoxylin)將其染色 並以PBS溶液清洗。計算支架膜下方側的細胞數目並以 Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring，MD)捕捉 及分析所攝得的影像，並以之來評估每一 MKN45子細胞 株的侵入性能力。 G. 細胞增生分析 以四唾鹽（tetrazolium salt，MTS)/吩0秦二甲S旨硫酸鹽 (phenazine methosulfate, PMS)分析來評估細胞生長速率_。 簡言之，以三重複且每一培養孔含有2000、4000或6000 個細胞的比例，將 MKN45、MKN45-GFP、MKN45-GFP TW4、MKN45-GFP TW10 及 MKN45-GFP TW12 細胞種植在 96-孔的培養盤中（Corning, Acton, MA)。每隔24小時即收 取一次細胞，連續收取6天，在37°C下培育90分鐘後，以 MTS/PMS 分析（其係由 2mg/ml MTS (Promega，Madison，WI) 及 0.38 mg/ml PMS (Sigma, Saint Louis, MO)，溶於不含苯 26 200914830 酚紅的RPMI 640培養基中所形成），測量所收取細胞在490 nm下的吸光值，藉此來監控所收取的細胞量。藉由 SigmaPlot 2001 (System Software, San Jose，CA)軟体内的非 線性迴歸分析（方程式：f=a*2A(x/b))，可獲得細胞在體外 生長的細胞數目倍增時間。 實施例2:以RNA微陣列鑑別出與轉移性胃癌相關的基因 A. RNA徽陳列分折 依據製造商提供的操作方法，以TRIZOL®試劑 (Invitrogen，Carlsbad, CA)來分離出 MKN45、MKN45-GFP 及其子細胞株（包括TW4、TW10和TW12)内的總RNA。並 以 Nanodrop Technology (Wilmington, DE)公司的 ND-1000 光譜儀，測定總RNA在260 nm下的OD值為其定量，並 以 Agilent Technology (Santa Clara，CA)公司的 Bioanalyzer 2100為其定性。在體外轉錄過程中，以Cy3或Cy5 (CyDye, Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ)標定 RNA，並以低 RNA 輸入線 性放大套組（Agilent Technology, Santa Clara，CA)將 0.5 微 克的總RNA放大。以Cy5標定樣本RNA，並以Cy3標定 從通用人類參考RNA中取得的RNA。在60°C下，將2微 克含有Cy-標定的cRNA培育在斷裂緩衝液中約30分鐘， 使其斷裂成平均大小約50-100核苷的斷片。然候，收集這 些有標定的cRNA斷片，並在60°C下與人類1A(第2版）寡 聚物微陣列（Agilent Technology, Santa Clara，CA)進行雜合 反應約17小時。人類1A募聚物中包括有20,000個適合用 27 200914830 來研究基因表現模式的推測基因，且其使用Cy3和Cy5訊 號來比較實驗組基因（即，MKN45母細胞株和其篩選出來的 TW4、TW10和TW12子細胞株）與控制組基因（即， MKN45-GFP)之間的基因表現量。待清洗完並以氮氣搶吹乾 後，以Agilent微陣列掃描儀在535 nm下分別掃瞄測定Cy3 和Cy5的訊號。以Agilent Technology公司提供的影像分析 和常態化軟體8.1來分析所得影像，以定量訊號和背景強 度，接著再以階層一致過濾LOWESS方法對數據進行常態 分析。 分別以光譜儀和Bioanalyzer 2100來定量及定性自 MKN45母細胞、MKN45-GFP和其子細胞株TW4、TW10 及TW12中所抽出來的總RNA。以包括有2萬條推測基因 之人類1A寡聚物與待鑑基因雜合，並比較實驗組（MKN45 母株、MKN45-GFP TW4、TW10 和 TW12)與控制組 (MKN45-GFP)之Cy3和Cy5的訊號，藉此鑑別出基因表現 模式。 B. 微陣列數據叢集分析 將微陣列上的基因表現量與細胞株的入侵能力彼此加 以相關。第3圖為階層叢集分析影像，有525個點（包括冗 餘點）具有明顯表現量，其中有190個上升點（表示與侵入性 為正相關）和335個下降點（表示與侵入性為負相關）。圖上 賦予表現量一假設的顏色表示。階層叢集分析影像的上半 部示出，從高（紅色）到低（綠色），基因表現下降情形；下半 部則是以相反方向呈現的基因表現增加情形。 28 200914830 依據與腫瘤進程相關的各種細 3圖中的基因進-击八士 J肘蕞集於第 .,M 步刀成5大類。這些類別包括：盘血管生 成相關的基因，例如，新 〇血吕生 生長因子；細胞循環财子2 洲和血管内皮 ^調即子，例如，ττκ蛋白激酶和Cyclin rk、”田】 運動力分子’如’催產素受體和cat— 二;蛋白酶和編生分子，如，枯連蛋白 -η ㈣和弟χη型谬原蛋白α七和訊遞分子，如G_蛋白Μ 文體48;和結合有肝素之生長因子的結合蛋白質。具有多 重功能的基因則會被納人—個以上的類別中（第4圖）。 ^鑑別出裏癌相翮的其田 透過上述的微陣列分析，可在所篩選出來的MKN45 之侵入性子細胞株中找到76條與轉移性胃癌有關的基因， 其平均表現量與正常組織間的差異至少為3倍。在所鑑別 出來的76條基时，有22條基因是從未f於文獻中被揭 露過與轉移性胃癌有關的基因。I i提供了用來鑑別出此 22條新穎基因之微陣列探針（序列編號：15〜36)，由這些探 針所鑑別出來的編碼序列（coding sequence, CD)(序列編 5虎：37〜57)及其蛋白質胺基酸序列（序列編號：58〜77)和該 些基因之完整cDNA序列。 29 200914830 表1:用來鑑別出與轉移性胃癌相關之新穎基因的探針序列
基因 名稱 探針序列 (序列編號） 編碼序列 (序列編 號） 氨基酸序列 (序列編 號） RIC3 RIC3蛋白質 15 37 58 CHCHD5 包含5之捲繞-螺旋-捲繞-螺旋域 (coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 5) 16 38 59 SAMD9 FLJ20073蛋白質 17 39 60 CXorf26 假設性蛋白質MGC874 18 40 61 SLC22A17 溶質載體家族22 (有機性離子傳 輸蛋白），成員Π 19 41 62 ZNF572 鋅指蛋白572 20 42 63 THC2052903 THC2052903 21 43 N/A ATAD2 ATP酶家族，包含2之AAA域 22 44 64 RIBC2 第22號染色體22的開放譯讀 框11 23 45 65 NEIL3 DNA糖基解酶hFPG2 24 46 66 HECTD2 含2之HECT域 25 47 67 \FU32065 假設性蛋白質FLJ32065 26 48 68 \C14orfl51 假設性蛋白質MGC13251 27 49 69 \kIF18A 動力蛋白家族成員18A 28 5〇 70 PGM2L1 類1之磷酸葡萄糖變位酶2 29 51 71 \TSPAN1 tetraspan 1 30 52 72 WDHDl |WD重複和HMG箱DNA結合 蛋白1 31 53 73 30 200914830
表2:所鑑別出之與轉移性胃癌相關之基因及其蛋白質
CHCHD5 包含5之捲繞·螺旋-捲繞-螺旋域 (coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 5) SAMD9 CXorf26 SLC22A17 \ZNF572 THC2052903 ATAD2 -· RIBC2 假設性蛋白質MGC874 |___ - - _ 洛質載體彖族22 (有機性離子傳 白），成員17 " '' ' 鋅指蛋白572 NEIL3 DNA糖基解酶hFpG2 含2之HECT域 FU32065 假設性蛋白質FLJ32065 THC2052903 ATP酶g，包含2之AAA 第體22的開放譯讀 獨特叢集 系統性名稱 lHs.458375 AY326436 Hs.375707 NM_032309 Hs.65641 NM_017654 Hs.370100 NM一016500 Hs.373498 NM_016609 Hs.175350 NM_152412 未知 THC2052903 Hs.298646 NM_014109 Hs_144505 NM—015653 Hs.405467 NM—018248 Hs.437398 NM一173497 Hs.396447 [NM—153032 31 200914830 基因 ----------^ 名稱 Τ' - 獨特叢集 系統性名稱 C14arfl51 假設性蛋白質MGC13251 *7 --- Hs.317821 NM_032714 K1F18A 劲力蛋白家族成員18Α Hs.301052 NM 031217 PGM2L1 類1之磷酸葡萄糖變位酶2 ' ' 1 — - Hs.26612 NM_173582 TSPAN1 tetraspan 1 Hs.38972 NM 005727 WDHD1 WD重複和HMG箱DNA結合蛋白j - Hs.385998 NM_007086 SEC11L3 類似訊號胜肽酶複合物（18kD) Hs.45107 NM_033280 THC2095000 THC2095000 未知 THC2095000 A_23_P111766 A一23—Pill766 未知 A_23_P111766 BEX2 表現在腦部的X-連接2 Hs.398989 NM_032621 KBTBD9 包含9之kelch重複和BTB (ΡΟΖ)域 Hs.348392 AB067508
實施例3 :以即時反轉錄聚合酶鍵反應（Real Time Reverse Transcription PCR, RT-PCR)分析來禮認徵陳列結果 A. 即時反轉錄聚合酶鏈反應分折 簡言之，在總體積為20μ1下，以Superscript III第一 股合成系統（Cat No.: 18080-400，Invitrogen，Carlsbad, CA)，將由MKN45及其子細胞株所收取得的總RNA(l-5pg) 反轉錄成為其反轉錄產物（lpg)，並直接用在PCR放大反應 中。依據製造商所提供的操作方式，以PCR試劑系統（Cat No.: 10198-018，Invitrogen，Carlsbad, CA)，在 PC818 程式 模組下，執行PCR放大反應。控制系統是來自ASTEC (Fukuoka，Japan)。表3列出用來放大選定基因之cDN A券 核苷引子。 32 200914830 表3 :選定基因的cDNA引子序列 名稱 序列
OTR LGR4 TFF3 BEX2
SGCE IGFBP3
GAPDH 5，-CCTTCATCGTGTGCTGGACG-3’（正向） 5’-CTAGGAGCAGAGCAC™TG-3’（反向） 5,-GGGAAGCTGGATGATTCGTCTTACT-3, (jl ^) 5’-GAAAAGGGGAAAACAGCCTGCT-3’（反向） S'-AGAGCCTTCCCCAAGCAAACA-S，（正向） 5’-GCAGGGGCUGAAACACCAA-3’（反向） 5，-CCTTGGCCCTACCTTTGAATGT-3,（正向） 5’-TGCTGACTGCCCGCAAACTA-3’（反向） 5，-TTCTCCAAGGTACACTCCGATCG-3,（正向） 5’-GGCCGATGTGATGTTTATGGC-3,（反向） 5'-ACGAGTCTCAGAGCACAGATACCC-3’（正向） 5’-TATCCACACACCAGCAGAAGCC-3’（反向） 5’-TCCACCACCCTGUGCTGTA-3’（正向〉 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’（反向）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 第5A圖為此6種選定基因的RNA表現量，其中TFF3、 BEX2、SGCE和IGFBP3基因，在侵入性較高的細胞株中 (即，MKN45-GFP TW12)有較高的表現量。相反的，OTR 和LGR4基因則是在侵入性較低的細胞株中（即， MKN45-GFP)有較高的表現量。這些RT-PCR的結果與微陣 列研究結果一致。 B. 以西方墨潰法分析表現在叢集基因中之蛋白質 33 200914830 為驗證所鑑別基因之蛋白質表現與上述微陣列篩選結 果一致，以兩種抗體（黑色素瘤抑制活性和類胰島素生長因 子結合蛋白3)來對所有5株MLN45子細胞株進行西方墨潰 分析。每一實驗都做了三重覆。第5B圖分別為MKN45和 其之侵入性子細胞株的黑色素瘤抑制活性（MIA)和類胰島 素生長因子結合蛋白3 (IGFBP3)之表現量。表現在ΜΚΝ45 之侵入性子細胞株（例如，MKN45-GFP TW12)中的ΜΙΑ的 蛋白質（包括其前蛋白型式（pro-form)與成熟蛋白質型式 (mature form)兩種）量較高。與MKN45之侵入性子細胞株 的侵入性能力成正相關的IGFBP3基因，其蛋白質層級也同 樣被往上調節。這些結果顯示，蛋白質的西方墨潰分析與 微陣列分析結果一致。 C. 西方墨潰法分析 以内含蛋白酶抑制劑混合物（Cat No. P8340，Sigma)的 放射線免疫蟹光沉澱分析（radio-immunoprecipitation assay, RIPA)緩衝液將MKN45及其子細胞株（包括MKN45-GFP、 MKN45-GFP TW4、MKN45-GFP TW10 和 MKN45-GFP TW12) 中的細胞溶解。以雙辛可寧酸（bicinchoninic acid, BCA)蛋 白質分析套組（PIERCE，Rockford. IL)來定量細胞溶解物中 的蛋白質量’並將其與電泳加載緩衝液（50mMTris-HCl，2%十 二烷基硫酸鈉鹽(dodecylsulfate sodium salt，SDS)，0.1% 溴化苯酚藍， 10%甘油和1 mM之二硫代蘇糖醇(dithi〇threitol，DTT))—起混合。進 行西方墨潰分析時’於還原條件下，讓所製備的樣本在12〇/〇 SDS中進行電泳。之後，將蛋白質轉移到PVDF膜上 34 200914830 (Immobilon TM-P，Millipore)。接著在 37°C 下，以 5% 脫月旨乳 阻斷PVDF膜上的非專一性反應約30分鐘。接著，在4°C 下讓PVDF膜與小鼠抗人類黑色素瘤抑制活性 (melanoma-inhibitory activity, MIA)之單株抗體或小氣抗人 類類胰島素生長因子結合蛋白3 (IGFBP3)之單株抗體反應 隔夜。兩種抗體均購自R&D系統（Minneapolis，MN)。每次 以PBS-T緩衝液清洗PVDF膜約5分鐘，連續清洗3次， 接著在室溫下和HRP-共軛之驢抗小鼠IgG抗體反應大約1 小時。以PBS-T緩衝液清洗後，讓PVDF膜與購自Perkin Elmer (Waltham，ΜΑ)的 Western LightningTM ECL 债測試劑 一起培育。 第5B圖為MKN45和其之侵入性子細胞株的黑色素瘤 抑制活性（MIA)和類胰島素生長因子結合蛋白3 (IGFBP3) 之表現量。表現在MKN45之侵入性子細胞株（例如， MKN45-GFP TW12)中的MIA的蛋白質（包括其之前蛋白型 式（pro-form)與成熟蛋白質型式（mature form)兩種）量均較 高，與MKN45之侵入性子細胞株的侵入性能力成正相關的 IGFBP3基因，其蛋白質層級也同樣被往上調節。這些結果 顯示，蛋白質的西方墨潰分析與微陣列分析結果一致。 實施例4 :偵測患者體内的轉移性胃癌 A. 以核酸進行偵測 從一罹患胃癌之患者身上取下一初始胃癌組織樣本與 一除胃以外的組織樣本（正常組織）。依據製造商提供的操作 35 200914830 方法，以 TRIZOL® 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA)來分離出 細胞内的總 RNA。並以 Nanodrop Technology (Wilmington， DE)公司的ND-1000光譜儀，測定總RNA在260 nm下的 OD 值為其定量，並以 Agilent Technology (Santa Clara, CA) 公司的Bioanalyzer 2100為其定性。在體外轉錄過程中，以 Cy3 或 Cy5 (CyDye，Perkin Elmer, Waltham, MA)標定胃癌 組織細胞的RNA，並以低RNA輸入線性放大套組（Agilent Technology, Santa Clara, CA)將 0.5 微克的總 RNA 放大。以 Cy5標定正常組織樣本RNA。在60。(：下，將2微克含有Cy-標定的cRNA培育在斷裂緩衝液中約30分鐘，使其斷裂成 平均大小約50-100核苷的斷片。然候，收集這些有標定的 cRNA斷片，並在60°C下與人類1A(第2版）寡聚物微陣列 (Agilent Technology，Santa Clara，CA)進行雜合反應約 17 小 時。待清洗完並以氮氣槍吹乾後，以Agilent微陣列掃描儀 在535 nm下分別掃瞄測定cy3和Cy5的訊號。以Agilent Technology公司提供的影像分析和常態化軟體8.1來分析 所得影像’以定量訊號和背景強度，接著再以階層一致過 濾LOWESS方法對數據進行常態分析。 聚核苷酸的相對表現量顯示一或多包含有序列編號： 37〜53之聚核苷酸在癌組織細胞中的表現量至少比正常組 織樣本中相同聚核苷酸的表現量低了 3倍，且一或多包含 有序列編號：54〜57之聚核苷酸在癌組織細胞中的表現量至 少比正常組織樣本中相同聚核苷酸的表現量高了 3倍。 B. 以抗體進行偵測 36 200914830 從-罹患胃癌之患者身上取下一初始胃癌組織樣本與 一除胃以外的組織樣本（正常組織）。從每一樣本中分離出蛋 : 白質並加入微量滴盤之每一個別滴定小孔中。可利用市面 • 上販售的各種套組（例如，Calbiochem出。之 P〇RTE〇EXTRAC，的完整哺乳動物蛋白質體抽取:组） 或IUPA抽取緩衝液來抽取錢、組織、尿液或其他體液内 的蛋白質。在每-滴定小孔内加入可與所揭示蛋白質結合 ('' m體。培育微量滴盤使得抗體可與多胜肽結合。^
抗體-多胜肽間的親合力、抗體專一性、和敏感性來改變每 一抗體的培育條件和價數。舉例來說，在室溫下與一級抗 體雜合1小時或是在4tT進行隔夜雜合。在每—滴定小孔 内加入可和-級抗體截合的二級抗體。二級抗體包含山葵 過氧化酶（膽）。將含有蛋白質一級與二級抗體之混合物 =起培育使-級抗體可與二級抗體相結合。舉例來說，在 室温下與二級抗體雜合1小時。在每_培養孔中加入ECL υ HRP基質。將微量滴盤插入至讀盤器中並測量HRP反應產 物的量，以決定出每一小孔内的多胜肽量。 多胜肽的相對表現量顯示一或多包含有序列編號： 5 8〜7 3之多胜肽在癌組織細胞t的表現量至少比正常組織 樣本^相同多胜肽的表現量低了 3倍，且一或多包含有序 」、扁號.74〜77之多胜肽在癌組織細胞中的表現量至少比正 常組織樣本中相同多胜肽的表現量高了 3倍。 、以上已透過實施方式清楚地闌述本發明，本發明範疇 並不僅限於所揭示的實施方式。可本文可預見處，仍可量: 37 200914830 本發明内容加以修改及改良，這些修改及改良均仍應視為 本發明申請專利範圍的延伸並為其所涵蓋。 【圖式簡單說明】 為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例 能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下： 第1圖為以倒立式顯微鏡於（A)可見光或（B)UV光拍攝 MKN45-GFP細胞而得的照片； 第2Α圖闡示ΜΚΝ45子細胞株的體外侵入性能力。上 圖為每一 ΜΚΝ45子細胞株經過蘇木素染色後的照片，下圖 為在Transwell膜下方側之每一 ΜΚΝ45子細胞株的細胞密 度； 第2B圖以MTS/PMS分析所決定出來之每一 MKN45 子細胞株的生長速率， 第3圖示出525個微陣列點的階層叢集分析結果，其 中鑑別出335個下降陣列點以及190個上升陣列點； 第4圖示出侵入性/轉移性相關基因群組，包括（A)血管 增生（angiogenesis)相關基因，（B)細胞週期調控子，（C)細胞 骨架及能動性分子，（D)蛋白酶和黏合蛋白，及（E)訊遞分子； 第5A圖示出RNA表現模式的RT-PCR分析結果；及 第5B圖示出一蛋白質表現模式的西方墨潰分析結果。 【主要元件符號說明】 38 200914830 段宗帆 SEQUENCE LISTING * <11CI>林恆良 ▼ 陳炯東 與轉移胃癌相關的基因 cl30> 0B842.0023-00 <140> 60/966,074 <141> 2007-08-24 <16〇> 77 <170> Patentln Ver. 3.3
<211> 20
<212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：合成引子 <400> 1 cctccatcgt gtgctggacg 20
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<210> 19 <211> 60 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223：»人造序列描述：合成探針 <400> 19 cttgctctat cattctgttt caataaagac atttggaata aacgagcata tcatagcctg 60
<210> 20 <211? 60 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：合成探針 <400> 20 ttgcatgggg gttattttat ctttcatgat tgtggtgcac ctgatgctgg cggggtattt 60 ,Λ
<210> 21 <211> 60 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：合成探針 6200914830 <400> 21 atgtcatttg ccatattgcc atctaaagga gaaaaactgc atcagcaaag ccattgtatt 60
<210> 22 <211> 60 <212> DNA <213>人造序列 <22〇><223>人造序列描述：合成探針 <400> 22 catggtatcg agtattcttt atattcagtt cctatttaag tcatttttgt catgtccgcc 60 <210> 23 <211> 60 <212> DNA<213>人造序列 <220><223>人造序列描述 合成探針 <400> 23 aagtcgataa tgaggaacac acccttgttc ccgtcattca cgtataaaga gtggctacct 60 <210> <211> <212> <213>
24 60 DNA 人造序列 <220><223>人造序列描述：合成探針
<400> 24 caccatgaaa acagtattga agattggacc taacaatgga aagaattttt tggtgtgtcc 60 <210> <211> <212> <213>
25 60 DNA 人造序列 <220><223>人造序列描述：合成探針 <400> 25 taatcctgta tcttatatgg atatatgtat gtgtttgcat tgactgggac ctctttcaca 60 7200914830 <210> <211> <212> <213> <220>
26 60 DNA 人造序列 人造序列描述：合成探針 <400> 26 ccattcgatt acattttctt ttattttcct acaatgcaag cacggtttta gtcctgtagg 60
c210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> •人造序列 <220><223>人造序列描述： 合成探針 <400> 27 actgccctag aaggcaaatc gcctacgtta cacagtgtac catgtggcaa acacgcacat 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <2132 人造序列 <220><223>人造序列描述：合成探針 <400> 28 caagt仁ctac atcaaacagt tcgttaactg cagacgtaaa ttctggatct gccaaacgtg 60
<210> 29 <211> 60 <212> DNA <213： 人造序列 <220><223>人造序列描述：合成探針 <400> 29 gggcatatgg aacagagcaa ccgagaactg catacattga accttgtgtt agcattctct 60
<210> 30 <211> 60 <212> DNA 213ϊ人造序列 <220>200914830 <223> 人造序列描述：合成探針 <400> 30 gtgtccatgt atctgtactg caatctacaa taagtccact tctgcctctg ccactactgc <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列描述：合成探針 <400> 31 tctttgcaga ttactctgcc tccaaatgca gggcctttca gagatgcatt gtgattgtaa <210> 32 <2I1> 60 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 人造序列描述：合成探針 <400> 32 ttcaagtatg ctcttttggc tgtaatgggt gcatatgtgt tactaaaacg tgaatcctaa <21〇> 33 <2X1> 60 <212> DNA <213> 人造序列
<220>
<223>人造序列描述：合成探針 <400> 33 ttttctcccc ttacgcactt tgaaacccat gctagaaaag tgaatacatc tgactgtgct
<210> 34 <211> 60 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：合成探針 <400> 34 catagctgcc aacagctaaa gcccccagta tctcttcagt ctctatacca attaaagtga 9200914830
<210> 35 <21X> 60 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223: 人造序列描述：合成探針 <400> 35 atttcttgtg ggtctcctat taccagcttc taaatgaatg ttgttcttga cccagtttgt 60
<210> 36 <211> 60 <212> DNA i213>人造序列 <220> 合成探針 <223>人造序列描述： <400> 36 acacagatga cattgaaatt cgtttctctc ctcatctatc acactggagc aaaactggct 60 <210> 37 <211> 384 <212> DNA <213> 人 <400> 37 atggcgtact ccacagtgca gagagtcgct ctgctgccca aggccttcct gtcccgcggg ggaaaattgg gccgatttcc acctatgatg actcctgggg ctcgtttcca gaggtctcac tcaggtggag gtgctggagg aggaggtagt atctacggtt ttgggatttt tttatatata atcctaacca tattacatca atga ctggcttctg ggcttgtcct ggctctgtcg 60 aagcggcagg agccgccgcc gacacctgaa 120 catcatcacc aggcaccctc agatggccag 180 cttgccgagg catttgcaaa ggccaaagga 240 ggaagaggtc tgatggggca gattattcca 300 ctgtacattc tatttaaggt aagtagaatc 360 384 <210> 38 <211> 333 <212> DNA <213> 人 <400> 38 atgcaggcgg ccctagaggt caccgctcgc tactgtggcc gggagctgga gcagtatggc 60 cagtgtgtgg cggccaagcc ggaatcctgg cagcgggact gtcactacct taagatgagc 120
attgcccagt gcacatcctc ccacccaatc atccgccaga tccgccaggc ctgtgctcag ISO ccttttgagg ccttcgagga gtgtcttcga cagaacgagg cagctgtggg caactgtgca 240 gagcatatgc gccgcttcct gcagtgcgct gagcaggtgc agccgccacg ctcacctgca 300 actgtggagg cacagccact tcctgcctcc tga 333 200914830 ίο
<210> 39 <211> 4770 <212> DNA <213> 人 <400> 39 atggcaaagc aacttaacct tccagaaaat acagatgatt ggacaaaaga ggatgtaaat 60 cagtggttag aaagtcataa gattgaccaa aaacacaggg aaattttgac tgaacaagac 120 gtgaatggag cagtcttgaa gtggttaaaa aaagaacatc ttgttgatat gggcatcaca 180 catggaccag ctattcaaat agaagaacta ttcaaagaat tgcggaaaac agccattgaa 240 gattcgattc agacatctaa gatgggaaag cccagtaaaa atgctcctaa agaccaaact 300 gtgtctcaaa aggaacgtag agaaacttca aagcaaaaac aaaagggtaa agagaaccca 360 gatatggcta atccgtctgc aatgagtaca actgctaaag gttctaagtc actaaaagtt 420 gagctcatag aagataaaat agattataca aaggaaaggc aaccatccat agacctgaca 480 tgtgtatcat atccatttga cgaattcagt aatccatatc gttacaagtt ggattttagt 540 ctacagcctg aaacaggacc aggcaatctc attgatccga tacatgaatt caaagccttc 600 acaaatacag caacagccac agaagaggat gtcaagatga aatcca^caa tgaggtttcc 660 cgatctgctt cagcttgtat gaattcacgt accaatggca ctattcattt tggagtcaaa 720 gacaaacccc atgggaaaat tgttggcatc aaagtcacca atgataccaa ggaagccctc 7Θ0 attaaccatt tcaatctgat gataaacaag tatttcgaag accatcaagt ccaacaagca 840 aagaagtgca ttcgagagcc aagatttgtg gaagttttac tgccaaatag tactctatct 900 gacagatttg ttattgaagt ggacattatt ccacagttct ctgaatgcca atatgattat 960 ttccagatta aaatgcaaaa ttacaacaac aaaatatggg aacaaagtaa aaaattctca 1020 ccatttgtgc gagatgggac cagctctaag gacattacga aaaataaagt tgatttcaga 1060 gcatttaaag cagattttaa aacactggca gagtccagaa aagcagcaga agaaaaattc 1140 agagcaaaaa caaataaaaa agaaagagag ggaccaaagt tggttaaatt attgacagga 1200 aatcaagatt tgttagataa ttcatactat gaacagtaca ttcttgtaac aaataaatgc 1260 cacccagatc aaacaaaaca cttagatttc ctgaaggaaa ttaaatggtt tgctgtattg 1320 gagtttgatc ctgagtctaa catcaatgga gtggtcaaag cttacaaaga aagccgagta 1360 gcaaaccttc actttccaag tgtatatgta gaacagaaaa ccacaccaaa tgagacgatt 1440 tctactctaa atctttacca tcaacccagc tggattttct gcaatggcag gttagacctt 1500 gacagtgaaa aatataaacc ctttgatcca agttcctggc aaagagaaag agcttctgat 1560 gtcaggaaac tgatttcatt tcttacacat gaagacataa tgccaagagg gaagtttttg 1620 gtggtatttc tattactgtc ctctgtggat gacccaagag atcccctcat tgagactttc 1680 tgtgctttct accaggatct caaaggaatg gaaaatatac tgtgtatttg tgtgcaccca 1740 cacatatttc agggatggaa agatctactt gaagcaagat taataaaaca ccaagatgaa 1800 atttcaagcc aatgtatttc tgctttaagc cttgaagaga tcaatggcac tattcttaaa 1660 ctaaaatctg tgactcaatc ttcaaaaagg cttttgccat ctattggttt atcgactgtc 1920 cttctgaaaa aggaagaaga tatcatgact gctctggaaa ttatctgtga aaatgaatgt 1980 gagggtacac cgttagagaa ggacaaaaat aaattccttg aattcaaggc atcaaaagag 2040
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<210> 40 <211> 702 <212> DNA <213> 人 <400> 40 atggcggcca ccagtggaac tgatgagccg gtttccgggg agttggtgtc tgtggcacat 60 gcgctttctc tcccagcaga gtcgtatggc aacgatcctg acattgagat ggcttgggcc X20 atgagagcaa tgcagcatgc tgaagtctat tacaagctga tttcatcagt tgacccacag 180
ttcctgaaac tcaccaaagt agatgaccaa atttactctg agttccggaa aaattttgag 240 acccttagga tagatgtgtt ggacccagaa gaactcaagt cagaatcagc caaagagaag 300 tggaggccat tctgcttgaa gtttaatggg attgctgaag acttcaacta tggtactttg 360 ctgcgactag attgttctca gggctacact gaggaaaaca ccatctttgc ccccaggata 420 caattctttg ccattgaaat tgctcggaac cgggaaggct ataacaaagc tgtttatatc 480 agtgttcagg acaaagaagg agagaaagga gtcaacaatg gaggagaaaa aagagctgac 540 agcggagaag aagagaacac caagaatgga ggagagaaag gagctgatag tggagaagaa 600 aaagaggaag gaatcaacag agaagacaaa accgacaaag gaggagaaaa agggaaagaa 660 gctgacaaag aaatcaacaa aagtggtgaa aaagctatgt aa 702 <210> 41 <211> 1563 <212> DNA <213> . 人 <400> 41 atggcctcgg accccatctt cacgctggcg cccccgctgc attgccacta cggggccttc 60 ccccctaatg cctctggctg ggagcagcct cccaatgcca gcggcgtcag cgtcgccagc 120 12 gctgccctag ggcttcgccc gtgctcacca atcctggagc cccgcagaca tgtggagtag ttgggctttc gacccaaccc ttcctgttcc accgctccct cggtggctga gagcgaaacc ctggagaata taccgcaaca attcgccact tctctgctgg cgatttggcc gtcctgctgg gggctcttct cccaccactg ctgagcggcc ctggcggcct aagctcctgc cagccacccc tga cagccagcgc cgccggactt ccaacgccat agatcctctt gatttggccg gaggggctgc tgcttgccgg agaggcttcg tgggcctggc gcatcctctt tagtgaagcg ggccccatgg cctgccctct tctggaaaaa gctaccagcc ocagcggcac gccggggcat gcctgtggga cctcccaagc tccggggccg cggcccagcg gcgccctcct ccgaggtgct ctacccgctg cgccagccgt caaccattgc cggccagtgg catcttgggc tcgcgggatt tgcaggctcc tgttgacctg 99tggccctg ccttgtctct cctgttttat gcagattgag gcagatgctg ccctgcaaca tctgcttatc tgtgggagga cgcagccctg ccttcttctc ttatctgaac tgccgccatc tggcctgggc cctccacatg ctgcattctc ccgggacggg tgaccacgtc gtcgccacca eccaaggatt gatctggtgt tttgcctccg gtgctgctga tccacaggcg ggtgtctacc gcaggggagt aaggattggc ggctggcctg gaggctcagt ggggaggagg tcctcctttt ctgggcttca ggagggagcc gcctgtgtct tccatgaccc gaggctgcca ctcagcaccc ctgatcatgg ggccatggag agcattatgc gagctgtgtc ccgctgcttg gtaccgaccc gggactataa gtgacctggg gctacctgtt ccttggggct tcatggccct tgatgcgcct tggtgggggt gattcctaca
gtttgttccC ctgtgctgag cccaggaggc cctttgcttc ccaacttcat catcggactt tcctgggggt ttaccggcat tcaccacttt tccttgctgc ctctaggggc ccttcctgca tgctgccgga gccggccttc ccacccccaa ctcgtgcagc tggccttcct ctggcaggtg cctgggttac ggtgggcccc ccgattcctc ggagctgtgc gggagggcac gcgaatgatc ggagtccgca gatcctggct cctgcaggac cctcctcaac tgcccatgcc ctacctgtgc caccgtggac tgcttccctg ctctgtcctt tgaggtcatc gcttggagga gcacgtggtg gaccaagcgc cctgctgcgg ccctgccctc 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1563 <210> 42 <211> 1590 <2X2> DNA <213>人 <400> 42 atggagcaag aaaaaaaact gttggtctca gattctaaca gctttatgga gagggagagt 60 ttgaaaagcc ctctcacagg agatacaagt atgaataatt tggaaactgt tcaccacaat 120 aattctaagg cagataaact taaagagaaa ccttcagaat ggtctaaaag acatagacca 180 caacattata agcatgagga tgcaaaagaa atgccactga catgggttca agatgagatc 240 tggtgtcatg actcctatga gagtgatggc aagtcagaga attggggaaa ttttatagct 300 aaagaggagg aaaaacccaa tcaccaggaa tgggactcag gagaacatac caatgcctgt 360 gtccagcaga attcatcctt tgtagacaga ccctataaat gttccgaatg ttggaaaagc 420 ttcagtaata gttctcattt gcgtactcac cagaggaccc actcaggaga aaagccttat 480 aaatgctctg agtgtgcaaa atgtttttgt aacagttctc acctgattca gcatctaaga 540 atgcacacag gagagaagcc cCaccagtgt ggtgaatgtg ggaaaagctt cagcaatacc 600 tcccatctta ttatccatga gagaactcac acgggagaga aaccctacaa atgtcccgag 660 tgtgggaaga gattcagcag cagctctcac cttattcagc atcacagatc acatacaggt 720 gaaaaaccat atgaatgttc tgtctgcgga aaaggcttca gtcacagcta tgtcctaata 780 gaacatcaga ggactcacac tggagaaaaa ccttataagt gccctgattg tgggaagagt B4〇 tttagtcaga gttccagcct cattcgccac cagcggacac acacaggtga gaagccctac 900 aaatgtcttg agtgtgaaaa aagctttggt tgtaattcta ctctaataaa acatcagaga 960 atacatacag gagaaaagcc ttatcaatgt ccagaatgtg ggaagaattt tagtcgtagt 1020 tcaaacctta ttacacacca gaaaatgcac acaggagaga aatcctatga aagttctgaa 1080 tatgaggaaa gtttgggtca gaactgcaat gtgatagaag aatgcagaat ccagttagga 1140 gagaaaccat atagatgttg tgaatgtggg aagagttttg gccttagctc ccatctcatt 1200 agacatcaga gaacacatac aggagaaaaa ccttacagat gttctgagtg ctggaaaact 1260 ttcagtcaga gttccaccct ggtgattcac caaaggacac atacaggaga gaaaccttat 1320 aaatgtcctg attgtggtga aagcttcagt cagagcttta accttatcag gcaccggagg 1380 acccacatag gggaaaaacc ttacaaatgt accagctgtg agaaatgctt cagcagaatt 1440 gcctacctca gtcagcatcg gaaaattcac gtagaaaagc cttttgagtc tcccgacgtt 1500 13 ggggattttc ctcatgaatg gacttggaaa aactgttcag gggaaatgcc cttcatctct 1560 tcattttccg tctcaaattc atcttcctga 1590
<210> 43 <211> 903 <212> DNA <213> 人 acaagttgga 60 agtaacaaat 120 tttgagaggg 180 aaacttgcct 240 attatgtgga 300 tccatgagta 360 aggtgaatgc 420 ggtttgtctt 480 ggagaaaaac 540 ggatttacta 600 accggccctc 660 atgttctgtg 720 aatggaatac 780 tattaaaact 840 aagctagagt 900 <400> 43 acgcagctca aaagggaccg ggaagcactt cacccaggag agacaataac tgtttacaat actttcctaa agatgttcac tcttctttgc tgcatcagca agctgatgaa atgtttgtat gaaatattaa actgatctac ataatttaaa agg tcaaccaccc aaaacaacgt acaagaaaat tgtctgagct tggaaaaaca ggtgggaaat taggcttttt tttagcagac ctgagaaata aagccattgt tattccaaaa gtacttgagg aaaaaaaaaa tactgatgtc tgtaccatga caatctcaac cggcaaaggc aagaaaggta gcattacctc aatgcaatat tcagctgagt ttcctaatac ctaatgtttc aaaatgtcat attgaactaa cgtggttgga agcaaaatga aaacataagc ttctttcagc aaaatatgca acgatggatg caggacatac gaaacaggag tagaaacctc acatgaactt tccaccaatt caccacctaa ctatgagatt ttgccatatt aagtttaaaa ttcaaggata gtaaaatgat catccatcat tttgatctaa gtaaaaatta agttctgtga cccagggaac gacccacgaa aaacaagtag tttccatggc ataaattaaa cagagaacac tcactgtaca gccatctaaa tgaactgcat tattttgtct actgaatgaa ccagaagaaa agatgtattt gttgtttCct
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gccctgcttc ttcgattgtt tactattgga 1680 ggggttcaaa aagaggtatt cagccttgct ggacctgtgg cgtcaatggc aggacatgga 1740 gaacagcttt tcattgttta tcacagaggt acaggatttg atggggatca gtgccttgga 1800 gtccaactgc tagagctggg gaaaaagaaa aaacaaattt tgcatggtga ccctcttcct i860 cttacaagga aatcctacct tgcatggatt gggttttcag ctgaaggtac cccttgttac 1920 gtggattcag aaggaattgt tcgaatgctt aacagaggac ttggtaatac gtggactcct 1980 atatgtaata caagagagca ctgcaaagga aaatctgatc actactgggt ggctggtatc 2040 catgaaaatc cccagcaact aaggtgcatC ccttgtaaag gttctcggtt tcccccaacc 2100 cttccacgcc ctgctgttgc tatattatcc tttaagcttc cttactgtca gattgcaaca 2160 gagaaaggac aaatggagga gcaattttgg cgttcagtta tatttcacaa ccaccttgat 2220 tatttagcta aaaatggtta tgaatatgaa gagagcacta aaaatcaagc aacaaaagag 2280 caacaggaac ttttaatgaa aatgcttgcg ctttcttgta aactggagcg agaattccgt 2340 tgtgtggaac ttgctgatct aatgactcaa aatgctgtga atttagccat taaatatgct 2400 tctcgctctc ggaaattaat actggctcaa aaactaagtg aactggctgt agagaaggca 2460 gccgaattga cagcaaccca ggtggaagag 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aaacctttag atttttctac aaatcagaaa 3360 ctatcagctt ttgcatttaa gcaggagtaa 3390 20 <210> 54 <211> 579 <212> DNA <213> 人 <400> 54 atggtgcgtg cgggcgccgt gggggctcat ctccccgcgt ccggcttgga tatcttcggg gacctgaaga agatgaacaa gcgccagctc tattaccagg ttttaaactt cgccatgatc gtgtcttctg cactcatgat atggaaaggc ttgatcgtgc tcacaggcag tgagagcccc atcgtggtgg tgctgagtgg cagtatggag ccggcctttc acagaggaga cctcctgttc ctcacaaatt tccgggaaga cccaatcaga gctggtgaaa tagtcgtttt taaagttgaa ggacgagaca ttccaatagt tcacagagta atcaaagttc atgaaaaaga taatggagac atcaaatttc tgactaaagg agataataat gaagttgatg atagaggctt gtacaaagaa ggccagaact ggctggaaaa gaaggacgtg gtgggaagag caagagggtt tttaccatat gttggtatgg tcaccataat aatgaatgac tatccaaaat tcaagtatgc tcttttggct gtaatgggtg catatgtgtt actaaaacgt gaatcctaa <210> 55 <211> 744 <212> DNA <213> 人 <400> 55 atgaatccac tcctgatcct tacctttgtg gcagctgctc ttgctgcccc ctttgatgat gatgacaaga tcgttggggg ctacaactgt gaggagaatt ctgtccccta ccaggtgtcc ctgaattctg gctaccactt ctgtggtggc tccctcatca acgaacagtg ggtggtaCca gcaggccact gctacaagtc ccgcatccag gtgagactgg gagagcacaa catcgaagtc ctggagggga atgagcagct catcaaCgca gccaagatca tccgccaccc ccaatacgac aggaagactc tgaacaatga catcatgtta accaagctct cctcacgtgc agtaatcaac gcccgcgtgt ccaccatctc tctgcccacc gcccctccag ccactggcac gaagtgcctc atctctggct ggggcaacac tgcgagctct ggcgccgact acccagacga gctgcagtgc ctggacgctc ctgtgctgag ccaggctaag tgtgaagcct cctaccctgg aaagattacc agcaacatgt tctgtgtggg cttccttgag ggaggcaagg attcatgtca gggtgattct ggtggccctg tggtctgcaa tggacagctc caaggagttg tctcctgggg tgatggctgt gcccagaaga acaagcctgg agtctacacc aaggtctaca actatgtgaa atggattaag aacaccatag ctgccaatag ctaa <2X0> 56 <211> 387 <212> DNA 咖人 <400> 56 atggagtcca aagaggaacg agcgttaaac aatctcatcg tggaaaatgt caaccaggaa aatgatgaaa aagatgaaaa ggagcaagtt gctaataaag gggagccctt ggccctacct ttgaatgtta gtgaatactg tgtgcctaga ggaaaccgta ggcggttccg cgttaggcag cccatcctgc agtatagatg ggacataatg cataggcttg gagagccaca ggcaaggatg agagaggaga atatggaaag gattggggag gaggtgagac agctgatgga aaagctgagg gaaaagcagt tgagtcatag tctgcgggca gtcagcactg atccccctca ccatgaccat cacgatgagt tttgccttat gccctga
<21〇> 57 <211> 1638 <212> DNA <213> 人 21 <400> 57 ccaaggtgtg cagggagatc tagccctgtg aggaagcggc acggtggccg cagggcagga 60 ggtaaggaca ccctggtctc tgtgcctagg tccgtgcaag acagcggcca gggcggccgg 120 gagaagctgg agctcgtcct gtcgaacctg caggcagacg tcctggagtt gctgctggag 180 tttgtctaca cgggctccct ggtcatcgac tcggccaacg ccaagacact gctggaggcg 240 gccagcaagt tccagttcca caccttctgc aaagtctgcg tgtcctttct cgagaagcag 300 ctgacggcca gcaactgcct gggcgtgctg gccatggccg aggccatgca gtgcagcgag 360 ctctaccaca tggccaaggc cttcgcgctg cagatcttcc ccgaggtggc cgcccaggag 420 gagatcctca gcatctccaa ggacgacttc atcgcctacg tctccaacga cagcctcaac 480 accaaggctg aggagctggt gtacgagaca gtcatcaagt ggatcaagaa ggaccccgcg 540 acacgcacac agtacgcggc tgagctcctg gccgtggtcc gcctcccctt catccacccc 600 agctacctgc tcaatgtggt tgacaatgaa gagctgatca agtcatcaga agcctgccgg 660 gacctggcga acgaggccaa acgctaccat acgctgcccc acgcccgcca ggagatgcag 720 acgccccgaa cccggccgcg cctctctgca ggtgtggctg aggtcatcgt cttggttggg 780 ggccgtcaga tggtggggat gacccagcgc Ccgctggtgg ctgtcacctg ctggaacccg 840 cagaacaaca agtggtaccc cttggcctcg ctgcccttct atgaccgcga gttcttcagt 900 gtagtgagtg caggggacaa catctacctc tcaggtggaa tggaatcagg ggtgacgctg 960 gctgatgtct ggtgctacat gtccctgctt gataactgga acctcgtctc cagaatgaca 1020 gtcccccgct gtcggcacaa tagcctcgtc tacgatggga agatttacac cctcggggga 1080 cttggcgtgg caggcaacgt ggaccacgtg gagaggtacg acaccatcac caaccaacgg 1140 gaggcggtgg cccctctgcc caaggcagta cactctgctg cagccacagt gtgtggcggc 1200 aagatctacg tgtttggtgg ggtgaacgag gcaggccgag ctgccggcgt cctccagtct 1260 tacgttcctc agaccaacac gtggagcttc atcgagtccc caatgattga caacaagtat 1320 gcccccgctg tcacgctcaa tggcttcgtt ttcatcctgg gcggggctta tgccagagct 1380 accaccatct acgaccctga gaaaggaaac attaaggcgg gcccaaacat gaaccactct 1440 cgccagttct gcagtgctgt ggtgcttgat ggcaagattt atgcaactgg aggtattgtc 1500 agcagtgaag ggcccgcgct gggcaacatg gaggcctacg agcccacaac caacacatgg 1560 accctcctcc cccacatgcc ctgccctgtg ttcagacacg gctgcgtcgt gataaagaaa 1620 tatattcaaa gcggctga 1636 <210> 58 <211> 127 <212> PRT <213> 人 <400> 58
Met Ala Tyr Ser Thr Val Gin Arg Val Ala Leu Ala Ser Gly Leu Val 15 10 15
Leu Ala Leu Ser Leu Leu Pro Lys Ala Phe Leu Ser Arg Gly Lys Arg 20 25 30
Gin Glu Pro Pro Pro Thr Pro GXu Gly Lys Leu Gly Arg Phe Pro Pro 35 40 45
Met Met His His His Gin Ala Pro Ser Asp Gly Gin Thr Pro Gly Ala 50 55 60
Arg Phe Gin Arg Ser His Leu Ala Glu Ala Phe Ala Lys Ala Lys Gly 65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Gly Leu Met Gly 85 90 95
Gin He lie Pro lie Tyr Gly Phe Gly lie Phe Leu Tyr He Leu Tyr 100 105 110 22 22
200914830 lie Leu Phe Lys Val Ser Arg lie lie Leu Thr lie Leu His Gin 115 120 125
<210> 59 <211> 110 <212> PRT <213> 人 c400> 59
Met Gin Ala Ala Leu Glu Val Thr Ala Arg Tyr Cys Gly Arg Glu Leu 15 10 15
Glu Gin Tyr Gly Gin Cys Val Ala Ala Lys Pro Glu Ser Trp Gin Arg 20 25 30
Asp Cys His Tyr Leu Lys Met Ser lie Ala Gin Cys Thr Ser Ser His 35 40 45
Pro lie lie Arg Gin lie Arg Gin Ala Cys Ala Gin Pro Phe Glu Ala 50 55 60
Phe Glu Glu Cys Leu Arg Gin Asn Glu Ala Ala Val Gly Asn Cys Ala 65 70 75 80
Glu His Met Arg Arg Phe Leu Gin Cys Ala Glu Gin Val Gin Pro Pro 85 90 95
Arg Ser Pro Ala Thr Val Glu Ala Gin Pro Leu Pro Ala Ser 100 105 110 <210> 60 <211> 1589 <212> PRT <213> 人 <400> 60
Met Ala Lys Gin Leu Asn Leu Pro Glu Asn Thr Asp Asp Trp Thr Lys 15 10 15
Glu Asp Val Asn Gin Trp Leu Glu Ser His Lys lie Asp Gin Lys His 20 25 30
Arg Glu He Leu Thr Glu Gin Asp Val Asn Gly Ala Val Leu Lys Trp 35 40 45
Leu Lya Lys Glu His Leu Val Asp Met Gly He Thr His Gly Pro Ala 50 55 60 lie Gin lie Glu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Arg Lys Thr Ala lie Glu 65 70 7S 80
Asp Ser lie Gin Thr Ser Lys Met Gly Lys Pro Ser Lys Asn Ala Pro 85 90 95 23 200914830
Lys Asp Gin Thr Val Ser Gin Lys Glu Arg Arg Glu Thr Ser Lys Gin 100 105 HO
Lys Gin Lys Gly Lys Glu Asn Pro Asp Met Ala Asn Pro Ser Ala Met 115 120 125
Ser Thr Thr Ala Lys Gly Ser Lys Ser Leu Lys Val Glu Leu lie Glu 130 135 140
Asp Lys lie Asp Tyr Thr Lys Glu Arg Gin Pro Ser He Asp Leu Thr 145 150 155 X60
Cys Val Ser Tyr Pro Phe Asp Glu Phe Ser Asn Pro Tyr Arg Tyr Lys 165 170 175
Leu Asp Phe Ser Leu Gin Pro Glu Thr Gly Pro Gly Asn Leu lie Asp 180 185 190
Pro He His Glu Phe Lys Ala Phe Thr Asn Thr Ala Thr Ala Thr Glu 195 200 205
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Ala Cys Met Asn Ser Arg Thr Asn Gly Thr lie His Phe Gly Val Lys 225 230 235 240
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Lys Glu Ala Leu lie Asn His Phe Asn Leu Met lie Asn Lys Tyr Phe 260 265 270
Glu Asp His Gin Val Gin Gin Ala Lys Lys Cys He Arg Glu Pro Arg 275 280 285
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Phe Gin He Lys Met Gin Asn Tyr Asn Asn Lys He Trp Glu Gin Ser 325 330 335
Lys Lys Phe Ser Leu Phe Val Arg Asp Gly Thr Ser Ser Lys Asp lie 340 345 350
Thr Lys Asn Lys Val Asp Phe Arg Ala Phe Lys Ala Asp Phe Lys Thr 355 360 365
Leu Ala Glu Ser Arg Lys Ala Ala GXu Glu Lys Phe Arg Ala Lys Thr 370 375 380
Asn Lys Lys Glu Arg Glu Gly Pro Lys Leu Val Lys Leu Leu Thr Gly 385 390 395 400 24
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Glu lie Lys Trp Phe Ala Val Leu Glu Phe Asp Pro Glu Ser Asn lie 435 440 445
Asn Gly Val Val Lys Ala Tyr Lys Glu Ser Arg Val Ala Asn Leu His 450 455 460
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Ser Thr Leu Asn Leu Tyr His Gin Pro Ser Trp He Phe Cys Asn Gly 485 490 495
Arg Leu Asp Leu Asp Ser Glu Lys Tyr Lys Pro Phe Asp Pro Ser Ser 500 505 510
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Leu Leu Ser Ser Val Asp Asp Pro Arg Asp Pro Leu lie Glu Thr Phe 545 550 555 560
Cys Ala Phe Tyr Gin Asp Leu Lys Gly Met Glu Asn lie Leu Cys He
565 570 57S
Cys Val His Pro Hig lie Phe Gin Gly Trp Lys Asp Leu Leu Glu Ala 580 585 590
Arg Leu He Lys His Gin Asp Glu lie Ser Ser Gin Cys lie Ser Ala 595 600 605
Leu Ser Leu Glu Glu lie Asn Gly Thr lie Leu Lys Leu Lys Ser Val €10 615 €20
Thr Gin Ser Ser Lys Arg Leu Leu Pro Ser lie Gly Leu Ser Thr Val 625 630 635 640
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Asp lie Met Thr Ala Leu Glu lie He Cys 645 6S0 655
Glu Asn Glu Cys Glu Gly Thr Leu Leu Glu Lys Asp Lys Asn Lys Phe 660 665 670
Leu Glu Phe Lys Ala Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr Arg Gly Gly Lys 675 680 €85
Val Ser Trp Trp Asn Phe Tyr Phe Ser Ser Glu Ser Tyr Ser Ser Pro 690 695 700 25
Phe Val Lys Arg Asp Lye Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Met lie Gin Asn 705 710 715 720
Cys Ala Asp Ser Ser Lys Pro Thr Ser Thr Lys lie lie His Leu Tyr 725 730 735
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Phe Glu Glu Gin Asp Asn Val Tyr Leu Leu Gin Tyr Ser lie Gin Thr 805 810 815
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Asp Phe Tyr Ser Phe Met lie Met Lys Thr Asn Phe Asn Lys Glu Tyr B85 890 895 lie Glu Asn Val Val Arg Asn He Leu Lys Gly Gin Asn lie Phe Thr 900 905 910
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Gly Asn Lys Lys Ala Phe Trp Gly Thr Glu Lys Phe Glu Asp Lys Met 945 950 955 960
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Trp Ala Lys Gin Ala Lys lie lie Glu Pro Asp Asn Ser Tyr lie Ser 1105 1110 1115 1120
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Glu Asn Gly Gly Asn Gly Asn lie Ser Val Asp Asp Leu lie Ala Leu 1140 1145 1150
Leu Asp Leu Ala Glu His Ala Ser Ser Ala Phe Lys Glu Ser Gin Gin 1155 1X60 1165
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Ser Lys Arg Arg Tyr Asp Thr Tyr Asn lie Ala Gly Tyr Gin Gly Glu 1185 1190 1195 1200 lie Glu Val Gly Leu Tyr Thr He Gin lie Leu Gin Leu He Pro Phe 1205 1210 1215
Phe Asp Asn Lys Asn Glu beu Ser Lys Arg Tyr Met Val Asn Phe Val 1220 1225 1230
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Ala Gly Tyr Phe Lys Lys Tyr Val Asp lie Phe Cys Leu Leu Glu Glu 1300 1305 1310 27
Ser Gin Asn Asn Thr Gly Leu Gly Ser Lys Phe Ser Glu Pro Leu Gin X315 1320 1325
Val Glu Arg Cys Arg Arg Asn Leu VaX Ala Leu Lys Ala Asp Lys Phe 1330 1335 1340
Ser Gly Leu Leu Glu Tyr Leu lie Lys Ser Gin Glu Asp Ala lie Ser 1345 1350 1355 1360
Thr Met Lys Cys lie Val Asn Glu Tyr Thr Phe Leu Leu Glu Gin Cys 1365 1370 1375
Thr Val Lys lie Gin Ser Lys Glu Lys Leu Asn Phe lie Leu Ala Asn 1380 1385 1390 lie lie Leu Ser Cys lie Gin Pro Thr Ser Arg Leu Val Lys Pro Val 1395 1400 1405
Glu Lys Leu Lys Asp Gin Leu Arg Glu Val Leu Gin Pro lie Gly Leu 1410 1415 1420
Thr Tyr Gin Phe Ser Glu Pro Tyr Phe Leu Ala Ser Leu Leu Phe Trp 1425 1430 1435 1440
Pro Glu Asn Gin Gin Leu Asp Gin His Ser Glu Gin Met Lya Glu Tyr 1445 1450 1455
Ala Gin Ala Leu Lys Asn Ser Phe Lys Gly Gin Tyr Lys His Met His 1460 1465 1470
Arg Thr Lys Gin Pro lie Ala Tyr Phe Phe Leu Gly Lys Gly Lys Arg 1475 1480 1485
Leu Glu Arg Leu Val His Lys Gly Lys lie Asp Gin Cys Phe Lys Lys 1490 1495 1500
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Asp lie Glu lie Val 1585 28 <2X0> 61 <211> 233 <212> PRT <213> 人 <400> 61
Met Ala Ala Thr Ser Gly Thr Asp Glu Pro Val Ser Gly Glu Leu Val 1 5 10 15
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Pro Asp lie Glu Met Ala Trp Ala Met Arg Ala Met Gin His Ala Glu 35 40 45
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Ala Ser Gly Val Ser Val Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ala 35 40 45
Ser Arg Val Ala Thr Ser Thr Asp Pro Ser Cys Ser Gly Phe Ala Pro 50 55 60
Pro Asp Phe Asn His Cys Leu Lys Asp Trp Asp Tyr Asn Gly Leu Pro 65 7〇 75 80
Val Leu Thr Thr Asn Ala He Gly Gin Trp Asp Leu Val Cys Asp Leu 85 90 95
Gly Trp Gin Val He Leu Glu Gin lie Leu Phe He Leu Gly Phe Ala 100 105 110
Ser Gly Tyr Leu Phe Leu Gly Tyr Pro Ala Asp Arg Phe Gly Arg Arg 115 120 125
Gly He Val Leu Leu Thr Leu Gly Leu Val Gly Pro Cys Gly Val Gly 130 135 140
Gly Ala Ala Ala Gly Ser Ser Thr Gly Val Met Ala Leu Arg Phe Leu 145 150 155 160
Leu Gly Phe Leu Leu Ala Gly Val Asp Leu Gly Val Tyr Leu Met Arg 165 170 175
Leu Glu Leu Cys Asp Pro Thr Gin Arg Leu Arg Val Ala Leu Ala Gly 180 185 190
Glu Leu Val Gly Val Gly Gly His Phe Leu Phe Leu Gly Leu Ala Leu 195 200 205
Val Ser Lys Asp Trp Arg Phe Leu Gin Arg Met lie Thr Ala Pro Cys 210 215 220 lie Leu Phe Leu Phe Tyr Gly Trp Pro Gly Leu Phe Leu Glu Ser Ala 225 230 235 240
Arg Trp Leu lie Val Lys Arg Gin lie Glu Glu Ala Gin Ser Val Leu 245 250 255
Arg lie Leu Ala Glu Arg Asn Arg Pro His Gly Gin Met Leu Gly Glu 260 265 270
Glu Ala Gin Glu Ala Leu Gin Asp Leu Glu Asn Thr Cys Pro Leu Pro 275 280 285
Ala Thr Ser Ser Phe Ser Phe Ala Ser Leu Leu Asn Tyr Arg Asn lie 290 295 300 30
Trp Lys Asn Leu Leu lie Leu Gly Phe Thr Asn Phe He Ala His Ala 305 310 315 320 lie Arg His Cys Tyr Gin Pro Val Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Asp 325 330 335
Phe Tyr Leu Cys Ser Leu Leu Ala Ser Gly Thr Ala Ala Leu Ala Cys 340 345 350
Val Phe Leu Gly Val Thr Val Asp Arg Phe Gly Arg Arg Gly lie Leu 355 360 365
Leu Leu Ser Met Thr Leu Thr Gly He Ala Ser Leu Val Leu Leu Gly 370 375 380
Leu Trp Asp Tyr Leu Asn Glu Ala Ala He Thr Thr Phe Ser Val Leu 385 390 395 400
Gly Leu Phe Ser Ser Gin Ala Ala Ala lie Leu Ser Thr Leu Leu Ala 40S 410 415
Ala Glu Val He Pro Thr Thr Val Arg Gly Arg Gly Leu Gly Leu lie 420 425 430
Met Ala Leu Gly Ala Leu Gly Gly Leu Ser Gly Pro Ala Gin Arg Leu 435 440 445
His Met Gly His Gly Ala Phe Leu Gin His Val Val Leu Aia Ala Cys 450 455 460
Ala Leu Leu Cys lie Leu Ser He Met Leu Leu Pro Glu Thr Lys Arg 465 470 475 480
Lys Leu Leu Pro Glu Val Leu Arg Asp Gly Glu Leu Cys Arg Arg Pro 485 490 495
Ser Leu Leu Arg Gin Pro Pro Pro Thr Arg Cys Asp His Val Pro Leu 500 505 510
Leu Ala Thr Pro Asn Pro Ala Leu 515 520
<210> 63 <211> 529 <212> PRT <213> 人 <400> 63
Met Glu Gin Glu Lys Lys Leu Leu Val Ser Asp Ser Asn Ser Phe Met 15 10 15
Glu Arg Glu Ser Leu Lye Ser Pro Phe Thr Gly Asp Thr Ser Met Asn 20 25 30
Asn Leu Glu Thr Val His His Asn Asn Ser Lys Ala Asp Lys Leu Lys 35 40 45 31 200914830
Glu Lys Pro Ser Glu Trp Ser Lys Arg His Arg Pro Gin His Tyr Lys 50 55 60
His Glu Asp Ala Lys Glu Met Pro Leu Thr Trp Val Gin Asp Glu lie 65 70 75 80
Trp Cys His Asp Ser Tyr Glu Ser Asp Gly Lys Ser Glu Asn Trp Gly 85 90 95
Asn Phe lie Ala Lys Glu Glu Glu Lys Pro Asn His Gin Glu Trp Asp 100 105 110
Ser Gly Glu His Thr Asn Ala Cys Val Gin Gin Asn Ser Ser Phe Val 1XS 120 125
Asp Arg Pro Tyr Lys Cys Ser Glu Cys Trp Lys Ser Phe Ser Asn Ser 130 135 140
Ser His Leu Arg Thr His Gin Arg Thr His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr 145 150 155 160
Lys Cys Ser Glu Cys Ala Lys Cys Phe Cys Asn Ser Ser His Leu He 165 170 175
Gin His Leu Arg Met His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gin Cys Gly Glu 180 165 190
Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asn Thr Ser His Leu lie lie His Glu Arg 195 200 205
Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Arg 210 215 220
Phe Ser Ser Ser Ser His Leu He Gin His His Arg Ser His Thr Gly 225 230 235 240
Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Val Cys Gly Lys Gly Phe Ser His Ser
245 250 25S
Tyr Val Leu He Glu His Gin Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr 260 265 270
Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gin Ser Ser Ser Leu lie 275 280 285
Arg His Gin Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Leu Glu 290 295 300
Cys Glu Lys Ser Phe Gly Cys Asn Ser Thr Leu lie Lye His Gin Arg 305 310 31S 320 lie His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gin Cys Pro Glu Cys Gly Lys Asn 325 330 335
Phe Ser Arg Ser Ser Asn Leu lie Thr His Gin Lys Met His Thr Gly 340 345 350 32
Glu Lys Ser Tyr Glu Ser Ser Glu Tyr Glu Glu Ser Leu Gly Gin Asn 355 360 365
Cys Asn Val lie Glu Glu Cys Arg lie Gin Leu Gly Glu Lys Pro Tyr 370 375 3Θ0
Arg Cys Cys Glu Cys Gly Lys Ser Phe Gly Leu Ser Ser His Leu He 385 390 395 400
Arg His Gin Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Arg Cys Ser Glu 405 410 415
Cys Trp Lys Thr Phe Ser Gin Ser Ser Thr Leu Val lie His Gin Arg 420 425 430
Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Glu Ser 435 440 445
Phe Ser Gin Ser phe Asn Leu lie Arg His Arg Arg Thr His He Gly 450 455 460
Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Thr Ser Cys Glu Lys Cys Phe Ser Arg lie 465 470 475 480
Ala Tyr Leu Ser Gin His Arg Lys He His Val Glu Lys Pro Phe Glu 485 490 495
Ser Pro Asp Val Gly Asp Phe Pro His Glu Trp Thr Trp Lys Asn Cys 500 505 510
Ser Gly Glu Met Pro Phe lie Ser Ser Phe Ser Val Ser Asn Ser Ser 515 520 525
Ser <21〇> 64 <211> 1390 <212> PRT <213> 人 <40〇> 64
Met Val Val Leu Arg Ser Ser Leu Glu Leu His Asn His Ser Ala Ala 1 5 10 15
Ser Ala Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ser Asp Phe Leu Ser Leu Glu 20 25 30
His He Gly Arg Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Ala Ala Gin Lys Lys 35 40 45
Pro Ala Ala Thr Thr Ala Lys Ala Gly Asp Gly Ser Ser Val Lys Glu 50 5S 60
Val Glu Thr Tyr His Arg Thr Arg Ala Leu Arg Ser Leu Arg Lys Asp 55 70 75 80 33 200914830
Ala Gin Asn Ser Ser Asp Ser Ser Phe Glu Lys Asn Val Glu lie Thr 85 90 95
Glu Gin Leu Ala Asn Gly Arg His Phe Thr Arg Gin Leu Ala Arg Gin 100 105 110
Gin Ala Asp Juys Lys Lys Glu Glu His Arg Glu Asp Lys Val He Pro 115 120 125
Val Thr Arg Ser I»eu Arg Ala Arg Asn lie Val Gin Ser Thr Glu His X30 135 140
Leu His Glu Asp Asn Gly Asp Val Glu Val Arg Arg Ser Cys Arg lie 145 150 155 160
Arg Ser Arg Tyr Ser Gly Val Asn Gin Ser Met Leu Phe Asp Lys Leu 165 170 175
He Thr Asn Thr Ala Glu Ala Val Leu Gin Lys Met Asp Asp Met Ly3 180 1Θ5 190
Lys Met Arg Arg Gin Arg Met Arg Glu Leu Glu Asp Leu Gly Val Phe 195 200 205
Asn Glu Thr Glu Glu Ser Asn Leu Asn Met Tyr Thr Arg Gly Lys Gin 210 215 220
Lys Asp lie Gin Arg Thr Asp Glu Glu Thr Thr Asp Asn Gin Glu Gly 225 230 235 240
Ser Val Glu Ser Ser Glu Glu Gly Glu Asp Gin Glu His Glu Asp Asp 245 250 255
Gly Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 260 265 270
Asp Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Glu Glu 275 280 285
Glu Asn Gin Lys Arg Tyr Tyr Leu Arg Gin Arg Lys Ala Thr Val Tyr 290 295 300
Tyr Gin Ala Pro Leu Glu Lys Pro Arg His Gin Arg Lys Pro Asn He 305 310 315 320
Phe Tyr Ser Gly* Pro Ala Ser Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Arg Leu Ser 325 330 335
Ser Ala Gly Pro Arg Ser Pro Tyr Cys Lys Arg Met Asn Arg Arg Arg 340 345 350
His Ala He His Ser Ser Asp Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp 355 360 36S
Glu Gin His Phe Glu Arg Arg Arg Lys Arg Ser Arg Asn Arg Ala He 370 375 380 34 34200914830
Asn Arg Cys Leu Pro Leu Asn Phe Arg Lys Asp Glu Leu Lys Gly lie 385 390 395 400
Tyr Lys Asp Arg Met Lys lie Gly Ala Ser Leu Ala Asp Val Asp Pro 405 410 415
Met Gin Leu Asp Ser Ser Val Arg Phe Asp Ser Val Gly Gly Leu Ser 420 425 430
Asn His lie Ala Ala Leu Lys Glu Met Val Val Phe Pro Leu Leu Tyr 435 440 445
Pro Glu Val Phe Glu Lys Phe Lys He Gin Pro Pro Arg Gly Cys Leu 450 455 460
Phe Tyr Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Val Ala Arg Ala Leu 465 470 475 480
Ala Asn Glu Cys Ser Gin Gly Asp Lys Arg Val Ala Phe Phe Met Arg 485 490 495
Lys Gly Ala Asp Cys Leu Ser Lys Trp Val Gly Glu Ser Glu Arg Gin 500 505 510
Leu Arg Leu Leu Phe Asp Gin Ala Tyr Gin Met Arg Pro Ser lie lie 515 520 525
Phe Phe Asp Glu lie Asp Gly Leu Ala Pro Val Arg Ser Ser Arg Gin 530 535 540
Asp Gin lie His Ser Ser lie Val Ser Thr Leu Leu Ala Leu Met Asp 545 550 555 560
Gly Leu Asp Ser Arg Gly Glu lie Val Val lie Gly Ala Thr Asn Arg 565 570 575
Leu Asp Ser lie Asp Pro Ala Leu Arg Arg Pro Gly Arg Phe Asp Arg 580 585 590
Glu Phe Leu Phe Ser Leu Pro Asp Lys Glu Ala Arg Lys Glu lie Leu 595 600 605
Lys He His Thr Arg Asp Trp Asn Pro Lys Pro Leu Asp Thr Phe Leu 610 615 620
Glu Glu Leu Ala Glu Asn Cys Val Gly Tyr Cys Gly Ala Asp lie Lys 625 630 635 640
Ser He Cys Ala Glu Ala Ala Leu Cys Ala Leu Arg Arg Arg Tyr Pro 645 650 655
Gin lie Tyr Thr Thr Ser Glu Lys Leu Gin Leu Asp Leu Ser Ser lie 660 665 670
Asn lie Ser Ala Lys Asp Phe Glu Val Ala Met Gin Lys Met lie Pro 675 6Θ0 685 35 35200914830
Ala Ser Gin Arg Ala Val Thr Ser Pro Gly Gin Ala Leu Ser Thr Val 690 695 700
Val Lys Pro Leu Leu Gin Asn Thr Val Asp Lys He Leu Glu Ala Leu 705 710 715 720 GXn Arg Val Phe Pro His Ala Glu Phe Arg Thr Asn Lys Thr Leu Asp 725 730 735
Ser Asp lie Ser Cys Pro Leu Leu Glu Ser Asp Leu Ala Tyr Ser Asp 740 745 750
Asp Asp Val Pro Ser Val Tyr Glu Asn Gly Leu Ser Gin Lys Ser Ser 755 760 765
His Lys Ala Lys Asp Asn Phe Asn Phe Leu His Leu Asn Arg Asn Ala 770 775 780
Cys Tyx Gin Pro Met Ser Phe Arg Pro Arg lie Leu lie Val Gly Glu 785 790 795 800
Pro Gly Phe Gly Gin Gly Ser His Leu Ala Pro Ala Val 11¾ His Ala 805 810 815
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Val Ser Thr Thr Ser Pro Glu Glu Thr Cys Ala Gin Val lie Arg Glu 835 840 845
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Leu Gin Asn He Pro Ser Phe Ala Pro Val Leu Leu Leu Ala Thr Ser 885 890 895
Asp Lys Pro His Ser Ala Leu Pro Glu Glu Val Gin Glu Leu Phe lie 900 905 9X0
Arg Asp Tyr Gly Glu lie Phe Asn Val Gin Leu Pro Asp Lys Glu Glu 915 920 925
Arg Thr Lys Phe Phe Glu Asp Leu lie Leu Lys Gin Ala Ala Lys Pro 930 935 940
Pro lie Ser Lys Lys Lys Ala Val Leu Gin Ala Leu Glu Val Leu Pro 945 950 955 960
Val Ala Pro Pro Pro Glu Pro Arg Ser Leu Thr Ala Glu Glu Val Lys 965 970 975
Arg Leu Glu Glu Gin Glu Glu Asp Thr Phe Arg Glu Leu Arg lie Phe 980 985 990 36
Leu Arg Asn Val Thr His Arg Leu Ala lie Asp Lys Arg Phe Arg Val 995 1000 1005
Phe Thr Lys Pro Val Asp Pro Asp Glu Val Pro Asp Tyr Val Thr Val 1010 1015 1020 lie Lys Gin Pro Met Asp Leu Ser Ser Val He Ser Lys lie Asp Leu 1025 1030 1035 1040
His Lys Tyr Leu Thr Val Lys Asp Tyr Leu Arg Asp He Asp Leu lie 1045 1050 1055
Cys Ser Asn Ala Leu Glu Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Pro Gly Asp Arg 1060 1065 1070
Leu 工le Arg His Arg Ala Cys Ala Leu Arg Asp Thr Ala Tyr Ala lie 107S 1080 1085 lie Lys Glu Glu Leu Asp Glu Asp Phe Glu Gin Leu Cys Glu Glu lie 1090 1095 1100
Gin Glu Ser Arg Lys Lys Arg Gly Cys Ser Ser Ser Lys Tyr Ala Pro 1105 1110 1115 1120
Ser Tyr Tyr His Val Met Pro Lya Gin Asn Ser Thr Leu Val Gly Asp 1125 1130 1135
Lys Arg Ser Asp Pro Glu Gin Asn Glu Lys Leu Lys Thr Pro Ser Thr 1140 1145 1150
Pro Val Ala Cys Ser Thr Pro Ala Gin Leu Lys Arg Lys He Arg Lys 1155 1160 1165
Lys Ser Asn Trp Tyr Leu Gly Thr lie Lys Lys Arg Arg Lys He Ser 1170 1175 1180
Gin Ala Lys Asp Asp Ser Gin Asn Ala lie Asp His Lys lie Glu Ser 1185 1190 1195 1200
Asp Thr Glu Glu Thr Gin Asp Thr Ser Val Asp His Asn Glu Thr Gly 1205 1210 1215
Asn Thr Gly Glu Ser Ser Val Glu Glu Asn Glu Lys Gin Gin Asn Ala 1220 1225 1230
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Glu Asn Glu Leu Glu Asp Ser Arg Lys Thr Thr Ala Cys Thr Glu Leu 1250 1255 1260
Arg Asp Lys lie Ala Cys Asn Gly Asp Ala Ser Ser Ser Gin lie lie 1265 1270 1275 1280
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Thr Arg Ala Arg Arg Ser Gin Val Glu Gin Gin Gin Leu He Thr Val 1300 1305 1310
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Asp His Glu Arg Leu Lys Asn Leu Leu Lys Thr Val Val Lys Lys Ser 1330 1335 1340
Gin Asn Tyr Asn lie Phe Gin Leu Glu Asn Leu Tyr Ala Val lie Ser 1345 1350 1355 1360
Gin Cys lie Tyr Arg His Arg Lys Asp His Asp Lys Thr Ser Leu He 1365 1370 1375
Gin Lys Met Glu Gin Glu Val Glu Aen Phe Ser Cys Ser Arg 1380 1385 1390
<210> SS <211> 309 <212> PRT <213> 人 <400> 65
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Arg Asp Arg Lys Asn Leu Cys Arg Ala lie Asn Asp Phe Gin Gin Ser 20 25 30
Phe Gin Lys Pro Glu Thr Arg Arg Glu Phe Asp Leu Ser Asp Pro Leu 35 40 45
Ala Leu Lys Lys Asp Leu Pro Ala Arg Gin Ser Asp Asn Asp Val Arg 50 55 60
Asn Thr He Sear Gly Met Gin Lys Phe Met Gly Glu Asp Leu Asn Phe 65 70 75 80
His Glu Arg Lys Lys Phe Gin Glu Glu Gin Asn Arg Glu Trp Ser Leu 85 90 95
Gin Gin Gin Arg Glu Trp Lys Asn Ala Arg Ala Glu Gin Lys Cys Ala 100 105 110
Glu Ala Leu Tyr Thr Glu Thr Arg Leu Gin Phe Asp Glu Thr Ala Lys 115 120 X25
His Leu Gin Lys Leu Glu Ser Thr Thr Arg Lys Ala Val Cys Ala Ser 130 135 140
Val Lys Asp Phe Asn Lys Ser Gin Ala lie Glu Ser Val Glu Arg Lys 145 150 155 160
Lys Gin Glu Lys Lys Gin Glu Gin Glu Asp Asn Leu Ala Glu lie Thr 165 170 175 38
Asn Leu Leu Arg Gly Asp Leu Leu Ser Glu Asn Pro Gin Gin Ala Ala 180 185 190
Ser Ser Phe Gly Pro His Arg Val Val Pro Asp Arg Trp Lys Gly Met 195 200 205
Thr Gin Glu Gin Leu Glu Gin He Arg Leu Val Gin Lys Gin Gin He 210 215 220
Gin Glu Lys Leu Arg Leu Gin Glu Glu Lys Arg Gin Arg Asp Leu Asp 225 230 235 240
Trp Asp Arg Arg Arg He Gin Gly Ala Arg Ala Thr Leu Leu Phe Glu 245 250 255
Arg Gin Gin Trp Arg Arg Gin Arg Asp Leu Arg Arg Ala Leu Asp Ser 260 265 270
Ser Asn Leu Ser Leu Ala Lys Glu Gin His Leu Gin Lys Lys Tyr Met 275 280 285
Asn Glu Val Tyr Thr Asn Gin Pro Thr Gly Asp Tyr Phe Thr Gin Phe 290 295 300
Asn Thr Gly Ser Arg 305
<210> 66 <211> 605 <212> PRT <213> 人 <400> 66
Met Val Glu Gly Pro Gly Cys Thr Leu Asn Gly Glu Lys He Arg Ala 15 10 15
Arg Val Leu Pro Gly Gin Ala Val Thr Gly Val Arg Gly Ser Ala Leu 20 25 30
Arg Ser Pro Gin Gly Arg Ala Leu Arg Leu Ala Ala Ser Thr Val Val 35 40 45
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Gly Met Lys Gly Phe He Met He Asn Pro Leu Glu Tyr Lys Tyr Lys 100 105 110
Asn Gly Ala Ser Pro Val Leu Glu Val Gin Leu Thr Lys Asp Leu tie 115 120 125 39 200914830
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Leu Gly Asp Val Leu Met Asp Gin Asn Val Leu Pro Gly Val Gly Asn 180 185 190 lie lie Lys Asn C3lu Ala Leu Phe Asp Ser Gly Leu His 195 200 205 Pro Ala Val
Lys Val Cys Gin Leu Thr Asp Glu Gin lie His His Leu Met Lys Met 210 215 220 lie Arg Asp Phe Ser lie Leu Phe Tyr Arg Cys Arg Lys Ala Gly Leu 225 230 235 240
Ala Leu Ser Lys His Tyr Lys Val Tyr Lys Arg Pro Asn 245 250 Cys Gly Gin 255 Cys His Cys Arg He Thr Val Cys Arg Phe Gly Asp Asn 260 265 Asn Arg Met 270 Thr Tyr Phe Cys Pro His Cys Gin Lys Glu Asn Pro Gin 275 280 285 His Val Asp lie Cys Lys Leu Pro Thr Arg Asn Thr He He Ser Trp 290 295 300 Thr Ser Ser Arg Val Asp His Val Met Asp Ser Val Ala Arg Lys Ser 305 310 315 Glu Glu His 320 Trp Thr Cys Val Val Cys Thr Leu He Asn Lys Pro Ser 325 330 Ser Lys Ala 335 Cys Asp Ala Cys Leu Thr Ser Arg Pro He Asp Ser Val 340 345 Leu Lys Ser 350 Glu Glu Asn Ser Thr Val Phe Ser His Leu Met Lys Tyr 355 360 365 Pro Cys Asn Thr Phe Giy Lys Pro His Thr Giu Val Lys lie Asn Arg 370 375 380 Lys Thr Ala Phe Gly Thr Thr Thr Leu Val Leu Thr Asp Phe Ser Asn 385 390 395 Lys Ser Ser 400
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Asn Pro Gly Tyr Ser Asn Ser Glu Leu Gin lie Asn Met Thr Asp Gly 485 490 495
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Phe Val Cys Pro Leu Gly Lys Glu Lys Gin Cys Asn Phe Phe Gin Trp 580 585 590
Ala Glu Asn Gly Pro Gly He Lys lie lie Pro Gly Cys 595 600 605 <210> 67 <211> 207 <212> PRT <213> ' 人 <400> 67
Met Ser Glu Ala Val Arg Val Pro Ser Pro Ala Thr Pro Leu Val Val 15 10 IS
Ala Ala Ala Ala Pro Glu Glu Arg Lys Gly Lys Glu Ser Glu Arg Glu 20 25 30
Lys Leu Pro Pro He Val Ser Ala Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Leu 35 40 45
Asp Arg Gly Ala Lys Gly Gin lie Ser Thr Phe Ser Ser Phe He Ser 50 55 60
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Arg Cys Cys Gin Ser Trp Ala Gly Gin Pro Gly Arg Arg Gly Gly Arg 20 25 30
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65 70 75 80
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Cys Pro Ser Ser Pro Ala Ala Ser Leu Asp 145 150 42 42 69 234 PRT 人 <210> <211> <212> <213> <400> 69
Met Ser Val Lys Glu Gly Ala Gin Arg Lys Trp Ala Ala Leu Lys Glu 15 10 15
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Ala Asp Pro Glu Leu Cys lie Arg Leu Leu Gin Met Pro Ser Val Val 35 40 45
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Met Val Gin Phe Leu Glu Gin Ser Gly Leu Asp Leu Leu Leu Glu Ala 65 70 75 80
Leu Ala Arg Leu Ser Gly Arg Gly Val Ala Arg He Ser Asp Ala Leu 85 90 95
Leu Gin Leu Thr Cys Val Ser Cys Val Arg Ala Val Met Asn Ser Arg 100 105 110
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Ser Gin Ala Leu Asp Thr Ser Asn Val Met Val Ly曰 Lys Gin Vai Phe 130 135 140
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Gin Leu Leu Asp Val Leu Ala Arg Leu Arg 225 230
<210> 70 <211> 898 <212> PRT <213> 人 43 43 Cys His His Met Lys Val Val Val 10 15 Glu Lys Ala Ala Gly Phe His Lys 25 30 工le Leu Val Phe Asp Pro Lys Gin 45 Lys Lys Thr Thr Asn Gin Asn Val 60 Lys Phe Val Phe Asp Ala Val Phe 75 80 Val Phe Glu His Thr Thr Lys Pro 90 95 Tyr Asn Cys Thr Val Leu Ala Tyr 105 110 His Thr Met Leu Gly Ser Ala Asp 125 Met Leu His Leu Tyr Lys Cys Met 140 Cys Ser Thr Ala Val Ser Tyr Leu 155 160 Asp Leu Leu Val Asn Ser Gly Pro 170 175 Lys Gly Val Val Val His Gly Leu 185 190 Glu Glu lie Leu His Leu Leu Asp 205 His Pro Thr Asp Met Asn Ala Thr 220 Gin lie Tyr Leu Arg Gin Gin Asp 235 240 Val Arg lie Ala Lys Met Ser Leu 250 255 Ala Ser Thr Ser Gly Ala Lys Gly 265 270 lie Asn Arg Ser Leu Leu Ala Leu 285 Asp Ser Lys Arg Lys Asn Gin His 300
\ / 200914830 <400> 70
Met Ser Val Thr Glu Glu Asp Leu 1 5
Arg Val Arg Pro Glu Asn Thr Lys 20
Val Val His Val Val Asp Lys His 35 40
Glu Glu Val Ser Phe Phe His Gly 50 55 lie Lys Lys Gin Asn Lys Asp Leu 65 7〇
Asp Glu Thr Ser Thr Gin Ser Glu 85 lie Leu Arg Ser.Phe Leu Asn Gly 100
Gly Ala Thr Gly Ala Gly Lys Thr 115 120
Glu Pro Gly Val Met Tyr Leu Thr 130 135
Asp Glu lie Lys Glu Glu Lys lie 145 150
Glu Val Tyr Asn Glu Gin lie Arg 165
Leu Ala Val Arg Glu Asp Thr Gin 180
Thr Leu His Gin Pro Lys Ser Ser 195 200
Asn Gly Asn Lys Asn Arg Thr Gin 210 215
Ser Ser Arg Ser His Ala Val Phe 225 230
Lys Thr Ala Ser He Asn Gin Asn 245 lie Asp Leu Ala Gly Ser Glu Arg 260
Thr Arg Phe Val Glu Gly Thr Asn 275 280
Gly Asn Val lie Asn Ala Leu Ala 290 295 44 200914830 lie Pro Tyr Arg Asn Ser Lys Leu Thr Arg Leu Leu Lys Asp Ser Leu 305 310 315 320
Gly Gly Asn Cys Gin Thr lie Met lie Ala Ala Val Ser Pro Ser Ser 325 330 335
Val Phe Tyr Asp Asp Thr Tyr Asn Thr Leu Lys Tyr Ala Asn Arg Ala 34Θ 345 350
Lys Asp lie Lys Ser Ser Leu Lys Ser Asn Val Leu Asn Val Asn Asn 355 360 365
His lie Thr Gin Tyr Val Lys lie Cys Asn Glu Gin Lys Ala Glu lie 370 375 380
Leu Leu Leu Lys Glu Lys Leu Lys Ala Tyr Glu Glu Gin Lys Ala Phe
./ 385 390 395 400
Thr Asn Glu Asn Asp Gin Ala Lys Leu Met lie Ser Asn Pro Gin Glu 405 410 415
Lys Glu lie Glu Arg Phe Gin Glu lie Leu Asn Cys Leu Phe Gin Asn 420 425 430
Arg Glu Glu lie Arg Gin Glu Tyr Leu Lys Leu Glu Met Leu Leu Lys 435 440 445
Glu Asn Glu Leu Lys Ser Phe Tyr Gin Gin Gin Cys His Lys Gin He 450 455 460
Glu Met Met Cys Ser Glu Asp Lys Val Glu Lys Ala Thr Gly hya Arg 465 470 475 480
Asp His Arg Leu Ala Met Leu Lys Thr Arg Arg Ser Tyr Leu Glu Lys 485 490 495
Arg Arg Glu Glu Glu Leu Lye Gin Phe Asp Glu Asn Thr Asn Trp Leu 500 505 510
His Arg Val Glu Lys Glu Met Gly Leu Leu Ser Gin Asn Gly His lie 515 520 525
Pro Lys Glu Leu Lys Lys Asp Leu His Cys His His Leu His Leu Gin 530 535 540
Asn lys Asp Leu Lys Ala Gin lie Arg His Met Met Asp Leu Ala Cys 545 550 555 560
Leu Gin Glu Gin Gin His Arg Gin Thr Glu Ala Val Leu Asn Ala Leu 565 570 575
Leu Pro Thr Leu Arg Lys Gin Tyr Cys Thr Leu Lys Glu Ala Gly Leu 5B0 585 590
Ser Asn Ala Ala Phe Glu Ser Asp Phe Lys Glu lie Glu His beu Val 595 600 605 45 45200914830
Glu Arg Lys Lys Val Val Val Trp Ala Asp Gin Thr Gly Glu Gin Pro 610 615 620
Lys Gin Asn Asp Leu Pro Gly He Ser Val Leu Met Thr Phe Ser Gin 625 630 635 640
Leu Gly Pro Val Gin Pro lie Pro Cys Cys Ser Ser Ser Gly Gly Thr 645 650 655
Asn Leu Val Lys lie Pro Thr Glu Lys Arg Thr Arg Arg Lys Leu Met 660 665 670
Pro Ser Pro Leu Lys Gly Gin His Thr Leu Lys Ser Pro Pro Ser Gin 675 660 685
Ser Val Gin Leu Asn Asp Ser Leu Ser Lys Glu Leu Gin Pro lie Val 690 695 700
Tyr Thr Pro Glu Asp Cys Arg Lys Ala Phe Gin Asn Pro Ser Thr Val 705 710 715 720
Thr Leu Met Lys Pro Ser Ser Phe Thr Thr Ser Phe Gin Ala lie Ser 725 730 735
Ser Asn lie Asn Ser Asp Asn Cys Leu Lys Met Leu Cys Glu Val Ala 740 745 750 lie Pro His Asn Arg Arg Lye Glu Cys Gly Gin Glu Asp Leu Asp Ser 755 760 765
Thr Phe Thr lie Cys Glu Asp He Lys Ser Ser Lys Cys Lys Leu Pro 770 775 780
Glu Gin Glu Ser Leu Pro Asn Asp Asn Lys Asp He Leu Gin Arg Leu 785 790 795 800
Asp Pro Ser Ser Phe Ser Thr Lys His Ser Met Pro Val Pro Ser Met 805 810 815
Val Pro Ser Tyr Met Ala Met Thr Thr Ala Ala Lys Arg Lys Arg Lys 820 825 830
Leu Thr Ser Ser Thr Ser Asn Ser Ser Leu Thr Ala Asp Val Asn Ser Θ35 840 845
Gly Phe Ala Lys Arg Val Arg Gin Asp Asn Ser Ser Glu Lys His Leu 850 855 860
Gin Glu Asn Lys Pro Thr Met Glu His Lys Arg Asn lie Cys Lys lie 665 870 Θ75 880
Asn Pro Ser Met Val Arg Lys Phe Gly Arg Asn lie Ser Lys Gly Asn 885 890 895
Leu Arg 47 47200914830
Val Gin Leu Ala Phe Lys Val Phe Gly Phe Lys Pro Pro lie Pro VaX 275 280 285
Pro Glu Gin Lys Asp Pro Asp Pro Asp Phe Ser Thr Val Lys Cys Pro 290 295 300
Asn Pro Glu Glu Gly Glu Ser Val Leu Glu Leu Ser Leu Arg Leu Ala 305 310 315 320
Glu Lys Glu Asn Ala Arg Val Val Leu Ala Thr Asp Pro Asp Ala Asp 325 330 335
Arg Leu Ala Ala Ala Glu Leu Gin Glu Asn Gly Cys Trp Lys Val Phe 340 345 350
Thr Gly Asn Glu Leu Ala Ala Leu Phe Gly Trp Trp Met Phe Asp Cys 355 360 365
Trp Lys Lys Asn Lys Ser Arg Asn Ala Asp Val Lys Asn Val Tyr Met 370 375 380
Leu Ala Thr Thr Val Ser Ser Lys He Leu Lys Ala He AXa Leu Lys 385 390 395 400
Glu GXy Phe His Phe Glu Glu Thr Leu Pro Gly Phe Lys Trp lie Gly 405 410 415
Ser Arg He He Asp Leu Leu Glu Asn Gly Lys Glu Val Leu Phe Ala 420 425 430
Phe Glu Glu Ser He Gly Phe beu Cys GXy Thr Ser Val Leu Asp Lys 435 440 445
Asp Gly Val Ser Ala Ala Val Val Val Ala Glu Met Ala Ser Tyr Leu 450 455 460
Glu Thr Met Asn lie Thr Leu Lys Gin Gin Leu Val Lys Val Tyr Glu 465 470 475 480
Lys Tyr Gly Tyr His lie Ser Lys Thr Ser Tyr Phe Leu Cys Tyr Glu 4Θ5 490 495
Pro Pro Thr lie Lys Ser lie Phe Glu Arg Leu Arg Asn Phe Asp Ser 500 505 510
Pro Lys Glu Tyr Pro Lys Phe Cys Gly Thr Phe Ala lie Leu His Val 515 520 525
Arg Asp Val Thr Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Gin Pro Asn Lys Lys Ser 530 535 540
Val Leu Pro Val Ser Lys Asn Ser Gin Met lie Thr Phe Thr Phe Gin 545 550 555 560
Asn Gly Cys Val Ala Thr Leu Arg Thr Ser Gly Thr Glu Pro Lys He 565 570 575 46 <210> 71 <211> 622 <212> PRT <213> 人 <400> 71
Met Ala Glu Asn Thr Glu Gly Asp Leu Asn Ser Asn Leu Leu His Ala IS 10 15
Pro Tyr His Thr Gly Asp Pro Gin Leu Asp Thr Ala He Gly Gin Trp 20 25 30
Leu Arg Trp Asp Lys Asn Pro Lys Thr Lys Glu Gin lie Glu Asn Leu 35 40 45
Leu Arg Asn Gly Met Asn Lys Glu Leu Arg Asp Arg Leu Cys Cys Arg 50 55 60
Met Thr Phe Gly Thr Ala Gly Leu Arg Ser Ala Met Gly Ala Gly Phe 65 70 75 80
Cys Tyr lie Asn Asp Leu Thr Val lie Gin Ser Thr Gin Gly Met Tyr 85 90 95
Lys Tyr Leu Glu Arg Cys Phe Ser Asp Phe Lys Gin Arg Gly Phe Val 100 105 1X0
Val Gly Tyr Asp Thr Arg Gly Gin Val Thr Ser Ser Cys Ser Ser Gin 115 120 125
Arg Leu Ala Lys Leu Thr Ala Ala Val Leu Leu Ala Lys Asp Val Pro 130 135 140
Val Tyr Leu Phe Ser Arg Tyr Val Pro Thr Pro Phe Val Pro Tyr Ala 145 150 155 160
Val Gin Lys Leu Lys Ala Val Ala Gly Val Met lie Thr Ala Ser His 165 170 175
Asn Arg Lys Glu Asp Asn Gly Tyr Lys Val Tyr Trp Glu Thr Gly Ala 180 185 190
Gin lie Thr Ser Pro His Asp Lys Glu lie Leu Lys Cys lie Glu Glu 195 200 205
Cys Val Glu Pro Trp Asn Gly Ser Trp Asn Asp Asn Leu Val Asp Thr 210 215 220
Ser Pro Leu Lys Arg Asp Pro Leu Gin Asp lie Cys Arg Arg Tyr Met 225 230 235 240
Glu Asp Leu Lys Lys lie Cys Phe Tyr Arg Glu Leu Asn Ser Lys Thr 245 2S0 255
Thr Leu Lys Phe Val His Thr Ser Phe His Gly Val Gly His Asp Tyr 260 265 270 48200914830
Lys Tyr Tyr Ala Glu Met Cys Ala Ser Pro Asp Gin Ser Asp Thr Ala 580 585 590
Leu Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Leu lie Asp Ala Leu lie Glu Asn 595 600 605
Phe Leu Gin Pro Ser Lys Asn Gly Leu lie Trp Arg Ser Val 610 615 620 <210> 72 <211> 240 <212> PRT c2…人 <400> 72
Met Gin Cys Phe Ser Phe He Lys 1 5
Leu He Phe Leu Cys Gly Ala Ala 20
Ser He Asp Gly Ala Ser Phe Leu 35 40
Ser Ala Met Gin Phe Val Asn Val 50 55
Val Val Val Phe Ala Leu Gly Phe €5 70
Glu Ser Lys Cys Ala Leu Val Thr 85
Phe lie Ala Glu Val Ala Ala Ala 100
Met Ala Glu His Phe Leu Thr Leu 115 120
C
Thr Met Met lie Leu Phe Asn Leu 10 15 Leu Leu Ala Val Gly lie Trp Val 25 30 Lys lie Phe Gly Pro Leu Ser Ser 45 Gly Tyr Phe Leu lie Ala Ala Gly 60 Leu Gly Cys Tyr Gly Ala Lys Thr 75 80 Phe Phe Phe lie Leu Leu Leu lie 90 95 Val Val Ala Leu Val Tyr Thr Thr 105 110 Leu Val Val Pro Ala lie Lys Lys 125 Thr Gin Val Trp Asn Thr Thr Met 140 Thr Asn Tyr Thr Asp Phe Glu Asp 155 160 Ala Phe Pro Pro Phe Cys Cys Asn 170 175 Glu Thr Cys Thr Lys Gin Lys Ala 185 190 Phe Asn Gin Leu Leu Tyr Asp lie 205 Gly Val Ala Ala Gly He Gly Gly 220
Asp Tyr Gly Ser Gin Glu Asp Phe 130 135
Lys Gly Leu Lys Cys Cys Gly Phe 145 ISO
Ser Pro Tyr Phe Lys Glu Asn Ser 165
Asp Asn Val Thr Asn Thr Ala Asn 180
His Asp Gin Lys Val Glu Gly Cys 195 200
Arg Thr Asn Ala Val Thr Val Gly 210 215 49200914830
Leu Glu Leu Ala Ala Met lie Val 225 230
Ser Met Tyr Leu Tyr Cys Asn Leu 235 240
<210> 73 <211> 1129 <212> PRT <213> . 人 <40D> 73
Met Pro Ala Thr Arg Lys Pro Met 1 5
Thr Glu Val Cys Phe Asp Asp Ser 20
Ser Asp Gly Asp Val Arg lie Trp 35 40
Lys Phe He Asn Val Gly Glu Lys 50 55
Gly Lys Leu Val Thr Ala Val Ser 65 70
Phe Pro Glu Gly Val Pro Asp Gly 65
Ala Asn His Val Val Phe Asn Gly 100
Ser Ser Asp Phe Leu Val Lys lie 115 120
Gin Lys Thr Phe Arg Gly His Asp 130 135
Asp Pro Lys Asp lie Phe Leu Ala X45 150
Arg Val Trp Gin lie Ser Asp Gin 165
Leu Gin Lys Cys Asn Asp Val lie 180
Ala Trp Gin Pro Lys Ser Gly Lys 195 200
Ser Val Lys Leu Tyr Arg Arg Glu 210 215
Ser Asp Asn Phe He Ser Gin Thr 225 230
Arg Tyr Gly His Thr Glu Gly His 10 15
Gly Ser Phe lie Val Thr Cys Gly 25 30
Glu Asp Leu Asp Asp Asp Asp Pro 45
Ala Tyr Ser Cys Ala Leu Lys Ser 60
Asn Asn Thr lie Gin Val His Thr 75 80 lie Leu Thr Arg Phe Thr Thr Asn 90 95
Asp Gly Thr Lys lie Ala Ala Gly 105 110
Val Asp Val Met Asp Ser Ser Gin 125
Ala Pro Val Leu Ser Leu Ser Phe 140
Ser Ala Ser Cys Asp Gly Ser Val 155 160
Thr Cys Ala lie Ser Trp Pro Leu 170 175
Asn Ala Lys Ser lie Cys Arg Leu 185 190
Leu Leu Ala He Pro Val Glu Lys 205
Ser Trp Ser His Gin Phe Asp Leu 220
Leu Asn lie Val Thr Trp Ser Pro 235 240 50 50 Ser lie Asn Gly Leu lie lie Val 250 255 Met Glu Arg Val Lys His Glu Lys 265 270 Trp His Pro Thr Cys Gly Arg lie 285 Leu Gly Leu Leu Glu Asn Val Cys 300 Ser Lys Val Ser Ser Arg Val Glu 315 320 Gly Asp Asp Met Ser Asn Ala Gly 330 335 Glu lie Pro Ser Phe Ser Lys Gly 345 350 Glu Asp Leu Met Met Ala Ser Gly 365 Leu Glu Asp Asp Glu Άβπ Ser Val 380 Ser Ser Leu Leu Lys Glu Glu Glu 395 400 His Asn Leu Pro Leu Val Thr Ser 410 415 Met Pro Thr Pro Arg Gin Lys Pro 425 430 His Leu Thr His Arg Phe Met Val 445 Cys Tyr Asn Asp Glu Gin Asp Asn 460 Thr Ser lie His His Ala Thr His 475 480 lie Ala Asp Leu Ser His Glu Ala 490 495 Asp Glu Leu Ala Ser Lys Leu His 505 510 Ser Ser Lys Glu Trp lie lie Asp 525 Ala lie Cys Leu Gly Gin Gly Trp 540
200914830
Cys Gly Gin Tyr Leu Ala Ala Gly 245
Trp Asn Val Glu Thr Lys Asp Cys 260
Gly Tyr Ala lie Cys Gly Leu Ala 275 280
Ser Tyr Thr Asp Ala Glu Gly Asn 290 295
Asp Pro Ser Gly Lys Thr Ser Ser 305 310
Lys Asp Tyr Asn Asp Leu Phe Asp 325
Asp Phe Leu Asn Asp Asn Ala Val 340
He He Asn Asp Asp Glu Asp Άβρ 355 360
Arg Pro Arg Gin Arg Ser His lie 370 375
Asp lie Ser Met Leu Lys Thr Gly 385 390
Glu Asp Gly Gin Glu Gly Ser lie • 405 .
Gin Arg Pro Phe Tyr Asp Gly Pro 420
Phe Gin Ser Gly Ser Thr Pro Leu 435 440
Trp Asn Ser lie Gly lie lie Arg 450 455
Ala lie Asp Val Glu Phe His Asp 465 470
Leu Ser Asn Thr Leu Asn Tyr Thr 485 lie Leu Leu Ala Cys Glu Ser Thr 500
Cys Leu His Phe Ser Ser Trp Asp 515 520
Leu Pro Gin Asn Glu Asp lie Glu 530 535 51 200914830
Ala Ala Ala Ala Thr Ser Ala Leu Leu Leu Arg Leu Phe Thr lie Gly 545 550 555 560
Gly Val Gin Lys Glu Val Phe Ser Leu Ala Gly Pro Val Val Ser Met 565 570 575
Ala Gly His Gly Glu Gin Leu Phe lie Val Tyr His Arg Gly Thr Gly 580 585 590
Phe Asp Gly Asp Gin Cys Leu Gly Val Gin Leu Leu Glu Leu Gly Lys 595 600 605
Lys Lys Lys Gin lie Leu His Gly Asp Pro Leu Pro Leu Thr Arg Lys 610 615 620
Ser Tyr Leu Ala Trp lie Gly Phe Ser Ala Glu Gly Thr Pro Cys Tyr 625 630 €35 640
Val Asp Ser Glu GXy lie Val Arg Met Leu Asn Arg Gly Leu Gly Asn 645 650 655
Thr Trp Thr Pro He Cys Asn Thr Arg Glu His Cys Lys Gly Lys Ser 660 665 670
Asp His Tyr Trp Val Val Gly lie His Glu Asn Pro Gin Gin Leu Arg 675 680 685
Cys lie Pro Cys Lys Gly Ser Arg Phe Pro Pro Thr Leu Pro Arg Pro 690 695 700
Ala Val Ala lie Leu Ser Phe Lys Leu Pro Tyr Cys Gin lie Ala Thr 705 710 715 720
Glu Lys Gly Gin Met Glu Glu Gin Phe Trp Arg Ser Val lie Phe His 725 730 735
Asn His Leu Asp Tyr Leu Ala Lys Asn Gly Tyr Glu Tyr Glu Glu Ser 740 745 750
Thr Lys Asn Gin Ala Thr Lys Glu Gin Gin Glu Leu Leu Met Lys Met 7S5 760 765 t
Leu Ala Leu Ser Cys Lys Leu Glu Arg Glu Phe Arg Cys Val Glu Leu 770 775 7Θ0
Ala Asp Leu Met Thr Gin Asn Ala Val Asn Leu Ala lie Lys Tyr Ala 785 790 795 800
Ser Arg Ser Arg Lys Leu lie Leu Ala Gin Lys Leu Ser Glu Leu Ala 805 810 815
Val Glu Lys Ala Ala Glu Leu Thr Ala Thr Gin Val Glu Glu Glu Glu 820 825 830
Glu Glu Glu Asp Phe Arg Lys Lys Leu Asn Ala Gly Tyr Ser Asn Thr 835 640 845 52 200914830
Ala Thr Glu Trp Ser Gin Pro Arg Phe Arg Asn Gin Val Glu Glu Asp 850 855 860
Ala Glu Asp Ser Gly Glu Ala Asp Asp Glu Glu Lys Pro Glu lie His 865 870 875 880
Lys Pro Gly Gin Asn Ser Phe Ser Lys Ser Thr Asn Ser Ser Asp Val 885 890 895
Ser Ala Lys Ser Gly Ala Val Thr Phe Ser Ser Gin Gly Arg Val Asn 900 905 910
Pro Phe Lys Val Ser Ala Ser Ser Lys Glu Pro Ala Met Ser Met Asn 915 920 925
Ser Ala Arg Ser Thr Asn lie Leu Asp Asn Met Gly Lys Ser Ser Lys 930 935 940
Lys Ser Thr Ala Leu Ser Arg Thr Thr Asn Asn Glu Lys Ser Pro lie 945 950 955 960 lie Lys Pro Leu lie Pro Lys Pro Lys Pro Lys Gin Ala Ser Ala Ala 965 970 975
Ser Tyr Phe Gin Lys Arg Asn Ser Gin Thr Asn Lys Thr Glu Glu Val 980 985 990
Lys Glu Glu Asn Leu Lys Asn Val Leu Ser Glu Thr Pro Ala lie Cys 995 1000 1005
Pro Pro Gin Asn Thr Glu Asn Gin Arg Pro Lys Thr Gly Phe Gin Met 1010 1015 1020
Trp Leu Glu Glu Asn Arg Ser Asn lie Leu Ser Asp Asn Pro Asp Phe 1025 1030 1035 1040
Ser Asp Glu Ala Asp lie He Lys Glu Gly Met He Arg Phe Arg Val 1045 X050 1055
Leu Ser Thr Glu Glu Arg Lys Val Trp Ala Asn Lys Ala Lys Gly Glu 1060 1065 1070 i
Thr Ala Ser Glu Gly Thr Glu Ala Lys Lys Arg Lys Arg Val Val Asp 1075 1080 1085
Glu Ser Asp Glu Thr Glu Asn Gin Glu Glu Lys Ala Lys Glu Asn Leu 1090 1095 1100
Asn Leu Ser Lys Lys Gin Lys Pro Leu Asp Phe Ser Thr Asn Gin Lys 1105 1110 1115 1120
Leu Ser Ala Phe Ala Phe Lys Gin Glu 1125 53 53200914830
<210> 74 <211> 192 <212> PRT <213> 人 <400> 74
Met Val Arg Ala Gly Ala Val Gly Ala His Leu Pro Ala Ser Gly Leu 15 10 15
Asp lie Phe Gly Asp Leu Lys Lys Met Asn Lys Arg Gin Leu Tyr Tyr 20 25 30
Gin Val Leu Asn Phe Ala Met He Val Ser Ser Ala Leu Met lie Trp 35 40 45
Lys Gly Leu lie Val Leu Thr Gly Ser Glu Ser Pro lie Val Val Val 50 55 €0
Leu Ser Gly Ser Met Glu Pro Ala Phe His Arg Gly Asp Leu Leu Phe 65 70 75 80
Leu Thr Asn Phe Arg Glu Asp Pro lie Arg Ala Gly Glu lie Val Val 85 90 95
Phe Lys Val Glu Gly Arg Asp lie Pro lie Val His Arg Val lie Lys 100 105 110
Val His Glu Lys Asp Asn Gly Asp lie Lys Phe Leu Thr Lys Gly Asp 115 120 125
Asn Asn Glu Val Asp Asp Arg Gly Leu Tyr Lys Glu Gly Gin Asn Trp 130 135 140
Leu Glu Lys Lys Asp Val Val Gly Arg Ala Arg Gly Phe Leu Pro Tyr 145 150 155 160
Val Gly Met Val Thr lie lie Met Asn Asp Tyr Pro Lys Phe Lys Tyr 165 170 175
Ala Leu Leu Ala Val Met Gly Ala Tyr Val Leu Leu Lys Arg Glu Ser 180 185 190 <210> 75 <211> 247 <212> PRT <213> 人 <400> 75
Met Asn Pro Leu Leu lie Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Leu Ala Ala 15 10 15
Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys He Val Gly Gly Tyr Asn Cys Glu Glu 20 25 30 54 54200914830
Asn Ser Val Pro Tyr Gin Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys 35 40 45
Gly Gly Ser Leu lie Asn Glu Gin Trp Val Val Ser Ala Gly His Cys 50 55 60
Tyr Lys Ser Arg lie Gin Val Arg Leu Gly Glu His Asn He Glu Val 65 70 75 80
Leu Glu Gly Asn Glu Gin Phe He Asn Ala Ala Lys lie lie Arg His 85 90 95
Pro Gin Tyr Asp Arg Lys Thr Leu Asn Asn Asp lie Met Leu lie Lys 100 105 110
Leu Ser Ser Arg Ala Val lie Asn Ala Arg Val Ser Thr lie Ser Leu 115 120 125
Pro Thr Ala Pro Pro Ala Thr Gly Thr Lys Cys Leu lie Ser Gly Trp 130 135 140
Gly Asn Thr Ala Ser Ser Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Gin Cys 145 150 155 160
Leu Asp Ala Pro Val Leu Ser Gin Ala Lys Cys Glu Ala Ser Tyr Pro 165 170 175
Gly Lys He Thr Ser Asn Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly 180 165 190
Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 155 200 205
Gin Leu Gin Gly Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gin Lys Asn 210 215 220
Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Lys Trp lie Lys 225 230 235 240
Asn Thr He Ala Ala Asn Ser 245
<210> 76 <211> 128 <212> PRT <213> 人 <400> 76
Met Glu Ser Lys Glu Glu Arg Ala Leu Asn Asn Leu lie Val Glu Asn 15 10 15
Val Asn Gin Glu Asn Asp Glu Lys Asp Glu Lys Glu Gin Val Ala Asn 20 25 30
Lys Gly Glu Pro Leu Ala Leu Pro Leu Asn Val Ser Glu Tyr Cys Val 35 40 45 55200914830
Pro Arg Gly Asn Arg Arg Arg Phe Arg Val Arg Gin Pro lie Leu Gin 50 55 60
Tyr Arg Trp Asp lie Met His Arg Leu Gly Glu Pro Gin Ala Arg Met 65 7〇 75 80
Arg Glu Glu Asn Met Glu Arg He Gly Glu Glu Val Arg Gin Leu Met BS 90 95
Glu Lys Leu Arg Glu Lys Gin Leu Ser His Ser Leu Arg Ala Val Ser 100 105 no
Thr Asp Pro Pro His His Asp His' His Asp Glu Phe Cys Leu Met Pro 115 120 125
<210> 77 <21X> 545 <212> PRT-U13> 人 <400> 77
Pro Arg Cys Ala Gly Arg Ser Ser Pro Val Arg Lys Arg His Gly Gly 15 10 15
Arg Arg Ala Gly Gly Lys Asp Thr Leu Val Ser Val Pro Arg Ser Val 20 25 30
Gin Asp Ser Gly Gin Gly Gly Arg Glu Lys Leu Glu Leu Val Leu Ser 35 40 45
Asn Leu Gin Ala Asp Val Leu Glu Leu Leu Leu Glu Phe Val Tyr Thr 50 55 60
Gly Ser Leu Val lie Asp Ser Ala Aen Ala Lys Thr Leu Leu Glu Ala 65 70 75 80
Ala Ser Lys Phe Gin Phe His Thr Phe Cys Lys Val Cys Val Ser Phe 85 90 95
Leu Glu Lys Gin Leu Thr Ala Ser Asn Cys Leu Gly Val Leu Ala Met 100 105 110
Ala Glu Ala Met Gin Cys Ser Glu Leu Tyr His Met Ala Lys Ala Phe 115 120 125
Ala Leu Gin lie Phe Pro Glu Val Ala Ala Gin Glu Glu tie Leu Ser 130 135 140 m lie Ser Lys Asp Asp Phe lie Ala Tyr Val Ser Asn Asp Ser Leu Asn 145 150 155 160
Thr Lys Ala Glu Glu hen Val Tyr Glu Thr Val lie Lys Trp He Lys 165 170 175 56 200914830
Lys Asp Pro Ala Thr Arg Thr Gin Tyr Ala Ala Glu Leu Leu Ala Val 180 185 190
Val Arg Leu Pro Phe He His Pro Ser Tyr Leu Leu Asn Val Val Asp 195 200 205
Asn Glu Glu Leu lie Lys Ser Ser Glu Ala Cys Arg Asp Leu Val Asn 210 215 220
Glu Ala Lys Arg Tyr His Met Leu Pro His Ala Arg Gin Glu Met Gin 225 230 235 240
Thr Pro Arg Thr Arg Pro Arg Leu Ser Ala Gly Val Ala Glu Val lie 245 250 255
Val Leu Val Gly Gly Arg Gin Met Val Gly Met Thr Gin Arg Ser Leu 260 265 270
Val Ala Val Thr Cys Trp Asn Pro Gin Asn Asn Lys Trp Tyr Pro Leu 275 280 285
Ala Ser Leu Pro Phe Tyr Asp Arg Glu Phe Phe Ser Val Val Ser Ala 290 295 300
Gly Asp Asn He Tyr Leu Ser Gly Gly Met Glu Ser Gly Val Thr Leu 305 310 315 320
Ala Asp Val Trp Cys Tyr Met Ser Leu Leu Asp Asn Trp Asn Leu Val 325 330 335
Ser Arg Met Thr Val Pro Arg Cys Arg His Asn Ser Leu Val Tyr Asp 340 345 350
Gly Lys lie Tyr Thr Leu Gly Gly Leu Gly Val Ala Gly Asn Val Asp 355 360 365
His Val Glu Arg Tyr Asp Thr lie Thr Asn Gin Trp Glu Ala Val Ala 370 375 380
Pro Leu Pro Lys Ala Val His Ser Ala Ala Ala Thr Val Cys Gly Gly 385 390 395 400
Lys He Tyr Val Phe Gly Gly Val Asn Glu Ala Gly Arg Ala Ala Gly 405 410 415
Val Leu Gin Ser Tyr Val Pro Gin Thr Asn Thr Trp Ser Phe lie Glu 420 425 430
Ser Pro Met He Asp Asn Lys Tyr Ala Pro Ala Val Thr Leu Asn Gly 435 440 445
Phe Val Phe He Leu Gly Gly Ala Tyr Ala Arg Ala Thr Thr lie Tyr 450 455 460
Asp Pro Glu Lys Gly Asn lie Lys Ala Gly Pro Asn Met Asn His Ser 465 470 475 480 57 57200914830
罾
Arg Gin Phe Cys Ser Ala Val Val Leu Asp Gly Lys lie Tyr Ala Thr 485 490 495
Gly Gly lie Val Ser Ser Glu Gly Pro Ala Leu Gly Asn Met Glu Ala 500 505 510
Tyr Glu Pro Thr Thr Asn Thr Trp Thr Leu Leu Pro His Met Pro Cys 515 520 525
Pro Val Phe Arg His Gly Cys Val Val lie Lys Lys Tyr lie Gin Ser 530 535 540
Gly 545

Claims (1)

  1. 200914830 十、申請專利範圍： 種用來偵測轉移性胃癌細胞的方法，勺人 a) 由一個體取得—或多組織樣本； * b) 測量該組織樣本中—或多聚核苷酸之 聚核苷酸包含與選自序列編號；37〜53 現置，该二 90%相同的核苷酸序列； 人S文序列至少
    C)決定在該組織樣本中該-或多聚核普酸之表現量 是否比-正常組織樣本中該一或多聚核普酸之表現量為 低，其中該較低的表現量代表該組織樣本中有轉移性胃癌 細胞存在。 2.如請求項1所述之方法，兑巾兮 ^ ^ ^ 兵干該一或多聚核苷酸包 含與選自序列編號；37〜53之核苷酸序列。 3.如請求項1所述之方法，其中該一或多聚核苷酸之 表現量係利用 一選自下列的方法來測定： a) 使一或多探針與該一或多聚核苷酸雜合，並 測量與該一或多聚核苷酸結合之該一或多 探針的董， b) 以PCR擴增該些聚核苷酸並測量該PCR產 物的量； c) 表現基因系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE);和 d) 大規模平行測序法（Massively Parallel 200914830
    •如請求項i所述之方法’其中在該樣本中之誃 多聚核苦酸的表現量比在該正常組織樣本中該—或= 普酸之表現量至少低3倍。 夕 所述之方法， <該一或 或多聚核 個二如S項1所述之方法，其中該組織樣本是選自該 體之初始月癌組織、轉移性胃癌組織和體液。 將6.如請求項5所述之方法，其中該體液是選自血液、 水·、血 、腹膜液、尿液和唾液。 7. 一種用來偵測轉移性胃癌細胞的方法，包含： a) 由一個體取得一或多組織樣本； b) 測量該組織樣本中一或多多胜肽之表現 量，該些多胜肽包含與選自序列編號；58〜73 之氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列； c) 決定在該組織樣本中該一或多多胜肽之表 現量是否比一正常組織樣本中該一或多多 胜肽之表現量為低，其_該較低的表現量代 表該組織樣本中有轉移性胃癌細胞存在。 、8·如請求項7所述之方法，其中該一或多多胜肽包含 選自序列編號；58〜73之氨基酸序列。 200914830 9. 如晴求項7所述之方法，其中該-或多多胜肽之表 現量係利用1自下列的方法來測定·· ) 使該一或多多胜肽與一或多抗體接觸，並測 疋包含該一或多多胜肽與該—或多抗體之 一或多複合物的量； b) 質譜儀；及 與一蛋白質陣列雜合。 10. 如明求項7所述之方法，其中該組織樣本是選自該 個體之初始胃癌組織、轉移性胃癌組織和體液。 u.如請求項”斤述之方法’其中該體液是選自血液、 血聚、灰清、腹膜液、尿液和唾液。 200914830 量代表該組織樣本中有轉移性胃癌細胞存 在。 I3.如請求項12所述之方法，其中該—或多聚核普酸包 含選自序列編號；54〜57之核苷酸序列。 如請求項12所述之方法，其中該一或多聚核苷酸之 表現量係利用一選自下列的方法來測定： a) 使一或多探針與該一或多聚核苷酸雜合，並 測量與該一或多聚核苷酸結合之該一或多 探針的量； b) 以PCR擴增該些聚核苷酸並測量該pcr產 物的量； c) 表現基因系列分析（Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)；和 d) 大規模平行測序法（Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS) ° 15.如請求項12所述之方法，其中在該樣本中之該一或 多聚核苷酸的表現量比在該正常組織樣本中該一或多聚核 苷酸之表現量至少高3倍。 16. —種用來偵測轉移性胃癌細胞的方法，包含： a) 由一個體取得一或多組織樣本； 200914830 b) 測量該組織樣本中一或多多胜肽之表現 量’該些多胜肽包含與選自序列編號；74〜77 之氣基序列至少90%相同的氨基酸序列； C) 決定在該組織樣本中該一或多多胜肽之表 現量是否比一正常組織樣本中該一或多多 胜肽之表現量為高，其中該較高的表現量代 表該組織樣本中有轉移性胃癌細胞存在。 17·如請求項16所述之方法，其中該一或多多胜肽包含 選自序列編號；74〜77之氨基酸序列。 ^18·如請求項16所述之方法，其中該一或多多胜肽之表 現量係利用一選自下列的方法來測定： a) 使該一或多多胜肽與一或多抗體接觸，並測 定包含該一或多多胜肽與該一或多抗體之 —或多複合物的量； b) 質譜儀；及 C) 與一蛋白質陣列雜合。 19·如句求項16所述之方法，其中該組織樣本是選自該 個體之初始胃癌組織、轉移性胃癌組織和體液。 2〇.如凊求項19所述之方法，其中該體液是選自血液、 血漿、血清、腹膜液、尿液和唾液。 5 200914830 21. —種套組，包含一選自下列的組合物： a) 一或多聚核苷酸，其係與一選自序列編號； 37〜57之核苷酸序列至少90%相同的核苷酸 序列互補；和 b) 一或多種抗體，該些抗體是與選自序列編 號：58~77中之多胜肽序列至少90%相同的 一多胜肽的專一性抗體。 22. —種癌細胞株，其係選自：MKN45-GFP TW4 (寄存 編號：BCRC960366)、MKN45-GFP TW10 (寄存編號： BCRC960367)和 MKN45-GFP TW12 (寄存編號： BCRC960368)。 200914830 七、指定代表圖： (一） 、本案指定代表圖為：第（2A)圖 (二） 、本案代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明 特徵的化學式：
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