TW200936608A - Improved anti-TrkB antibodies - Google Patents

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Description

200936608 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於酪胺酸受體激酶B(TrkB)之抗體及抗原結 合分子促效劑。 本申請案主張2008年1月17曰申請之美國臨時申請案第 61/021,820號之權利，該案之全部内容以引用的方式併入 本文中。 【先前技術】
❹ I. TrkB 酪胺酸受體激酶B(TrkB)屬於包括TrkA及TrkC之單次跨 膜受體酪胺酸激酶家族。此等酪胺酸受體激酶（trk)介導神 經營養素（neurotrophin)之活性。神經營養素為神經元存活 及發育所需且經由調節神經元架構及突觸塑性來調控突觸 傳遞。神經營養素包括（但不限於）神經生長因子（NGF)、 腦源性神經營養因子（BDNF)、神經營養素-3(NT-3)及神經 營養素-4/5(NT-4/5)。（Lo，KY # Λ ，J. Biol. Chem.， 參 280:41744-52 (2005)) » TrkB 為 BDNF 之高親和力受體 (Minichiello 事入，iVewrow 21:335-45 (1998))。神經營養素 與trk之結合使受體活化，該受體使受體胞内域上的特定酪 胺酸殘基二聚化及自體磷酸化（^叩#人，^^狀〇« 9:1067-1079 (1992) ； Barbacid, J. Neurobiol. 25:1386-1403 (1994)； Bothwell, Ann. Rev. Neurosci. 18:223 253 (1995) ； Segals Greenberg, Ann. Rev. Neurosci. 19:463 489 (1996) ； Kaplan ^.Miller, Curr. Opinion Neurobiol. 10:381 391 (2000))。此 137605.doc 200936608 等罐酸化酷胺酸殘基用作產生對神經元死亡之抑制及其他 神經營養素作用的胞内信號級聯之元件的對接位點 (docking site)。舉例而言，She、FRS-2、SH2B、rAPS 及 PLCy經由磷酸化酪胺酸殘基與TrkB相互作用。此等接附 分子與經活化TrkB之締合使得信號傳輸路徑（包括經有絲 分裂原活化之蛋白激酶、磷脂醯肌醇3-激酶及plcy路徑） 得以啟始’藉此介導神經營養素之作用（Lo，KY #入，乂 Biol, Chem., 280:41744-52 (2005)) ° 〇 η·被尿病 人類血流中的葡萄糖濃度必須控制在相對嚴格範圍（每 分升血液60-120毫克）内以保持正常健康狀況。若血糖降至 過低’則產生稱為低血糖症之病況’其具有諸如暈厥、虛 弱、頭痛、精神錯亂及人格改變之症狀。血糖過高或高血 糖症可由於過量葡萄糖與細胞、組織及器官中之蛋白質之 間的化學反應引起組織損傷。認為此損傷引起糖尿病併發 症：失明、腎衰竭、陽痿、動脈粥樣硬化及易感染性増 ❹加。 ’、θ 糖尿病與連續且病理學上升高之血糖濃度有關；在美國 此為死亡的主要原因之一且造成所有死亡率的約5%。糖 尿病分為兩個主要子類：丨型，亦稱為青少年糖尿病或胰 島素依賴型糖尿病（IDDM);及„型，亦稱為成年型糖尿 病’或非胰島素依賴型糖尿病（NIDDM)。 π型糖尿病之診斷包括症狀評定及對尿與血液中葡萄糖 之量測。血糖含量測定對於準確診斷而言為必要的。更特 137605.doc 200936608 定言之，空腹血糖含量測定為所用之標準方法。然而，公 認口服葡萄糖耐量測試（OGTT)比空腹血糖含量更靈敏^ II 型糖尿病與口服葡萄糖耐量（OGT)受損有關。OGTT因此可 幫助診斷II型糖尿病，儘管此對於糖尿病診斷而言一般並 非必要（Emancipator K，Am J Clin Pathol 1997 年 11 月； 112(5):665 74 ； Type 2 Diabetes Mellitus, Decision Resources Inc., March 2000) ° 因此，在空腹血糖含量低於II型糖尿病診斷所需之彼等 0 含量但在OGTT期間具有介於正常與糖尿病之間的血糖反 應之個體中診斷出葡萄糖耐量受損。認為葡萄糖耐量受損 為前驅糖尿病病狀，且葡萄糖耐量受損（如OGTT所定義） 為發生II型糖尿病之強烈預示（Haffner S M，Med 1997年 8月；14 增刊 3:S12 8)。 II型糖尿病為與胰腺功能降低及/或其他胰島素相關過程 有關之漸進性疾病，血糖含量增加使其加重。因此，Π型 糖尿病一般具有延長之前驅糖尿病階段，且各種病理生理 ® 學機制可導致病理學高血糖症及葡萄糖耐量受損，例如前 驅葡萄糖病況中葡萄糖利用及效用、胰島素作用及/或胰 島素產生之異常（Goldberg R B，Me ¢/ C7i« iVor ί/z 1 998 年 7月；82(4):805 21)。 與葡萄糖失耐有關之前驅糖尿病病況亦可與易患腹部肥 胖、胰島素抵抗、高脂質血症及高血壓相關（Groop L， Forsblom C，Lehtovirta M，Jw 1997年 9 月；10 (9 Pt 2):172S 180S ； Haffner S M, J Diabetes Complications 137605.doc 200936608 1997 March-April, 1 1(2):69 76 ； Beck-Nielsen H, Henriksen J E, Alford F, Hother-Nielson 〇, Diabet Med 1996^9^ ； 13(9增刊 6):S78 84)。 處於發展II型糖尿病風險中之個體中的早期干預（致力於 減輕病理學高血糖症或葡萄糖耐量受損）可預防或延緩向工工 型糖尿病及有關併發症之進展。因此，藉由有效治療口服 葡萄糖耐量受損及/或血糖含量升高可預防或抑制病症向卩 型糖尿病進展。例如參見美國專利第7，1〇9，174號。
胰島素及績醯腺（口服低血糖症治療劑）為目前美國指定 的兩種主要類別之糖尿病藥物。胰島素指定用於〗型及11型 糖尿病兩者，而磺醯脲一般僅指定用於„型糖尿病。磺酿 脲刺激天然胰島素分泌且降低胰島素抵抗；此等化合物不 替代胰島素在新陳代謝中之功能。大約1/3接受續酿腺之 患者變得對其具有耐藥性。一些II型糖尿病對磺醯腺療法 不起反應。對磺醯脲初始治療起反應的患者中，5_1〇%在 約1〇年後可能經歷磺醯脲效用損失。例如參見美國專利第 7，1 15,284 號。 許多通常指定用於治療II型糖尿病之抗糖尿病劑（例如確 醯脲及噻唑啶二酮）具有增加體重之非所要副作用。串有 前驅糖尿病病狀或患有經診斷II型糖尿病之患者中之體重 增加由於新陳代謝及内分泌失調的加重而產生有害作用， 且肥胖本身為II型糠尿病發展及逐漸惡化的關鍵風險因 素。因此需要保持或降低體重之抗糖尿病劑。例如參見美 國專利第7,199，174號。 I37605.doc 200936608 =嚴重的公眾健康問題，因為其增加個體 罹患夕種嚴重病狀之風險，包括糖尿病、心臟病、中風、 高企壓及-些類型的癌症。過去2時肥胖個體數目的大量 增加已產生深遠公眾健康含義。儘 „ 1 慑官研究已表明藉由飲食 及鍛煉來減輕肥胖使相關風險 、「汉顯者降低，但鑒於肥 與&成食慾增加、偏愛高熱量食物、 身體，舌動減少及脂肪 生成新陳代謝增加之遺傳因辛炻古 这得口素極有關，此等治療在很大程
度上不成功。例如參見美國專利第7，1 15,767號。 HI·雷特氏症候群（Rett Syndft0me) 由Mew醫生在1966年首次鑑別之雷特氏症候群 (RTT)為源起於晚期神經發育缺陷之破壞性CNS病症。此 乂 1/1 〇，刚15，嶋活產之比率幾乎獨有的影響所有種族的 年輕女孩。-些患有RTT之個體在年輕時死亡，然而，其 中許多可活至成年且深度殘疾。高達25%患者死於心臟/呼 吸衰竭。料沒有針對該疾狀有效治療。 在一定時期的表觀正常發f後’受影響女孩在6_18個月 的年齡發展RTT症狀，料錢錢後料間逐漸惡化。 症狀包括出生時頭圍正常隨後頭部生長減速；喪失已獲得 之語言能力、交流功能障礙、認知功能障礙；彳目的手部 技能由常規手部運動(紆曲手部扭絞、洗手、&掌、輕拍 等）替代，運動⑦#或劣化（步態共濟失調、僵硬等”蘇醒 時呼吸困難；嬰兒早划夕疏脏羽油/ 干期之睡眠s慣受損；伴隨肌肉萎縮及 肌張力障礙之異常肌肉登强. π緊張，周邊血管舒縮性干擾；進行 性脊柱側彎或脊柱後彎；及生長遲緩。 137605.doc 200936608 該病症特徵亦在於中樞自主性功能障礙，雷特氏患者展 現一些或所有以下症狀：由屏氣週期、呼吸微弱、換氣過 度、持續呼吸暫停組成之多發性呼吸節律障礙；基線心臟 迷走神經張力降低之心率失常；及壓力反射之心臟敏感 性。此等症狀威脅生命且使雷特氏患者處於突然死亡之風 險中。其表明腦幹未成熟且在覺醒期間缺乏心肺網路内及 來自下視丘或皮質邊緣之綜合抑制。此外，在雷特氏患者 中報導腦幹神經營養素信號傳輸（NGF及BDNF)改變，如一 〇 元胺（血清素、去甲腎上腺素）及神經肽（物質P)含量降低。 RTT為單基因疾病，其在大多數狀況下由X染色體連鎖 基因mecp2中的突變引起，該基因編碼轉錄抑制物 MeCP2(甲基CpG胞嘧啶結合蛋白2)。MeCP2優先與甲基化 DNA結合。 已知神經營養素因子BDNF為MeCP2的直接標靶，且為 去甲腎上腺素及血清素神經元之重要營養因子。令人驚奇 地，Mecp2-KO小鼠缺乏腦BDNF，且腦BDNF之遺傳過度 ® 表現可增加其壽命且援救其一些運動缺陷。在人類體内鑑 別之BDNF缺乏病症包括雷特氏症候群、威爾姆氏腫瘤 (Wilms'tumor)、無虹膜、泌尿生殖器異常及智力發育遲滯 (WAGR)症候群（Han等人，N Engl J Med (2008) 359(9): 918-27)、由黑色素皮質素受體MC4R缺乏引起之肥胖 (Farooqi 及 O'Rahilly，Endocrine Rev (2006) 27(7):710- 18)、惡病質/肌肉萎縮症候群（Lin等人，PloS，3(4):el900; WO 2007/088476)。 137605.doc 200936608 【發明内容】 在一態樣中，本發明提供結合酷胺酸受體激酶B(TrkB) 之抗體。在一些實施例中，抗體包含： (a) 包含人類重鏈V區段、重鏈互補決定區3 (CDR3)及重 鏈框架區4(F'R4)之重鏈可變區，及 (b) 包含人類輕鏈V區段、輕鍵CDR3及輕鍵FR4之輕鏈可 變區，其中 i) 重鏈CDR3包含胺基酸序列V(T/V)(S/T/R/N)WFAY ❹ （SEQ ID NO:34);且 ii) 輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列（S/M)QGT(H/A) (E/V/I)PYT(SEQ ID ΝΟ··42);且 其中抗體為TrkB促效劑。 在另一態樣中，本發明提供特異性結合TrkB之抗體。在 一些實施例中，抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中 重鏈可變區及輕鏈可變區各自包含以下三個互補決定區 (CDR) : CDR1、CDR2及 CDR3 ;其中： ❿ i)重鏈可變區之CDR1包含SEQ ID NO:25之胺基酸序 列； ii) 重鏈可變區之CDR2包含選自由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30組成之群的胺基酸序列； iii) 重鏈可變區之CDR3包含選自由SEQ ID NO:32及SEQ IDNO:33組成之群的胺基酸序列； iv) 輕鏈可變區之CDR1包含選自由SEQ ID NO:35、SEQ ID NO :3 6及SEQ ID NO :37組成之群的胺基酸序列； 137605.doc 200936608 V)輕鏈可變區之CDR2包含SEQ ID NO:39之胺基酸序 列； vi)輕鏈可變區之CDR3包含選自由SEQ ID NO:40及SEQ IDNO:41組成之群的胺基酸序列。 關於抗體之實施例，在一些實施例中，重鏈V區段與 SEQ ID NO:16共有至少90%序列一致性，且其中輕鏈V區 段與SEQ ID NO:24共有至少90%序列一致性。 在一些實施例中，重鏈V區段與選自由SEQ ID NO: 12、 ❺ SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14 及 SEQ ID NO:15 組成之群 的胺基酸共有至少90%序列一致性，且輕鏈V區段與選自 由 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22 及 SEQ ID NO:23組成之群的胺基酸共有至少90%序列一致性。 在一些實施例中，重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO:32 及SEQ ID NO:33組成之群的胺基酸序列；且輕鏈CDR3包 含選自由SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41組成之群的胺基 © 酸序列。 在一些實施例中，重鏈FR4為人類生殖系FR4。在一些 實施例中’重鏈FR4為SEQ ID NO:50。在一些實施例中， 重鏈J區段包含人類生殖系JH4部分序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:50)。 在一些實施例中，輕鏈FR4為人類生殖系FR4。在一些 實施例中’輕鏈FR4為人類生殖系Jk2部分序列 FGQGKLEIK(SEQ ID NO:61)。 137605.doc • 10· 200936608 在一些實施例中，重鏈v區段及輕鏈v區段各自包含互 補決定區1(CDR1)及互補決定區2(CDR2);其中： i) 重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列； ii) 重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:31之胺基酸序 列； iii) 輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:38之胺基酸序 列；且 iv) 輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:39之胺基酸序 〇 列。 在一些實施例申， i) 重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:25 ; ii) 重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:28 ; iii) 重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:32 ; iv) 輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:35 ; v) 輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:38 ;且 vi) 輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:41。 ® 在-些實施例中， i) 重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:25 ; ii) 重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:28 ; iii) 重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:32 ; iv) 輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:36 ; v) 輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:38 ;且 vi) 輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:40。 在一些實施例中， 137605.doc •11 · 200936608 i) 重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:25 ; ii) 重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:28 ; iii) 重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:32 ; iv) 輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:37 ; v) 輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:38 ;且 vi) 輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:40。 在一些實施例中， i)重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:25 ; 〇 ii)重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:29 ; iii) 重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:32 ; iv) 輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:35 ; v) 輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:38 ;且 vi) 輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:41。 在一些實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO:4之可變區 共有至少90%胺基酸序列一致性，且輕鏈可變區與SEQ ID NO: 11之可變區共有至少90%胺基酸序列一致性。 ® 在一些實施例中，重鏈可變區與選自由SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群的可變區共有至少 90%胺基酸序列一致性，且輕鏈可變區與選自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10組成之群的可變區共有至少90% 胺基酸序列一致性。 在一些實施例中，重鏈可變區與選自由SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群的可變區共有至少 137605.doc -12- 200936608 95%胺基酸序列一致性，且輕鏈可變區與選自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10組成之群的可變區共有至少95% 胺基酸序列一致性。 在一些實施例中，重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群的胺基酸序 列，且輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及 SEQ 〇 ID NO: 10組成之群的胺基酸序列。 在一些實施例中，抗體以小於5 χ ΙΟ·8 Μ之平衡解離常 數（KD)與TrkB結合。 在一些實施例中，抗體為FAb’片段。在一些實施例中， 抗體為IgG。在一些實施例中，抗體為單鏈抗體（scFv)。在 一些實施例中，抗體包含人類恆定區。 在一些實施例中，抗體不與酪胺酸激酶受體A或酪胺酸 激酶受體C結合。在一些實施例中，抗體與TrkB之配位體 ® 結合域（LBD)結合。在一些實施例中，抗體與腦源性神經 營養因子（BDNF)競爭與TrkB之結合。 在一些實施例中，抗體包含包括SEQ ID NO: 1之重鏈及 包括SEQ ID NO:8之輕鏈。 在一些實施例中，抗體包含包括SEQ ID NO: 1之重鏈及 包括SEQ ID NO:9之輕鏈。 在一些實施例中，抗體包含包括SEQ ID ΝΟ:1之重鏈及 包括SEQ ID NO:10之輕鏈。 137605.doc -13 - 200936608 在一些實施例中’抗體包含包括SEQ ID NO:3之重鏈及 包括SEQ ID NO:8之輕鍵。 在另-態樣中，本發明提供醫藥學上可接受之組合物， 其包含本發明之抗體及生理譽μ 學上相谷之賦形劑。醫藥學上 可接受之組合物的實施例係如上文針對抗體所述。'
❹ 在-些實施例中’醫藥組合物進—步包含用於減輕 制呼吸窘迫之藥劑’例如去甲腎上腺素及/或血清素路和 之活化劑1二藥劑可為三環抗抑臀劑，例如地昔帕: (desip腿ine，DMI)。在—些實施例中，第二藥劑為血清 素1A受體部分促效劑，例如丁螺環酮…則“⑺⑽卜氟西汀 (Fluoxetine)及瑞波西汀（Reb〇xetine)。在一些實施例中: 第二藥劑為麩胺酸能AMPA受體之活化劑，例如AMpAkine CX54。在一些實施例中，箆一蘊乂 τ 弟一樂劑為前列腺素 (prostaglandin)、孕酮（progester〇ne)或 TrkB 活性之增效劑 (例如，蛋白酪胺酸磷酸酯酶抑制劑）。 在-些實施例中’醫藥組合物進—步包含降低個體血糖 含量之藥劑。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含降 低個體體重之藥劑。 在一相關態樣中，本發明提供藉由向有需要之個體投予 本發明抗體來治療、減輕、抑制、改善及/或預防該個體 體内由BDNF功能不全引起之病症之方法。治療方法之實 施例如上文及本文針對抗體所述。在一些實施例中，抗體 係全身或周邊（例如，經口、吸入、靜脈内或腹膜内）投 予。在一些實施例中，由BDNF功能不全引起之病症係選 137605.doc -14 - 200936608 自由雷特氏症候群、|織症候群、由MC4R缺乏引起之 肥胖及惡病質(例如’由於癌症、老化、飲食病症或藥 物’包括類鴉片誘發之嘔吐）組成之群。 在另態樣中，本發明提供降低有需要之個體的血糖含 里及/或體重之方法，該方法包含向該個體投予治療有效 量之本發明抗體。治療方法之實施例如上文及本文針對抗 體所述。關於該等方法之其他實施例，在一些實施例中， 個體具有如驅糖尿病。在一些實施例中，個體具有J型糖 〇 尿病。在一些實施例中，個體具有II型糖尿病。在一些實 施例中’個體超重。在一些實施例中，個體肥胖。 在一些實施例中，該等方法進一步包含向個體投予治療 有效量之有效降低血糖之第二藥劑。在一些實施例中，第 二藥劑係選自由以下各物組成之群：胰島素、磺醯脲、胰 島素促泌劑（insulinotropic agent)、二甲雙胍（metformin)、 ΡΡΑΪΙγ促效劑、ppARa促效劑、PPARS促效劑、PPARa/γ 雙重促效劑、ΡΡARa/γ/δ全促效劑、a-葡糖苷酶抑制劑、 © DPP-IV抑制劑及GLP-1/GLP-1類似物。 在一些實施例中，該等方法進一步包含向個體投予治療 有效量之有效降低體重或肥胖之第二藥劑。在一些實施例 中，第二藥劑係選自由脂肪酶抑制劑、諾美婷 (sibutramine)、CB-1 抑制劑、托 °比酯（topiramate)、艾汀 (amylin)、艾汀類似物、痩素（leptin)、PYY/PYY類似物及 GLP-1/GLP-1類似物組成之群。 在一些實施例中，第二藥劑及抗體係以混合物形式投 137605.doc 200936608 予。在一些實施例中，第二藥劑及抗體係單獨投予。 定義 "抗體"係指免疫球蛋白家族之多肽或包含能非共價地、 可逆地且以特異性方式結合相應抗原之免疫球蛋白之片段 的多肽。一例示性抗體結構單元包含四聚體。各四聚體包 含兩個一致多肽鏈對’各對具有經由雙硫鍵連接之一"輕" 鏈（約25 kD)及一"重"鏈（約5〇_7〇 kD)。所辨識免疫球蛋白 基因包括代、入、〇1、丫、§、6及4恆定區基因，以及無數免 ^ 疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為K或λ。重鏈分類為γ、 μ、α、δ或ε ’其又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、
IgA、IgD及IgE *各鏈之N末端定義主要負責抗原識別之具 有約100至110個或更多胺基酸的可變區。術語可變輕鏈 (Vl)及可變重鍵（VH)分別指此等輕鏈及重鏈之區。如本申 請案中所用，"抗體"涵蓋具有特定結合特異性（例如，對
TrkB)之抗體及其片段的所有變化。因此，此概念範疇内 為全長抗體、嵌合抗體、單鏈抗體（ScFv)、Fab、Fab，及具 ® 有相同結合特異性之此等片段的多聚型式（例如， F(ab')2)。 "互補決定域，，或”互補決定區（"CDR")"可互換地指&與 Vh之高變區。CDR為收納該標靶蛋白之特異性的抗體鏈之 標靶蛋白結合位點。在各人類VL或中存在三個CDR (CDR1-3 ’自N末端依序編號），其占可變域之約15_2〇0/〇。 CDR與標起蛋白之抗原決定基在結構上互補且因此直接造 成結合特異性。VL或Vh之其餘段（所謂框架區）顯示較少胺 137605.doc -16 - 200936608 基酸序列變化（Kuby，Immunology，第4版，第4章。W.Η. Freeman & Co·，New York，2000) 〇 CDR及框架區之位置係使用此項技術中之各種熟知定義 判斷，例如Kabat、Chothia、國際ImMunoGeneTics資料庫 (IMGT)(在萬維網 imgt.cines.fr/上）及 AbM(例如參見 Johnson 等人，Nucleic Acids Res.，29:205-206 (2001) ; Chothia及 Lesk，J. Mol. Biol” 196:901-917 (1987); Chothia等人， Nature, 342:877-883 (1989) ; Chothia等人，J. Mol. Biol., 0 227:799-817 (1992) ; Al-Lazikani 等人，J. Mol. Biol.， 273:927-748 (1997))。抗原組合位點之定義亦在以下文獻 中描述：Ruiz等人，Nucleic Acids Res.，28:219-221 (2000) 及 Lefranc，Μ.P.，Nucleic Acids Res.，29:207-209 (2001); MacCallum等人，J. Mol. Biol.，262:732-745 (1996);及 Martin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989) ; Martin 等人，Methods Enzymol.，203:121-153 (1991);及 Rees 等人，In Sternberg M.J.E.(編），Protein ❹ Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。 術語"結合特異性決定子"或"BSD"互換地指互補決定區 内對於判斷抗體之結合特異性而言必要的最小毗連或非毗 連胺基酸序列。最小結合特異性決定子可在一或多個CDR 序列内。在一些實施例中，最小結合特異性決定子歸於 (亦即，僅由其決定）抗體之重鏈及輕鏈的部分或全長CDR3 序列。 137605.doc 200936608 本文所用之”抗體輕鏈”或”抗體重鏈"分別指包含、或^ 之多肽。内源性乂!^係由基因區段V(可變）及；（接合）編碼， 且内源性VH係由v、D(多樣性）及J編碼。Vl或Vh中之每一 者包括CDR以及框架區。在本申請案中，抗體輕鏈及/或 抗體重鏈可（有時）總稱為"抗體鏈，^如熟習此項技術者將 容易地辨識，此等術語涵蓋含有未破壞Vl*Vh之基本結構 之突變之抗體鏈。 抗體以完整免疫球蛋白或以藉由以各種肽酶消化產生之 〇 許多經充分表徵之片段形式存在。因此，舉例而言，胃蛋 白酶消化鉸鏈區中雙硫鍵聯下方的抗體產生F(ab)，2，其為 Fab’之二聚體’本身為由雙硫鍵與Vh_Ch i接合之輕鏈。 F(ab)’2可在溫和條件下還原以斷開鉸鏈區中之雙硫鍵聯， 藉此將F(ab)’2二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體基本上為 具有部分鉸鍵區之 Fab。Paul, /www«o/〇 幻;第 3 版。（1993)。儘管根據完整抗體之消化定義各種抗體片 段’但熟練技術人員將瞭解該等片段可以化學方法或藉由 ® 使用重組DNA方法從頭合成。因此，本文所用之術語"抗 體”亦包括藉由修飾完整抗體製備之抗體片段或使用重組 DN A方法從頭合成之彼等抗體（例如，單鍵Fv)或使用嗤菌 體呈現文庫鑑別之彼等抗體（例如參見McCafferty等人， iVaiwre 348:552-554 (1990))。 對於單株或多株抗體之製備而言，可使用此項技術中已 知之任何技術（例如參見Kohler及Milstein, /Vaiwre 256:495- 497 (1975) ; Kozbor 等人，/mww«o/ogy Toc/ay 4:72 137605.doc -18 _ 200936608 (1983) ; Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ’ 第 77-96 頁。Alan R. Liss, Inc, 1985)。製備單鏈 抗體之技術（美國專利第4,946,778號）可用於製備針對本發 明多肽之抗體。同樣，轉殖基因小鼠或其他生物艎（諸如 其他哺乳動物）可用於表現人源化抗體。或者，可使用噬 菌體呈現技術來鑑別與所選抗原特異性結合之抗體及雜聚 Fab片段（例如參見McCafferty等人，上文；Marks等人， 10:779-783,（1992))。 〇 此項技術中熟知使非人類抗體人源化或靈長類化之方 法。一般而言，人源化抗體具有一或多個自非人類來源引 入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為輸 入殘基，其通常取自輸入可變域。人源化基本上可根據 Winter及合作者之方法（例如參見jones等人， 321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，Waiwre 332:323-327 (1988); Verhoeyen等人，Sciewce 239:1534-1536 (1988)及 Presta，Cwrr. (9;?, 2:593-596 (1992))藉由以截 ® 齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行。 因此，該等人源化抗體為嵌合抗體（美國專利第4,816,567 號），其中實質上小於完整人類可變域已由來自非人類物 種之相應序列取代。實際上，人源化抗體通常為一些互補 決定區（"CDR")殘基及可能的一些框架（"FR")殘基經來自 齧齒動物抗體中類似位點之殘基取代的人類抗體。 "嵌合抗體"為抗體分子’其中（a)恆定區或其部分經改 變、置換或交換使得抗原結合位點（可變區）與不同或經改 137605.doc •19· 200936608 變類別、效應功能及/或物種之恆定區或完全不同之分子 連接’該分子賦予嵌合抗體以新特性，例如酶、毒素、激 素、生長因子及藥物；或（b)可變區或其部分經具有不同或 經改變抗原特異性之可變區改變、置換或交換。 術語"可變區"或"v區"互換地指包含fr1_cdri_fr2_ CDR2-FR3-CDR3-FR4之f鏈或輕鍵。參見@1。内源性可 變區由免疫球蛋白重鏈V-D-J基因或輕鏈v_j基因編碼。v 區可為天然存在的、重組的或合成的。 〇 如本文所用，術語"可變區段"或"V區段”互換地指包括 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3之可變區的子序列。參見圖i。 内源性V區段係由免疫球蛋白v基因編碼。v區段可為天然 存在的、重組的或合成的。 如本文所用，術語"J區段"係指包含CDR3及FR4之C末端 部分的所編碼可變區之子序列。内源性j區段係由免疫球 蛋白J基因編瑪。參見圖1。j區段可為天然存在的、重組 的或合成的。 ® "人源化”抗體為保持非人類抗體之反應性同時在人類體 内具有較低免疫原性之抗體。此可（例如）藉由保留非人類 CDR區且以其人類對應物置換抗體之其餘部分來實現。例 如參見 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) ; Morrison 及 Oi，yic/v. /wwwwo/.， 44:65-92 (1988) ; Verhoeyen等人，239:1534-1536 (1988) » Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991) ί
Padlan，Mo/ec. 7>w/ww«·，31(3):169-217 (1994) 0 137605.doc -20- 200936608 術語''相應人類生殖系序列”係指編碼人類可變區胺基酸 序列或子序列之核酸序列’該序列或子序列相較於由人類 生殖系免疫球蛋白可變區序列編碼之所有其他升高之可變 區胺基酸序列與參考可變區胺基酸序列或子序列共有最高 經決定胺基酸序列一致性。相應人類生殖系序列亦可指人 類可變區胺基酸序列或子序列，該序列或子序列相較於所 有其他升高之可變區胺基酸序列與參考可變區胺基酸序列 或子序列具有最高胺基酸序列一致性。相應人類生殖系序 ❹ 列可僅為框架區、僅互補決定區、框架及互補決定區、可 變區段（如上文所定義）或包含可變區之序列或子序列的其 他組合。序列一致性可使用本文所述之方法測定，例如使 用BLAST、ALIGN或此項技術中已知的另一比對算法來比 對兩個序列。相應人類生殖系核酸或胺基酸序列可與參考 可變區核酸或胺基酸序列具有至少約9〇%、92%、94%、 96°/。、98%、99°/。序列一致性。相應人類生殖系序列可（例 如）經公眾可用之國際ImMunoGeneTics資料庫（IMGT)(萬維 網 imgt.cines.fr/ 上）及 V-base(萬維網 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk上）決定。 當在描述抗原（例如蛋白質）與抗體或抗體來源結合劑之 間的相互作用之上下文中使用時，片語”特異性（或選擇性） 結合”係指決定抗原在蛋白質及其他生物製劑之異質群體 中之存在的結合反應。因此，在指定之免疫檢定條件下， 具有特定結合特異性之抗體或結合劑與特定抗原結合至少 兩倍於背景且實質上不以顯著量與樣本中存在之其他抗原 137605.doc •21 - 200936608 結合。在該等條件下與抗體或結合劑之特異性結合可能需 要抗體或㈣已針對其對特定蛋白f之特異性進行選擇。 此選擇可藉由自其他物種（例如，小鼠）或其他μ亞型（例 如，舰、㈣等）_減去與（例如）τ⑽分子交又反應之 抗體來實現。可使用多種免疫檢定格式來選擇與特定蛋白 質發生特異性免疫反應之抗體。舉例而言，按常規使用固 相簡Α免疫檢定來選擇與蛋白質發生特異性免疫反應之 抗體（例如參見Harlow及Lane,Αη^〇(Π% A Laboratory Manual (1998)，其用於描述可用於決定特異性 免疫反應性之免疫檢定格式及條件）。通常，特異性或選
擇性結合反應將產生高於背景信號至少兩倍，且更通常高 於背景信號至少10至100倍之信號。 術浯平衡解離常數（KD，M)"係指解離速率常數（kd，時 間J除以解離速率常數（ka，時間·〗，平衡解離常數 可使用此項技術中之任何已知方法量測。本發明抗體一般 將具有小於約10或1 0 8 Μ，例如小於約1 〇-9 μ或1 〇-1❹μ， 在一些實施例中，小於約1〇-丨1 Μ、10-丨2从或10-13 Μ之平 衡解離常數。 如本文所用，術語"抗原結合區"係指本發明TrkB結合分 子中負責分子與TrkB之間的特異性結合之域。抗原結合區 包括至少一個抗體重鏈可變區及至少—個抗體輕鏈可變 區。各本發明之TrkB結合分子中存在至少一個此類抗原結 〇 S ’且抗原結合區中之每一者可與其他相同或不同。在 一些實施例中，本發明TrkB結合分子之抗原結合區中之至 I37605.doc -22- 200936608 少一者充當TrkB之促效劑。 術語”抗體促效劑"或”促效劑"互換地指能夠活化受體以 誘導全部或部分（例如，至少60%)受體介導之反應的抗 體。舉例而言，TrkB之促效劑與TrkB結合且誘導TrkB介 '導之信號傳輸。在一些實施例中’ TrkB抗體促效劑可由其 結合TrkB且在與SH-SY5Y細胞接觸時誘導神經突贅生物 (outgrowth)之能力或如本文所述以其他方式來鑑別。在其 他實施例中，TrkB抗體促效劑可藉由其如本文所述之失巢 ❹ 调亡（anoikis)檢定中量測之自脫離依賴性細胞调亡援救細 胞之能力來鑑別。在本文所述之失巢凋亡檢定中，認為具 有小於 5 nM，例如小於 1 nM、500 pM、250 pM、100 pM、50 pM或30 pM之EC5〇的抗TrkB抗體為TrkB抗體促效 劑。 術語"TrkB"或"酪胺酸受體激酶B"交互地指受體酪胺酸 激酶之原肌球蛋白相關激酶（Trk)家族的三個成員之一，其 他成員為TrkA及TrkC。TrkB為神經營養酪胺酸受體激酶 © (NTRK)家族的一員，亦稱為2型神經營養酪胺酸激酶受體 (NTRK2)。TrkB為膜結合受體，在神經營養素結合後，使 自身及MAPK路徑之成員磷酸化。TrkB之配位體包括腦源 性神經營養因子（BDNF)及神經營養素-3。參見例如Haniu 等人，Jrc/z Biochem Biophys (1995) 322(1):256-264 ； Squinto 等人，Cell (1991) 65(5) 885-893 ；及 Soppet等人， Ce// (1991) 65(5) 895-903。經由TrkB信號傳輸導致細胞分 化。此基因中之突變已與肥胖及情感障礙有關。存在編碼 137605.doc •23- 200936608
TrkB之不同異型體的替代轉錄剪接變體◊ TrkB的核酸及胺 基酸序列已知，且以GenBank寄存編號ΝΜ_〇〇1〇18064 (gi:65506744，PRI 2007年 11 月 18 日）公開。亦參見 GenBank 寄存編號 BC 075804.1、U12140.1、BC031835.1 及 AF410899.1。如本文所用，TrkB多肽在功能上為酷·胺酸激 酶受體，其藉由BDNF或神經營養素-3之結合而活化，且 藉由使自身及MAPK路徑之成員磷酸化來引起胞内信號傳 輸。結構上，TrkB胺基酸序列與GenBank寄存編號 ❹ NP_001018074.1、AAB33109、AAL67968、AAL67964、 AAC51371.1、AAH 31835.1 或 AAL67965.1 之胺基酸序列共 有至少約 90%、91% ' 92%、93%、94% > 95%、96%、 97%、98%、99%或100%序列一致性。結構上，TrkB胺基 酸序列與 GenBank 寄存編號 NM_001018064、S76473、 BC075804.1、U12140.1、BC031835.1 或 AF410899.1 之胺基 酸序列共有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或 100%序列一致性。 ® 本發明多肽之"活性"係指多肽在其天然細胞或組織中的 結構、調節或生物化學功能。多肽活性之實例包括直接活 性及間接活性。例示性直接活性為與多肽的直接相互作 用，包括配位體結合，諸如BDNF與TrkB之配位體結合域 (LBD)結合（參見例如 Naylor 等人，Bz’oc/zew Biophys Res Commun. 291 (3):501-7 (2002)))之結果，產生或耗盡第二 訊息（例如cAMP、cGMP、IP3、DAG或Ca2+)、離子流、及 改變磷酸化或轉錄程度。TrkB的例示性間接活性經觀測為 137605.doc •24· 200936608 細胞或組織之表型或反應對多肽直接活性的改變，例如由 於多肽與其他細胞或組織組份的相互作用而使整體血糖量 降低。 當在提及成年人類中使用時，術語"肥胖”係指具有30或 更高之體重指數（BMI)的個體。當在提及成年人類中使用 時，"超重"係指具有25或更高之BMI的個體。對於兒童而 言，使用關於年齡之體重指數表，其中大於0.85之BMI視 為"超重"且大於0.95之BMI視為"肥胖"。例如參見C/iwica/ 〇 Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adult (National Heart, Lung and Blood Institute，1998年6月17日）及於世界衛生組織肥 胖協商會（the World Health Organization Consultation of Obesity) + Preventing and Managing the Global jEp/i/em/c 〇/(9办eizXWHO，Geneva，1997年 6月）。 ”前驅糖尿病個體"係指具有大於110 mg/dH旦小於126 mg/dl之空腹血糖含量或大於140 mg/dl但小於200 mg/dl之2 © 小時PG讀數的成年人。"糖尿病個體"當用於與來自患者之 樣本比較時，係指具有大於126 mg/dl之空腹血糖含量或大 於200 mg/dl的2小時PG讀數之成年人。"空腹"係指至少8 h 沒有熱量攝取。"2小時PG"係指以含有75 g溶解於水中之 無水葡萄糖之等效物的葡萄糖負載激發患者後的血糖含 量。整體測試一般稱為口服葡萄糖耐量測試（OGTT)。例 如參見Care，2003, 26(1 1): 3160-3167 (2003)。 術語"經分離"當應用於核酸或蛋白質時表示核酸或蛋白 137605.doc -25- 200936608 質基本上不含其在天然狀態下締合之其他細胞組份。其較 佳呈均質狀態。其可在無水溶液或水溶液中。純度及均質 性通常使用分析型化學技術測定，諸如聚丙烯醯胺凝膠電 泳法或高效液相層析法。作為製劑中存在之主要物質的蛋 白質實質上經純化。詳言之，經分離基因係自側接該基因 且編碼不為所關注基因之蛋白質的開放閱讀框架分離。術 語"經純化"表示核酸或蛋白在電泳凝膠中基本上產生一個 條帶°特定言之’其意謂核酸或蛋白質至少85%純，更佳 Ο 至少95%純，且最佳至少99%純。 術s吾"核酸”或”聚核苷酸”係指脫氧核糖核酸（DNA)或核 糖核酸（RNA)及其呈單鏈或雙鏈形式之聚合物。除非明確 限制’否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核 酸，該等核酸與參考核酸具有類似結合特性且以與天然存 在之核苷酸類似的方式代謝。除非另外指定，否則特定核 酸序列暗中亦涵蓋其經保守修飾之變體（例如，簡幷密碼 子取代）、等位基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明 ❹ 確指定之序列。特定言之，簡幷密碼子取代可藉由產生一 或多個所選（或所有）密碼子中的第三位置經混合鹼基及/或 脫氧肌苷殘基取代之序列來實現（Batzer等人，# AW 19:5081 (1991) ; Ohtsuka等人，心/_ ❹飢 260:2605-2608 (1985);及 Ross〇Hn；[等人，偷，ce// 尸8:91-98 (1994)) ° 術語"多肽"、"肽"及"蛋白質”在本文中互換使用，指胺 基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基 137605.doc •26· 200936608 為相應天然存在胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合 物’以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之 胺基酸聚合物。 術語”胺基酸”係指天然存在之胺基酸及合成胺基酸，以 及以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的胺基酸類似 物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼 之彼等胺基酸，以及隨後經修飾之彼等胺基酸，例如經基 脯胺酸、γ·羧基麩胺酸及0-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係 〇 指與天然存在之胺基酸具有相同基本化學結構的化合物， 亦即α碳與氫、羧基、胺基及尺基團結合，例如高絲胺酸、 正白胺酸、甲硫胺酸亞砜、曱硫胺酸曱基銃。該等類似物 具有經修飾之R基團（例如，正白胺酸）或經修飾之肽主 鍵’但保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。胺 基酸模擬物係指具有不同於胺基酸之一般化學結構的結構 但以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用之化合物。 "經保守修飾之變體”適用於胺基酸及核酸序列兩者。關 ® 於特定核酸序列’經保守修飾之變體係指編碼一致或基本 上致的胺基酸序列之彼等核酸，或在核酸不編碼胺基酸 序列之狀況下指基本上一致的序列。因為遺傳密碼之簡幷 性，所以大量功能上一致之核酸編碼任何給定蛋白質。舉 例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及Gcu均編碼胺基酸丙 胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子指定之每一位置，密碼子 可改變為所述相應密碼子中之任一者而不改變所編碼之多 肽。該等核酸變異為"沉默變異"，其為經保守修飾之變^ 137605.doc •27- 200936608 中的一種。本文中每一個編碼多肽之核酸序列亦描述核酸 之每一個可能的沉默變異。技術人員將認識到核酸中之各 密碼子（除一般為曱硫胺酸之僅有密碼子的AUG及一般為 色胺酸之僅有密碼子的TGG外）可經修飾以產生功能上一 致的分子。因此，編碼多肽之核酸的各沉默變異隱含於各 所述序列中。 關於胺基酸序列，技術人員將認識到對核酸、肽、多肽 或蛋白序列之個別取代、缺失或添加（改變、添加或缺失 © 所編碼序列中之單個胺基酸或小百分比之胺基酸）為"經保 守修飾之變體"’其中改變使得胺基酸經化學上類似之胺 基酸取代。提供功能上類似之胺基酸的保守取代表為此項 技術中所熟知》該等經保守修飾之變體為對本發明之多形 態變體、種間同源物及等位基因之補充且不將其排除。 以下8個群各自含有相對於彼此為保守取代之胺基酸： 1)丙胺酸（A)、甘胺酸（G) ; 2)天冬胺酸（D)、麩胺酸（E) ; 3) 天冬酿胺（N)、麩胺醯胺（Q) ; 4)精胺酸（R)、離胺酸（κ); ® 5)異白胺酸⑴、白胺酸（L)、曱硫胺酸（Μ)、纈胺酸（v) ; 6) 笨丙胺酸（F)、酪胺酸（Υ)、色胺酸（w) ; 7)絲胺酸（s)、蘇 胺酸（Τ);及8)半胱胺酸（C)、曱硫胺酸（Μ)(例如參見 Creighton, Proieiwj (1984))。 ”序列一致性百分比"係藉由在比較窗口内比較兩個經最 佳對準之序列來測定’其中與不包含添加或缺失之參考序 歹!(例如’本發明之多狀）相比’聚核普酸序列在比較窗口 中之部分可包含添加或缺失（亦即’缺口）以供兩個序列之 137605.doc -28- 200936608 最佳對準。藉由測定兩序列中存在一致核酸鹼基或胺基酸 殘基的位置數產生匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗 口中的總位置數且將結果乘以1 〇〇產生序列一致性百分 比，從而計算出百分比β 術語"一致性"或” 一致性"百分比在兩個或兩個以上核酸 或多狀序列之内容中係指兩個或兩個以上為相同序列之序 列或子序列。當如使用以下序列比較算法中之一者或藉由 手動對準及目測所量測在比較窗口或指定區内比較及比對 最大對應性時’若兩個序列具有特定百分比之松同胺基酸 殘基或核苷酸（亦即，特定區域内或（當未指定時）參考序列 之整個序列内 70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%序列一致性），則兩個序列"實質上 一致”。本發明提供分別與本文例示之多肽或聚核苷酸（例 如’ SEQ ID NO: 1-11中之任一者例示之可變區；SEq ID NO: 12-24中之任一者例示之可變區；seQ ID NO: 25-42中 之任一者例示之CDR; SEQ ID NO: 43-61中之任一者例示 之FR;及SEQ ID NO: 62-73中之任一者例示之核酸序列） 實質上一致的多肽或聚核苷酸。視情況而言，一致性存在 於參考序列之長度為至少約15、25或5〇個核苷酸之區域 内’或更佳地長度為100至500個或1〇〇〇個或更多核苷酸之 區域内’或參考序列之全長内。關於胺基酸序列，一致性 或實質一致性可存在於參考序列的長度至少為5、10、15 或20個胺基酸’長度視情況至少為約25、3〇、35、40、 5〇、75或1〇〇個胺基酸’長度視情況至少為約15〇、2〇〇或 137605.doc -29- 200936608 250個胺基酸之區域内或參考序列全長之區域内。關於較 短胺基酸序列（例如，具有2〇個或更少胺基酸之胺基酸序 列），當一或兩個胺基酸殘基根據本文所定義之保守取代 經保守取代時’存在實質一致性。 為進行序列比較，通常一序列充當比較測試序列的參考 序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸 入電腦中，指定子序列座標（若必要）且指定序列算法程式 參數。可使用預設程式參數或者可指定替代參數。隨後序 〇 列比較算法基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之 序列一致性百分比。 如本文所用之，，比較窗口，，包括提及毗連位置數選自由20 至600、一般約50至約200、更一般約1〇〇至約15〇組成之群 的任一者之區段，其中在最佳對準兩個序列之後可將序列 與具有相同毗連位置數之參考序列進行比較。用於比較之 序列之對準方法為此項技術中所熟知。可（例如）藉由smith 及 Waterman (1970) Mv. ΜαίΛ. 2:482c之局部同源性 ❹算法，藉由 Needleman 及 Wunsch (1970) */· Mo/·价〇/_ 48:443之同源性比對算法’藉由pearson及Lipman (1988)
Procr. jcrad Scz·· ί/α 85:2444之類似性搜尋方法，藉 由此等算法之電腦實施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr”
Madison，WI 中之 GAP、BESTFIT、FASTA及 TFASTA)，或 藉由手動對準及目測（例如參見Ausubel等人，
Proiocok ζ·« Mo/ecw/ar 和o/og_>； (1995增刊））來進行比較序 137605.doc -30- 200936608 列之最佳對準。 適於測定序列一致性及序列相似性百分比之算法的兩個 實例為BLAST及BLAST 2,0算法，其分別描述於八^此⑴等 人（1977) •心心义 25:3389-3402，及 Altschul 等人 (1990) 乂 Mo/.价〇/. 215:403-410 中。執行 BLAST 分析之軟 體經由國豕生物技術資訊中心（Nati〇nai Center for Biotechnology Information)為公眾可用。此算法包括首先 藉由鑑別查詢序列中長度W之短字組來鑑別高計分序列對 〇 (HSP) ’其在與資料庫序列中相同長度之字組對準時匹配 或滿足一些正值臨限計分T ^ T稱為鄰近字組計分臨限 (Altschul等人，上文）。此等初始鄰近字組採樣充當啟始搜 尋以發現含有其之較長HSP的種子。只要累積對準計分可 增加’則該等字組採樣沿各序列的兩個方向延伸。對於核 苷酸序列而言’使用參數M(—對匹配殘基之獎勵計分；始 終>0)及N(錯配殘基之罰分；始終<0)計算累積計分。對於 胺基酸序列而言’使用計分矩陣來計算累積計分。各方向 中之字組採樣的延伸可在以下狀況下暫停：累積對準計分 自其所達成之最大值減少量X;歸因於一或多個負計分殘 基對準之累積’累積計分變成零或零以下；或達到序列之 任一末端。BLAST算法參數w、T及X確定對準之靈敏性及 速度。BLASTN程式（對於核苷酸序列而言）使用字長（w)為 11、期望值（E)為10、M=5、N=-4及兩股之比較作為預設 值。對於胺基酸序列而言，BLASTP程式使用字長為3、及 期望值（E)為1〇，且BLOSUM62計分矩陣（參見Henikoff及 137605.doc -31 - 200936608
Henikoff (1989) 心"· 似.t/以 89:l〇915)對準 (B)為50、期望值（E)為l〇、m=5、N=-4及兩股之比較作為 預設值。 BLAST算法亦執行兩個序列之間相似性的統計分析（例
如參見 Karlin及 Altschul (1993) iVoc. iVai/· Jcad 5W. CASJ 90:5 873-5 787)。BLAST算法提供之一個相似性量測值為最 小和機率（P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間會 偶然發生匹配的機率指標。舉例而言，若測試核酸與參考 © 核酸之比較中最小和機率小於約0.2，更佳小於約〇.〇 1，且 最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。 兩個核酸序列或多肽實質上一致的指標為由第一核酸編 碼之多肽與針對由第二核酸編碼之多肽產生的抗體具有免 疫學交又反應性，如下所述。因此，舉例而言，若兩個狀 不同之處僅在於保守取代，則多肽通常與第二多肽實質上 一致。兩個核酸序列實質上一致的另一指#為如下所述兩 ㈣子或其互補序列在嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序 爿實質上-致的另-指標為可使用相同引子來擴增序列。 術語”連接"當在描述抗原結合區如何在本發明之TrkB結 合分子内連接之内容中使用時涵蓋用於使該等區物理結合 所有可倉b方式$個抗原結合區時常由諸如共價鍵（例 如’肽鍵或雙硫鍵）或非共價鍵（其可為直接鍵（亦即，兩個 抗原結合區之間無連接子)或間接鍵(亦即，在兩個或兩個 以上抗原結合區之間藉助於至少一個連接子分子））之化學 137605.doc -32- 200936608 術語"受檢者"、"患者"及"個體，，互換地指哺乳動物，例 如人類或非人類靈長類哺乳動物。哺乳動物亦可為實驗室 哺乳動物，例如小鼠、大鼠、家兔、倉鼠。在一些實施例 中’哺乳動物可為農業哺乳動物(例如，馬、綿羊、牛、 豬、絡銳）或家庭哺乳動物（例如，犬、猫）。 術扣療上可接受之量"或"治療有效劑量"互換地指足 以實現所要結果（亦即，使標靶細胞凋亡）之量。在一些實 包例中療上可接受之量不誘發或不引起非所要副作 © 。治療上可接受之量可藉由首先投予低劑量，且接著使 彼劑量以增量增加直至實現所要作用來確定。本發明之 TrkB促效抗體的"預防有效劑量"及"治療有效劑量"分別可 預防疾病症狀（例如，與異常低水準之TrkB信號傳輸有關 的病症症狀，例如由缺乏包括BDNF2TrkB配位體引起）發 作或使該等疾病症狀嚴重程度降低。該等術語亦可分別促 進或增加無疾病症狀時期之頻率及持續時間。"預防有效 劑$ "及”治療有效劑量"亦可分別預防或改善因由TrkB的 不充分活化引起的病症或疾病所導致的功能障礙或失能。 如本文所用，術語"呼吸病症"包括（但不限於）肺膨脹不 全、囊腫性纖維化、雷特氏症候群（RTT)、哮喘、呼吸暫 停（例如’睡眠呼吸暫停）、急性呼吸箸迫症候群（ARDS)、 慢性阻塞性肺病（C〇pd)、肺氣腫、急性呼吸困難、呼吸 急促、呼吸急促、類風濕性肺病、肺充血或水腫、慢性阻 塞性氣道疾病（例如’肺氣腫、慢性支氣管炎、支氣管哮 喘及支氣‘擴張）、換氣不足、匹克威克症候群（pickwickian 137605.doc -33- 200936608
Syndrome)、肥胖-換氣不足症候群、嬰兒猝死症候群 (SIDS)及高碳酸血症。此外，”呼吸病症"亦包括已知與遺 傳缺陷關聯之人類病狀，諸如恰克-馬利_杜斯氏症 (Chaixot-Marie-Tooth disease)、陳-施氏呼吸病症 Stokes breathing disorder)、威利-普拉德症候群（Wiui_ Prader syndrome)、嬰兒猝死症候群、先天性中樞性換氣 不足、彌漫性肺間質疾病（例如，肉狀瘤病、肺塵埃沈著 病、過敏性肺炎、細支氣管炎、古德巴斯德症候群 〇 (G〇odPasture’s syndrome)、特發性肺纖維化、特發性肺含 鐵血黃素沈著症、肺泡性蛋白沈積症、脫屑性間質性肺 炎、慢性間質性肺炎、纖維性肺泡炎、韓曼-理查症候群 (hamman-rich syndrome)、肺部嗜酸粒細胞增多症、彌漫 性肺間質纖維化、韋格納肉芽腫（Wegener，s granulomatosis)、淋巴瘤樣肉芽腫及類脂性肺炎）或腫瘤 (例如’支氣管癌、細支氣管肺泡癌、支氣管類癌、錯構 瘤及間葉細胞腫瘤）。 ® 【實施方式】 1.引言 本發明提供經改良之TrkB促效劑抗體。本發明之經改良 TrkB促效劑抗體與TrkB特異性結合且活化TrkB。發現本 發明之TrkB促效劑抗體可用於減輕、抑制及預防由TrkBM 效劑配位體缺乏（例如，BDNF缺乏）產生之病症及疾病之 症狀。可使用本發明之抗TrkB促效劑抗體治療之例示性疾 病包括雷特氏症候群、WAGR症候群、由MC4R突變引起 137605.doc -34- 200936608 之肥胖及惡病質/消痩症候群（例如，由於癌症、老化、飲 食病症或藥物導致）。亦發現抗TrkB促效劑抗體可用於降 低有需要之個體體内的血糖含量。此外，發現本發明之 TrkB促效劑抗體可用於防止體重增加。TrkB活化適用於預 防高血糖症及其有關病狀、肥胖、前驅糖尿病及II型糖尿 病。 2.經改良之抗TrkB抗體概述 本發明抗體與原肌球蛋白相關激酶（Trk)受體酪胺酸激酶 O B(TrkB)特異性結合。由此，抗體可與配位體結合位點結 合且阻斷天然配位體（例如，腦源性神經營養因子（Bdnf) 或神經營養素-3)之結合，起拮抗劑或促效劑作用。在一些 實施例中’本發明之抗TrkB抗體充當TrkB受體之促效劑。 TrkB抗體促效劑為特異性結合TrkB且活化或增強τ^Β介 導之胞内信號傳輸的抗體。抗TrkB抗體可視情況經多聚化 且根據本發明方法使用。抗TrkB抗體可為全長四聚抗體 (亦即，具有兩個輕鏈及兩個重鏈）、單鏈抗體（例如， ® ScFv)或包含形成一或多個抗原結合位點且賦予TrkB結合 特異性之抗體片段，例如包含重鏈及輕鏈可變區（例如， Fab’或其他類似片段）的分子。 抗TrkB抗體片段可藉由此項技術中已知的任何方式產 生，包括（但不限於）抗體四聚體之重組表現、化學合成及 酶促消化，而全長單株抗體可藉由（例如）融合瘤或重組製 造獲得。重組表現可來自此項技術中已知之任何適當宿主 細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵:宿主 I37605.doc •35· 200936608 細胞、昆蟲宿主細胞等。若存右，日丨丨、*上+ 右仔在，則適當時抗TrkB抗體之 值定區可為任何類型或亞型，且可經選擇以來自待由本發 明方法治療之個體物種（例如’人類、非人類靈長類或其 他哺乳動物，例如農業哺乳動物(例如，，…帛羊、牛、 豬、駱駝）、家庭哺乳動物（例如，犬、貓）或馨齒動物（例 如，大鼠、小氣、倉鼠、家兔））。
❹ 本發明之抗T r k B抗體或抗原結合分子亦包括具有駱駝骨 架的單域抗原結合單元。駱駝科之動物包括駱駝、美洲駝 及羊駝《駱駝科動物產生無輕鏈之功能性抗體。重鏈可變 (VH)域自主摺疊且獨立地充當抗原結合單元。與典型抗原 結合分子（Fab)或單鏈可變片段（seFv)中的6個（：1)11相比， 其結合表面僅包括3個CDR。駱駝抗體能夠實現與習知抗 體之彼等親和力相當的結合親和力。可使用此項技術中熟 知之方法製造具有本文例示之抗TrkB抗體之結合特異性的 基於路凝:骨架之抗TrkB分子，例如Dumoulin等人，Nature
Struct. Biol. 1 1:500-515，2002 ; Ghahroudi 等人，FEBS Letters 414:521-526，1997 ;及 Bond等人，J Mol Biol. 332:643-55, 2003 〇 本發明之經改良抗TrkB抗體為經基因工程設計之人類抗 體’該抗體之V區序列與人類生殖系V區序列具有實質胺 基酸序列一致性，同時保留參考抗體之特異性及親和力。 參見美國專利公開案第2005/0255552號及美國專利公開案 第2006/0134098號，其兩者皆以引用的方式併入本文中。 改良方法鑑別決定參考抗體可變區之抗原結合特異性所需 137605.doc -36· 200936608 的最小序列資訊，且將彼資訊轉移至人類部分v區基因序 列之文庫以產生人類抗體v區之集中於抗原決定基的文 庫。可使用基於微生物之分泌系統來表現呈抗體Fab片段 形式之文庫成員，且例如使用菌落轉移（colony_nft)結合檢 定針對抗原結合Fab來篩選文庫。例如參見美國專利公開 案第2007/0020685號。陽性純系可經進一步表徵以鑑別彼 等具有最高親和力者。所得經基因工程設計之人類Fab保 留親本參考抗TrkB抗體之結合特異性，其相較於親本抗體 © 通常具有相等或更高之抗原親和力，且其V區相較於人類 生殖系抗體V區具有高度序列一致性。 產生集中於抗原決定基之文庫所需的最小結合特異性決 定子（BSD)通常由重鏈CDR3("CDRH3")内的序列及CDR3之 輕鏈（"CDRL3")内的序列表示。BSD可包含CDR3之部分或 整個長度。BSD可包含毗連或非毗連胺基酸殘基。在一些 狀況下，集中於抗原決定基之文庫係由與來自含有Bsd之 參考抗體之唯一 CDR3-FR4區連接的人類v區段序列及人類 ◎. 生殖系J區#又序列建構（參見’圖1及美國專利公開案第 2005/0255552號）《>或者，人類v區段文庫可藉由連續序列 盒置換產生’其中僅部分參考抗體V區段起初由人類序列 文庫置換。支持剩餘參考抗體胺基酸序列情形中之結合的 經鑑別人類序列盒接著在第二文庫筛選中重組以產生完 全人類V區段（參見美國專利公開案第2006/0134098號）。 在各狀況中，使用成對重鏈及輕鏈CDR3區段、CDR3-FR4區段或J區段（含有來自參考抗體之特異性決定子）來約 137605.doc -37- 200936608 束結合特異性以便自文庫獲得之抗原結合子保留參考抗體 之抗原決定基特異性。在文庫建構期間可向各鏈之cDR3 區中引入其他成熟改變以鑑別具有最佳結合動力學之抗 體。所得經基因工程設計之人類抗體具有來源於人類生殖 系文庫之V區段序列，保留來自CDR3區内之短BSD序列且 具有人類生殖系框架4(FR4)區域。 因此在一些實施例中，抗TrkB抗體含有來源於起源或參 考單株抗體之重鏈及輕鏈之CDR3内的最小結合序列決定 〇 子（BSD)。重鏈及輕鏈可變區（CDR及FR)之剩餘序列（例如 V區段及J區段）係來自相應人類生殖系及親和力成熟胺基 酸序列。V區段可選自人類V區段文庫。可藉由親和力成 熟實現進一步序列改造。 在另一實施例中’抗TrkB抗體之重鍵及輕鏈含有來自相 應人類生殖系序列（FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)之人類V區 段（例如選自人類V區段文庫）及來自起源單株抗體之CDR3-FR4序列區段》CDR3-FR4序列區段可藉由以相應人類生殖 ® 系序列置換序列區段及/或藉由親和力成熟進一步改造。 舉例而言，可使圍繞BSD之FR4及/或CDR3序列經相應人 類生殖系序列置換，而保留來自起源單株抗體之CDR3的 BSD。 在一些實施例中，重鏈V區段之相應人類生殖系序列為 Vhl -02。在一些實施例中，重鏈J區段之相應人類生殖系 序列為JH4。在一些實施例中，重鏈J區段包含人類生殖系 JH4部分序列 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)。來自人類 137605.doc • 38 - 200936608 生殖系JH4之全長J區段為YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:74)。根據免疫球蛋白可變區基因之標準命名法引述可 變區基因。當前免疫球蛋白基因資訊可自萬維網獲得，例 如 ImMunoGeneTics(IMGT)、V-base 及 PubMed資料庫。亦 參見 Lefranc，Exp Clin Immunogenet. 2001; 1 8(2): 100- 16;Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001; 1 8(3): 1 61-74;£xp C7/« /mmwnogewei. 2001;18(4):242-54 ;及 Giudicelli等人， Nucleic Acids Res. 2005 年 1 月 1 日；33(Database 發 ❹ 行）:D256-61。 在一些實施例中，輕鏈V區段之相應人類生殖系序列為 VKII A23。在一些實施例中，輕鏈J區段之相應人類生殖 系序列為Jk2。在一些實施例中，輕鏈J區段包含人類生殖 系Jk2部分序列FGQGTKLEIK(SEQ ID NO:61)。來自人類 生殖系Jk2之全長J區段為YTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:75)。 在一些實施例中，重鏈V區段與胺基酸序列 ❿ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(G/A)Y(D/Y)
MHWVRQAPGQGLEWMGWI(D/N)P(N/R)SG(G/D)T(N/R/S) Y(A/K)QKFQGRVTMTRDTSISTAYMEL(H/S)RL(R/T)SDDT 八乂丫丫(：(入/>1)(〇/11)(8丑(^1〇^[〇:16)共有至少90%、93%、 95%、96%、97%、98%、99%或 100%序列一致性。在一些 實施例中，輕鏈V區段與胺基酸序列D(I/V)VMTQ(S/T) PLS(L/S)PVTLGQPASISCRSSQSL(L/V)HS(D/N)GNTYL(N/ S)W(L/Y)QQ(K/R/T)PGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSG 137605.doc ·39· 200936608 AGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:24)共有至少 90%、93%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序歹ij 一 致性。 在一些實施例中，重鏈V區段與選自由SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:15 組成之群 的胺基酸序列共有至少90%、93%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%序列一致性。 在一些實施例中，輕鏈V區段與選自由SEQ ID NO:17、 〇 SEQ ID ΝΟ:18、SEQ ID ΝΟ:19、SEQ ID ΝΟ:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23組成之群的胺基酸 序列共有至少 90%、93%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%序列一致性。 在一些實施例中： i) 重鏈CDR3包含胺基酸序列基元V(T/V)(S/T/R/N) WFAY(SEQ ID NO:34);且 ii) 輕鏈CDR3包含胺基酸序列基元（S/M)QGT(H/A) ❹ （E/V/I)PYT(SEQ ID NO:42)。 在一些實施例中： i) 重鏈 CDR3 包含選自由 VTTWFAY(SEQ ID NO:32)及 VTSWFAY(SEQIDNO:33)組成之群的胺基酸序列；且 ii) 輕鏈 CDR3 包含選自由 MQGTHEPYT(SEQ ID NO:40) 及MQGTHVPYT(SEQ IDNO:41)組成之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，該重鏈 可變區包含：包含胺基酸序列（A/G)Y(D/Y)MH(SEQ ID 137605.doc • 40- 200936608 NO:27)之 CDRl ;包含胺基酸序列 WI(D/N)P(N/R)SG(G/D) T(N/R/S)Y(A/K)QKFQG(SEQ ID NO:31)之 CDR2 ;及包含 胺基酸序列 V(T/V)(S/T/R/N)WFAY(SEQ ID NO:34)之 CDR3。 在一些實施例中，本發明之抗體包含輕鏈可變區，該輕 鏈可變區包含：包含胺基酸序列RSSQSL(L/V)HSNGNTYL (N/S)(SEQ ID NO:38)之 CDR1 ;包含胺基酸序列 KISNRFS (SEQ ID NO:39)之CDR2 ;及包含胺基酸序列（S/M)QGT © (H/A)(E/V/I)PYT(SEQ ID NO:42)之 CDR3。 在一些實施例中，重鏈可變區包含：包含胺基酸序列 SEQ ID NO:43之FR1 ;包含胺基酸序列SEQ ID NO:44之 FR2 ;包含胺基酸序列SEQ ID NO:49之FR3 ;及包含胺基 酸序列SEQ ID NO:50之FR4 »經鑑別胺基酸序列可具有一 或多個經取代胺基酸（例如，來自親和力成熟）或一或兩個 經保守取代之胺基酸。 在一些實施例中，輕鍵可變區包含：包含胺基酸序列 ❾ SEQ ID ΝΟ··55之FR1 ;包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之 FR2 ;包含胺基酸序列SEQ ID N〇:60之FR3 ;及包含胺基 酸序列SEQ ID NO:61之FR4。經鑑別胺基酸序列可具有一 或多個經取代胺基酸（例如，來自親和力成熟）或一或兩個 經保守取代之胺基酸。 在其全部長度上，本發明之抗TrkB抗體之可變區與相應 人類生殖系可變區胺基酸序列般將具有至少約90% ’例 如至少約 91%、92%、93%、94。/。、95%、96%、97%、 137605.doc -41 - 200936608 98%、99%或100%的整個可變區（例如’ fr1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)胺基酸序列一致性。舉例而言’抗 TrkB抗體之重鏈與人類生殖系可變區Vhl-02/JH4可共有至 少約 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或1 〇〇%胺基酸序列一致性。抗TrkB抗體之輕鏈與人類 生殖系可變區VKII A23/Jk2可共有至少約91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%胺基酸 序列一致性。在一些實施例中，僅添加、缺失或取代框架 © 區内之胺基酸。在一些實施例中，序列一致性比較排除 CD3 〇 在一些實施例中，本發明之抗TrkB抗體包含與SEQ ID NO:4之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、 94。/。、95%、96%、97%、98%、99%或 100%胺基酸序列一 致性的重鏈可變區且包含與SEQ ID NO: 11的輕鏈可變區具 有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。 © 在一些實施例中，本發明之抗TrkB抗體包含與選自由 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2 及 SEQ ID N0:3 組成之群的重 鏈可變區具有至少 90%、91%、92°/。、93°/。、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100°/。胺基酸序列一致性之重鏈 可變區，且包含與選自由SEQ ID NO:5、SEQ ID N0:6、 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 及 SEQ ID N0:10組成之群的輕鏈可變區具有至少90°/o、91%、92%、 930/。、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%胺基酸 137605.doc •42- 200936608 序列一致性的輕鏈可變區。 在一些實施例中，本發明之抗TrkB抗體包含與SEQ ID ΝΟ:1之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93〇/〇、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%胺基酸序列一 致性的重鏈可變區且包含與SEQ ID NO:8的輕鏈可變區具 有至少 90%、91〇/〇、92%、93%、94%、95%、96%、97% ' 98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區（亦即， 純系 LFC325)。
〇 在一些實施例中，本發明之抗TrkB抗體包含與SEQ ID NO: 1之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%胺基酸序列一 致性的重鏈可變區且包含與SEQ ID NO:9的輕鏈可變區具 有至少 90%、91% ' 92%、93%、94% ' 95% ' 96°/〇、97%、 98°/。、99%或100°/。胺基酸序列一致性的輕鏈可變區（亦即， 純系 LFC327)。 在一些實施例中，本發明之抗TrkB抗體包含與SEQ ID 〇 NO: 1之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%胺基酸序列一 致性的重鏈可變區且包含與SEQ ID NO: 10的輕鏈可變區具 有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區（亦即純 系 LFD253)。 在一些實施例中，本發明之抗TrkB抗體包含與SEQ ID NO:3之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、 137605.doc -43- 200936608 94%、95%、96%、97%、98%、99°/。或 100%胺基酸序列一 致性的重鍵可變區且包含與SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區具 有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鍵可變區（亦即純 系 LFD254)。 對於長度小於20個胺基酸之經鑑別之胺基酸序列而言， 可容許一或兩個保守性胺基酸殘基取代，同時仍保留所要 特異性結合及/或拮抗劑活性。 〇 本發明之抗TrkB抗體一般將以小於約1(Γ8或ΙΟ'9 Μ，例 如小於約ΙΟ-10 Μ或10·11 Μ，在一些實施例中，小於約1〇·12 Μ或10·13 Μ之平衡解離常數（KD)結合TrkB。 3.鑑別TrkB促效劑抗«之檢定 促效劑抗體可藉由產生抗TrkB抗體，接著測試各抗體觸 發TrkB介導事件的能力（例如啟始SH-SY5Y細胞之分化及/ 或分枝），測量對於細胞以潛在TrkB促效劑處理反應而援 救之失巢凋亡（anoikis)(由喪失細胞-基質相互作用所引起 〇 之細胞凋亡），或使用BaF3/TrkB細胞增殖檢定來鑑別。 SH-SY5Y檢定涉及塗鋪SH-SY5Y細胞，及細胞以視黃酸 (具有或不具有潛在促效劑抗體及/或BDNF)處理，隨後測 量神經突贅生物。一般而言，單獨視黃酸將誘發少量神經 突贅生·物。單獨BDNF應不誘發顯著神經突贅生物且單獨 抗體應不誘發顯著神經突贅生物。然而，以視黃酸、 BDNF及抗體處理之細胞應展現廣泛神經突贅生物。一種 例示性SH-SY5Y檢定描述於Kaplan DR等人，iVewrow 11: 137605.doc -44- 200936608 321-331 (1993)中。在測試抗TrkB促效劑抗體之檢定中， BDNF以測試抗體置換。陽性對照細胞暴露於BDNF。
BaF3造血細胞/TrkB細胞增殖檢定涉及量測由TrkB受體 之促效作用刺激的細胞增殖。舉例而言，使BaF3細胞生長 於具有IL-3之完全RPMI培養基中且以表現TrkB之逆轉錄 病毒感染。將細胞於不存在IL-3之狀況下洗滌且塗盤。在 適當培育後量測潛在促效劑抗體及細胞存活（例示，使用 發光細胞成活力偵測試劑，諸如Cell-Titer GloTM)。將陽性 ❹ 對照細胞以BDNF培育。 失巢凋亡檢定涉及再懸浮大鼠腸上皮（RIE)/TrkB細胞（例 如，在DMEM培養基中）且視情況在多孔容器中使細胞與 潛在抗體促效劑（例如，2.5 X 104個細胞10 μΐ 1-20 pg/ml抗 體）接觸。將混合物於存在或不存在BDNF對照之狀況下培 育且接著量測細胞成活力（例如，使用發光細胞成活力偵 測試劑，諸如Cell-Titer GloTM)。一例示性失巢凋亡檢定描 述於 Douma等人，iVaiwre 430:1034-1039(2004)中。 ® 亦可對SH-SY5Y細胞評估TrkB促效劑保護細胞免於長春 鹼（vinblastine)及順鉑（cisplatin)毒性之能力。此檢定已描 述於（例如）Scala 等人，Cawcer iJej. 56(16):3737-42 (1996);及 Jaboin 等人，62(22):6756-63 (2〇〇2) 中。 4.使用抗TrkB促效劑抗艟之方法 本發明之抗TrkB促效劑抗體可用於治療或改善受益於 TrkB活性增加的任何疾病或病況，包括呼吸道病症及疾 137605.doc -45- 200936608 病，尤其由TrkB信號傳輸不足引起之彼等病症及疾病；由 BDNF功能不全引起之病症及疾病；及由TrkB信號傳輸不 足引起之腸道蠕動下降疾病（例如，發炎性腸症候群）。 本發明之TrkB促效劑抗體與TrkB相互作用且由此能夠調 節TrkB功能。本發明之TrkB促效抗體可調節（例如，促 進）TrkB的一或多種生物功能。舉例而言，TrkB促效劑抗 體可調節TrkB之二聚化，且隨後使TrkB胞内域上之特定酪 胺酸殘基自體磷酸化。作為另一實例，TrkB促效劑抗體可 〇 啟始TrkB相關胞内信號傳輸級聯（例如，有絲分裂原活化 之蛋白激酶、磷脂醯肌醇3激酶及PLCy路徑），該等級聯產 生抑制神經元死亡、促進神經突贅生物及神經營養素之其 他作用。 在一些實施例中，本文所述之TrkB促效劑抗體充當 BDNF模擬物，且可用於重演BDNF及其他TrkB促效劑配位 體之營養活性，藉此發揮神經保護及神經營養作用。本發 明方法之抗TrkB促效劑抗體可與BDNF競爭結合TrkB，且 ® 藉此活化、增強或延長TrkB路徑活化及信號傳輸。在一些 實施例中，該等TrkB促效劑抗體與TrkB配位體結合域結 合，藉此與BDNF競爭結合TrkB。 因此，TrkB促效劑抗體可用於促進活體外及活體内TrkB 路徑信號傳輸。發現本發明之TrkB促效劑抗體可用於（例 如）診斷、抑制、預防、改善與異常低水準之TrkB路徑信 號傳輸有關之病症（例如，由於患病個體體内BDNF功能不 全或另一 TrkB促效劑配位體功能不全引起）的症狀、對該 137605.doc -46- 200936608 等病症進行保護及治療。病症之非限制性實例與以下病症 有關：TrkB信號傳輸異常下調（例如，包括雷特氏症候群 (RTT))，其特徵在於編碼MeCP2(其與BDNF直接結合）之基 因突變；由TrkB功能喪失突變引起之嚴重肥胖及發育遲緩 (Giles，S 等人（2004) Nature Neuroscience 7:1187-9)、威爾 姆氏腫瘤、無虹膜、泌尿生殖器異常及智力發育遲滯 (WAGR)症候群（Han 等人，iV 五ng/ Med (2008) 359(9): 918-27)、由黑色素皮質素受體MC4R缺乏引起之肥胖 ❹ （Farooqi 及 O'Rahilly，(2006) 27(7):710-18)、惡病質/肌肉萎縮症候群（Lin等人，尸/o<S，3(4):el900; WO 2007/088476)。 本發明因此提供治療、診斷、預防及/或改善由BDNF缺 乏引起之病症及疾病（例如，雷特氏症候群（RTT)、WAGR 症候群、由黑色素皮質素受體MC4R缺乏引起之肥胖、惡 病質/肌肉萎縮症候群）之方法，該方法包含投予包含治療 或預防有效量之本文所述之TrkB促效劑抗體及醫藥載劑之 ® 醫藥組合物。在一些實施例中，本文所述之抗TrkB抗體係 經全身或周邊（例如，經口、吸入、靜脈内或腹膜内）投 〇 亦發現本文所述之抗TrkB抗體可用於治療、診斷、預防 及/或改善呼吸疾病及病症，尤其由TrkB活性不足引起之 彼等疾病及病症。例示性呼吸病症包括雷特氏症候群、睡 眠呼吸暫停、匹克威克症候群及本文所述之其他病症。 在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含用於治療、診 137605.doc -47· 200936608 斷、預防及/或改善呼吸窘迫（例如’呼吸困難）之症狀的單 獨及獨立藥劑’諸如去甲腎上腺素及/或血清素路徑之小 分子活化劑（實例包括（但不限於）三環抗抑鬱劑地昔帕明 (DMI)、血清素1Λ受體部分促效劑、丁螺環嗣及更具選擇 性之抗抑鬱劑氟西汀及瑞波西汀）、麩胺酸能AMPA受體之 活化劑（例如AMPAkine CX546)、前列腺素、孕酮或TrkB 活性之增效劑（例如，蛋白酪胺酸磷酸酯酶抑制劑）。
在一些實施例中’與TrkB之抗體促效劑（或含有其之醫 Ο 藥組合物）組合向個體投予有效治療、診斷、預防及/或改 善呼吸障礙或呼吸窘迫之症狀的治療及/或預防有效量之 第二試劑。在一些實施例中，第二藥劑及TrkB之抗體促效 劑（或含有其之醫藥組合物）係以混合物形式投予β在一些 實施例中，第二藥劑係選自由去甲腎上腺素及/或血清素 路徑之小分子活化劑（實例包括三環抗抑鬱劑地昔帕明 (DMI)、血清素1Α受體部分促效劑、丁螺環嗣及更具選擇 性之抗抑鬱劑氟西汀及瑞波西汀）、麩胺酸能ampa受體之 ^ 活化劑（例如AMPAkine CX546)、前列腺素、孕酮或TrkB 活性之增效劑（例如，蛋白酪胺酸磷酸酯酶抑制劑）組成之 群。 本發明亦提供治療、診斷、預防及/或改善由缺乏TrkB 胞内信號傳輸引起的呼吸窘迫或呼吸病症之症狀的方法， 該方法包含投予抗TrkB促效抗體或包含其之醫藥組合物。 該等症狀包括（但不限於）呼吸困難（例如，喘鳴或喘息、屏 氣、呼吸微弱、換氣過度、持續呼吸暫停）、血液氧合作 137605.doc -48- 200936608 用不良或降低（例如，青紫，例如由氧吸收受損、肺部ix 液不充分灌注等所引起）、去甲腎上腺素（NE)含量降低、 骨髓中表現絡胺酸經化酶（TH)之神經元減少及胸痛。在一 些實施例中’該等方法包含向個體投予治療或預防有效量 之如本文所述之酪胺酸激酶受體B(TrkB)的抗體促效劑。 在一些實施例中，該等方法包含向個體投予醫藥組合物， 該組合物包含治療或預防有效量之TrkB促效抗體及醫藥載 劑。在一些實施例中，個體患有雷特氏症候群及/或經歷 © 一或多種呼吸窘迫症狀。在一些實施例中，個體有呼吸窘 迫症狀之傾向。 在一些實施例中，使用本發明之TrkB促效劑抗體來治療 或緩解個體體内之高血糖症及/或糖尿病或其症狀。或 者，或以組合形式，本發明抗體可用於減輕有需要之個體 的體重。在一些實施例中’使用抗體來緩解肥胖。因為肥 胖個體更易患胰島素抵抗及II型糖尿病，所以此尤其適 用。 ® 本發明提供抑制神經細胞死亡之方法，其包含投予如本 文所述之TrkB促效抗體（或包含其之醫藥組合物）^舉例而 吕’本發明亦提供藉由向有需要之個體投予本發明之TrkB 促效劑抗體來治療或預防神經退化性或中樞神經系統 (CNS)疾病之方法。例示性CNS疾病包括（例如）阿兹海默氏 症（Alzheimer’s diseases)、帕金森氏症（Parkins〇n，s diseases)、亨廷頓氏症（Huntington's diseases)或 ALS 疾 病。 137605.doc -49- 200936608 增加TrkB活化亦參與緩解物質濫用》例如參見美國專利 公開案第2005/020301 1號。因此，本發明提供緩解物質（例 如，酒精、菸鹼及/或麻醉劑）濫用之方法且該方法依賴於 向有需要之個體投予本發明之TrkB促效劑抗體。 在一些實施例中，抗體為人源化抗體。在一些實施例 中，抗體為單鍵抗體。在一些實施例中，抗體不與酪胺酸 激酶受體A或酪胺酸激酶受體C結合。在一些實施例中， 抗體不與神經營養素受體p75NR結合。在一些實施例中， 〇 抗體與人類TrkB特異性結合，與其他物種之TrkB(例如， 非人類靈長類動物或小鼠TrkB)最小限度結合或不結合。 在一些實施例中’抗體與人類TrkB特異性結合且亦與其他 物種之TrkB結合（亦即’與其他物種之TrkB交叉反應，包 括小鼠、大鼠及/或非人類靈長類動物（例如，食蟹猴或摘 猴））。 5.醫藥组合物 本發明提供包含與醫藥學上可接受之載劑一起調配之抗 〇 TrkB抗體或抗原結合分子的醫藥組合物。組合物可另外含 有適於治療或預防指定病症之其他治療劑。醫藥學上之載 劑增強組合物或使組合物穩定或有助於組合物之製備。醫 藥學上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、 衣料、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似 物。 本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中已知的各種方法 投予。投藥之途徑及/或模式視所要結果而變化。投藥較 137605.doc -50- 200936608 :::::内、肌肉内、腹臈内或皮下方式，或接近於標乾 :醫藥學上可接受之载劑應適於靜脈内'肌肉 如、二下、非經腸、鼻内、吸入、脊椎或表皮投藥(例 二由=輸液)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦 =、雙特異性及多特異性分子）可以材料塗覆以保護 化5物不受酸及其它可使化合物失活之天然條件作用。 ❹
可將抗體單獨地或與其它合適組㈣合製錢溶勝調配 物（亦即其可”經霧化”）以經由吸人投藥。氣溶膠調配物可 置入經加壓之可接受推進劑中，諸如二氣二氣甲燒、丙 烷、氮氣及其類似物。 在一些實施例中’組合物無菌且為液體。可（例如）藉由 使用諸如㈣脂之衣料，在分散液狀況下藉由維持所要粒 徑且藉由使用界面活性劑來保持適#流動性。在許多情況 下，較佳在組合物中包括等張劑，例如糖、諸如甘露糖醇 或山梨糖醇之多元醇及氣化納。可藉由將延遲吸收之藥劑 (例如單硬脂酸銘或明膠)納入組合物中而達成可注射組合 物之長期吸收。 可根據此項技術中熟知且f規實施之方法製備本發明之 醫藥組合物。醫藥學上可接受之載劑部分由所投予之特定 組合物以及用於投予組合物之特定方法決定。因此，存在 多種本發明醫藥組合物之合適調配物。調配抗體及判斷適 當劑量及時程之合適方法可見於（例如⑽⑽ w 0/ 仏削㈣，第 21 版 ’ 2〇〇5,
LiPPencott Williams & WUkins (2006);及施州._/6, ^ 137605.doc 200936608
Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press.，及 Martindale, 7V?e •Ejcira P/zarmaco/Joei’a，第 31版，1996，Amer Pharmaceutical Assn，及 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson編，Marcel Dekker，Inc.，New York， 1978中，其各自以引用的方式併入本文中。醫藥組合物較 佳在GMP條件下製造。通常，本發明之醫藥組合物中採用 治療有效劑量之抗TrkB抗體。藉由彼等熟習此項技術者已 © 知之習知方法將抗TrkB抗體調配為醫藥學上可接受之劑 型。調整劑量方案以提供所要反應（例如，治療反應）。為 確定治療或預防有效劑量，可投予低劑量且接著以增量增 加直至達成所要反應而非所要副作用最小或無。舉例而 言，可單次團式投予，可分若干次劑量隨時間投予，或依 治療情況之緊急需要指示，可按比例減少或增加劑量。將 非經腸組合物調配為易於投予且劑量均一之單位劑型尤其 有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於 ® 待治療個體的物理離散單元；各單元含有經計算以產生所 要治療作用之預定量的活性化合物以及所要醫藥載劑。 可改變本發明醫藥組合物中之活性成份的實際劑量水準 以便獲得在對患者無毒性之狀況下有效實現針對特定患 者、組合物及投藥模式的所要治療反應的活性成份之量。 所選劑量水準視多種藥物動力學因素而定，該等藥物動力 學因素包括本發明所採用之特定組合物或其酯、鹽或醯胺 之活性、投藥途徑、投藥時間、所採用之特定化合物的排 137605.doc -52- 200936608 泄速率：治療持續時間、與所採用之特定組合物組合使用 之其它藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性 別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史及其類似因 ❹ 醫師或獸醫可使用低於實現所需治療作用所需之水準開 始以醫藥組合物形式採用之本發明抗體的給藥，且逐步增 加劑量直至實現所要作用。一般而言，本發明組合物之有 效劑量視許多不同因素而變化，包括待治療之特定疾病或 病狀、投藥方式、標靶部位、患者之生理狀態、患者為人 類或為動物、所投予之其他藥物及治療為預防性或為治療 性治療。需要滴n療劑量以使安全性及功效最佳。對於 抗體投藥而言，劑量範圍為約0.0001至100毫克/公斤宿主 體重’且更一般為001至5毫克/公斤宿主體重。舉例而 吕，劑量可為1毫克/公斤體重或1〇毫克/公斤體重或在卜1〇 毫克/公斤體重範圍内。一例示性治療方案限定每兩週一 次或每月一次或每3至6個月一次投藥。 在藥劑為核酸之實施例中，典型劑量可在約01毫克/公 斤體重至（且包括）約100毫克/公斤體重的範圍内例如， 介於約1毫克/公斤體重至約50毫克/公斤體重之間。在一些 毫克/公斤體重。 抗體可以單次劑量或分次劑量形式投予。抗體一般多次 投予。單次劑量之間的時間間隔可為每週、每月或每年。 時間間隔亦可如藉由量測患者體内抗丁1^3抗體之血液含量 137605.doc -53- 200936608 所心明為不定期的〇右—此士、i i 在 二方法中，調整劑量以獲得j _ 1_ 之血漿抗體濃度且在_些方法中獲得25 3〇〇
咖之血漿抗體濃度。或者，抗體可以持續釋放調配物 $式投予在該狀況下’需要頻率較低之投藥。劑量及頻 率視抗體在患者體内之半衰期而變化…般而纟，人源化 抗體顯示比嵌合抗體及非人類抗體長的半衰期4藥之劑 量及頻率可視治療為預防性抑或治療性治療而變化。在預 防I·生應用中，歷經長時期以相對不頻繁之時間間隔投予相 對低之劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療 性應用中，有時需要以相對短的時間間隔投予相對高劑量 直至疾病進展降低或終止，且較佳直至患者顯示疾病症狀 之部分或完全改善。其後，可向患者投予預防性方案。
TrkB抗體促效劑可與已知有益於減輕體重、降低血糖含 量、冶療糖尿病或緩解糖尿病症狀、治療神經退化性疾病 或減輕物質濫用之藥劑組合使用。用於治療糖尿病之例示 性藥劑包括（例如）胰島素；磺醯脲（例如，格列吡嗪 (Glipizide)及瑪爾胰（Amaryl))及胰島素促泌劑（例如，那格 列奈（nateglinide)及諾和隆·（repagiinide));二甲雙胍； PPARy促效劑（例如，梵帝雅（rosigiitizone)及吼格列嗣 (pioglitazone))以及 PPARa、PPAR5、PPARa/γ雙重促效劑 及PPARa/γ/δ全促效劑；a-葡糖苷酶抑制劑（例如，阿卡波 糖（Acarbose)) ; DPP-IV抑制劑（例如，維格列汀 (vildagliptin));及GLP-1/GLP-1類似物（例如，艾塞那狀 (exenatide))。用於治療肥胖之例示性藥劑包括（例如）脂肪 137605.doc -54- 200936608 酶抑制劑（例如’羅氏鮮（Odistat));諾美蟀；CB」抑制劑 (例如，利莫那班（rimonabant));托吡酯 乂汀/义汀類似 勿（例如’普蘭林肽（pramlintide))、瘦素、ργγ/ργγ類似 物；及GUM/glp]類似物（例如，艾塞那肽（exenatide))。 活性劑可與TrkB促效劑抗體一起以混合物形式投予或可 各自單獨投予。抗艎藥劑與其他活性劑可（但不必）同時投 予。 實例 ❹ 提供以下實例來說明但並非限制所主張之本發明。 實例1 : 以下實例提供與人類生殖系V區序列具有實質胺基酸序 列一致性之抗TrkB抗體的建構及筛選。 方法 v區之次選殖 自起源單株抗體A10F 18.2次選殖V區《使用pcR來擴增v 重及V-κ區之V基因且併入適於選殖入表現載體中之限制酶 ^ 位點。v區以Fab片段形式選殖且自表現載體表現於大腸桿 菌（五.co//)中。測試參考Fab之TrkB抗原結合且將其稱為 TR3 1 〇 亦將V區選殖入IgG表現載體中。使用PCR擴増及具有附 加限制位點之引子，將Vh區擴增且選殖入含有人類1§(31怪 定區且賦予安比西林（ampicillan)及新黴素（neomycin)抗性 之表現載體中。使用PCR擴增及具有附加限制位點之引 子’將Vk區擴增且選殖入含有人類κ恆定區且賦予安比西 137605.doc 55- 200936608 林及潮黴素（hygromycin)抗性之表現載體中。將此等載體 以各種組合測試以產生全IgG組以供功能分析。 抗體純化 藉由使用表現載體自大腸桿菌分泌來表現Fab片段。使 細胞在2xYT培養基中生長至OD600為0.6。在33°C下使用 IPTG誘導表現歷時3小時。自周質部分獲得經組裝之Fab且 根據標準方法藉由使用鏈球菌（Streptococcal)蛋白G之親和 力層析法（HiTrap蛋白G HP管柱；GE Healthcare)將其純 〇 化。將Fab溶離於pH 2.0緩衝液中，立即調整至pH 7.0且以 PBS pH 7.4透析（PBS不含鈣及鎂）。 自經瞬時轉染之CHO細胞的培養基（無血清）製備IgG。 根據標準方法藉由使用蛋白A之親和力層析法（HiTrap蛋白 A HP管柱；GE Healthcare)純化 IgG。將 Fab 溶離於 pH 2.7 緩衝液中，立即調整至pH 7.0且以PBS pH 7.4透析（PBS不 含鈣及鎂）。
一般性ELISA 〇 藉由在4°c下培育隔夜使1〇〇 ng重組Fc-TrkB抗原與96孔 微量滴定盤結合。在33°C下將培養盤以5%牛奶於PBS-Tween("PBST”）中之溶液阻斷1小時。將經純化Fab稀釋於 PBS中且向各孔中添加50 μΐ。在33°C下培育1 h後，將培養 盤以PBST沖洗3次。向各孔中添加50 μΐ抗人類κ鏈HRP共 軛物（Sigma ;在PBST中稀釋至0.1 ng/ml)且將培養盤在 33°C下培育40 min。將培養盤以PBST洗滌3次且以PBS洗 滌1次。向各孔中添加100 μΐ 3,3'，5,5'-四甲基聯苯胺 137605.doc •56- 200936608 ("TMB”）受質（Sigma)且將培養盤在室溫下培育約5 min。向 各孔中添加100 μΐ 0.2 N H2S04使反應停止。在45 0 nm下在 分光光度計中讀取培養盤。
阻斷ELISA 將ELISA培養盤以100 ng Fc-TrkB抗原塗覆。將 A10F18.2 IgG之2倍連續稀釋液在室溫下以抗原培育1 h。 洗去未結合之IgG且向各孔中添加50 nM Fab溶液且在室溫 下培育1 h。洗去未結合之Fab且以抗人類κ-HRP共輛物偵 〇 測經結合之F ab。 菌落轉移結合檢定（"CLBA”) 基本上如所述（美國專利公開案第2005/0255552號及第 2006/0134098號）使用抗原Fc-TrkB塗覆之硝化纖維素過濾 器進行Fab片段之文庫筛選。 使用ForteBio之親和力量測 使用ForteBio Octet生物感測器分析IgG與Fab片段之結合 動力學。根據製造商方法使用EZ-link生物素化套組 〇 (Pierce)使重組Fc-TrkB抗原經生物素標記。接著使抗原與 抗生蛋白鏈菌素塗覆之感測器（ForteBio)偶合。使用生物 層干涉量測分析及製造商提供之軟體實時監測Fab結合。 由測定之締合及解離常數計算親和力。 使用Biacore之親和力量測 所有Biacore試劑係購自Biacore，其為GE Healthcare (Piscataway，NJ)的部門。藉由使用光學生物感測器Biacore S5 1之表面電漿共振量測進行動力學結合參數之測定。此 137605.doc -57- 200936608 技術允許無標記測定配位體與受體結合（ka)及解離（kd)的 微觀速率常數。其因此尤其適於表徵抗體-抗原相互反 應。 藉由將Fc-hTrkB固定於S系列CM-5 Biacore感應晶片（經 認證）（Biacore # BR-1005-30)上進行經改良抗體之結合研 究。以"胺偶合套組"（Biacore # BR-1000-50)進行Fc融合蛋 白之共價結合。於10 mM乙酸納，pH 4.5(Biacore # BR-1003-50)中以5 pg/ml以10 pL/min之流動速率使Fc融合蛋 〇 白連接於於經EDC活化之葡聚糖表面。 於 PBS+100 mM NaCl，0.005 % P20(Biacore # BR-1000-54)中使一定濃度範圍之經改良抗體流經Fc-TrkB捕獲晶 片。使用Biacore S5 1評估軟體分析所得感應譜。將所有濃 度之資料全面擬合為1:1朗谬爾模型（Langmuir model)。 失巢凋亡檢定 在失巢凋亡檢定中使用大鼠腸上皮（RIE)-TrkB細胞。使 用 Accutase(Innovative Cell Technologies Inc., San Diego, © C A)使RIE/TrkB細胞分離且再懸浮於完全DMEM培養基
中。將細胞以無清DMEM洗滌3次，且再懸浮於自2% BSA於PBS中之儲備液稀釋的含有0.1% BSA之無血清 DMEM中（細胞培養級，# A8806-5G Sigma)。接著將細胞 以每毫升4.2 X 105個細胞每孔60 ml(=2.5 X 104個細胞/孔） 塗鋪於96孔Corning Costar超低叢集培養盤（Costar # 3474) 中。將10 ml TrkB促效劑抗體（於PBS中之儲備液）添加至測 試孔中直至最終濃度介於1-20 gg/mL之間。將細胞在37°C 137605.doc -58- 200936608 下培育 1 h。將 10 ml人類 BDNF(R&D，於 0.1% BSA/PBS 中 之儲備液20 mg/mL)添加至對照孔中直至最終濃度介於10-50 ng/mL之間。將BDNF 以DMEM(SF)/0.1%BSA稀釋。接 者將細胞再培育24-48 h。每孔添加80 ml Cell-Titer Glo(Promega，Madison，WI)且使培養盤經受溫和振盪。15 min後’將液體轉移至96孔白色透明底培養盤中且讀取發 光。 結果 O v區之選殖及表現
Fab TR3_1具有來自起源抗體A10F18.2之完整V區，與人 類怪疋區融合且自大腸桿菌純化。在TrkB抗原結合的稀釋 ELISA測試中，經選殖之Fab產生與抗體濃度相關之結合 曲線（資料未圖示）。 文庫建構及V區序列盒 集中於抗原決定基之文庫係由與來自含有結合特異性決 定子（"BSD”）之起源抗體之唯一 CDR3_FR4區連接之人類v ® 區段文庫序列及人類生殖系j區段序列建構。此等"全長" 文庫用作建構"序列盒"文庫之基礎，其中初始僅起源抗體 之部分V區段經人類序列之文庫置換。建構兩種類型之序 列盒。V重鏈及V-κ鏈兩者之序列盒係藉由在框架2區内具 有重疊常見序列之橋式PCR製成。以此方式，針對人類v 重鏈1及V-κ II同型建構”前端”及”中部,,人類序列盒文庫。 支持與TrkB抗原之結合的人類序列盒藉由菌落轉移結合檢 疋鑑別且根據於ELIS A及Forte分析中之親和力排序。接著 137605.doc -59- 200936608 將最高親和力序列盒之池在第二文庫篩選中重組以產生完 全人類v區段。 在鑑別具有人類V區段之高親和力Fab池之後，建成親和 力成熟文庫。使用簡幷PCR引子使具有人類V區段之Fab純 系組的常見BSD序列突變以產生文庫。使用菌落轉移結合 檢定篩選此等誘變文庫。以ELISA及Forte分析關於親和力 將所選Fab排序。鑑別出相較於參考TR3-1 Fab支持抗原之 類似或改良親和力之突變。 〇 此外，在具有人類V區段之各Fab的輕鏈之CDR3中進行 人類生殖系之點突變。位置89(Chothia編號）由S變為Μ， 所有人類生殖系Vkll區段均在彼位置編碼該胺基酸。 使用Forte Octet分析檢定具有人類V區段之Fab及IgG對 人類TrkB抗原之親和力 將具有人類V區段之Fab自菌落轉移結合檢定分離且由抗 原結合ELISA確認。將在抗原結合ELISA中顯示強陽性信 號之Fab純系純化且藉由與參考Fab TR3-1之動力學比較進 〇 一步表徵。對於蛋白質-蛋白質相互作用之實時無標記監 測使用ForteBio Octet系統分析結合動力學。代表性動力學 分析展示於圖3中。所計算出之締合及解離常數展示於表1 及2中。 137605.doc -60- 200936608 表1
Fab 莫耳濃度 [Ml Kd il/sl Ka [1/Msl KD [Ml TR-3-1 IE-7 6.61E-3 1.96E5 3.37E-8 TR135-8(SEQIDNO:l 及 6) IE-7 4.39E-3 1.36E5 3.23E-8 TR139-2(SEQ ID ΝΟ:1 及 7) IE-7 3.17E-3 2.11E5 1.51E-8 TR144-1(SEQ ID NO:3及6) IE-7 3.92E-3 1.26E5 3.11E-8 TR151-l(SEQIDNO:2 及 7) IE-7 3.95E-3 2.13E5 1.86E-8 TR3-1 IE-7 6.90E-3 1.41E5 4.89E-8 Q 表1概述藉由生物層干涉量測法使用ForteBio Octet生物 感測器技術對與重組TrkB抗原之Fab結合之分析，展示締 合常數（Ka)、解離常數（Kd)及所計算出之親和力（KD)。 表2
Fab 莫耳濃度 『Ml Kd il/sl Ka fl/Msl KD [Ml TR3 IE-7 7.88E-3 2.80E5 2.82E-8 TR134-4(SEQ ID NO:l 及5) IE-7 4.22E-3 1.18E5 3.56E-8 TR135-8(SEQIDNO:l 及 6) IE-7 4.58E-3 1.44E5 3.19E-8 TR139-2(SEQ ID NO:l 及7) IE-7 3.34E-3 2.35E5 1.42E-8 TR144-1(SEQ ID N0:3及6) IE-7 3.66E-3 1.23E5 2.97E-8
表2概述藉由生物層干涉量測法使用ForteBio Octet生物 感測器技術對與重組TrkB抗原之Fab結合的分析，展示締 合常數（Ka)、解離常數（Kd)及所計算出之親和力（KD)。 對 Fab 純系 TR134-4、TR135-8、TR139-2、TR151-1 及 TR144-1及參考純系TR3-1之動力學分析均顯示對TrkB抗 原具有低奈莫耳濃度親和力。純系TR139-2及TR151-1相較 137605.doc -61 - 200936608 於參考對照一致具有經改良之解離速率（off-rate)(Kd)及較 高總體親和力。TR144-1、TR135-8及TR134-4相較於參考 對照一致具有大致相同之總體親和力。 具有人類V區段之IgG亦由CHO細胞之瞬時轉染製備。將 IgG製劑純化且藉由與參考IgG A10F18.2的動力學比較進 一步表徵。對於蛋白質-蛋白質相互作用之實時無標記監 測使用ForteBio Octet系統分析具有人類V區段之兩種IgG 的結合動力學。代表性動力學分析展示於圖4中。所計算 〇 出之締合及解離常數展示於表3中。結果表明具有人類V區 段之IgG以等於參考A1 OF 18.2 IgG之親和力結合抗原。 表3
IgG 莫耳濃度 [Ml Kd fl/sl Ka fl/Msl KD fMl A10F18.2 IgG IE-8 1.44E-5 3.79E5 3.79E-11 TR127Vh&TR119Vk (SEQIDN0:1 及 8) IE-8 1.52E-5 4.53E5 3.35E-11 TR127Vh 及 TR129Vk (SEQIDNO:l 及 9) IE-8 7.90E-6 4.01E5 1.97E-11 A10F18.2 IgG IE-8 1.89E-5 3.96E5 4.77E-11 表3概述藉由生物層干涉量測法使用ForteBio Octet生物 感測器技術對與重組TrkB抗原之IgG結合的分析，展示締 合常數（Ka)、解離常數（Kd)及所計算出之親和力（KD)。 與人類生殖系序列之一致性百分比 使V區經PCR擴增，以限制酶消化且選殖入IgG表現載體 中。使來自TR134-4、TR144-1及TR144-1之重鏈經PCR擴 137605.doc -62- 200936608 增且以Sail及Nhel消化；將所得片段分別選殖入含有人類 IgGl恆定區之表現載體中以產生TR127、TR143及TR154。 使來自TR134-4、TR135-8及TR139-2之輕鏈經PCR擴增且 以BssHII及BsiWI消化；將所得片段分別選殖入含有人類κ 恆定區之表現載體中以產生TR1 19、TR129及TR137。由 DNA定序確認插入物之一致性及完整性。 表4
IgG載體組合 Fab型式 與Vhl-02之 一致性％11 與 Vkll A23 之一 致性％ TR127 Vh及TR119 Vk (LFC325) (SEQIDNO:l 及 8) TR134-4 (SEQIDNO:l 及 5) 94% 94% TR127 Vh及TR129 Vk (LFC327) (SEQIDNO:l 及 9) TR135-8 (SEQIDNO:l 及 6) 94% 94% TR127 Vh及TR137 Vk(LFD253) (SEQIDNO:l 及10) TR139-2 (SEQIDNO:l 及 7) 94% 98% TR143 Vh及TR129Vk (ND) (SEQIDNO:3 及 9) TR144-1 (SEQIDNO:3 及 6) 90% 94% TR154 Vh 及 TR137Vk (ND) (SEQIDNO:2 及 10) TR151-1 (SEQ ID NO:2 及 7) 94% 98% TR143 Vh及TR119Vk (LFD254) (SEQIDNO:3 及 8) ND* 90% 94% 〇 〇 *ND=未進行； a與人類生殖系之一致性％不包括CDR3 137605.doc •63· 200936608 表4說明含於IgG表現載體内之V區與人類生殖系序列的 一致性百分比：所有百分比代表V區上與單鏈人類生殖系 序列之一致性且不包括CDR3 BSD序列。Fab之Vh區及Vk 區中之每一者與人類生殖系胺基酸序列極接近。
展示抗原決定基特異性之阻斷ELISA 如方法部分所述以含有人類V區段之經純化Fab進行阻斷 ELISA。結果展示於圖7中。所有Fab純系之結合由增加濃 度之起源單株抗體A10F18.2 IgG阻斷，表明Fab與起源單 〇 株IgG結合同一抗原決定基。 藉由ELISA檢定與TrkB蛋白之抗體結合
IgG 抗體 NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325 及 NVP-LFC327係藉由瞬時轉染產生，如本文所述進行純化 且評估其與Fc-TrkB之特異性結合。使用人類TrkB及各別 抗體LFD253、LFD254、LFC325或LFC327之連續稀釋液進 行 ELISA。ELISA檢定顯示 LFD253、LFD254、LFC325 及 LFC327與人類TrkB結合。參見圖8。 〇 具有人類V區段之IgG(例如，NVP-LFD253、NVP- LFD254、NVP-LFC325及 NVP-LFC327)與 TrkB 而非 TrkA或 TrkC特異性結合。藉由檢驗經純化IgG抗體與三種不同Trk 家族成員（TrkA、TrkB及TrkC)的相互作用來評估2 pg/ml 之經純化IgG抗體的特異性。二級Ab為僅以山羊-抗-人類 Fab-HRP偵測Ab阻斷及處理之複製品。如圖9A-D所示， LFD253、LFD254、LFC325或LFC327中無一者與此等相關 Trk家族受體中之任一者結合。 137605.doc -64- 200936608 失巢凋亡檢定：功能促效作用 在失巢凋亡中使用大鼠腸上皮（RIE)-TrkB細胞評估經純 化 IgG(例如，LFD253、LFD254、LFC325 或 LFC327)。此 等細胞易受失巢凋亡（脫離依賴性細胞凋亡）影響，但可以 TrkB受體之活化援救。LFD253處理能夠自失巢凋亡援救 RIE-TrkB細胞（如成活力所量測），且此作用具劑量依賴 性。參見圖10A-D。自此資料計算出的LFD253之EC50為 4.1 ng/ml(28 pM)。自此資料計算出的LFD254之EC50為 〇 24.0 ng/ml(160 pM)。自此資料計算出的LFC325之EC50為 41.8 ng/ml(280 pM)。自此資料計算出的LFC327之EC50為 26.9 ng/ml(180 pM)。 藉由Biacore測定抗體親和力 測定 NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325及 NVP-327與經固定Fc-TrkB結合之動力學常數。圖11A-D展示各 IgG之動力學迹線之代表性組的詳情。圖11A展示LFD253 自62.5 nM稀釋兩倍降至3.9之滴定感應譜。圖11B展示 〇 LFD254自31.25 nM稀釋兩倍降至1.9之滴定感應譜。圖lie 展示LFC325自31.25 nM稀釋兩倍降至1.95之滴定感應譜。 圖11D展示LFC327自31.25 nM稀釋兩倍降至1.95之滴定感 應譜。表5展示當使用Biacore S51評估軟體使實驗全面擬 合為朗繆爾模型時獲得之資料的概述。儘管此抗體為二價 抗體，但結合作為1:1事件處理。 137605.doc -65- 200936608 表5 K〇(nM) kd(l/s) γ2 NVP-LFD253 0.165 3·25 χ 10·5 1.97 χ 1〇5 ——Λ 10.0 NVP-LFD254 0.117 1.94 χ ΙΟ'5 1.66 χ ΐ〇5 0.05 NVP-LFC325 0.114 4.85 χ ΙΟ·5 1.97 χ 1〇5 3.04 NVP-LFC327 01465 5.76 χ ΙΟ·5 3.934 χ 1〇5 2.24 表5展示抗體-受體複合物之快締合及慢解離動力學兩 者。當全面處理感應譜時獲得最佳擬合。 應瞭解，本文所述之實例及實施例僅出於說明性目的且 ® 熟習此項技術者可對其進行各種輕微修正或改變，且該等 修正或改變包括在本申請案之精神及範圍及隨附申請專利 之範疇内。出於所有目的，本文所引用之所有公開案、專 利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中。 【圖式簡單說明】 圖1說明包含抗體V區之結構單元的示意圖。重鏈由三個 基因家族（重_V、D及J)編碼且輕鏈由兩個基因家族（κ*λ v Q 及J)編碼。此等基因之重組產生完整V區。CDR3序列在重 鏈狀況下係處於重V、D&j基因的重組位點，且在輕鏈狀 況下處於κ或λ V及J基因的重組位點。 圖2說明將參考抗體胺基酸序列以人類胺基酸序列置換 的示意圖。 圖3說明藉由生物層干涉量測法使用F〇rteBi〇 〇ctet生物 感測器技術對與重組TrkB抗原結合之Fab進行的分析。此 等曲線之數值資料展示於表1及2中。 137605.doc -66- 200936608 圖4說明藉由生物層干涉量測法使用ForteBio Octet生物 感測器技術對與重組TrkB抗原結合之IgG進行的分析。此 等曲線之數值資料展示於表3中》 圖 5說明 Fab純系 TR134-4(SEQ ID NO:76及 80)、TR135-8(SEQ ID NO:76及 81)、TR139-2(SEQ ID NO:76及 82)、 TR151-1(SEQ ID NO:77及 82)及 TR144-1(SEQ ID NO:78及 81)的經對準可變區胺基酸序列（FR1至CDR3)及與生殖系 Vhl-02(SEQ ID NO:15)或 Vkll A23(SEQ ID NO:79)之最接 〇 近單個可變區轉譯的比較。所有Fab Vh區之FR4(未圖示） 係來自人類生殖系JH4且具有序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)。所有Fab Vk區之FR4(未圖示）係來自人類生殖系 Jk2且具有序列FGQGKLEIK(SEQ ID NO:61)。CDR經加框 且不同於生殖系序列中相應位置之殘基（CDR3 "BSD"序列 除外）為粗體。相對於CDR3之親和力成熟變化經加下劃線 且Vk CDR3中之生殖系置換殘基為斜體。 圖 6 說明 IgG 純系 TR127-2(SEQ ID NO:76) ' TR143-❹ 3(SEQIDNO:78)、TR154-2(SEQIDNO:77)、TR119-
1(SEQ ID NO:84)、TR129-1(SEQ ID NO:85)及丁11137-1(SEQIDN0:86)之經對準可變區胺基酸序列（FR1至CDR3) 及與生殖系 Vhl-02(SEQ ID NO:15)或 Vkll A23(SEQ ID NO:83)之最接近單個人類可變區轉譯的比較。所有IgG Vh 區之FR4(未圖示）係來自人類生殖系JH4且具有序列 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)。所有 IgG Vk區之FR4(未 圖示）係來自人類生殖系Jk2且具有序列FGQGKLEIK(SEQ 137605.doc • 67· 200936608 ID NO:61)。CDR經加框且不同於生殖系序列中相應位置 之殘基（CDR3 "BSD"序列除外）為粗體。相對於CDR3之親 和力成熟變化經加下劃線且Vk CDR3中之生殖系置換殘基 為斜體。 圖7說明Fab與人類V區段之結合在ELISA檢定中由增加 濃度之A10F18.2 IgG阻斷。 圖 8A_D 說明 NVP-LFD253(A)、NVP-LFD254(B)、NVP-LFC3 25(C)或 NVP-LFC3 27(D)與人類 Fc-TrkB之結合。 〇 圖 9A-D 說明展示 NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP- LFC325及NVP-LFC327與人類TrkB_Fc融合蛋白但不與人 類TrkB-Fc或TrkC-Fc融合蛋白之特異性結合的ELISA檢 定。藉由檢驗經純化IgG與三種不同Trk家族成員（TrkA、 TrkB及TrkC)的相互作用來評估2 pg/ml下之經純化IgG的 特異性。二級Ab為僅以山羊-抗-人類Fab-HRP偵測Ab阻斷 及處理之複製品。 圖10A-D說明在失巢凋亡檢定中對NVP-LFD253、NVP-❹ LFD254、NVP-LFC325及NVP-LFC327的促效活性之評 估。以RIE-TrkB細胞評估經純化IgG歷時48 h。（-)為未經 抗體處理之細胞。 圖 11A-D 說明 IgG 抗體 NVP-LFD253、NVP-LFD254、 NVP-LFC325及NVP-LFC327之代表性Biacore動力學迹 線。Fc-TrkB經固定於Biacore晶片表面。IgG之連續稀釋液 以30 pL/min流經晶片。締合期為300秒，隨後於自由緩衝 液流動中的解離期為1200秒。 137605.doc 68 - 200936608 圖12說明使用抗TrkB促效劑mAb的長期處理延長Mecp2-Bird小鼠的壽命。Mecp2tml.lBird裸小鼠重演罹患雷特氏 症候群之個體的多種核心呼吸功能障礙，包括：呼吸週期 持續時間中之可變性增加、快及慢呼吸頻率之交替期、出 現呼吸暫停、平均呼吸頻率增加（及每分鐘通氣量）^小鼠 最終死於致命性呼吸衰竭。抗體A10係指與本文所述之經 改良抗TrkB抗體促效劑共有互補結合決定區（CDR)及最小 結合決定子的親本小鼠單株抗體。 Ο 圖13說明經抗TrkB促效劑mAb處理之Mecp2-Bird小鼠中 的呼吸功能之改良。以抗TrkB促效劑mAb處理進行處理 後，藉由整體體積量測法評估Mecp2小鼠的呼吸參數。未 經處理之Mecp2小鼠展示增強之呼吸間歇（penh)中的年齡 依賴性增加，此在經mAb處理之動物中降低。年齡依賴性 Penh可指示氣道抗性增加，可模擬rTt患者體内之佛薩瓦 氏壓力均衡（valsalva maneuver)併發症之表型。在mAb處 理後在野生型及Mecp2小鼠中皆觀測到呼吸頻率增加及吸 ® 氣時間減少。* Ρ<·〇5 ’ ** ρ<·〇1相對於相同基因型，反處 理；# p<.05 ’ ρ<.01 ’ ### ρ<·〇〇ΐ相對於相反基因型， 相同處理；$ ρ<·〇5，$$ ρ<·01，$$$ ρ<·〇〇ι MeCP2-KO/A1 0相對於MeCP2-WT/SAL »相繼進行單因子ANOVA 及學生 t測試（Student's t-test)。 圖14說明向食蟹猴靜脈内投予抗TrkB促效劑mAb LFI987後對食物攝取及體重的作用。藉由將HC可變區轉 移至沉默IgGl主鏈中來使抗體純系LFD253轉變為 137605.doc -69· 200936608 LFI987。在第1、5及8天將動物以0.3及3.0 mg/kg LFI987靜 脈内給藥3次。數據為平均值土 SE ; n=4-6。相繼進行重複 量測之Anova及唐那氏測試（Dunnett's test)，相對於基線， 的* P<0.05，LFI987以劑量依賴性方式顯著增加食物攝取 及體重。 ❹ 137605.doc 70- 200936608 序列表 <11〇>美商艾姆公司 <120>改良之抗-TRKB抗體 <130> P13I8 <140> 098101724 <141> 2009-01-16 <150> 61/021,820 <151> 2008-01-17 <160> 86 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列
<223>/註釋對人工序列之說明：合成多肽" <400> 1
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Q 85 90 95
Thr Gly Val Thr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成多肽 <400> 2
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 137605-序列表.doc 200936608
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Scr Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Gly Val Thr Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110 ❹
Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋對人工序列之說明：合成多肽1 <400> 3
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Arg Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Gly Val Thr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 4 <211> 116 <212> PRT -2- 13 7605-序列表.doc 200936608 <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成多狀" <220> <221>變異體 <222> (54)..(54) <223> / 置換="Arg" <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> /註釋序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異趙 <222> (57)..(57) <223> / 置換="Asp" <220> <221> misc feature <222> (57)..(57)
<223>/註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (59)..(59) <223> / 置換="Ser" <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (61)..(61) <223> /置換=”Lys" <220> <221> misc feature <222> (61)..(61) <223>/註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (84)..(84) <223> /置換=，，Ser" <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> /註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <22丨> 變異體 <222> (87)..(87) <223> /置換=”Thr" <220> <221> misc_feature <222> (87)7.(87) <223> /註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 137605-序列表.doc 200936608 <222> (97)..(97) <223> /置換="Thr” <220> <221> misc_feature <222> (97),.(97) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> 一 <221>變異體 <222> (101)..(101) <223> /置換="Thr” <220> <221> misc feature <222> (101)..(101) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <400> 4
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Gly Val Thr Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 112 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋==·’對人工序列之說明：合成多肽" <400> 5
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin 35 40 45 -4- 137605-序列表.doc 200936608
Pro Pro Arg Leu Leu Me Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Scr Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95
Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成多肽1
<400> 6
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Va! 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95 ❹
Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=="對人工序列之說明：合成多肽 <400> 7
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His 20 25 30 137605·序列表.doc 200936608
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu He Tyr Lys lie. Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Va! Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95
Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 313 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成多肽1 <400> 8
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 111 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 /註釋=”對人工序列之說明：合成多肤1 <400> 9
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser -6- 13 7605·序列表.doc 200936608 20 25 30
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Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 90 95
Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Lys Leu Glu He Lys 100 105 110
<210> 10 <211> 111 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成多肽 <400> 10
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 90 95
Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 11 <211> ill <212〉 PRT <2】3>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成多肽' <220> <221>變異體 <222> (2)..(2) 137605·序列表.doc 200936608 <223> /置換="Val" <220> <221> misc feature <222> (2)..(2) <223>/註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <220> <221>變異體 <222> (7)..(7) <223> /置換="Thr" <220> <221> misc feature <222> (7)..(7)
<223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性M <220> <221>變異體 <222> (30)..(30) <223> /置換="Val" <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (39)..(39) <223> /置換="Ser" <220> <221> misc feature <222> (39)7.(39) <223> /註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (41)..(41) <223> /置換="Tyr” <220> <221> misc feature <222> (41)..(41) <223> /註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> i
<221>變異體 <222> (44)..(44) <223> /置換=”Arg"或"Thr" <220> <221> misc feature <222> (44)..(44) <223>/註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性"
變異IS <222> (99)..(99) <223> /置換=”Var <220> <221> mi sc_feature <222> (99)..(99) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <400> 11 137605-序列表 _doc 200936608
Asp Me Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 90 95
Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 ❹ <210> 12 <211> 98 <212> m <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽" <400> 12
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Gly <210> 13 <211> 98 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽 -9- 137605-序列表.doc 200936608 <400> 13
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp He Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Gly <210> 14 <211> 98 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽” <400> 14
Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Aia Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met ❹ 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Arg Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Gly <210> 15 <211> 98 <212> PRT <213>人工序列 -10· 137605·序列表.doc 200936608 <220> <221>源序列 <223> /Ί主釋=”對人工序列之說明：合成肽 <400> 15
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Scr Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg <210> 16 <211> 98 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋=”對人工序列之說明：合成肤1 <220> <221>變異體 <222> (31)..(31) <223> /置換="Ala" <220> <221> misc_feature <222> (31)7.(31) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (33)..(33) <223> /置換=”Tyr” <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> /註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (52)..(52) <223> / 置換=”Asn" <220> <221> misc feature <222> (52)..(52) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" • 11 - 137605-序列表.doc 200936608 <220> <221>變異體 <222> (54)..(54) <223> /置換="Arg” <220> <221> misc feature <222〉 （54)..(54) <223>/註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <220> <221>變異體 <222> (57)..(57) <223> /置換=nAspM <220> <221> misc—feature <222> (57)..(57) <223>/註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性·' <220> <221>變異體 <222> (59)..(59)
<223> /置換="Arg"或"Ser" <220> <221> misc feature <222> (59)..(59) <223> /註‘="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (61)..(61) <223〉/ 置換="Lys” <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異艎 <222> (84)..(84) <223> /皇換="Ser" <220> <221> misc feature <222> (84)..(84) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <220> <221>變異體 <222> (87)..(87) <223> / 置換="Thr" <220> . <221> misc feature <222> (87)..(87) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> Λ <221>變異體 <222> (97)..(97)
<223> /置換=，'ThrM <220> <221>變異體 12· 137605-序列表.doc 200936608 <222> (98)..(98) <223> /置換=”Arg" <220> <221> misc feature <222> (97)..(98) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <400> 16
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Gly <2】0> ]7 <211> 94 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋對人工序列之說明：合成肽 <400> 17
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Q 1 5 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80
He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 18 <211> 94 •13· 137605·序列表.doc 200936608 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=：”對人工序列之說明：合成肽1 <400> 18
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys He Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 19 <211> 94 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋：="對人工序列之說明：合成肽1 <400> 19
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 20 <211> 93 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 -14- 137605·序列表,doc 200936608 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成肽" <400> 20
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phc Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Va丨 Giu Ala Glu Asp Val Gly Vai Tyr Tyr Cys
<210> 21 <211> 93 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成肽 <400> 21
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys He Ser Asn Arg Phe Scr Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 22 <211> 93 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成舨i <400> 22
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly -15- 137605-序列表.doc 200936608 5 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Scr Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90
<210> 23 <211> 93 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”封人工序列之說明：合成肽' <400> 23
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 24 <211> 93 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=·’對人工序列之說明：合成多肽 <220> <221>變異艎 <222> (2)..(2) <223> /置換="Val’， <220> <221> misc feature -16- 137605·序列表.doc 200936608 <222> (2)..(2) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <220> <221>變異體 <222> (7)..(7) <223> / 置換="Thr" <220> <221> misc feature <222> (7).7(7) <223> /註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <220> <221>變異體 <222> (11)..(11) <223> /置換="Ser" <220> <221> misc feature <222> (11)7.(11) <223> /註釋=·’序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性π
<220> <22】> 變異體 <222> (30)..(30) <223> /置換="Val" <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223>/註釋序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性π <220> <221>變異體 <222> (33)..(33) <223〉/置換="Asn" <220> <221> misc feature <222> (33)7.(33) <223> /註釋=_·序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (39)..(39) <223> /置換="Ser” <220> <221> misejeature <222> (39)..(39) <223>/註序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性•’ <220> <221>變異體 <222> (41)..(41) <223> / 置換="Tyr" <220> <221> misc feature <222〉 （41):.(41) <223>/註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <220> <221>變異體 <222> (44)..(44) <223> /置換=”Arg"fThr" •17- 13 7605-序列表.doc 200936608 <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <400> 24
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 25 <211> 5 <212> m <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋==”對人工序列之說明：合成肽" <400> 25
Ala Tyr Asp Met His <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋對人工序列之說明：合成政·1 <400> 26
Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽 <221>變異體 <222> (1)..(1) <223> /置換="Gly' 18- 137605-序列表.doc 200936608 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> /註釋=”序列令所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <220> _ <221>變異體 <222> (3)..(3) <223> /置換="Tyr” <220> <221> misc一feature <222> (3)..(3) <223> /註釋序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <400> 27
Ala Tyr Asp Met His
<210> 28 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽•’ <400> 28
Trp lie Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽" <400> 29
Trp lie Asp Pro Arg Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋對人工序列之說明：合成肽" <400> 30
Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15 -19- 137605·序列表.doc 200936608
Gly <210> 31 <211> 17 <212> m <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽" <220> <221>變異體 <222> (3)..(3) <223> /置換="Asn’， <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> /註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性"
<220> <221>變異體 <222> (5)..(5) <223> /置換="Arg" <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> /註釋序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (8)..(8)
<223> /置換=”AspM <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> /註釋序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <220> <221>變異體 <222> (10)..(10) <223> _/置換=nArg"或"Sern <220> <221> misc.feature <222> (10)7.(10)
<223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性M <220> <221>變異體 <222> (12)..(12) <223> /置換=nLysn <220> <22I> misc feature <222> (12)7.(12) <223>/註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性π <400> 31
Trp He Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15 •20- 137605-序列表.doc 200936608
Gly <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽” <400> 32
Val Thr Thr Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 33 <21l> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成肽" <400> 33
Val Thr Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋==”對人工序列之說明：合成肽" <220> <221>變異體 <222> (2)..(2) <223> /置換="Val" <220> <221>變異體 <222> (3)..(3) <223> /置換="Thr"或"Arg，，或"Asn" <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <400> 34
Val Thr Ser Trp Phe Ala Tyr <210> 35 <211> 16 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成肽’· -21 · 137605-序列表.doc 200936608 <400> 35
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 15 10 15 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋對人工序列之說明··合成肽1 <400> 36
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成狀i <400> 37
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser 15 10 15 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋==”對人工序列之說明··合成肽 <220> <221>變異體 <222> (7)..(7) <223〉/置換="Val’， <220> <221> misc feature <222> (7)..(7) <223> /註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (16)..(16) <223> /置換="Ser" <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <400> 38
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 15 10 15
<210> 39 <211> 7 <212> PRT 22- 13 7605-序列表.doc 200936608 <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋=”對人工序列之說明：合成肽” <400> 39
Lys He Ser Asn Arg Phe Ser <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <2M> /註釋="對人工序列之說明：合成肽” <400> 40
Met Gin G]y Thr His Glu Pro Tyr Thr 1 5
<210> 41 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋對人工序列之說明：合成肽" <400> 41
Met Gin Gly Thr His Val Pro Tyr Thr <210> 42 <21l> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋=”對人工序列之說明：合成肽 <220> <221>變異體 <222> (1)..(1)
<223> /置換="MetM <220> <221> misc feature <222> (l).T(l) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> ^ <221>變異體 <222> (5)..(5) <223> /置換=”Ala" <220> <221>變異體 <222> (6)..(6) <223> /置換="Val"或”Ile_， <220> <221> misc_feature 23- 137605-序列表.doc 200936608 <222> (5)..(6) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性” <400> 42
Ser Gin Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr <210> 43 <211> 30 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成肽1 <400> 43
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
<210> 44 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成肽” <400> 44
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 45 <211> 32 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成肽" <400> 45
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15
Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly 20 25 30 <210> 46 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <22〗> 源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽” <400> 46
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15 -24- 137605-序列表.doc 200936608
Leu His Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly 20 25 30 <210> 47 <211> 32 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成肽 <400> 47
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15
Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30
<210> 48 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽 <400> 48
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 49 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成多肽 <220> <221>變異體 <222> (18)..(18) <223> /置換="Ser" <220> <221> misc feature <222> (18)..(18) <223> /註釋序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> <221>變異體 <222> (21)..(21) <223> /置換=nThr" <220> <221> misc feature <222> (21)..(21) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" •25- 137605-序列表.doc 200936608 <220> <221>變異體 <222> (31)..(31) <223> /置換="Thr" <220> <221>變異體 <222> (32)..(32) <223> /置換="Arg” <220> <221> misc_feature <222> (31)7.(32) <223> /註釋序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <400> 49
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp TTir Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15
Leu His Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly 20 25 30
<210> 50 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋：=«對人工序列之說明：合成肽" <400> 50
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <2]0> 51 <211> 24 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋=”對人工序列之說明：合成肽" <400> 51
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys 20 <210> 52 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成肽" <400> 52
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15 -26- 137605·序列表 _doc 200936608
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys 20 <210> 53 <211> 23 <212> m <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽1 <400> 53
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys 20
<210> 54 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成肽” <400> 54
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys 20 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋=_’對人工序列之說明：合成肽"
<22丨> 變異體 <222> (7)..(7) <223> /置換="Thr” <220> <221> misc feature <222> (7)..(7) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性'· <220> <221>變異體 <222> (11)..(11) <223> /置換="Ser" <220> <221> misc feature <222> (11)..(11) <223>/註釋=”序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <400> 55 -27· 137605·序列表.doc 200936608
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys 20 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <2^> /註釋=”對人工序列之說明：合成肽" <400> 56
Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr 15 10 15
<210> 57 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽" <400> 57
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽" <400> 58
Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr 15 W 15 ❹ <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋=”對人工序列之說明：合成肽” <220> <221>變異體 <222> (2)..(2) <223> /置換=nTyrn <220> <221> misc feature <222> (2)..(2) <223> /註釋="序列中所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <220> -28 - 137605-序列表.doc 200936608 <221>變異體 <222> (5)..(5) <223> /査換="Arg"或"Thr" <220> <221> mi sc feature <222> (5)..(5) <223> /註釋="库列申所給出之殘基對該位置而言相對於 註解中之殘基不具偏好性" <400> 59
Trp Leu Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 60 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成肽i
O <400> 60 Gly Val Pro Asp
Arg
Phe Ser Gly Scr Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr 10 15
O
Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋對人工序列之說明：合成肽" <400> 61
Phe Gly Gin Gly Lys Leu Glu lie Lys 1 5 <210> 62 <211> 348 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋對人x序列之說明：合成肽·’ <400> 62 caggtgcagc tcctgcaagg cctggacaag gcacagaagt atggagctga acctggtttg tggtgcagtc cctctggata ggcttgagtg ttcagggcag gcaggetgae cgtactgggg tggggctgag caccttcacc gatggg£tgg ggtcaccatg atetgaegae tcaaggtacc gtgaagaage gcctacgata atcgacccta accagggaca acggccgtgt ctggtgaccg ctggggcctc tgcactgggt acagtggtgg cgtccatcag actactgcac tgagctcc agtgaaggtc gcgacaggcc cacaaggtat tacagcctac aggtgttacg 60 120 180 240 300 348 <210> 63 <211> 348 -29- 137605-序列表.doc 200936608 <212> DNA <213>人工序列 <220> 丨乐序列 <223>/註釋對人工序列之說明：合成聚核甞酸" <400> 63 caggttcagc tggtgcagtc tcctgcaagg cctctggaia cctggacaag ggcttgagtg aaacagaagt ttcagggcag atggagctgc acaggctgag acctggtttg cgtactgggg tggggctgag gtgaagaagc caccttcacc gcctacgata gatgggctgg atcgacccta ggtcaccatg accagggaca atctgacgac acagctgtgt tcaaggtacc ctggtgaccg ctggggcctc agtgaaggtc tgcactgggt gcggcaggcc gaagtggtga cacaagctat cgtccatcag cacagcctac actactgcac aggtgttacg tgagctcc 60 120 180 240 300 348 Ο <210> 64 <211> 354 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成聚核苜酸" 60 120 180 240 300 354 <400> 64 caggtgcagc tggtgcagtc tcclgcaagg cctctggata cctggacaag ggcttgagtg gcacagaagt ttcagggcag atggagctga gcaggctgac agctggtttg cgtactgggg tggggctgag gtgaagaagc caccttcacc gcctacgata gatgggatgg atcgacccta ggtcaccatg accagggaca atctsacgac acggccgtgt tcaaggtacc ctggtgaccg ctggggcctc agtgaaggtc tgcactgggt gcgacaggcc acagtggtgg cacaaggtat cgtccatcag tacagcctac actactgcgc aggtgttacg tgagctccgc tagc
<210> 65 <211> 339 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成聚核苷破” <400> 65 60 120 180 240 300 339 atggatgttg tgatgactca gtctccactc tccctgcccg tcacccttgg acagccggcc tccatctcct gcaggtccag tcaaagcctc ctacatagta atggaaacac ctacttgaat tggtatcagc agacgccagg ccagcctcca agactcctga tttataagat ttctaaccgg ttctctgggg tcccggacag attcagtggc agtggggcag ggacagattt cacactgaaa atcagcaggg tggaagctga ggatgttgga gtttactact gcatgcaagg tacacatgag ccgtacacgt ttggccaagg tacgaaactg gaaattaaa <210> 66 <211> 339 <212> DNA <213>人工序列 -30- 137605·序列表.doc
200936608 <220> <221>源序列 <223>/注釋="對人工序列之說明：合成聚核苷酸i <400> 66 atggatgttg tgatgactca gtctccactc tccctgcccg tcacccttgg acagccggcc tccatctcct gcaggtctag tcaaagcctc gtacacagta atggaaacac ctacttgaat tggtatcagc agaagccagg ccagcctcca agactcctga tttataagat ttctaaccgg ttctctgggg tcccggacag attcagtggc agtggggcag ggacagattt cacactgaaa atcagcaggg tggaagctga ggatgttgga gtttactact gcatgcaagg tacacatgag ccgtacacgt ttggccaagg tacgaaactg gaaattaaa <210> 67 <211> 339 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成聚核甞酸" 60 120 180 240 300 339 <400> 67 atggatgttg tccatctcct tggcttcagc ttctctgggg atcagcaggg ccgtacacgt tgatgactca gcaggtctag agaggccagg tcccggacag tggaagctga ttggccaagg gtctccactc tccctgcccg tcacccttgg acagccggcc tcaaagcctc gtacacagta atggaaacac ctacttgagt ccagcctcca agactcctga tttataagat ttctaaccgg attcagtggc agtggggcag ggacagattt cacactgaaa ggatgttgga gtttactact gcatgcaagg tacacatgag tacgaaactg gaaattaaa 60 120 180 240 300 339
O <210> 68 <211> 348 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋對人工序列之說明：合成聚核替酸" <400> 68 caggtgcagc tggtgcagtc tcctgcaagg cctctggata cctggacaag ggctt£agtg gcacagaagt ttcagggcag atggagctga gcaggctgac acctggtttg cgtactgggg tggggctgag gtgaagaagc caccttcacc gcctacgata gatgggatgg atcgacccta ggtcaccatg accagggaca atctgacgac acagctgtgt tcaaggtacc ctggtcactg ctggggcctc agtgaaggtc tgcactgggt gcgacaggcc acagtggtgg cacaaggtat cgtccatcag tacagcctac actactgcac aggtgttacg tctcttct 60 120 180 240 300 348 <210> 69 <211> 348 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成聚核甞酸" • 31 - 137605-序列表.doc 200936608 <400> 69 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctctggata caccttcacc gcctacgata tgcactgggt gcggcaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggctgg atcgacccta gaagtggtga cacaagctat 180 aaacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctgc acaggctgag atctgacgac acagccgtgt actactgcac aggtgttacg 300 acctggtttg cgtactgggg tcaaggtacc ctggtcactg tctcttct 348 <210> 70 <211> 348 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋=·_對人工序列之說明：合成聚核甞酸" <400> 70
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctctggata caccttcacc gcctacgata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgacccta acagtggtgg cacaaggtat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag tacagcctac 240 atggagctga gcaggctgac atctgacgac acggccgtgt actactgcgc aggtgttacg 300 agctggtttg cgtactgggg tcaaggtacc ctggigaccg tgagctcc 348 <210> 71 <211> 336 <212> IWA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成聚核苷鹸“ <400> 71 60 120 180 240 300 336 gatattgtga tgactcagac tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc atctcctgca ggtccagtca aagcctccta catagtaatg gaaacaccta cttgaattgg tatcagcaga cgccaggcca gcctccaaga ctcctgattt ataagatttc taaccggttc tctggggtcc cggacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagggtgg aagctgagga tgttggagtt tactactgca tgcaaggtac acatgtgccg tacacgtttg gccaaggtac gaaactggaa attaaa <210> 72 <211> 336 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成聚核:^酸， <400> 72 -32- 137605-序列表.doc 200936608 gatattgtga atctcctgca tatcagcaga tctggggtcc agcagggtgg tacacgtttg tgactcagtc ggtctagtca agccaggcca cggacagatt aagctgagga gccaaggtac tccactctcc aagcctcgta gcctccaaga cagtggcagt tgttggagtt gaaactggaa ctgcccgtca cacagtaatg ctcctgattt ggggcaggga tactactgca attaaa cccttggaca gaaacaccta ataagatttc cagatttcac tgcaaggtac gccggcctcc cttgaattgg taaccggttc actgaaaatc acatgagccg 60 120 180 240 300 336 DNA 人工序列 ❹ <210> 73 <211> 336 <212> <213> <220> <22丨> 源序列 <223> /註釋=，，對人工序列之說明：合成聚核:^酸1 60 120 180 240 300 336 <400> 73 gatattgtga atctcctgca cttcagcaga tctggggtcc agcagggtgg tacacgtttg tgactcagac ggtctagtca ggccaggcca cggacagatt aagctgagga gccaaggtac tccactctcc aagcctcgta gcctccaaga cagtggcagt tgttggagtt gaaactggaa ctgcccgtca cacagtaatg ctcctgattt ggggcaggga tactactgca attaaa cccttggaca gaaacaccta ataagatttc cagatttcac tgcaaggtac gccggcctcc cttgagttgg laaccggttc actgaaaatc acatgagccg <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=="對人工序列之說明：合成肽” <400> 74 Ο
Tyr Phc Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=："對人工序列之說明：合成肽” <400> 75 |yr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 1 5 10 <210> 76 <211> 105 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人卫序列之說明：合成多狀" •33- 137605-序列表.doc 200936608 <400> 76
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Gly Val Thr Thr Trp Phe Ala Tyr 100 105 <210> 77 <211> 105 <212> PRT <213>人工序列 <220> <22】> 源序列 <223> /註釋對人工序列之說明：合成多肽" <400> 77
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Gly Val Thr Ser Trp Phe Ala Tyr 100 105 <210> 78 <211> 105 <212> PRT <213>人工序列 -34- 137605·序列表.doc 200936608 <220> <221>源序列 <223>註釋=“對人工序列之說明：合成多肽” <400> 78
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 】 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Arg Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu His Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Gly Val Thr Thr Trp Phe Ala Tyr 100 105 <210> 79 <211> 100 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成多肽” <400> 79
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95
Thr Gin Phe Pro 100 <210> 80 <211> 103 -35- 137605-序列表 _doc 200936608 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成多肽” <400> 80
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Scr lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95
Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr 100 <210> 81 <211> 103 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成多肽" <400> 81
Met Asp Val Val Met Thr Gin Scr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu
Gly Gin Pro Ala Scr lie Ser Cys Arg Ser Scr Gin Ser Leu Val His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95
Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr 100 • 36- 137605·序列表.doc 200936608 <210> 82 <211> 103 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成多肽” <400> 82
Met Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95
Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr 100 <210> 83 <211> 98 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成肽" 〇 <400> 83
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95 -37- 13 7605-序列表.doc 200936608
Thr Gin <2I0> 84 <211> 103 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋=”對人工序列之說明：合成多肽1 <400〉 84
Met Asp He Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu He Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95
Gly Thr His Val Pro Tyr Thr 100 <210> 85 <211> 103 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223> /註釋="對人工序列之說明：合成多肽 <400> 85
Met Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin -38- 137605-序列表.doc 200936608 85 90 95
Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr 100 <210> 86 <211> 103 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>源序列 <223>/註釋="對人工序列之說明：合成多肽1 <400> 86
Met Asp He Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His 20 25 30
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80
He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95
Gly Thr His Glu Pro Tyr Thr 100 ❹ 137605-序列表.doc 39-

Claims (1)

  1. 200936608 七、申請專利範圍： h 一種與酪胺酸受體激酶B(TrkB)結合之抗體，其中該抗 體包含： (a) 包含人類重鏈V區段、重鏈互補決定區3(CDR 3)及 重鏈框架區4(FR4)之重鏈可變區，及 (b) 包含人類輕鏈V區段、輕鏈CDR3及輕鏈FR4之輕鏈 可變區，其中 i) 該重鏈CDR3包含胺基酸序列V(T/V)(S/T/R/N) ❹ WFAY(SEQ ID NO:34);及 ii) 該輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列（S/M)QGT (H/A)(E/V/I)PYT(SEQ ID NO:42);及 其中該抗體為TrkB促效劑（agonist)。 2. 如請求項1之抗體，其中該重鏈V區段與SEQ ID NO: 16 共有至少90%序列一致性，其中該輕鏈V區段與SEQ ID NO:24共有至少90%序列一致性。 3. 如請求項1之抗體，其中該重鍵V區段與一個選自由SEQ G ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14及 SEQ ID NO: 15組成之群的胺基酸序列共有至少90%序列一致 性，其中該輕鏈V區段與一個選自由SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22及 SEQ ID NO:23 組成之群的胺 基酸序列共有至少90%序列一致性。 4. 如請求項1之抗體’其中： 1)該重鏈匸〇113包含一個選自由8丑(5 1〇>10:32及8£(5 1〇 137605.doc 200936608 NO:33組成之群的胺基酸序列；及 ii)該輕鏈CDR3包含一個選自由SEQ ID NO:40及SEQ IDNO:41組成之群的胺基酸序列。 5. 如請求項1之抗體，其中該重鏈FR4為人類生殖系 (germline) FR4。 6. 如請求項5之抗體，其中該重鏈FR4為SEQ ID NO: 50。 7. 如請求項5之抗體，其中該重鏈J區段包含人類生殖系 JH4部分序列 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)。 Ο 8.如請求項1之抗體，其中該輕鏈FR4為人類生殖系FR4。 9. 如請求項8之抗體，其中該輕鏈FR4為SEQ ID NO: 61。 10. 如請求項8之抗體，其中該輕鏈J區段包含人類生殖系Jk2 部分序列 FGQGKLEIK(SEQ ID NO:61)。 11. 如請求項1之抗體，其中該重鏈V區段及該輕鏈V區段各 包含互補決定區1(CDR1)及互補決定區2(CDR 2);其 中： i)該重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:27之胺基酸序
    ii) 該重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:31之胺基酸序 列； iii) 該輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:38之胺基酸 序列；及 iv) 該輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:39之胺基酸序 列。 12.如請求項11之抗體，其中： 137605.doc 200936608 i) 該重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:25 ; ii) 該重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:28 ; iii) 該重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:32 ; iv) 該輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:35 ; v) 該輕鏈V區段之CDR2包含SEQIDNO:38;及 vi) 該輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:41。 13. 如請求項11之抗體，其中： i)該重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:25 ; 〇 ii)該重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID ΝΟ:28 ; iii) 該重鏈 CDR3 包含 SEQ ID ΝΟ:32 ; iv) 該輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID ΝΟ:36 ; ν)該輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID ΝΟ:38 ;及 vi)該輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID ΝΟ:40。 14. 如請求項11之抗體，其中： i) 該重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID ΝΟ:25 ; ii) 該重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID ΝΟ:28 ; ® iii)該重鏈 CDR3 包含 SEQ ID ΝΟ:32 ; iv)該輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID ΝΟ:37 ; ν)該輕鏈V區段之CDR2包含SEQIDNO:38;及 vi)該輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:40。 15. 如請求項11之抗體，其中： i) 該重鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:25 ; ii) 該重鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:29 ; iii) 該重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:32 ; 137605.doc 200936608 iv) 該輕鏈V區段之CDR1包含SEQ ID NO:35 ; v) 該輕鏈V區段之CDR2包含SEQ ID NO:38 ;及 vi) 該輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:41。 16. 如請求項1之抗體，其中該重鏈可變區與SEQ ID NO:4之 可變區共有至少90%胺基酸序列一致性，該輕鏈可變區 與SEQ ID ΝΟ:11之可變區共有至少90%胺基酸序列一致 性。 17. 如請求項1之抗體，其中該重鏈可變區與選自由SEQ ID © NO:l、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群的可變區 共有至少90%胺基酸序列一致性，該輕鏈可變區與選自 由 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID 1^0:8、8£(^10 1^0:9及8£(5 10>^0:10組成之群的可變區 共有至少90%胺基酸序列一致性。 18. 如請求項1之抗體，其中該重鏈可變區與選自由SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3組成之群的可變區 共有至少95%胺基酸序列一致性，該輕鏈可變區與選自 ❹ 由 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQIDNO:9及SEQIDNO:10組成之群的可變區 共有至少95%胺基酸序列一致性。 19. 如請求項1之抗體，其中該重鏈可變區包含一個選自由 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2 及 SEQ ID NO:3 組成之群的 胺基酸序列，該輕鏈可變區包含一個選自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10組成之群的胺基酸序列。 137605.doc 200936608 20.如請求項1之抗體，其中該抗體以小於5 χ 10_8 Μ之平衡 解離常數（KD)與TrkB結合。 2 1.如請求項1之抗體，其中該抗體為FAb'片段。 22. 如請求項1之抗體，其中該抗體為IgG。 23. 如請求項1之抗體，其中該抗體為單鏈抗體（scFv)。 24. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含人類恆定區。 25. 如請求項1之抗體，其中該抗體不與酪胺酸激酶受體A或 酪胺酸激酶受體C結合。 〇 26.如請求項1之抗體，其中該抗體與TrkB之配位體結合域 (LBD)結合。 27. 如請求項1之抗體，其中該抗體與腦源性神經營養因子 (BDNF)競爭與TrkB結合。 28. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含包括SEQ ID NO: 1之 重鏈及包括SEQ ID NO:8之輕鏈。 29. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含包括SEQ ID NO: 1之 重鏈及包括SEQ ID NO:9之輕鏈。 ® 3 0.如請求項1之抗體，其中該抗體包含包括SEQ ID ΝΟ:1之 重鏈及包括SEQ ID NO:10之輕鏈。 31.如請求項1之抗體，其中該抗體包含包括SEQ ID NO:3之 重鏈及包括SEQ ID NO:8之輕鏈。 3 2. —種特異性結合TrkB之抗體，其中該抗體包含重鏈可變 區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區及該輕鏈可變區各 包含以下三個互補決定區（CDRs) : CDR1、CDR2及 CDR3 ;其中： 137605.doc 200936608 i) 該重鏈可變區之CDR1包含SEQ ID NO:25之胺基酸序 列； ii) 該重鏈可變區之CDR2包含一個選自由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29 及 SEQ ID NO:30 組成之群的胺基 酸序列； iii) 該重鏈可變區之CDR3包含一個選自由SEQ ID NO:32及SEQIDNO:33組成之群的胺基酸序列； iv) 該輕鏈可變區之CDR1包含一個選自由SEQ ID O NO:35、SEQ ID NO:36 及 SEQ ID NO:37 組成之群的胺基 酸序列； v) 該輕鏈可變區之CDR2包含SEQ ID NO:39之胺基酸序 列； vi) 該輕鏈可變區之CDR3包含一個選自由SEQ ID NO:4〇及SEQIDNO:41組成之群的胺基酸序列。 33. —種醫藥學上可接受之組合物，其包含如請求項丨之抗 體及生理上相容之賦形劑。 34. 如請求項33之組合物，其中該醫藥組合物進一步包含降 低個體血糖含量之藥劑。 35_如請求項33之組合物其中該醫藥組合物進一步包含降 低個體體重之藥劑。 降低有需要之個體血_糖含量及/或體重之方法，該方 法匕含向該個體投予治療有效量之如請求項1之抗體。 ^項36之方法’其中該個體患有前驅糖尿病。 38·如喷求項36之方法’其中該個體患有I型糖尿病。 137605.doc 200936608 3 9.如請求項36之方法，其中該個體患有II型糖尿病。 40.如請求項36之方法，其中該個體超重。 4 1.如請求項36之方法，其中該個體肥胖。 42. 如請求項36之方法，其進一步包含向該個體投予治療有 效量之有效降低血糖之第二藥劑。 43. 如請求項42之方法，其中該第二藥劑及該抗體係以混合 物投予。 44. 如請求項42之方法，其中該第二藥劑及該抗體係分別投 ❹ 予。 45. 如請求項42之方法，其中該第二藥劑係選自由以下組成 之群：姨島素、項醢脲、騰島素促泌劑（insulinotropic agent)、二甲雙胍（metformin)、PPARy促效劑、PPARa促 效劑、ΡΡΑΙΙδ促效劑、PPARa/γ雙重促效劑、PPARa/γ/δ 全促效劑（pan agonists)、a-葡糖普酶抑制劑、DPP-IV抑 制劑、及GLP-1/GLP-1類似物。 46. 如請求項36之方法，其進一步包含向該個體投予治療有 ® 效量之有效降低體重或肥胖之第二藥劑。 47. 如請求項46之方法，其中該第二藥劑及該抗體係以混合 物投予。 48. 如請求項46之方法，其中該第二藥劑係分別投予。 49. 如請求項46之方法，其中該第二藥劑係選自由脂肪酶抑 制劑、諾美婷（sibutramine)、CB-1抑制劑、托D比西旨 (topiramate)、艾 丁（amylin)、艾汀類似物、瘦素（leptin)、 PYY/PYY類似物、及GLP-1/GLP-1類似物組成之群。 137605.doc 200936608 50. —種減輕或抑制腦源性神經營養因子（BDNF)缺乏所引起 病症的症狀之方法，其包含向有需要之個體投予治療有 效量之如請求項1之抗體。 51·如請求項50之方法，其中BDNF缺乏所引起之病症係選 自由雷特氏症候群（Rett Syndrome)，威爾姆氏腫瘤 (Wilms' tumor)、無虹膜、泌尿生殖器異常及智力發育遲 滯（mental retardation)(WAGR)症候群，黑色素皮質素受 體（melanoc〇rtin receptor)MC4R缺乏所引起之肥胖，及 惡病質（cachexia)/肌肉萎縮症候群組成之群。 52. 如請求項50之方法，其中BDNF缺乏所引起之病症為雷 特氏症候群。 53. 如清求項5〇之方法，其中該抗體係全身投予。
    137605.doc
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