TW201106972A - Combination treatments - Google Patents

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Jo-Anne S Hongo
Dara Y Kallop
yong-jun Li
Jin-Feng Liu
Mary Ludlam
Lin Pei
Christine Tan
Xiao-Fen Ye
Jiping Zha
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Description

201106972 「、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體上係關於分子生物學領域。更明確地說，本 發明係關於Axl拮抗劑及其使用方法。 本案主張2009年7月27曰所申請之美國專利申請案第 61/228,915號及2010年6月18日所申請之第61/3 56,498號之 優先權，該等案之内容以引用方式併入本文中。 【先前技術】
Axl屬於ΤΑΜ受體酪胺酸激酶（RTK)亞家族，該亞家族亦 包括 Tyro3 及 Mer(0，Bryan J.P_等人，（1991) Mo/. Ce// 5ζ_ο/. 1 1:5016-5031 ; Lai C.及 G. Lemke (1991) TVewrow 6:691-704)。TAM受體之特徵為以下之組合：位於胞外區中之兩 個免疫血球蛋白樣結構域及雙重纖維結合蛋白III型重複， 以及細胞質激酶域。ΤΑΜ受體之配位體為Gas6(生長抑制 特異性6)及蛋白質S(兩種顯示43%胺基酸序列一致性且共 有類似域結構的維生素K依賴性蛋白質）（Varnum B.C.等 人，（1995) iVaiwre 373:623-626 ; Stitt T.N.等人，（1995) Ce// 80:661-670)。各蛋白質具有：含有11個γ-羧基麩胺酸 殘基的Ν端Gla域，後接四個表皮生長因子（EGF)樣模組， 及由兩個串聯層黏連蛋白G域組成之C端性激素結合球蛋 白（SHBG)樣結構。SHBG域對於ΤΑΜ受體結合及活化為必 要且充分的，而Gla域結合帶負電的膜磷脂且在ΤΑΜ介導 之凋亡細胞吞噬作用中起重要作用（Sasaki Τ.等人，（2006) EMBO J. 25:80-87 ； Hasanbasic I.f A » (2005) J. Thromb. 149799.doc 201106972
Haemost. 3'.1Ί90-2Ί9Ί、。 ΤΑΜ活化及信號傳導已牽涉多種細胞反應，包括細胞存 活、增殖、遷移及黏附（Hafizi S.及B. Dahlback (2006) 273:5231-5244)。ΤΑΜ受體信號傳導已顯示可調節 血管平滑肌穩定（Melaragno M.G.等人，（1999) Cardiovasc. Med. 9:250-253 ； Korshunov V.A.^ A 5 (2006) Circ. 98:1446-1452 ; Korshunov V.A.等人，（2007) 50:1057-1062)、血小板功能、企栓穩定性 (Angelillo-Scherrer A.等人，（2001) Met/· 7:215-221 ; Gould W.R.等人，（2005) ·/_ TTzromZ?· //aemosi. 3:733-741) 及紅血球生成（Angelillo-Scherrer A.等人，（2008) ·/. C7i«. 7«vesί_ 1 18:583-596)。TAM受體亦牽涉募樹突神經勝質細 胞存活之控制（Shankar S.L.等人，（2006) X iVewroMi·. 26:5638-5648)及蝕骨細胞功能之調節（Katagiri Μ.等人， (2001) «/·价〇/· C//ew. 276:7376-73 82)。對基因剔除小氣之 最新研究表明ΤΑΜ受體在先天免疫中起重要作用（Lemke G.及 C.V.，Rothlin (2008) _/Vai. /mmwwo/· 8:327-336)。 TAM抑制巨噬細胞及樹突狀細胞之炎症（Rothlin C.V.等 人，（2007) Ce// 131:1124-1136 ; Sharif M.N.等人，（2006) «/.五:>Φ· Med. 203:1891-1901)、促進凋亡細胞吞嗤作用 (Prasad D.等人，（2Ό06) Mo/· CW/· iVewrosc/·. 33:96-108 ; 1^().等人，（1999)7\/«〜?^ 398:723-728)且刺激自然殺手細 胞之分化（Caraux A.等人，（2006) Α/α/· /wmwwo/. 7:747-754)。在許多此等情況下，主要下游ΤΑΜ信號傳導路徑似 149799.doc 201106972 乎為 PI3K/AKT 路徑（Angelillo-Scherrer Α·等人，（2001) iVai· Med. 7:215-221 ; Shankar S.L.等人，（2006) ·/. 26:5638-5648 ; Keating A.K.等人，（2006) 0« ⑶gene 25: 6092-6100);然而，傑納斯激酶（Janus kinase)- STAT路徑為 TAM介導之免疫反應所必需（Rothlin C.V.等人，（2007) Ce// 131:1124-1136)。此外，許多由ΤΑΜ調節之生物功能 需要ΤΑΜ受體與細胞激素受體信號傳導網路之間的協同交 互作用（Rothlin C.V.等人，（2007) Ce// 131:1124-1136; Budagian V. # A > (2005) EMBO J. 24:4260-4270) °
Axl最初自慢性骨髓性白血病患者選殖且在過度表現時 呈現轉型潛能（O’Bryan J.P.等人，（1991) Mo/· Ce// 11:5016-5031 ; Janssen J.W.等人，（1991) Owcogewe 6: 2113-2120)。已報導在多種人類癌症中存在Axl過度表現 (Berclaz G.等人，（2001) dm C>«co/. 12:819-824 ; Craven R.J.等人，（1995) /«ί· J. Cancer 60:791-797 ; Shieh Y.S.等 人，（2005) iVeop/aha 7:1058-1064 ; Sun W.等人，（2004) 66:450-457 ; Ito T.等人，（19 9 9 ) 9:563- 567)，且Axl過度表現與以下癌之侵襲及轉移有關：肺癌 (Shieh Y.S.等人，（2005) 7:1058-1064)、前列腺 癌（Sainaghi P.P.等人，（2005) «/· Cell. Physiol. 204:36-44)、乳癌（Meric F.等人，（2002) Ties. 8:361- 367)及胃癌（Wu C.W.等人，（2002) 22: 1071-1078)以及腎細胞癌瘤（Chung B.I.等人，（2003) DAM Ce//· 22:533-540)及神經膠母細胞瘤（glioblastoma 149799.doc 201106972 (HuttererM.等人，（2008) C7/1 C⑽14:130-138)。 最新研究表明，Axl經由「酪胺酸激酶開關」過度表現引 起胃腸道受質腫瘤對伊馬替尼（imatinib)之抗性（Mahadevan D.等人 ’（2007) 26:3909-3919)。Axl 表現受化學 療法藥物誘導且Axl過度表現引起急性骨髓性白血病之抗 藥性（Hong C_C.等人，（2008) C⑽268:314-324)。
Ax〗亦顯示可調節内皮細胞遷移及及血管形成（Holland S.J. 等人 ’（2005) C ⑽ cer 65:9294-9303)。此等發現表 明’ Axl可能涉及腫瘤形成之多個方面之調節，包括腫瘤 生長、襲及血管生成。與Axl及抗Axl抗體相關的其他公 開案包括 WO 2004/039955、WO 2009/063965 ;共同擁有 之同在申請中的美國專利申請案61/356,5〇8(2〇1〇年6月18 曰申請）；共同擁有之同在申請中的美國專利申請案 61/356,514(2010 年 6 月 18 日申請）；WO 2009/062690 ; WO 2004/008147 ;及 5,468,634。 也管系統之發育為許多生理及病理過程之基本需要。諸 如胚胎及腫瘤之活躍生長組織需要足夠之血液供應。其藉 由產生促進新血管經由稱為企管生成之過程形成的促血管 生成因子來滿足此需求。血管形成是一個複雜但有序之生 物事件，其涉及全部或多個以下步驟：勾内皮細胞（ec)由 現有EC增殖或由袓細胞分化；b)EC遷移並聚結以形成束 狀結構；c)接著血管束經歷管生成（tubul〇genesis)a形成具 有中央腔之血管；d)現有管束或血管長出新枝而形成二級 血官；e)原始血管叢經歷進一步重塑及再成形；及〇募集 149799.doc 201106972 外皮内皮細胞包圍内皮管，從而向血管提供維持及調節功 能；該等細胞包括小毛細血管之外被細胞、較大灰管之平 滑肌細胞及心臟中之心肌細胞。Hanahan，D. Science 277:48-50 (1997) ； Hogan, B. L.AKolodziej, P. A. Nature
Reviews Genetics· 3:513-23 (2002) ; Lubarsky，B 及 * Krasnow，M. A. Cell. 112:19-28 (2003)。 現已充分確定，血管生成牽涉多種病症之發病機理。此 〇 等病症包括實體腫瘤及轉移；動脈粥樣硬化；晶狀體後纖 維組織增生；血管瘤；慢性炎症；眼内新生血管疾病，諸 如增生性視網膜病變（例如糖尿病性視網膜病變）、年齡相 關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼；移植角膜組織 及其他組織之免疫排斥反應；類風濕性關節炎；及牛皮 癬。Folkman 等人，J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992)，Klagsbrun等人，Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991);及 Garner A”「Vascular diseases」，於：Pathobiology Q Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A.,
Klintworth GK編，第 2版（Marcel Dekker, NY, 1994)，第 1625-1710頁。 在腫瘤生長情況下’血管生成對於增生轉變為贅瘤形成 及向腫瘤生長及轉移提供營養似乎至關重要。F〇lknlan等 人’ Nature 339:58 (1989)。與正常細胞相比，新管生成 允§午腫瘤細胞獲取生長優勢及增殖自主性。腫瘤通常始於 單個異常細胞，其因與可利用之毛細A管床距離遠而可僅 增生至幾立方毫米之大小，且腫瘤可長期保持「休眠」而 149799.doc 201106972 不進一步生長及散播。接著一些腫瘤細胞轉變成血管生成 表型以活化内皮細胞，其增殖並成熟成為新毛細血管。此 等新形成之血管不僅允許原發性腫瘤持續生長，而且允許 轉移的腫瘤細胞散播及再定殖。相應地，已在乳癌及多種 其他腫瘤中觀測到腫瘤切片中之微血管密度與患者存活率 之間的相互關係。Weidner等人，N· Engl. j. Med 324:1-6 (1991) ’ Horak 等人 ’ Lancet 340:1120-1124 (1992). Macchiarini等人，Lancet 340:145-146 (1992)。尚未清楚 瞭解控制血管生成開關之準確機制，但咸信腫瘤塊之新血 &生成係由大量血官生成刺激物及抑制物之淨平衡引起 (Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31) ° 血管發育過程受到嚴格調節。迄今，大量分子（主要為 由周圍細胞產生之分泌因子）已顯示可調節EC分化、增 殖、遷移及聚結成為束狀結構。舉例而言，血管内皮生長 因子（VEGF)已鑑別為涉及刺激血管生成及誘導血管滲透性 之關鍵因子。Ferrara等人，Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)。 喪失甚至單一 VEGF對偶基因亦導致胚胎死亡之發現表 明’此因子在血管系統形成及分化中起到不可替代之作 用。此外’ VEGF已顯示為與腫瘤及眼内病症相關之新血 管生成之關鍵介體。Ferrara等人，Endocr. Rev.同上。所 檢查之人類腫瘤大部分過度表現VEGF mRNA。Berkman等 人，J· Clin. Invest. 91:153-159 (1993) ; Brown等人， Human Pathol. 26:86-91 (1995) ; Brown等人，Cancer Res. 53:4727-4735 (1993) ; Mattern等人，Brit. J. Cancer 73: 149799.doc 201106972 931-934 (1996) ; Dvorak等人，Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)。 抗VEGF中和抗體抑制裸小鼠中多種人類腫瘤細胞株之 生長（Kim 等人，Nature 362:841-844 (1993) ; Warren 等 人，J· Clin. Invest· 95:1789-1797 (1995) ; Borgstr0m 等 人，Cancer Res. 56:4032-4039 (1996) ; Melnyk 等人， Cancer Res. 56:921-924 (1996))且亦抑制缺血性視網膜病 0 症模型中眼内血管生成。Adamis等人，Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)。因此，抗VEGF單株抗體或其他VEGF作 用抑制劑為有望用於治療腫瘤及各種眼内新生血管病症之 候選藥物。該等抗體描述於例WEp 817,648(1998年14 日公開）；及WO 98/45331 與WO 98/45332(均於 1998年10月 1 5曰公開）中。 癌症為對人類健康之最致命威脅之一。僅在美國，癌症 每年衫響近一百二十萬新患者且為心血管疾病之後的第二 ❹^]主要死亡原因，在死亡中占約1/4。實體腫瘤是造成大 刀彼等死亡的原因。儘管某些癌症之醫療已顯著進步， 但在過去2〇年中所有癌症之總體5年存活率僅提高約 10%。儘管癌症治療顯著進步，但仍然在尋求改良療法。 本文中引用之所有參考文獻，包括專利申請案及公開 案，均以全文引用的方式併入本文中。 【發明内容】 本發明提供治療諸如癌症之病理性病狀之組合療法，其 中將AX1拮抗劑與VEGF拮抗劑組合。 149799.doc 201106972 在一態樣中，本發明提供治療個體癌症之方法，其包含 向個體投與治療有效量之Axl拮抗劑及VEGF拮抗劑。 在另一態樣中，本發明提供抑制個體癌轉移之方法，其 包含向個體投與治療有效量之Axl拮抗劑及VEGF抬抗劑。 在另一態樣中，本發明提供抑制個體企管生成之方法， 其包含向個體投與治療有效量之Axl拮抗劑及VEGF拮抗 劑。 在另一態樣中，本發明提供抑制個體細胞增殖之方法， 其包含向個體投與治療有效量之Axl拮抗劑及VEGF拮抗 劑。 在某些實施例中，VEGF拮抗劑為阻礙VEGF與細胞受體 結合之化合物。該等VEGF阻斷拮抗劑之實例包括（但不限 於）可溶性VEGF受體、對VEGF具有特異性之適體或肽 體，及抗VEGF抗體。在一實施例中，抗VEGF抗體為貝伐 珠單抗（bevacizumab)。 在某些實施例中，當組合使用時，貝伐珠單抗的投與量 範圍為約0.05 mg/kg至約15 mg/kg。在一實施例中，可向 個體投與約 0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、3.0 mg/kg ' 4.0 mg/kg、5.0 mg/kg、6.0 mg/kg ' 7.0 mg/kg、 7.5 mg/kg、8.0 mg/kg、9.0 mg/kg、10 mg/kg或 15 mg/kg 中 之一或多種劑量（或其任何組合）。該等劑量可間歇地投 與，例如每天、每三天、每週或每兩至三週。
Axl拮抗劑之實例包括（但不限於）可溶性Axl受體、可溶 性Axl配位體變異體、對Axl或Axl配位體具有特異性之適 149799.doc -10- 201106972 體或肽體、Axl小分子、抗Axl抗體及抗Axl配位體抗體。 在一些實施例中，Axl拮抗劑為抗Axl抗體。在一些實施例 中，Axl拮抗劑不為華法林（warfarin)。 在一些實施例中，抗Axl抗體包含含有序列EVQLVESG GGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSGSWIHWVRQAPGKGLEW VGWINPYRGYAYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLR AEDTAVYYCAREYSGWGGSSVGYAMDYWGQGTLV(SEQ ID ΝΟ:1)的重鏈可變區及含有序列DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQDVSTAYAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTF GQGTKVEIKR(SEQIDNO:2)的輕鏈可變區。 在一些實施例中，Axl拮抗劑為R428(Rigel; Holland等 人，Cancer Research 70，1544 (2010))或 PF02341066。 在某些實施例中，該方法進一步包含投與EGFR拮抗 劑。在某些實施例中，EGFR拮抗劑為埃羅替尼 (erlotinib)。在某些實施例中，可以每天150 mg之劑量或 以每天100 mg之劑量投與埃羅替尼。 本發明之方法可用於改變任何適合的病理狀態。舉例而 言，本發明之方法可用於治療不同癌症（實體腫瘤與液體 腫瘤以及相似的軟組織腫瘤）。可依照本發明之療法治療 的癌症之非限制性實例包括乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、 非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkins lymphoma，NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌（諸如肝細 胞癌）、胰臟癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤（kaPosi's 149799.doc 11 201106972 ma)類癌瘤（carcinoid carcinoma)、頭頸癌、署色素 瘤、卵巢癌、胃癌、間皮瘤及多發性骨髓瘤。在某些態樣 中癌症為轉移性癌。在其他態樣中，癌症為非轉移性 癌。 在一些實施例中，抗Αχ1抗體及抗VEGF抗體（諸如貝伐 珠單抗）用於諸如非小細胞肺癌之癌症之組合療法中。 視待治療之特定適應症而定，可將本發明之組合療法與 諸如化學治療劑之其他治療劑或諸如放射線療法或手術之 其他療法組合。許多已知化學治療劑可用於本發明之組合 療法中。在某些實施例中’本發明之組合療法可與一種以 上化學治療劑組合。在某些實施例中，所用的彼等化學治 療劑為用於治療特定適應症之標準藥劑。在另一實施例 中’組合使用之各種治療劑之劑量或頻率等同於或小於不 使用其他治療劑時相應治療劑之劑量或頻率。 在某些實施例中，癌症顯示Axl表現（諸如Axl過度表 現）、擴增或活化。 在某些實施例中，個體經診斷患有表現Axl之癌症。 本發明亦提供抑制組成性Axl活化之方法，其包含使細 胞與下調Axi表現（降低例如細胞表面（諸如腫瘤細胞表面） 上之Axl表現及/或降低細胞（諸如腫瘤細胞）中之總體Αχί表 現）之抗體（或其抗原結合片段）接觸。 本發明亦提供治療個體癌症之方法，其包含向個體投與 下調Axl表現（降低例如細胞表面（諸如腫瘤細胞表面）上之 Axl表現及/或降低細胞（諸如腫瘤細胞）中之總體Axl表現） 149799.doc -12- 201106972 的抗Axl抗體。 本發明亦提供阻斷配位體與Axl結合之方法，其包含使 表現Axl之細胞與結合Axl且抑制配位體與Axl結合之抗體 或其抗原結合片段接觸，其中該抗體識別人類Axl而非小 % 鼠Axl上之抗原決定基。單株抗體可為例如嵌合抗體、人 ’ 類化抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體。在一些實施例中， 抗體結合的抗原決定基與選自由3G9、8B5、12A11及4F8 〇 組成之群之單株抗體所結合之抗原決定基相同。在一些實 施例中，抗體抑制配位體與Axl結合。在一些實施例中， 抗體下調Axl表現。在一些實施例中，抗體識別Αχί上之變 性抗原決定基’如可由西方墨點法（Western blot)偵測。在 一些實施例中’抗體之IC5〇為至少約1〇〇 ng/ml。在一些實 施例中’抗體抑制Gas6誘導之Axl磷酸化。 在一態樣中’本發明提供由融合瘤細胞株3G9· 19.7產生 之抗體，融合瘤細胞株3G9.19.7具有美國菌種保存中心 ❹ （ATCC)編號_ ，寄存於_。 在一態樣中’本發明提供分離抗體，其包含由具有美國 菌種保存中心（ATCC)編號_______之融合瘤細胞株 • 3G9.19·7所產生之抗體之重鏈及/或輕鏈可變域，其中該分 • 離抗體特異性結合人類Axl。 在一態樣中，本發明提供包含至少1個（至少2個、至少3 個 '至少4個、至少5個、及/或6個）高變序列（Hvr)之分離 抗體’該（等）高變序列包含選自由具有美國菌種保存中心 (ATCC)編號--^融合瘤細胞株3G9.19.7所產生之 149799.doc 13 201106972 抗體之HVR-Ll、HVR.L2、HVR-L3、HYR-Hl、HVH-m 及/或HVR-H3組成之群的序列，其中該分離抗體特異性結 合人類Axl。 在一態樣中，本發明提供所結合之人類Αχ1上之抗原決 定基與由具有美國菌種保存中心（ATCC)編號一______之 融合瘤細胞株3G9.19.7產生之抗體所結合之人類Αχ1上之 抗原決定基相同的分離抗體。 在一態樣中’本發明提供與由具有美國菌種保存中心 (ATCC)編號--——之融合瘤細胞株3G9.19.7所產生之 抗體競爭結合人類Axl的分離抗體。 本發明亦提供下調細胞中Axl表現之方法，其包含使該 細胞與引起該細胞中Axl表現降低之抗體接觸。抗體可為 單株抗體。抗體可為例如嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗 體或雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體結合的抗原決 定基與選自由3G9、8B5、12A11及4F8組成之群之單株抗 體所結合之抗原決定基相同。在一些實施例中，抗體抑制 配位體與Axl結合。在一些實施例中，抗體識別Αχί上之變 性抗原決定基’如可由西方墨點法彳貞測。在一些實施例 中，抗體之IC5〇為至少約1 00 ng/ml。在一些實施例中，抗 體抑制Gas6誘導之Axl填酸化。 本發明亦提供偵測樣品中Axl之方法，其包含使該樣品 與特異性結合於Axl上之抗原決定基且不與該樣品中其他 蛋白質交叉反應的抗體接觸。在一些實施例中，抗體結合 的抗原決定基與選自由3G9、8B5、12A11及4F8組成之群 149799.doc • 14- 201106972 之單株抗體所結合之抗原決定基相同。在一些實施例中， 抗體識別Axl上之變性抗原決定基，如可由西方墨點法摘 測。在一些實施例中，抗體之ICS()為至少約丨⑼叩“卜 纟I月亦提（、0斷患有以Αχι表現（在—些實施例中，為 過度表現）為特徵之病狀之患者的方法，其包含自該患者 獲得樣品且針對Axl表現分析該樣品，其中該分析法包含 使用所結合之抗原決定基與選自由3G9、8B5、丨2A11及 Q 8、’且成之群之抗體或其抗原結合片段所結合之抗原決定 基相同的杬體。在一些實施例中，抗體為3G9、8B5、 12A11、4F8，其抗原結合片段，或其組合。抗體可為單株 抗體、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或其抗原結合片 段。在一些實施例中，抗體與可偵測標記（諸如（但不限於） 放射性同位素、螢光化合物或酶標記）結合。 本發明亦提供治療患者癌症之方法，其包含：（a)使用第 一抗體偵測該患者之樣品中Axl之過度表現；及（b)向該患 〇 者投與包含第二抗體及醫藥學上可接受之載劑的組合物， 其中該第一抗體特異性結合於人類Axl上之抗原決定基且 該第二抗體抑制配位體與Axl結合、Axl磷酸化，或下調 • Axl表現。癌症可為選自由以下組成之群的癌症：骨髓性 . 白血病、肺癌（例如非小細胞肺癌（NSCLC))、胃癌、乳 癌、前列腺癌、腎細胞癌、胰臟癌及神經膠母細胞瘤。在 一些實施例中，第一抗體結合的Axl抗原決定基與選自由 3G9、8B5、12A11及4F8組成之群之單株抗體或其抗原結 合片段所結合之Axl抗原決定基相同。在一些實施例中， 149799.doc -15- 201106972 第二抗體結合的Axl抗原決定基與選自由3G9、8B5、 12A11及4F8組成之群之單株抗體或其抗原結合片段所結合 之Axl抗原決定基相同。在一些實施例中，第一抗體及第 二抗體為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或 其抗原結合片段。在一些實施例中，第一抗體及/或第二 抗體與細胞毒性劑（諸如（但不限於）化學治療劑、毒素或放 射性同位素）結合。在一些實施例中，該方法進一步包含 在投與結合Axl之抗體之前、之後或同時投與抗VEGF抗 體。 本發明亦提供抑制過度表現Axl之細胞之血管生成之方 法’其包含向該等細胞投與抗體，該抗體特異性結合人類 Axl上之抗原決定基且抑制配位體與Αχί結合、Axl填酸 化’或下調Axl表現。癌症可為選自由以下組成之群的癌 症：骨髓性白血病、肺癌（例如非小細胞肺癌（NSCLC))、 胃癌、乳癌、前列腺癌、腎細胞癌、胰臟癌及神經膠母細 胞瘤。在一些實施例中，抗體結合的抗原決定基與選自由 3G9、8B5、12A11及4F8組成之群之抗體或其抗原結合片 段所結合之抗原決定基相同。在一些實施例中，抗體為單 株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或其抗原結合 片段。在一些實施例中，抗體與細胞毒性劑（諸如（但不限 於）化學治療劑、毒素或放射性同位素）結合。在一些實施 例中，該方法進一步包含在投與結合Ax丨之抗體之前、之 後或同時投與抗VEGF抗體。抗Axl抗體及抗VEGF抗體可 呈多特異性抗體形式，諸如（但不限於）雙特異性抗體。 149799.doc -16· 201106972 在一態樣中，本發明提供抗Axl抗體及其使用方法。 在一些實施例中’本發明提供特異性結合人類Axl而非 小鼠Axl上之抗原決定基的單株抗體，或該抗體之抗原結 合片段。單株抗體可為例如嵌合抗體、人類化抗體、單鏈 抗體或雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體結合的抗原 決定基與選自由3G9、8B5、12A11及4F8組成之群之單株 抗體所結合之抗原決定基相同。在一些實施例中，抗體抑 q 制配位體與Axl結合。在一些實施例中，抗體下調Axl表 現。在一些實施例中，抗體識別Axl上之變性抗原決定 基，如可由西方墨點法偵測。在一些實施例中，抗體之 ICso為至少約100 ng/ml。在一些實施例中，抗體抑制Gas6 誘導之Axl磷酸化。 本發明亦提供醫藥組合物，其包含如前述段落中所述之 單株抗體及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫 藥組合物進一步包含抗VEGF抗體。 〇 本發明進一步提供包含容器、容器中所含組合物及藥品 §兒明書之製品，其中該組合物包含所結合之Αχ1抗原決定 基與選自由3G9、8B5、12A11及4F8組成之群之單株抗體 或其抗原結合片段所結合之Αχ1抗原決定基相同的單株抗 • 體，且該藥品說明書包含該組合物之使用說明。在一些實 轭例中’抗體為選自由3G9、8B5、12A11及4F8組成之群 之單株抗體。 在一態樣中，提供編碼任一種上述抗體之聚核苷酸。在 一實施例中，提供包含聚核苷酸之載體。在一實施例中， 149799.doc -17- 201106972 挺供包含載體之宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞為真 核細胞。在一實施例中，宿主細胞為CHO細胞。在一實施 例中，提供製備抗Axl抗體之方法，其中該方法包含在適 於表現編碼抗體之聚核苷酸的條件下培養宿主細胞、及分 離抗體。 在一實施例中，任一種上述抗體均為單株抗體。在一實 施例中’抗體為選自Fab、Fab，-SH、Fv、scFv或（Fab，）2片 段之抗體片段。在一實施例中，抗體為人類化抗體。在一 實施例中，抗體為人類抗體。 【實施方式】 本發明提供以組合療法使用Axl拮抗劑及VEGF拮抗劑治 療諸如癌症之病理病狀之方法。 本發明亦提供結合Axl之分離抗體及使用其之方法，例 如使用其診斷或治療諸如以下之癌症的方法：骨髓性白血 病、肺癌（例如非小細胞肺癌（NSCLC))、胃癌、乳癌、前 列腺癌、腎細胞癌、胰臟癌及神經膠母細胞瘤。 I. 一般技術
本文中所述或所參考之技術及程序為熟習該項技術者已 廣泛瞭解且共同使用的習知方法，諸如描述於以下文獻中 之廣泛使用方法·· Sambrook等人，Mo/ecw/ar J
Laboratory Manual 第 3 版（2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ； Current Proioco/s /n Mo/ecw/ar (F. M· Ausubel，等人編， (2003));叢刊 Enz少wo/〇g_y (Academic Press, 149799.doc •18· 201106972
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Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd 及 C. Dean 編，Oxford University Press, 2000) ； Using J Mawwa/ (E. Harlow 及 D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ； The 149799.doc •19- 201106972 山'es (M. Zanetti及 J. D. Capra編，Harwood Academic
Publishers, 1995);及 Ccmcer.. Practice 〇/
Owco/og_y (V. T. DeVita等人編 ’ J.B. Lippincott Company, 1993)〇 II.定義 為解釋本說明書之目的，以下定義將適用，且只要適合 時’以單數所用之術語亦將包括複數，反之亦然。若下述 任何定義與以引用的方式併入本文中之任何文獻相悖，則 以下述定義為準。 多肽「變異體」意謂與原生序列多肽具有至少約80〇/〇胺 基酸序列一致性之生物學活性多肽。該等變異體包括例如 在多肽之N或C端添加或缺失一或多個胺基酸殘基之多 狀。通常’變異體與原生序列多肽將具有至少約8〇%胺基 酸序列一致性、更佳至少約9〇%胺基酸序列一致性且甚至 更佳至少約95%胺基酸序列一致性。 「原生序列」多肽包含與源自自然界之多肽具有相同胺 基酸序列之多肽。因此，原生序列多肽可具有任何哺乳動 物之天然存在多肽的胺基酸序列。該原生序列多肽可自自 然界分離，或可由重組或合成方法製備。術語「原生序 列」多肽特定包涵天然存在之截短型或分泌型多肽（例如 胞外域序列）、天然存在之變異型（例如選擇性剪接型）多肽 及天然存在之對偶基因變異體多肽。 抗Axl抗體」為以足夠親和力及特異性結合Αχι之抗 體。所選抗體通常對Axl具有足夠強之結合親和力，例如 149799.doc -20· 201106972 抗體可以100 nM-l pM之間的Kd值結合人類Axl。在某些實 施例中，結合Axl之抗體具有$1 μΜ、£100 nM、$10 nM、 SI nM或£0.1 nM之解離常數（Kd)。舉例而言，抗體親和力 可藉由例如基於表面電漿子共振之分析法（諸如描述於PCT 申請公開案第WO 2005/012359號中之BIAcore分析法）、酶 聯免疫吸附分析法（ELISA)及競爭分析法（例如RIA)測定。 較佳地，抗Axl抗體與不相關非Axl蛋白之結合程度小於該 抗體與Axl之結合程度之約10%，如藉由例如放射免疫分 析法（RIA)所量測。在某些實施例中，抗Axl抗體可用作靶 向及干預涉及Axl活性之疾病或病狀的治療劑。此外，可 對抗體進行其他生物活性分析法，例如以評估其作為治療 劑之有效性。該等分析法在此項技術中已知且視標靶抗原 及抗體之預定用途而定。 「Axl拮抗劑」（可互換地稱為「Axl抑制劑」）為干擾 Axl活化或功能之藥劑。Axl抑制劑之實例包括Axl抗體； Axl配位體抗體；小分子Axl拮抗劑；Axl酪胺酸激酶抑制 劑；反義及抑制性RNA(例如shRNA或siRNA)分子（參見例 如WO 2004/87207)。較佳地，Axl抑制劑為結合Axl之抗體 或小分子。在一特定實施例中，Axl抑制劑對Axl具有約 1,000 nM或小於1,000 nM之結合親和力（解離常數）。在另 一實施例中，Axl抑制劑對Axl具有約100 nM或小於100 nM 之結合親和力。在另一實施例中，Axl抑制劑對Axl具有約 50 nM或小於50 nM之結合親和力。在一特定實施例中， Axl抑制劑與Axl共價結合。在一特定實施例中，Axl抑制 149799.doc -21 201106972 劑以1,000 nM或小於1,000 nM之IC5〇抑制Axl信號傳導。在 另一實施例中，Axl抑制劑以500 nM或小於500 nM之IC50 抑制Axl信號傳導。在另一實施例中，Axl抑制劑以50 nM 或小於50 nM之IC5〇抑制Axl信號傳導。 「Axl活化」係指Axl受體之活化或麟酸化。通常，Αχί 活化引起信號轉導（例如由Axl受體之胞内激酶域使Axl或 受質多肽内之酪胺酸殘基磷酸化所引起）。Axl活化可由 Axl配位體（例如Gas6)結合相關Axl受體介導。Axl配位體 結合Axl可活化Axl之激酶域且由此引起Axl中之酷胺酸殘 基磷酸化及/或其他受質多肽中之酪胺酸殘基磷酸化。 如本文中所用之術語「配位體非依賴性」，例如應用於 受體信號傳導活性時，係指信號傳導活性不依賴於配位體 之存在。舉例而言，EGFR信號傳導可由與HER家族之其 他成員（諸如HER2)二聚所引起。受體具有配位體非依賴性 激酶活性不一定會妨礙配位體與該受體之結合，從而產生 激酶活性之其他活化。 如本文中所用之術語「組成性」，例如應用於受體激酶 活性時’係指受體之連續信號傳導活性不依賴於配位體或 八他活化分子之存在。舉例而言，常見於多形性神經膠母 細胞瘤中之EGFR變異體m(EGFRvIII)已缺失其大部分胞 外域。儘管配位體不能結合£(}1?以111，然而其持續具有活 性且與異常增殖及存活相關。視受體性質而定，所有活性 可為、’且成性的或受體之活性可由其他分子（例如配位體）結 〇進步活化。一般熟習此項技術者熟知引起受體活化之 149799.doc -22- 201106972 細胞事件。舉例而言，活化可包括寡聚（例如二聚、三聚 等）成高級受體複合物。複合物可包含單一物種之蛋白 質，亦即均聚複合物。或者，複合物可包含至少兩個不同 物種之蛋白質，亦即雜聚複合物。複合物形成可由例如正 常或突變型受體在細胞表面上過度表現而引起。複合物形 成亦可由受體之一或多個特異性突變而引起。 術語「VEGF」或「VEGF-Α」用於指165-胺基酸人類血 管内皮細胞生長因子及相關的121-胺基酸、189-胺基酸及 206-胺基酸人類血管内皮細胞生長因子，如Leung等人， Science, 246:13 06 (1989)及 Houck 等人，Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)所述，以及其天然存在之對偶基因形式及經 處理形式。VEGF-A為包括 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、 VEGF-E、VEGF-F及P1GF之基因家族之一部分。VEGF-A 主要結合兩種高親和力受體酪胺酸激酶VEGFR-1 (Fit-1)及 VEGFR-2(Flk-l/KDR)，VEGFR-2(Flk-l/KDR)為 VEGF-A之 血管内皮細胞致有絲分裂信號傳導之主要傳遞質。此外， 神經纖毛蛋白-1已鑑別為結合肝素之VEGF-A同功異型物 之受體且可在血管發育中起重要作用。術語「VEGF」或 「VEGF-A」亦指非人類物種（諸如小鼠、大鼠或靈長類動 物）之VEGF。特定物種之VEGF有時用諸如hVEGF(對於人 類VEGF)或mVEGF(對於鼠類VEGF)之術語表示。術語 「VEGF」亦用於指包含165-胺基酸人類血管内皮細胞生 長因子之胺基酸8至109或1至109之多肽之截短形式或片 段。在本案中，提及任何該等形式之VEGF均可用例如 149799.doc -23- 201106972 「VEGF(8-109)」、「VEGF(1-109)」或「VEGF165」標識。 「截短」型原生VEGF之胺基酸位置如原生VEGF序列中所 示進行編號。舉例而言，截短型原生VEGF中之胺基酸位 置17(曱硫胺酸）亦為原生VEGF中之位置17(曱硫胺酸）。截 短型原生VEGF對KDR及Flt-Ι受體之結合親和力與原生 VEGF相當。 如本文中所用之術語「VEGF變異體」係指在原生VEGF 序列中包括一或多個胺基酸突變的VEGF多肽。一或多個 胺基酸突變視情況包括胺基酸取代。為簡寫本文中所述之 VEGF變異體名稱之目的，應注意編號係指沿公認原生 VEGF之胺基酸序列之胺基酸殘基位置（Leung等人（同上）及 Houck等人（同上）提供）。 「VEGF生物活性」包括與任何VEGF受體結合或任何 VEGF信號傳導活性，諸如調節正常與異常血管生成及血 小管生成（Ferrara 及 Davis-Smyth (1997) 18:4-25 ； Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543)；促進胚 胎jk小管生成及血管生成（Carmeliet等人，（1996) TVaiwre 380:435-439 ; Ferrara等人，（1996) iVai㈣ 380:439-442); 及調節雌性生殖道中環狀血管增生及骨骼生長及軟骨形成 (Ferrara 等人，（1998) iVaiwT-e Met/· 4:336-340 ; Gerber 等 人，（1999) Mei 5:623-628)。除作為血管生成及血 小管生成中之血管生成因子之外，作為多效性生長因子之 VEGF亦在其他生理學過程（諸如内皮細胞存活、血管滲透 性及血管擴張、單核細胞趨化性及鈣流入）中展現多重生 149799.doc -24- 201106972 物效應（Ferrara及Davis-Smyth (1997),同上及Cebe-Suarez 等人，Ο//· Mo/· Zz/e &ζ· 63:601-615 (2006))。此外，最 近研究已報導VEGF對少數非内皮細胞類型（諸如視網膜色 素上皮細胞、胰管細胞及許旺氏細胞（Schwann cell))的促 有絲分裂作用。Guerrin等人，（1995) ·/. Ce// 164: 385-394 ； Oberg-Welsh^ A 5 (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132 ; Sondell等人，（1999) /_ 19:5731- 5740 ° 「血管生成抑制劑」或「抗血管生成劑」係指直接或間 接抑制血管生成、血小管生成或非所要之血管通透性的小 分子量物質、聚核苷酸、多肽、分離蛋白、重組蛋白、抗 體、或其結合物或融合蛋白。應瞭解，抗血管生成劑包括 結合血管生成因子或其受體且阻斷血管生成因子或其受體 之血管生成活性的抗血·管生成劑。舉例而言，抗血管生成 劑為如上文所定義之抗體或其他血管生成劑拮抗劑，例如 抗VEGF-A或VEGF-A受體（例如KDR受體或Flt-Ι受體）之抗 體、抗PDGFR抑制劑，諸如GLEEVEC®(甲磺酸伊馬替尼 (Imatinib Mesylate))。抗血管生成劑亦包括原生血管生成 抑制劑’例如血管抑制素、内皮抑制素等。參見例如 Klagsbrun 及 D'Amore，心仙.如ν ρ/υΛ5ζ·〇/ , 53:217_39 (1991)，Streit及 Detmar, 〇„c〇_e, 22·3172 3179 (2〇〇3) (例如表3列出惡性黑色素瘤之抗血管生成療法）；
Alitalo, TtoMre Me山cz«e 5:1359-1364 (1999) ; Tonini 等 人，22:6549-6556 (2003)(例如表2列出已知的抗 149799.doc -25- 201106972 血管生成因子）；及 Sato. /«，.《/. C//«. 0«co/·，8:200-206 (2003)(例如表1列出臨床試驗中所使用的抗血管生成劑）。 「VEGF拮抗劑」係指能夠中和、阻斷、抑制、中止、 減少或干擾VEGF活性（包括其與一或多個VEGF受體之結 合）的分子。在某些實施例中，VEGF拮抗劑將VEGF之表 現量或生物活性減少或抑制至少10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90°/。或 90% 以上。在一實施例 中，受VEGF拮抗劑抑制之VEGF為VEGF(8-109)、 VEGF(1-109)或VEGF165。適用於本發明方法中之veGF拮 抗劑包括特異性結合VEGF之肽基或非肽基化合物，諸如 抗VEGF抗體及其抗原結合片段；特異性結合VEGF之多肽 或其片段；及特異結合VEGF、藉此隔絕其與一或多種受 體（例如可溶性VEGF受體蛋白或其VEGF結合片段，或嵌 合VEGF受體蛋白）結合之受體分子及衍生物；與編碼 VEGF多肽之核酸分子之至少一個片段互補的反義核苷鹼 基券聚物，與編碼VEGF多狀之核酸分子之至少一個片段 互補的小RNA ;靶向VEGF之核糖酶；抗VEGF之肽體；及 VEGF適體。 「抗VEGF抗體」為以足夠親和力及特異性結合VEGF之 抗體。所選抗體對VEGF通常具有足夠強之結合親和力， 例如抗體可以100 nM-1 pM之間的Kd值結合hVEGF。抗體 親和力可藉由例如基於表面電漿子共振之分析法（諸如描 述於PCT申請公開案第WO 2005/012359號中之BIAcore分 析法）、酶聯免疫吸附分析法（ELISA)及競爭分析法（例如 149799.doc -26- 201106972 RIA)測定。在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體可用 作把向及干預涉及VEGF活性之疾病或病狀的治療劑。此 外，可對抗體進行其他生物活性分析法，例如以評估其作 為治療劑之有效性。該等分析法在此項技術中已知且視標 靶抗原及抗體之預定用途而定。實例包括HUVEC抑制分 析法（如以下實例中所述）；腫瘤細胞生長抑制分析法（如 (例如）WO 89/06692中所述）；抗體依賴性細胞介導之細胞 毒性（ADCC)及補體介導之細胞毒性（CDC)分析法（美國專 利5,500,362);及拮抗活性或血細胞生成分析法（參見WO 95/27062) 〇抗VEGF抗體通常不會結合其他VEGF同源物， 諸如VEGF-B或VEGF-C，亦不會結合其他生長因子，諸如 P1GF、PDGF 或 bFGF。 在某些實施例中，抗VEGF抗體包括單株抗體，該單株 抗體所結合的抗原決定基與由融合瘤ATCC HB 10709所產 生之單株抗VEGF抗體A4.6.1(根據Presta等人，Cawcer/Je·?. 57:4593-4599 (1997)所產生之重組人類化抗VEGF單株抗 體）所結合之抗原決定基相同。在一實施例中，抗VEGF抗 體為「貝伐珠單抗（BV)」，亦稱為「rhuMAb VEGF」或 「AVASTIN®」。貝伐珠單抗包含突變型人類igGl構架區及 抗原結合互補決定區，抗原結合互補決定區來自阻斷人類 VEGF與其受體結合之鼠類抗hVEGF單株抗體A.4.6.1。貝 伐珠單抗（包括大部分構架區）之胺基酸序列中約93%來源 於人類IgGl ’且約7%序列來源於鼠類抗體A4.6.1。貝伐珠 單抗具有約149,000道爾頓（dalton)之分子量且經糖基化。 149799.doc •27- 201106972 貝伐珠單抗已由FDA批准與化學治療方案組合用於治療轉 移性結腸直腸癌（CRC)及非小細胞肺癌（NSCLC)。Hurwitz 等人 ’ N. Engl. J. Med. 350:2335-42 (2004)，Sandler 專 人，Ν· Engl. J. Med. 355:2542-50 (2006)。目前許多臨床 試驗正在對貝伐珠單抗治療各種癌症適應症進行研究。 Kerbel, 乂 19:45S-51S (2001) ; De Vore等人’ 尸roc. *Soc. C/M. 0加〇/· 19:485a. (2000) ; Hurwitz 等 人，Co/orecia/ C⑽cer 6:66-69 (2006) ; Johnson 等 人，Proc. dm. Soc. C7i«. 厂 20:315a (2001) ; Kabbinavar 等人，J. C"«_ 21:60-65 (2003) ; Miller 等人，
Caw. TVeai. 94:Suppl 1:S6 (2005)。 貝伐珠單抗及其他人類化抗VEGF抗體進一步描述於 2005年2月26日頒予之美國專利第6,884,879號中。其他抗 體包括G6或B20系列抗體（例如G6-31，B20-4.1)，如PCT公 開案第 WO 2005/012359號、PCT公開案第 WO 2005/044853 號及美國專利申請案60/991,302中所述，此等專利申請案 之内容以引用方式明確併入本文中。關於其他抗體，參見 美國專利第 7,060,269 號、第 6,582,959 號、第 6,703,020 號 ' 第 6,054,297 號；WO 98/45332 ； WO 96/30046 ； WO 94/10202 ; EP 0666868B1 ;美國專利申請公開案第 2006009360號、第 20050186208號、第 20030206899號、第 20030190317號、第 20030203409 號及第 20050112126號； 及 Popkov 等人，Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)。其他抗體包括可與包含殘基FI 7、 149799.doc -28- 201106972 M18、D19、Y21、Y25、Q89、191、K101、E103 及 C104 或者包含殘基 F17、Y21、Q22、Y25、D63、183 及 Q89 之 人類VEGF上之功能性抗原決定基結合的抗體。 本發明之「G6系列抗體」為來源於PCT公開案第WO 2005/012359號之圖7、24-26及34-35中任一者之G6抗體或 G6衍生抗體之序列的抗VEGF抗體，該案全部内容以引用 方式明確併入本文中。亦參見PCT公開案第WO 2005/044853號，該案全部内容以引用方式明確併入本文 中。在一實施例中，G6系列抗體與包含殘基F17、Y21、 Q22、Y25、D63、183及Q89之人類VEGF上之功能性抗原 決定基結合。 本發明之「B20系列抗體」為來源於PCT公開案第WO 2005/012359號之圖27-29中任一者之B20抗體或B20衍生抗 體之序列的抗VEGF抗體，該案全部内容以引用方式明確 併入本文中。亦參見PCT公開案第WO 2005/044853號及美 國專利申請案60/991，302，此等專利申請案之内容以引用 方式明確併入本文中。在一實施例中，B20系列抗體與包 含殘基 F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、191、K101、 E103及C104之人類VEGF上之功能性抗原決定基結合。 本發明之「功能性抗原決定基」係指抗原中之對抗體結 合起積極作用的胺基酸殘基。任一個起積極作用之抗原殘 基之突變（例如由丙胺酸或同系物突變引起之野生型VEGF 突變）將中斷抗體之結合使得抗體之相對親和力比率（IC50 突變型VEGF/IC50野生型VEGF)大於5(參見WO 2005/ 149799.doc -29- 201106972 012359之實例2)。在一實施例中，相對親和力比率係利用 溶液結合噬菌體呈現ELISA測定。簡言之，在4°C下用2 ug/ml濃度（含於PBS中）之待測試抗體之Fab形式塗佈96孔 Maxisorp免疫培養盤（NUNC)隔夜，且在室溫下用PBS、 0.5% BSA及0.05% Tween20(PBT)阻斷2小時。噬菌體呈現 hVEGF丙胺酸點突變體（殘基8-109形式）或野生型 hVEGF(8-109)於PBT中之連續稀釋物首先在室溫下、在 Fab塗佈之培養盤上培育15分鐘，且用PBS、0.05% Tween20(PBST)洗務培養盤。所結合噬菌體用1:5000於 PBT中稀釋之抗M13單株抗體辣根過氧化酶（Amersham Pharmacia) 4貞測，且用3,3'，5,5'-四曱基聯苯胺（TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD)受質顯色約5 分鐘，用1·0 M H3P〇4淬滅，且在450 nm下以分光光度計 讀取。IC5〇值之比率（IC5Q,ala/IC5〇，wt)表示結合親和力之降 低倍數（相對結合親和力）。 「酪胺酸激酶抑制劑」為在某種程度上抑制酪胺酸激酶 之酷胺酸激酶活性的分子，諸如Axl受體。 「嵌合VEGF受體蛋白」為具有來源於至少兩種不同蛋 白質之胺基酸序列的VEGF受體分子，其中至少一者為 VEGF受體蛋白。在某些實施例中，嵌合VEGF受體蛋白能 夠結合VEGF且抑制VEGF之生物活性。 具有指定抗體的「生物學特徵」之抗體為具有彼抗體之 一或多種生物學特徵的抗體，該等生物學特徵將其與結合 相同抗原之其他抗體相區分。 149799.doc -30- 201106972 片段」意謂一種多肽或核酸分子之一部分，該部分較 佳含有參考核酸分子或多肽之全長的至少1 〇%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或 95%以 上。片段可含有 10、20、30、40、50、60、70、80、90或 100、200、3 00、400、5 00、000 或 000個以上核苷酸，或 10、20、30、40、50、60、70、80、90、1〇〇、120、 140、160、180、190、200或200個以上胺基酸。 Q 「治療」係指治療性處理及防治性或預防性措施。需要 /α療者包括已患有良性、癌前期或非轉移性腫瘤者，以及 預防癌症發生或復發者。 術語「治療有效量」係指治療或預防哺乳動物疾病或病 症之治療劑的量。在癌症情況下，治療劑之治療有效量可 減少癌細胞數目；降低原發性腫瘤尺寸；抑制（亦即在某 種程度上減緩且較佳終止）癌細胞浸潤至周邊器官中；抑 制（亦即在某種程度上減緩且較佳終止）腫瘤轉移；在某種 Ο 程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上減輕與病症相 關的一或多種症狀。就藥物可防止生長及/或殺死現有癌 細胞而言，藥物可為細胞生長抑制劑及/或細胞毒性劑。 ·· :癌症治療之活體内功效可藉由例如評估存活持續時間、疾 錢展時間（ΤΤΡ)、反應率_、反應持續時間及/或生活 品質來量測。 術語「癌症」及「癌性」係指或描㈣乳動物體内通常 以細胞生長調節異常為特徵之生理病況。此定義包括良性 及惡性癌症。「早期癌症」力「早期腫瘤」意謂非侵襲性 149799.doc •31 · 201106972 或轉移性或分類為〇、I或π期癌症之癌症。癌症之實例包 括（但不限於）癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤（包括神經管母細胞 瘤及視網膜母細胞瘤）、肉瘤（包括脂肪肉瘤及滑膜細胞肉 瘤）、神經内分泌腫瘤（包括類癌腫瘤、胃泌素瘤及胰島細 胞癌）、間皮瘤、神經鞘瘤（包括聽神經瘤）、腦膜瘤、腺 癌、黑色素瘤及白血病或淋巴惡性疾病。該等癌症之更特 疋貫例包括鱗狀細胞癌（例如上皮鱗狀細胞癌）、肺癌（包括 小細胞肺癌（SCLC)、非小細胞肺癌（NSCLC)、肺腺癌及肺 鱗狀癌）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（包括胃腸癌）、胰臟 癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌（Hver cancer)、膀胱癌、肝腫瘤（hepat〇ma)、乳癌（包括轉移性乳 癌）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜或子宮 癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、陰門癌 '曱狀腺癌、肝 癌（hepatic carcinoma)、肛門癌、陰莖癌、睾丸癌、食道 癌、膽道腫瘤以及頭頸癌。 「轉移」意謂癌症自其原發性位點擴散至體内其他位 置。癌細胞可脫離原發性腫瘤，滲入淋巴及血管中，經由 血流循環且在體内其他位置處之正常組織内的遠端病灶中 生長（轉移）。轉移可為局部或遠端轉移。視腫瘤細胞脫離 原發性腫瘤、經由血流行進且停留在遠端位點而定，轉移 為連續過程。在新位點，細胞確立血液供給且可生長而形 成威脅生命之團塊。 「降低或抑制」意謂引起20%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、 3 0%、40% ' 50% 95%或大於95%之 總 149799.doc -32- 201106972 體降幅之能力。降低或抑制可涉及所治療病症之症狀、轉 移之存在或尺寸、原發性腫瘤尺寸、或血管生成病症中血 管之尺寸或數目。 本文中之術語「抗體」以最廣泛意義使用且尤其涵蓋單 株抗體、多株抗體、由至少兩個完整抗體形成之多特異性 抗體（例如雙特異性抗體），及抗體片段，只要其展現所要 生物活性即可。
「分離」抗體為已鑑別且與其天然環境之組分分離及/ 或自其天然環境之組分中回收的抗體。其天然環境之污染 物組分為干擾抗體之研究、診斷性或治療性使用的物質， 且可包括酵素、激素及其他蛋白性溶質或非蛋白性溶質。 在一些實施例中，抗體純化至（1)大於95重量％之抗體且在 一些實施例中大於99重量％(如利用例如洛瑞法 method)所測定）；（2)足以獲得N端或内部胺基酸序列之至 少15個殘基的程度（使用例如旋杯式定序儀（spinning cup sequenator));或（3)均質之程度（在還原或非還原性條件下 使用例如庫馬斯藍（Coomassie blue)或銀染料進行观· PAGE)。由於抗體之天然環境中之至少—種組分將不存 在：因此分離抗體包括重組細胞内原位之抗體。然而，分 離抗體通常藉由至少一個純化步驟來製備。 「原生抗體」通常為約150,000道爾頓之雜四聚糖蛋 白，其由兩條相同輕鏈⑹及兩條相同重鏈（H)構成。各輕 鏈經由-個共價雙硫鍵與重鏈連接，而在不同免疫球蛋白 同型之重鏈間，雙硫鍵之數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有 149799.doc -33- 201106972 律〖門隔之鏈内雙硫橋。各重鏈在-端具有可變域 (H) 〃後》大置恆定域。各輕鏈在一端具有可變域 且在另一端具有以域；輕鏈之‘以域與重鍵之第-怪定 域對準’且輕鏈可變域與重鏈可變域對準。咸信特定胺基 酸殘基形成輕鏈與重鏈可變域之間的界面。 i體之可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈之 胺基Uf域。重鏈之可變域可稱為「」。輕鏈之可變 域可稱為VL」。此等結構域通常為抗體之最易變部分且 含有抗原結合位點。 術語「可變」係、指可變域之某些部分的序列在各種抗體 之間廣泛不同且該等部分用於各種特定抗體對其特定抗原 之'、’α 〇及特異性。然而，可變性在整個抗體可變域中並非 均勻分佈。其集中於輕鏈可變域及重鏈可變域中三個稱為 问變區（HVR)之區段中。可變域之較高度保守部分稱為構 架區（FR)。原生重鏈及輕鏈之可變域各包含四個區，該 4 FR區主要採用β片構形、經由三個hvr連接，從而形成 連接β片結構的環，且在一些情況下該等環形成ρ片結構之 一部分。各鏈中之HVR經由FR區緊密結合在一起，且與另 一鏈之HVR—起促使形成抗體之抗原結合位點（參見Kabat 專 k ’ Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，National Institute of Health, Bethesda，MD (1991))。 怪定域不直接涉及抗體與抗原之結合，但展現各種效應功 能’諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。 來自任何脊椎動物種之抗體（免疫球蛋白）之「輕鏈」基 149799.doc -34- 201106972 於其恆定域之胺基酸序列可歸類為兩種明顯不同類型（稱 為κ及λ)之一。 抗體（免疫球蛋白）視其重鏈之恆定域之胺基酸序列而定 可歸為不同類。存在五種主要類別之免疫球蛋白：IgA、 IgD、IgE、IgG及IgM，且此等免疫球蛋白中之若干者可進 一步分為亞類（同型）’例如 IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi 及IgA2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈怪定域分別稱為 〇 α、β、ε、γ及μ。不同類免疫球蛋白之次單位結構及三維 構形已熟知且大體描述於例如Abbas等人，Ce//w/ar Mo/. ，第 4版（W.B. Saunders, Co” 2000)中。抗 體可為由該抗體與一或多種其他蛋白質或肽共價或非共價 結合所形成之較大融合分子的一部分。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「整個抗體」在本文 中可互換使用以指呈實質上完整形式之抗體，而非如下所 定義之抗體片段。該等術語尤其指具有包含Fc區之重鏈的 抗體。 用於本文目的之「裸抗體」為未與細胞毒性部分或放射 性標記結合之抗體。 • 「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳包含其抗原 ； 結合區。抗體片段之實例包括Fab、Fab，、F(ab，）2及Fv片 段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子及由抗體片段 形成之多特異性抗體。 木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個稱為「Fab」片段之相同 抗原結合片段’各具有單一抗原結合位點；及一殘餘 149799.doc -35- 201106972 「Fc」片段，其名稱反映其易於結晶之能力。胃蛋白酶處 理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠與抗原交聯之 F(ab')2片段。 「F”為含有完整抗原結合位點之最小抗體片段。在一 實施例中’雙州物質由緊密、非共價結合之—個重鍵可 變域與一個輕鏈可變域之二聚體組成。在單鏈卜^^幻物 質中，-個重鏈可變域與一個輕鏈可變域可經由柔性狀連 接子共價連接，使得輕鏈與重鏈可以類似於雙鏈&物質結 構之「二聚」結構結合。在此構形中，各可變域之三個 HVR相互作用以設定抓几二聚體表面上之抗原結合位 點。總而言之，六個HVR使抗體具有抗原結合特異性。，欲 而，即使單個可變域（或僅包含三個對抗原具有特異性之 HVR之Fv的一半）亦能夠識別及結合抗原但是親和力低 於完整結合位點。
Fab片段含有重鏈可變域及輕鏈可變域且亦含有輕鏈之 恆定域及重鏈之第-怪定域（CH1)。Fab，片段因在重鍵⑽ 結構域之羧基末端添加有少量殘基（包括一或多個來自抗 體鉸鏈區之半胱胺酸）而與Fab片段不同。在本文中 才曰示其中恆疋域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之以匕，。 F(ab')2抗體片段最初係作為其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab， 片段對產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。 「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之vh及vl 域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。通常，scFv多肽進 一步包含VH與VL域之間之多肽連接子，其使scFv能夠形 149799.doc -36- 201106972 成抗原結合所需結構。欲回顧scFv，參見例如Pluckthiin， The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第]Λ3 卷， Rosenburg及Moore編，（Springer-Verlag, New York, 1994)， 第 269-315頁。 術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之抗體 片段，該等片段在同一多肽鏈（VH-VL)中包含相連接之重 鏈可變域（VH)與輕鏈可變域（VL)。因使用連接子過短而無 法使同一鏈上兩個域之間配對，該等域被迫與另一條鏈之 互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體可為二 價或雙特異性抗體。雙功能抗體更全面地描述於例如EP 404,097 ； WO 1993/01161 ； Hudson# A » Nat. Med. 9:129-134 (2003);及 Hollinger 等人，iVoc. iVa". 9〇: 6444-6448 (1993)中。三功能抗體及四功能抗體亦描述 於 Hudson等人，TVai. Med 9:129-134 (2003)中。 如本文所用之術語「單株抗體」係指自一群實質上同源 抗體獲得之抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可微量存 在之可能突變（例如天然存在之突變）外均相同。因此，修 飾語「單株」表示不為個別抗體之混合物之抗體的特徵。 在某些實施例中，該單株抗體通常包括包含結合標靶之多 肽序列之抗體，其中藉由包括自複數個多肽序列選擇單個 標靶結合多肽序列之方法來獲得標靶結合多肽序列。舉例 而言，選擇方法可為自複數個純系（諸如融合瘤純系池、 噬菌體純系池或重組DNA純系池）選擇獨特純系。應暸 解，所選擇之標靶結合序列可進一步變異以例如提高對標 149799.doc •37· 201106972 靶之親和力、使標靶結合序列人類化、提高其在細胞培養 物中之產量、減少其活體内免疫原性、產生多特異性抗體 等，且包含變異之標靶結合序列的抗體亦為本發明之單株 抗體。與通常包括針對不同決定子（抗原決定基）之不同抗 體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑中之各單株抗體係 針對抗原上之單個決定子。單株抗體製劑除其特異性外， 有利之處亦在於其通常未受到其他免疫球蛋白污染。 修飾語「單株」表示自一群實質上同源抗體獲得之抗體 之特性，且不應理解為需要利用任何特定方法產生該抗 體。舉例而6，根據本發明使用之單株抗體可利用多種技 術製備’包括例如融合瘤方法（例如Kohler及Milstein, iVaiwre，256:495-97 (1975) ; Hongo等人，//少〜·而廳，14 (3): 253-260 (1995) ; Harlow等人，如价祕w d （Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版 1988) ; Hammerling等人’於：她⑽·以 r-Ce// 563-681 (Elsevier, N.Y·，1981)中）；重 組DNA方法（參見例如美國專利案第4,816,567號）；噬菌體 呈現技術（參見例如Clackson等人，TVaiwre，352: 624-628 (1991) ; Marks等人，J. Mo/. 5ζ·〇/· 222: 581-597 (1992); Sidhu等人，乂 Μσ/· 5Μ/· 338(2): 299-310 (2004); Lee等 人’乂 Mo/· 340(5): 1073-1093 (2004) ; Fellouse，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)； 及 Lee 等人 ’ J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004));及用於在動物中產生具有編碼人類免疫球蛋白之 149799.doc -38- 201106972 人類免疫球蛋白基因座或基因之一部分或全部之人類或人 類樣抗體的技術（參見例如WO 1998/24893 ; WO 1996/ 34096 ； WO 1996/33735 ; WO 1991/10741 ; Jakobovits 等 人，尸roc. #加/· Jai/· 5W. tASJ 90: 2551 (1993);
Jakobovits# A J Nature 362: 255-258 (1993) ； Bruggemann 等人，Fear in Immunol. 7:33 (1993);美國專利案第 5,545,807 號、第 5,545,806 號、第 5,569,825 號、第 5,625,126 號、第 5,633,425 號及第 5,661，016號；Marks 等 k，Bio/Technology 10: 779-783 (1992) ; Lonberg 等人， Nature 3 68: 856-859 (1994) ； Morrison, Nature 3 68: 812-813 (1994) ; Fishwild等人，5/oiec/mo/· 14: 845-851 (1996) ; Neuberger, iVaiwre Bfoiec/mo/· 14: 826 (1996);及 Lonberg 及 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)) 〇 本文之單株抗體特定包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/ 或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或亞 類之抗體中的相應序列一致或同源，而該（該等）鏈之其餘 部分與源自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體中 的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要其展 現出所需生物學活性即可（參見例如美國專利案第 4,816,567號；及 Morrison 等人，Proc. A/W/. Jccd <Scz·· 81:6851-6855 (1984))。嵌合抗體包括 PRIMATIZED® 抗 體，其中抗體之抗原結合區源自藉由例如以相關抗原使獼 猴免疫而產生之抗體。 149799.doc -39- 201106972 「人類化」形式之非人類（例如鼠類）抗體為含有源自非 人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在一實施例中， 人類化抗體為人類免疫球蛋白（受者抗體），其中受者之 HVR的殘基已經具有所要特異性、親和力及/或容量之非 人類物種（供者抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類 動物）之HVR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋 白之FR殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可 包含未發現於受者抗體或供者抗體中之殘基。可進行此等 修飾以進一步改進抗體效能。通常，人類化抗體將包含實 質上全部之至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質 上全部南變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且全部 或貫質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之fr。人類化抗 體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區通常為人類免疫 球蛋白恆定區）之至少一部分。欲知詳情，參見J〇nes等 人，施321:522-525 (1986) ; Riechmann等人， 332.323-329 (1988);及 Presta，Cwrr· Ο/?· Βζ·ο/. 2:593-596 (1992)。亦參見例如 vaswani 及 Hamilton,
Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-1 15 (1998) ； Harris, 价oc/zem. Soc. 似 23:1035-1038 (1995) ; Hurle及
Gross，Cwrr. Aoiec/z. 5:428-433 (1994);及美國專利第 6,982,321 號及第 7,087,409號。 「人類抗體」為具有與人類所產生之抗體之胺基酸序列 相對應的胺基酸序列及/或使用本文所揭示之任何製造人 類抗體之技術製得的抗體。人類抗體之此定義尤其排除包 149799.doc •40- 201106972 含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。可使用此項技術巾 已知之各種技術（包括噬菌體呈現文庫）產生人類抗體。 Hoogenboom 及 Winter, 乂 Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks等人，/. Mo/· 222:581 (1991)。描述於以下文 獻中之方法亦可用於製備人類單株抗體：Cole等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss > 第 77 頁（1985) ; Boerner 等人，《/· /wmwwo/.，147(1):86-95 (1991)中。亦參見van Dijk 及 van de Winkel，Cwrr. 5: 368-74 (2001)。人類抗體可藉由將抗原投 與轉殖基因動物來製備，該轉殖基因動物經修飾可回應抗 原攻毒而產生該等抗體、但其内源基因座已失能，例如經 免疫之異種移植小鼠（xenomice)(關於又£1^01^101；8£1^技 術，參見例如美國專利第6,075，181號及第6，15〇,584號）。 關於經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體，亦參見 例如 Li 等人，scz··仍乂，i〇3:3557_3562 (2006)° 術語「咼變區」、「HVR」或「HV」當用於本文中時係 指序列1¾變及/或形成結構上確定之環的抗體可變域區 域。通常’抗體包含六個HVR ;三個在VH中（HI、H2、 H3) ’且三個在VL中（LI、L2、L3)。在原生抗體中，H3及 L3顯示六個HVR之最高多樣性，且尤其咸信H3在賦予抗 體精細特異性方面起獨特作用。參見例如Xu等人， /廳謂13:37-45 (2000); Johnson及 Wu，於输如心 k
Molecular Biology 248:1-25 (Lo^ > Human Press, Totowa, 149799.doc -41- 201106972 NJ, 2003)。實情為，僅由重鏈組成之天然存在之駱駝科動 物抗體在不存在輕鏈的情況下亦具功能性及穩定性。參見 例如 Hamers-Casterman等人，TVaiwre 363:446-448 (1993); Sheriff等人，«SYrMci. 5/〇/· 3:733-736 (1996) 0 本文中使用並涵蓋許多HVR敍述。Kabat互補決定區 (CDR)係以序列可變性為基礎且最常使用（Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版， 公共衛生署（Public Health Service),國家衛生研究院 (National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991))。 Chothia改為指出結構環之位置（Chothia &LeskJ.Mo/· 价〇/· 196:901-917 (1987))。AbM HVR代表 Kabat HVR與 Chothia結構環之間的折衷處理，且由Oxford Molecular之 AbM抗體建模軟體使用。「接觸」HVR係基於對可用複合 物晶體結構之分析。此等HVR每一者之殘基註解如下。 環 Kabat AbM Chtrthia 接觸 LI L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 HI H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat 編號) HI H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia 編號） H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 149799.doc 201106972 HVR可包含如下之「延長HVR」：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56 或 50-56(L2)及 89-97 或 89-96(L3);及 VH 中 之 26-35(Η1)、50-65 或 49-65(H2)及 93-102、94-102 或 95-102(H3)。可變域殘基係根據Kabat等人（同上）關於該等定 義中之每一者所述進行編號。 '「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之HVR殘基以 外之可變域殘基。 八 術語「根據Kabat之可變域殘基編號」或「根據Kabati 〇 胺基酸位置編號」及其變化形式係指Kabat等人（同上）之用 於編譯抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用 該編號系統，實際線性胺基酸序列可含有更少或其他胺基 酸（對應於可變域之FR或HVR之縮短，或插入）。舉例而 言，重鏈可變域可包括位於H2殘基52後之單一胺基酸插入 (殘基52a ’根據Kabat)及位於重鏈FR殘基82後之插入殘基 (例如殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。可藉由在同源 Q 區比對抗體序列與「標準」Kabat編號序列來確定指定抗 體中殘基之Kabat編號。
Kabat編號系統通常在提及可變域中之殘基（大致為輕鏈 殘基1-107及重鏈殘基1-113)時使用（例如Kabat等人， Sequences of Immunological Interest.第 5版，公共禕ί 生署 國家衛生研究院，Bethesda，Md. (1991))。「£11編號系統」 或「EU索引」通常在提及免疫球蛋白重鍵怪定區中之殘 基時使用（例如Kabat等人（同上）報導之EU索引）。「根據 Kabat之EU索引」係指人類igGl EU抗體之殘基編號。除 149799.doc -43- 201106972 非本文中另有說明，否則提及抗體可變域中之殘基編號意 謂依據Kabat編號系統進行之殘基編號。除非本文中另有 說明’否則提及抗體恆定域中之殘基編號意謂依據EU編 號系統進行之殘基編號（參見例如美國臨時申請案第 60/640,323號關於EU編號之諸圖）。 「親和力成熟」抗體為其一或多個HVR中具有一或多個 變異的抗體，該等變異使得抗體對抗原之親和力提高（與 不具有彼等變異之親本抗體相比）。在一實施例中，親和 力成熟抗體對乾抗原具有奈莫耳（nanomolar)或甚至皮莫耳 (picomolar)親和力。可使用此項技術中已知之某些程序產 生親和力成熟抗體。舉例而言，Marks等人之Bio/
Technology 10:779-783 (1992)描述藉由 VH及 VL域改組進 行親和力成熟。HVR及/或構架殘基之隨機突變誘發描述 於例如Barbas等人 ’ Proc #加· t/以 91:3809- 3813 (1994) ; Schier 等人，Gene 169:147-155 (1995);
Yelton 等人，乂 /wwwno/. 155:1994-2004 (1995) ； Jackson 等人 ’ 乂 /wmwno/· 154(7):3310-9 (1995);及 Hawkins 等 A » J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) t。 「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體為抑制或降低其所結合 之抗原之生物活性的抗體。某些阻斷抗體或拮抗劑抗體實 質上或完全抑制抗原之生物活性。 如本文中所用之「促效劑抗體」為部分或完全模擬相關 多肽之至少一種功能活性的抗體。 「生長抑制性」抗體為防止或減少表現抗體所結合之抗 149799.doc -44 - 201106972 原之細胞增瘦的抗體。舉例而言，抗體可防止或減少活體 外及/或活體内表現Axl之癌細胞的增瘦。 「誘導細胞凋亡」之抗體為誘導漸進式細胞死亡的抗 體，如藉由標準細胞凋亡分析法所測定，諸如磷脂結合蛋 白Vhnnexin V)結合、DNA斷裂、細胞皺縮、内質網擴 張、細胞斷裂、及/或膜囊（稱為細胞凋亡體）形成。 抗體「效應功能」係指由抗體之F c區（原生序列F c區或 〇 胺基酸序列變異體Fc區）引起之彼等生物活性，且其隨抗 體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補 體依賴性細胞毒性（CDC) ; Fc受體結合；抗體依賴性細胞 介導之細胞毒性（ADCC);吞嗟作用；細胞表面受體（例如 B細胞受體）之下調；及B細胞活化。 本文中之術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之c端 區域’包括原生序列Fc區及變異型Fc區。雖然免疫球蛋白 重鏈之Fc區之邊界可變化’但人類IgG重鏈Fc區通常定義 Q 為自位置Cys226之胺基酸殘基或自pr〇23〇伸展至其叛基末 端。可移除Fc區之C端離胺酸（殘基447，根據EU編號系 統）’例如在產生或純化抗體期間或藉由對編碼抗體重鏈 • 之核酸進行重組工程改造來移除。因此，完整抗體之組成 : 可包含全部K447殘基皆移除之抗體群體、K447殘基未移 除之抗體群體’及具有存在Κ447殘基之抗體與不存在 Κ447殘基之抗體之混合物的抗體群體。 「功能性Fc區」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例 示性「效應功能」包括Clq結合；CDC ; Fc受體結合； 149799.doc •45- 201106972 ADCC ;吞噬作用；細胞表面受體（例如b細胞受體；BCR) 之下調等。該等效應功能通常需要Fc區與結合域（例如抗 體可變域）組合且可使用例如本文定義中所揭示之各種分 析法來評估。 「原生序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸 序列一致之胺基酸序列。原生序列人類Fc區包括原生序列 人類IgG! Fc區（非A異型及A異型）、原生序列人類igG2 Fc 區、原生序列人類IgG3 Fc區，及原生序列人類IgG4 Fc區 以及其天然存在之變異體。 「變異型Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾、較佳一或 多個胺基酸取代而與原生序列F c區之彼胺基酸序列不同的 胺基酸序列。較佳地，與原生序列卜區或親本多肽之以區 相比，變異Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在原生序 列Fc區中或親本多肽之Fc區中具有約一個至約十個胺基酸 取代，且較佳約一個至約五個胺基酸取代。本文中之變異 型Fc區較佳與原生序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有 至少約80%之同源性，且最佳與其具有至少約9〇%之同源 性，更佳與其具有至少約9 5 %之同源性。 「Fc受體」或r FcR」描述結合抗體卜區之受體。在一 些貝施例中，FcR為原生人類fcr。在一些實施例中，FcR 為結合IgG抗體之FcRq受體）且包括FcyRI、f^rii及 FcyRIII亞類之受體，包括該等受體之對偶基因變異體及選 擇性拼接形式。FCYRII受體包括FcyRnA(「活化受體」）及 FcYRIIB(「抑制受體」），其胺基酸序列相似，主要區別在 149799.doc •46- 201106972 於其細胞質域。活化受體FcyRIIA在其細胞質域中含有基 於免疫受體絡胺酸之活化基元（ITAM)。抑制受體FcyRllB 在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元 (ITIM)(參見例如 DaSron, J㈣m. i?ev. 15:203-234 (1997))。FcR §平述於例如 Ravetch 及 Kinet，jnm/· i?ev. /wmw⑽/ 9:45 7-92 (1991)，Capel 專人，⑽心 4:25-34 (1994);及 de Haas 等人，J. cm Me<i. 126: 330-41 (1995)中。本文中術語「FcR」涵蓋其#Fcr，包括 〇 有待將來鑑別之FcR。 術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其 負責將母體IgG傳遞至胎兒中（Guyer等人，乂 /所則„0/. 117:587 (1976)及 Kim等人，《/· /wwwno/. 24:249 (1994))及 免疫球蛋白之穩定調節。量測FcRn結合之方法已知（參見 例如 Ghetie 及 Ward·, Immunol. Today 18(12):592-598 (1997) ; Ghetie等人，iViziMre 15(7):637-640 〇 (1997) ; Hinton 等人，《/. Bzo/. CAew. 279(8):6213-6216 (2004) ; WO 2004/92219 (Hinton 等人））° 可例如在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染人類細 ： 胞株中，或在投與具有變異型Fc區之多肽的靈長類動物 ； 中，分析人類FcRn高親和力結合多肽之活體内人類FcRn 結合及jk清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述與FcR之 結合增強或減弱的抗體變異體。亦參見例如Shields等人， J.价〇/· C7zem_ 9(2):6591-6604 (2001)。 「人類效應細胞」為表現一或多種FcR且執行效應功能 149799.doc •47- 201106972 之白血球。在某些實施例中，該等細胞至少表現FcyRIII且 執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包 括周邊血液單核細胞（PBMC)、自然殺手（NK)細胞、單核 細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球。可自原生來源（例 如jk液）分離效應細胞。 「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或r ADCC」係指 一種細胞毒性形式，其中所分泌之1§結合於某些細胞毒性 細胞（例如NK細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞）上所存在之 Fc受體（FcR)使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合 攜有抗原之標靶細胞且隨後用細胞毒素殺死該標靶細胞。 介導ADCC之初級細胞、NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細 胞表現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。FcR在造血細胞上之表現 概述於 Ravetch 及 Kinet, Rev. Immunol 9:457-92 (1991)之第464頁上的表3中。為評估相關分子的adcC活 性，可執行活體外ADCC分析法，諸如美國專利第 5,500,362號或第5,821,337號或美國專利第6,737,056號 (Presta)中所述之分析法。適用於該等分析法之效應細胞 包括PBMC及NK細胞。或者或另外，相關分子的adcC活 性可於活體内’例如在諸如Clynes等人，户见a 95:652-656 (1998)所揭示之動物模型中評估。 「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指標靶細胞在補 體存在下溶解。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第 一組分（C 1 q)與結合其同源抗原之抗體（適當亞類之抗體）結 合來啟動。為評估補體活化，可進行CDC分析法，例如 I49799.doc •48- 201106972
Gazzano-Santoro 等人，·/· Immunol. Methods 202:163 (1996)中所述。具有變異Fc區胺基酸序列（具有變異型Fc區 之多肽）且C 1 q結合能力增加或減小之多肽變異體描述於例 如美國專利第6,194,551 B1號及WO 1999/51642中。亦參見 例如 Idusogie 等人，《/ 164: 4178-4184 (2000) 〇 Ο 〇 術語「包含F c區之抗體」係指包含F c區之抗體。可移除 Fc區之C端離胺酸（殘基447，根據EU編號系統），例如在抗 體純化期間或藉由對編碼抗體之核酸進行重組工程改造來 移除。因此’包含具有本發明之Fc區之抗體的組合物可包 含具有K447之抗體、所有K447均移除之抗體、或具有 K447殘基之抗體與不具有K447殘基之抗體的混合物。 「結合親和力」通常係指分子（例如抗體）之單一結合位 點與其結合搭配物（例如抗原）之間非共價相互作用力的總 和。除非另有說明，否則如本文所使用之「結合親和力」 係指反映結合對（例如抗體與抗原）成員之間丨：丨相互作用之 固有結合親和力。分子X對其搭配物γ之親和力通常可由 解離承數（Kd)表不。可藉由此項技術中已知之常用方法（包 括本文所述之方法;)量測親和力。低親和力抗體一般緩慢 :合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體—般較快： :抗原且傾向於保持較長時間結合。此項技術中已知多種 測、’。口親和力之方法，其申任一種方法均可用於本發明 :二的。量測結合親和力之特定說明性及例示性實 述於下文中。 在貫施例中，本發明之「κ $「γ估乂么从
Kd」或Kd值」係藉由放射 149799.doc •49- 201106972 性標記抗原結合性分析法（RIA)量測，該分析法利用相關 抗體之Fab形式及其抗原執行，如以下分析法所述。Fab對 抗原之溶液結合親和力如下量測：在連續滴定之未標記抗 原存在下，使Fab與最小濃度之（1251)標記之抗原平衡，接 著用塗佈抗Fab抗體之培養盤捕捉所結合抗原（參見例如 Chen等人，/. Mo/. 5b/·, 293:865-881(1999))。為建立分析 條件，用含5 pg/ml捕捉抗Fab抗體（Cappel Labs)之50 mM 碳酸鈉（pH 9.6)塗佈MICROTITER®多孔培養盤（Thermo Scientific)隔夜，且接著在室溫（約23°C)下用含2%(w/v)牛 血清白蛋白之PBS阻斷2至5小時。在非吸附培養盤（Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM [1251]-抗原與相關Fab之連 續稀釋液混合（例如按照Presta等人，Cancer及以· 57:4593_ 4599 (1997)中之抗VEGF抗體Fab-12之評估）。接著培育相 關Fab隔夜；然而，可持續培育較長時間（例如約65小時）以 確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至捕捉性培 養盤中培育（例如歷時1小時）。隨後移除溶液且用含0.1 °/〇 TWEEN-20TMiPBS洗滌培養盤八次。當培養盤乾燥時， 每孔添加 150微升閃爍體（MICROSCINT-20tm ; Packard)， 且培養盤在TOPCOUNTtm γ計數器（Packard)上計數十分 鐘。得到小於或等於20%最大結合之各Fab濃度選用於競 爭性結合分析法。 根據另一實施例，藉由在25°C下，使用BIACORE®-2000 或 BIACORE®-3000(BIAcore，Inc·，Piscataway, NJ)，利用 以約10個反應單位（RU)固定之抗原CM5晶片，使用表面電 149799.doc -50- 201106972 漿子共振分析法來量測Kd或Kd值。簡言之，根據供應商說 明書，以尽乙基二曱基胺基丙基）_碳化二亞胺鹽酸 鹽（EDC)及羥基丁二醯亞胺（NHS)活化羧甲基化葡聚糖 生物感應器晶片（CM5, BIACORE, Inc.)。用10 mM乙酸鈉 (卩114.8)稀釋抗原至5 4邑/1111(約0.2 41^)，再以5微升/分鐘之 流速注射，以獲得約10個反應單位（RU)之偶合蛋白。注射 抗原之後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應基團。為進行動 力學量測，在25°C下，以約25 μΐ/min之流速注射Fab於含 0.05% TWEEN-20tm界面活性劑之PBS(PBST)中之兩倍連 續稀釋液（0.78 nM至5〇0 nM)。使用簡單的一對一朗繆爾 結合模型（one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE ® 評估軟體3.2版），藉由同時擬合結合及解離感應圖譜來計 算結合速率（kj及解離速率（k。^)。根據k^f/ku比率計算平 衡解離常數（Kd)。參見例如Chen等人，/. Mo/. 5z‘o/· 293:865-881 (1999)。若依據上述表面電漿共振分析法，結 合速率超過106 Μ·1 s_1，則可藉由使用螢光淬滅技術測定 結合速率，該技術係在遞增濃度之抗原（如分光計（諸如配 備停流模式之分光光度計（Aviv Instruments)或具有攪拌式 比色管的.8000系列SLM-AMINCO TM分光光度計 (ThermoSpectronic))所量測）存在下，在25°C下量測含於 PBS(pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體（Fab形式）之螢光發射強 度（激發=295 nm ;發射=340 nm ’ 16 nm帶通）的增大或減 小0 本發明之「結合速率」或「k〇n」亦可如上所述使用 149799.doc 51 201106972 biacorE®_2000 或 BIAC〇RE®_3〇〇〇 系統（BiAe〇re，Inc， Piscataway，NJ)來測定。 如本文中所用之術語「實質上類似」或「實質上相同」 表示兩個數值（例如一個與本發明抗體相關且另一個與參 考/比較杬體相關）之間具有足夠高之相似度，以致熟習此 項技術者會認為，在生物學特徵依據該等值（例如L值）度 量之情況下，兩個值之間之差異很小或無生物學及/或統 β十學顯著性。以參考/比較值計，該兩個值之間的差異為 例如小於約50%、小於約40%、小於約3〇%、小於約2〇% 及/或小於約10%。 如本文中所用之片語「實質上減小」或「實質上不同」 表示兩個數值（通常一個與分子相關且另一個與參考/比較 分子相關）之間具有足夠高之差異，以致熟習此項技術者 會認為，在生物學特徵依據該等值（例如Kd值）度量之之情 況下，該兩個值之間之差異具有統計學顯著性。以參考/ 比較分子之值計’該兩個值之間的差異為例如大於約 1 0%、大於約20%、大於約30%、大於約40%及/或大於約 50%。 「純化」意謂分子存在於樣品中之濃度為至少95%或至 少98%(以含有其之樣品重量計）。 「分離」核酸分子為一種核酸分子，其已與其通常所結 合之至少一種其他核酸分子（例如在其天然環境中）分離。 分離核酸分子進一步包括通常表現核酸分子之細胞中所含 之核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其 149799.doc -52- 201106972 天然染色體位置不同之染色體位置。 如本文所使用之術語「載體」意指一種核酸分子，其能 夠轉運其所連接之另一核酸分子。一類載體為「質體」， 其指可接合其他DNA區段之環形雙股DNA。另一類載體為 病毋載體’其中可將其他DNA區段接合至病毒基因組中。 • 某些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製（例 如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載 Q 體）。其他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主 細胞之後整合至宿主細胞基因組中，且從而與宿主基因組 一起複製。此外，某些載體能夠導引其可操作地連接之基 -因之表現。該等載體在本文中稱為「重組性表現載體」或 簡稱「表現載體」。通常，適用於重組DNA技術中之表現 載體通常呈質體形式。在本說明書中，由於質體為最常用 之載體形式，故「質體」與「載體」可互換使用。 如本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任 〇 何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為 脫氧核糖核苷酸 '核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基、 及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成 反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之 核苷酸，諸如曱基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在 裝配聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序 列可雜有非核普酸組分。聚核苷酸可包含合成之後所形成 之修飾，諸如與標記結合。其他類型之修飾包括：例如， 或夕個天然存在之核苷酸經類似物「帽」取代；核苷酸 H9799.doc •53· 201106972 間修飾，諸如具有不帶電荷之鍵聯（例如膦酸甲酯、磷酸 三酯、磷醢胺酸、胺基甲酸酯等）之彼等物及具有帶電荷 鍵聯（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）之彼等物、含有 側接部分（例如蛋白質（例如核酸酶、毒素、抗體、信號 肽、ply-L-離胺酸等）之彼等物、具有嵌入劑（例如吖啶 (acridine)、補骨脂素（psoralen)等）之彼等物、含有螯合劑 (例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等）之彼等物、 含有烧化劑之彼等物、具有經修飾之鍵聯（例如α變旋異構 體核酸等）之彼等物，以及聚核苷酸之未修飾形式。此 外’通常存在於糖中之任何羥基均可經例如膦酸酯基、鱗 酸酯基置換’經標準保護基團保護或經活化以製備與其他 核苷酸之其他鍵聯；或可與固體或半固體支撐物結合。5, 及3'末端ΟΗ可經磷酸化或經】至2〇個碳原子之胺或有機封 端基團部分取代。其他羥基亦可衍生為標準保護基。聚核 苷酸亦可含有此項技術中通常已知之核糖或脫氧核糖之類 似物形式’包括例如2'-〇-甲基-核糖、2，_〇_烯丙基_核糖、 2·-氟•核糖或2’-迭氮基-核糖、碳環糖類似物、心變旋異構 糖、差向異構糖（绪如阿拉伯糖（arabin〇se)、木糖或來蘇糖 (lyxose))、哌喃醣、呋喃醣、景天庚酮糖、無環類似物及 鹼性核苷類似物（諸如曱基核糖苷）。一或多個磷酸二酯鍵 聯可經替代性連接基團置換。此等替代性連接基團包括 (但不限於）磷酸酯基經P(0)s(「硫代酸酯基」）、p(s)s (「二硫代酸酯基」）、（〇)NR2(「醯胺酸酯基」）、p(〇)R、 P(0)0R’、CO或CH2(「曱縮醛」）置換的實施例，其中各尺 149799.doc -54- 201106972 或R'獨立地為Η或者視情況含有醚（_〇_)鍵聯之經取代或未 經取代之烷基（1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或 芳烷基。並非聚核苷酸中之所有鍵聯皆需相同。上述描述 適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。 如本文中所使用之「募核苷酸」通常係指短聚核苷酸， ' 通常為單股、通常為合成的短聚核苷酸，其長度通常（但 不一定）小於約200個核苷酸。術語「募核苷酸」及「聚核 0 苷&」並不相互排斥。上文有關聚核苷酸之描述同樣且完 全適用於寡核苷酸。 除非另外指示，否則如本文中所用之術語「Αχ1」係指 來自任何脊椎動物來源（包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人類）及齧齒動物（例如小鼠及大鼠））之任何原生 AX1。該術語涵蓋「全長」、未經處理之Αχ1以及由在細胞 中處理所產生之任何形式之Axl ^該術語亦涵蓋天然存在 之Axl變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。 Ο 除非另外指示，否則如本文中所用之術語「Axl配位 體」或「Gas6」係指來自任何脊椎動物來源（包括哺乳動 物，諸如靈長類動物（例如人類）及齧齒動物（例如小鼠及大 鼠））之任何原生Axl配位體。該術語涵蓋「全長」、未經處 理之Axl配位體以及由在細胞中處理所產生之任何形式之 Axl配位體。該術語亦涵蓋天然存在之變異型A"配位體， 例如剪接變異體或對偶基因變異體。 如本文中所用’「治療（treatment)」（及其變化形式，諸 如/「treat」或「treating」）係指試圖改變所治療個體或細 149799.doc -55- 201106972 胞之自然過程之臨床干預， 預且可出於預防之目的或在臨床 病理過程中執行。理想 療效果包括預防疾病發生或復 輕症狀、減少疾病之任何直接或間接病理性後果、 預防轉移、降低疾病進展速 逐手改善或減綾疾病狀態、及 症狀緩解或預後改良。在一此 二貫她例中，使用本發明之抗 緩疾病或病症之發展或減慢疾病或病症之進展。 「個體（individual/sub㈣」丨「患者」為脊椎動物。 在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。哺乳動物包括 (但不限於）農畜（諸如牛）、運動型動物'窥物（諸如描、狗 及馬）、靈長類動物、小鼠及大鼠。在某些實施例中，哺 乳動物為人類。 術δ吾「醫樂調配物係指g由 切」你扣呈使活性成分之生物活性有效 之形式的製劑，且：a：不合料外淑分啡Λ u 、+ 3對杈與遠調配物之個體具有不可 接受之毒性的其他組分。該等調配物可為無菌的。 「無菌」調配物為無菌的或不含所有活微生物及其孢 子0 「有效量」係指有效達成所需治療或預防結果所必需之 劑量及時間量。 本發明之物質/分子之「治療有效量」可根據諸如以下 因素而變"固體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及物 質/分子在個體中誘發所要反應的能力。治療有效量涵蓋 使治療有利作用超過物質/分子之任何毒性或有害作用的 里。「預防有效I」係指有效達成所需預防結果所必需之 劑量及時間量。因為預防劑量係在疾病之前或在疾病早期 149799.doc -56- 201106972 用於個體，所以預防有效量通常（但不一定）會少於治療有 效量。 如本文中所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細 胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。該術語意欲包 括放射性同位素（例如At211、I131、1丨25、Y90、Rel86、
Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb⑴及“之放射性同位素）、 化學治療劑（例如曱胺嗓吟（methotrexate)、阿黴素 〇 (adriamicin)、長春花生物鹼（Vinca alkaloid)(長春新鹼 (vincristine)、長春鹼（vinblastine)、依託泊苷（etop〇side))、 小紅莓（doxorubicin)、美法侖（melphalan)、絲裂黴素 C(mitomycin C)、苯丁 酸氮芥（chl〇rambucii)、道諾黴素 (daunorubicin)或其他嵌入劑、酵素及其片段（諸如核酸分 解酶）、抗生素及毒素（諸如小分子毒素，或細菌、真菌、 植物或動物來源之酶促活性毒素，包括其片段及/或變異 體）’以及下文揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞 ◎ 毒性劑在下文中描述。殺腫瘤劑可引起腫瘤細胞毀壞。 「毒素」為能夠對細胞生長或增殖具有有害影響的任何 物質。 「化學治療劑」為可用於治療癌症之化合物。化學治療 ; 劑之實例包括烷基化劑’諸如塞替派（thi〇tepa)及環磷醯胺 (cyclosphosphamide ; CYTOXAN®);烷基磺酸酯，諸如白 消安（busulfan)、英丙舒凡（improsuifan)及娘泊舒凡 (piposulfan);氮丙〇定（aziridine)，諸如苯〇坐多巴 (benzodopa)、卡波酿i(carboquone)、米特多巴（meturedopa) 149799.doc -57- 201106972 及尤利多巴（uredopa);乙烯亞胺（ethylenimine)及曱基三聚 氰fe’包括，、甲密胺（altretamine)、曲他胺 (triethylenemelamine) '三伸乙基填醯胺、三伸乙基硫代填 醯胺及三羥甲基三聚氰胺；乙醯精（尤其布 拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮（bullatacin〇ne)) ; δ 9 四 氫大麻酚（屈大麻酚（dr〇nabin〇i)，MARINOL®) ; β-拉帕酮 (beta-lapachone);拉帕醇（iapach〇〇 ;秋水仙鹼 (colchicine);樺木酸（betulinic扣⑷；喜樹鹼 (camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康（t〇p〇tecan ; HYCAMTIN®) ' CPT-ll(伊立替康（irin〇teCan ; CAMPTOSAR®))、乙醯基喜樹鹼、東莨菪素（sc〇p〇iectin) 及9-胺基喜樹驗）；苔蘚抑素（bry〇statin);卡利斯塔叮 (eallystatin) ; CC_l〇65(包括其合成類似物阿多來新 (adozelesin) 卡折來新（carzelesin)及比折來新 (bizelesin)) ’ 足葉草毒素（p〇d〇phyll〇toxin);足葉草酸 (podophyllinic acid);替尼泊苷（teniposide；);念珠藻環肽 (cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒 素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括合成類似物 KW-2189 及 CB1-TM1);艾權素（eleutherobin);盤克斯塔叮 (pancratistatin);沙考的汀（sarcodictyin);海綿抑素 (spongistatin);氮芥（nitrogen mustard)，諸如苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芥（chlornaphazine)、氯璘醯胺 (chlorophosphamide)、雌莫司汀（estramustine)、異環填醯 胺（ifosfamide)、雙氯乙基甲胺（mechlorethamine)、雙氯乙 149799.doc -58- 201106972 基曱胺氧化物鹽酸鹽、美法俞、新恩比興（novembichin)、 膽固醇對苯乙酸氮芬（phenesterine)、潑尼莫司汀 (prednimustine)、曲洛填胺（trofosfamide)、尿 α密咬芥 (uracil mustard);亞硝基脲，諸如卡莫司汀（carmustine)、 氯脲黴素（chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司 、;丁（lomustine)、尼莫司 ί丁（nimustine)及雷莫司丁 (ranimnustine);抗生素，諸如稀二炔抗生素（例如刺孢黴 素（calicheamicin)，尤其刺孢黴素γΐΐ及刺孢黴素ωΐΐ (參見 Nicolaou^ A > Angew. Chem Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) ; CDP323(—種口服a-4整合素抑制劑）；達米 辛（dynemicin)，包括達米辛A;艾斯帕米辛（esperamicin); 以及新制癌菌素（neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯 二炔抗生素發色團）、阿克拉黴素（aclacinomysin)、放線菌 素（actinomycin)、安麯黴素（authramycin)、偶氮絲胺酸 (azaserine)、博來徽素（bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、 卡拉比辛（carabicin)、洋紅黴素（carminomycin)、嗜癌菌素 (carzinophilin)、色黴素（chromomycin)、放線菌素 D(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星（detorubicin)、6-重氮基-5-側氡基-L-正白胺酸、小紅莓（包括 ADRIAMYCIN®、N-嗎啉基-小紅莓、氰基-(N-嗎啉基）-小 紅莓、2-(N-吡咯啉基）_小紅莓、鹽酸小紅莓脂質體注射液 (DOXIL®)、脂質體小紅葛 TLC D-99(MYOCET®)、聚乙二 醇化脂質體小紅莓（CAELYX®)及脫氧小紅莓 (deoxydoxorubicin))、表柔比星（epirubicin)、依索比星 149799.doc •59- 201106972 (esorubicin)、伊達比星（idarubicin)、麻西羅黴素 (marcellomycin)、絲裂黴素（諸如絲裂黴素C)、黴S分酸 (mycophenolic acid)、諾拉黴素（nogalamycin)、橄禮1 黴素 (olivomycin)、培洛黴素（peplomycin)、泊非黴素 (porfiromycin)、°票吟黴素、三鐵阿黴素（quelamycin)、羅 多比星（rodorubicin)、鏈黑黴素（streptonigrin)、鏈佐星 (streptozocin)、殺結核菌素（tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、左柔比星（zorubicin); 抗代謝物，諸如曱胺嗓吟、吉西他濱（gemcitabine ; GEMZAR®)、喃氟啶（tegafur ; UFTORAL®)、卡培他濱 (capecitabine ; XELODA®)、埃坡黴素（epothilone)及 5-氣 尿°密咬（5-FU);葉酸類似物，諸如迪諾特寧（denopterin)、 甲胺嗓呤、蝶羅0令（pteropterin)、三曱曲沙（trimetrexate); 嗓呤類似物，諸如氟達拉濱（fludarabine)、6-疏基嘌呤、 硫11米°票吟（thiamiprine)、硫鳥嘌吟；°密。定類似物，諸如安 西他濱（ancitabine)、阿紮胞苦（azacitidine)、6-氮雜尿誓、 卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙脫氧尿苷、 脫氧氟尿苷、依諾他濱（enocitabine)、氮尿苷 (floxuridine);雄激素，諸如卡普睾酮（calusterone)、屈他 雄酮丙酸醋（dromostanolone propionate)、環疏雄醇 (epitiostanol)、美雄烧（mepitiostane)、睾内醋（testolactone); 抗腎上腺，諸如胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦 (mitotane)、曲洛司坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅 林酸（frolinic acid);乙醢葡搭醋（aceglatone);搭磷醯胺糖 149799.doc -60- 201106972
苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘴。定（eniluracil);安0丫 π定 (amsacrine);倍思塔布（bestrabucil);比生群（bisantrene); 艾達曲克（edatraxate);得弗伐胺（defofamine);秋水仙胺 (demecolcine);地'1 丫酿（diaziquone);艾弗鳥胺酸 (elfornithine);依利醋敍（elliptinium acetate);埃坡黴素； 依託格魯（etoglucid);硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖 (lentinan)；羅尼達寧（lonidainine)；類美登素 (maytansinoid)，諸如美登素（maytansine)及胺沙托辛 (ansamitocin);米托胍月宗（mitoguazone);米托蒽酿 (mitoxantrone)；莫比達摩（mopidanmol);硝’拉維林 (nitraerine);喷司他丁（pentostatin);凡那明（phenamet); 0比柔比星（pirarubicin);洛索蒽醒（losoxantrone) ; 2-乙基 醢肼；丙卡巴肼（procarbazine) ; PSK®多醣複合物（JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生（razoxane);根瘤 菌素（rhizoxin);西佐喃（sizofiran);鍺螺胺（spirogermanium); 細交鏈抱菌酮酸（tenuazonic acid);三亞胺酿；2,2',2'-三氯 三乙胺；單端孢黴烯族毒素（trichothecene)(尤其T-2毒素、 弗納庫林A(verracurin A)、桿抱菌素A(roridin A)及蛇形菌 毒素（anguidine));烏拉坦（urethan);長春地辛（vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®);達卡巴嗪（dacarbazine);甘 露莫司汀（mannomustine);二溴甘露醇（mitobronitol);二 漠·衛矛醇（mitolactol) ; 〇辰泊漠烧（pipobroman);曱托辛 (gacytosine);阿拉伯糖苷（arabinoside ;「Ara-C」）；塞替 派；紫杉烧類（taxoid)，例如太平洋紫杉醇（paclitaxel ; 149799.doc -61 - 201106972 TAXOL®)、白蛋白工程改造之太平洋紫杉醇之奈米顆粒調 配物（ABRAXANETM)及多西他赛（TAXOTERE®);苯丁酸 氮芥（chloranbucil) ; 6-硫代鳥嘌呤；疏嗓α令；曱胺嗓呤； 舶藥劑，諸如順始（cisplatin)、奥沙利舶（oxaliplatin)(例如 ELOXATIN®)及卡I白（carboplatin);防止微管蛋白聚合形 成微管的長春花（vincas)，包括長春鹼（VELBAN®)、長春 新鹼（ONCOVIN®)、長春地辛（ELDISINE®、FILDESIN®) 及長春瑞賓（vinorelbine ; NAVELBINE®);依託泊苷（VP-16);異環磷醯胺；米托蒽醌；曱醯四氫葉酸（leucovorin); 諾凡特龍（novantrone);依達曲沙（edatrexate);道諾黴 素；胺基蝶呤；伊班膦酸鹽（ibandronate);拓撲異構酶抑 制劑RFS 2000 ;二氟曱基鳥胺酸（DMFO);類視黃素，諸 如視黃酸，包括貝瑟羅汀（bexarotene ; TARGRETIN®); 雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽（clodronate)(例如BONEFOS® 或 OSTAC®)、依替膦酸鹽（etidronate ; DIDROCAL®)、 NE-58095、°坐來膦酸（zoledronic acid)/嗤來膦酸鹽 (zoledronate ; ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽（alendronate ; FOSAMAX®)、帕米膦酸鹽（pamidronate ; AREDIA®)、替 魯膦酸鹽（tiludronate ； SKELID®)或利塞膦酸鹽 (risedronate ; ACTONEL®);曲沙他濱（troxacitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，尤其抑制 與異常細胞增殖有關之信號傳導路徑中之基因之表現的反 義寡核苷酸，諸如PKC-(x、Raf、H-Ras及表皮生長因子受 體（EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫 149799.doc •62· 201106972 苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及 VAXID®疫苗；拓撲異構酶1抑制劑（例如LURTOTECAN®); rmRH(例如 ABARELIX®) ; BAY439006(索拉非尼 (sorafenib) ; Bayer) ; SU-11248(舒尼替尼（sunitinib)， SUTENT®，Pfizer);哌立福新（perifosine)、COX-2抑制劑 (例如塞來昔布（celecoxib)或依託昔布（etoricoxib))、蛋白 酶體抑制劑（例如PS341);硼替佐米（bortezomib ; VELCADE®) ; CCI-779 ;替吡法尼（tipifarnib ; R1 1577); 索拉非尼（orafenib)、ABT510 ; Bcl-2抑制劑，諸如奥利默 森納（oblimersen sodium ; GENASENSE®);匹克生璦 (pixantrone) ; EGFR抑制劑（參見以下定義）；酷胺酸激酶 抑制劑（參見以下定義）；絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑，諸如 雷帕黴素（rapamycin)(西羅莫司（sirolimus)，RAPAMUNE®); 法尼基轉移酶（farnesyltransferase)抑制劑，諸如洛那法尼 (lonafarnib ; SCH 6636，SARASARTM);及上述任一者之 醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及上述兩者或兩者 以上之組合，諸如CHOP，其為環磷醯胺、小紅莓、長春 新鹼及潑尼龍之組合療法之縮寫；及FOLFOX，其為奥沙 利鉑（ELOXATINtm)與5-FU及曱醯四氫葉酸之組合治療方 案的縮寫。 如本文中所定義之化學治療劑包括用以調節、減少、阻 斷或抑制可促進癌生長之激素之作用的「抗激素劑」或 「内分泌治療劑」。其可為激素本身，包括（但不限於）：具 有混合促效/拮抗概況之抗雌激素，包括他莫昔芬 149799.doc -63- 201106972 (NOLVADEX®)、4-經基他莫昔芬、托瑞米芬（toremifene ; FARESTON®)、艾多昔芬（idoxifene)、曲洛昔芬 (droloxifene)、雷洛昔芬（rai〇xifene ; EVISTA®)、曲沃昔 芬（trioxifene)、雷洛昔芬（keoxifene)及選擇性雌激素受體 調節劑（SERM)，諸如SERM3 ;不具有促效性質之純抗雌 激素，諸如氟維司群（fulvestrant ; FASLODEX®)及 EM800(該等藥劑可阻斷雌激素受體（ER)二聚化、抑制 DNA結合、增加ER週轉且/或抑制ER含量）；芳香酶抑制 劑，包括類固醇芳香酶抑制劑（諸如福美司坦（formestane) 及依西美坦（exemestane ; AROMASIN®))及非類固醇芳香 酶抑制劑（諸如阿那曲唑（anastrazole ; ARIMIDEX®)、來 曲。坐（letrozole ; FEMARA®)及胺魯米特），以及其他芳香 酶抑制劑，包括伏氣0坐（vorozole ; RIVISOR®)、乙酸曱地 孕酮（megestrol acetate ; MEGASE®)、法屈0坐（fadrozole) 及4(5)-咪唑；黃體激素釋放激素促效劑，包括亮丙立德 (leuprolide ; LUPRON® 及 ELIGARD®)、戈舍瑞林 (goserelin)、布舍瑞林（buserelin)及曲特瑞林（tripterelin); 性類固醇，包括孕激素（諸如乙酸甲地孕酮及乙酸曱羥孕 酮）、雌激素（諸如己浠雌紛（diethylstilbestrol)及普雷馬林 (premarin))及雄激素/類視黃素（諸如H經曱基睾_ (fluoxymesterone)、所有反式視黃酸及芬維A胺 (fenretinide));奥那司酮（onapristone);抗孕酮；雌激素受 體下調劑（ERD);抗雄激素’諸如氟他胺（flutamide)、尼 魯胺（nilutamide)及比卡魯胺（bicalutamide);及上述任一者 149799.doc -64- 201106972 之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及上述兩者或兩 者以上之組合。 §用於本文中時，「生長抑制劑」係指活體外或活體内 , 抑制細胞（諸如表現Axl之細胞）生長之化合物或組合物。因 此，生長抑制劑可為大大降低s期細胞（諸如表現Axl之細 胞）百分率的藥劑。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期 進程（除S期外之階段）之藥劑，諸如誘導G1停滯及Μ期停 〇 滯之藥劑。經典Μ期阻斷劑包括長春花（長春新鹼及長春 鹼）、紫杉烷（taxane)及拓撲異構酶Π抑制劑（諸如多柔比 星、表柔比星、柔紅黴素、依託泊苷及博萊黴素）。阻滞 G1之彼等藥劑亦導致s期停滯，例如DNA烷化劑，諸如他 莫西芬、潑尼松（prednisone)、氮烯唑胺、氮芥、順鉑、甲 胺喋呤、5-氟尿啶及ara_c。更多資訊可見於Mendeis〇hn及 Israel 編，The Molecular Basis of Cancer·,第 1 章， Murakami等人之題為「Cell cycle regulati〇n，〇nc〇genes, 〇 and antineoplastic drugs」（WB Saunders， 1995)，例如第13頁。紫杉烷（太平洋紫杉醇及多西他赛 (docetaxel))均為源自紫杉樹之抗癌藥。源自歐洲紫杉之多 西他賽（TAXOTERE®，Rh〇ne-poulenc Rorer)為太平洋紫杉 醇（TAXOL®，BriSt〇l-Myers Squibb)之半合成類似物。紫杉 醇及多西他賽促進微管蛋白二聚體組裝成微管且藉由防止 解聚而使微管穩定，從而抑制細胞有絲分裂。 III.組合物及方法 本發明之特徵在於以組合療法使用Axl拮抗劑及VEGF拮 149799.doc -65- 201106972 抗劑治療諸如腫瘤之病理病狀。本發明亦提供抗Axl抗體 及其使用方法。
Axl拮抗劑 適用於本發明方法之Αχί拮抗劑包括特異性結合Αχί之多 肽、抗Axl抗體、Axl小分子、特異性結合Αχί之受體分子 及衍生物’及融合蛋白。Axl拮抗劑亦包括Axl多肽之拮抗 性變異體、siRNA、針對Axl及Axl配位體之RNA適體及肽 體。適用於本發明方法之Axl拮抗劑亦包括抗Axl配位體抗 體、抗Axl配位體多肽、特異性結合Αχί配位體之Axl受體 分子及衍生物。此等每一者之實例描述於下文中。在一些 實施例中，Axl拮抗劑不為華法林。 適用於本發明方法之抗Axl抗體包括以足夠親和力及特 異性結合Axl且可降低或抑制Axl活性之任何抗體。 抗Axl抗體在此項技術中已熟知且進一步描述於本文 中。參見例如 WO 2009/062690 ; WO 2009/06396 ;共同擁 有之同在申請中之美國專利申請案61/356,508(2010年6月 18曰申請）；5,468,634。在一實施例中，抗Axl抗體為單株 抗體。在一實施例中，抗Axl抗體為抗體片段，例如Fab、 Fab'-SH、Fv、scFv 或（Fab')2 片段。在一實施例中，抗 Αχ1 抗體為欲合、人類化或人類抗體。在一實施例中，抗Αχι 抗體經純化。在某些實施例中，組合物為用於治療癌症之 醫藥調配物。 由融合瘤產生之例示性單株抗體提供於本文中且描述於 實例8中。該等抗體稱為3G9、8B5、12A11及4F8。在一態 149799.doc •66· 201106972 樣中，提供與3G9、8B5、12A11及4F8競爭結合Axl之單株 抗體。亦提供所結合之抗原決定基與3G9、8B5、12A11及 4F8所結合之抗原決定基相同的單株抗體。 在一些實施例中，抗Axl抗體包含含有序列EVQLVESG GGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSGSWIHWVRQAPGKGLEW VGWINPYRGYAYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLR AEDTAVYYCAREYSGWGGSSVGYAMDYWGQGTLV(SEQ ID NO:)的重鏈可變區，及含有序列DIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFG QGTKVEIKR(SEQIDNO)的輕鏈可變區。 抗Axl配位體Gas 6之抗體亦可用於本發明之方法中。 特異性結合Axl配位體（例如Gas6)之Axl分子或其片段可 用於本發明之方法中，例如結合且螯合Axl配位體蛋白 質、藉此阻止其信號傳導的Axl分子或其片段。Axl分子或 其Axl配位體結合片段較佳為可溶形式。在一些實施例 中，受體之可溶形式藉由結合Axl配位體而對Axl蛋白質之 生物活性施加抑制作用，藉此防止其結合標靶細胞表面上 存在之其天然受體。亦包括Axl融合蛋白，其實例描述於 下文中。亦參見Nagata，J Biol Chem 271:30022 (1996); 2005/0185471 ; McClosky等人，J Biol Chem 272: 23285 (1997) ; Fridell等人，J Biol Chem 273:7123 (1998)。 可溶性Axl蛋白質或嵌合Axl蛋白質包括不經由跨膜域而 固著至細胞表面之Axl蛋白質。因而，Axl之可溶形式（包 149799.doc •67- 201106972 括嵌合受體蛋白）儘管能夠結合Axl配位體且使Axl配位體 失活’但不包含跨膜域且因此通常不與表現分子的細胞之 細胞膜結合。 本發明之方法中可使用特異性結合Axl且阻斷或降低Axl 之活化，藉此防止其信號傳導的Axl配位體分子或其片 段。
Axl siRNA描述且舉例說明於本文中且亦描述於例如w〇 2009/005813 中。 適體為核酸分子，其形成的三級結構特異性結合諸如 Axl配位體多肽之標把分子。此項技術中已熟知適體之產 生及治療用途。參見例如美國專利案第5,475,096號。Axl 配位體適體為聚乙二醇化修飾之寡核普酸，其採用使得其 能夠與細胞外Axl配位體結合之三維構形。關於適體之其 他資afl可見於美國專利申請公開案第20060148748號中。 肽體為連接至編碼免疫球蛋白分子之片段或部分之胺基 酸序列的肽序列。多肽可源自藉由任何特異性結合方法所 選擇之隨機化序列，該方法包括（但不限於）噬菌體呈現技 術。在一較佳實施例中，可將所選多肽連接至編碼免疫球 蛋白之Fc部分的胺基酸序列。特異性結合且拮抗Αχι配位 體或Axl之肽體亦適用於本發明之方法中。
Axl拮抗劑包括小分子，諸如R 428(Rigei ; 丨等 人，Cancer Research 70, 1544 (2〇1〇))及 pF〇234i〇66。在 一些實施例中，小分子Axl拮抗劑不為華法林。 VEGF拮抗劑 149799.doc •68- 201106972 VEGF拮抗劑係指能夠結合VEGF、降低VEGF表現量或 中和、阻斷、抑制、中止、降低或干擾VEGF生物學活性 (包括VEGF與一或多種VEGF受體結合及VEGF介導之血管 生成及内皮細胞存活或增殖）的分子。適用於本發明方法 中之VEGF拮抗劑包括特異性結合VEGF之多肽、抗VEGF 抗體及其抗原結合片段、特異性結合VEGF藉此隔絕其與 一或多種受體結合之受體分子及衍生物、融合蛋白（例如 VEGF-Trap(Regeneron))及 VEGF12i-白樹素（gelonin) (Peregrine)。VEGF拮抗劑亦包括VEGF多肽之拮抗性變異 體、針對VEGF之RNA適體及肽體。下文描述此等每一者 的實例。 適用於本發明方法中之抗VEGF抗體包括以足夠親和力 及特異性結合VEGF且可降低或抑制VEGF生物活性之任何 抗體或其抗原結合片段。抗VEGF抗體通常不結合諸如 VEGF-B或VEGF-C之其他VEGF同源物，亦不結合諸如 P1GF、PDGF或bFGF之其他生長因子。該等抗VEGF抗體 之實例包括（但不限於）本文中在「定義」之下所提供之抗 體。 兩種經最佳表徵之VEGF受體為VEGFR1 (亦稱為Fit-1)及 VEGFR2(關於鼠類同系物，亦稱為KDR及FLK-1)。各受體 對各VEGF家族成員之特異性可變化，但VEGF-A與Fit-1及 KDR均結合。全長Flt-1受體包括具有七個Ig域之細胞外 域、跨膜域及具有酪胺酸激酶活性之細胞内域。細胞外域 涉及結合VEGF且細胞内域涉及信號轉導。 149799.doc -69- 201106972 特異性結合VEGF之VEGF受體分子或其片段可在本發明 之方法中用於結合且螯合VEGF蛋白質，藉此防止其信號 傳導。在某些實施例中，VEGF受體分子或其VEGF結合片 段為可溶形式，諸如sFlt-1。受體之可溶形式藉由結合 VEGF來對VEGF蛋白質之生物活性發揮抑制作用，藉此阻 止VEGF與標靶細胞表面上存在之其天然受體結合。亦包 括VEGF受體融合蛋白，其實例描述於下文中。 嵌合VEGF受體蛋白為具有源自至少兩種不同蛋白質之 胺基酸序列的受體分子，其中至少一種蛋白質為能夠結合 VEGF且抑制VEGF之生物活性的VEGF受體蛋白（例如flt_l 或KDR受體）。在某些實施例中，本發明之嵌合VEGF受體 蛋白由源自僅兩種不同VEGF受體分子之胺基酸序列組 成；然而，包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個或 所有七個來自fit-1及/或KDR受體之細胞外配位體結合區之 Ig樣結構域的胺基酸序列可連接至其他不相關蛋白質之胺 基酸序列，例如免疫球蛋白序列。可與Ig樣結構域組合之 其他胺基酸序列對於一般技術者顯而易知。嵌合VEGF受 體蛋白之實例包括可溶性Flt-1/Fc、KDR/Fc或FLt-1/KDR/Fc(亦稱為VEGF Trap)(參見例如PCT申請公開案第 WO 97/44453)。 本發明之可溶性VEGF受體蛋白或嵌合VEGF受體蛋白包 括不經由跨膜域固定至細胞表面之VEGF受體蛋白。因 此，VEGF受體之可溶形式（包括嵌合受體蛋白）儘管能夠結 合VEGF且使VEGF失活，但不包含跨膜域且因此通常不與 149799.doc -70- 201106972 表現分子的細胞之細胞膜結合。 適體為核酸分子’其形成的三級結構特異性結合諸如 VEGF多肽之標靶分子。此項技術中已熟知適體之產生及 治療用途。參見例如美國專利案第5,475,〇96號。VEGF適 體為聚乙二醇化修飾之券核苷酸，其採用使得其能夠與細 ’胞外VEGF結合之三維構形。靶向VEGF以治療年齡相關之 黃斑變性的治療有效適體之一實例為派加替尼 〇 (Pegaptanib ; Macugen™, 0SI)。關於適體之其他資訊可見 於美國專利申請公開案第20060148748號中。 肽體為連接至編碼免疫球蛋白分子之片段或部分之胺基 酸序列的肽序列。多肽可源自藉由任何特異性結合方法所 選擇之隨機化序列，該方法包括（但不限於）噬菌體呈現技 術。在一較佳實施例中，可將所選多肽連接至編碼免疫球 蛋白之Fc部分的胺基酸序列。特異性結合vegf且拮抗 VEGF之肽體亦適用於本發明之方法中。 〇 机後 1.抗體片段 本發明涵蓋抗體片段。抗體片段可藉由傳統方法產生， -諸如酶促消化’或藉由重組技術產生。在某些情形下，使 :用抗體片段優於使用整個抗體。較小尺寸之片段允許迅速 清除且更容易進入實體腫瘤中。欲回顧某些抗體片段，參 M, Hudson^ A > (2003) Nat. Med. 9:129-134 〇 已開發用於產生抗體片段的多種技術。傳統上，經由完 整抗體之蛋白水解消化獲得該等片段（參見例如M〇rim〇t〇 149799.doc -71 201106972 專尺 ’ Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及 Brennan 等人，229:81 (1 985))。然而’該等片段現可由重組宿主細胞直接產生。 Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可由大腸桿菌表現且分泌，從 而容易產生大量此等片段。可自上文所討論之抗體噬菌體 文庫中分離抗體片段。或者，可自大腸桿菌直接回收Fabi_ SH片段且以化學方式偶合而形成p(ab，）2片段（Carter等人， 扪1〇:163_167 (1992))。根據另一方法， F(ab’）2片段可自重組宿主細胞培養物直接分離。美國專利 第5,869,046號中描述包含救助受體結合抗原決定基殘基、 活體内半衰期延長的Fab及F(ab，）2片段。產生抗體片段之 其他技術對於熟習此項技術者顯而易知。在某些實施例 中，抗體為單鏈Fv片段（scFv)。參見w〇 93/16185、美國 專利第5,571，894號及第5,587,458號。Fv及scFv為完整結合 位點不含恆定區的唯一物質；因此，其可適於在活體内使 用期間減少非特異性結合。可構築scFv融合蛋白以使效應 蛋白在ScFv之胺基或羧基末端融合。參見办 B0rrebaeck編（同上）。抗體片段亦可為例如 「線性抗體」，例如美國專利第5,641，87〇號中所述。該等 線性抗體可為單特異性或雙特異性抗體。 2.人類化抗體 本發明涵盍人類化抗體。此項技術中已知將非人類抗體 人類化之多種方法。舉例而言，人類化抗體中可引入一或 多個來自非人類來源之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘 149799.doc -72- 201106972 基通常稱為「輸入」殘基，其通常取自「輸入」可變域。 人類化基本上可依循Winter及同事之方法（jones等人， (1986) 321:522-525 ; Riechmann 等人，（1988) itowre 332:323-327 ; Verhoeyen等人，（1988) 加e 239:
1534-1536)藉由南變區序列取代人類抗體之相應序列來進 行。因此，該等「人類化」抗體為嵌合抗體（美國專利第 4,816,567號），其中實質上小於完整人類可變域已經非人 類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為人類 抗體，其中一些高變區殘基及可能之一些FR殘基已經齧齒 動物抗體之類似位點之殘基取代。 選擇用於產生人類化抗體之人類可變域（輕鏈與重鏈）對 於減少抗原性極其重要。根據所謂之「最佳擬合」方法， 對照已知人類可變域序列之完整文庫篩檢齧齒動物抗體之 可變域序列。隨後將與齧齒動物之該序列最接近之人類序 列視作人類化抗體之人類構架。參見例如以邮等人， (1993) J. 151:2296 ; Ch〇thia等人，ο%?)
Mo/.此〇/. 196:901。另一方法係使用源自含有特定亞群之 輕鏈或重鏈之所有人類抗體之共同序列的特定構架。若干 架。參見例如Carter等 USA, 89:4285 ； Presta^ 不同的人類化抗體可使用相同構 k，（\992) Proc. Natl. Acad. Sci. 人，（1993) J. /w卿⑽/·，151:2623。 通常更需要使抗體在保持對抗原之高親和力及其他良好 生物特性下經人類化。為達成此目的，根據—種方法:藉 由使用親本序列及人類化序列之三維模型分析親本序列^ 149799.doc -73- 201106972 、u生人類化產物的過程來製備人類化抗體。三维免 疫球蛋白模型普遍可得且為熟習此項技術者熟知。可利用 電腦程式說明及呈現所選擇之候選免疫球蛋白序列之可能 二維構形結構。檢查此等呈現可分析殘基在候選免疫球蛋 白序列之功能中的可能作用，亦即，分析影響候選免疫球 蛋白結合其抗原之能力的殘基。藉此，可自接受者及輸入 序列選擇FR殘基且加以組合以便獲得所需抗體特徵，諸如 對標乾抗狀親和力增加。通f，冑變區殘基直接且最實 質性地涉及影響抗原結合。 3.人類抗體 可藉由將選自人類源噬菌體呈現文庫之Fv純系可變域序 列與如上所述之已知人難定域序列組合來構築本發明之 人類抗體。或者’可利㈣合瘤方法製造本發明之人類單 株抗體。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小氣_人 類雜交骨髓瘤（heteromyei〇ma)細胞株已描述於例如K〇zb〇r 乂 /讲卿似/·，133: 3001 (1984) ; Br〇deur等人’
Antibody Production Techniques and Applications ,箄 s\-63 頁（Marcel Dekker，Inc.，New York，1987);及 Boernei^ 人，《/. /mmw«o/·, 147: 86 (1991)中。 現可產生轉殖基因動物（例如小鼠），其免疫後能夠在缺 乏内源免疫球蛋白產生之情況下產生全譜系之人類抗體。 舉例而言，已描述敌合及生殖系突變體小鼠中抗體重鏈連 接£ (JH)基因的同種接合子缺失會完全抑制内源抗體產 生。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該等生殖系 149799.doc -74- 201106972 突變體小鼠體内將會在抗原攻擊後引起人類抗體之產生。 參見例如 Jakobovits等人 ’ Proc. Jcac/. Scz· C/a, 90: 2551 (1993) ; Jakobovits等人，iVaiwre, 362: 255 (1993);
Bruggermann等人，/mmwwo/·, 7: 33 (1993)。 '· 亦可使用基因改組自非人類（例如齧齒動物）抗體獲得人 類抗體’其中人類抗體具有與初始非人類抗體類似之親和 力及特異性。根據此方法（其亦稱「抗原決定基印記 Q 法」），藉由如上所述之噬菌體呈現技術所獲得之非人類 抗體片段之重鏈或輕鏈可變區可以人類V域基因之譜系置 換’形成非人類鍵/人類鍵scFv或Fab喪合體之群。以抗原 進行選擇可分離非人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab，其中人 類鏈可恢復在移除初級噬菌體呈現純系中之相應非人類鏈 時所損壞的抗原結合位點，亦即抗原決定基決定（印記）人 類鏈搭配物之選擇。當重複此過程以置換剩餘非人類鏈 時，獲得人類抗體（參見1993年4月1日公開之PCT w〇 ◎ 93/06213)。與傳統上藉由CDR移植使非人類抗體人類化不 同，此技術提供不具有非人類來源之1711或（：〇尺殘基的完全 人類抗體。 4·雙特異性抗體 雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性的 單株抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體為人類或人類 化抗體。纟某些實施例中，結合特異性之一係針對—而 另-者係針對其他任何抗原4某些實施射，雙特異性 抗體可結合AXl之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦 149799.doc •75- 201106972 可用於將細胞毒性劑定位於表現Axl之細胞。此等抗體具 有結合Axl之臂及結合細胞毒性劑之臂，該細胞毒性劑諸 如皂草素（saporin)、抗干擾素-α、長春花生物鹼、蓖麻毒 素Α鏈、甲胺喋呤或放射性同位素半抗原。可製備全長抗 體或抗體片段形式之雙特異性抗體（例如F(ab，）2雙特異性抗 體）。 此項技術中已知製造雙特異性抗體之方法。傳統上，雙 特異性抗體之重組產生法係基於兩對免疫球蛋白重鏈_輕 鏈之共同表現，其中兩個重鏈具有不同特異性（Milstein及 Cuello, 305: 537 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈及 輕鍵之隨機分配’此專融合瘤（四源雜交瘤）產生10種不同 抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確雙特異性結 構。通常藉由親和層析步驟進行之正確分子之純化法相當 繁瑣’且產物產率較低。類似程序揭示於i 993年5月i 3日 公開之 WO 93/08829及 Traunecker 等人，£从50 /·，10: 3655 (1991)中。 根據不同方法，將具所需結合特異性（抗體_抗原結合位 點）之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。例如與 免疫球蛋白重鏈恆定域（包含敍鏈、CH2及CH3區之至少一 部分）融合。在某些實施例中，含有輕鏈結合所需位點的 第一重鏈悝定區（CH1)存在於至少一個融合部分。將編碼 免疫球蛋白重鏈融合體及（若需要）免疫球蛋白輕鏈2DNA 插入個別表現載體中，且共轉染至適當宿主生物體中。從 而在使用不相等比率之三個多肽鏈以建構得到最佳產量的 149799.doc -76· 201106972 實施例中，為調整這三個多肽片段之相互比例提供極大靈 活性。然而，當相等比率之至少兩個多狀鍵的表現造成高 產量或當比率並非特別重要時，可將兩個或全部三個多肽 鍵之編碼序列插入一個表現載體中。 在此方法之一實施例中，雙特異性抗體係由位於一臂中 ' 之雜交免疫球蛋白重鏈（具有第一結合特異性）與位於另一 臂中之雜交免疫球蛋白重鏈_輕鏈對（提供第二結合特異性） 〇 組成。已發現此不對稱結構有利於將所需雙特異性化合物 與非所要之免疫球蛋白鏈組合分離，因此免疫球蛋白輕鍵 存在於雙特異性分子之僅一半中可提供一種簡便之分離方 式。此方法揭示於wo 94/04690中。關於產生雙特異性抗 體之其他細節，參見例如Suresh等人，抓如心以 121:210 (1986)。 根據另一方法，可工程改造一對抗體分子間之界面以使 自重組細胞培養物回收雜二聚體之百分比最大化。該界面 O g 3抗體恆定域之Ch3域之至少一部分。以此方法，使第 k體分子界面之一或多條小胺基酸側鏈經較大側鏈（例 如酪胺酸或色胺酸）置換。藉由較小胺基酸側鏈（例如丙胺 酸或蘇胺酸）置換較大胺基酸側鏈可在第二抗體分子之界 產生尺寸與較大側鏈相同或類似之互補「空腔」。由 此提供增加雜二聚體（而非其他非所要最終產物，諸如同 二聚體）之產量的機制。 雙特異性抗體包括交聯或「異結合」抗體。舉例而言， 異結合之抗體之一可與抗生物素蛋0(avidin)偶合，另一 149799.doc •77- 201106972 者與生物素偶合。已提出該等抗體例如可使免疫系統細胞 靶向不需要細胞（美國專利案第4,676,980號）且可用於治療 HIV 感染（WO 91/00360、WO 92/00373 及 EP 03089)。可使 用任何適宜的交聯方法製造異結合抗體。適當交聯劑及多 種交聯技術在此項技術中已熟知且揭示於美國專利案第 4,676,980號中。 自抗體片段產生雙特異性抗體之技術已描述於文獻中。 舉例而言，可使用化學鍵聯製備雙特異性抗體。Brennan 等人，229: 81 (1985)描述一種程序，其中完整抗 體經蛋白質裂解而產生F(ab')2片段。此等片段在二硫醇錯 合劑亞砷酸鈉存在下還原以穩定鄰近二硫醇且防止分子間 二硫鍵形成。接著所產生之Fab’片段轉化為硫代硝基苯甲 酸酯（TNB)衍生物。接著藉由髄基乙胺還原將Faiy-TNB衍 生物之一再轉化為Fab'-硫醇，且與等莫耳量之另一種Fab1-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性 抗體可用作選擇性固定酵素之藥劑。 最新進展已可方便地自大腸桿菌直接回收Fab’-SH片 段，該等片段可經化學偶合而形成雙特異性抗體。 Shalaby等人，MW.，175: 217-225 (1992)描述完全 人類化雙特異性抗體F(ab’）2分子之製備。各Fab'片段分別 由大腸桿菌分泌且進行活體外定向化學偶合以形成雙特異 性抗體。由此形成之雙特異性抗體能夠結合過度表現 HER2受體之細胞及正常人類T細胞，且引發人類細胞毒性 淋巴細胞針對人類乳房腫瘤標靶之溶解活性。 149799.doc •78· 201106972 亦已描述直接在重組細胞培養物中形成且分離雙特異性 抗體片段之多種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生 雙特異性k體。Kostelny等人，乂 /所則仙厂，148(5):1547_ 15 53 (1992)。藉由基因融合將來自F〇s及Jun蛋白之白胺酸 拉鏈肽與兩種不同抗體之Fab·部分連接。抗體均二聚體在 鉸鏈區還原而形成單體，且接著再氧化而形成抗體雜二聚 體。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。H〇llinger等人’ 尸roc. Α^αί/· Jcai/· 5W· 90:6444-6448 (1993)所述之「雙 功能抗體」技術已提供一種用於製造雙特異性抗體片段之 替代機制。該等片段包含經連接子連接至輕鏈可變域（VL) 之重鏈可變域（VH) ’該連接子過短而無法使同一鏈上之兩 個結構域之間配對。因此，一個片段之VH及VL域被迫與 另一個片段之互補VL及VH域配對，由此形成兩個抗原結 合位點。另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體形成雙特異性 抗體片段之朿略亦已報導。參見Gruber等人，J. ， 152:5368 (1994)° 涵蓋兩價以上之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗 體。Tutt等人，/· /mwMwo/· 147: 60 (1991)。 5.多價抗體 多價抗體可比二價抗體更快地被表現抗體所結合之抗原 的細胞内化（及/或異化）。本發明之抗體可為具有三個或三 個以上抗原結合位點之多價抗體（IgM類別之抗體除外）（例 如四價抗體）’多價抗體可容易藉由重組表現編碼抗體多 肽鏈之核酸來製得。多價抗體可包含二聚域及三個或三個 149799.doc •79· 201106972 以上抗原結合位點。在某些實施例中，二聚域包含Fc區或 鉸鏈區（或由Fc區或鉸鏈區組成）。在此情形中，抗體將包 含Fc區及三個或三個以上位於Fc區之胺基末端之抗原結合 位點。在某些實施例中’多價抗體包含三個至約八個抗原 結合位點（或由三個至約八個抗原結合位點組成）。在一該 實施例中，多價抗體包含四個抗原結合位點（或由四個抗 原結合位點組成）。多價抗體包含至少一個多肽鍵（例如兩 個多狀鍵），其中多狀鍵包含兩個或兩個以上的可變域。 舉例而言’多肽鏈可包含νϋ^(Χ1)η-νϋ2-(Χ2)η-Ρο，其中 VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為一條多肽鏈 中之Fc區’ XI及X2表示胺基酸或多肽，且η為〇或1。舉例 而言’多肽鏈可包含：VH-CH1-柔性連接子-VH-CHl-Fc區 鏈或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中之多價抗體可另外 包含至少兩個（例如四個）輕鏈可變域多肽。本文中之多價 抗體可例如包含約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文所 涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情形另外包含 CL域0 6·單域抗體 在一些實施例中，本發明之抗體為單域抗體。單域抗體 為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或者輕鏈可變域 之全部或一部分的單一多肽鏈。在某些實施例中，單域抗 體為人類單域抗體（Domantis，Inc·, Waltham，MA;參見例 如美國專利案第6,248,516 B1號）。在一實施例中，單域抗 體係由抗體重鏈可變域之全部或一部分組成。 149799.doc -80 · 201106972 7.抗體變異鱧 在一些貫施例中’本發明涵蓋本文所述之抗體的胺基酸 序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力 及/或其他生物學特性。可藉由將適當變異引入編碼抗體 之核苦酸序列中或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變 異體。該等修飾包括例如抗體胺基酸序列内之殘基缺失 及/或插入及/或取代。缺失、插入及取代可任意組合以獲 ❹ 得最終構築體’其限制條件為最終構築體具有所需特徵。 可在形成序列時將胺基酸變異引入標的抗體胺基酸序列 中。 種適用於鑑別抗體之作為較佳突變誘發位置之某些殘 基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如
Cunningham 及 Wells (1989) 244:1081-1085 所描 述。其中，鑑別一個殘基或一組標靶殘基（例如帶電荷殘 基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或帶負電荷之 〇 胺基酸（例如丙胺酸或聚丙胺酸）置換以影響胺基酸與抗原 之相互作用。接者，藉由在取代位點或針對取代位點引入 另外或其他變異體來改進對取代顯示功能敏感性之彼等胺 基酸位置。因此，雖然引入胺基酸序列變異之位點係預先 確定’但突變之性質本身無需預先確定。舉例而言，為分 析特定位點之突變效能，在靶密碼子或區域執行ala掃描或 隨機突變誘發且針對所需活性篩檢所表現之免疫球蛋白。 胺基酸序列插入物包括長度範圍為一個殘基至含有一百 個或一百以上個殘基之多肽的胺基末端及/或羧基未端融 149799.doc -81 - 201106972 合體’以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列内插入物。 末端插入物之貫例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗 體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C: 端與酵素（例如，肖於ADEPT而言）或延長抗體之血清半衰 期之多狀的融合體。 在某些實施例中，本發明之抗體經變異可增大或減小抗 體糖基化之程度。多肽之糖基化通常為]^連接型或〇連接 型。N連接型係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基之 側鏈。二肽序列天冬醯胺_Χ_絲胺酸及天冬醯胺蘇胺酸 (其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸）為碳水化合物部分 與天冬醯胺側鏈之酶促連接的識別序列。因此，多肽中存 在此等三肽序列之任一者可產生潛在糖基化位點。〇連接 型糖基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一連 接至輕基胺基酸’最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用 5 -經基脯胺酸或5 -經基離胺酸。 抗體糖基化位點之添加或缺失宜藉由改變胺基酸序列以 使得產生或移除一或多個上述三肽序列來實現（針對N_連 接型糖基化位點）。亦可藉由一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘 基之添加、缺失或取代來使原始抗體序列產生變異（針對〇 連接型糖基化位點）。
在抗體包含F c區之情況下’可改變與其連接之碳水化合 物。哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支鏈、雙觸 角（biantennary)募醣，其通常藉由N鍵聯連接至FC區之CH2 域之 Asn297。參見例如 Wright 等人，（1997) TIBTECH 149799.doc -82- 201106972 15:26-32。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙 觸角寡醣結構之「莖幹」中之GlcNAc之海藻糖。在一些 實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便產生具 有某些改良性質之抗體變異體。
舉例而言，提供具有碳水化合物結構之抗體變異體，該 碳水化合物結構缺乏（直接或間接）連接至Fc區之海藻糖。 該等變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利 公開案第 US 2003/0157108 號（Presta, L_) ; US 2004/ 0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去海藻糖基 化」或「缺海藻糖」抗體有關之公開案的實例包括：US 2003/0157108 ； WO 2000/61739 ； WO 2001/29246 ； US
2003/0115614 ； US 2002/0164328 ； US 2004/0093621 ； US
2004/0132140 ； US 2004/0110704 ； US 2004/0110282 ; US
2004/0109865 ； WO 2003/085119 ； WO 2003/084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； WO 2005/053742 ； WO 2002/031140 ; Okazaki等人，乂 Mo/.价〇/· 336:1239-1249 (2004) ; Yamane-Ohnuki 等人，87: 614 (2004)。產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏 蛋白質海藻糖基化之Lecl3 CHO細胞（Ripka等人，Jrc/z. 价249:533-545 (1986);美國專利申請案第 US 2003/0157108 Α1 號，Presta，L ;及 WO 2004/056312 Al，Adams等人，尤其實例11)，及基因剔除細胞株，諸如 α-1，6-海藻糖基轉移酶基因、尸、基因剔除CHO細胞（參 149799.doc -83- 201106972 見例如 Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bi〇enS- 87:614 (2004) ; Kanda，Y.等人，价扣/m〇/.价⑽狀.，94(4):680-688 (2006);及 WO 2003/085107)。 另外提供寡醣被切成兩分之抗體變異體，例如其中藉由 GlcNAc將連接至抗體之Fc區之雙觸角募醣切成兩分。該 等抗體變異體可具有減少之海藻糖化及/或改良之ADCC功 能。該等抗體變異體之實例描述於例如wo 2003/ 01 1878(Jean-Mairet 等人）、美國專利案第 6,602,684 號 (Umana等人）及 US 2005/0123546(Umana等人）中。亦提供 在連接至Fc區之募醣中具有至少一個半乳糠殘基之抗體變 異體。該等抗體變異體可具有改良之CDC功能。該等抗體 變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人）、WO 1998/58964(Raju, S.)及 WO 1999/22764(Raju，S_)中。 在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個進一步 改良ADCC之胺基酸取代（例如Fc區之位置298、333及/或 334(Eu殘基編號）處之取代）的1^區。該等取代可與上述任 何變異組合出現。 在某些實施例中’本發明涵蓋具有一些（但非全部）效應 功能之抗體變異體’從而使其成為許多應用之理想候選藥 物，其中抗體之活體内半衰期為重要的，但某些效應功能 (諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。在某些實施例 中，可量測抗體之Fc活性以確保僅維持所要特性。可進行 活體外及/或活體内細胞毒性分析法以確認CDC及/或ADCC 活性之降低/耗竭。舉例而言，可進行Fc受體（FcR)結合分 149799.doc -84· 201106972 析法以確保抗體缺乏FcYR結合能力（從而可能缺乏ADCC活 性），但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞、NK 細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、FcyRII及 FcyRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)之第 464頁之表 3 中。 評估相關分子之ADCC活性之活體外分析法之非限制性實 例描述於美國專利案第5,500,362號（參見例如1^113〖1'〇111， I.，KProc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))A Hellstrom, A » Proc. ΝαίΊ Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985) ; 5,821,337(參見 Bruggemann，M.等人，J.五x/?. Mei 166:1351-1361 (1987))中。或者，可使用非放射性分 析方法（參見例如流式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞 毒性分析法（CellTechnology，Inc. Mountain View，CA);及 CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析法（Promega, Madison， WI))。適用於該等分析法之效應細胞包括周圍血液單核細 胞（PBMC)及自然殺手（NK)細胞。或者或另外，可評估相 關分子在活體内，例如在動物模型（諸如揭示於Clynes等 人，尸roc. Scz·· 95:652-656 (1998)中之動物 模型）中之ADCC活性。亦可進行Clq結合分析法以確認抗 體無法與Clq結合且因此缺乏CDC活性。為了評估補體活 化，可執行CDC分析法（參見例如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996) ； Cragg, M.S.等人， 5/ood 101:1045-1052 (2003);及 Cragg，M_S.及]\4丄 Glennie，5/ooof 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術 149799.doc •85- 201106972 中已知之方法測定FcRn結合及活體内清除/半衰期（參見例 如 Petkova, S.B.等人，7«〆/. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。 提供具有一或多個胺基酸取代之其他抗體變異體。用於 取代性突變誘發之相關位點包括高變區，但亦涵蓋FR變 異。保守型取代顯示於表1中「較佳取代」標題下。稱為 「例示性取代」之更多實質性變異提供於表1中，或如下 文參考胺基酸類別進一步描述。可將胺基酸取代引入相關 抗體中且篩檢產物，例如針對所要活性（諸如改良之抗原 結合、降低之免疫原性、改良之ADCC或CDC等）篩檢產 物。 表1 原始殘基 例示性取代 較佳取代 Ala (A) Val ; Leu ; lie Val Atr(R) Lys ; Gin ; Asn Lys Asn (N) Gin ; His ; Asp，Lys ; Arg Gin Asp (D) Glu ； Asn Glu Cys (C) Ser ; Ala Ser Gln(〇) Asn ; Glu Asn Glu (E) Asp ; Gin Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn ； Gin ； Lys ； Arg Arg lie (I) Leu ; Val ; Met ; Ala ; Phe ;正白胺酸 Leu Leu (L) 正白胺酸；He ; Val ; Met ; Ala ; Phe lie Lys (K) Arg ; Gin ; Asn Arg Met (M) Leu ; Phe ; lie Leu -86- 149799.doc 201106972 原始殘基 例示性取代 較佳取代 Phe(F) Trp ； Leu ； Val ； lie ； Ala ； Tyr Tyr Axl(P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr(T) Val ； Ser Ser Trp(W) Tyr ； Phe Tyr Tyr (Y) Trp ； Phe ； Thr ； Ser Phe Val (V) lie ; Leu ; Met ; Phe ; Ala ;正白胺酸 Leu 可藉由選擇影響以下方面之取代來實現抗體生物學性質 之改變：（a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如呈片或螺旋 構形；（b)靶點處分子之電荷或疏水性；或（c)側鏈之大 小。胺基酸可根據其側鏈性質之相似性分類（A. L. Lehninger, Biochemistry，第二版，第 73-75 頁，Worth Publishers, New York (1975)) · (1) 非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、lie (I)、 Axl(P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M) (2) 不帶電荷極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys 〇 (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gin (Q) (3) 酸性：Asp (D)、Glu (E) (4) 鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His(H) 或者，天然存在之殘基可基於共同側鏈性質分類： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 驗性：His、Lys、Arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro ; 149799.doc -87- 201106972 (6)方族：Trp、Tyr、Phe 〇 非保守取代將引起此等類別之一之成員交換成另—類成 員。亦可將該等經取代之殘基引入保守性取代位點中或引 入其餘（非保守性）位點中。 一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體（例如人類化 抗體或人類抗體）之一或多個高變區殘基。通常，所得選 用於進一步開發之變異體相對於產生其之親本抗體具有經 修改（例如改良）的生物特性。例示性取代變異體為親和力 成熟抗體，其宜使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術產 生。簡而言之，使數個高變區位點（例如6_7個位點）突變， 以在各位點處產生所有可能之胺基酸取代。由此產生之抗 體以與封裝於各粒子内之噬菌體鞘蛋白(例如M i 3之基因 ΙΠ產物）之至少一部分融合的形式由絲狀噬菌體粒子呈 現。接著篩檢噬菌體呈現之變異體之生物活性(例如结合 親和力）。為鑑利於修飾之候選高變區位點，可執行掃 描誘變(例如丙胺酸掃描)以鑑別對抗原結合有顯著作用的 咼變區殘基。或者或另外，可有益的暑八 ，皿妁疋分析抗原-抗體複 合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。根據此 ^支術中已知之技術，包括本文詳述之技術，該等接觸殘 土及相鄰殘基為用於取代之候選殘基。一旦產生該等變異 體’即使用此項技術中已知 、 笪姑tv ^ 中描述之彼 #技術）師檢該組變里體 且… 擇在一或多個相關分析 法中'、有優良性質的變異體用於進一步開發。 編碼抗體之胺基酸序列變 #幻龙異體之核酸分子係由此項技術 149799.doc -88 - 201106972 已知之多種方法製備。該等方法包括（但不限於）自天然來 源分離（在天然存在之胺基酸序列變異體之情況下），或藉 由對早先製備之抗體變異體或非變異型抗體進行寡核普酸 ‘（或疋點）之突變誘發、PCR突變誘發及卡匿式突變誘 發來製備。 可能需要將一或多個胺基酸修飾引入本發明抗體之Fc區 中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個 0 胺基酸位置（包括鉸鏈半胱胺酸位置）含有胺基酸修飾（例如 取代）之人類Fc區序列（例如人類igGl、lgG2、IgG3或IgG4 Fc 區）。 根據本說明書及此項技術之教示，可預期在有些實施例 中’本發明之抗體與野生型相應抗體相比可包含一或多個 變異，例如Fc區中之一或多個變異。然而，此等抗體保留 與其野生型對應物實質上相同之治療效用所需特徵。舉例 而s ’咸信Fc區中產生的某些變異會改變（亦即改良或減 〇 弱 )C 1 q結合及/或補體依賴性細胞毒性（CDC)，例如w〇 99/5 1642中所述。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見
Duncan 及 Winter，iVaiwre 322:738-40 (1988);美國專利案 •第5,648,260號；美國專利案第5,624,821號；及w〇 94/29351。WO 00/42072(Presta)及 w〇 2004/056312 (Lowman)描述與FcR結合增強或減弱的抗體變異體。此等 專利公開案之内容以引用之方式明確併入本文中。亦參見
Shields等人，J. 5沁/· C/2em. 9(2): 6591-6604 (2001)。US 2005/0014934Al(Hinton等人）中描述半衰期延長且與新生 149799.doc -89- 201106972 兒Fc受體（FcRn)之結合增強的抗體，新生兒以受體負責將 母體IgG轉移至胎兒中（Guyer等人，J. /讀㈣ι17:587 (1976)及 Kim等人，//«膽⑽/· 24:249 (1994))。此等抗體 包含其中具有一或多個增強Fc區與FcRn結合之取代的Fc 區。美國專利第6，194,551B1號、W099/5 1642中描述Fc區 胺基酸序列已變異且Clq結合能力增大或減小之多肽變異 體。該等專利公開案之内容以引用的方式明確併入本文 中。亦參見Idusogie等人 ’ J. ⑽/ 164: 4178-4184 (2000) 〇 在另一態樣中，本發明提供在包含Fc區之Fc多肽之界面 中包含修飾的抗體，其中該等修飾有助於且/或促進雜二 聚化。該等修飾包含將突起引入第一 Fc多肽中以及將空腔 引入第一 Fc多肽中’其中該突起可定位於該空腔中以便促 進第一 Fc多肽與第二Fc多肽之複合。產生具有該等修飾之 抗體的方法已知於此項技術中，例如美國專利第5,73丨，丨68 號所述。 在另一態樣中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造之抗 體，例如「thioMAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺 酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基存在於抗體之 可達位點。藉由半胱胺酸取代彼等殘基，從而將反應性硫 醇基定位於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分 (諸如樂物部分或連接子-藥物部分）結合’如本文中進一步 描述。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可經半胱胺 酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號）；重鏈之AU8(Elm 149799.doc -90· 201106972 號）；及重鏈Fc區之S400(EU編號）。 8.抗艎衍生物 本發明之抗體可進-步修飾成含有此項技術中已知且易 於獲得之其他非蛋白部分。適於抗體衍生化之部分較佳為 水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括（但不 ㈣）聚乙二醇（PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、叛甲基纖維 素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚丨，％二氧戊 0 壞 '聚_1，3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基 酸（均聚物或無規共聚物）及葡聚糖或聚（N_乙烯吡咯啶嗣） 聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚 物、聚氧乙烯多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。 聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可具有製造優勢。聚 合物可具有任何分子量，且可分支或不分支。連接至抗體 之聚合物之數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則其 可為相同或不同分子。通常’用於衍生化之聚合物之數目 〇 及/或類型可基於以下考慮來確定：包括（但不限於）待改良 之抗體特定性質或功能，抗體衍生物是否將用於限定條件 下之療法等。 -在另一實施例中，提供抗體與非蛋白部分之結合物，該 • 等結合物可藉由曝露於輻射來選擇性加熱。在一實施例 中’非蛋白部分為碳奈米管（Kam等人，尸roc· jVai/ C/U 1〇2: 11600-11605 (2005))。此輻射可具有任一波 長’且包括（但不限於）不損傷一般細胞、但能將非蛋白部 分加熱至可殺死抗體—非蛋白部分鄰近之細胞之溫度的波 149799.doc -91 · 201106972 長。 B.某些製造抗體之方法 1.某些基於融合瘤之方法 本發明之單株抗體可使用融合瘤方法製備，融合瘤方法 首先描述於Kohler等人，Waiwre, 256:495 (1975)中’且進 一步描述於關於人類-人類融合瘤的以下文獻中：例如 Hongo等人，14 (3): 253-260 (1995) ; Harlow 等人，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版 1988) ; Hammerling等人， ^ ： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y·，1981);及 Ni，Χία«如/ 26(4): 265-268 (2006)。其他方法包括例如美國專利第7,189,826 號中所述之關於自融合瘤細胞株產生單株人類天然IgM抗 體之方法。人類融合瘤技術（三源雜交瘤技術）描述於 Vollmers 及 Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)及 Vollmers及 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)中。 對於各種其他融合瘤技術，參見例如US 2006/258841 ; US 2006/183887(完全人類抗體）；US 2006/059575 ; US 2005/287149 ; US 2005/100546 ; US 2005/026229 ;及美國 專利第7,078,492號及第7,153,507號。使用融合瘤方法產生 單株抗體之例示性方案描述如下。在一實施例中，使小鼠 或其他適當宿主動物（諸如倉鼠）免疫以誘使淋巴細胞產生 149799.doc -92- 201106972 或能夠產生特異性結合用於免疫之蛋白質之抗體。藉由多 次皮下（SC)或腹膜内（ip)注射包含Axl或其片段之多肽及佐 劑（諸如單磷醯基脂質A(MPL)/海藻糖二柯諾黴菌酸醋 (trehalose dicrynomycolate ； TDM)(Ribi Immunochem. Research，Inc.，Hamilton，MT))來使動物產生抗體。可使用 此項技術中熟知之方法（諸如重組方法）製備包含Αχί或其片 段之多肽，其中一些方法在本文中另外描述。分析經免疫 動物之血清中的抗Axl抗體’且視情況投與免疫強化劑。 自產生抗Axl抗體之動物分離淋巴細胞。或者，可於活體 外免疫淋巴細胞。 隨後使用適合融合劑（諸如聚乙二醇）使淋巴細胞與骨髓 瘤細胞融合以形成融合瘤細胞。參見例如G〇ding, Monocloncil Antibodies. Principles and Practice ,第 59-103 頁（Academic Press，1986)。可使用有效融合、有助於所選 抗體產生細胞穩定高量產生抗體且對培養基（諸如HAT培養 基）敏感的骨髓瘤細胞。例示性骨髓瘤細胞包括（但不限於） 鼠類骨髓瘤細胞株’諸如可自沙克生物研究所細胞分配中 心（Salk Institute Cell Distribution Center)(San Diego, California USA)獲得之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤所產生 的彼等細胞及可自美國菌種保存中心（American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland USA)獲得之 SP-2 或X63-Ag8-653細胞。亦已描述用於產生人類單株抗體的 人類骨趙瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株（Kozbor，《/. /wimMno/·，133:3001 (1984) ; Brodeur 等人，Mo«oc/o«a/ 149799.doc -93- 201106972
Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc.，New York, 1987))。 由此製備之融合瘤細胞接種且生長於適當培養基中，例 如含有一或多種抑制未融合之親代骨髓瘤細胞之生長或存 活之物質的培養基。舉例而言，若親代骨髓瘤細胞缺乏次 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或HPRT)，則融合瘤 培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷（HAT培養 基）’該等物質會阻止缺乏HGPRT之細胞之生長。無血清 之融合瘤細胞培養方法較佳用於減少使用動物源血清（諸 如胎牛血清），例如Even等人，h S/oiec/mo/ogj；, 24(3), 105-108 (2006)中所述。 作為提高融合瘤細胞培養物之生產力之手段的募肽描述 於 Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)中。特定言之，標準培養基富含某些胺基酸（丙 胺酸、絲胺酸、天冬酿胺、捕胺酸）或蛋白質水解產物部 分’且由三個至六個胺基酸殘基構成之合成寡肽可顯著抑 制細胞凋亡。該等肽以毫莫耳濃度或高於毫莫耳濃度之濃 度存在。 可對培養融合瘤細胞之培養基分析結合Αχί之單株抗體 之產生。融合瘤細胞所產生之單株抗體的結合特異性可藉 由免疫沈澱法或藉由活體外結合分析法（諸如放射免疫分 析法（RIA)或酶聯免疫吸附分析法（ELISA))測定。單株抗 體之結合親和力可藉由例如史卡查分析（Scatchard analysis)來測定。參見例如Munson等人，j⑽/ 149799.doc -94- 201106972 107:220 (1980)。 銓別可產生具有所要特異性、親和力及/或活性之抗體 的融合瘤細胞之後，可藉由限制性稀釋程序次選殖純系且 . #由標準方法培養。參見例如Goding，同上。適用於此目 的之培養基包括例如D-ME1V[或RPMI-1640培養基。另外， 融合瘤細胞可在動物體活體内内培養為腹水腫瘤。次純系 所刀/必之單株抗體宜藉由習知免疫球蛋白純化程序（諸如 〇 蛋白A_瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和性 層析）自培養基、腹水或血清中分離。一種自融合瘤細胞 分離蛋白質之程序描述於us 2〇〇5/176122及美國專利第 6,919,436號中。該方法包括在結合過程中使用最少量之鹽 (諸如易溶鹽）及亦較佳在溶離過程中使用少量有機溶劑。 2·某些文庫篩檢方法 可藉由使用組合文庫篩檢具有所需活性之抗體來獲得本 發明之抗體。舉例而言’此項技術中已知多種產生噬菌體 ◎ 呈現文庫及篩檢該等文庫中具有所要結合特徵之抗體的方 法。該等方法一般描述於H〇〇genb〇〇m等人之〜 M〇/㈣—心/㈣ 178:1_37(〇,Brien等人編，Human : T〇towa，NJ，2001)中。舉例而言，如^等人，】m〇i _· Bi〇1. (2〇04)，340(5):1073_93中所述，一種產生相關抗體之 方法係使用噬菌體抗體文庫。 大體上，藉由筛檢含有噬菌體的噬菌體文庫來選擇合成 抗體純系，該噬菌體呈現與噬菌體鞘蛋白融合之抗體可變 區（Fv)之各種片段。藉由針對所需抗原進行親和層析來淘 149799.doc •95· 201106972 % 3玄專电囷體文庫。表現能夠與所需抗原結合之FV片段之 純系吸附至抗原且因此與文庫中非結合純系分離。接著將 結合純系自抗原溶離，且可藉由另外幾輪抗原吸附/溶離 進一步富集。本發明之任何抗體可如下獲得：設計適合抗 原篩檢程序以選擇相關嗤菌體純系，接著使用相關噬菌體 純系之Fv序列及Kabat等人，Sewe〇/ Pr0如·如〇/ /mmw⑽/«ierew，第 5版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)，第1-3卷中所述之適合恆定區（Fc)序 列來構築全長抗體純系。 在某些實施例中，抗體之抗原結合域係由兩個具有約 110個胺基酸之可變（V)區形成，可變區各來自輕鏈（VL)及 重鏈（VH)且均存在三個高變環（HVR)或互補決定區 (CDR)。可變域可作為單鏈Fv(scpv)片段（其中vh與VL經 由柔性短肽共價鍵聯）或作為Fab片段（其中VH與VL各與恒 定域融合且非共價相互作用）功能性地呈現於噬菌體上， 如Winter等人，則⑽厂，12: 433-455(1994)中所 述如本文所使用’ scFv編碼嗟菌體純系及Fab編碼嗔菌 體純系統稱為「Fv噬菌體純系」或「Fv純系」。 VH與VL基因譜系可藉由聚合酶鏈反應（pcR)分別選殖， 且在嗟菌體文庫令隨機重組，接著可搜尋抗原結合純系， 如 Winter專人，J⑽I〗： 433-455(1994)中所 述。來自經免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體 而無需構築融合瘤。或者，可選殖可提供針對廣泛範圍之 非自體抗原以及自體抗原之單一人類抗體來源而無需任何 149799.doc -96- 201106972 免疫作用的天然譜系，如Griffiths等人，五ΜδΟ 乂 12: 725· 734 (1993)所述。最後，天然文庫亦可如下合成獲得：自 幹細胞選殖未經重排之V—基因片段並使用含有隨機序列之 t PCR引子編碼CDR3高變區及完成活體外重排，如
Hoogenboom及 Winter，Μί?/· 5ζ·ο/·，227: 381-388 (1992)所 述。 在某些實施例中，使用絲狀噬菌體呈現與次要鞘蛋白 Q ρΠΙ融合的抗體片段。抗體片段可作為單鏈Fv片段呈現， 其中VH域與VL域藉由柔性多肽間隔基連接於同一多肽鏈 上，例如Marks等人 ’ X m〇/·出〇/·, 581-597(1991)中所述； 或作為Fab片段呈現，其中一鏈與？111融合而另一鏈分泌進 入細菌性宿主細胞周質内，在周質内藉由置換一些野生型 鞘蛋白組裝呈現於噬菌體表面上的Fab-鞘蛋白結構，例如 Hoogenboom等人，, 19: 4133 4137 中所述。 〇 通常，編碼抗體基因片段之核酸可自由人類或動物採集 之免疫細胞獲得。若需要偏重於抗Αχί純系的文庫，則個 體以Axl免疫以產生抗體反應’且回收脾細胞及/或循環b 細胞及其他周圍血液淋巴細胞（PBL)用於文庫建構。在較 佳實施例中’偏重於抗Axl純系之人類抗體基因片段文庫 可糟由在攜有功能性人類免疫球蛋白基因陣列（且缺乏功 能性内源抗體產生系統）之轉殖基因小鼠中產生抗Αχ丨抗體 反應以使得Axl免疫引起Β細胞產生抗Axl之人類抗體來獲 得。下文描述產生人類抗體之轉殖基因小鼠的產生。 149799.doc -97- 201106972 針對抗Axl反應性細胞群之其他富集可藉由使用適當筛 檢程序分離表現Axl特異性膜結合抗體之B細胞來獲得，例 如使用Axl親和層析法分離細胞或使細胞吸附至螢光染料 標記之Axl、再進行流式活化細胞分選（FACS)。 或者’使用未免疫供體之脾細胞及/或B細胞或其他pBL 可更好地展現可能抗體譜系，且亦容許使用任何動物（人 類或非人類）物種（其中Axl不具抗原性）建構抗體文庫。對 於合併活體外抗體基因建構之文庫而言，自個體採集幹細 胞以提供編碼未重排抗體基因區段之核酸。相關免疫細胞 可自多種動物物種獲得，諸如人類、小鼠、大鼠、兔類、 狼、犬、貓、豬、牛、馬及鳥類物種等。 自相關細胞中回收編碼抗體可變基因區段（包括VH及VL 區段）之核酸並擴增。在重排VH及VL基因文庫之狀況中， 所需DNA可如下獲得：自淋巴細胞中分離基因組dnA或 mRNA ’接著利用與重排VH及VL基因之5,端及3,端匹配之 引子進行聚合酶鏈反應（PCR)，如Orlandi等人，Proc. iVai/. 5Ά (USA), 86: 3833-3837 (1989)中所述，從而 獲得用於表現之各種V基因譜系。V基因可自cDNA及基因 組DNA擴增’其中反向引子位於編碼成熟v域之外顯子之 5'端且前向引子定位於J區段内部，如〇riandi等人，（1989) 及 Ward等人，iVaiMre, 341: 544-546 (1989)中所述。然而， 自cDNA擴增時，反向引子亦可定位於前導外顯子中，如 Jones等人，9: 88-89 (1991)中所述，且前向引 子可位於值定區内部，如Sastry等人，尸roc. iVai/. vicac/. 149799.doc •98- 201106972
Scr人86: 5728-5732 (1989)中所述。為最大化互補 性’可合併引子中的簡併性，如〇rlandi等人（丨989)或 Sastry等人（1989)中所述。在某些實施例中，文庫多樣性 可藉由使用靶向各V基因家族的pcR引子最大化，以擴增 存在於免疫細胞核酸樣品中之所有可利用的VH與VL排 列，例如Marks等人，/· M〇/_ 厂，222: 581-597 (1991)之 方法中所述或如Orum等人，及以，21: 4491-4498 (1993)之方法中所述。將擴增之dna選殖入表現載體 内時，可將稀少限制性位點引入PCR引子内之一端作為標 記，如Orlandi等人（1989)中所述，或利用標記引子進一步 進行 PCR擴增，如 Clackson 等人，TVaiwre, 352: 624-628 (1991)中所述。 合成性重排之V基因Ί普系可活體外源自v基因區段。人 類VH基因區段中的大部分已選殖且定序（報導於T〇niHns〇n 專人 ’·/. Λ/ο/· 5/〇厂，227: 776-798 (1992)中），且已繪'出圖 譜（報導於 Matsuda 等人，iVaiwre Gewei·, 3: 88-94 (1993) 中）；可使用此等選殖區段（包括HI與H2環之所有主要構 形）以及編碼各種序列及長度之H3環的PCR引子產生各種 VH基因譜系，如Hoogenboom 及 Winter，丄 Mo/. 227. 381-388 (1992)中所述。亦可獲得所有序列多樣性皆集中 於長H3環之單一長度上的VH譜系，如Barbas等人，Pr〇c iWzi/. ylcaci. 5Ά 89: 4457-4461 (1992)中所述。人類
Vk及νλ區段已選殖且定序（報導於Williams及Winter, £阶· ·/·/所顧⑽/·，23: 1456-1461 (1993)中）且可用於形成合成性 149799.doc -99- 201106972 輕鏈譜系。基於一系列之VH與VL摺疊及L3與H3長度之合 成V基因譜系將編碼具有大量結構多樣性之抗體。擴增v 基因編碼DNA之後，生殖系V基因區段可根據11〇〇#心〇〇111 及 Winter，i M〇/•如 〇/., 227: 381-388 (1992)之方法活體外 重排。 可藉由以多種方式將VH與VL基因譜系組合在一起來建 構抗體片段譜系。各譜系可建立於不同載體中，且載體可 活體外重組’例如Hogrefe等人，128: 119-126 (1993)中所述，或藉由組合感染（例如Waterh〇use等人， We/7^·，21: 2265_2266 (1993)中所述之比⑼系統） 活體内重組。活體内重組方法係利用F ab片段之雙鏈性質 來克服大腸桿菌轉型效率對文庫大小所施加之限制。天然 VH及VL譜系係分別選殖，一者選殖入噬菌粒中且另一者 選殖入噬菌體載體中。接著藉由噬菌體感染含有噬菌粒之 細菌來組合兩個文庫，以使得各細胞含有不同組合且文庫 大小僅受所存在細胞數量（約1〇12個純系）限制。兩載體均 含有活體内重組信號，以使得¥11與VL基因在單一複製子 上重組且共封裝於噬菌體病毒粒子中。此等大型文庫提供 大量具有良好親和力（Kd·1為約10_8 M)之多種抗體。 或者，該等譜系可依序選殖入同一載體，例如Barbas等 人，Proc.心"· w 仍乂，88: 7978_7982 (1991)中所 述，或藉由PCR組裝在一起且接著選殖，例如（^丨“匕⑽等 人，352: 624-628 (1991)中所述。亦可使用 PCR組 裝將VH及VL DNA與編碼柔性肽間隔基之DNA連接在一起 149799.doc 201106972 以形成單鏈Fv(scFv)譜系。在另一種技術中，使用「細胞 内PCR組裝」藉由pcr在淋巴細胞内組合VH與VL基因且 接著選殖已連接基因之譜系，如Embleton等人，WMC/ 及 20:3831-37 (1992)中所述0 由天然文庫所產生之抗體（天然或合成）可具有中度親和 力（約106至1〇7 Μ-1之Kd-1)，但親和力成熟亦可藉由建構及 再選擇第二文庫來活體外模擬，如Winter等人（1994)(同 0 上）所述。舉例而言，可使用Hawkins等人，J. Mo/.別〇厂， 226: 889-896 (1992)之方法或 Gram等人，Pro。Jcad. 5W t/M，89: 3576-3 580 (1992)之方法中之易出錯聚合酶 (報導於 Leung等人 ’ rec/migwe, 1: 11-15 (1989)中）活體外 隨機引入突變。此外’親和力成熟可如下進行：在所選個 別Fv純系中使一或多個CDR隨機突變，例如使用具有全長 為相關CDR之隨機序列的引子進行PCR，且篩檢較高親和 力純系。WO 96〇7754(1"6年3月I4日公開）描述一種誘導 〇 免疫球蛋白輕鏈之互補決定區發生突變以建立輕鏈基因文 庫的方法。另一種有效方法為將藉由嗤菌體呈現所選擇的 VH域或VL域與獲自未免疫供體之天然存在之v域變異體 譜系重組且以數輪鏈改組篩檢較高親和力，如Marks等 .人，1〇: 779_783 (1992)中所述。此技術能夠 產生親和力為約1〇-9 Μ或10_9 μ以下之抗體及抗體片段。 可藉由此項技術中已知之各種技術完成文庫篩檢。舉例 而吕，可使用Axl塗佈吸附板之各孔，於固定至吸附板之 宿主細胞上表現或用於細胞分選，或與生物素結合以供塗 149799.doc -101- 201106972 有抗生物蛋白鏈菌素之珠粒捕捉，或用於淘選噬菌體呈現 文庫之任何其他方法中。 在適於使嗤菌體顆粒之至少一部分與吸附劑結合之條件 下’使嗟菌體文庫樣品與經固定Αχί接觸。通常選擇可模 擬生理條件的條件，包括pH值、離子強度、溫度及其類似 條件。洗蘇結合至固相之噬菌體且接著藉由酸溶離，例如 Barbas等人 ’ 勤".deal W 88: 7978-7982 (199 U中所述’或藉由驗溶離’例如Marks等人，J. Mo厂 方⑴/·’ 222·· 581-597 (1991)中所述’或藉由Axl抗原競爭， 例如以與Clackson等人，iVa/wre, 352:624-628 (1991)之抗 原競爭方法類似之程序進行Αχί抗原競爭。可在單輪選擇 中备集20-1，〇〇〇倍之噬菌體。此外，所富集之噬菌體可在 細菌培養物中生長並經歷其他多輪選擇。 選擇效率視許多因素而定’包括洗滌過程中之解離動力 學及單一噬菌體上之多個抗體片段能否同時與抗原接合。 具有快速解離動力學（及弱結合親和力）之抗體可藉由使用 紐時間洗滌、多價噬菌體呈現及抗原於固相中之高塗佈密 度予以保留。高密度不僅經由多價相互作用使噬菌體穩 定，且亦有利於使已解離之噬菌體再結合。可使用長時間 洗滌及單價噬菌體呈現（如Bass等人’ 8: 309-314 (1990)及臂〇 92/〇969〇中所述）及低抗原塗佈密度（如 等人，別oiec/mo/_, 10: 779_783 (1992)中所述）來促進對具 有慢速解離動力學（及良好結合親和力）之抗體之選擇。 可在對Axl親和力不同之噬菌體抗體之間選擇，即使親 149799.doc -102· 201106972 和力稍微不同。然而，所選抗體之隨機突變（例如，如在 一些親和力成熟技術中所執行）可能產生許多突變體，大 多數結合抗原，且有一些具有較高親和力。在限制Αχΐ ' 下，可淘汰稀少的高親和力噬菌體。為了保留所有較高親 和力突變體，可將噬菌體與過量的經生物素標記之一 起培育，但經生物素標記之Axl之莫耳濃度比Αχ1之目標莫 耳親和力常數低。高親和力結合噬菌體接著可被塗有抗生 ◎ 物蛋白鏈菌素之順磁珠粒捕捉。該「平衡捕捉」使得能夠 根據抗體之結合親和力以敏感性選擇抗體，該敏感性允許 使具有僅兩倍高親和力之突變體純系與具有較低親和力之 大夏過I噬菌體分離。亦可操控用於洗滌結合至固相之噬 菌體的條件以基於解離動力學進行區分。 可基於活性選擇抗Axl純系。在某些實施例中，本發明 提供結合天然表現Axl之活細胞之抗Αχ1抗體。在一實施例 中，本發明提供阻斷Axl配位體與Axl之間結合但不阻斷 〇 Axl配位體與第二蛋白之間結合的抗Αχ1抗體。對應於該等 抗Axl抗體的Fv純系可如下選擇：（1)如上所述自噬菌體文 庫中分離抗Axl純系，及視需要擴增分離的噬菌體純系群 • 體（藉由在適當細菌宿主中培育該群體）；（2)針對分別需要 •‘ 阻斷活性及非阻斷活性來選擇Axl及第二蛋白；（3)將抗Αχ1 噬菌體純系吸附至固著Axl ; (4)使用過量的第二蛋白溶離 任何非所要純系’非所要純系識別的Αχ1結合決定子與第 二蛋白之結合決定子重疊或共有；及（5)溶離步驟（4)完成 後仍吸附的純系。具有所要阻斷/非阻斷特性之純系視需 149799.doc •103- 201106972 要可進一步藉由將本文中所述之選擇程序重複一或多次來 富集。 使用習知程序（例如使用設計成自融合瘤或噬菌體Dna 模板特異性擴增相關重鏈及輕鏈編碼區的寡核苷酸引子） 易於分離及定序編碼本發明之融合瘤源單株抗體或噬菌體 呈現Fv純系的DNA。DNA —經分離，便可置於表現載體 内’接著轉染至宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猿c〇s細 胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞）中（否則宿主 細胞不產生免疫球蛋白），以於重組宿主細胞中獲得所需 單株抗體之合成。關於在細菌中重組表現編碼抗體之DNA 的評論文章包括Skerra等人，C«rr. Op⑻·0„〜廳⑽厂，5: 256 (1993)及 Pluckthun, /ievs，130: 151 (1992)。 可將編碼本發明Fv純系之DNA與已知編碼重鏈及/或輕 鏈恆定區之DNA序列（例如適當之DNA序列可依據Kabat等 人（同上）獲得）組合以形成編碼全長或部分長度重鏈及/或 輕鏈之純系。應瞭解，為達成此目的可使用任何同型之恆 定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恆 定區可由任何人類或動物物種獲得。源自一種動物（諸如 人類）物種之可變域DNA且接著與另—動物物種之恆定區 DNA融合以形成「雜交」全長重鏈及/或輕鏈之編碼序列 的Fv純系包括於如本文所使用之「嵌合」及「融合」抗體 定義中。在某些實施例中，使來源於人類可變〇?^入之以純 系與人類恆定區DNA融合以形成全長或部分長度人類重鏈 及/或輕鏈之編碼序列。 149799.doc * 104- 201106972 編碼本發明之源自雜交瘤之抗Axl抗體的DNA亦可經修 飾’例如用人類重鏈恆定域及輕鏈恆定域編碼序列取代源 自融合瘤純系的同源鼠序列（例如Morrison等人，Pr〇c 81: 6851-6855 (1984)之方法）。編碼 源自融合瘤或Fv純系之抗體或片段的dna可藉由共價連接 至免疫球蛋白編碼序列、非免疫球蛋白多肽之全部或部分 編碼序列來進一步修飾。以此方式可製備具有本發明之源 Q 自FV純系或融合瘤純系之抗體之結合特異性的「嵌合」或 「融合」抗體。 3·載體、宿主細胞及重組方法 亦可使用重組方法產生抗體。為重組產生抗八“抗體， 將編碼該抗體之核酸分離且插入可複製載體中以便進一步 選殖（擴增DNA)或用於表現。可使用習知程序（例如使用能 夠特異性結合編碼抗體重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探 針）谷易離及疋序編碼抗體之DNA。可利用多種載體。 〇 載體組分一般包括（但不限於）以下一或多者：信號序列、 複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉 錄終止序列。 a)信號序列組分 . 本發明之抗體不僅可直接重組產生，而且可以與異源多 肽之融合多肽形式產生，該異源多肽較佳為信號序列或在 成熟蛋白質或多肽之N末端處具有特定裂解位點之其他多 肽所選擇之異源信號序列較佳為可由宿主細胞識別及處 理（亦即由信號肽酶裂解）之信號序列。對於不識別及處理 149799.doc -105- 201106972 原生抗體信號序列之原核宿主細胞而言，將該信號序列取 代為原核彳s號序列’例如選自驗性填酸酶、青黴素酶、 !PP或熱穩定性腸毒素II前導序列之群的原核信號序列。對 於酵母分泌’原生彳s號序列可取代為例如酵母轉化酶前導 序列、α因子如導序列（包括酵母菌及克魯 維酵母（尤/吵veromyeOa因子前導序列）或酸性磷酸酶前導 序列、白色念珠菌（C. albicans)葡糖澱粉酶前導序列或w〇 90/13646中所述之信號。在哺乳動物細胞表現中，可使用 哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導序列（例如單純疱 疹gD信號）。 b)複製起點 表現載體與選殖載體皆含有使載體能夠在一或多種所選 佰主細胞中複製的核酸序列。通常，在選殖载體中，此序 列為使載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製的序列，且包 括複製起點或自主複製序列。已熟知多種細菌、酵母及病 毒之該等序列。質體ρΒΜ22之複製起點適於大多數革蘭 氏陰性（Gram-negative)細菌，2μ質體起點適於酵母，且各 種病毒起點（SV40、多形瘤、腺病毒、vsv或Βρν)適用於 哺乳動物細胞巾之選耗體。通常，哺乳動物表現載體不 需要複製起點組分（使用SV40起點的原因通常僅在於其含 有早期啟動子）。 ^ 3 c)選擇基因組分 ，亦稱為可選標記物。 針對抗生素或其他毒素 表現及選殖載體可含有選擇基因 典型選擇基因編碼的蛋白質（a)賦予 149799.doc -106- 201106972 (例如安比西林（ampicillin)、新黴素（ne〇mycin)、曱胺喋呤 或四環素（tetracycline))的抗性，（b)補充營養缺陷型不^ 或⑷供應不可自複雜培養基中得到之關鍵營養，例如編碼 桿狀菌（5此////)之D-丙胺酸消旋酶的基因。 ' 選擇方案之一實例係利用藥物阻滯宿主細胞之生長。經 異源基因成功轉型之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白質且 ^此在選擇療程中存活。該顯性選擇之實例係使用藥物新 0 黴素、黴酚酸及濕黴素（hygromycin)。 適用於哺乳動物細胞之可選擇標記之另一實例為能夠鑑 別有能力接納編碼抗體之核酸之細胞的彼等標記，諸如 DHFR、麵醯胺酸合成酶（GS)、胸苷激酶、金屬硫蛋白工及 金屬硫蛋白11(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因广腺苷 脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。 舉例而言，藉由在含有甲胺喋呤（Mtx)(DHFR之競爭性 拮抗劑）之培養基中培養轉化子來鑑別經DHFR基因轉型之 〇 細胞。在此等條件下，卿R基因與任何其他共轉型核酸 一起擴增。可使用缺乏内源性DHFR活性之中國倉鼠卵巢 (CH0)細胞株（例如 ATCC CRL-9096)。 或者，藉由在含有L- f硫胺酸續醯亞胺（Msx)(GS之抑制 劑）之培養基中培養轉化子來鑑別經Gs基因轉型之細胞。 在此等條件下，GS基因與任何其他共轉型核酸一起擴增。 GS選擇/擴增系統可與上述DHFR選擇/擴增系統組合使 用。 或者，可藉由在含有針對可選擇標記之選擇劑（諸如胺 149799.doc •107- 201106972 基醣普抗生素，例如卡那黴素（kanamycin)、新黴素或 G4 1 8)之培養基中培養細胞來選擇經編碼相關抗體之DNA 序列、野生型DHFR基因及另一可選擇標記（諸如胺基醣普 31-磷酸轉移酶（ΑΡΗ))轉型或共轉型之宿主細胞（尤其含有 内源性DHFR之野生型宿主）。參見美國專利案第4,965,199 號。 適用於酵母中之選擇基因為存在於酵母質體YRp7中之 冲1 基因（Stinchcomb等人，施iwre, 282:39 (1979))。冲1 基 因為不能在色胺酸中生長的突變型酵母菌株（例如ATCc編 號44076或PEP4-1)提供選擇標記。jones，仏奸价八85:12 (1977)。酵母宿主細胞基因組中存在之丨損傷接著為偵 測在色胺酸不存在下由生長所引起之轉型提供有效環境。 類似地，/^2缺陷型酵母菌株（八丁(^ 20,622或38,626)由攜 有基因之已知質體補充。 此外’來源於1.6 μηι環狀質體PKD1之載體可用於轉型克 魯維酵母。或者，已報導乳酸克魯維酵母（尺之表 現系統’其用於大規模生產重組小牛凝乳酶。Van den Berg，出〇/7^以0/0幻;，8:ι35 (1990)。亦已揭示供工業克魯 維酵母菌株分泌成熟重組人類血清白蛋白的穩定多複本表 現載體。Fleer等人，仏〇/7^/2«〇/〇容少，9:968-975 (1991)。 d)啟動子組分 表現及選殖載體通常含有可被宿主生物體識別且可操作 地連接至編碼抗體之核酸之啟動子。適用於原核宿主之啟 動子包括；?/2〇A啟動子、β-内醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼 149799.doc •108· 201106972 性磷酸酶啟動子、色胺酸（trp)啟動子系統、及融合啟動子 (諸如tac啟動子）。然而’其他已知之細菌啟動子亦適用。 用於細菌系統中之啟動子亦含有可操作地連接至編碼抗體 之DNA之夏因-達爾加諾（shine-Dalgarno; S.D.)序列。 已知用於真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因 均具有位於轉錄起始位點上游大約25至3〇個鹼基處之富AT 區。發現於多種基因之轉錄起點上游7〇至8〇個鹼基處的另 0 一序列為CNC AΑτ區，其中N可為任何核苷酸。大部分真 核基因的3’端為AATAAA序列，該序列可為添加p〇丨y八尾 至編碼序列之3,端的信號。所有此等序列均適合插入真核 表現載體中。 適用於酵母宿主之啟動子序列之實例包括3 _填酸甘油酸 激酶或其他醣解酶（諸如烯醇酶、甘油醛_3_磷酸脫氫酶、 己醣激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖_6_磷酸 異構酶、3-磷酸甘油酸歧化酶、丙酮酸激酶、磷酸丙醣異 〇 構酶、磷酸葡糖異構酶及葡萄糖激酶）之啟動子， 作為具有轉錄受生長條件控制之額外優勢之可誘導啟動 子的其他酵母啟動子為以下之啟動子區：乙醇脫氫酶2、 • 異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之降解酶、金 .屬硫蛋白、甘油醛_3_磷酸脫氫酶及負責麥芽糖及半乳糖利 用之酵素。EP 73,657中進一步描述適用於酵母表現之載體 及啟動子。酵母增強子亦可有利地與酵母啟動子一起使 用。 哺乳動物宿主細胞中經由載體進行的抗體轉錄可藉由例 149799.doc -109- 201106972 如以下啟動子控制：獲自病毒（諸如多形瘤病毒、雞痘病 毒、腺病毒（諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥肉瘤病 毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒、猿猴病 毒40(SV40))之基因組的啟動子；或異源哺乳動物啟動子 (例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子）；熱休克啟動 子’其限制條件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。 SV40病毒之早期及晚期啟動子宜作為亦含有SV4〇病毒 複製起點之SV40限制片段獲得。人類細胞巨大病毒之立即 早期啟動子宜作為Hindlll E限制片段獲得。美國專利第 4,419，446號中揭示使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體在哺乳動 物宿主中表現DNA之系統。美國專利第4,6〇1，978號中描述 此系統之改型。關於人類β干擾素cDNA在小鼠細胞中在單 純疮疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下之表現，亦參見
Reyes 等人，TVaiwre 297:598-601 (1982)。或者，可使用勞 斯肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus)之長末端重複序列作為啟 動子。 C)強化子元件組分 尚等真核細胞轉錄編碼本發明抗體之dNA通常藉由將強 化子序列插入載體中來增強。現已知多種源自哺乳動物基 因（球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、心胎蛋白及胰島素）的 強化子序列。然而，通常使用真核細胞病毒之強化子。實 例包括複製起點（bp 100-270)後側之SV4〇強化子、細胞巨 大病毒早期啟動子強化子、複製起點後側之多形瘤病毒強 化子及腺病毒強化子。關於用於活化真核啟動子之增強元 149799.doc -110- 201106972 件’亦可參見Yanjv, 297:17-18 (1982)。強化子可煎 接至載體中位於抗體編碼序列之5,或3,位置，但較佳位於 啟動子之5’位點。 f) 轉錄終止組分
L 在真核宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動物 '人 類或來自其他多細胞生物體之有核細胞）中使用之表現載 體亦含有終止轉錄及穩定mRNA所需的序列。該等序列通 q 常可自真核細胞或病毒DNA或cDNA之5'且有時3'非轉譯區 獲得。此等區域含有在編碼抗體之mRNA之非轉譯部分中 以聚腺苷酸化片段形式轉錄的核苷酸區段。一種適用之轉 錄終止組分為牛生長激素多聚腺苷酸化區。參見WO 94/11 026及其中所揭示之表現載體。 g) 選擇及轉型宿主細胞 適用於在本文中之載體中選殖或表現DNA之宿主細胞為 上述原核細胞、酵母或高等真核細胞。適於此目的之原核 〇 細胞包括真細菌’諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體， 例如腸内囷科（Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬 (仏⑷（例如大腸桿菌）、腸内菌屬（五加、 •歐文氏菌屬CErm’m’a)、克雷伯氏菌屬、變形桿 .菌屬（iVo/ewi)、沙門氏菌屬（化/w〇„e//a)(例如鼠傷寒沙門 氏菌//α ί少则”·謂））、沙雷氏菌屬（心"加⑷（例 如黏/沙雷氏菌（《Serra/ia marcescaws))及志贺氏菌屬 (以如/⑷以及芽孢桿菌屬⑺⑽·叫（諸如枯草芽孢桿菌 μ⑽出）及地衣芽孢桿菌例如1989年4月 149799.doc -111 - 201106972 12日公開之DD 266,710中揭示之地衣芽孢桿菌41p))、假單 胞菌屬諸如綠膿假單胞菌（p "細㈣》 及鏈黴菌屬（汾repiomKw)。儘管諸如大腸桿菌B、大腸桿 菌 X1776(ATCC 31，537)及大腸桿菌 W3110(ATCC 27,325)之 其他菌株亦適合，但一較佳大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌 294(ATCC 3 1，446)。此等實例具說明性而非限制性。 可在細議中產生全長抗體、抗體融合蛋白及抗體片段， 尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時，諸如當治療性抗體 與自身顯示有效破壞腫瘤細胞之細胞毒性劑（例如毒素）結 合時。全長抗體在循環中具有較長半衰期。大腸桿菌之生 產更快且更具成本效率。關於抗體片段及多肽在細菌中之 表現，參見例如 U.S. 5,648,237(Carter 等人）、u.s. 5,789,199(Joly# A) ' U.S. 5,840,523(Simmons # A) > 述轉譯起始區（丁IR)及用於優化表現及分泌之信號序列。 亦參 lChar\ton，Methods in Molecular Biology，第248卷 (B.K.C. Lo編，Humana press, Totowa，NJ，2〇〇3)，第 245_ 254頁，其描述大腸桿菌中抗體片段之表現。表現之後， 抗體可自可溶部分中之大腸桿菌細胞糊狀物分離且可視同 型而疋經由例如蛋白A或G管柱加以純化。最終純化可類 似於純化例如CH〇細胞中所表現之抗體的方法進行。 除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核細胞微生物 為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主。在低等真核 細胞佰主微生物中最常使用釀酒酵母（Saccharomyces CereV】-Siae)或普通麵包酵母（baker’s yeast)。然而，大量其 149799.doc •112· 201106972
他屬、種及菌株通常可利用並適用於本文，諸如裂瘦酵母 (Schizosaccharomyces尸〇所办e);克魯維酵母宿主，諸如乳 酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母（尺./ragz7b)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母（尤 16,045)、威克克魯維酵母（ii：_w/cA：eram//)(ATCC 24,178)、 瓦提克魯維酵母（尺.而/i/〇(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵 母菌（AT.i/rc^op/n'/arwwXATCC 3 6,906)、耐熱克魯維酵母菌 ([ 及馬克斯克魯維酵母（足，所;解 脂耶氏酵母（}arro\Wa)(EP 402,226);甲醇酵母（P/c/^a paW〇rh)(EP 183,070);假絲酵母半知菌木黴 {Trichoderma reesia)(E? 244,234);粗厚神經胞子菌 (iVewroipora crassa);許旺酵母屬（Sc/iwawm’ow少ces)，諸如 西方許旺酵母（《Sc/zwawm’o/wyce·? occWwia/z··?);及纖維狀真 菌’諸如脈孢菌屬（iVewroaora)、青黴菌屬（户_以7//_)、 彎^員徽（Tb/ypoc/a山'Mm)及曲黴菌宿主，諸如溝 〇 巢麯黴及黑麵黴（Am’ger)。關於討論酵母及絲 狀真菌用於製備治療性蛋白質之用途的評述’參見例如
Gerngross，ΛΓα/· ^oiec/z. 22:1409-1414 (2004)。 可選擇糖基化路徑已「人類化」的某些真菌及酵母菌 株從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體。參 見例如Li等人，#加·价24..210-215 (2006)(描述甲醇 酵母中糖基化路徑之人類化）；及Gerngross等人（同上）。 適用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可源自多細胞生物 體（無脊椎動物及脊椎動物）。無脊椎動物細胞之實例包括 149799.doc -113- 201106972 植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株及變異體以及來 自諸如以下宿主的相應許可性昆蟲宿主細胞厂^地黏蟲 (Spodoptera frugiperda)(毛A) '埃及伊故以以以狀訂沖) (蚊子）、白紋伊蚊（Ua ⑽）（蚊子）、黑腹果繩 me/w叹似如）（果蠅）及家蠶（5〇_只_^·)。用 於轉染之多種病毒株公開可得’例如苜卷丫紋夜蛾 〇4wiograp/7a ca/(/bmka)NPV 之 L-1 變異體及家蠶 Npv 之
Bm-5病毒株，且該等病毒可根據本發明用作本文中之病 毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。 棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍（浮 萍科、紫苜蓿（截形苜蓿⑶/β))及菸 草之植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第 5,959，177 5虎、弟 6,040,498 號、第 6,420,548 號、第 7，125,978號及第6,417,429號（描述在轉殖基因植物中產生 抗體之 PLANTIBODIEStm 技術）。 脊椎動物細胞可用作宿主’且在培養物（組織培養物）中 增殖脊椎動物細胞已成為常規程序。適用哺乳動物宿主細 胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株（COS-7， ATCC CRL 1651);人類胚腎細胞株（293細胞或經次選殖以 便在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人，*/. Gen Wro/· 36:59 (1977);幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10);小鼠足細胞（TM4，Mather,价〇/.及叩⑺汰23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞 (VERO-76，ATCC CRL-1587);人類子宮頸癌細胞（HELA ’ 149799.doc -114· 201106972 ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛鼠 肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138， ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳 腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等 A » Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC 5多田 胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞株（Hep G2)。其他適用 哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，包括 DHFR_ CHO 細胞（Urlaub等人，Proc. iVai/. Jcai 5cz·· t/SJ 77:4216 (1980));及骨髓瘤細胞株，諸如NSO及Sp2/0。欲 回顧適用於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株，參見例 如 Yazaki 反 Methods in Molecular Biology，第 248 卷 (B.K.C. Lo編 ’ Humana Press, Totowa, NJ，2003)，第 255-268 頁。 宿主細胞用產生抗體之上述表現或選殖載體轉型，且在 適當時經修改的習知營養培養基中培養以便誘導啟動子、 Q 選擇轉化子或擴增編碼所需序列之基因。 h)培養宿主細胞 用於產生本發明抗體之宿主細胞可於多種培養基中培 -養。市購培養基（諸如Ham氏FlO(Sigma)、最低必需培養基 • (MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜貝科氏修飾之伊格 氏培養基（Dulbecco’s Modified Eagle's Medium ; DMEM)(Sigma))適用於培養宿主細胞。此外，Ham等人， Mei/z. £«ζ· 58:44 (1979) ; Barnes 等人， 102:255 (1980);美國專利第 4,767,704 號、第 4,657,866 149799.doc • 115- 201106972 號、第 4,927,762號、第 4,560,655號或第 5,122,469號；WO 90/03430，WO 87/00195 ;或美國專利參考案3〇,985中所 述之任何培養基可用作宿主細胞之培養基。任何此等培養 基均可視需要補充激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、 運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸如氯化鈉、躬、鎂及填 酸鹽）、緩衝液（諸如HEPES)、核苷酸（諸如腺苷及胸苦）、 抗生素（諸如GENTAMYCIN™藥物）、微量元素（定義為無 機化合物，通常以在微莫耳濃度範圍内之最終濃度存在） 及葡萄糖或等效能源。亦可包括熟習此項技術者已知之適 當濃度的任何其他必需補充劑。培養條件（諸如溫度、pH 值及其類似條件）為前述選擇用於表現之宿主細胞所用的 條件，且對一般技術者顯而易知。 i)抗體純化 使用重組技術時，抗體可在細胞内、周質間隙中產生， 或直接分泌至培養基中。若抗體於細胞内產生，則作為第 一步驟，藉由例如離心或超濾移除微粒碎片（宿主細胞或 已溶解片段）。Carter 等人，价1〇:163_167 (1992)描述將分泌至大腸桿菌之周質間隙中之抗體分離的 程序。簡言之，在乙酸鈉（pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯 氟（PMSF)存在下，經約30分鐘將細胞糊狀物解凍。細胞碎 片可利用離心移除。在抗體分泌至培養基中之情形下，通 帛首先使用市售蛋白濃縮過濾器（例如Amic〇n或Miiiip0re Pellicon超濾裝置）濃縮此等表現系統之上清液。任何前述 步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水 149799.doc •116· 201106972 解’且可包括抗生素以防止外來污染物生長。 由細胞製備之抗體組合物可使用例如羥磷灰石層析、疏 水相互作用層析、凝膠電泳、透析及親和性層析來純化， 親和性層析為通常較佳之純化步驟之一。蛋白人作為親和 性配位體之適用性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白&域 的種類及同型而定。蛋白A可用於純化基於人類γ1、丫2或 γ4重鏈的抗體（Lindmark等人，/· /所所⑽从似62m 0 (1983))。蛋白G推薦用於所有小鼠同型及人類Y3(Guss等 人，五5:15671575 (1986))。雖然親和性配位體所連 接之基質最常為瓊脂糖，但可利用其他基質。與用瓊脂糖 可達成之流速及處理時間相比，機械穩定性基質（諸如可 控孔隙玻璃或聚（苯乙烯二乙稀基）苯）允許更快之流速及更 短之處理時間。當抗體包含Ch3域時，可使用BakeAond ΑΒΧ™樹脂α τ歸％ phi出psburg，Νί)純化。視欲回收 ^抗體而定’亦可利用純化蛋白質之其他技術，諸如離子 〇 交換柱分離法、乙醇沈澱法、逆相HPLC、二氧化矽層 析、肝素SEPHAR0SETM層析、陰離子或陽離子交換樹脂 (諸如聚天冬胺酸管柱）層析、層析聚焦、sds_page及硫 酸銨沈澱。 繼任何初步純化步驟之後，可使用阳值為約2 5_4 5之間 的溶離緩衝液使包含所關注之抗體及污染物之混合物進行 低阳疏水性相互作用層析，較佳在低鹽濃度（例如約0-0.25 Μ鹽）下進行。 通常’用於製備供研究、測試及臨床使用之抗體之各種 149799.doc •117- 201106972 方法在此項技術中已充分確立，與上述方法一致且/或被 熟習此項技術者視為適用於所關注之特定抗體。 c.免疫結合物 本發明亦提供包含與一或多種細胞毒性劑結合之抗體的 免疫結合物（可互換地稱為「抗體_藥物結合物」或 「ADC」），細胞毒性劑諸如化學治療劑、藥物、生長抑 制劑、毒素（例如蛋白質毒素，細菌、真菌、植物或動物 來源之酶促活性毒素，或其片段）或放射性同位素（亦即放 射性結合物）。 免疫結合物已在癌症治療中用於細胞毒性劑（亦即殺死 細胞或抑制細胞生長或增殖之藥物）之局部傳遞（Lambert， J_ (2005) 灯 5:543-549 ; Wu等 人，（2005) TVaiwre 少 23(9):1 137-1 146 ; Payne， G. (2003) i 3:207-212 ; Syrigos 及 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614 ; Niculescu-Duvaz 及 Springer (1997) Ji/v. De/ίν. 26:151-172 ;美國專 利第4,975，278號）。免疫結合物允許藥物部分乾向傳遞至 腫瘤且在其中進行細胞内積聚，其中未結合藥物之全身投 與會對正常細胞以及試圖消除之腫瘤細胞造成不可接受之 毒性程度（Baldwin等人，(1986年3月15日）第603-05 頁；Thorpe (1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review，」於 M〇f2〇c/〇«<3/
AntibodiQS '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera等人編）第475-5 06頁）。已報導多株抗體與單株抗 149799.doc -118- 201106972 體均適用於此專录略中（Rowland等人，（1986) Cczwcer iwmwwo/. /mmMwoi/zer. 21:1 83-87)。該等方法中使用的藥物 包括道諾黴素、阿黴素、曱胺喋呤及長春地辛（Rowland等 人，（1986)同上）。用於抗體-毒素結合物之毒素包括諸如 白喉毒素之細菌毒素；諸如萬麻毒蛋白之植物毒素；小分 子毒素，諸如格爾德黴素（geldanamycin)(Mandler等人， (2000) J. Cancer 92(19):1573-1581 ; Mandler等 人 ’ (2000) S/oorg'am.c c& Chem. Letters 10:1025- 1028 ; Mandler等人，（2002) C/zew. 13:786- 791)，類美登素（EP 1391213 ; Liu等人，（1996) iVoc.
Jcod 5W. i/iSvi 93:8618_8623)及加里刹徽素（calicheamicin) (Lode等人，（1998) Cancer Λα. 58:2928 ; Hinman等人， (1993) Cancer Λα. 53:3336-3342)。毒素可藉由包括微管 蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來發揮其細 胞毒性作用。有些細胞毒性藥物當與大抗體或蛋白質受體 配位體結合時易失活或活性降低。 ZEVALIN®(替伊莫單抗替烏克坦（ibritumomab tiuxetan)， Biogen/Idec)為抗體-放射性同位素結合物，其由藉由硫脲 連接子-螯合劑相結合之抗CD20抗原（發現於正常及惡性B 淋巴細胞之表面上）之鼠類IgGlK單株抗體與114η或9GY放射 性同位素組成（Wiseman 等人（2000)五wr. «/owr. 27 (7):766-77; Wisemanf A(2002) Blood 99 (12) :4336-42; Witzig等人（2002) J. Owco/· 20 (10) :2453-63; Witzig 等人（2002) J. C/M. 0«co/. 20 (15) :3262-69)。儘管 149799.doc -119- 201106972 ZEVALIN具有抗B細胞非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)的活性， 但投藥在大部分患者中引起嚴重及長期性血細胞減少症。 MYLOTARG™(吉妥珠單抗奥唑米星（gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)(— 種由相連接之 huCD33抗體與刺孢黴素組成的抗體藥物結合物）於2000年 獲准用於注射治療急性骨髓性白血病（Drwg·? 〇/ ί/ze Fwiwre (2000) 25 (7):686 ;美國專利第 4970198 號、第 5079233 號、第 5585089 號、第 5606040 號、第 5693762 號、第 5739116號、第5767285號、第5773001號）。康圖單抗美坦 辛（Cantuzumab mert an sine) (Immunogen, Inc.)(—種由經由 二硫化物連接子SPP相連接之huC242抗體與類美登素藥物 部分DM 1構成的抗體-藥物結合物）正進入治療表現CanAg 之癌症的II期試驗，諸如結腸癌、胰臟癌、胃癌及其他癌 症。MLN-2704(Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.)(—種由相連接之抗前列腺特異性膜抗原 (PSMA)單株抗體與類美登素藥物部分DM1構成的抗體-藥 物結合物）正開發用於前列腺腫瘤之潛在性治療。奥利斯 坦叮（auristatin)肽、奥利斯坦叮E(AE)及單曱基奥利斯坦 叮（monomethylauristatin ; MMAE)(海兔毒素之合成類似 物）與後合單株抗體cBR96(對癌科Lewis Y具有特異性）及 cACIO(對惡性血液病CD30具有特異性）結合（D〇r〇nina等人 (2003) Nature Biotechnology 21 (7):778-784)且正在治療性 開發中。 在某些實施例中’免疫結合物包含抗體及化學治療劑或 149799.doc •120- 201106972 其他毒素。本文中（例如上文）描述了適用於產生免疫結合 物之化學治療劑。可使用的酶促活性毒素及其片段包括： 白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自 綠膿假單胞菌）、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根 毒蛋白A鏈、α-帚麴菌素（alpha-sarcin)、油掏（Aleurites fordii)蛋白質、康乃馨蛋白質、美洲商陸（Phyt〇laca americana)蛋白質（PAPI、PAPII 及 PAP-S)、苦瓜（momordica
charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白（curcin)、巴豆毒蛋白 (crotin)、肥皂草（sapaonarja 〇fficinaiis)抑制劑、白樹素 (gelonin)、有絲分裂素（mitogeiHn)、侷限麴菌素 (restrictocin)、紛徽素、伊諾黴素（en〇mycin)及單端抱黴烯 族毒素（tricothecene)。參見例如1993年1〇月28曰公開之 WO 93/21232。多種放射性核素可用於產生放射性結合之 抗體。實例包括212Bi、1311、mIn、川丫及⑻以。抗體與細 胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑製得，該 等蛋白偶聯劑諸如3-(2-吡啶基二硫基）丙酸N_ 丁二醯亞胺 醋（SPDP)、5胺基硫雜環戊帥τ)、_㈣之雙官能街 生物（諸如二亞胺代己二酸二甲醋鹽酸鹽）、活性醋（諸如辛 二酸二丁二醯亞胺醋）、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合 物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己- ° 签—胺）、雙重氮鹽衍生物 (Γ如雙（對重氮鹽苯甲酿基）·乙二胺）、二異氛酸醋（諸如甲 本2,6_二異氮酸醋）及雙活性氟化合物（諸如1>5_二氟_24二 石肖基苯）。舉例而言，昆麻毒素免疫毒素可如抑伽等人， Science，238:1098 (1987)中所述力 149799.doc -121. 201106972 異硫氰基苯曱基-3-曱基二伸乙三胺五乙酸（ΜΧ-DTPA)為一 種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見 WO 94/11026。 本文亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素（諸如刺胞黴 素、美登素類、海兔毒素、奥瑞他汀、單端孢黴稀族毒素 及CC1065以及此等毒素之具有毒素活性之衍生物）之彡士合 物0 1·美登素與類美登素 在一些實施例中，免疫結合物包含抗體（全長或片段）與 一或多種類美登素分子之結合物。 類美登素為藉由抑制微管蛋白聚合而發揮作用之有絲分 裂抑制劑。美登素最先係自東非灌木齒葉美登木 (1\^71611此561^13)分離（美國專利第3,896，111號）。隨後發 現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇 酯（美國專利第4,15 1,042號）。合成的美登醇及其衍生物及 類似物揭示於例如美國專利第4,137,230號；第4,248，870 號；第 4,256,746號；第 4,260,608號；第 4,265,814號；第 4,294,757號；第 4,307,016號；第 4,308,268號；第 4,308,269 號；第 4,309,428 號；第 4,313,946 號；第 4,315,929 號；第 4,317,821號；第 4,322,348 號；第 4,331,598 號；第 4,361,650 號；第 4,364,866 號；第 4,424,219 號；第 4,450,254 號；第 4,362,663 號及第 4,371,533 號中。 類美登素藥物部分為抗體藥物結合物中引人注目之藥物 部分，此歸因於其：（i)藉由醱酵或化學修飾、醱酵產物衍 149799.doc -122- 201106972 金i製備相對各易；⑻易用適於經由非二硫化物連接子 、抗體結合之官能基衍生化；（m)在血衆中穩定；及（iv) 對多種腫瘤細胞株有效。 _ +#|胃美登素之免疫結合物、其製造方法及其治療用途 、揭不於例如美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲 專利EP 〇 425 235 B1中，其揭示内容以引用的方式明確併 入本文中。Liu等人，Proc Natl Acad Sci USA 93:8618_ ο 8623 (1996)描述的免疫結合物包含相連接之類美登素(命 名為DM1)與針對人類結腸直腸癌之單株抗體c242。已發 現該結合物對所培養之結腸癌細胞具有高細胞毒性且在活 體内腫瘤生長分析法中顯示抗腫瘤活性。Chari等人， Cancer Research 52:127 131 (1992)描述免疫結合物其中 類美登素經由二硫化物連接子與結合至人類結腸癌細胞株 上之抗原的鼠類抗體八7結合’或與結合HER_2/neu致癌基 因之另種乳類單株抗體TA_ 1結合。已活體外測試τα. 1 _ 〇 類美登素結合物對人類乳癌細胞株SK-BR-3之細胞毒性， δ亥細胞株每個細胞表現3χ1〇5個HER_2表面抗原。藥物結合 物達成的細胞毒性度與游離類美登素藥物類似，細胞毒性
I •度可藉由增加每個抗體分子之類美登素分子之數目來增 加Α7_類美登素結合物在小鼠體内顯示低全身性細胞毒 性。 抗體-類美登素結合物係藉由將抗體與類美登素分子化 學連接來製備而不顯著降低抗體或類美登素分子之生物學 活性》參見例如美國專利第5,2〇8,〇2〇號（其揭示内容以引 149799.doc •123- 201106972 用方式明確地併入本文中）。平均每個抗體分子結合3_4個 類美登素分子已顯示出增強標靶細胞之細胞毒性之功效而 對抗體功能或溶解性無不利影響，即使一個分子毒素/抗 體預計亦會增強細胞毒性而超過使用裸抗體。類美登素已 為此項技術中所熟知，且可藉由已知技術合成或自天然來 源分離。適當之類美登素揭示於例如美國專利第5,2〇8,〇2〇 號及上文提及之其他專利及非專利公開案中。較佳之類美 登素為美登醇及在美登素醇分子之芳環中或其他位置處經 修飾之美登醇類似物（諸如各種美登醇酯）。 此項技術中已知之用於製備抗體_類美登素結合物的多 種連接基團包括例如美國專利第5,2θ8,θ2θ號或歐洲專利〇 425 235 B1 ’ Chari 等人，Cancer Research 52:127. 131(1992)及美國專利申請案第1〇/96〇6〇2號（2〇〇4年1〇月8 曰申請）中所揭示的連接基團，其揭示内容以引用方式明 確併入本文中。可如2004年1〇月8曰申請之美國專利申請 案第10/960,602號中所揭示，製備包含連接組分SMCC之抗 體-類美登素結合物。如以上鑑別之專利中所揭示連接 基團包括二硫基、硫醚基、酸不穩定性基團、光不穩定性 基團、肽酶不穩定性基團或酯酶不穩定性基團，較佳為二 硫基及硫醚基。本文中描述及舉例說明其他連接基團。 杬體與類美登素之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑 製得，該等蛋白偶合劑諸如3_(2_吡啶基二硫基）丙酸义丁 二醯亞胺酯（SPDP)、4-(Ν-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷_ 1-甲酸丁二醯亞胺酯（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷（ΙΤ)、醯 149799.doc -124*. 201106972 亞胺酯之雙官能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸 鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛類（諸如戊 二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己二 胺）、雙重氮鹽衍生物（諸如雙（對重氮鹽苯甲醯基）_乙二 胺）、二異氰酸酯（諸如曱苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化 合物（諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。特別較佳之偶合劑包 括提供二硫鍵之3-(2-吡啶基二硫基）丙酸N-丁二醯亞胺酯 (SPDP)(Carlsson等人，如173:723-737 (1978))及 4-(2-吡啶基硫基）戊酸N-丁二醯亞胺酯（SPP)。 視連接類型而定，連接子可連接於類美登素分子之各種 位置。舉例而言’可使用習知偶合技術、藉由與羥基反應 形成酯鍵。反應可發生於具有羥基之C-3位置、經經甲基 修飾之C-14位置、經羥基修飾之c-1 5位置及具有羥基之c_ 20位置處。在一較佳實施例中，鍵聯形成於美登醇或美登 醇類似物之C-3位置處。 2·奥利斯坦叮及海兔毒素 在一些實施例中’免疫結合物包含抗體與海兔毒素或海 兔毒素肽類似物及衍生物奥利斯坦叮之結合物（美國專利 第5635483號、第578〇588號）。海兔毒素及奥利斯坦叮已 顯示可干擾微管動力學、GTP水解及細胞核及細胞分裂 (Woyke等人 ’（2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):358〇-3584)且具有抗癌（US 5663149)及抗真菌活性 (Pettit等人 ’（1998) Antimicrob· Agents Chemother. 42. 2961 -965)。海兔毒素或奥利斯坦叮藥物部分可經由肽藥物 149799.doc -125- 201106972 部分之N(胺基）末端或C(羧基）末端與抗體連接（WO 02/088172)。 例示性奥利斯坦叮實施例包括「Monomethyl valine Compounds Capable of Conjugation to Ligands」（2004年 11 月5日申請之美國專利第10/983,340號，其全部揭示内容以 引用方式明確併入本文中）中所揭示的N末端連接之單曱基 奧利斯坦叮藥物部分DE及DF。 基於肽之藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上胺基酸 及/或肽片段之間形成肽鍵而製備。該等肽鍵可根據例如 肽化學領域中熟知之液相合成方法（參見E. Schrader及K. Liibke，「The Peptides」，第 1 卷，第 76-136 頁，1965, Academic Press)製備。可根據以下文獻中之方法製備奥利 斯坦叮/海兔毒素藥物部分：US 5635483 ; US 5780588 ; Pettit等人，（1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465 ; Pettit 等人（1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R.等人，Synthesis, 1996，719-725 ;及 Pettit 等 人，（1996) J. Chem. Soc· Perkin Trans. 1 5:859-863。亦參 見 Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7):778-784 ； 「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，2004年11月5日申請之美國專利第10/983,340 號，其全文以引用方式併入本文中（揭示例如連接子及製 備與連接子結合之單甲基纈胺酸化合物（諸如MMAE及 MMAF)的方法）。 3.刺孢擻素 149799.doc •126- 201106972 在其他實施例中，免疫結合物包含抗體與一或多個刺孢 黴素分子之結合物。刺胞黴素家族之抗生素能夠在亞皮莫 耳濃度下產生雙股DNA斷裂。有關刺胞黴素家族結合物之 製備，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第 5,739，116 號、第 5,767,285 號、第 5,770,701 號、第 5,770,710 號、第 5,773,001 號及第 5,877,296 號（均頒予 American Cyanamid Company)。可使用之刺孢黴素之結構 類似物包括（但不限於）γΐΙ、α2Ι、《31、N-乙醯基-γιι、 PSAG及 0Il(Hinman等人，Cancer Research 53:3336-3342 (1993) ; Lode等人 ’ Cancer Research 58:2925-2928 (1998); 及頒予American Cyanamid之上述美國專利）。可與抗體結 合之另一種抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑。刺胞黴素 與QFA皆具有細胞内作用位點且不易於跨過質膜。因此， 細胞經由抗體介導之内化作用攝取此等藥劑可大大增強其 細胞毒性作用。 4.其他細胞毒性劑 可與抗體結合之其他抗瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素 (streptozoicin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶（該家族之藥劑統 稱為LL-E33288複合物，如美國專利5,〇53,394、5,770,710 中所述）以及艾斯帕米辛（eSperamicin)(美國專利 5,877,296) ° 可使用的if；促活性毒素及其片段包括白喉A鍵、白喉毒 素之非結合活性片段、外毒素A鏈（獲自綠膿假單胞菌）、 篦麻毒素A鏈、相思豆毒素a鍵、蒴蓮根毒素a鏈、α_帚麴 149799.doc -127· 201106972 菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白(顧、 PAPII及PAp_S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋 白、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲分裂素、偈限麵菌素、 酚黴素、伊諾黴素及單端孢黴烯族毒素。參見例如1993年 10月28日所公開之WO 93/21232。 本發明進一步涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物（例 如核糖核酸酶或DNA内切酶，諸如去氧核糖核酸酶； DNase)之間所形成的免疫結合物。 為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。可使 用多種放射性同位素產生放射性結合抗體。實例包括 At、I13 丨、I丨25、γ9。、Re186、Rei88、％153、出212、卩32、
Pb212及Lu之放射性同位素。當使用結合物進行偵測時，其 可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如Tc"m或 I123 ;或用於核磁共振（NMR)成像（亦稱為磁共振成像， mri)之自旋標記’諸如峨_丨23及硪_丨3〗、銦-丨丨丨、氟_丨9、 碳-13、氮-1 5、氧-17、釓、猛或鐵。 可以已知方式將放射性標記或其他標記併入結合物中。 舉例而言，肽可生物合成，或可藉由化學胺基酸合成、使 用適當胺基酸前驅物（包括例如替代氫的氟_丨9)來合成。諸 如tc或I 、Rel86、Re188及In111之標記可經由肽中之半 胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。可使用 IODOGEN 方法（Fraker 等人，（1978) Biochem. Biophys· Res. Commun· 80: 49_57)併入碘 _123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」（Chatal, CRC Press 149799.doc -128· 201106972 1989)詳細描述了其他方法。 抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合 劑製得，該等蛋白偶合劑為諸如3-(2-吡啶基二硫基）丙酸 N-丁二醯亞胺酯（SPDP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基）環 己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷 (IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二曱 酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛類 (諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯 基）己二胺）、雙重氮鹽衍生物（諸如雙（對重氮鹽苯甲醯基）-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如曱苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性 氟化合物（諸如1,5 -二氟-2，4-二石肖基苯）。舉例而言，蓖麻 毒素免疫毒素可如Vitetta等人，238:1098 (1987) 中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-曱基二伸 乙三胺五乙酸（MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗 體結合之例示性螯合劑。參見W094/11026。連接子可為 有利於細胞毒性藥物釋放於細胞中之「可裂解連接子」。 舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接 子、光不穩定性連接子、二曱基連接子或含二硫鍵連接子 (Chari等人，52:127-131 (1992);美國專 利第 5,208,020號）。 該等化合物明確涵蓋（但不限於）與以下交聯試劑所製備 之 ADC : BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、 MBS、ΜΡΒΗ、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、 SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo- 149799.doc -129- 201106972 MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC 及 sulfo-SMPB 及 SVSB((4- 乙烯基砜）苯甲酸丁二醯亞胺酯），該等交聯試劑可市構（例 如構自 Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。 參見 2003-2004 Applications Handbook and Catalog第 467- 498 頁。 5.製備抗體藥物結合物 在抗體藥物結合物（ADC)中，抗體（Ab)經由連接子（l)與 一或多個藥物部分（D)(例如每個抗體約1至約2〇個藥物部 分）結合。式I之ADC可藉由若干途徑，使用熟習此項技術 者已知之有機化學反應、條件及試劑來製備，包括：（”使 抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成 Ab-L，接著與藥物部分D反應；及（2)使藥物部分之親核基 團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D_L，接著與 抗體之親核基團反應。本文描述用於製備ADC之其他方 法。
Ab-(L-D)p j 連接子可由一或多種連接子組分構成。例示性連接子組 分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基（「Mc」）、順丁烯二醯 亞胺基丙醯基（「MP」）、纈胺酸-瓜胺酸（「val-cit」）、丙 胺酸.苯丙胺酸（「ala-phe」）、對胺基苯曱氧基羰基 (「PAB」）、4-(2-吡啶基硫基）戊酸N_ 丁二醯亞胺酯 (「SPP」）、4_(N_順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷小甲酸 N-丁 —醯亞胺酯（「SMCC」）及（4_碘-乙醯基）胺基苯甲酸 N-丁二醯亞胺酯（「SIAB」）。其他連接子組分已為此項技 149799.doc -130- 201106972 術中所知且有些描述於本文中。亦參見 「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，2004年11月5曰申請之美國專利第1〇/983,wo 號’其全部内谷以引用方式併入本文中。 在一些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺 基酸連接子組分包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二 肽包括纈胺酸-瓜胺酸（vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸（af Q 或ala-Phe)。例示性三肽包括甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸（gly-Val_cit)及甘te酸-甘胺酸-甘胺酸（gly_gly_gly)。包含胺基 酸連接子組分之胺基酸殘基包括天然存在之胺基酸以及次 要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。可 對胺基酸連接子組分進行設計且優化以對特定酵素（例如 腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、c及D或纖溶蛋白酶）之 酶促裂解具有選擇性。 抗體上之親核基團包括（但不限於）：⑴N末端胺基；（Η) 〇 側鍵胺基’例如離胺酸；（in)側鏈硫醇基，例如半胱胺 酸；及（iv)抗體經糖基化之糖羥基或胺基。胺基、硫醇基 及羥基呈親核性且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親 •電子基團（包括：（i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲 :酸醋及酸鹵化物；（ii)烷基及苯甲基函化物，諸如齒乙醯 胺；（iii)搭、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基;)反應形成共價 鍵。某些抗體具有可還原之鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸 橋抗體可猎由诸如DTT(二硫蘇糖酵）之還原劑處理而具 有反應性以便與連接子試劑結合。因此，每個半胱胺酸橋 149799.doc -131· 201106972 在理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。其他親核基團可 經由離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷（特勞特試劑（心扣以 reagent))反應使胺轉化為硫醇而引入抗體中。反應性硫醇 基可藉由引入-個、兩個、三個、四個或四個以上半脱胺 酸殘基而引入抗體（或其片段）中（例如製備包含一或多個非 原生半胱胺酸胺基酸殘基之突變體抗體）。 亦可藉由修飾抗體以引入可與連接子試劑或藥物上之親 核性取代基反應的親電子性部分來製備抗體藥物結合物。 糖基化抗體中之糖可以例如過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成 可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的越或嗣基。所得 亞胺希夫鹼（Schiff base)基團可形成穩定鍵聯，或可經例 如硼氫化物試劑還原而形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖 基化抗體中之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過峨酸 納之反應可於蛋白質中產生可與藥物上之適當基團反應的 幾基（酸及 _基團）（Hermans〇n，Bi〇c〇njugate τ_η 咖十 在另貫把例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白 質可與偏過碘酸鈉反應’從而產生醛而非第一胺基酸 (Geoghegan 及 Stroh，（1992) Bi〇c〇njugate 3:138_ 146’· US 5362852)。«可與藥物部分或連接子親核體反 應。 類似地，藥物部分上之親核基團包括（但不限於）：胺、 硫醇、經基、醯肼 '海、肼、硫半卡（thi〇semi⑽以贿）、 肼Μ酸鹽及芳基醯肼基團，該等基團能夠與連接子部分及 連接子試劑上之親電子基團（包括：⑴活性醋，諸如麵 149799.doc • J32- 201106972 酯、H〇m酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；（ii)烷基及苯甲基鹵 化物，諸如鹵乙醯胺；（iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞 胺基）反應形成共價鍵。 或者，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可藉由例如重 組技術或肽合成法製造。DNA之長度可包含編碼結合物之 兩個部分的各別區域，該等區域可彼此相鄰或由編碼不破 壞結合物所需特性之連接子肽之區域分隔。 Q 在另一實施例中，抗體可與用於預靶向腫瘤的「受體」 (諸如抗生物蛋白鏈菌素）結合，其中將抗體_受體結合物投 與患者，隨後使用廓清劑將未結合之結合物自循環系統中 移除，且接著投與與細胞毒性劑（例如放射性核苷酸）結合 的「配位體」（例如抗生物素蛋白）。 本發明之抗Axl抗體可藉由此項技術中已知之各種分析 法表徵其物理/化學性質及/或生物活性。 a) 活性分析法 〇 在一態樣中，提供用於鑑別具有生物活性之抗Axl抗體 之分析法。生物活性可包括例如抑制配位體與Αχί結合、 抑制Axl之磷酸化或下調Αχί表現。亦提供在活體内及/或 活體外具有該生物活性之抗體。 在某些實施例中，測試本發明抗體抑制配位體與Αχ1結 合、抑制Axl磷酸化或下調Αχί表現之能力。 b) 結合分析法及其他分析法 在一態樣中’測試本發明抗體之抗原結合活性，例如藉 由諸如ELISA、西方墨點法等已知方法測試。在另一態樣 149799.doc -133· 201106972 中，可使用競爭分析法鑑別與3G9、8B5、12A11或4F8競 爭結合Axl之單株抗體。在某些實施例中，該競爭抗體結 合的抗原決定基與3G9、8B5、12A11或4F8所結合之抗原 決定基（例如線性或構形抗原決定基）相同。例示性競爭分 析法包括（但不限於）常規分析法，諸如Harlow及Lane (1988) vl 第 14 章（Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)中提供 之常規分析法。對抗體所結合之抗原決定基定位之詳細例 示性方法提供於 Methods in Molecular Biology，第 66 卷 (Humana Press, Totowa，NJ)中之 Morris (1996)「Epitope Mapping Protocols」中。兩種抗體若一者將另一者之結合 阻斷50%或50%以上，則稱該兩種抗體結合於相同抗原決 定基。 在例示性競爭分析法中，在包含結合Axl之第一經標記 抗體（例如3G9、8B5、12A11或4F8)及經測試能夠與第一抗 體競爭結合Axl之第二未標記抗體的溶液中培育固定Axl。 第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第 一經標記抗體、但不包含第二未標記抗體的溶液中培育固 定之Axl。在允許第一抗體與Axl結合之條件下培育之後， 移除過量的未結合抗體，且量測與固定之Axl結合之標記 之量。若相對於對照樣品，測試樣品中與固定之Axl結合 之標記之量大幅減少，則指示第二抗體與第一抗體競爭結 合 Axl。 在一態樣中，本發明之抗體可藉由一系列分析法進一步 149799.doc -134- 201106972 表徵’該等分析法包括（但不限於）N末端定序、胺基酸分 析、非變性尺寸排阻高壓液相層析（HpLC)、質譜分析、離 子交換層析及木瓜蛋白酶消化。 應瞭解，可使用本發明之免疫結合物替代抗Axl抗體或 除抗Axl抗體之外亦可使用本發明之免疫結合物來執行任 何上述分析法。 方法 〇 〇 組合療法 本發明之特徵在於Axl拮抗劑與vegf拮抗劑之組合使 用°該組合之有利效應包括（但不限於）治療劑組合所產生 之樂物動力學或樂效學共同作用。本發明尤其適用於治療 各階段之各類型癌症。 術語癌症包含多種辦+、戍、产..x 夕種增生病症，包括（但不限於）癌前期生 二且二=瘤及惡性腫瘤。良性腫瘤保持定位於初始位點 潤、侵襲或轉移至遠端位點之能力。惡性腫 ==壞其周圍的其他組織。其亦能夠脫離初始位 體的其他部分（轉移）。原發性 擴政至身 型分類；轉移性腫瘤係依計 據其發生之組織類 膻層係依據癌細胞所來源之 類。惡性腫瘤細胞隨日㈣變得更 、㈤“ 細胞。癌細胞外形之此變二且似手更不像正常 為充分分化(低級)、中度：:腫:錢’且癌細胞描述 級)。充分分化細胞之外形 化或未分化(高 正常細胞。未分化細胞為…/類似於其所來源之 胞為已變件如此異常以致無法判定細 149799.doc -135· 201106972 胞起源的細胞。 癌症分期系統描述在解剖學上癌症已擴散之程度且試圖 將具有類似預後及治療之患者歸為同一階段組。可進行數 種測試以有助於對癌症分期’包括活組織檢查及某些成像 測試，諸如胸部X射線、乳房X射線攝像（mamm〇gram)、 骨骼掃描、CT掃描及MRI掃描。亦使用血液測試及臨床評 估來評估患者總體健康且偵測癌症是否已擴散至某些器 官。 為對癌症分期，美國癌症聯合委員會（American Joint Committee on Cancer)首先使用TNM分類系統將癌症（尤其 實體腫瘤）按字母歸類。癌症以字母τ(腫瘤尺寸）、N(可觸 知結點）及/或Μ(轉移）指明。T1、Τ2、丁3及了4描述原發性 病變之尺寸增加；NG、N1、Ν2、⑽指示涉及進行性發展 之結點；且Μ0及]νπ反映不存在或存在遠端轉移。 在第二種分期方法（亦稱為總體分期或羅馬數字分期） 中將癌症刀成0至1 V期（合併原發性病變之尺寸以及結節 擴散及遠端轉移；、 . L, . ^ ^ 将砂之存在）。在此系統令，將病例分為由羅 馬數字I至IV表示之四個階段，或歸類為「復發性」。對於 某些癌症，0期稱為「疮从 々「π. 冉馬原位」或Tis」，諸如對於乳癌而 °私為乳腺官原位癌或小葉原位癌。高級腺瘤亦可歸類
1通# I期癌症為通常可治癒之小局部癌症，而IV 期通常表不無法進行手術或轉移性癌症。⑽及出期癌症 通常局部發展及/或顯示涉及局部淋巴結。通常，較高級 數字指示較曹士 # + 疾病’包括較大腫瘤尺寸及/或癌症擴散 149799.doc •136· 201106972 至附近淋巴結及/或鄰近原發性腫瘤之器官。此等階段定 義明確，但各類型癌症的定義不同且為熟習此項技術者所 知。 許多癌症登記處（諸如美國國家癌症研究所之監視、流 行病學及最終結果計劃（NCI，s Surveillance，Epidemiology， and End Resuhs pr〇gram，SEER))係使用總結分期。此系 統用於所有類型之癌症。其將癌症病例分成五個主要類 為別： 、 〇 原位為早期癌症，其僅存在於其開始之細胞層中。 局部化為偈限於開始器官’而無擴散證據之癌症。 區域性為已擴散超出初始（原發性）位點至附近淋巴結或 益官及組織之癌症。 遠端為已自原發性位點擴散至遠端器官或遠端淋巴結之 癌症。 未知用於描述無足夠資訊指示階段之病例。 〇 此外常見的是’在原發性腫瘤已移除之後數月或數年， 癌症復發。在所有可見腫瘤已根除之後復發之癌症稱為復 發性疾病。在原發性腫瘤區域内復發之疾病為局部復發， ’ 且以轉移形式復發的疾病稱為遠端復發。 腫瘤可為貫體腫瘤或非實體腫瘤或軟組織腫瘤。軟組織 腫瘤之實例包括白血病（例如慢性骨髓性白血病、急性骨 髓性白金病、成年急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白 病成熟B細胞急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性 白血病、前淋巴球性白血病或毛細胞白血病）或淋巴瘤（例 149799.doc •137- 201106972 如非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚τ細胞淋巴瘤或霍 實體腫瘤包括除血液、骨髓或淋巴系統以外的身體组織之 任何癌症。龍腫射進―步分為上皮細胞起源之實體腫 瘤及非上皮細胞起源之實體腫瘤。上皮細胞實體腫瘤之實 例包括胃腸道、結腸、乳房、前列腺、肺、腎、肝、姨、 即巢、頭及頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛 門、膽囊、唇、鼻咽、皮膚、子宮、雄性生殖器、泌尿器 官、膀胱及皮膚之腫瘤。非上皮起源之實體腫瘤包括肉 瘤、腦腫瘤及骨腫瘤。 除上述治療方案以外，可對患者進行外科手術移除癌細 胞及/或放射療法。 在某些實施例中，對本文中之患者進㈣斷測試，例如 在治療之前及/或治療期間及/或治療之後進行診斷測試。 通常，若進行診斷測試，則樣品可獲自需要治療之患者。 若個體患有癌症，則樣品可為腫瘤樣品或其他生物樣品， 諸如生物體液，包括（但不限於）血液、尿、唾液、腹水、 或諸如血清及血漿之衍生物，及其類似物。 在些貫知例中’個體癌症表現（在一些實施例中，過 度表現）Axl及/或VEGF ^測定Αχ1及VEGF表現之方法在此 項技術中已知且本文中描述某些方法。 在一態樣中’本發明提供治療癌症、抑制不良細胞增 殖、抑制癌症轉移及活體内或活體外誘導腫瘤細胞之細胞 ;周亡的方法’該方法包含在允許本發明之抗體與Axl結合 之條件下使細胞暴露於抗體。在某些實施例中，細胞為骨 149799.doc -138- 201106972 髓性白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、前列 腺癌細胞、腎細胞癌細胞及神經膠母細胞瘤細胞。在—實 施例中，本發明之抗體可用於抑制Axl之活性，該方法包 含使Axl暴露於本發明之抗體以便抑制Αχί之活性。 在一態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其包含向個 體投與有效量之本發明抗體。在某些實施例中，治療癌症 之方法包含向個體投與有效量之醫藥調配物，其包含本發 Q 明之抗體及視情況選用之至少一種其他治療劑（諸如下文 提供之治療劑）。 本發明之抗體在治療中可單獨使用或與其他組合物組合 使用。舉例而言’本發明之抗體可與至少一種其他治療劑 及/或佐劑共投與。在某些實施例中，其他治療劑為抗 VEGF抗體。 上述該等組合療法涵蓋組合投藥（其中兩種或兩種以上 治療劑包括在同一或各別調配物中），及分別投藥，在此 〇 情況下本發明抗體之投與可在投與其他治療劑及/或佐劑 之前、同時及/或之後進行。本發明之抗體亦可與放射療 法組合使用。 在一實施例中，將本發明之抗體用於結合個體中之Axl 的方法中’該個體罹患與Αχί表現及/或活性增加相關之病 症，該方法包含將抗體投與個體以結合個體中之Αχ1。在 一實施例中’ Axl為人類Axl且個體為人類個體。 診斷方法及偵測方法 在一態樣中’本發明之抗體適用於偵測生物樣品中Axl 149799.doc •139· 201106972 之存在。如本文中所用之術語「俄測」涵蓋定量或定性偵 測。在某些實施例中’生物樣品包含細胞或組織諸如腫 瘤組織。 在一態樣中，本發明提供偵測生物樣品中Αχ1之存在的 方法。在某些實施例中，該方法包含在允許抗Αχ1抗體與 Axl結合之條件下使生物樣品與抗Αχ1抗體接觸，及偵測抗 Axl抗體與Axl之間是否形成複合物。 在一態樣中，本發明提供診斷與Αχ1表現增加相關之病 症的方法。在某些實施例中，該方法包含：使測試細胞與 抗Axl抗體接觸；藉由偵測抗Αχ1抗體與Αχ1之結合來測定 測試細胞中Axl之表現量（定量或定性及對測試細胞之 Axl表現1與對照細胞（例如與測試細胞來源於相同組織之 正常細胞’或Axl表現量與此正常細胞相當之細胞）之Axl 表現量加以比較’其中測試細胞之AX丨表現量高於或低於 對照細胞皆指示存在與Αχί表現增加相關之病症。在某些 實施例中’測試細胞獲自懷疑患有與Αχί表現增加相關之 病症之個體。在某些實施例中’病症為細胞增殖性病症， 諸如癌症或腫瘤。 可使用本發明之抗體診斷之例示性病症包括骨髓性白血 病、肺癌（例如非小細胞肺癌（NSCLc))、胃癌、乳癌、前 列腺癌、腎細胞癌、胰臟癌及神經膠母細胞瘤。 可使用某些其他方法偵測抗體與Αχί之結合。該等方法 包括（但不限於）此項技術中熟知之抗原結合分析法，諸如 西方墨點法、放射免疫分析法、ELISA(酶聯免疫吸附分析 149799.doc •140- 201106972 法）、「夾心」免疫分析法、免疫沈殺分析法、螢光免疫分 析法、蛋白A免疫分析法及免疫組織化學（IHC)。 在某些實施例中，抗體經標記。標記包括（但不限於）直 接谓測之標記或部分（諸如蝥光、發色團、電子密度、化 學發光及放射性標記），以及間接偵測之部分，例如經由 ' 酶促反應或分子間相互作用間接偵測之部分，諸如酵素或 配位體。例示性標記包括（但不限於）放射性同位素32p、 Q 14(：、1251、4及1311 ;螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素 (fluorescein)及其衍生物；若丹明（rh〇damine)及其衍生 物；丹醯基（dansyl);傘酮（umbelliferone);螢光素酶，例 如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶（美國專利第4,737,456 號），螢火蟲發光素（111(^61>丨11);2,3-二氫酜嗓二_;辣根 過氧化酶（HRP);鹼性磷酸酶；半乳糖苷酶；葡糖澱粉 酶，〉谷菌酶，醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化 酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃 〇 嘌呤氧化酶，以及使用過氧化氫氧化染料前驅物之酵素 (諸如HRP、乳酸過氧化酶或微過氧化酶）、生物素/抗生物 素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定游離基團及其類似 物。 在某些實施例中，將抗體固定於不溶性基質上。固定可 能引起抗Axl抗體與溶液中保持游離之任何Αχΐ分離。固定 s知如下元成.在分析程序之前，降低抗Αχΐ抗體溶解 生，吸附至水不溶性基質或表面（Bennkh等人，U S 3,720,760)，或共價偶合（例如使用戊二醛交聯”或在抗 149799.doc -141 - 201106972
Axl抗體與Axl之間形成複合物之後，降低抗Axl抗體溶解 性，例如藉由免疫沈澱法降低抗Axl抗體溶解性。 應瞭解，可使用本發明之免疫結合物代替抗Axl抗體或 除抗Axl抗體之外亦使用本發明之免疫結合物來執行任何 上述診斷或偵測實施例。 本發明亦提供測定對Axl拮抗劑治療之反應的方法，包 含偵測圖6中所示之任一基因之表現（多肽，核酸）。在一些 實施例中，用Axl拮抗劑（諸如抗Axl抗體）治療後， MYCN、HLX、GAS7、HDAC9、E2F1、CXCR4、PMCH及 ANG-2中一或多者之表現增加。在一些實施例中，用Axl 拮抗劑（諸如抗Axl抗體）治療後，IFI44L、GJA4、Axl、 IFIT1、SCG5、CYTL1、DPP4 及 DKK3 中一或多者之表現 降低。在一些實施例中，增加及/或降低之表現為尚未經 Axl拮抗劑治療之個體（或經Axl拮抗劑治療之前的個體）中 的相對表現。 化學治療劑 本發明之組合療法可進一步包含一或多種化學治療劑。 組合投藥包括使用各別調配物或單一醫藥調配物進行共投 藥或同時投藥，及依任一次序之連續投藥，其中較佳存在 兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物活性的時間段。 化學治療劑（若投與）通常以其已知劑量投與，或由於藥 物之組合作用或可歸因於投與抗代謝物化學治療劑之消極 副作用而視情況降低。可根據製造商之說明書或如熟練從 業者根據經驗所確定來使用該等化學治療劑之製劑及給藥 149799.doc -142- 201106972 時程。 以上揭示可組合之各種化學治療劑。— „ 甘—些實施例中， 待組合之化學治療劑選自由以下組成 X <群.紫杉醇（包括 多西他赛及太平洋紫杉醇）、長春花（諸如 ^ 長春知負或長春 化鹼）、始化合物（諸如卡銘或順始）、芳香酶抑制劑（諸士 來曲峻、阿那曲錢依西美坦）、抗雌激素（例如氟維司群 或他莫昔芬）、依託泊苷、嗟替派、 a 壤磷醯胺、甲胺喋
呤、脂質阿黴素、聚乙二醇化脂質阿黴素、卡西他賓、士、 西他濱、COX-2抑制劑（例如賽利克西）或蛋白酶體抑制二 (例如PS342)。在-些實施例中，化學治療劑為紫杉醇及 翻化合物（諸如卡鉑）。 調配物、劑量及投藥 本發明所用治療劑將以符合優良醫藥實 給予且投與。本文中所考慮之因素包括所治療=病 症、所治療之特定健、個別患者之臨床錄、病症之病 因、藥劑傳遞位點、投藥方法、投藥時程、待組合藥劑的 藥物-藥物相互作用及醫學從業者已知之其他因素。 治療性調配物係使用此項技術中已知之標準方法，藉由 混合具有所需純度之活性成分與可選的生理學上可接受之 載劑、賦形劑或穩定劑（Remingt〇n，s pharmaceuticai Sciences (第 20 版），A. Gennar〇 編，2〇〇〇, Uppinc〇tt，
Williams & Wilkins，Phi][adelphia，pA)來製備。可接受之載 dJ包括生理食鹽水或緩衝劑，諸如填酸鹽、檸檬酸鹽及其 他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量（小於約 149799.doc -143- 201106972 ίο個殘基）多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫 球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶g同；胺基酸，諸 如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單 醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊 精；螯合劑，諸如EDTA;糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖 醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子界面活性劑， 諸如 TWEENtm、plur〇nicstm或 pEG。 調配物視情況但較佳含有醫藥學上可接受之鹽，較佳為 氣化鈉且較佳處於約生理學濃度下。本發明之調配物可視 If况含有醫藥學上可接受之防腐劑。在一些實施例中，防 腐劑濃度範圍通常為H2 ()%(v/v)。適當防腐劑包括醫 樂技術中已知者。笨甲醇、苯盼、間甲紛、對經基苯甲酸 ”曰及對經基苯甲酸丙醋為較佳防腐劑。本發明之調配物 了視情況包括濃度為〇 〇〇5至〇 〇2%之醫藥學上 面活性劑。 饮又·^介 ’d疋適應症需要時，本文中之調配物 以上活性化合物，較佳A且亡有 佳為具有不會對彼此產生不利影響 互補活性的活性化合物。 “、y響 之量組合存在。 以分子宜以有效達成預期目 活性成分亦可截留於 所製備之微谬囊(例如=由凝聚技罐^ 及聚(甲基丙烯酸甲酷):膠囊：甲基纖維气或：膠微夥: 統(例如脂質體、白、, 、截留於膠狀藥物傳遞: 米囊劑)或截留於巨乳洛由 心液“顆粒及; 中。該等技術揭示於Remingt()n 149799.doc -144 - 201106972
Pharmaceutical Sciences(同上）中 〇 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含 有抗體之半透性固體疏水性聚合物基質，該等基質呈成型 物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包 括聚酯、水凝膠（例如聚（曱基丙烯酸2_羥基乙酯）或聚（乙 '烯醇））、聚乳酸交酯（美國專利第3,773,919號）、L_麩胺酸 與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解性乙烯_乙酸乙烯 Q 酯、可降解性乳酸·乙醇酸共聚物（諸如LUpR〇N DEPOT，由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林構成的可 注射微球體））及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯_乙酸 乙烯醋及乳酸-乙醇酸之聚合物釋放分子能夠逾1〇〇天，但 某些水凝勝釋放蛋白質的時段更短。當囊封抗體長時間保 留於體内時，由於在3rC下暴露於水分，其可變性或聚 集，導致生物活性損失及可能之免疫原性變化。視所涉及 之機制而定，可設計合理策略以達成穩定化。舉例而言， 〇 #發現聚集機制為經由硫基-二硫化物互換形成分子間°s_s 鍵，則可藉由修飾氫硫基殘基、由酸性溶液;東乾、控a制水 分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來 本發明之治療劑係根據已知方法投與人類患者，諸如快 速靜脈内投與或在一段時間連續輸注、肌肉内、、 腦脊髓内、皮下1節内、滑膜内、鞘内、經口、局部赤 吸入路徑。在VEGF括抗劑之情況下，若廣泛 ： 性與―结抗作用相_，則尤其需要局部投藥。治 149799.doc -145- 201106972 應用亦可使用離體策略。離體策略涉及以編碼Axl及/或 VEGF拮抗劑之聚核苷酸轉染或轉導自個體獲得之細胞。 接著，使轉染或轉導細胞返回至個體。該等細胞可為多種 類型中之任一種，包括（但不限於）造血細胞（例如骨腾細 胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、T細胞或b細 胞）、纖維母細胞、上皮細胞、内皮細胞、角質細胞或肌 細胞。 舉例而言’若Axl及/或VEGF拮抗劑為抗體，則藉由包 括非經腸、皮下、腹膜内、肺内及鼻内之任何適合方式投 與該抗體，且若需要局部免疫抑制治療，則藉由病灶内方 式投與。非經腸輸注包括肌肉内、靜脈内、動脈内、腹膜 内或皮下投藥。此外，抗體宜藉由脈衝輸注來投與，尤其 遞減劑量之抗體。給藥較佳藉由注射進行，最佳靜脈内或 皮下注射，此部分地視投藥為短期或長期而定。 在另一實例中，當病症或腫瘤位置允許時，可局部投與
Axl及/或VEGF结抗劑化合物，例如藉由直接注射局=投 與，且可定期重複注射。Axl及/或VEGF拮抗劑亦可全身 性傳遞至個體或直接傳遞至腫瘤細胞，例如在外科切除腫 瘤之後傳遞至腫瘤或腫瘤床，以防止或減少局部復發或轉 移。 在抑制劑為抗體的情況下，所投抗體較佳為裸抗體。然 而，所投抑制劑可與細胞毒性劑結合。戶斤結合之抑制劑 及/或與其結合之抗原較佳經細胞内化，從而增加免疫结 合物殺死其所結合之標心胞之治療功效。在-較佳實施 149799.doc •146. 201106972 例中，細胞毒性劑乾向或干擾癌細胞中之核酸。該等細胞 毒性劑之實例包括類美登素、加里刹徵素、核糖核酸酶及 DNA核酸内切酶。 本文中所列之任一治療劑之適當劑量為目前使用之劑量 且可由治療醫師適當降低或提高。 治療劑組合通常在限定時間段（通常數分鐘、數小時、 數天或數週，視所選組合而定）投與。組合療法意欲包含 〇 依序投與此等治療劑（亦即，其中在不同時間投與各治療 劑）以及貫質上同時投與此等治療劑或至少兩種治療劑。 治療劑可由相同途徑或不同途徑投與。舉例而言，可藉 2靜脈内注射投與組合中之¥咖及/或Axl拮抗劑，而組 合中之蛋白質激酶抑制劑可經口投與。或者，例如，視特 定：療劑而定，可經口投與兩種治療劑或可藉由靜脈内注 射扠/、兩種/σ療劑。視特定藥劑而定，亦可改變治療劑之 投與次序。 〇 本案涵蓋藉由基因療法來投與VEGF及/或AxW抗劑。 關於使用基因療法產生細胞内抗體，參見例如^㈣年3月 14 曰公開之WO96/07321。 ‘應瞭解，可使用本發明之免疫結合物代替抗體或除抗體 之外亦使用本發明之免疫結合物來執行任何上述治療方 法。 D·製品 在本發明之另—態樣中，提供-種含有適用於治療、預 防及/或δ乡斷上述病症之物質的製品。該製品包含容器及 149799.doc -147- 201106972 位㈣容器上或與該容器相關之標鐵或藥品說明書。適入 之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器^諸2 璃或塑膠之多種材料形成。 谷益可由诸如玻璃或塑膠之多 :材 各器容納單獨組合物或該組合物與有好 t預防及/或診斷病狀之另—種組合物之組合，且可二 2 Ί接取例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之 =靜脈内溶液袋或小瓶)。組合物中至少-種活性劑 為本發明之抗體卷务 合物用於治療所:=、、：。標記或藥品說明書指示組 物Μ一 卜，製品包含⑷其巾含有組合 ♦益’其中該組合物包含本發明之抗體或免疫結 I ，及⑻其中含有組合物之第二容器，丨中該組合物包 3^種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中 的製-可it #包含藥品說明書，該藥品說明書指示組合 物可用於治療特定病狀。或者或另外，製品可進一步包含 3有醫樂學上可接受之缓衝液（諸如注射用之抑菌水 (B㈣)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液⑻_ S〇1Utl〇n)及右旋糖溶液）的第二（或第三）容器。其可進一步 就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他 緩衝劑、稀釋劑、過據器、針及注射器。 ’、 實例 乂下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，鑒於上 文提供之一般說明，可實施各種其他實施例。 A.物質及方法 抗體。抗體獲自以下供應商··針對人類Axl之小鼠單株 149799.doc -148- 201106972 抗體（mAb)(純系 6C8，Abnova, Taiwan) ’填酸化 Akt(Ser 473)小鼠mAb及Akt多株抗體（Cell Signaling)，針對人類 Gas6之小鼠mAb(R&D System)。用於磷酸化Axl之ELISA套 組購自 R&D System。 細胞株及培養物。人類癌瘤細胞株來自ATCC。初級人 類臍靜脈内皮細胞（HUVEC)及肺動脈平滑肌細胞（PASMC) 來自Cambrex(Walkersville，MD)且根據供應商建議培養。 siRNA轉染。Axl及螢光素酶對照物（GL2)之siRNA購自 Dharmacon。基於先前公開之序列（Holland, 2005)之其他 Axl siRNA(Axl2及Axl4)係内部合成。siRNA轉染時，使用 脂染胺（lipofectamine)RNAiMax(Invitrogen)以 50 pmol siRNA轉染3 xlO5個細胞/孔（6孔培養盤）HUVEC，且轉染後 24至96小時藉由FACS定量所阻斷之Axl基因表現。 產生可誘導性Αχ丨shRNA細胞株。shRNA載體（pHUSH-GW)包含shRNA表現穿梭質體及反轉錄病毒載體骨架，該 反轉錄病毒載體骨架含有TetR-IRES-Puro卡匣以使得 shRNA表現能夠被四環素調節。使用脂染胺2000試劑 (Invitrogen)轉染293GP2細胞。轉染後48小時，收集傳染 性上清液，過濾且接著與所靶向之癌症細胞株一起培育24 小時。將對嘌呤黴素處理具有抗性之細胞合併以產生表現 AxlshRNA之穩定細胞株。 共培養。添加HUVEC前一天將PASMC(2.4xl05個細胞/ 孔）接種於塗有膠原蛋白之12孔培養盤中。用50 Pm〇l siRNA轉染早期繼代HUVEC(p<5)，且在轉染後24小時， 149799.doc -149- 201106972 以胰蛋白酶處理細胞且將4χ 104個細胞置放於單層PASMC 上。共培養細胞3天且藉由結合FITC之抗CD31抗體染色來 表徵。在ImageXpressMICR()成像系統下觀察且拍攝血管。 藉由MetaXpress軟體分析總管長度。 微陣列。用Axl或對照物siRNA轉染HUVEC。轉染後72 小時，使用RNeasy Plus小型套組（Qiagen)提取RNA。在 Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0陣列 上、根據製造商方案執行HUVEC之mRNA表現分析。資料 分析及探針設定如本文中所描述。 產生抗Axl單株抗體。Axl細胞外域在CHO細胞中表現且 自CHO細胞純化。使用經純化AxlECD使小鼠免疫。針對 抑制Baf3 - Axl細胞之Gas6依賴性增殖之能力篩檢融合瘤上 清液。所選抗體進行次選殖及純化。 異種移植實驗。所有研究皆根據「實驗動物之護理及使 用準貝ij (Guidance for the Care and Use of Laboratory Animals)」（NIH)進行且由機構性動物護理及使用委員會 (Institutional Animal Care and Used Committee ; IACUC)批 准。本文中描述詳細方案。 正位轉移模型。依序用AxlshRNA及dsRedLuc感染乳癌 細胞株MDA-MB-231以產生可表現Dox可誘導性AxlshRNA 與螢光素酶報導基因的穩定細胞株。將1 〇5個細胞植入 SCID小鼠之乳腺脂肪塊中。植入後次日’將小鼠分為Dox 處理組及未處理組（每組n=5)。當原發性腫瘤尺寸達到 1000 mm3時，移除腫瘤。移除原發性腫瘤後5週’移除肺 149799.doc 150· 201106972 用於生物發光成像。 生物發光成像》將200 μι含25 mg/mL D-螢光素 (Invitrogen，Carlsbad，CA)之PBS腹膜内注入小鼠且在成像 期間使用異氟烷（Henry Schein，Sparks，NV)經由鼻錐麻醉 小既。使用固疋至不透光成像室之冷卻式加強電荷輕合裝 置攝影機（Stanford Photonics, Palo Alto, CA)獲得生物發光 影像。影像獲取時間通常小於5分鐘，且藉由將參考影像 Q 與生物發光資料影像共寄存來處理。離體成像時，獲取 肺，在PBS中沖洗且浸泡於1〇〇 μ丨25 mg/mL D_螢光素納鹽 中。 實例1. Axl頻繁過度表現於癌細胞株中 使用微陣列分析法篩檢一大批代表多種腫瘤類型之癌細 胞株用於Axl mRNA表現。Axl展現自僅可偵測之量至極高 量之廣泛表現’甚至在相同組織類型中（圖1A)。Αχί過度 表現於多種癌細胞株中，其中多形性神經膠母細胞瘤 Q (GBM)及胰臟癌中頻率最高。使用免疫墨點法測定所選癌 細胞株中Axl蛋白含量。Axl高度表現於所有經測試之癌細 胞株中’包括GBM、前列腺癌、胰臟癌、結腸癌、NSCLC 及乳癌（SH-SY5Y(—種已知不表現Axl之神經母細胞瘤細胞 株）用作陰性對照）（圖1B)。此外，配位體Gas6共同表現於 此等癌細胞株中（圖1B)。為測定Axl是否經組成性活化， 藉由ELISA量測磷酸化Axl之含量。所有經測試之癌細胞 株均具有可偵測之磷酸化Axl含量（圖1C)。用外源添加之 Gas6處理細胞可顯著誘導A172、Calul及H1299細胞中之 149799.doc -151 - 201106972 進一步Axl磷酸化，但不能誘導其他細胞株中之進一步Axl 磷酸化。此等結果表明Axl在腫瘤細胞株中在不同程度上 被組成性活化（可能經由内源Gas6之自分泌作用）。 實例2.阻斷癌細胞株中之Axl基因表現可降低細胞存活 率且減弱其遷移 為檢查Axl表現在腫瘤生長、遷移及轉移中之功能性意 義，建立其中Axl表現可藉由多西環素（doxycycline)可誘導 性AxlshRNA阻斷的穩定細胞株。首先測試六種Axl siRNA 序列抑制人類臍靜脈内皮細胞（HUVEC)中Axl表現之能 力。所有六種Axl特異性siRNA皆使Axl蛋白含量降低超過 90%，如轉染後48小時FACS所量測（圖10A及圖10B)，而對 照物siRNA對Axl蛋白質無影響。接著，使用以一種Axl siRNA(Axl-4)為基礎之短髮夾RNA(shRNA)產生可誘導性 阻斷Axl基因表現之穩定細胞株。此等細胞株作為細胞池 產生以防止純系變異。 用Dox處理穩定表現AxlshRNA之癌細胞株72小時使得 Axl蛋白質表現幾乎被完全抑制（圖2A)。阻斷Axl基因表現 伴隨下游信號傳導事件之抑制。儘管Gas6在未經Dox處理 之親本H1299及H1299AxlshRNA細胞中誘導Akt磷酸化， 但Gas6誘導之Akt磷酸化在阻斷Axl基因表現之細胞中完全 中止，與經可溶性受體AxlFc處理之細胞類似（圖2B)。 為測試阻斷Axl基因表現對活體外癌細胞之作用，執行 細胞增殖及遷移分析法。Dox誘導阻斷Axl基因表現可降低 A549(50%)及 MDA-MB-23 1(330/。）之細胞存活率（圖 2C)。儘 149799.doc -152· 201106972 管在Gas6不存在下阻斷HI299細胞中之Axl基因表現不影響 細胞存活率，但其使Gas6介導之培養於低血清中之細胞之 存活率停止增加（圖2C)。阻斷Axl基因表現可顯著減弱 MDA-MB-231(40%)及 A549(48%)細胞（圖 2D)之遷移。此等 結果表明，視細胞情形而定，Gas6-Axl信號傳導在不同程 度上促進癌細胞生長及遷移。 實例3.阻斷Axl基因表現可降低異種移植模型中之腫 瘤生長 為評估活體内癌細胞生長是否需要Axl表現，測試阻斷 Axl基因表現對小鼠中之NSCLC A549及H1299及乳癌MDA-MB-23 1異種移植物之生長的影響。將穩定表現AxlshRNA 之細胞分別皮下植入裸小鼠（A549及H1299)或SCID小鼠 (MDA-MB-231)中。對於A549及H1299模型，植入後將小 鼠隨機分為處理組及對照組且分別投與含多西環素（Dox) 或蔗糖之飲用水。與未處理小鼠相比，Dox誘導之Axl沉默 引起A549腫瘤生長能力之顯著減弱（圖3A)。Dox誘導之阻 斷H1299細胞中之Axl基因表現引起裸小鼠中腫瘤生長之中 度（25%)抑制（圖3B)。對於MDA-MB-231模型，讓異種移植 腫瘤生長至200 mm3之平均尺寸；接著將小鼠隨機分為未 處理組或Dox處理組。阻斷Axl基因表現顯著降低所建立之 MDA-MB-231腫瘤之生長（33%抑制）（圖3C)。在所建立之 A549腫瘤模型中獲得類似結果（資料未圖示）。研究結束 時，藉由西方墨點法分析腫瘤溶解產物來檢驗Axl基因表 現之有效阻斷（圖3)。此等結果表明ΑχΗ言號傳導有助於 149799.doc -153- 201106972 A549、出299及河0八-]^8-231腫瘤異種移植物之活體内生 長。 實例4.阻斷Αχ丨基因表現可抑制MDA-MB-231乳癌細胞 轉移至肺 已證明Axl促進活體外癌細胞之遷移及侵襲性（圖2d，
Zhang等人，2008 ; Tai等人，2008);然而，仍需確定Axl 在癌症轉移中之作用。利用正位模型及藉由生物發光成像 監視腫瘤轉移來解決此問題。產生表現D〇x可誘導性 AxlshRNA與螢光素酶報導基因之穩定mDA_mb_23丨細胞 株。如活體外螢光素酶分析法所測定，此細胞株顯示高生 物發光度（資料未圖示）。 圖4A概述針對此項研究之實驗設計。首先提問Αχΐ表現 對乳癌細胞擴散至遠端器官位點是否有影響。細胞植入後 次曰開始多西環素處理。植人後2週，良好建立原發性腫 瘤。當原發性腫瘤達到1000 mm3之尺寸時將其移除，且移 除原發腫瘤後k視肺轉移5週。移除原發性腫瘤後5週， 在對照組5隻小鼠中的3隻小鼠肺中偵測到大規模轉移性病 灶而、、呈D〇x處理之動物（n=5)中無肺轉移跡象（圖4B，第t 、、且）肺中腫瘤病灶之存在係藉由狀£染& (圖4c)及藉由可 確定性地標記人類腫瘤細胞的c_Met(已知表現於mda_mb_ 231、.、田胞中之蛋白質）IHC(未圖示）確認。此等結果表明'Μ 促進乳癌細胞轉移至肺。接著提問—旦癌細胞定殖於肺中 後轉移ί生生長是否需要Αχ1表現。為解決此問題，讓原 發性腫瘤尺寸達到1〇〇〇 mm3，移除原發性腫瘤接著開始 149799.doc -154- 201106972 用Dox處理。移除原發性腫瘤後監視小鼠5週。經對照物處 理之小鼠與經Dox處理之小鼠均具有轉移性病灶（每組5隻 小鼠中的3隻小鼠）（圖4B，第2組）。此等結果表明一旦癌細 胞自身在肺中建立後，Axl對轉移性病灶生長並非關鍵。 實例5.阻斷HUVEC中之Axl基因表現可減少内皮小管 形成 先前研究已表明，Axl不僅過度表現於腫瘤中，而且過 度表現於周圍血·管細胞中（Hutterer等人）。為進一步評估 Axl在調節血管生成中之潛在作用，測試阻斷Axl基因表現 對内皮小管形成之影響。FACS分析證明Axl表現於HUVEC 表面上（圖5A)。轉染後48小時，在經Axl特異性siRNA轉染 之HUVEC中，Axl蛋白含量下調超過90%，而對照物螢光 素酶siRNA(GL2)無影響（圖5A)。阻斷HUVEC中之Axl基因 表現對細胞生長無顯著影響（圖1 0C)。 接著使用初級HUVEC/PASMC(肺動脈平滑肌細胞）共培 養分支小管形成分析法評估Axl在血管生成中之重要性。 與經對照物siRNA轉染之細胞相比，經Axl siRNA轉染之 HUVEC中依據小管長度定量之管形成減少約40%(圖5B)。 此等結果表明Axl涉及内皮小管形態形成之調節。 實例6. Axl調節血管生成因子Dickkopf同系物3(DKK3) 及促血·管生成素-2(Ang-2)之表現 為瞭解Axl調節血管生成所涉及的機制，對經Axl或對照 物siRNA轉染之HUVEC執行基因分析。圖6A列舉阻斷Axl 基因表現後HUVEC中上調或下調幅度最大的八種基因。 149799.doc -155- 201106972 其中兩種基因Ang-2及DKK3為已知的血管生成調節劑。藉 由對DKK3及Ang-2執行定量RT-PCR來確認微陣列結果。 此外，如ELISA所量測，阻斷Axl基因表現後，HUVEC溶 解產物及培養基中DKK3及Ang-2蛋白質之含量亦變化（圖 11)。 為瞭解Axl與DKK3或Ang-2之間的關係，測試阻斷DKK3 及Ang-2 siRNA基因表現對Axl表現之影響。阻斷DKK3及 Ang-2基因表現均不影響Axl蛋白含量（圖11)。此外，阻斷 DKK3基因表現對Ang-2無影響，阻斷Ang-2基因表現亦不 影響DKK3表現（圖11)。接著測試DKK3及Ang-2 siRNA對 内皮小管形成之作用。藉由RNAi阻斷DKK3基因表現可使 小管形成減少至與阻斷Axl基因表現類似之程度，而單獨 Ang-2 siRNA對小管形成無顯著作用（圖6C)。此等結果表 明DKO及Ang-2為Αχ1之下游標靶且可藉由不同信號傳導 路徑調節其表現。 實例7.阻斷Αχ丨基因表現與抗VEGF具有相加效應 因為VEGF為調節内皮細胞功能之主要因子，所以在j 管形成分析法中測試阻斷Axl基因表現與抗vegf單株抗體 -起之作用。用單獨抗而處理細胞弓丨起劑量依賴性小 管形成減少（未圖示），阻斷Axl基因表現與抗vegf一起可 增強對小管㈣之抑制（圖7)，阻斷咖3基因表現亦具有 類似結果（圖7)。此等結果表明，下調Αχ1表現與抗v咖具 有抑制小管形成的相加效應、。 實例8.產生阻斷Αχ丨功能之單株抗體 149799.doc -156- 201106972 使用RNAi之驗證資料表明Axl涉及腫瘤生長、轉移以及 血管生成之調節。因此著手開發針對Axl之單株抗體。開 發的基於細胞之分析法係直接測試Axl mAb阻斷Axl/Gas6 介導之細胞生長之能力。產生過度表現Axl之Baf3前B細胞 的穩定細胞株（圖12A)。Baf3細胞中Axl之表現引起Gas6依 賴性生長（圖12B)，其可由AxlFc以劑量依賴性方式抑制（圖 12C)。用人類AxlECD使小鼠免疫，且使用此分析法篩檢 一組融合瘤上清液。鑑別四種抗體阻斷Gas6誘導之 Baf3Axl細胞生長（圖12D)。經純化之抗體對Baf3Axl細胞 生長顯示劑量依賴性抑制，最強阻斷劑12A11展現約100 ng/ml之 IC5〇(圖 8A) 〇 為瞭解此等mAb抑制Axl之機制，進一步表徵此等抗 體。在固相ELISA中，Axl mAb 3G9及8B5阻斷配位體與受 體結合，而12A11及4F8對配位體結合無影響（圖8B1)。藉 由使用FACS測定Axl mAb阻斷Gas6與A549細胞之細胞表 面Axl結合之能力來確認此結果（圖8B2)。Axl mAb 12A11、8B5及3G9下調A549細胞中之受體表現，而4F8無 影響（圖8C)。4F8為西方墨點法偵測Axl之唯一抗體，表明 其識別線性抗原決定基（資料未圖示）。此外，12A11及3G9 抑制H1299細胞中經Gas6誘導之Axl磷酸化（圖8C)。 此等單株抗體不與鼠類Axl交叉反應（圖13 A)，其亦不與 相關受體Tyro3及Mer交叉反應（圖13B)。在交叉阻斷分析 法中，Axl mAb彼此不競爭（資料未圖示），表明其結合不 同抗原決定基。為定位mAb之結合抗原決定基，活體外轉 149799.doc -157- 201106972 錄及轉譯Axl ECD之不同部分（圖8D)且接著用作ELISA中 之抗原。3G9及8B5之抗原決定基似乎位於第一 Ig域内，與 其阻斷配位體與受體結合之能力一致，而12A11及4F8之抗 原決定基定位於第一纖維結合蛋白域中（圖8 D)。 實例9. Axl mAb抑制A549 NSCLC異種移植腫瘤生長 為評估mAb抑制Axl是否影響活體内腫瘤細胞生長，將 A549細胞皮下植入裸小鼠中。當腫瘤尺寸達到1 〇〇 mm3時 (圖9A中第0天），將動物隨機分組且用30 mg/kg Axl mAb或 對照抗體處理，每週2次。與對照物相比，Axl mAb顯著減 弱A549腫瘤生長，給藥後第40天抑制約40%(圖9A)。為研 究Axl mAb抑制腫瘤生長之機制，執行藥效學研究。投與 抗體後〇、24、48及72小時後切除腫瘤且產生腫瘤溶解產 物。西方墨點法分析表明，給藥後24小時Axl mAb下調腫 瘤中Axl表現，此下調持續72小時（圖9B)。對腫瘤樣品之 Ki67及卡斯蛋白酶3染色表明，給藥後72小時，Axl mAb 12A11引起Ki67染色減少20%(圖9C)及卡斯蛋白酶3染色增 加約50%(未圖示）。此等結果表明Axl mAb藉由下調受體表 現來減弱A549異種移植物生長，從而又引起腫瘤細胞之細 胞凋亡增強及細胞增殖減少。此等結果與阻斷A549細胞中 之Axl基因表現一致，證明Axl在調節此NSCLC細胞株之腫 瘤生長中起重要作用。 討論 此研究中已研究Axl在腫瘤形成（包括腫瘤生長、轉移以 及血管生成）中之多種作用。已使用可誘導性shRNA抑制 149799.doc -158- 201106972 人類癌細胞株中之Axl表現且證明Axl表現促進NSCLC及乳 癌模型中之腫瘤生長。分別使用Axl顯性負性突變體或 shRNA之先前研究表明，Axl表現促進神經膠母細胞瘤 (Vajkoczy等人，2006)及乳癌（Holland等人，2005)異種移 植模型中之腫瘤生長。然而，此等研究均在對照細胞株與 ' 其中在植入小鼠前Axl或其信號傳導經下調之細胞株之間 進行腫瘤生長速率比較。儘管此方法適用，但其無法評估 Axl抑制對腫瘤生長之直接影響。本發明方法係利用 〇
AxlshRNA之可誘導表現且在Axl表現存在或不存在下量測 相同細胞株之生長。本發明結果表明Axl表現對腫瘤生長 之影響視所用細胞模型而定。儘管阻斷A549 NSCLC中之 Axl基因表現幾乎完全抑制腫瘤生長，但阻斷Axl基因表現 對H1299 NSCLC及MDA-MB-231之影響為中度的（約30%生 長抑制）。A549細胞對阻斷Axl基因表現之敏感度較高可能 歸因於此等細胞中存在增加之Axl基因複本數目（未公開結 〇 果）。 轉移在所有癌症死亡中佔約90% ;且在涉及癌形成的所 有過程中，局部侵襲及轉移形成在臨床上最相關。最新實 ' 驗進展已鑑別多種分子路徑及細胞機制可解釋轉移之多階 ·. 段過程。此等階段包括腫瘤侵襲、腫瘤細胞經由血液或淋 巴系統擴散、定殖於遠端器官中及轉移之過度生長 (Christofori，2006)。Axl表現與多種癌症中之侵襲及轉移 相關，包括乳癌（Meris等人，2002 ; Zhang等人，2008)、 肺癌（Shieh等人，2005)及胃癌（Sainaghi等人，2005)以及 149799.doc -159- 201106972 神經膠母細胞瘤（Hutterer等人，2008)。已活體外證明Αχ1 涉及促進癌細胞遷移及侵襲（Zhang等人，2008 ; Tai等人， 2008 ; Vajkoczy等人，2006)。在乳癌模型中，Αχ1之異位 表現足以向弱侵襲性MCF7細胞賦予高侵襲性表型。相 反’藉由阻斷shRNA基因表現或抗Axl抗體抑制Αχί信號傳 導可減少高侵襲性乳癌細胞之遷移及侵襲^儘管此等研究 確定活體外Axl促進細胞遷移及侵襲之作用，但尚未說明 Axl表現是否引起轉移。此研究中已使用正位乳癌模型研 究Axl在轉移中之功能性意義。本發明結果表明mdA-MB-23 1細胞需要Axl表現以在肺中建立轉移性病灶，因為 shRNA阻斷Axl基因表現可完全中止來自原發性腫瘤之細 胞定殖於肺中之能力。然而，一旦轉移性病灶建立於肺 中，Axl似乎對轉移之過度生長不具有顯著影響。此結果 表明Axl與MDA-MB-23 1癌細胞轉移之早期有關，且提供 Axl與轉移直接有關的第一活體内證據。
Gas6/Axl信號傳導因調節血管平滑肌細胞及内皮細胞之 存活及遷移而在血管生物學中起重要作用（Melaragn〇等 人，1999)。Gas6/Axl在損傷動脈中之表現受到上調且 Gas6經由PI3K/Akt之活化誘導A類清除性受體，引起泡沫 細胞形成，此為動脈粥樣硬化之重要步驟（Ca〇等人， 2001)。活化Axl信號傳導可介導内皮細胞之層流剪切應力 之抗細胞凋亡效應’可能經由其與ανβ3整合素複合物之結 合介導此效應（D’Arcangelo等人，2006)。Αχι與Gas6共同 表現於神經膠質瘤中與腫瘤相關之血管細胞中（Hutterer等 149799.doc -160- 201106972 人，2008)。在原生人類乳癌樣品中，發現腫瘤受質細胞 中之強Axl染色（未公開觀測結果）。因此，Axl不僅可在腫 瘤細胞中影響腫瘤形成，而且調節腫瘤受質功能，諸如血· 管生成。此研究中，執行實驗以瞭解涉及Axl調節内皮細 胞功能之機制。本發明資料表明内皮細胞增殖不需要Axl ' 表現，因為RNAi阻斷Axl基因表現對此等細胞之生長具有 極小影響。然而，抑制Axl表現可減少内皮小管形成。 _ 為瞭解有關機制，分析mRNA表現以鑑別可受Axl表現調 ❹ 節之基因。阻斷Axl基因表現引起DKK3之下調及Ang-2之 上調，DKK3及Ang-2已知為涉及血管生成的兩種因子。 DKK3為Wnt信號傳導之Dickkopf分泌性調節劑家族的一員 (Krupnik等人，1999)，且強表現於小鼠及雞之正發育心臟 及血管中（Monaghan等人，1999)。最新研究證明DKK3蛋 白質表現於高度血管化贅瘤之血管中，包括GBM、高級非 霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤及結腸直腸癌（Monaghan等 Q 人，1999)。B16F10細胞中鼠類DKK3之穩定過度表現可顯 著增加C57/BL6黑色素瘤模型中之微血管密度。此外，對 初級内皮群落形成細胞之活體外研究表明，siRNA阻斷 - DKK3基因表現並不顯著影響細胞增殖，而是減少基質膠 -. (matrigel)中之小管形成（Untergasser等人，2008)。此等結 果與阻斷Axl或DKK3基因表現後在HUVEC中之發現類 似。阻斷HUVEC中之Axl基因表現引起Ang-2之上調。促 血管生成素信號傳導系統在調節血管生成、血管恆定及血 管退化中起重要作用（Yancopoulos等人，2000)。此信號傳 149799.doc -161 - 201106972 導系統係由促血管生成素1及促血管生成素2及其受體Tie2 組成（Dumonut等人，1994)。Ang-1為經由pi3K/Akt信號傳 導路徑（Peters等人，2004)促進EC存活及内皮完整（§111^等 人，1998)之促效劑。另一方面，Ang_2(Mais〇npierre等 人，1997)為抑制Ang-Ι之作用以促進血管失去穩定的信號 傳導拮抗劑。在VEGF存在下，Ang-2提供重要的血管生成 刺激物（Yancopoulos等人，2000)。然而，當vEgf信號傳 導丈抑制或缺乏時，Ang-2對血管之促失穩作用引起細胞 死亡及毛細血管退化（Yanc〇p〇ul〇s等人，2〇〇〇)。本發明結 果證明，阻斷Axl基因表現與抗VGEF具有抑制内皮小管形 成的相加效應。當Axl表現受抑制時，可經由Ang_2之上調 來介導此相加效應。總而言之，本發明結果提出藉由Αχΐ 調節内皮細胞功能的以下模型。Ec中Αχ1之表現引起促血 管生成因子DKK3之上調及Ang_2之下調，從而又促進八叫_ 1/Tie2之信號傳導且引起血管生成增加。
Axl在腫瘤形成中所起的多種作用使得其成為受關注之 癌症治療標靶。抗Axl抗體為可用於研究Αχ1在腫瘤形成中 之作用的特定試劑且提供抑制患者中Αχ1依賴性信號傳導 之治療可能。拮抗性mAb可由多種機制實現其功能：（1)阻 斷配位體與受體結合，（2)促進受體降解，阻斷受體二 聚，或（4)介導ADCC。因為許多腫瘤可展現配位體非依賴 性活化Axl，所以重要的是開發且比較經由不同作用模式 起作用之mAb且基於功效選擇主導mAb。此研究中已表徵 一組針對Axl之融合瘤抗體。已針對阻斷Αχ1生物功能之單 149799.doc •162- 201106972 株抗體開發出基於細胞之篩檢。本文中所表徵之mAb包括 兩種阻斷配位體與受體結合之mAb(3G9及8B5)，以及一種 不干擾配位體結合但抑制受體磷酸化之mAb(12All)。所 有3種mAb皆誘導受體表現之下調。最重要的是，此等 mAb減弱A549 NSCLC腫瘤生長。此等結果不僅證實Axl在 促進腫瘤生長中之作用（如shRNA研究所表明），而且表明 單株抗體可提供治療過度表現Axl之癌症的有效策略。因 為此等mAb不與鼠類Axl交叉反應，所以無法評估Axl對於 活體内腫瘤血管生成之重要性及其對腫瘤基質之影響。目 前已開發出交叉反應性mAb以研究活體内Axl之此等潛在 功能。 總而言之，本發明已驗證Axl在促進腫瘤生長中之作用 且提供乳癌細胞轉移至肺需要Axl表現之第一證據。本發 明已證明Axl經由促血管生成素及DKK3信號傳導系統起作 用來增強内皮小管形成。本發明資料表明針對Axl之治療 性抗體不僅可在腫瘤本身中、而且可在周圍基質中阻斷 Axl功能。Axl抑制與抗VEGF之相加效應表明阻斷Axl功能 可增強抗血管生成療法。 實例10 物質及方法 抗體及細胞株。抗體獲自以下供應商：針對人類Axl之 小鼠單株抗體（mAb)(Abnova, Taiwan)，填酸化Akt小鼠 mAb及Akt多株抗體（Cell Signaling)。用於石粦酸化Axl之小 鼠重組Gas6及ELISA套組購自R&D System。人類癌瘤細胞 149799.doc -163 - 201106972 株獲自ATCC且在補充有10% FBS之PRMI1640培養基中培 養。融合瘤抗人類Axl單株抗體12All&3GW^、*Genentech 提供（參見Li(2009))。 產生噬菌體抗Αχ丨單株抗體。為產生抗體，淘選使用人 類噬菌體抗體文庫，其在所選互補決定區（HI、Η2、Η3) 中具有模擬人類IgG譜系之天然多樣性的合成多樣性。Fab 片段二價呈現於Ml 3噬菌體顆粒表面上。針對人類及鼠類 Axl ECD多輪淘選噬菌體抗體文庫。與人類Axl ECD-His及 鼠類Axl ECD-Fc融合蛋白結合之噬菌體抗體係藉由ELISA 及DNA定序鑑別，且重組抗體純系以表現全長IgG(Liang 等人，2007)。個別純系短暫表現於哺乳動物細胞中且以 蛋白A管柱純化（Carter，1992)。 篩檢嗔菌體純系抑制Baf3-Axl細胞之Gas6依賴性增殖之 能力。選擇在抑制Baf3 Axl細胞增殖中展現最高效能的兩 個純系用於親和力成熟。 對於親和力成熟，在Ml 3噬菌體表面上呈現單價Fab之 嗜菌質體（Liang等人，2007)充當用於接枝噬菌體Ab之輕 鏈（VL)可變域及重鏈（VH)可變域之文庫模板。親和力成熟 係採用軟隨機化策略，如（Liang等人，2007)所述，且使用 高產量單點競爭性噬菌體ELISA快速篩檢高親和力純系， 如（Sidhu等人，2004)所述。 量測抗Axl抗體之親和力。測定抗Axl抗體之結合親和力 時，使用由BIAcore™-3000儀器量測表面電漿子共振 (SRP)。為量測抗Axl抗體與人類Axl ECD-His蛋白之間的 149799.doc -164- 201106972 親和力，藉由可達成約250個反應單位（RU)之塗有小鼠抗 人類IgG的CM5生物感測晶片捕捉抗Axl人類IgG。動力學 量測時，在25°C下以30 μΐ/min之流速注射人類Axl ECD-
His於PBT緩衝液（含有0.05% Tween 20之PBS)中之兩倍連 續稀釋液（440 nM-28 nM)。使用簡單的一對一朗繆爾結合 ' 模型（BIAcore評估軟體3.2版）計算結合速率及解離速 率（k〇ff)。平衡解離常數（尤D)依據hff/tn比率計算。為量測 a 抗Axl抗體對鼠類Axl ECD-Fc融合蛋白之親和力，藉由可 〇 達成約150個反應單位（RU)之塗有小鼠抗人類IgG的CM5生 物感測晶片捕捉鼠類Axl ECD人類IgG融合蛋白。動力學量 測時，在25°C下以30 ml/min之流速注射抗Axl Fab片段於 PBST緩衝液（含有0.05% Tween 20之PBS)中之兩倍連續稀 釋液（200 nM-12 nM)。 細胞增殖分析法。細胞以5000個細胞/孔接種於96孔培 養盤中且用多種濃度之Axl mAb處理72小時。使用 Q CellTiter-Glo發光細胞存活率分析法（Promega)、根據製造 商說明書量測細胞增殖。 ELISA及螢光活化細胞分選（FACS)» ELISA分析法執行 •如下：用 0.5% BSA、PBS、0.05% Tween 20(PBST)阻斷塗 . 有山羊抗人類IgG Fc之培養盤。對於交叉反應分析法，在 室溫下將所塗培養盤與人類Axl.Fc、小鼠Axl.Fc或人類 Mer.Fc、Tyro-3 .Fc —起培育1小時，在PBST中洗蘇4次， 與抗Axl mAb及結合HRP之抗小鼠Ig—起培育。對於結合 分析法，在室溫下將所塗培養盤與人類Axl.Fc—起培育1 149799.doc -165 - 201106972 小時，在PBST中洗滌4次，在室溫下與rmGas 6及抗Axl mAb—起培育1小時。培養盤在PBST中洗滌4次，與結合生 物素之抗mGas6及抗生物蛋白鏈菌素-HRP—起培育。根據 製造商說明書、使用R&D ELISA套組量測所分泌之Ang-2 及DKK3。使用標準技術藉由FACS測定細胞表面上之Axl 表現。簡言之，收集細胞，在冰上用抗Axl mAb( 12 All ’ 10 ug/ml)染色30分鐘，在PBS中洗滌2次且接著用結合PE 之第二抗體染色。為測定抗體對Gas6與細胞表面上之Axl 結合的阻斷作用，收集細胞，用抗Axl mAb染色30分鐘且 在冰上與rmGas6 —起培育3 0分鐘。在PB S中洗蘇2次且用 結合生物素之抗Gas6及結合PE之抗生物蛋白鏈菌素染色。 樣品在BDFACScalibur流式細胞儀上分析。 異種移植實驗。所有研究皆根據「實驗動物之護理及使 用準則」（NIH)進行且由機構性動物護理及使用委員會 (IACUC)批准。將基質膠中總共5χ106(Α549)或107個細胞 (MDA-MB-231)分別皮下植入裸小鼠（A549)或SCID小鼠 (MDA-MB-231)之右侧腹中。當平均腫瘤尺寸達到100mm3 時，將小鼠隨機分為不同處理組（每組n= 10)。經由腹膜内 注射（IP)以10-3 0 mg/kg投與抗Axl或對照IgGl抗體，以1-2 mg/kg投與抗VEGF，每週2次。每天經口管飼100 mg/kg埃 羅替尼。處理開始時，分別地，每天皮下投與6.25 mg/kg 太平洋紫杉醇歷時5天，及皮下投與100 mg/kg單一劑量之 卡鉑。使用雙因子變異數分析（Anova two-way)執行統計分 析以比較不同處理組之腫瘤生長。 149799.doc -166 - 201106972 對於藥效學（PD)研究，用抗體處理小鼠0、24、72及168 小時。在各時間點切除腫瘤，處理以用於免疫組織化學染 色及影像分析，且用於產生細胞溶解產物以用於西方墨點 分析。 對於轉移研究，經由尾靜脈注射將經螢光素酶報導基因 穩定轉染之5xl05個MDA-MB-231(Li等人，2009)植入SCID 小鼠中。藉由生物發光偵測法監視腫瘤細胞向各器官之轉 移，如（Li等人，2009)所述。 免疫組織化學。將異種移植腫瘤樣品固定於10%中性緩 衝福馬林（formalin)中，處理，包埋於石蝶中且以4 μηι切 片。薄切片接著用針對Ki67、分裂卡斯蛋白酶3及MECA32 之一次抗體處理，接著用結合生物素之二次抗體及DAB色 素原處理。 自Cureline Inc.獲得原發性人類乳癌組織微陣列，包括 乳腺管及轉移性腺癌。使用先前描述之抗Axl單株抗體（Li 等人，2009)執行Axl IHC，且使用CD68染色巨噬細胞。對 於雙重 Axl/CD68 IHC，首先使用 Vector ABC Elite HRP試 劑及DAB受質以2 pg/ml執行Axl染色。亦使用ABC Elite-HRP試劑、但改用Vector SG色素原（藍色/灰色）以0.5 pg/ml 依序執行CD68染色。在兩種複合物之間執行第二標靶抗 原修復步驟以溶離第一複合物，從而避免兩種標記物之交 叉反應性。 血管密度量測及資料分析。腫瘤樣品用MECA32(—種泛 内皮細胞標記物）染色。藉由Ariol SL-50自動化載片掃描 149799.doc -167- 201106972 平台（Genetix Ltd.; Hampshire, UK)獲得100倍最終放大率 影像。腫瘤特定區域作為個別8位元影像輸出以供 Metamorph 套裝軟體（MDS Analytical Technologies, Ontario, Canada)分析。使用藍色正規化演算法、經由蘇木 精對比染色分離棕色DAB特異性染色，如（Brey等人， 2003)所述。分段演算法鑑別血管且基於尺寸及形狀移除 雜訊。細胞係基於蘇木精染色之尺寸、形狀及密度鑑別為 腫瘤或非腫瘤。非腫瘤區域係依據非腫瘤細胞密度與腫瘤 細胞密度之對比加以鑑別。完成分析後，人工再檢視影像 以移除錯誤鑑別為血管或腫瘤區域之假影。記錄個別血管 以及各影像中腫瘤及非腫瘤區域的面積量測。使用JMP 8.0 軟體（SAS Institute,Inc·, North Carolina, USA)分析基於 影像分析之原始數值。執行學生t檢驗以比較各對平均 值，其中ρ<〇·〇5。 分離腫瘤相關巨噬細胞（ΤΑΜ)及偵測所分泌之細胞激 素。切開腫瘤，斬為小塊及在含2.5% FBS、0.2單位/毫升 Liberase Blendzymes II及 5 單位/毫升 DNasel之 RPMI1640培 養基（Roche)中培育。使用MACS解離器（Miltenyi Biotec)解 離腫瘤細胞且在室溫下保持20分鐘。添加EDTA(最終濃度 0.002%)以終止反應。製備單細胞懸浮液且使用RBC溶解 緩衝液（eBioscience)移除紅血球。以107個細胞/毫升將細 胞再懸浮於含有1% FBS之PBS中且與20 pg/ml FcRII、 FcRIII及FcRIV —起培育20分鐘。添加抗F4/80-PE (eBioscience)及抗 CDllc-APC(BD Pharmingen)(0.2 pg/106 149799.doc -168- 201106972 個細胞）且在冰上培育30分鐘。藉由FACSAria(BD Biosciences)分選F4/80及CDllc陽性細胞。將總共2χ105個 F4/80及CD 11c陽性細胞接種於96孔培養盤中且培養隔夜。 收集培養基且使用Bio-Plex小鼠細胞激素分析法（Bio-Rad) 、 根據製 造商說 明書測 定細胞 激素及 趨化因 子之含 量。 抗原決定基定位 藉由標準分子生物學技術製備入\1-2(?11反111^\1(1-134Aa)/HuIgGlFc)、Axl-3(PRK HuAxl(l-221Aa)/HuIgGlFc)、 Axl-4(PRK HuAxl(l-324Aa)/HuIgGlFc)及 Axl-5(PRK HuAxl (l-435Aa)/HuIgGlFc)質體構築體。藉由直接定序及/或限 制消化確認所有質體。使用Promega L2080 TNT SP6快速 轉錄/轉譯系統套組活體外轉錄及轉譯編碼Axl細胞外域之 多個部分（aal-134、aal-221、aal-324、aal-435)的質體且 用作ELISA中之抗原。用於此等實驗之Axl部分包括： 人類Axl(包含Axl之Igl)之胺基酸1-134 : MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPF VGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILE LADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRITSLQLSDTGQYQC LVFLGHQTFVSQPGYVG (SEQ ID NO:18)，及 人類Axl(包含Axl纖維結合蛋白域）之胺基酸221-324 : ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTL QAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHP HTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWL (SEQ ID NO:19)。 149799.doc -169- 201106972 抗體競爭實驗 為測定噬菌體抗Axl mAb YW3 27.6或YW3 27.42是否與融 合瘤抗Axl mAb 12A11及3G9競爭，A549細胞用抗Axl嗤菌 體抗體（各為50 ug/ml)及融合瘤抗Axl抗體（各為10 ug/ml) 共染色30分鐘。細胞在PBS中洗滌2次且用抗小鼠Ig-PE染 色。如上針對FACS分析所述，樣品在BDFACScalibur流式 細胞儀（BD Biosciences)上分析。 結果 產生阻斷Αχ丨功能之噬菌體源單株抗體。為鑑別與鼠類
Axl及人類Axl交叉反應之抗體，使用在所選互補決定區中 具有模擬人類IgG之天然多樣性之合成多樣性的噬菌體呈 現抗體文庫（Lee等人，2004)。藉由ELISA及DNA定序鑑別 與人類Axl ECD及鼠類Axl ECD均結合之噬菌體抗體，且 重組抗體純系以表現全長IgG(Liang等人，2007)。接著針 對抑制Baf3Axl細胞之Gas6依賴性生長之能力篩檢一組全 長IgG(Li等人，2009)，對純系YW327.6之一進行親和力成 熟及純化。 親和力成熟之Axl mAb YW327.6S2以高親和力結合人類 Axl與鼠類Axl，Kd分別為約1 nM及545 pM(圖14A)。特定 而言，Ka 為 1.7xl05，kd 為 1_7><104 且 KD 為 9.9><10_10。此抗 體亦結合獼猴Axl，但其不與相關受體Tyro3及Mer交叉反 應（圖14B)。如無細胞ELISA與細胞表面FACS所證明， YW327.6S2以劑量依賴性方式阻斷配位體Gas6與Axl結合 (圖 14C)。 149799.doc -170- 201106972 親和力成熟之Axl MAb YW327.6S11、YW327.42S8 及 YW327.42S31 亦已表徵。YW327.6S11、YW327.42S8 及 YW327.42S3 1以南親和力結合人類Axl與鼠類Axl。舉例而 言，對抗體結合人類Axl之biacore分析產生以下結果：
Hu Axl
Ka kd KD YW327.6S11 1.7χ105 1.7x104 1.3x10! YW327.42S8 5.2χ104 1.3χ104 2.5x10! YW327.42S31 6.3 χΙΟ4 1.5χ104 2.4x10'
此等抗體不與Tyro3及Mer交叉反應。YW327.6S2(及親本 抗體YW 327.6)阻斷配位體Gas6與Axl結合，而 YW327.42S8 及 YW327.42S31(及親本 Mab YW327.42)不阻 斷配位體Gas6與Axl結合。
YW327.6S2包含含有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFSLSGSWIHWVRQAPGKGLEWVGWINPYRGYAYYAD SVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYSG WGGSSVGYAMDYWGQGTLV(SEQ ID ΝΟ:1)的重鍵可變 區，及含有序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR (SEQIDN0:2)的輕鏈可變區。
Axl抗原決定基分析 使用ELISA分析結合人類Axl細胞外域之多個部分的Axl 抗體。獲得結果。 149799.doc -171 - 201106972 YW327.6 YW327.42
Axl2 (aal-134) + -
Axl-3 (aal-221) + -
Axl-4 (aal-324) + + YW3 27.6結合包含人類Axl之胺基酸1-134的Axl-Fc融合 物。相反，YW327.42結合包含人類Axl之胺基酸1-324之 Axl-Fc融合物，但不結合包含胺基酸1-134及1-221之Axl Fc融合物。因此得出結論：YW327.6結合由人類Axl之胺 基酸1-134組成之多肽且YW327.42結合需要人類Axl胺基酸 222-234。胺基酸1-134含有Axl Igl域且胺基酸222-234含有 Axl纖維結合蛋白域。 抗Axl融合瘤抗體之競爭實驗 測定抗體YW3 26.6及YW3 27.42是否可與抗Axl融合瘤抗 體12A11及3G9(Li, (2009))競爭結合人類Axl。在對人類 Axl之抗體競爭結合實驗中，抗體YW327.6不與融合瘤抗 體12A11或3G9中任一者競爭結合人類Axl，證明此等抗體 不識別相同抗原決定基。抗體YW327.42與融合瘤抗體 12A11競爭結合人類Axl，但不與融合瘤抗體3G9競爭結合 人類Axl。 YW327.6S2下調Axl表現，抑制其活化、信號傳導及 Gas6依賴性Baf3Ax丨細胞增殖 為測試YW327.6S2是否影響Axl生物功能，首先評估其 對Axl表現及信號傳導之影響。用YW327.6S2處理NSCLC 細胞株A549引起細胞表面上Axl表現之快速下調（圖14D， 149799.doc -172- 201106972
上圖）且此下調持續24小時（圖14D，下圖）。用Gas6處理 H1299 NSCLC細胞可誘導Axl磷酸化，當細胞用 YW327.6S2預培育時，Axl磷酸化受抑制（圖14E，上圖）。 因此，用YW327.6S2預培育H1299細胞可阻斷Gas6誘導之 下游信號傳導分子Akt磷酸化（圖14E，下圖）。藉由 YW3 27.6S2下調Axl表現且使其信號傳導失活可有效抑制 Baf3Axl細胞之Gas6依賴性生長，其中IC50為340 ng/ml(圖 14F)。 YW327.6S2降低A549異種移植物生長且增強抗VEGF之 作用。在前述研究中，已顯示藉由RNAi抑制Axl或用抗人 類Axl融合瘤單株抗體處理可顯著減弱A549 NSCLC腫瘤生 長（Li等人，2009)。因此首先測試YW327.6S2對此模型中 之Μ瘤生長之影響。10 mg/kg單獨YW327_6S2，每週兩次 給藥方案顯著降低A549腫瘤生長（圖15A)，且此抑制效果 與抗人類Axl融合瘤抗體相當（圖15C)。
Axl表現於内皮細胞上且增強VEGF誘導之内皮小管形成 (Li等人，2009 ; Holland等人，2005);已測試抗 Axl mAb 是否可增強抗VEGF之抗腫瘤生長性質（Liang等人， 2006)。單獨抗VEGF抗體及單獨YW327.6S2對A549腫瘤生 長具有類似作用（圖15 A)。與任一種單獨抗體相比，兩種 抗體之組合可增強對腫瘤生長之抑制，其中單一藥劑抑制 3 0%，相比之下，組合處理抑制60%(圖15 A)。 此研究中之動物每週給藥2次歷時60天且隨後在第85天 檢查踵瘤生長之延緩（當腫瘤尺寸超過800 mm3時將動物自 149799.doc •173- 201106972 研究移除；無動物因中毒而移除）。單一藥劑相比， 丫\¥3 27.682與抗乂£0卩組合可顯著延緩腫瘤生長（圖15八）。 自最後一次給藥至實驗結束（第85天）所耗時間期間，組合 處理組中不存在腫瘤再生長，此組中之所有動物在實驗結 束時存活，如卡普蘭-麥爾（Kaplan-Meier)曲線所示（圖 15B)。 抗人類Axl融合瘤單株抗體12A11 (其不與鼠類Axl交叉反 應）顯著減弱A549異種移植腫瘤生長（Li等人，2009)，其亦 增強抗VEGF之作用，如圖15C所示。此為所期望的，因為 12A11直接抑制腫瘤細胞生長且抗VEGF影響腫瘤血管結 構。 YW327.6S2下調受體表現且誘導A549腫瘤細胞之細胞凋 亡。為開始瞭解介導YW327.6S2對減少腫瘤生長之作用的 機制，執行藥效學研究。用YW327.6S2處理含有A549腫瘤 之小鼠且在給藥後0、24、72及168小時切除腫瘤。西方墨 點法分析腫瘤溶解產物顯示，投與抗體後24小時，Axl表 現下調且持續168小時（圖15D)，表明YW327.6S2之抗腫瘤 生長效應部分地由Axl表現之下調介導。 為確定YW327.6S2是否對腫瘤細胞增殖及細胞凋亡具有 直接影響，切除經對照物或YW327.6S2處理兩週之A549異 種移植腫瘤且執行分裂卡斯蛋白酶3(CC3)及Ki67 IHC。與 經對照物處理之腫瘤相比，經YW327.6S2處理之腫瘤展現 增加之CC3(圖15E)，表明YW327.6S2誘導腫瘤細胞之細胞 凋亡。經對照物處理之腫瘤與經YW327.6S2處理之腫瘤之 149799.doc 174· 201106972 間不存在Ki67陽性細胞核之顯著差異，表明YW327.6S2不 直接影響腫瘤細胞增殖。 為研究YW327.6S2是否影響腫瘤相關血管結構，用單獨 YW327.6S2或用YW327.6S2與抗VEGF之組合處理含有 A549腫瘤之小鼠。切除腫瘤且用MECA32(—種泛内皮標 記物）染色以檢查瘤内血管密度。與對照物相比，單獨 YW327.6S2不顯著降低血管密度，但YW327.6S2與抗 VEGF之組合引起腫瘤相關血管密度之顯著降低（圖15F) 〇 相反，單獨12A11或其與抗VEGF之組合不顯著影響瘤内血 管密度。 YW327.6S2增強埃羅替尼及化學療法之作用。為測試 YW327.6S2是否可增加NSCLC之標準護理之治療指數，執 行YW327.6S2與EGFR小分子抑制劑（SMI)埃羅替尼及化學 療法之組合處理。 A549含有野生型EGFR且對埃羅替尼僅中度敏感（Yauch 等人，2005);因此研究抗Axl mAb是否可使此等細胞對 EGFR SMI敏感。YW327.6S2及埃羅替尼當作為單一藥劑 投與時引起腫瘤生長降低30%，但組合投與時降低腫瘤生 長速率超過50%(圖16A)，表明抗Axl mAb增強埃羅替尼之 抗腫瘤生長作用。 接著研究抗Axl mAb是否能夠增加NSCLC之標準化學療 法之治療指數。含有A549異種移植物之小鼠用一輪化學療 法處理，此輪化學療法係由在處理開始時（第0天，圖16B) 投與太平洋紫杉醇（6.25毫克/公斤/天，5天）及卡鉑（100 149799.doc -175- 201106972 mg/kg，單一劑量）組成。單獨化學療法與單獨投與 YW327.6S2對腫瘤生長具有類似作用，且兩者之組合可增 強對腫瘤生長之抑制（圖16B)。 在MDA-MB-231乳癌異種移植模型中，YW327.6S2降低 血管密度且抑制腫瘤相關巨噬細胞分泌發炎性細胞激素。 因為shRNA阻斷Axl基因表現對MDA-MB-231異種移植腫 瘤生長僅具有中度作用（Li等人，2009)，所以提問 YW327.6S2在此模型中是否有效。在此模型中，單獨 YW327.6S2能夠降低腫瘤生長（25°/。）且與用作單一藥劑之 抗VEGF具有類似效果（圖17A)。組合療法引起腫瘤生長降 低5 0%，表明YW3 27.6S2增強抗VEGF之作用（圖17A)。相 反，在此模型中，不與鼠類Axl交叉反應之抗Axl融合瘤抗 體12All(Li等人，2009)作為單一藥劑對腫瘤生長不具有 顯著作用，抗VEGF亦無影響（圖1 7B)。西方墨點分析顯示 YW327.6S2與12A11者均下調腫瘤中之Axl表現（圖17C及圖 17D)。此等結果表明YW327.6S2之抗腫瘤生長效應可藉由 調節腫瘤基質功能來介導。 為進一步研究YW327.6S2會如何調節腫瘤基質功能，用 單獨YW3 27.6S2或其與抗VEGF之組合處理含有MDA-MB-23 1之小鼠。在投與抗體後之多個時間點，切除腫瘤且用 MECA32染色以檢查瘤内血管密度。與對照物相比， YW327.0S2與抗VEGF均顯著降低血管密度（圖17E)。且兩 種抗體之組合進一步降低腫瘤相關灰管密度。此等結果表 明YW3 27.6S2藉由改變血管功能來部分地降低MDA-MB- 149799.doc -176- 201106972 23 1腫瘤生長。 在原發性人類乳癌樣品中，發現Axl蛋白質強表現於浸 潤巨噬細胞中（圖17F)且因此提問Axl mAb YW327.6S2是否 會影響腫瘤相關巨噬細胞（ΤΑΜ)功能。用YW327.6S2、 12Α11或對照抗體處理MDA-MB-231異種移植腫瘤1週，且 藉由分選F4/80陽性細胞來分離ΤΑΜ。細胞在不含血清之 培養基中培養隔夜，且收集上清液並針對各種細胞激素及 趨化因子之存在進行分析法。與經對照抗體處理之ΤΑΜ相 比，來自經YW327.6S2及12Α11處理之腫瘤的ΤΑΜ產生的 發炎性細胞激素及趨化因子量低得多（圖17G)。與此等抗 體下調腫瘤細胞上之Axl表現（圖17C及圖17D)相反，用任 一種Axl-mAb處理均不影響ΤΑΜ上之Axl表現量（資料未圖 示）。此等結果表明Axl mAb很可能以間接方式（可能藉由 阻斷腫瘤與基質細胞之間的聯絡）調節ΤΑΜ分泌發炎性細 胞激素/趨化因子。 YW327.6S2降低MDA-MB-231乳癌細胞轉移至骨骼。前 述研究中已顯示，shRNA阻斷Axl基因表現可抑制正位模 型中MDA-MB-23 1乳癌細胞轉移至肺（Li等人，2009)，因 此測試YW327.6S2是否影響此等細胞之轉移。經由尾靜脈 將穩定表現螢光素酶報導基因之MDA-MB-23 1細胞注入 SCID小鼠中。注射後四週，在對照抗體處理組中的所有5 隻動物之顱面區域、脛骨及股骨偵測到強螢光信號。在對 照組中，利用生物發光所偵測之位點在各動物中為5、5、 4、3及1個，總共18個（圖18A)。在經YW327.6S2處理之小 149799.doc -177- 201106972 鼠中’利用生物發光所偵測之位點顯著減少，各動物中為 0、1、2、3及1個位點且整個組為總共7個（圖1 8A)。藉由 組織分析檢驗骨骼中轉移性病灶之存在（圖1 8B)。此等結 果表明YW327.6S2能夠降低MDA-MB-231乳癌細胞轉移至 遠端器官。 討論 已開發且表徵展現交叉物種反應性且阻斷Αχί在腫瘤形 成中之多種功能的人類抗Axl單株抗體（YW327.6S2)。除作 為第一個所報導之針對Axl之完全人類化阻斷抗體外， YW3 27 ·6 S2不僅充當分析Axl活化/信號傳導在癌症發展及 進程之多方面中之影響的有力工具，而且代表治療多種癌 症之可能治療劑。 本發明結果表明YW327.6S2藉由下調Axl表現及抑制配 位體Gas6與受體結合從而引起Αχί及其下游信號傳導之失 活來阻斷Axl功能（圖14)。因為許多癌症表現組成性活化
Axl且不再對外源Gas6有反應，所以¥貿327 682下調癌細 胞中之Axl表現的能力代表其抑制作用之重要機制（Li等 人，2009)。 在A549 NSCLC模型中，YW327.6S2當作為單一藥劑投 與時顯著減弱腫瘤生長（圖15A)。此抑制效果與抗Αχ1融合 瘤抗體在此模型中之抑制效果相當（Li等人（2〇〇9)，圖 i5C)。YW327.6S2快速下調異種移植物中之Αχΐ表現（圖 1 5D)，且誘導腫瘤細胞之細胞凋亡（圖丨5E)，此可能為介 導其腫瘤生長抑制作用的機制之一。Αχ1藉由調節〇〇：3及 149799.doc -178- 201106972 促血管生成素/Tie2路徑調節内皮細胞功能的先前發現（Li 等人，2009)提高抗Axl mAb可增強抗VEGF降低腫瘤生長 之作用的可能性。本發明結果（圖1 5 A及圖1 5F)與此假設一 致，亦即YW327.6S2藉由增強抗VEGF降低瘤内血管密度 之作用來影響腫瘤血管結構。實際上，在A549模型中， YW327.6S2與抗VEGF之共投與引起腫瘤停滯，此停滯在 停止處理後維持至少4週（圖15B)。融合瘤抗體12A11亦增 強抗VEGF在此模型中之抗腫瘤作用（圖15C)。然而，與 YW327.6S2不同，12A11對腫瘤血管結構不具有直接影 響；而是其直接抑制腫瘤細胞增殖及誘導細胞凋亡（Li等 人，2009)。當兩種藥劑一起使用時，12A11對腫瘤生長之 作用及抗VEGF對腫瘤血管結構之作用引起增加之效果。 諸如埃羅替尼之EGFR小分子抑制劑可有效治療具有 EGFR突變或擴增之NSCLC腫瘤（Lynch等人，2004 ; Paez 等人，2004 ; Eberhard 等人，2005 ; Giaccone 等人， 2005 ; Tsao等人，2005)。亦已知用Her2/EGFR小分子抑制 劑拉帕替尼（Lapatinib)或抗Her2抗體赫赛汀（Herceptin)處 理乳癌細胞可誘導Axl表現且因此導致癌細胞對此等療法 產生抗性（Liu等人，2009)。最近發現在已獲得針對埃羅替 尼之抗性的HCC827 NSCLC(具有EGFR突變及擴增之細胞 株）細胞中可誘導Axl表現且阻斷抗性細胞中之Axl基因表 現可恢復該等細胞對埃羅替尼之敏感性，表明Axl可在 NSCLC對埃羅替尼之抗性中起作用。因為A549細胞含有 野生型EGFR且對活體外EGFR抑制僅具中度敏感性（Yauch 149799.doc -179- 201106972 等人，2005)，所以提問抗Axl mAb是否會使此等細胞對埃 羅替尼敏感。本發明結果顯示YW327.6S2增強埃羅替尼降 低腫瘤生長之作用（圖1 6A)，表明抗Axl mAb可增強EGFR 抑制劑在單獨EGFR抑制難治性腫瘤中的作用（可能藉由直 接降低腫瘤細胞中之Axl表現）。 全身化學療法在NSCLC之治療範例中占最大比重。對於 復發性或晚期疾病，經由卡鉑/太平洋紫杉醇組成之化學 療法治療之患者的反應率為15%且中值存活期為10.3個月 (Sandley等人，2006)。本發明在A549 NSCLC模型中之結 果顯示YW327.6S2能夠增強卡鉑/太平洋紫杉醇之抗腫瘤功 效（圖16B)，表明阻斷Axl功能可提高此疾病之化學療法之 治療指數。本發明結果與最近證明Axl小分子抑制劑與順 鉑協同抑制4T1乳癌正位模型中之肝微轉移之報導（Holland 等人，2010)—致。 MDA-MB-231乳癌模型中，單獨YW327.6S2能夠顯著減 弱腫瘤生長（圖17A)。不與鼠類Axl交叉反應且因此僅會影 響腫瘤細胞之抗Axl融合瘤抗體對此模型中之腫瘤生長不 具有顯著作用（圖17B)。此等結果表明YW327.6S2可能經由 其對腫瘤基質之作用來發揮其抗腫瘤效應。本發明結果表 明YW3 27.6S2降低瘤内血管密度（圖17E)且增強抗VEGF之 作用。YW327.6S2經由其對腫瘤血管結構之作用可影響腫 瘤生長。 已長期瞭解癌症之發展與炎症之間的相關性（Balkwi 11及 Mantovani, 2001 ; Coussens及 Werb,2002)。與感染及刺激 149799.doc -180- 201106972 相關之慢性炎症可能產生培養基因組病變及腫瘤起始之環 境。愈來愈多的證據表明ΤΑΜ在包括促進血管生成及基質 再成型的腫瘤進展中具有因果作用（Balkwill等人，2005 ; Pollard, 2004)。導致此作用之信號被認為是發炎性細胞激 素，包括腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、介白素6(IL-6)及過多 的趨化因子。此等細胞激素及趨化因子不僅募集刺激腫瘤 進展之免疫細胞至特定位點，而且顯示其受體表現於腫瘤 細胞上，從而其可增強腫瘤生長及遷移（Haghnegahdar等 人，2000)。在原發性人類乳癌中，Axl蛋白高量表現於腫 瘤相關巨噬細胞（ΤΑΜ)上（圖17F)。本文證明抗Axl mAb可 經由間接機制調節此等細胞之功能。本發明資料顯示，用 YW327.6S2或12A11(其不與鼠類Axl交叉反應且因此對 ΤΑΜ不應具有直接作用）處理MDA-MB-231可抑制ΤΑΜ分 泌發炎性細胞激素及趨化因子（圖17G)。因為Axl-mAb似乎 不是對ΤΑΜ上之Axl表現具有顯著作用，而是下調腫瘤細 胞上之受體表現，所以抗Axl-mAb可藉由阻斷腫瘤與基質 細胞之間的聯絡來調節ΤΑΜ分泌細胞激素/趨化因子。此 等結果與最新報導（腫瘤細胞可藉由教導浸潤性白血球誘 導Gas6之表現來促進自身生長（Loges等人，2010);且Axl 之小分子抑制劑降低4T1乳房腫瘤細胞中之GM-CSF表現 (Holland等人，2010))—致。 先前研究已確定Axl在促進腫瘤細胞遷移、侵襲及轉移 中之作用（Zhang等人，2008 ; Li等人，2009 ; Tai等人， 2008 ; Vajkoczy等人，2006 ; Gjerdrum等人，2010)。本文 149799.doc -181 - 201106972 顯示YW327.6S2能夠減少MDA-MB-231乳癌細胞轉移至 骨。此等結果與先前資料（藉由RNAi使乳癌細胞中之Axl沉 默可抑制正位模型中之乳癌細胞轉移至肺（Li等人， 2009 ; Gjerdrum等人，2010))—致，表明此抗Axl抗體可不 僅在治療性原發腫瘤上、而且在治療轉移性疾病上具有治 療潛能。 總而言之，已開發阻斷Axl功能之人類單株抗體。此抗 Axl mAb經由多種機制發揮其抗腫瘤作用，該等機制包括 誘導腫瘤細胞之細胞凋亡、調節血管生成及調節腫瘤相關 免疫細胞功能。此外，此抗Axl mAb增強抗VEGF、EGFR SMI以及化學療法之抗腫瘤功效，因此可代表臨床配置中 之新穎治療方法，其中此等療法為標準護理。 參考文獻
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Axl4)siRNA轉染HUVEC。藉由FACS分析轉染後48小時細 胞表面上之Axl表現。圖塊A : FACS分析之Axl表現概況。 條形圖表示FACS之定量。圖塊B : siRNA序列（SEQ ID NO:3-16)。圖塊C:阻斷Axl基因表現對HUVEC生長之影 響。轉染後72小時藉由CellTiter Glo分析法測定細胞存活 率； 圖11顯示藉由RNAi阻斷DKK3或Ang2基因表現不會影響 HUVEC中之Axl蛋白質含量。用對照物（GL2)、Axl、Dkk3 或Ang-2 siRNA轉染HUVEC。轉染後48小時，藉由FACS分 析Axl蛋白質含量且藉由ELIS A測定培養基中DKK3及Ang-2之蛋白質含量。以相較於對照物之基因表現變化倍數表 不， 圖12顯示用於篩檢Axl單株抗體（mAb)之以細胞為基礎之 分析法。圖塊A : Axl穩定表現於Baf3細胞中（西方墨點 法）。圖塊B : Baf3Axl細胞之Gas6依賴性生長。圖塊C : AxlFc抑制Baf3Axl細胞之Gas6依賴性生長。圖塊D :篩檢 阻斷Gas6依賴性Baf3Axl生長之Axl mAb。Baf3Axl細胞在 200 ng/ml Gas6(C及D)存在下、用指定劑量之AxlFc(C)或 融合瘤上清液（D)培養72小時。藉由CellTiter Glo測定細胞 存活率。誤差長條圖表示標準差（n=8); 圖13顯示Axl mAb之交又反應性。圖塊a : Axl mAb不與 鼠類Axl交叉反應。圖塊B : Axl mAb不與Mer及Tyro-3交叉 反應。使用人類AxlFc、鼠類AxlFc、及人類MerFc及Tyro-3Fc作為供抗體結合之抗原執行ELISA ; 149799.doc -197· 201106972 圖 14 : Axl mAb YW327。6S2之表徵。Α·使用 BIAcore量 測YW327.6S2之親和力。使用一對一朗繆爾（Langmuir)結 合模型計算結合速率及解離速率（kQff)。平衡解離常數 (Kd)係由kon/koff比率推算。B. YW327.6S2之交叉反應性。 YW327.6S2與鼠類Axl及獼猴Axl而不與Tyro3或Mer交叉反 應。用抗人類IgG Fc塗佈培養盤，接著與人類Axl、Mer、 Tyro3 Fes、小鼠AxlFcs或獼猴AxlFcs —起培育。洗務後， 添加同型對照抗體或YW327.6S2，接著添加結合HRP之抗 人類IgG.C· YW327.6S2阻斷Gas6與Axl結合。上圖： ELISA。用抗人類IgG Fc塗佈培養盤且與人類Axl-Fc—起 培育。洗滌後，在抗體存在或不存在下添加Gas6。藉由結 合生物素之抗Gas6抗體及抗生物蛋白鏈菌素-HRP結合物 偵測Gas6之結合。下圖：FACS。收集HUVEC且用 YW327.6S2或對照抗體處理，接著在冰上與Gas6—起培 育30分鐘。藉由結合生物素之抗Gas6抗體及抗生物蛋白鏈 菌素-PE結合物偵測Gas6與細胞表面之結合。D. YW327.6S2 下調 Axl表現。A549細胞與 1 pg/ml YW327.6S2 一起培育指定時間，且藉由FACS測定細胞表面Axl表現（上 圖）並藉由西方墨點法分析總蛋白質表現（下圖）。E. YW327.6S2抑制Gas6誘導之Axl磷酸化及信號傳導。H1299 細胞在不含血清之培養基中培養隔夜，用YW327.6S2預培 育4小時並用Gas6處理30分鐘。藉由ELISA量測磷酸化 Axl(上圖）且藉由西方墨點法分析磷酸化Akt(下圖）。F. YW327.6S2抑制Baf3Axl細胞生長。Baf3Axl細胞在含有 149799.doc •198· 201106972 200 ng/ml Gas6之培養基中生長且用指定濃度之 YW327.6S2處理72小時。藉由CellTiter Glo分析法量測細 胞存活率； 圖15 : YW327.6S2減弱A549異種移植腫瘤生長且增強抗 VEGF之作用。A.腫瘤生長曲線。當平均腫瘤尺寸達到100 " mm3時開始（第0天）腹膜内投與mAb，10 mg/kg(YW327.6S2 及同型對照抗體）或1 mg/kg(抗VEGF)，每週兩次。誤差長 條圖表示平均值之標準誤差（每個實驗中，每組n=10)。 〇 p = 0.0003(YW327.6S2相較於對照物），p=10'n(YW327.6S2 相較於組合療法）。B.各處理組之卡普蘭-麥爾曲線。當其 腫瘤尺寸達到800 mm3時，即自研究中移除該小鼠，且對 各組中剩餘動物（剩餘百分比）作圖。C. 12A11增強抗VEGF 之作用。當平均禮瘤尺寸達到100 mm3時開始（第0天）分別 以30 mg/kg及1 mg/kg腹膜内投與12A11及抗VEGF，每週 兩次。誤差長條圖表示平均值標準誤差（每個實驗中，每 ◎ 組 n=10)。ρ=0.006(12Α11相較於對照物）；ρ=0·0001(12Α11 相較於組合療法）。D. YW327.6S2下調Axl表現。用10 mg/kg之YW327.6S2處理小鼠且在指定時間點切除腫瘤。 藉由西方墨點法針對Axl表現分析腫瘤之細胞溶解產物。 E. YW327.6S2誘導細胞凋亡。切除經對照物或YW327.6S2 處理2週之腫瘤且執行CC3 IHC以量測細胞凋亡。F. YW327.6S2增強抗VEGF在降低瘤内血管密度中之作用。 給藥後0小時及72小時切除如上述D中所處理之小鼠之腫瘤 且藉由MECA32免疫組織化學染色來顯現腫瘤血管結構且 149799.doc •199· 201106972 藉由景/像刀析疋量（以平方微米表示）。對各對樣品執行學 生t檢驗（對於對照物相較於組合療法，卩<〇〇5); 圖16 : YW327 6S2增強A549異種移植模型中埃羅替尼及 化學療法之抗腫瘤作用。A. YW327 6S2增強埃羅替尼之作 用。抗體投與與圖2中相同。以1〇〇毫克/公斤/天經口管飼 投與埃羅替尼。每組n=1〇 D p=h7xl〇-9(YW327 6s2相較於 對照物），15=2.3\1〇-1。(丫貿327.682相較於組合療法）。；6 YW327.6S2增強化學療法。抗體投與與圖2中相同。治療 開始時（第0天）分別皮下投與6·25毫克/公斤/天之太平洋紫 杉醇5天及1〇〇 mg/kg單一劑量之卡鉑。每組η=ι〇。 p=3xl(T5(YW327.6S2相較於對照物），ρ；=10-9(化學療法相 較於對照物）’ ρ=1 〇_5(組合療法相較於單獨化學療法）； 圖I7 : YW327_6S2藉由調節腫瘤受質功能來減弱MDA-MB-231異種移植腫瘤生長。a及B. YW327.6S2而非12A11 降低MDA-MB-231腫瘤生長且增強抗VEGF之作用。平均 腫瘤尺寸達到100 mm3時開始（第〇天），以20 mg/kg (YW327.6S2 及同型對照抗體）、30 mg/kg(12All)及 2 mg/kg(抗VEGF)腹膜内投與mAb，每週兩次。誤差長條圖 表示平均值標準誤差（每個實驗中，每組n=l〇)。P=8.5x10·6 (YW327.6S2相較於對照物），p=2.8xl(T8(YW327.6S2相較 於組合療法），ρ=〇·〇5(12Α11相較於對照物），p=〇.i45(抗 VEGF相較於組合療法）。C及D. YW327.6S2下調Axl表現。 用20 mg/kg之mAb處理含有MDA_MB231異種移植腫瘤（平 均尺寸500 mm3)之小鼠且在指定時間點切除腫瘤。腫瘤之 149799.doc •200- 201106972 細胞溶解產物用於西方墨點法分析Axl表現。E. YW3 27.6S2降低腫瘤相關血管結構之密度。0小時及給藥 後1週切除如上述C中所處理之小鼠之腫瘤且藉由MECA32 免疫組織化學染色來顯現腫瘤血管結構且藉由影像分析定 量（以平方微米表示）。對各對樣品執行學生t檢驗（對於 〜 YW327.6S2相較於對照物、抗VEGF相較於對照物，及抗 VEGF相較於組合療法，p<0.05)。F. Axl高度表現於原發性 ^ 人類乳癌之浸潤性巨噬細胞中。使用免疫組織化學檢查79 ❹ 種原發性腫瘤。21%此等腫瘤在浸潤性巨噬細胞中表現高 含量Axl。藉由抗CD68染色來鑑別巨噬細胞，且藉由抗 Axl/CD68雙重IHC測定巨噬細胞上Axl之表現。使用一系 列切片。G. YW327.6S2抑制腫瘤相關巨噬細胞發炎性分泌 細胞激素/趨化因子。用20 mg/kg之對照抗體、YW327.6S2 或12A11處理含有MDA-MB231異種移植腫瘤（平均尺寸500 mm3)之小鼠且在處理1週後切除腫瘤。藉由分選F4/80陽性 Q 細胞來分離腫瘤相關巨嗟細胞且培養隔夜。使用Bio-Plex 小鼠細胞激素分析套組量測分泌入培養基中之細胞激素及 趨化因子； '· 圖18 : YW327.6S2減少MDA-MB-231乳癌細胞向骨骼之 ·. 轉移。A.尾靜脈注射腫瘤細胞後4週進行的生物發光成 像。將 200μί 含 25 mg/mL D-螢光素（Invitrogen)之 PBS 腹膜 内（i.p)注入小鼠中且在成像期間使用異氟烷經由鼻錐麻醉 小鼠。用具有增強式電荷耦合器件攝影機之光子成像器 (Biospace Lab，Paris, France)獲得生物發光影像。B.脛骨 149799.doc -201 - 201106972 切片之Η及E染色。實驗結束時收集組織且固定於4%曱醛 中，切片且用H&E染色。上圖中之圓圈顯示侵襲骨骼之腫 瘤細胞。下圖詳細顯示骨髓中之贅生性細胞；及 圖 19 :例示性人類 Axl序列 RefSeq NM—001699(SEQ ID NO:17)。 149799.doc 202- 201106972 序列表 <110>美商建南德克公司 <120>組合療法 <130> P4347R1 <140> 099124592 <141> 2010/07/26 <150> US 61/228,915 <151> 2009-07-27 <150> US 61/356,498 <151> 2010-06-19 <160> 19 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <2]3>人造序列 <220>
<223>合成序列 <400> 1
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30
Gly Ser Trp lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Va] Gly Trp lie Asn Pro Tyr Arg Gly Tyr Ala Tyr Tyr 50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Ser Gly Trp Gly Gly 95 100 105
Ser Ser Val Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 110 115 120
Val <210> 2 <21]> 108 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 2
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser 20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45
Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 149799.doc 201106972 65 70 75
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 3 cguacgcgga auacuucgat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 4 ucgaaguauu ccgcguacgt t 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 5 gaaagaagga gacccgttat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400〉 6 taacgggtct ccttctttct t 21 <210〉 7 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 7 ccaagaagat ctacaatggt t 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 8 2- 149799.doc 201106972 ccattgtaga tcttcttggt t 21 <210> 9 <2U> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 9 ggaactgcat gctgaatgat t zi <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 10 f tcattcagca tgcagttcct t 21
<210> 11 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 11 ... gaaggagacc cgttatggat t ii <210> 12 <211> 21 <212> RNA <2}3>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 12 tccataacgg gtctccttct t n <210〉 13 <211> 21 <212> RNA <213〉人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 13 t t gacatcctct ttctcctgct t ll <210> 14 <2\\> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 14 , gcaggagaaa gaggatgtct t /1 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 149799.doc 201106972 <400> 15 gatttggaga acacactgat t 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>合成序列 <400> 16 tcagtgtgtt ctccaaatct t 21 <210> 17 <211> 875 <212〉 PRT <213>智人 <400> 17
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp 15 10 15
Cys Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr 20 25 30
Gin Ala Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn lie Thr 35 40 45
Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gin Leu Gin Val 50 55 60
Gin Gly Glu Pro Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gin lie 65 70 75
Leu Glu Leu Ala Asp Ser Thr Gin Thr Gin Val Pro Leu Gly Glu 80 85 90
Asp Glu Gin Asp Asp Trp lie Trp Ser Gin Leu Arg lie Thr Ser 95 100 305
Leu Gin Leu Ser Asp Thr Gly Gin Tyr Gin Cys Leu Val Phe Leu 110 115 120
Gly His Gin Thr Phe Val Ser Gin Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu 125 130 135
Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Gla Glu Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala 140 145 150
Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys Gin Ala Gin Gly Pro Pro 155 160 165
Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gin Asp Ala Val Pro Leu Ala 170 175 180
Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gin Arg Ser Leu His Val Pro Gly 185 190 195
Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Aia His Asn Ala Lys 200 205 210
Gly Trp Ser Arg Thr Ala Thr lie Thr Val Leu Pro Gin Gin Pro 215 220 225
Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gin Pro Thr Glu Leu Glu Val 230 235 240
Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly lie Tyr Pro Leu Thr His Cys 245 250 255
Thr Leu Gin Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly lie Gin Ala 260 265 270 -4- 149799.doc 201106972
Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gin Ala Ser 275 280 285
Val Pro Pro His Gin Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr 290 295 300
Pro Tyr His lie Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gin Gly Pro Ser 305 310 315
Ser Trp Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro 320 325 330
Leu Gly Pro Pro Glu Asn lie Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gin 335 340 345
Ala Phe Val His Trp Gin Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gin Gly Thr 350 355 360
Leu Leu Gly Tyr Arg Leu Ala Tyr Gin Gly Gin Asp Thr Pro Glu 365 370 375
Val Leu Met Asp lie Gly Leu Arg Gin Glu Val Thr Leu Glu Leu 380 385 390
Gin Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn Leu Thr Val Cys Val Met Tyr
395 400 405
Thr Met Gly Asp Gly Pro Txp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala 410 415 420
Trp Arg Pro Val Lys Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp Pro 425 430 435
Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala Trp Ala Ala Ala Cys Val Leu 440 445 450 lie Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg 455 460 465
Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Trp 470 475 4S0
Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala 485 490 495
Thr Leu Asn Ser Leu Gly ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu 500 505 510
Arg Asp Val Met Val Asp ATg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr 515 520 525
Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gin Leu Asn 530 535 540
Gin Asp Asp Ser Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile 545 550 555
Ala Ile Cys Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala 560 565 570
Val Cys Met Lys Glu Phe Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile 575 580 585
Gly Val Cys Phe Gin Gly Ser Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro 590 595 600
Trp Ile Leu Pro Phe Met Lys His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu 605 610 615
Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gin Pro Trp Leu Pro Thr Gin Met 620 625 630
Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu 635 640 645 149799.doc 201106972
Ser Thr Lys Arg Phe lie His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys 650 655 660
Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu 665 670 675
Ser Lys Lys lie Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg Gin Gly Arg lie 680 685 690
Ala Lys Met Pro Val Lys Trp lie Ala lie Glu Ser Leu Ala Asp 695 700 705
Arg Trp Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Thr Met 710 715 720
Trp Glu lie Ala Thr Arg Gly Gin Thr Pro Tyr Pro Gly Val Glu 725 730 735
Asn Ser Glu lie Tyr Asp Tyr Leu Arg Gin Gly Asn Arg Leu Lys 740 745 750
Gin Pro Ala Asp Cys Leu.Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg 755 760 765
Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gin Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu 770 775 780
Arg Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gin 785 790 795
Glu Pro Asp Glu lie Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly 800 805 810
Tyr Pro Glu Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr 815 820 825
Gin Pro Asp Pro Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu 830 835 840
Val His Pro Ala Gly Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro 845 850 855
Ser Pro Ala Gin Pro Ala Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly 860 865 870
Gin Glu Asp Gly Ala 875 <210> 18 <211> 134
<212> PRT <213>智人 <400> 18
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp 15 10 15
Cys Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr 20 25 30
Gin Ala Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn He Thr 35 40 45
Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gin Leu Gin Val 50 55 60
Gin Gly Glu Pro Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gin lie 65 70 75
Leu Glu Leu Ala Asp Ser Thr Gin Thr Gin Val Pro Leu Gly Glu 80 85 90
Asp Glu Gin Asp Asp Trp lie Val Val Ser Gin Leu Arg lie Thr 95 100 105 -6- 149799.doc 201106972
Ser Leu Gin Leu Ser Asp Thr Gly Gin Tyr Gin Cys Leu Val Phe 110 115 120
Leu Gly His Gin Thr Phe Val Ser Gin Pro Gly Tyr Val Gly 125 130 <210> 19 <212> 104 <212> PRT <213>智人 <400> 19 lie Thr Val Leu Pro Gin Gin Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser 1 5 10 15
Arg Gin Pro Thr Glu Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser 20 25 30
Gly lie Tyr Pro Leu Thr His Cys Thr Leu Gin Ala Val Leu Ser 35 40 45
Asp Asp Gl.y Met Gly lie Gin Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu 50 55 60
Glu Pro Leu Thr Ser Gin Ala Ser Val Pro Pro His Gin Leu Arg
Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro Tyr His He Arg Val Ala 80 85 90
Cys Thr Ser Ser Gin Gly Pro Ser Ser Trp Thr His Trp Leu 95 100
149799.doc

Claims (1)

  1. 201106972 七、申請專利範圍： 1. 一種治療個體癌症之方法，其包括向該個體投與治療有 效量之Axl拮抗劑及VEGF拮抗劑。 2. —種抑制個體癌症轉移之方法，其包括向該個體投與治 ' 療有效量之Axl拮抗劑及VEGF拮抗劑。 3. 一種抑制個體血管生成之方法，其包括向該個體投與治 療有效量之Axl拮抗劑及VEGF拮抗劑。 4. 一種抑制個體細胞增殖之方法，其包括向該個體投與治 療有效量之Axl拮抗劑及VEGF拮抗劑。 5. 如請求項1、2、3或4之方法，其中該癌症為乳癌、結腸 直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤 (non-Hodgkins lymphoma ； NHL)、腎細胞癌、前歹丨]腺 癌、肝癌（諸如肝細胞癌）、胰臟癌、軟組織肉瘤、卡波 西氏肉瘤（kaposi’s sarcoma)、類癌瘤、頭頸癌、黑色素 瘤、卵巢癌、胃癌、間皮瘤及多發性骨聽瘤。 q 6.如請求項1、2、3或4之方法，其中該Axl拮抗劑為抗Axl 抗體。 7.如請求項6之方法，其中該抗Axl抗體包括含有序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSGSWIHWVRQ APGKGLEWVGWINPYRGYAYYADSVKGRFTISADTSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYSGWGGSSVGYAMDY WGQGTLV(SEQ ID ΝΟ:1)的重鏈可變區，及含有序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQK PGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP 149799.doc 201106972 EDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:2) 的輕鍵可變區。 8. 如請求項6之方法，其中該抗Axl抗體為抗體3G9或抗體 3G9之人類化形式。 9. 如請求項1、2、3或4之方法，其中該VEGF拮抗劑為抗 VEGF抗體。 10_如請求項9之方法，其中該抗VEGF抗體為貝伐珠單抗 (bevacizumab)。 149799.doc
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