CZ291047B6 - Farmaceutický prostředek obsahující antagonisty faktoru růstu vaskulárních endoteliálních buněk - Google Patents

Abstract

Jsou pops ny farmaceutick prost°edky obsahuj c antagonisty faktoru r stu vaskul rn ch endoteli ln ch bun k (VEGF) pro l en tumoru savce.\

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká farmaceutických prostředků obsahujících antagonisty faktoru růstu vaskulárních endoteliálních buněk (VEGF) pro léčení tumoru savce.

Dosavadní stav techniky

Dvě hlavní buněčné složky vaskularity jsou endoteliální buňky a buňky hladkého svalstva. Endoteliální buňky tvoří výstelky na vnitřním povrchu veškerých krevních cév a tvoří netrombo15 genické rozhraní mezi krví a tkání. Endoteliální buňky tedy bují během angiogeneze nebo neovaskularizace spojené s nádorovým růstem a metastází a s různými neneoplazickými chorobami nebo poruchami.

Různé polypeptidy, přirozeně se vyskytující, podle zpráv indukují proliferaci endoteliálních 20 buněk. K těmto polypeptidům patří bazické a kyselé faktory růstu fibroblastových buněk (FGF).

Burgess aMaciag. Annual Rev. Biochem. 58:575 (1989), faktor růstu endoteliálních buněk odvozený z destiček (PD-ECGF), Ishikawa, et al.. Nátuře 338:557 (1989) a endoteliální faktor vaskulámího růstu (VEGF), Leung, et al.. Science 246:1306 (1989), Ferrara & Henzel. Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:851 (1989), Tischer, et al.. Biochem Biophys. Res. Commun.

165:1198 (1989), Ferrara, et al.. WO 90/13 649.

VEGF byl poprvé identifikován v médiu upraveném folikulámími nebo folikulostelámími buňkami hovězí hypofýzy. Biochemický rozbor ukázal, že hovězí VEGF je dimerický protein se zjevnou molekulární hmotností asi 45 000 daltonů a se zjevnou mitogenní specifitou pro 30 vaskulámí endoteliální buňky. DNA s kódem hovězího VEGF byla izolována pomocí vyšetřování cDNA informace připravené z těchto buněk a užitím oligonukleotidů založených na aminoterminálních sekvencích proteinu, jakožto hybridizačních vzorků.

Lidský VEGF byl poprvé získán pomocí počátečního vyšetření cDNA informace připravené 35 z lidských buněk, s použitím hovězího VEGF cDNA, jakožto hybridizačního vzorku. Jeden cDNA takto identifikovaný kóduje 165-aminokyselinový protein mající vyšší než 95 % homologii vůči hovězímu VEGF, kterýžto protein je chápán jako lidský VEGF (hVEGF). Mitogenní aktivita lidského VEGF byla potvrzena expresí cDNA lidského VEGF v savčích hostitelských buňkách. Médium upravené buňkami transfektovanými cDNA lidského VEGF 40 podpořilo proliferaci kapilárních endoteliálních buněk, kdežto u kontrolních buněk tomu tak nebylo. Leug, et al.. Science 246:1306 (1989).

Několik dalších cDNA bylo identifikováno v lidské cDNA informaci, která nese kód pro 121-, 189- a 206-aminokyselinové izoformy hVEGF (kolektivně nazývané též hVEGF-příbuzné 45 proteiny). 121-aminokyselinový protein se liší od hVEGF tím, že 44 aminokyselin mezi zbytky 116 a 159 v hVEGF chybí. 189-aminokyselinový protein se liší od hVEGF tím, že 24 aminokyselin je vloženo do hVEGF ve zbytku 116 a je zjevně identický s faktorem lidské vaskulámí propustnosti (hVPF). 206-aminokyselinový protein se liší od hVEGF tím, že 41 aminokyselin je vloženo ve zbytku 116 do hVEGF. Houck, et al.. Mol. Endocrin 5:1806 (1991); Ferrara, et al.. 50 J. Cell. Biochem. 47:211 (1991); Ferrara, et al., Endocrine Reviews 13:18 (1992); Keck, et al..

Science 246:1309 (1989); Connolly, et al.. J. Biol. Chem. 264:20017 (1989); Keck, et al.. EP - B - 370 989.

- 1 CZ 291047 B6

VEGF nejen stimuluje proliferaci vaskulárních endoteliálních buněk, ale vyvolává též propustnost a angiogenezi. Angiogeneze, jež zahrnuje též formaci nových krevních cév z původního endothelia, je důležitou součástí celé řady nemocí a poruch, včetně růstu nádorů a včetně metastází, revmatické artritidy, psoriázy, arteriosklerózy, diabetické retinopatie, retrolentální fibroplazie, neovaskulárního glaukomu, hemangiomů, imunní rejekce (odmítnutí) transplantované korneální tkáně nebo jiných tkání a chronických zánětů.

V případě nádorového růstu, angiogeneze se zdá mít klíčový význam pro přechod od hyperplazie k neoplazii a pro dodání výživy rostoucímu nádoru z pevné tkáně. Folkman, et al„ Nátuře 339:58 (1989). Angiogeneze také umožňuje nádoru, aby byl v kontaktu svaskulámím lůžkem jako hostitel, což zřejmě umožňuje cestu, po které nádorové buňky metastázují. Tato role, kterou angiogeneze hraje v metastázích nádorů, je prokázána například ve studiích ukazujících korelaci mezi množstvím a hustotou mikrocév v histologických vzorcích invazivního karcinomu lidského prsu a skutečné přítomnosti vzdálené metastáze. Weidner, et al„ New Engl. J. Med. 324:1 (1991).

Z hlediska role růstu vaskulárních endoteliálních buněk a angiogeneze a role takových procesů v případě mnoha nemocí a poruch je žádoucí mít k dispozici způsob redukce nebo inhibice jednoho nebo mnoha biologických účinků VEGF. Je též žádoucí mít k dispozici způsob zkoušky dokazující přítomnost (nebo nepřítomnost) VEGF za normálních a patologických podmínek, obzvláště při výskytu rakoviny.

Tento vynález odhaluje antagonisty VEGF, včetně (a) protilátek ajejich variant, které jsou schopné vázat výslovně hVEGF, hVEGF receptor nebo komplex obsahující hVEGF v souvislosti shVEGF receptorem, (b) hVEGF receptor a jeho varianty a (c) hVEGF varianty. Antagonisté zabraňují mitogenní, angiogenní nebo jiné biologické činnosti hVEGF ajsou tedy užitečné k léčbě nemocí nebo poruch pomocí nežádoucí nadbytečné neovaskularizace, včetně užití příkladu takových nádorů, obzvláště zhoubných nádorů z pevné tkáně, revmatické artritidy, psoriázy, arteriosklerózy, diabetické nebo jiné retinopatie, retrolentální fibroplazie, neovaskulárního glaukomu, hemangiomů, hyperplazie štítné žlázy (včetně Graveho nemoci), transplantace korneální a jiné tkáně a chronických zánětů. Antagonisté jsou též užiteční při léčbě nemocí a poruch charakterizovaných nežádoucí nadbytečnou vaskulámí permeabilitou, např. edém spojený s mozkovým nádorem, ascites spojené s výskytem zhoubného bujení. Mejsův syndrom, zápal plic, nefrotický syndrom, perikardiální efúzí (např. spojená s perikarditidou) a pleurální efůze.

Z jiných hledisek VEGF antagonisté jsou polyspecifické monoklonální protilátky, které jsou schopné vázání s (a) ne-hVEGF epitopy, např. epitopy proteinu účastnícího se trombogeneze nebo trombolýzy nebo antigen povrchu nádorové buňky a s (b) hVEGF, hVEGF receptory nebo komplexy obsahujícími hVEGF ve spojení s hVEGF receptory.

A ještě z jiných hledisek VEGF-antagonisté jsou konjugované s cytotoxickou složkou.

Z jiného hlediska tento vynález se zabývá izolovanou nukleovou kyselinou nesoucí kód monoklonální protilátky, jak je popsán výše, a buněčné linie hybridomu, jež takové monoklonální protilátky produkují.

Z jiného aspektu tento vynález se zabývá farmaceutickou kompozicí obsahující VEGFantagonisty v množství účinně redukujícím nebo eliminujícím v savcích mitogenní nebo angiogenní činnost léčenou pomocí hVEGF.

Z odlišného hlediska tento vynález se zabývá metodou léčení zahrnující léčbu savců, především lidských pacientů, kteří takovou léčbu potřebují, s užitím fyziologicky účinného množství VEGF-antagonistů. Je-li potřeba. VEGF-antagonisté jsou podáváni dohromady, buď současně,

-2CZ 291047 B6 nebo sériově za sebou, s jedním nebo více jinými VEGF-antagonisty nebo protinádorovými nebo anti-angiogenními substancemi.

Z jiného hlediska tento vynález se zabývá metodou detekce hVEGF ve zkušebním vzorku pomocí kontaktu tohoto zkušebního vzorku s protilátkami, schopnými vázání specificky s hVEGF a determinací rozsahu takové vazby.

Graf číslo 1 ukazuje působení anti-hVEGF monoklonálních protilátek (A4.6.1 nebo B2.6.2) nebo irelevantní protilátky k anti-hepatocytnímu faktoru růstu (antiHGF) na vázání anti-hVEGF monoklonálních protilátek s hVEGF.

Graf číslo 2 zobrazuje účinek anti-hVEGF monoklonálních protilátek (A4, 6. 1 nebo 82, 6.2) nebo libovolných anti-HGF protilátek na biologickou činnost hVEGF v kulturách hovězího adrenálního kortexu kapilárních endoteliálních (ACE) buněk.

Graf číslo 3 ukazuje vliv anti-hVEGF monoklonálních protilátek (A4.6.1, B2.6.2 nebo A2.6.1) na vázání hVEGF s hovězími ACE buňkami.

Graf číslo 4 ukazuje vliv léčby pomocí anti-hVEGF monoklonálních protilátek A4.6.1 na rychlost růstu nádorů NEG55 u myší.

Graf číslo 5 zobrazuje účinek podávání anti-hVEGF monoklonálních protilátek A4.6.1 na velikost nádorů NEG55 u myší po pěti týdnech aplikace.

Graf číslo 6 ukazuje vliv podávání anti-hVEGF monoklonálních protilátek A4.6.1 (VEGF Ab) na růst nádorů SK-LMS-1 u myší.

Graf číslo 7 ukazuje vliv různých dávek anti-hVEGF monoklonálních protilátek A4.6.1 (VEGF Ab) na růst nádorů A673 u myší.

Graf číslo 8 zobrazuje účinek anti-hVEGF monoklonálních protilátek A4.6.1 na růst a přežívání buněk glioblastomu NEG55 (G55) v kultuře.

Graf číslo 9 ukazuje vliv anti-hVEGF monoklonálních protilátek A4.6.1 na růst a přežívání buněk rabdomyosarkomu A673 v kultuře.

Graf číslo 10 zobrazuje účinek anti-hVEGF monoklonálních protilátek A4.6.1 na lidskou synoviální chemotaxi, způsobenou tekutinou lidských endoteliálních buněk.

Výraz hVEGF, jak je užitý v tomto textu, vyjadřuje 165-aminokyselinový faktor růstu lidských vaskulárních endoteliálních buněk a příbuzné 121-, 189- a 206aminokyselinové faktory růstu vaskulámích endoteliálních buněk, jak je to popsáno Leungem, et al„ Science 246:1306 (1989) a Houckem, et al.. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) a zpracované formy těchto faktorů růstu.

Tento vynález dává k dispozici antagonisty hVEGF, kteří jsou schopni zabránit jedné nebo více biologických činností hVEGF, například mitogenní nebo angiogenní aktivitě. Antagonisté hVEGF mají účinek tím, že interferují svázáním hVEGF s buněčnými receptory, dále účinkují zneschopněním nebo zabitím buněk, které byly aktivovány hVEGF nebo interferencí s vaskulárními endoteliálními buňkami, které byly aktivované poté, kdy se hVEGF vázal s buněčnými receptory. Všechny tyto způsoby intervence ze strany antagonistů hVEGF budou uvažovány pro účely tohoto vynálezu jako rovnocenné. V důsledku toho do rozsahu vynálezu spadají protilátky, zejména monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty, které se váží s hVEGF, hVEGF-receptorem nebo komplexem obsahujícím hVEGF ve spojení s hVEGFreceptorem. Též začleněny do tohoto pojmu v rámci tohoto vynálezu jsou fragmenty a varianty

-3 CZ 291047 B6 aminokyselinových sekvencí hVEGF, které vážou hVEGF-receptory, ale nevykazují biologickou aktivitu přirozeného hVEGF. K tomuto pojmu v rámci tohoto vynálezu též patří hVEGFreceptory a fragmenty a takové jejich varianty aminokyselinových řad, které jsou schopny se vázat s hVEGF.

Termín hVEGF-receptor nebo hVEGFr, jak je ho užito v tomto textu, označuje buněčný receptor pro hVEGF, obvykle receptor buněčného povrchu nalézající se na vaskulárních endoteliálních buňkách a jeho varianty, které si uchovávají schopnost vázat se s hVEGF. Receptory hVEGF a jejich varianty, které jsou antagonisty hVEGF, se budou typicky vyskytovat spíše v izolované formě, než aby byly integrovány do buněčné membrány nebo připevněny pevně k buněčnému povrchu, jak tomu může být v přírodě. Příkladem takového hVEGF-receptoru je tyrozinová kináza (fit), podobná fms, transmembránový receptor v rodině tyrozinové kinázy. DeVries, et al.. Science 255:989 (1992); Shibuya, et al., Oncogene 5:519 (1990). Tento flt-receptor obsahuje extracelulámí doménu, transmembránovou doménu a intracelulámí doménu s činností tyrozinové kinázy. Extracelulámí doména se týká vazby s hVEGF, kdežto intracelulámí doména zasahuje signální transdukci.

Jiným příkladem hVEGF-receptoru je flk-1 receptor (též označovaný jako KDR). Matthews, et al., Proč. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman, et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman, et al„ Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992).

Výsledkem vázání hVEGF s flt-receptorem je formace nejméně dvou komplexů o vysoké molekulární váze, mající zjevnou molekulární hmotnost 205 000 a 300 000 daltonů. Komplex mající 300 000 daltonů je považovaný za dimer obsahující molekulu o dvou receptorech vázaných k jedné molekule hVEGF.

Varianty hVEGFr jsou též pojaty do rámce této práce. Reprezentativní příklady zahrnují zkrácené formy receptoru, ve kteiých membránové a cytoplazmatické domény byly deletovány z receptoru a fúzní proteiny, ve kterých nonhVEGFr polymery nebo polypeptidy jsou konjugované s hVEGFr nebo raději s jejich zkrácenými formami. Příklad takového polypeptidu, nesoucího hVEGF, je imunoglobulin. V jeho případě například extracelulámí doména hVEGFr nahrazuje Fv doménu imunoglobulinového lehkého nebo (raději) těžkého řetězu, ve kterém je Ckonec receptoru extracelulámí domény kovalentně spojen s aminokoncem CHI, ginglymem. CH2 nebo jiným článkem těžkého řetězu. Takové varianty jsou konstruovány tímtéž způsobem jako imunoadhezony. Viz př. Gascoigne, et al„ Proč. Nat. Acad. Sci. 84:2936 (1987); Capon, et al.. Nátuře 337:525 (1989), Aruffo, et al.. Cell 61:1303 (1990); Ashkenazi, et al., Proč. Nat. Acad. Sci. 88:10535 (1991); Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060 (1991). V jiných provedeních je hVEGFr konjugováno s polymery neproteinového typu, příkladně s polyetylem glykolu (PEG) (viz příkladně Davis, et al.. U. S. Patent Č. 4,179,337; Goodson, et al.. Bio Technology 8:343346 (1990); Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3578 (1977); Abuchowski, et al.. J. Biol. Chem. 252:3582 (1977) nebo uhlovodany /sacharidy/ (viz příkladně Marshall, et al.. Arch. Biochem. Biophys. 167:77 (1975). Toto slouží k prodloužení biologického poločasu hVEGFr a sníží možnost, že receptor bude imunogenní v savcích, jimž je podáván. Tento hVEGFr je užíván v podstatě stejným způsobem jako protilátky k hVEGF, přičemž afinita antagonistů a jejich potence vůči hVEGF je brána na zřetel.

Extracelulámí doména receptoru hVEGF, buď sama o sobě nebo ve fúzi s peptidem imunoglobulinu nebo jiného polypeptidu-nosiče, je obzvláště užitečná jako antagonista hVEGF díky své schopnosti sekvestrovat hVEGF, který je přítomen v hostiteli, ale není vázán s hVEGFr na povrchu buňky.

hVEGFr a jeho varianty jsou také užitečné při vyšetřovacích zkouškách k identifikaci agonistů a antagonistů hVEGF. Například hostitelské buňky, transfektované DNA, nesoucí kód hVEGFr (například fit nebo fikl), exprimují polypeptidy receptoru na povrch buňky, činíc takovou

-4CZ 291047 B6 rekombinovanou hostitelskou buňku ideálně vhodnou pro analyzování schopnosti pokusné sloučeniny (například malé molekuly, lineárního nebo cyklického peptidu nebo polypeptidu) vázat hVEGFr, hVEGFr a fúzní proteiny hVEGFr, například hVEGFr-lgG fúzní protein může být užit podobným způsobem. Například fúzní protein je vázán k imobilizovanému nosiči a schopnost pokusné sloučeniny zaměnit hVEGF označený radiem z domény hVEGFr je určena.

Výraz rekombinantní, užitý ve vztahu k hVEGF, receptoru hVEGF, monoklonálním protilátkám nebo jiným proteinům, označuje proteiny, které jsou produkované expresí, vyjádřením rekombinantní DNA v hostitelské buňce. Tato hostitelská buňka může být prokaryotická (například bakteriální buňka, jako př. E. coli), nebo eukaryotická (například kvasinky nebo savčí buňka).

Termínu monoklonální protilátky je v tomto textu užito ve smyslu protilátky získané z populace v podstatě homogenních protilátek, tzn. individuální protilátky sestávající z této populace jsou identické ve specificitě a afinitě, s výjimkou možné, přirozeně se vyskytující mutace, která je přítomná v malých množstvích. Mělo by být kladně oceněno, že jako výsledek takových přirozeně se vyskytujících mutací a jim podobných forem jsou prostředky s obsahem monoklonálních protilátek podle tohoto vynálezu, jež obsahují převážně protilátky schopné specificky se vázat s hVEGF, hVEGFr nebo komplexem sestávajícím se z hVEGF ve spojení s hVEGFr (hVEGF-hVEGFr-komplex), mohou též obsahovat malá množství jiných protilátek.

V důsledku toho adjektivum monoklonální označuje charakter protilátky získané z takové v podstatě homogenní populace protilátek a není tvořena užitím nějaké zvláštní metody. Například monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu mohou být vytvořeny užitím metody hybridomu, poprvé popsané Kohlerem & Milsteinem. Nátuře 256:495 (1975) nebo metodami rekombinantu DNA. Cabilly, et al„ US Patent 4 816 567.

U metody hybridomu, myš nebo jiné příslušné hostitelské zvíře je imunizováno antigenem podkožní, intraperitoneální nebo intramuskulámí cestou, aby byly aktivovány lymfocyty, které produkují nebojsou schopny produkovat protilátky, jež se budou specificky vázat s proteinem užitým k imunizaci. V jiném případě lymfocyty mohou být imunizovány in vitro. Lymfocyty potom vstoupí do fúze s buňkami myelomu, užívajíce vhodný fúzní prostředek (médium), např. polyethylenglykol k vytvoření buněk hybridomu. Goding, Monoclonal Antibodies;

Principles and Practice /Monoklonální protilátky: Zásady a praxe/ pp. 59-103 (Academie Press, 1986).

Antigen může být hVEGF, hVEGFr nebo komplex hVEGF-hVEGFr. Antigen je, podle potřeby, fragment nebo část buď hVEGF nebo hVEGFr, mající jeden nebo více aminokyselinových zbytků, jež se účastní na vazbě hVEGF s jedním z jeho vlastních receptorů. Například imunizace s extracelulámí doménou hVEGFr (tj. zkrácený hVEGF polypeptid bez transmembránové a bez intracelulámí domény(bude obzvláště užitečný při produkování protilátek, které jsou antagonisty hVEGF, protože to je extracelulámí doména, jež zasahuje do vázání hVEGF.

Monoklonální protilátky, schopné vázání komplexu hVEGF-hVEGFr, jsou užitečné, zejména jestliže se nevážou k nespojeným nekomplexovaným hVEGF a hVEGFr. Takové protilátky tedy vážou pouze buňky, které procházejí okamžitou aktivací způsobenou hVEGF a tudíž nejsou sekvestrovány volnými hVEGF a hVEGFr, jak je tomu normálně u savců. Takové protilátky obyčejně vážou epitop, který spojuje jeden nebo více bodů kontaktu mezi receptorem a hVEGF. Takové protilátky byly produkovány pro jiné ligandní komplexy receptorů a mohou být v tomto případě produkovány stejným způsobem. Tyto protilátky nepotřebují, a nesmějí, neutralizovat nebo znemožňovat biologickou činnost nevázaných hVEGF nebo hVEGFr, ať už jsou protilátky schopny vázání s nespojenými hVEGF nebo hVEGFr, anebo nejsou.

-5CZ 291047 B6

Buňky hybridomu, připravené tímto způsobem, jsou naočkovány a rostou ve vhodném médiu kultury, které nejlépe obsahuje jednu nebo dvě substance, jež zabraňují růstu a přežití rodičovských buněk myelomu, jež nevstoupily do fúze. Například jestliže rodičovské buňky myelomu postrádají enzym hypoxantin guanin fosforibosyl transferázu (HGPRT nebo HPRT), kultivační médium pro hybridom bude v typickém případě zahrnovat hypoxantin, aminopterin a thymidin (HAT médium), kteréžto substance zabrání růstu buněk s nedostatkem HGPRT.

Preferované buňky myelomu jsou takové buňky, které vstupují efektivně do fúze, podporují stabilní vysokou úroveň exprese protilátek vybranými buňkami produkujícími protilátky ajsou citlivé k médiu, jako např. k HAT médiu. Z nich preferované řady buněk myelomu jsou řady myšího myelomu, např. takové, které jsou odvozeny od MOPC-21 aMPC-11 myších nádorů, daných k dispozici Salk Institute Cell Distribution Center. San Diego. Califomia. USA, SP-2 buňky byly dodány Američan Type Culture Collection. Rockville. Maryland. USA a P3X63Ag8U.l buňky, popsané Yeltonem, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978). Buněčné řady lidského myelomu a myšího-lidského heteromyelomu byly též popsány pro produkci lidských monoklonálních protilátek. Kozbor. J. Immunol. 133:3001 (1984). Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications /Metodyprodukce monoklonálních protilátek a jejich užití/, pp. 51-63 (Marcel Dekker. Inc. New York, 1987).

Médium kultury, v němž rostou buňky hybridomu, je zkoumáno na produkci monoklonálních protilátek namířených proti antigenu. Vazebná specifita monoklonálních protilátek produkovaných buňkami je nejlépe určena imunoprecipitací nebo pomocí in vitro zkoumání vazby, příkladně v případě radioimunoanalýzy (R1A) nebo imunoabsorpčního zkoumání v návaznosti na enzym (ELISA). Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu jsou takové protilátky, které přednostně imunoprecipitují hVEGF, hVEGFr nebo komplex hVEGF-hVEGFr, nebo se přednostně váží nejméně kjednomu z těchto antigenů při rozboru vázání ajsou schopny zabránit biologické činnosti hVEGF.

Poté, kdy jsou identifikovány buňky hybridomu, jež produkují antagonistické protilátky o žádoucí specificitě, afinitě a aktivitě, klony mohou být subklonovány pomocí procedury omezování zředění a pěstování s užitím standardních metod. Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice /Monoklonální protilátky; Zásady a praxe/ pp. 59-104 (Academie Press, 1986). Vhodná média kultury pro tento účel zahrnují například Dulbecco modifikované Eagleovo médium nebo RPMI-1640 médium. Buňky hybridomu mohou navíc být pěstovány in vivo jako ascity nádorů ve zvířatech.

Monoklonální protilátky sekretované subklony jsou vhodně odděleny z kultivačního média kultury, tělní tekutiny nebo séra pomocí konvenčních procedur imunoglobulinové purifikace jako takových, například protein A-Sepharosis, chromatografie hydroxylapatity, elektroforézní želé, dialýza nebo afinitní chromatografie.

DNA kódující monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu je snadno izolována a sekvencována s užitím konvenčních metod (například užitím zkoušek oligonukleotidů), jež jsou schopny specifického vázání s geny kódujícími těžké a lehké řetězy myších protilátek. Buňky hybridomu podle tohoto vynálezu slouží jako preferovaný zdroj takové DNA. Když už je jednou izolována. DNA může být umístěna do expresních vektorů, které jsou následně transfektovány do hostitelských buněk, jako například opičí buňky COS, buňky vaječníků čínského křečka (CHO) nebo buňky myelomu, které jinak neprodukují imunoglobulinový protein, aby bylo dosaženo syntézy monoklonálních protilátek v rekombinantních hostitelských buňkách.

DNA může být podle přání modifikována za účelem změny charakteru imunoglobulinu produkovaného jeho expresí. Příkladně humanizované formy myších protilátek jsou produkovány nahražením komplementaritu určující oblasti (CDR) variabilní domény myších protilátek za korespondující oblast lidských protilátek. V některých provedeních

-6CZ 291047 B6 aminokyselinové zbytky vybrané z úseků základní struktury (FR) myších protilátek jsou též nahrazovány korespondujícími aminokyselinovými zbytky lidských protilátek. Carter, et al.. Proč. Nat. Acad. Sci. 89:4285 (1992); Carter, et al., Bio Technology 10:163 (1992). Chimérické formy myších protilátek jsou také produkovány substitucí kódujících sekvencí pro vybrané domény lidských těžkých a lehkých konstantních řetězců na místě homologních myších sekvencí. Cabilly, et al„ US 4 816 567; Morrison, et al., Proč. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984).

Protilátky zahrnuté do rámce této práce zahrnují různé protilátky, příkladně chimérické (včetně humanizované) protilátky a hybridní protilátky obsahující imunoglobulinové řetězce, schopné vázání s hVEGF, hVEGFr, nebo komplex hVEGF-hVEGFr a jiné epitopy, než hVEGF (non-hVEGF).

Protilátky zahrnuté v této práci zahrnují všechny původní druhy a imunoglobulinové třídy (příkladně lgA, lgD, IgE, IgG a lgM) a podtřídy, jakož i protilátky fragmentů, příkladně Fab. F(ab')₂ a Fv), pokud jsou schopné vázat hVEGF, hVEGFr nebo komplex hVEGF-hVEGFr a jsou schopny antagonizovat biologickou činnost hVEGF.

V preferovaném užití tohoto vynálezu, monoklonální protilátky budou mít afinitu k imunizujícímu antigenu o velikosti nejméně 10⁹ litrů/mol, jak stanoveno příkladně Scatchardovou analýzou podle Munsona & Pollarda. Anal. Biochem. 102:220 (1980). Monoklonální protilátky tedy typicky inhibují mitogenní nebo angiogenní činnost hVEGF z nejméně 50%, raději více než 80% a vůbec nejlépe více než 90%, jak určeno příkladně pomocí rozboru přežití nebo proliferace buněk in vitro, příkladně jak popsáno v příkladu 2.

Pro některá terapeutická a diagnostická užití je žádoucí, aby monoklonální protilátky reagovaly s menším počtem a ne se všemi různými molekulárními formami hVEGF. Například může být žádoucí míti monoklonální protilátku, která je schopná se vázat specificky se 165-aminokyselinovou sekvencí hVEGF, ale nikoliv se 121- nebo 189- aminokyselinovou sekvencí hVEGF polypeptidů. Takové protilátky mohou být snadno identifikovány pomocí srovnávací zkoušky ELISA nebo srovnávací imunoprecipitací různých hVEGF polypeptidů.

V některých užitích je žádoucí mít k dispozici cytotoxické složky, konjugované na monoklonální protilátku specifickou vůči hVEGF nebo na hVEGFr. V těchto užitích slouží cytotoxin k zneškodnění nebo zabití buněk, které produkují nebo váží hVEGF nebo jeho receptor. Konjugace je zaměřena na buňky podle domén, které jsou schopné vázání s hVEGF, hVEGFr nebo s komplexem hVEGF-hVEGFr. Monoklonální protilátky, tedy ty, které jsou schopné vázání s hVEGF, hVEGFr, nebo s komplexem hVEGF-hVEGFr, jsou konjugovány na cytotoxiny. Podobně je i hVEGFr konjugován na cytotoxin. Zatímco monoklonální protilátky jsou v ideálním případě schopné neutralizovat činnost hVEGF samy o sobě (bez cytotoxinu), v tomto případě není nutné, aby monoklonální protilátky nebo receptor byly schopny něčeho více než vázání s hVEGF, hVEGFr nebo s komplexem hVEGF-hVEGFr.

V typickém případě cytotoxin je proteinový cytotoxin, tj. diftérie, ricin nebo Pseudomonas toxin, ačkoliv v případě určitých tříd imunoglobulinů může Fc doména monoklonální protilátky sama o sobě sloužit jako zdroj cytotoxinu (příkladně v případě protilátek lgG2, které jsou schopné fixovat komplement a účastnit se buněčné cytotoxicity /ADCC/ závislé na protilátkách). Cytotoxin ale nemusí být bílkovinný a může obsahovat chemoterapeutické prostředky dosud aktivně užívané, například pro účel léčení nádorů.

Cytotoxin je typicky vázán s monoklonální protilátkou nebo jejím fragmentem páteřní amidovou vazbou uvnitř (nebo v části nebo v celé) Fc doméně protilátky. Kde zdrojem funkce zaměření je hVEGFr, cytotoxická složka je nahrazena v kterékoliv doméně receptoru, který se neúčastní vazby s hVEGF, lépe, složka je substituována v místě transmembrány nebo na membráně a/nebo

-7CZ 291047 B6 na cytoplazmických doménách receptoru. Optimální místo substituce je určeno rutinním experimentováním a to nevyžaduje žádné geniální schopnosti.

Konjugáty, které jsou fúzní proteiny, mohou být snadno připraveny v rekombinantní buněčné kultuře expresí genu nesoucího kód konjugátu. Na druhé straně, konjugáty jsou tvořeny pomocí kovalentní křížové vazby cytotoxických složek s postranním řetězem aminokyselinového zbytku nebo s C-terminálním karboxylem protilátky nebo receptoru pomocí všeobecně známých metod per se, jako například výměna disulfidu nebo vazba pomocí spojení thioesteru s užitím například iminothiolátu a metyl-4-merkaptobutyrimadátu.

Monoklonální protilátky a hVEGFr, které jsou antagonisty hVEGF, jsou konjugovány do látek, které nemusí být ihned klasifikovány jako cytotoxiny v pravém slova smyslu, ale které zvýší aktivitu uvnitř těchto složení. Tak například monoklonální protilátky nebo hVEGFr schopné vázat se s hVEGF, hVEGFr nebo s komplexem hVEGF-hVEGFr jsou fúzovány s heterogenními polypeptidy, jako například virovými sekvencemi, buněčnými receptory, cytokinázami jako TNF, interferony, interleukiny a s peptidy, které jsou schopné prokoagulační aktivity a s dalšími biologicky nebo imunologicky aktivními polypeptidy. Taková spojení jsou snadno docílena pomocí rekombinačních metod. Obyčejně takové neimunoglobulinové polypeptidy jsou nahrazeny za konstantní domény, anti-hVEGF nebo anti-hVEGF-hVEGFr protilátkových komplexů nebo transmembránových a intracelulámích domén hVEGFr. Alternativně mohou nahradit variabilní doménu antigen vázajícího místa anti-hVEGF protilátky popsané zde.

V preferovaných provedeních neimunoglobulinné polypeptidy jsou spojeny nebo nahrazeny za konstantní domény protilátek popsaných zde. Bennet, et al„ J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991). Alternativně jsou substituovány za Fv protilátku popsanou zde za vytvoření chimérické polyvalentní protilátky, sestávající alespoň ze zůstávajícího vazebného místa pro antigen, který má specifítu k hVEGF, hVEGFr nebo komplexu hVEGF-hVEGFr a nahrazuje vazebné místo antigenu mající funkci nebo se specifitou odlišnou od této primární protilátky.

Monoklonální protilátky schopné vázat se na hVEGF, hVEGFr nebo hVEGF-hVEGFr komplex musí obsahovat pouze jedno vazebné místo pro vyjmenované epitopy, tj. obvykle jeden komplex lehkého-těžkého řetězce nebo jeho fragment. Nicméně takové protilátky mají rovněž doménu pro vazbu antigenu, které je schopná vázat epitop nebo jeho fragment, který se nenachází u žádného z hVEGF, hVEGFr nebo hVEGF-hVEGFr komplexu. Například nahrazují korespondující aminokyselinovou sekvenci nebo aminokyselinová rezidua přirozeného anti-hVEGF, antihVEGFr nebo anti-hVEGF-hVEGFr komplexu protilátky v místě určujícím komplementaritu, a je-li to nezbytné, soustavu reziduí protilátky, která je specifická pro jiný antigen než hVEGF, hVEGFr nebo hVEGF-hVEGFr komplex, atak bude tvořit mnohospecifickou protilátku skládající se z jednoho místa vážícího antigen, který je specifický pro non-hVEGF, hVEGFr nebo hVEGF-hVEGFr komplex antigenu ajiné vazebné místo antigenu mající specifítu pro non-hVEGF, hVEGF nebo komplex antigenu hVEGF-hVEGF. Tyto protilátky jsou bivalentní, ale mohou být polyvalentní. To záleží na počtu antigenů vazebného místa vlastních skupin protilátky, která je vybrána. Například protilátky třídy IgM budou polyvalentní.

V preferovaných provedeních jsou takové protilátky schopné vázat hVEGF nebo hVEGFr epitop a jednak (a) polypeptidy aktivní v krevních koagulátech, jako například bílkovinách C nebo tkáňových faktorech, (b) cytotoxické bílkoviny, jako například faktor nádorové nekrózy (TNF) nebo (c) ne-hVEGFr receptor buněčného povrchu, jako je CD4 nebo HER-2 receptor (Maddon, et al„ Cell 42:93 (1985), Coussens, et al.. Science 230:1137 (1985). Heterospecifické, multivalentní protilátky jsou konvenčně produkovány kotransformací hostitelské buňky s DNA kódující těžké a lehké řetězy obou protilátek a jejich získáním pomocí imunoafinitní chromatografie, nebo podobné, přičemž proporce exprimovaných protilátek mají vazebné

-8CZ 291047 B6 vlastnosti k požadovanému antigenu. Alternativně, takové protilátky jsou připravovány in vitro rekombinací specifických protilátek.

Monovalentní protilátky schopné vázat se na hVEGFr nebo hVEGF-hVEGFr komplex jsou obzvláště užitečné jako antagonisté hVEGF. Bez omezení tohoto objevu na jakýkoliv určitý mechanismus biologické aktivity je známo, že aktivace buněčných hVEGF receptorů pokračuje pomocí mechanismů, kde vázání hVEGF na buněčné hVEGF receptory indukuje shlukování těchto receptorů a zpětně aktivuje vnitrobuněčné receptory kinetické aktivity. Protože monovalentní anti-hVEGF receptory protilátek nemohou indukovat takové agregace, a proto nemohou 10 aktivovat hVEGF receptor tímto mechanismem, jsou ideálními antagonisty hVEGF.

Mělo by však být zmíněno, že tyto protilátky by měly být cílené proti hVEGF vazebnému místu receptorů, nebo jinak by měly být schopné blokovat vázání hVEGF na receptor hVEGF, stejně jako stéricky zabránit přístupu hVEGF k receptorů. Jak je popsáno na jiném místě, anti-hVEGFr 15 protilátky, které nejsou schopné blokovat vazbu hVEGF, jsou užitečné, když jsou konjugovány k neimunoglobulinovým složkám, jako jsou například cytotoxiny.

Metody pro přípravu monovalentních protilátek jsou dobře známy v technice. Například jedna metoda zahrnuje rekombinantní expresi imunoglobulinového lehkého řetězce a modifiikovaného 20 těžkého řetězce imunoglobulinu. Těžký řetězec je omezený obecně na kterémkoliv místě v Fc regionu, aby se tak zabránilo jeho křížové vazbě. Alternativně, relevantní cysteinová rezidua jsou nahrazována jinými aminokyselinovými rezidui, nebo jsou odstraněna, aby se zabránilo křížové vazbě. Metody in vitro jsou rovněž vhodné pro přípravu monovalentních protilátek. Například Fab fragmenty jsou připravovány enzymatickým štěpením neporušených protilátek.

Pro diagnostické aplikace budou protilátky nebo hVEGFr tohoto objevu typicky označeny detekovatelnými složkami. Detekovatelná složka může být látka, která je schopna produkovat buď přímo nebo nepřímo zjistitelný signál. Detekovatelná složka může být například radioizotop, jako ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S nebo ¹²⁵I, fluorescenční nebo chemiluminiscenční sloučenina, jako 30 fluorescein izothiokyanát, rhodamin nebo luciferin; radioaktivní izotopy, jako například ^l251, ³²P, ¹⁴C nebo ³H, nebo enzym, jako alkalická fosfátáza, beta-galaktosidáza nebo křenová peroxidáza.

Jakákoliv metoda, známá v profesi pro oddělenou konjugaci protilátky nebo hVEGFr ke zjistitelné složce, může být použita, včetně metod popsaných v Hunterovi et al„ Nátuře 144:945 35 (1962); David, et al„ Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al„ J. Immunol. Meth. 40:219 (1981) aNygren. J. Histochem, and Cytochem. 30:407 (1982)).

Protilátky a receptory tohoto objevu mohou být použity v jakékoliv známé metodě kvantitativního rozboru, jako analýzy kompetitivní vazby, přímé nebo nepřímé sendvičové 40 zkoušky a imunoprecipitační vazby. Zola, Monoclonal Antibodies; A Manual of Techniques, /Monoklonální Protilátky Manuál technik/, pp. 147-158 (CRC Press. Inc., 1987).

Kompetitivní vazebný test závisí na schopnosti značeného standardu (což může být hVEGF nebo imunologicky reaktivní část) s testovaným vzorkem (hVEGF) a schopností vázat se s omezeným 45 množství protilátky. Množství hVEGF v testovaném vzorku je nepřímo úměrné množství standardu, který je vázán s protilátkou nebo receptorem. Umožňuje to determinovat množství standardu, který bude vázán protilátkou nebo receptorem v nerozpustné formě před nebo po konkurenci. Takže standard a analyzovaný vzorek, které jsou vázány s protilátkou nebo receptorem, mohou být odstraněny konvenčním způsobem od standardu a analyzovaného vzorku, 50 které zůstaly nevázány.

Sendvičová zkouška zahrnuje užití dvou protilátek nebo receptorů, z nichž každý je schopný vazby s odlišnou imunogenní částí nebo epitopem bílkoviny, která má být detekována. V sendvičové zkoušce je testovaný vzorek nejdříve vázán s první protilátkou nebo receptorem,

-9CZ 291047 B6 který je imobilizován na pevném nosiči, a potom se druhá protilátka váže na analyzovaný vzorek a vytváří tak nerozpustný třídílný komplex. David & Greene. US Pat. 4 3761 10. Druhá protilátka nebo receptor mohou být značeny zjistitelnou složkou (přímá sendvičová zkouška) nebo mohou být měřeny za použití anti-imunoglobulinové protilátky, která je označena zjistitelnou složkou (nepřímá sendvičová zkouška). Například jeden druh testu je ELISA a v tomto případě je zjistitelnou složkou enzym.

Protilátky nebo receptory popsané zde jsou rovněž užitečné pro simulaci in vivo, kde protilátka nebo hVEGFr, označená zjistitelnou složkou, je podána pacientovi, preferovaně do krevního oběhu a přítomnost a lokalizace zjistitelné protilátky nebo receptoru u pacienta je analyzována. Tato simulační technika je užitečná například při přípravě a léčení novotvaru. Protilátka nebo hVEGFr je označen jakoukoliv látkou, která je zjistitelná v savcích, jednak pomocí nukleární magnetické rezonance, radiologicky nebo pomocí jiné detekční metody známé v profesi.

Kromě protilátek popsaných zde existují jiní užiteční antagonisté hVEGF, kteří zahrnují fragmenty a aminokyselinové sekvence přirozených hVEGF, které se váží do hVEGF receptoru, ale nevykazují biologickou aktivitu přirozených hVEGF. Mezi takové antagonisty patří například fragmenty a aminokyselinové sekvence, které zahrnují receptorovou vazebnou doménu hVEGF, ale chybí jim doména udělující biologickou aktivitu nebo jsou jinak defektní při aktivaci buněčných hVEGF receptorů, jako v případě fragmentů nebo aminokyselinových sekvencí, které jsou nedostačující vjejich schopnosti indukovat shlukování nebo aktivaci buněčných hVEGF receptorů. Termín vazebná doména receptoru se týká aminokyselinové sekvence v hVEGF, která se účastní vazby v hVEGF receptoru. Termín biologicky aktivní doména nebo doména udělující biologickou aktivitu se týká aminokyselinové sekvence v hVEGF, která nese částečnou biologickou aktivitu faktoru, jako je mitogenní nebo angiogenní aktivita.

Zjištění, že hVEGF má schopnost formovat komplex se dvěma nebo více hVEGFr molekulami na povrchu buněk ukazuje, že hVEGF má alespoň dvě určitá místa pro vázání s hVEGFr a že se váže do takových buněčných receptorů postupným způsobem, nejdříve na jednom místě a potom na druhém, dříve než nastane aktivace, způsobem jako růstový hormon, prolaktin apod. /viz příkladně Cunningham, et al., Science 254:821 (1991); deVos, et al., Science 255:306 (1992); Fuh, et al„ Science 256:1677 (1992)/. Podobně jsou antagonistické varianty hVEGF vybírány způsobem, kde jedno vazebné místo receptoru hVEGF (obyčejně místo zahrnuté v počátečním vázání hVEGF na hVEGFr) zůstává nezměněno (nebo, je-li změněno, je pozměněno ke zvýšení vazebnosti), zatímco vazebné místo druhého hVEGF receptoru je obyčejně pozměněno nekonzervativní aminokyselinovou substitucí nebo delecí, aby se toto vazebné místo stalo nefunkčním.

Vazebné domény receptoru v hVEGF a vazebné domény hVEGF v hVEGFr jsou determinovány metodami známými v oboru, zahrnujícími studia X-záření, mutační analýzy a studia vázání protilátek. Mutační přístupy zahrnují techniku náhodné saturační mutageneze, doplněné selekcí vzniklých mutantů a inzerční mutageneze. Jiná strategie, vhodná pro identifikaci vazebné domény receptoru v ligandech, je mutageneze snímkovaného alaninu. Cunningham, et al.. Science 244, 1081-1985 (1989). Tato metoda zahrnuje identifikaci oblastí, které obsahují nabité aminokyselinové boční řetězce. Nabitá rezidua v každém identifikovaném regionu (například Arg. Asp. His. Lys aGlu) jsou nahrazena (jedna oblast per mutantní molekuly) s Ala a je testována vazba receptoru na získané ligandy, aby se stanovil význam té které oblasti ve vazbě receptoru. Další úspěšná metoda pro lokalizaci vazebných domén receptoru je užití neutralizačních anti-hVEGF protilátek. Kim, et al., Growth Factors 7:53 (1992). Obyčejně kombinace těchto a podobných metod je použita pro lokalizaci domén zahrnutých ve vazbě receptoru.

Termín varianta aminokyselinových sekvencí, užitý ve vztahu k hVEGF, označuje polypeptidy, které mají aminokyselinovou sekvenci, která se liší do určité míry od

- 10CZ 291047 B6 aminokyselinové sekvence přirozených forem hVEGF. Běžně budou mít varianty aminokyselinových sekvencí antagonistů alespoň kolem 70 % homologii s alespoň jednou vazebnou doménou receptoru přirozeného hVEGF a přednostně alespoň 80 % nebo dokonce 90 % homologii s alespoň jednou vazebnou doménou přirozeného hVEGF. Varianty aminokyselinových sekvencí zahrnují substituce, delece a/nebo inzerce na určitých místech uvnitř aminokyselinových sekvencí přirozeného hVEGF, a to tak, že tyto varianty si zachovávají schopnost vázat se s hVEGF receptorem (a takto soutěžit s přirozenými hVEGF ve vazbě s hVEGF receptorem), ale selžou při indukci jednoho nebo více biologických účinků hVEGF, jako proliferaci endoteliálních buněk, angiogenezi nebo cévní permeabilitě.

Homologie je definována jako procento variant reziduí aminokyselinové sekvence, které jsou identické s rezidui v aminokyselinové sekvenci vazebné domény receptorů v přirozeném hVEGF po seřazení sekvencí a zavedení mezer (gaps), je-li to nezbytné k dosažení maximální procentní homologie. Metody a počítačové programy pro seřazení sekvencí jsou velmi dobře známy v profesi. Jeden z počítačovým programů je Align2, uvedený v Genentech. Inc., kteiý byl patentován s dokumentací v United States Copyright Office (Patentový Úřad Spojených Států Amerických), Washington. DC 20559, 10. prosince 1991. Substituční varianty jsou takové, které mají alespoň jeden aminokyselinový zbytek v přirozené sekvenci odstraněný a odlišnou aminokyselinu vloženou na zcela stejném místě. Tyto substituce mohou být jednoduché, kde pouze jedna aminokyselina v molekule byla nahrazena, nebo mohou být vícenásobné, kde dvě nebo více aminokyselin v téže molekule byly nahrazeny.

Inzerční varianty jsou takové, kde jedna nebo více inzertovaných aminokyselin jsou bezprostředně připojeny k aminokyselině na určitém místě v přirozeném pořadí. Bezprostřední připojení aminokyseliny znamená spojení k bud, to α-karboxy nebo aamino funkční skupině aminokyseliny.

Deleční varianty jsou takové, kde je odstraněno jedno nebo více aminokyselinových reziduí v přirozené sekvenci. Obyčejně deleční varianty budou mít jeden nebo více aminokyselinových zbytků, deletovaných v určitém regionu molekuly.

Fragmenty a varianty aminokyselinových sekvencí hVEGF jsou již připravovány metodami známými v oboru, jako například místně cílenou mutagenezí DNA kódující přirozený faktor. Mutovaná DNA je vložena do vhodného expresního vektor, u a hostitelské buňky jsou potom transfektovány rekombinatním vektorem. Rekombinantní hostitelské buňky jsou kultivovány v médiu vhodném pro tuto kulturu a požadovaný fragment nebo varianty aminokyselinových sekvencí z buněk příjemce jsou získány zpět z rekombinantních buněčných kultur pomocí chromatografických nebo jiných purifikačních metod.

Alternativně, fragmenty a aminokyselinové varianty hVEGF jsou připravovány in vitro; například proteolýzou přirozených hVEGF nebo syntézou za použití metod standardní syntézy peptidů na pevných fázích, jak bylo popsáno Merrifieldem (J. Am. Chem. Soc. 85:2149 /1963/), ačkoliv mohou být použity jiné ekvivalentní chemické syntézy známé v oboru. Syntéza na pevných fázích je iniciována z C-konce peptidu pomocí vazby chráněné α-aminokyseliny do vhodné pryskyřice. Aminokyseliny jsou vázány do peptidového řetězce pomocí technik, které jsou dobře známé v oboru tvorbou peptidových vazeb.

Antagonisté tohoto objevu, kteří se používají k terapeutickým aplikacím, jsou podáváni savcům, a to především člověku ve farmaceuticky přijatelných dávkách včetně těch, které mohou být člověku podány intravenózně jako bolus nebo plynulou infuzí v určitém časovém období, intramuskulárně, intraperitoneálně, intracerebrospinálně, subkutánně, intracelulámě, intrasynoviálně, intrathekálně, orálně, lokálně nebo inhalačními cestami. Tito antagonisté jsou rovněž vhodně podáváni intratumorálně, peritumorálně, intralesionálně nebo perilesionálně, s cílem

-11 CZ 291047 B6 dosáhnout lokálních, stejně jako celkových terapeutických účinků. Intraperitoneální způsob podání se jeví být obzvláště užitečný, jako například při léčbě nádoru vaječníku.

Takové dávky obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče, které jsou přirozeně netoxické a neterapeutické. Příklady takových nosičů jsou iontoměniče, oxid hlinitý, stearan hlinitý, lecitin, bílkoviny séra, jako sérový lidský albumin, tlumicí roztoky jako fosfáty, glycin, kyselina sorbová, sorban draselnatý, částečné glyceridové směsi saturovaných rostlinných mastných kyselin, voda, soli nebo elektrolyty, jako protaminsulfát, dvojsodný hydrogenfosfát, fosfát draselný, chlorid sodný, zinkové soli, koloidní oxid křemičitý, trisilikát hořečnatý, polyvinylpyrrolidon, sloučeniny na bázi celulózy a polyethylenglykol. Mezi nosiče topických forem nebo forem s gelovým základem patří polysacharidy, jako například karboxymethylcelulóza nebo methylcelulóza, polyvinylpyrrolidon, polyakryláty, polymery polyoxyethylenpolyoxypropylenových komplexů, polyethylenglykol, dřevito-voskové alkoholy. Konvenční depotní formy jsou vhodné pro všechna použití. Takové formy zahrnují například mikrokapsule, nano-kapsule, liposomy, náplasti, inhalační formy, nosní spreje, podjazyčné tablety a přípravky plynule uvolňované. Antagonisté budou obvykle připravováni v nosičích o koncentracích od 0,1 mg/ml do 100 mg/ml.

Vhodné příklady přípravků plynule uvolňovaných zahrnují semipermeabilní matrice pevných hydrofobních polymerů obsahujících tohoto antagonistu. Tyto matrice jsou ve formě tvarovaných výrobků, jako například filmu nebo mikrokapsulí. Příklady matric jsou polyestery, hydrogely (například poly(2-hydroxyethylmetakrylát), jak je popisuje Langer, et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167 (1981) a Langer. Chem. Těch. 12:98-105 (1982) nebo poly(vinylalkohol), polylaktidy (US Patent 3 773 919), kopolymery kyseliny L-glutamidové a gama ethyl Lglutamáty (Sidman, et al., Biopolymers 22:547 (1983), neodbourávající se ethylen-vinylacetát, (Langer, et al„ tamže), odbourávající se kopolymery kyseliny acido-glykolové, jako například Lupron Depot (mikrofery vhodné pro injekce složené zkopolymeru kyseliny acido-glykolové a acetátu leuprolidu) a kyseliny poly-D-(-)3hydroxymáselné. Zatímco polymery jako acetát ethylen-vinylu a acido-glykol kyseliny mléčné umožňují uvolnění molekul za více než sto dnů, určité hydrogely uvolňují proteiny během kratších časových úseků. Když zapouzdření antagonisté polypeptidů zůstávají v těle po dlouhou dobu, mohou denaturovat nebo se shlukovat jako výsledek expozice vlhku za teploty 37 °C, a to může vyvolat ztrátu biologické aktivity a možné změny v imunogenitě. Poměrné strategie mohou být navrženy ke stabilizaci, což záleží na zahrnutém mechanismu. Například, je-li zjištěno, že mechanismus agregace je intermolekulámí tvorba S-S vazby pomocí thio-sulfídové výměny, potom může být stabilizace dosaženo modifikováním sulfhydrylových reziduí, lyofilizací z kyselých roztoků, kontrolou obsahu vlhkosti, použitím vhodných přísad a vyvinutím specifických polymemích matricových přípravků.

Přípravky plynule uvolňovaných hVEGF antagonistů také zahrnují lipozomálně zachycené protilátky antagonistů a hVEGFr. Lipozomy obsahující tyto antagonisty jsou připraveny pomocí metod známých v profesi, jak je popsal Epstein, et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); US Pat. 4 485 045; U S Pat. 4 544 545. Obyčejně jsou tyto lipozomy malé (kolem 200-800 angstromů), unilamelámích typů, ve kterých je obsah lipidů větší než kolem 30 % mol, cholesterolu, což je proporce, která je přizpůsobena pro optimální HRG terapii. Lipozomy se zvýšeným oběhovým časem jsou patentovány v US Pat. 5 013 556.

Další využití tohoto objevu zahrnuje inkorporaci hVEGF antagonisty do tvarovaných výrobků. Takové výrobky mohou být užity při modulování růstu endoteliálních buněk a angiogenezi. Kromě toho invaze nádorů a metastáze může být modulována pomocí těchto výrobků.

Pro prevenci nebo léčení onemocnění bude přiměřené dávkování antagonisty záležet na typu onemocnění, které má být léčeno, jak je definováno výše, na závažnosti onemocnění, zda-li tyto

- 12CZ 291047 B6 protilátky jsou podávány pro prevenci nebo terapeutické účely, předchozí terapii, pacientově klinické minulosti a reakci na tohoto antagonistu a na uvážlivosti ošetřujícího lékaře. Antagonista je vhodně podán pacientovi najednou nebo během několika měsíců.

Uvedení hVEGF antagonisté jsou užiteční při léčení různých novotvarů a neneoplazických onemocnění a poruch. Novotvary a podobné případy, které jsou přístupné léčení, zahrnují karcinom prsu, karcinomy plic, karcinomy zažívacího traktu, karcinomy nosohltanu, karcinomy rekta, karcinomy jater, karcinomy vaječníku, blan, arthenoblastom, karcinomy krčku děložního, karcinomy sliznice děložní, hyperplazie sliznice děložní, endometrózy, fibrosarkomy, choriokarcinomy, nádory hlavy a krku, karcinomy esofagu, laryngitidní karcinomy, hepatoblastomy. Kapošiovy sarkomy, melanózy, karcinomy kůže, hemangiomy, dutinové hemangiomy, hemangioblastosomy, karcinomy pankreatu, retinoblastosomy, astrocytomy. Schwannowy glioblastomy, oligodendrogliomy, meduloblastomy, neuroblastomy, rabdomyosarkomy, osteogenické sarkomy, leiomyosarkomy, karcinomy močového traktu, karcinomy štítné žlázy. Wilmowy nádory, karcinomy ledvinových buněk, karcinomy prostaty, abnormální vaskulámí proliferaci spojenou s fakomatózami, edémy (například spojené s nádorem mozku) a Meigsův syndrom.

Neneoplazická onemocnění, která jsou přístupná léčení, zahrnují revmatické arttritidy, psoriázy, arterosklerózy, diabetes a ostatní retinopatie, retrolentální fibroplazie, neovaskulámí glaukomy, thyroidní hyperplazie (včetně Gravova onemocnění), komeální a jiné tkáňové transplantáty, chronické záněty, zápal plic, nefrotické syndromy, preeklampsie, vodnatelnost, perikardiální výpotek (spojené s perikarditis) a pleurální výpotek.

Počáteční dávkování antagonisty je od 1 pg/kg do 15 pg/kg, což záleží na typu a závažnosti onemocnění. Toto může být podáváno pacientovi najednou, nebo v několika dávkách, nebo pokračující infuzí. Typická denní dávka může být v rozmezí od 1 pg/kg do 100 pg/kg nebo více, což je závislé od výše uvedených faktorů. Pro opakované použití během několika dnů nebo déle, což opět záleží na podmínkách léčení, je opakováno tak dlouho, až nastane požadované potlačení symptomu onemocnění. Nicméně i jiné dávkování může přinést výsledky. Zlepšování této terapie je snadno zjistitelné pomocí konvenčních technik a analýz, zahrnujících například radiologické skenování nádoru.

Podle jiného provedení tohoto vynálezu efektivnost tohoto antagonisty při prevenci nebo léčení onemocnění může být zlepšena podáním tohoto antagonisty periodicky, nebo v kombinaci s jiným činidlem, které je účinné pro tyto účely, jako například faktor nádorové nekrózy (TNF), protilátka schopná inhibice nebo neutralizace angiogenní aktivity kyselých nebo bazických fibroblastových růstových faktorů (FGF) nebo hepatocytického růstového faktoru (HGF), protilátka schopná inhibice nebo neutralizace shlukovacích aktivit tkáňového faktoru, bílkovina C nebo bílkovina S (viz Esmon, et al., WO 91/01753, publikováno 21. února 1991) nebo jedno nebo více konvenčních terapeutických činidel, jako například alkylační činidla, antagonisté kyseliny listové, anti-metabolity kyseliny nukleové, antibiotika, analogy pyrimidinů, 5fluorouracil, purinové nukleosidy, aminy, aminokyseliny, triazolové nukleosidy nebo kortikosteroidy. Další činidla mohou být přítomná ve sloučeninách, které jsou podávány nebo mohou být podávány zvlášť. Rovněž je vhodné podávat antagonisty postupně nebo v kombinaci s radiologickým léčením, zahrnujícím ozařování nebo podávání radioaktivních substancí.

V jednom provedení vaskularizace nádoru je léčena kombinovanou terapií. Jeden nebo více hVEGF antagonistů jsou podávány pacientům s tumorem po terapeuticky aktivních dávkách, jak je určeno například pozorováním nekrózy tumoru nebo jeho metastatickým ohniskem. Tato terapie pokračuje, dokud další účinné efekty nejsou pozorovány nebo klinické vyšetření neukáže stopy tumoru nebo jakéhokoliv metastatického ohniska. Potom je TNF podáván buď samostatně nebo v kombinaci s dalšími pomocnými činidly, jako například alfa-, betanebo gamainterferony,

- 13 CZ 291047 B6 anti-HER2 protilátkami, heregulinem, protilátkou anti-heregulinu. Dfaktorem, interleukinem-1 (IL-1), interleukinem-2 (IL-2), granulocytomakrofágním koloniovým stimulačním faktorem (GMCSF) nebo činidly, která podporují mikrovaskulámí koagulaci v tumoru, jako například antibílkovina C protilátky, antibílkovina S protilátky nebo C4b vazebný protein (viz Esmon, et al., WO 91/01753, nebo teplo, nebo ozařování.

Vzhledem ktomu, že auxilámí činidla se budou lišit v jejich účinnosti, je žádoucí srovnat jejich vliv na tumor pomocí matricové filtrace konvenčním způsobem. Podávání antagonisty hVEGF a TNF je opakováno, dokud není dosažen požadovaný klinický efekt. Alternativně, antagonisté hVEGF jsou podáváni společně s TNF a volitelně s auxilámími činidly. V případech, kde pevné tumory jsou zjištěny na okrajích nebo jiných ložiscích citlivých na izolaci z obecných oběhů, jsou podávána terapeutická činidla popsaná v tomto článku do tohoto izolovaného tumoru nebo orgánu. V dalších provedeních FGF nebo antagonista růstového faktoru krevních destiček (PDGF), jako anti-FGF nebo anti-PDGF neutralizující protilátka, je podávána pacientovi ve spojení s antagonistou hVEGF. Léčení s antagonisty hVEGF může být optimálně odloženo během časových úseků hojení ran nebo požadované neovaskularizace.

Anti-hVEGF protilátky tohoto objevu jsou rovněž užitečné jako afinitní purifikační činidla. V tomto procesu jsou protilátky proti hVEGF imobilizovány na vhodném nosiči, jako je pryskyřice Sephadex nebo filtrační papír, za použití velmi dobře známých metod. Imobilizovaná protilátka je kontaktována se vzorkem obsahujícím hVEGF a je purifikována a poté je nosič omýván vhodným rozpouštědlem, které odstraní následně všechny složky ve vzorku, kromě hVEGF, který je vázán do imobilizované protilátky. Konečně je nosič omýván dalším přiměřeným rozpouštědlem, jako je glycerínový tlumicí roztok o hodnotě pH 5, 0, který bude uvolňovat hVEGF z této protilátky.

Následující příklady jsou pro ilustraci a nejsou míněny tak, aby limitovaly tento vynález jakýmkoliv způsobem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava anti-hVEGF monoklonální protilátky

Aby byl získán hVEGF konjugovaný pro imunizaci do hemokyaninu (KLH), rekombinantní hVEGF (165-aminokyselin), Leung, et al., Science 246:1306 (1989), musel být smíchán sKLH v poměru 4:1, v přítomnosti 0,05 % glutaraldehydu a tato sloučenina byla inkubována při teplotě místnosti za jemného míchání po dobu tří hodin. Tato sloučenina byla následně dialyzována na solném fosfátovém tlumicím roztoku (PBS) při 4 °C přes noc.

Skupina Balb/c myší byla imunizována čtyřikrát během dvou týdnů pomocí intraperitoneálních injekcí s 5 pg hVEGF konjugovaného do 20 pg KLH a dávky byly postupně zvyšovány se stejným množství hVEGF konjugovaným do KLH čtyři dny před buněčným splynutím.

Buňky sleziny z imunizovaných myší byly spojeny s P3X63Ag8U.l myelomovými buňkami. Yelton, et aL, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978), za použití 35 % glykolu polyetylénu (PEG), jak popsal Yarmush, et al., Proč. Nat. Acad. Sci. 72:2899 (1980). Hybridomy byly selektovány v HAT prostředí.

- 14CZ 291047 B6

Supernatanty z hybridomů buněčných kultur byly filtrovány pro získání antihVEGF protilátky pomocí analýzy ELISA, za použití mikrotitračních destiček potažených hVEGF. Protilátka vázaná na hVEGF byla v každém zásobníku determinována za použití alkalickou fosfatázou konjugovaného kozího protimyšího IgG imunoglobulinu a p-nitrofenylfosfátu, který sloužil jako chromogenní substrát. Harlow & Lané, Antibodies; A Laboratory Manual (Protilátky; Laboratorní příručka), pp. 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Hybridomové buňky, které byly určeny k produkci anti-hVEGF protilátek, byly klonovány pomocí částečného zředění a dva z těchto klonů, označené jako A4.6.1 a B.2.6.2, byly vybrány pro další studium.

Příklad 2

Charakteristika anti-hVEGF monoklonální protilátky

A. Specifičnost antigenu

Vazebná specifita anti-hVEGF monoklonálních protilátek produkovaných A4.6.1 aB2.6.2 hybridomy byla determinována pomocí vazby ELISA. Monoklonální protilátky byly přidány do zásobníků s mikrotitračními destičkami, které byly předtím potaženy hVEGF, FGF, HGF nebo piedermálním růstovým faktorem (EGF). Vázaná protilátka byla detekována s peroxidázou konjugovanou s kozím protimyším IgG imunoglobulinem. Výsledky této analýzy potvrdily, že monoklonální protilátky produkované hybridomy A4.6.1 a B.2.6.2 se váží na hVEGF, ale nejsou zjistitelné jinými bílkovinami růstových faktorů.

B. Mapování epitopu

Kompetiční vazba ELISA byla použita k determinaci, zda monoklonální protilátky produkované hybridomy A4.6.1 a B2.6.2 jsou vázány do stejných nebo jiných epitopů (míst) v hVEGF. Kim, et al„ Infect. Immun. 57:944 (1989). Jednotlivé neznačené anti-hVEGF monoklonální protilátky (A4.6.1 nebo B.2.6.2) nebo irelevantní anti-HGF protilátky (lgGl izotopy) byly přidány do zásobníků s mikrotitračními destičkami, které byly předtím potaženy hVEGF. Poté byly přidány biotinylované anti-hVEGF monoklonální protilátky (BIO-A4.6.1 nebo BIO-B2.6.2). Poměr biotinylované protilátky a neznačené protilátky byl 1:1000. Vázání biotinylovaných protilátek bylo znázorněno přidáním peroxidáz konjugovaných s avidinem a následně o-fenylenediamin dihydrochloridem a peroxidem vodíku. Barevná reakce indikující množství vázané biotinylované protilátky byla zjištěna měřením optické denzity (O.D.) při vlnové délce 495 nm.

Jak je znázorněno v grafu číslo 1, v každém případě bylo vázání biotinylované anti-hVEGF protilátky inhibováno odpovídající neznačenou protilátkou, ale ne jinou neznačenou anti-hVEGF protilátkou nebo anti-HGF protilátkou. Tyto výsledky ukazují, že monoklonální protilátky, produkované hybridomy A4.6.1 a B2.6.2, se váží do různých epitopů uvnitř hVEGF.

C. Izotypy

Izotypy monoklonálních protilátek anti-hVEGF produkované pomocí hybridomů A4.6.1 a B2.6.2 byly zjištěny pomocí metody ELISA. Vzorky kultivačního prostředí (supematant), ve kterém každý hybridom byl produkován, byly přidány do zásobníků mikrotitračních destiček, které byly předem potaženy hVEGF. Zachycení anti-hVEGF monoklonálních protilátek bylo provedeno inkubací s odlišnou izotypu-specifickou alkalickou fosfatázou konjugovanou s kozími protimyšími imunoglobuliny a vazba těchto konjugovaných protilátek na anti-hVEGF monoklonální protilátky byla zjištěna přidáním p-nitrofenyl fosfátu. Barevná reakce byla měřena při 405 nm s pomocí metody ELISA.

- 15CZ 291047 B6

Pomocí této metody byly izotypy monoklonální protilátky produkované oběma A4.6.1 a B2.6.2 hybridomy určeny jako IgGl.

D. Vazebná afinita

Afinita anti-hVEGF monoklonálních protilátek produkovaných A4.6.1 aB2.6.2 hybridomy hVEGF byla zjištěna pomocí kompetiční vazebné analýzy. Předurčená suboptimální koncentrace monoklonální protilátky byla přidána ke vzorkům obsahujícím 20 000 až 40 000 cpm ¹²⁵I-hVEGF (1 až 2 ng) a různá známá množství neznačeného hVEGF (1 až 1000 ng). Za jednu hodinu (teplota místnosti) bylo přidáno 100 μΐ kozího-protimyšího Ig antiséra (Pel-Freez. Rogers. AR USA) a tyto sloučeniny byly inkubovány další hodinu při teplotě místnosti. Komplexy protilátky a vázané bílkoviny (imunitní komplex) byly vysráženy přidáním 500 μΐ 6 % polyethylenglykolu (PEG, molekulová hmotnost 8000) při 4 °C a následně centrifugovány při 2000 x g po dobu 24 minut a 4 °C. Množství ^12:>I-hVEGF vázaného k anti-hVEGF monoklonální protilátce v každém vzorku bylo determinováno počítáním kuliček v gama počítadle.

Afinitní konstanty byly vypočítávány ze získaných dat pomocí Scatchardovy analýzy. Afinita anti-hVEGF monoklonální protilátky produkované hybridomem A4.6.1 byla stanovena 1,2 χ 10⁹ 1/mol. Afinita anti-hVEGF monoklonální protilátky produkované hybridomem B2.6.2 byla stanovena 2,5 χ 10⁹ 1/mol.

E. Inhibice hVEGF-mitogenní aktivity

Endoteliální buňky kůry nadledvinek skotu (ACE) Ferrara, et al„ Proč. Nat. Acad. Sci. 84:5773 (1987) byly kultivovány při denzitě 10⁴ buněk/ml ve 12 multizásobníkových plotnách a 2,5 ng/ml hVEGF bylo přidáno do každého zásobníku, a to buď za přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací antihVEGF monoklonálních protilátek produkovaných hybridomy A4.6.1 nebo B2.6.2 nebo irelevantními anti-HGF monoklonálními protilátkami. Po pětidenní kultivaci byly buňky v každém zásobníku počítány, pomocí Coulterova počítadla. Jako kontrolní vzorek byly ACE buňky kultivovány za nepřítomnosti hVEGF.

Jak je ukázáno v grafu číslo 2, obě anti-hVEGF monoklonální protilátky inhibovaly schopnost přidaného hVEGF podpořit růst nebo přežití hovězích ACE buněk. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem A4.6.1 kompletně inhibovala mitogenní aktivitu hVEGF (více než 90 % inhibicí), zatímco monoklonální protilátka produkovaná hybridomem B2.6.2 pouze částečně inhibovala mitogenní aktivitu hVEGF.

F. Inhibice vazby hVEGF

Hovězí ACE buňky byly kultivovány při denzitě 2,5 χ 10⁴ buněk/0,5 ml/zásobník ve 24 zásobnících s mikrotitračními destičkami v Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) obsahujícím 10 % telecí sérum, 2 mM glutaminu a 1 ng/ml bazického fíbroblastového růstového faktoru. Buňky byly kultivovány přes noc a poté byly omývány jednou ve vázacím tlumicím roztoku (stejný obsah DMEM a média F12, plus 25 mM HEPES a 1 % hovězího albuminového séra) při 4 °C.

Poté 12 000 cpm ¹²⁵I-hVEGF (přibližně 5 χ 10⁴ cpm/ng/ml) bylo preinkubováno během 30 minut s 5 pg anti-hVEGF monoklonální protilátky produkované hybridomem A4.6.1, B2.6.2 nebo A2.5.1 (celkový obsah 250 μΐ) a tato sloučenina byla přidána do hovězích ACE buněk v mikrotitračních destičkách. Buňky byly inkubovány po dobu 3 hodin při 4 °C, rozpuštěny přidáním 0,5 ml 0,2N NaOH a počítány v gama počítadle.

- 16CZ 291047 B6

Jak je ukázáno v grafu číslo 3 (horní), anti-hVEGF monoklonální protilátky produkované hybridomy A4.6.1 a B2.6.2 inhibovaly vázání hVEGF do hovězích ACE buněk. Naopak antihVEGF monoklonální protilátky' produkované hybridomem A2.6.1 neměly žádný efekt na vázání hVEGF do hovězích ACE buněk. Souhlasně s výsledky získanými v buněčné proliferační analýze, která je popsaná výše, monoklonální látky produkované hybridomem A4.6.1 inhibovaly vázání hVEGF ve větším rozsahu než monoklonální protilátky produkované hybridomem B2.6.2.

Jak je ukázáno v grafu číslo 3 (dolní), monoklonální protilátky produkované hybridomem A4.6.1 zcela inhibovaly vázání hVEGF s hovězími ACE buňkami při molámím poměru 1:250 hVEGF a protilátky.

G. Křížová reaktivita s jinými VEGF izoformami

Při potřebě zjistit, zda anti-hVEGF monoklonální protilátka produkovaná hybridomem A4.6.1 je reaktivní se 121- a 189-aminokyselinovým hVEGF, byla protilátka analyzována pro její schopnost imunoprecipitace těchto polypeptidů.

Lidské buňky 293 byly transfektovány pomocí vektorů obsahujících nukleotid kódující sekvenci 121- a 189-aminokyselinových hVEGF polypeptidů, jak popsal Leung, et al., Science 246:1306 (1989). Dva dny po přenosu byly buňky opět přeneseny do média bez cysteinu amethioninu. Buňky byly inkubovány po dobu 30 minut v tomto médiu, potom bylo přidáno 100 pCl/ml ³⁵S-methioninu a ³⁵S-cysteinu do tohoto média. Takto byly buňky inkubovány další dvě hodiny. Označení bylo provedeno přenesením buněk do média bez séra a inkubováním tři hodiny. Buněčné kultury byly sesbírány a buňky byly lyžovány inkubováním po dobu 30 minut v lyžujícím tlumicím roztoku (150 mM NaCl, 1 % NP40,0,5 % deoxycholátu, 0,1 dodecylsulfátu sodného (SDS), 50 mM Tris, pH 8,0). Buněčný odpad byl odstraněn z lyzátů centrifugací při 200 x g po dobu 30 minut.

500 μΐ vzorku buněčných kultur a buněčných lyzátů bylo inkubováno se 2 μΐ hybridomu A4.6.1 protilátky (2,4 mg/ml) po dobu 1 hodiny při 4 °C a následně byly inkubovány s 5 μΐ králičího protimyšího IgG imunoglobulinu po dobu 1 hodiny při 4 °C. Imunokomplexy ³⁵S-hVEGF a anti-hVEGF monoklonální protilátky byly vysráženy proteinem A Sepharosa (Pharmacia) a potom vystaveny SDS-12% polyakrylamidové gelové elektroforéze za redukovaných podmínek. Gel byl vystaven X-záření pro analýzu imunoprecipitačních, radioaktivních proteinů pomocí rentgenového snímku.

Výsledky této analýzy indikují, že anti-HVEGF monoklonální protilátka produkovaná hybridomem A4.6.1 byla křížově reaktivní s oběma formami 121- a 189-aminokyselinového hVEGF.

Příklad 3

Příprava hVEGF receptoru - IgG směsi proteinů

Kódující sekvence nukleotidů a aminokyselin fit hVEGF receptoru jsou popsány v Shibuya, et al., Oncogene 5:519-524 (1990). Kódující sekvence extracululámích domén fit hVEGF receptoru byla fúzována do kódující sekvence lidského IgGl těžkého řetězce v dvoustupňovém procesu.

Místně cílená mutageneze byla použita k zavedení BstBl do DNA kódující fit v místě 5' do kodonu 759 aminokyseliny fit a ke konverzi jedinečného BstEll restrikčního místa v plazmidu pBSSK-FC, Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:2306023067 (1991) do místa BstBl. Modifikovaný plazmid byl štěpen pomocí EcORI a BstBl a výsledný fragment DNA plazmidu

-17CZ 291047 B6 byl spojen spolu s EcoRI-BstBl fragmentem fit DNA kódujícím extracelulámí doménu (aminokyseliny 1-758) fit hVEGF receptoru.

Výsledná látka byla štěpena pomocí Clal aNotl, aby se získal fragment o hmotnosti přibližně 3,3 kb, který byl potom vložen do mnohonásobného klonovacího místa savčího expresního vektoru pHEBO 2 (Leung, et al., Neuron 8:1045 /1992/) pomocí vazby. Konce tohoto 3,3 kb fragmentu jsou modifikovány například přidáním článků, aby se získalo vložení tohoto správně orientovaného fragmentu do vektoru a byly zajištěny správné orientace pro expresi.

Savčí buňky příjemce (například CEN4 buňky /Leung, et al., tamže/) jsou přeneseny splazmidem pHEBO2 obsahujícím fit vložený pomocí elektroporace. Transfektované buňky jsou kultivovány v médiu obsahujícím kolem 10 % zárodečného hovězího séra, 2 mM glutaminu, antibiotika. Kolem 75 % tohoto výtěžku bylo přeneseno do média neobsahujícího sérum. Médium je připravováno po dobu 3-4 dnů před použitím a flt-IgG směs proteinů je purifikována z média pomocí chromatografie na bílkovinné A matrici, jak je popsáno v Bennett, et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991).

Příklad 4

Inhibice tumorového růstu s hVEGF antagonisty

Různé buňky lidských nádorů rostoucích v kulturách byly analyzovány pro produkci hVEGF pomocí ELISA. V nádorových buňkách vaječníků, plic, tlustého střeva, žaludku, mléčné žlázy a mozku bylo zjištěno, že produkují hVEGF. Tři buněčné linie, které produkují hVEGF, NEG 55 (často označovaný jako G55) (linie lidských gliomických buněk získaná od Dr. M. Westphala, oddělení neurochirurgie. Univerzitní nemocnice Eppendor. Hamburg. Německo, často označované jako G55), A-673 (linie lidských rabdomyosarkomatických buněk získaná z Američan Type Culture Collection /Sbírka kultur amerického typu /ATCC/, Rockville. Maryland. USA 20852, jako buněčná linie číslo CRL 1598) aSK-LMS-1 (linie leiomyosarkomatických buněk získaná z ATCC jako linie buněk číslo HTB 88), byly použity k dalšímu studiu.

K pokusům byly použity myši beige/nude staré šest až deset týdnů (Charles River Laboratory. Wilmington. Massachusetts. USA), které byly očkovány podkožně 1 až 5 x 10⁶ nádorovými buňkami v 100-200 μΐ PBS. V různých časových obdobích, když počal růst tumoru myší, byly očkovány intraperitonálně jednou nebo dvakrát týdně různými dávkami A4.6.1 anti-hVEGF monoklonální protilátky, irelevantní anti-gp 120 monoklonální protilátky (5 BG) nebo PBS. Velikost tumoru byla měřena každý týden a nádory byly vyňaty a váženy na konci studia.

Vlivy různých hmotností A4.6.1 anti-hVEGF monoklonální protilátky na růst nádorů NEG55 v myších jsou znázorněny v grafech Číslo 4 a 5. Graf číslo 4 ukazuje, že myši, kterým bylo podáváno 25 pg nebo 100 pg A4.6.1 anti-hVEGF monoklonální protilátky počínaje 1 týden po očkování buňkami NEG55, měly výrazně redukovaný poměr růstu nádoru, ve srovnání s myšmi, kterým byla podávána buď irelevantní protilátka nebo PBS. Graf číslo 5 ukazuje, že pět týdnů po očkování buňkami NEG55 byla velikost tumoru v myších, kterým byla podána A4.6.1 anti-hVEGF protilátka, o přibližně 50 % (v případě myší, kterým byla podána dávka 25 pg protilátky) až 85 % (v případě myší, kterým byla podána dávka 100 μg protilátky) menší než velikost tumoru v myších, kterým byla podána irelevantní protilátka nebo PBS.

Efekt užití A4.6.1 anti-hVEGF monoklonální protilátky na růst SK-LMS-1 nádoru u myší je ukázán v grafu číslo 6. Pět týdnů po očkování SK-LMS-1 buňkami průměrná velikost nádoru

-18CZ 291047 B6 u myší, kterým byla podávána A4.6.1 anti-hVEGF protilátka byla o přibližně 75% menší než velikost nádorů u myší, kterým byla podávána irelevantní protilátka nebo PBS.

Efekt podávání A4.6.1 anti-hVEGF monoklonální protilátky na růst A673 nádoru u myší je ukázán v grafu číslo 7. Čtyři týdny po očkování A673 buňkami byla průměrná velikost tumoru v myších, kterým byla podávána A4.6.1 anti-hVEGF protilátka o přibližně 60 % (v případě myší, kterým byla podávána dávka 10 pg protilátky) až o přibližně 90 % (v případě myší, kterým byla podávána dávka 50 až 400 pg protilátky) menší než velikost nádoru u myší, kterým byla podávána irelevantní protilátka nebo PBS.

Příklad 5

Analýza přímého účinku anti-hVEGF protilátky na růst nádorových buněk v kultuře

Buňky NEG55 lidského glioblastomu nebo rabdomyosarkomové A673 buňky byly kultivovány při denzitě 7 x 10³ buněk/zásobník v multizásobníkových plotnách (12 zásobníků/ploten) vF12/DMEM médiu obsahujícím 10% fetální telecí sérum, 2 mM glutaminu a antibiotika. Protilátka A4.6.1 anti-hVEGF byla následně přidána do buněčných kultur až do konečné koncentrace 0 až 20,0 pg protilátky/ml. Po pěti dnech kultivace buněk v zásobnících byly buňky odděleny pomocí trypsinu a počítány v Coulterově počítadle.

Grafy číslo 8 a 9 ukazují výsledky těchto studií. Jak je zjevné. A4.6.1 antihVEGF protilátka neměla žádný významný efekt na růst NEG55 nebo A673 buněk v kultuře. Tyto výsledky ukazují, že A4.6.1 anti-hVEGF protilátka není cytotoxická a naznačují, že pozorované protinádorové účinky protilátek jsou způsobeny jejich inhibicí VEGF zprostředkované neovaskularizací.

Příklad 6

Vliv anti-hVEGF protilátky na chemotaxi endoteliálních buněk

Chemotaxe endoteliálních buněk a ostatních buněk, včetně monocytů alymfocytů, hrají významnou roli při patogenezích revmatických artritid. Migrace a proliferace endoteliální buňky doprovázejí angiogenezi, která nastane v revmatickém synoviu. Vaskularizovaná tkáň napadne a rozruší artikulární chrupavku.

K určení, zda-li hVEGF antagonisté interferují s tímto procesem, jsme analyzovali vliv A4.6.1 anti-hVEGF protilátky na endoteliální buněčné chemotaxe stimulované synoviálním roztokem z pacientů, kteří měli revmatickou artritidu. Jako kontrolu jsme analyzovali vliv A4.6.1 antihVEGF protilátky na chemotaxe endoteliálních buněk stimulované synoviálním roztokem z pacientů, kteří trpěli osteoartritidou (angiogeneze, která se vyskytuje v revmatických artritidách se nevyskytuje v osteoartritidách).

Chemotaxe endoteliálních buněk byla analyzována za použití modifikovaných Boydenových komor podle zaběhnutých procedur. Thompson, et al., Cancer Res. 51.:2670 (1991); Phillips, et al., Proč. Exp. Biol. Med. 197:458 (1991). Přibližně 10⁴ lidských buněk z pupečních žil bylo navázáno na gelem potažené filtry (velikost pórů byla 0,8 mikronu) ve 48 zásobnících mnohozásobníkových mikrokomor v kultivačním médiu obsahujícím 0,1 % fetálního hovězího séra. Po dvou hodinách byly komory invertovány a vzorky testovány (revmatický artritidní synoviální roztok), osteoartritický synoviální roztok, základní FGF (bFGF) do konečné koncentrace 1 pg/ml

- 19CZ 291047 B6 nebo PBS a A4.6.1 anti-hVEGF protilátky (do konečné koncentrace 10 pg/ml) byly přidány do zásobníků. Po dvou až čtyřech hodinách buňky, které migrovaly, byly obarveny a počítány.

Graf číslo 10 ukazuje průměrné výsledky těchto studií. Hodnoty, ukázané ve sloupci označeném synoviální roztok a ukázané na konci strany pro kontrolní vzorky, jsou průměrná množství endoteliálních buněk, které migrovaly v přítomnosti synoviálního roztoku, bFGF nebo pouze PBS. Hodnoty ve sloupci označeném synoviální roztok + mAB VEGF jsou průměrná množství endoteliálních buněk, které migrovaly za přítomnosti synoviálního roztoku a přidané A4.6.1 antihVEGF protilátky. Hodnoty ve sloupci označeném % suspenze označují procentní snížení 10 migrace buněk v synoviálním endoteliálním roztoku jako výsledek přidání anti-hVEGF protilátky. Jak je ukázáno, anti-hVEGF protilátka výrazně inhibuje schopnost revmatoidního artritidního synoviálního roztoku (53,40 průměrná procentní inhibice), ale ne osteoartritidního synoviálního roztoku (13,64 průměrná procentní inhibice) k indukci migračních endoteliální m buněk.

Claims (11)

1. Použití hVEGF antagonisty, kterým je anti-hVEGF protilátka pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny.

2. Použití hVEGF antagonisty podle nároku 1, kterým je anti-hVEGF protilátka.

3. Použití hVEGF antagonisty podle nároku 1 nebo 2, kde protilátka je monoklonální protilátka.

4. Použití hVEGF antagonisty podle kteréhokoliv nároku 1 až 3, kde protilátka je humanizo30 váná.

5. Použití hVEGF antagonisty podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde protilátka je v množství dostatečném ke snížení velikosti nádoru.

35

6. Použití hVEGF antagonisty podle nároku 5, kde nádorem je maligní pevný nádor.

7. Použití hVEGF antagonisty podle nároku 5 nebo 6, kterým je protilátka snižující velikost nádoru inhibicí VEGF-zprostředkované neovaskularizace.

40

8. Použití hVEGF antagonisty podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde protilátka je vázaná k cytotoxické složce.

9. Použití hVEGF antagonisty podle nároku 8, kde cytotoxická složka je proteinový cytotoxin nebo Fc doména monoklonální protilátky.

10. Použití hVEGF antagonisty podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde protilátka je sériová nebo kombinovaná s dalším činidlem pro léčení rakoviny.

11. Použití hVEGF antagonisty podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde protilátka je 50 sériová nebo kombinovaná s rentgenologickým léčením.