TW201202425A - Production of viral components - Google Patents

Description

201202425 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明屬於醫藥工業領域且係關於一種繁殖流感病毒之 方法及該方法在流感疫苗製造中之用途。此外，本發明係 關於一種測試添加極低感染性病毒粒子數目/細胞（MO:[)之 預選病毒株至用於繁殖病毒粒子之細胞培養組合物是否致 使病毒粒子及/或加工病毒粒子產量增加的方法》 【先前技術】 疫苗係用於保護群體免於常見致病威脅，對於降低疾病 負擔及增加預期壽命產生極大影響。疫苗之有效使用主要 依賴於能夠快速產生大量疫苗材料及增加可用疫苗劑量 數，其中不同疫苗材料為獲得可接受之產量需要不同生長 條件》 在此方面，專利申請案US 2006/0188977 Al(2006年8月 24 曰；「Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses」）尤其描述在細胞培養物中製造疫苗材料（諸如病 毒）。在本文中，在培養基中繁殖MDCK細胞，用病毒感染 且培養。之後分離所複製之病毒。在約0.0001至約10之 MOI下，用病毒感染細胞。

Govorkova等人(「African Green Monkey Kidney (Ve:ro)

Cells Provide an Alternative Host Cell System for Influenza A and B Viruses」，Journal of Virology, 1996年 8 月，第 5519-5524頁）展示非洲綠狼腎細胞株（African green monkey kidney cell line，Vero)與馬丁達比犬腎（Madin-Darby 154987.doc 201202425 canine kidney，MDCK)細胞同樣適用作生產複製流感病毒 之宿主細胞系統，因為Vero細胞株亦提供足夠數量之A型 及B型流感病毒以滿足出現大流行病時所面臨之疫苗需 求。為了用所測試之流感病毒感染兩種不同細胞株，用範 圍介於每個細胞0.01至0.001 PFU之不同感染倍率 (multiplicity of infection，MOI)感染細胞株。

Ozaki等人（「Generation of High-Yielding Influenza A Viruses in African Green Monkey Kidney (Vero) Cells by Reverse Genetics」，Journal of Virology，2004年 2月，第 1851-1857頁）描述經改質之流感病毒主要病毒株，其在 Vero細胞株中具有經改良之病毒拯救及生長性質。其可展 示經改良之性質為藉由PR8 NS基因取代Vero適應重配病毒 (Vero-adapted reassortant virus)之PR8 NS基因（Eng53/v-a) 所介導。藉由用Vero適應重配病毒以0.01之感染倍率 (MOI)感染Vero細胞來檢定病毒複製。

Voeten 等人（ 「 Characterization of high-growth reassortant influenza A viruses generated in MDCK cells cultured in serum-free medium」，Vaccine 17，1999，1942-1950)描述連續細胞株（MDCK-SF1)之用途，其能夠在無胎 牛血清之情況下生長以產生高生長重配A型流感病毒，該 等病毒可用於在此等細胞中產生病毒抗原。重配病毒株之 高生長表型可藉由比較由感染產生之重配病毒與相應野生 病毒株之血球凝集單位（hemagglutinating unit，HAU)來證 明。在96孔板（200微升/孔’細胞密度為約2χ105個細胞/毫 154987.doc 201202425 升）中以範圍介於0.001至0.000001之不同MOI進行細胞感 染。作者證明高生長表型可分別歸結於高生長實驗室病毒 株 PR 34 或 HK 68 之基質蛋白（matrix protein)。Voeten 等人 以血球凝集單位（HAU)量測病毒繁殖動力學。然而，此測 試以及各別實驗中使用低數目細胞（此測試在96孔板中約 200 μΐ體積之培養基中進行，其含有密度為約〇.2xl06個細 胞/毫升之細胞）產生不展現顯著性之不準確結果。

Audsley 及 Tannock(「The growth of attenuated influenza vaccine donor strains in continuous cell lines」，Journal of Virological Methods 123 (2005)，187-193)在其研究中比較 三種俄羅斯減毒活供體病毒株（Russian live attenuated donor strain)在不同MOI下於MDCK及Vero細胞培養物中之 生長特性。在此研究中，其展示所有供體病毒株生長之最 佳 MOI為 0.01。 EP 2 022 849 A1係關於一種大規模製造流感病毒之方 法，其描述組織培養物可以0.00001至0.01之MOI感染。 WO 97/38094係關於高生長流感病毒株之複製，其中使 哺乳動物細胞感染該等病毒株且培養，同時維持胰蛋白酶 濃度在0.05-1.0pg/ml之範圍内。

Brands等人（「InfluvacTC: A Safe Madin Darby Canine Kidney (MDCK) Cell Culture-Based Influenza Vaccine」， Developments in Biological Standardization,第 98卷，1999 年1月1日）描述流感病毒疫苗InfluvacTC之總體製造方法。 其中，MDCK 實用種毒株（working seed virus’ WSV)由 154987.doc 201202425 WHO指定之雞蛋適應流感病毒以低感染倍率於無血清培養 基中之MDCK細胞培養物中製造。此外，描述疫苗製造期 間所執行的後續加工（用病毒感染細胞、收集含有病毒之 培養基、病毒純化、將病毒加工成疫苗），以及已採用之 安全措施（病毒不活化（inactivation)、病毒清除、假定存在 宿主細胞污染物之測試）。Brands等人完全未提及特定 MOI。 WO 2008/043805係關於大環内酯多烯抗生素或其衍生物 或類似物之用途，其係作為培養補充劑用於病毒繁殖，以 便增加連續細胞株中所繁殖之病毒的產量且提高其品質。 WO 2008/043805之圖1展示，對於所測試之各MOI而言， 在病毒生長培養基中存在兩性黴素B對病毒複製具有正面 效應。WO 2008/043805揭示藉由使用大環内酯多烯抗生素 或其衍生物或類似物，可使用0.001或0.0001以至0.00001 或甚至更低之MOI感染細胞。WO 2008/043805例如未提及 病毒添加時細胞培養物中之細胞量，以及在病毒添加後之 特定時間點下確定之活細胞密度。 WO 96/15232係關於一種確保人類流感病毒在哺乳動物 細胞株中以低感染倍率複製之方法，其中維持該培養基中 始終最小的膜蛋白酶濃度（約0.05 pg/ml)。根據WO 96/15232，測試展示當MOI介於每個細胞約ΙχΙΟ·5與lxlCT6 TCID50之範圍時，約0.1 gg/ml之胰蛋白酶濃度最佳，且在 每個細胞約5 X 10·7 TCID5〇下獲得令人滿意的結果。WO 96/1 5232既未揭示例如病毒添加之時間點下細胞培養物中 154987.doc 201202425 之細胞量’亦未揭示病毒添加後之特定時間點下活細胞之 密度。 儘管上文描述用於在細胞培養物中繁殖病毒粒子之高生 長病毋株及細胞株以及疫苗製造方法，但仍需要且因此存 在改良病毒組分製造方法及改良用於製造病毒組分之細胞 培養物的目標。 【發明内容】 本發明挺供以下態樣、標的物及較佳實施例，其分別單 獨或組合採用，有助於達成本發明之目標： (1) 一種繁殖包含免疫原性血球凝集素（HA)之流感病毒 .的方法，其中細胞在第一步驟中培養於細胞培養物中且其 中隨後在第二步驟中添加感染性流感粒子（諸如A型、15型 或C型流感病毒）至該細胞培養物，其中用於培養細胞之培 養基在病毒添加步驟之前或期間經置換為與先前用於培養 細胞之培養基的重量莫耳滲透濃度（〇Sm〇laHty)相比且有至 少帆、較佳至少85%、更佳至少9Q%且最佳至少抓之重 量莫耳滲透濃度的培養基，且其與先前用於培養細胞之培 養基相比不具有顯著較低量，較佳不少於5〇%、更佳不少 於帆、甚至更佳不少於65%且最佳不少於75%之蛋白 質、生長因子及/或無機鹽總量，其中 丹1f在病毒添加時細胞 培養物中之細胞量為至少〇.5xl()6個細胞/毫升，其中在病 毒添加後12至36小時内，活細胞之宓疮 肥之苍度不低於感染時細胞 密度之40%， 其中在病毒添加步驟期間所添加m病毒粒子總數/ 154987.doc 201202425 細胞（感染倍率，MOI)小於10_5» 在本發明之含義中，表述「用於培養細胞之培養基」、 用於培養細胞之細胞培養基」或「細胞培養基」表示在 細胞培養物接種病毒之前所用之培養基。置換該細胞培養 基之培養基（置換培養基）由術語「用於繁殖病毒之培養 基J 、 「病毒培養基」或「病毒繁殖培養基」表示。其為 病毒繁殖階段所用之培養基。 在一實施例中’用於培養細胞之細胞培養基及用於繁殖 病毒之培養基（亦即置換培養基）僅在存在/不存在BSA(牛 血清白蛋白）上有差異（其他成分及成分之量基本上相同， 亦即所有個別物質之量差異不超過30%，較佳不超過 20%) 〇 在另一實施例中，將蛋白質豐富的培養基用作用於培養 細胞之細胞培養基且蛋白質缺乏的培養基用作用於繁殖病 毒之培養基。術語「蛋白質豐富」及「蛋白質缺乏」定義 蛋白質總量在「蛋白質豐富的培養基」中相比「蛋白質缺 乏的培養基」中較高。或者或另外較佳言之，用於繁殖访 毒之培養&中所含之游離胺基酸總量不高於或基本上不3 於用於培養細胞之細胞培養基中之胺基酸總量。 另外較佳5之，用於繁殖病毒之培養基與用於培養細月 之、.田胞培養基相比’不具有顯著較低量（例如不少於 更佳不少於60%、甚至争杜了， 最主更佳不少於65%且最佳不少於750/ 之個別物質或物質群’該等物質分別選自由蛋白質、生 因子及/或無機鹽組成之群。舉例而言，在用於繁殖病 154987.doc 201202425 之培養基中，蛋白質之量較佳不少於50%、更佳不少於 6〇%、甚至更佳不少於65%且最佳不少於75%。在比較屬 於蛋白質群之個別物質的量時，不考慮bsa，然而在比較 蛋白質總量時，考慮BSA。在本發明之含義中，術語 「BSA」包括任何種類的bSa，諸如bSa Fraction V或 Albumax I(牛類富含脂質之BSA)。在本發明之含義中， 物質群」，例如蛋白質，包含屬於該群之所有個別物 質’例如乳白蛋白水解物。 此外，在本發明之含義中，術語「蛋白質、生長因子及/ 或無機鹽總量」一方面表示分別屬於蛋白質、生長因子或 無機鹽之群之個別物質的總量（例如屬於蛋白質群之所有 個別物質的總量，或屬於生長因子群之所有個別物質的總 量）’且其在另一方面表示屬於蛋白質、生長因子及無機 鹽之群之所有個別物質的總量。 在該方法之另一較佳實施例中，用於繁殖病毒之培養基 與用於培養細胞之細胞培養基相比，不具有顯著較低量 (小於75%之細胞培養基之量）之三種、兩種或一種選自由 生長因子及/或無機鹽組成之群的物質。 為確定是否實現該準則，藉由常用於此領域之方法測定 各別單個物質之量或物質群（諸如蛋白質群、生長因子群 及/或無機鹽群）之量。隨後將病毒繁殖培養基之個別物質 或物質群之各別量與細胞培養基之量進行比較。 在另一實施例中，細胞培養基未補充有抗生素。 在另一實施例中，病毒繁殖培養基未補充有抗生素。 154987.doc 201202425 在另一實施例中，細胞培養基及病毒繁殖培養基均未補 充有抗生素。 詳言之’細胞培養基及/或病毒繁殖培養基未補充有大 環内醋多烯抗生素或其衍生物或類似物。 (2) 如項目（1)之方法，其中該置換培養基不含BSA。 在另一較佳實施例中，置換培養基未補充有抗生素。 (3) 如項目（1)或（2)之方法，其中在添加感染性流感粒 子後，將蛋白酶以1 pg/ml至50 pg/ml之濃度範圍添加至該 培養基。 (4) 如項目（3)之方法，其中蛋白酶以大於1〇 至5〇

Mg/ml之濃度範圍、較佳丨5 μ§Ληι至5〇 ^/mi之濃度範圍、 更佳2·〇叫/〇11至50 μ§/ηιι之濃度範圍且甚至更佳2 $ pg/mi 至5〇 Mg/mi之濃度範圍添加至該培養基。 (5) 如項目（3)或（4)之方法，其中該蛋白酶為姨蛋白 (6)如項目（1)至（5)中任 固著依賴性細胞（anch〇rage depe_nt灿） 步=項目⑴至(Ο中任一項之方法…在病毒添 MO!)等;^添加之感純病毒粒子總數/細胞（感染倍率 m〇i)4於或小於1〇-6。 τ (8)如項目（1)至（6)中任一項之 步驟期間m、天4 ’ /、中在病毒添 、加之感染性病毒粒 MOI)等於或小於10-7。 +〜數/細胞（感染倍率 (9)如項目（1)至（6)t任一 項之方法’其中在病毒添; 154987.doc 201202425 步驟期間所添加之感染枓 '、病毒粒子總數/細胞（感染倍率， MOI)專於或小於1〇-8。 (10)如項目（1)至（9)巾权 s & έ 項之方法，其中在病毒添加 後12至3 6小時内，、壬仏队 /、· I之密度不低於病毒添加時細胞密 度之60°/。。 :π)如項目⑴至(9)令任一項之方法其中在病毒添加 36小時内，活細胞之密度不低於感染時細胞密度之 80%。 - 任一項之方法，其中在病毒添加 之後度不低於感染時細胞密度之 (12)如項目（1)至（9)中 後12至36小時内，活細胞 100% 〇 /13)如項目⑴至⑽中任一項之方法，其中用於培養 細胞之培養基在病毒添加步驟之前或期間經置換為與先前 用。於培養細胞之培養基的重量莫耳參透濃度相比具有至少 95%之重量莫耳滲透濃度的培養基（置換培養基）。 (14)如項目（1)至（13)中任-項之方法，其中在病毒添 加時該細胞培養物中之細胞的量為至少3胸〇6個細胞纔 升。 (15)如項目⑴至⑽中任一項之方法，其中在病毒添 加時該細胞培養物中之細胞的量為至少5 〇χ1〇6個細胞/毫 升。 ⑽如項目⑴至（13)中任-項之方法，其中在病毒添 加時該細♦培養⑯中之細胞的量為至少7.〇xl〇6個細胞/毫 升。 154987.doc 201202425 07)如項目⑴至(13)中任一項之方法，其中在病毒添 加時該細胞培養物中之細胞的量為至少9 個細 升。 ⑽如項目⑴至（13)中任—項之方法，其中在病毒添 加時該細胞培養物中之細胞的量為至少η 〇χΐ〇6個細胞 升。 (19)如項目⑴至(13)中任一項之方法，其中在病毒添 加時該細胞培養物中之細胞的量為至少13.0χ106個細胞/毫 升。 (2〇)如項目⑴至(19)中任一項之方法，其中所用細胞 為動物細胞，較佳為哺乳動物細胞。 在一較佳實施例中，哺乳動物細胞係選自由％γ〇、

PerC6、BHK、293、C0S、PCK、MRC 5、mdck、 MDBK及WI-38組成之群，細胞較佳為MDCK細胞。 在另一較佳實施例中，細胞係以黏附細胞之方式培養。 (21) 如項目（20)之方法，其中所用細胞為mdck細胞。 (22) 如項目⑴至(21)中任一項之方法其—該方法進 一步包含一或多個進—步加工繁殖病毒粒子之步驟。 (23) 如項目（22)之方法，其中該等加工病毒粒子包含不 活化（inactivated)病毒粒子，及/或減毒病毒粒子，及/或分 裂病毒抗原，及/或次單位病毒抗原，及/或病毒體 (virosome) 〇 (24) 如項目（23)之方法，其中該等加工病毒粒子包含— 或多個流感抗原。在—較佳實施例中’加工病毒粒子包含 154987.doc -12· 201202425 血球凝集素（HA)及/或神經胺糖酸苷酶（να) » (25) 如前述項目中任一項之方法，其係用於製造流感 疫苗。 (26) —種測試添加感染細胞所必需之極低感染性病毒 粒子總數/細胞（「感染倍率」’ ΜΟΙ)之預選病毒株至用於 繁殖·病毒粒子之細胞培養組合物是否致使病毒粒子及/或 加工病毒粒子產量增加的方法，其包含以下步驟： a) 使細胞在細胞培養組合物中生長，直至達到至少 0.5 X106個細胞/毫升之細胞密度， b) 將使用極低MOI之總數的預選病毒株感染性病毒粒子添 加至該細胞培養組合物，其中該極低M0I為小於丨〇_ 5之 MOI， c) 將步驟b)之添加該等感染性病毒粒子至該等細胞後所獲 得之病毒粒子及/或加工病毒粒子的產量與在使用在等於 或高於ΙΟ·5範圍内之參考MOI將相同類型感染性病毒粒子 添加至相同類型細胞時所獲得之病毒粒子及/或加工病毒 粒子之量進行比較。該參考MOI較佳為1〇_3。 在另一較佳實施例中，在步驟a)中，使細胞生長，直至 達到至少3.〇Xl〇6個細胞/毫升、較佳至少5〇χΐ〇6個細胞/毫 升、進一步較佳至少7.0Χ106個細胞/毫升、甚至進一步較 佳至少約9·〇χ1〇6個細胞/毫升、較佳至少約1ι〇χΐ〇6個細胞/ 毫升或進一步較佳至少13·〇χ1〇6個細胞/毫升之細胞密度。 (27) 如項目（26)之測試方法，其中病#添加後…二夺之 病毒粒子之量在以101og TCID5〇/ml形式量測時為至少6。 154987.doc •13· 201202425 (28) 如項目（26)或（27)之測試方法，其中在步驟c)之前 執行對所製造病毒粒子之收集及視情況選用之其他加工步 驟。 (29) 如項目（26)至（28)中任一項之測試方法，其中步驟 b)之感染性病毒粒子添加至該等細胞後所獲得的病毒粒子 或加工病毒粒子之量為使用在至少1〇-5或1〇-5以上範圍内 之參考MOI添加相同類型感染性病毒粒子至相同類型細胞 後所獲得之病毒粒子或加工病毒粒子之量的至少1.2倍、 較佳至少1.5倍、更佳至少2倍且最佳至少3倍，其中病毒 粒子之里較佳在病毒添加後24小時測定。尤其較佳使用 1〇·3之ΜΟΙ作為參考ΜΟΙ。 (3〇)如項目（26)至（29)中任一項之測試方法，其中在步 驟a)之後’較佳在步驟a)之後且在步驟b)之前或期間，以 極低MOI及參考M0I用於培養細胞之細胞培養基經置換為 病毒繁殖培養基’其與先前用於培養細胞之細胞培養基的 重量莫耳滲透濃度相比具有至少80%、較佳至少85%、更 佳至少90%且最佳至少95%之重量莫耳滲透濃度。 關於較佳細胞培養基及用於繁殖病毒之培養基，參考本 文所述之各別培養基《上述關於各別培養基之準則是否實 現’可如本文別處所述進行判定。 (31) 如項目（26)至（30)中任一項之測試方法，其中該等 細胞為如項目（20)或（21)中所定義之細胞。 (32) 如項目（26)至（31)中任一項之測試方法，其中該感 染性病毒粒子為感染性流感粒子。 154987.doc -14- 201202425 (33)如項目（26)至（32)中任一 τ ^ . 峭之測试方法，其中該加 工病毒粒子為如項目（23)或（2 子。 所叱義之加工病毒粒 (34)如項目（1)至（25)中任 (33)中任一項之測試方法，其 視情況荨於或小於1 χ 1 〇 -7， 1 X 1〇·8。 一項之方法或如項目（26)至 中該M〇1等於或小於1 X 1 〇 6， 進步視情況等於或小於 (35) 如項目（1)至（25)中任一 項之方法或如項目（26)至 (33)中任一項之測試方法中該等病毒粒子或加工病毒 粒子之量係藉由單向輕射免疫擴散（Single Radial Im_〇

Diffusion ’ SRID)檢定式拉 士 1 4〇 > ^慨疋次藉由逆相高效液相層析（RT_ HPLC)檢定來偵測。 (36) 一種用於製造病毒粒子及/或加工病毒粒子之細胞 培養組合物，其中 a) 已藉由使用至少0.5χ1()6個細胞/毫升之起始細胞量製備 該細胞培養組合物’亦即在病毒添加時該細胞培養物中之 細胞量為至少0·5χ106個細胞/毫升，及 b) 已向步驟a)之細胞培養組合物中添加使用小於1〇.5之極 低M0I之總數的感染性病毒粒子，及 c) 在病毒添加後1天範圍内，步驟b)之細胞培養組合物中 所存在之活細胞量相當於該細胞培養組合物中所存在之起 始細胞量（亦即在病毒添加時該細胞培養物中之活細胞量） 的至少約60%、較佳至少約7〇%、更佳至少約75%、甚至 更佳至少約80%且最佳至少約85〇/〇。 154987.doc 15- 201202425 在另較佳實施例中，在病毒添加後24小時之範圍内， 步驟b)之細胞培養組合物中所存在之活細胞量相當於該細 胞培養組合物中所存在之起始細胞量的至少約^ 或至 少約110% » 在另一較佳實施例中，在病毒添加後48小時之範圍内， 步驟b)之細胞培養組合物中所存在之活細胞量相當於在病 毒添加時該細胞培養組合物中所存在之細胞量的至少約 5%、較佳至少約1 〇%、較佳至少約15%。 (37) 如項目（36)之細胞培養組合物，其中已藉由使用根 據如項目（26)至（35)中任一項之測試方法所測試之]^〇1向 步驟a)之細胞培養組合物中添加感染性病毒粒子。 (38) 如項目（36)或（37)之細胞培養組合物，其中病毒添 加後4天之後的血球凝集素（HA)/mUb率高於15 gg/mi，較 佳高於20 pg/ml。 (39) —種用於繁殖病毒粒子之細胞培養組合物的用 途，其中向在病毒添加時含有至少0.5xl〇6個細胞/毫升之 細胞量的細胞培養組合物中添加感染性病毒粒子，其中所 用感染細胞所必需之感染性病毒粒子總數/細胞（「感染倍 率」，MOI)小於ΙΟ·5(極低M0I)。在另一較佳實施例中， MOI等於或小於1〇-6,等於或小於10-7,或等於或小於 亦參考如上所指出之極低MOI的較佳值。 (40) —種製造包含免疫原性血球凝集素（HA)之病毒粒 子或製造免疫原性HA蛋白之方法，其包含以下步驟： a)繁殖包含免疫原性HA之病毒粒子’其中向在病毒添加 154987.doc -16- 201202425 時含有至少0.5 χ 1 Ο6個細胞/毫升之細胞量的細胞培養組合 物中添加感染性病毒粒子，且其中所用感染細胞所必需之感 染性病毒粒子總數/細胞（「感染倍率」，Μ〇Ι)小於丨〇_5 ;及 b)獲得繁殖病毒粒子，且視情況進一步加工該等繁殖病 毒粒子以分離免疫原性企球凝集素（HA)蛋白及/或免疫原 性神經胺糖酸苷酶（NA)蛋白。 (41)如項目（4〇)之方法，其進一步如項目（丨）至（25)中任 一項所述來定義。 關於較佳起始細胞量，參考上述說明。在本發明之含義 申，術語「起始細胞量」表示在病毒添加時細胞培養物中 之細胞量。隨著病毒添加至細胞培養物，細胞之感染階段 開始。 μ 【實施方式】 本發明現藉由較佳實施例及實例進行更詳細描述，然 而，其僅以說明性目的而呈現且不應理解為以任何方式限 制本發明之範_。 病毒（諸如流感病毒）為每年出現或季節性爆發之流行病 或大流行病的病原體。豸等疾病爆#造成相當大的發病率 及死亡率，尤其在處於危險_之人群中，諸如罹患心臟病 或肺病、糖尿病或免疫系統功能失調之人群。為了保護群 體免於常見致病威脅且為了防止地方病或大流行病蔓延， 使用疫苗n例如在大流行病（諸如流感大流行）情況 :’預期全球規模内疫苗製造量與疫苗需求量之間差距顯 著。因此，亟需增加可用疫苗劑量之數目，其可例如藉由 154987.doc 201202425 在製造細胞株中改良，例如分別增加病毒產量或病毒組分 產量來達成。 本發明提供-種繁殖流感病毒之方法’其致使繁殖病毒 粒子(亦即繁殖流感病毒)及所獲得之病毒組分產量增加。 在本發明之含義中，術語「病毒组分」表示加工病毒粒 子。已驚奇地發現，當以特定最小細胞密度(亦即至少 0.5X106個細胞/毫升，較佳至少3 〇><1〇6個細胞/毫升、 5·〇χ106個細胞/毫升、7.0,6個細胞，毫升、9〇χΐ〇6個細 胞/毫升、η.οχπ)6個細胞/毫升或13〇xl〇6個細胞/毫升（起 始細胞量))起料，向言亥最小量細胞中添加小於ι〇_5之感 染細胞所需之感染性病毒粒子總數/細胞（Μ〇ι)，可使病毒 粒子或病毒組分產量顯著增加。雖然每既定量細胞使用相 當低起始#之添加病毒’但是已意外地發現以上述極低 ΜΟΙ添加感染性病毒粒子至最小起始量細胞中尤其有利且 可用於繁殖病毒粒子之方法，因為可獲得產量增加之繁殖 病毒粒子及產量增加之病毒組分。其尤其有利於製造流感 病毒組分，諸如製造如流感病毒抗原金球凝集素（ηα)或神 經胺糖酸苷酶（ΝΑ)之流感病毒組分。不欲為任何理論所束 缚，似乎由於將病毒添加至細胞培養物且以該極低河〇1感 染細胞，在病毒添加後一定時段（例如多至約三天之時段） 内，存活細胞之百分比較高。其似乎導致一種更有效的病 毒繁殖方法，尤其在進行細胞感染之關鍵初期，造成更延 長且更多產病毒產生’因而繁殖病毒粒子產量增加及病毒 組分產量較高。當使用在1χ106個細胞/毫升與4-5Χ106個細 154987.doc -18· 201202425 胞/毫升之間的細胞密度（起始細胞量，亦即在病毒添加時 細胞培養物中之細胞量）時，特別可獲得高增量之病毒血 球凝集素（HA)，且其中M0I在小於1〇-5至約1〇_7之範圍内。 在迄今已知的使用等於或大M1〇-52M〇I的方法中當 使用病毒繁殖培養基與用於培養細胞之細胞培養基相比2 有較少如蛋白f、生長因+等物㈣，獲得最大產量之繁 殖病毒粒子。此意謂該病毒繁殖培養基較少增濃。然而， 已意外地發現在本發明中，當根據本發明使用極低Μ⑴ 時在使用病毒繁殖培養基並不具有比細胞培養基顯著較 少量物質時，病毒粒子產量甚至可進一步增加。 由於本發明之方法可在產量增加的情況下繁殖病毒粒子 (例如流感病毒粒子）且製造病毒組分（亦即加工病毒粒 子）’故其加速疫苗產生過程且減少疫苗投放前置時間。 藉由應用纟發明之方甚至可能增加來源於+已適應高 生長之病毒株（例如重配病毒株或適應在特定細胞株中較 佳生長之病毒株）的病毒組分產量。 一般而言’藉由使用特定Μ0Ι(感染倍率）之病毒株向製 造細胞株中添加該病毒株，以便繁殖該病毒株。需要繁殖 之病毒株在本文中亦稱為預選病毒株。特定Μ〇ι通常在等 於或高於1〇-5之範圍内且在本文中稱為「參考」MOI。所 用較佳參考MOI為1〇_3。·然而，如在本發明之過程中已證 明，該「參考」MOI並非所有欲繁殖病毒株之最有效 MOI，但具有在低於1〇-5範圍内之極低河⑴提供較有效之 病毒繁殖，藉此致使病毒粒子及/或病毒組分產量增加。 I54987.doc 19 201202425 因此本發明進一步提供一種測試添加極低感染性病毒粒 子、’·《數/細胞之預選病毒株至用於繁殖病毒粒子之細胞培 α物疋否为別致使病毒粒子或病毒組分產量增加 、、冬一 ^ β。 《由應用該方法可有利地確定各預選病秦株個體分別 提供最大產量繁殖病毒粒子及病毒組分之Μ〇Ι，且尤其在 $头並未涵蓋於工業疫苗製造方法中之極低MOI範圍中。 此外，其限制條件為觀察到上述最小起始細胞密度，可能 偵測到無增量效應❶此意謂在小規模或半工業規模下，例 如在約3 1或3 1以下、或例如3〇 mi或3〇 mi以下之工作體積 中獲得之結果可轉換為大/工業規模，諸如轉換為具有ι〇〇 1以上（例如約1200丨）之工作體積的生物反應器。因此，例 如可能同時在小規模下及/或在半工業規模下進行多次測 試培養，以便測試使用極低M〇I接種是否分別產生較高產 量病毒粒子或病毒組分，且若分別產生較高產量病毒粒子 或病毒組分，則該極低河01為對於既定病毒株提供最高可 能產量之MOI。此極低MOI可隨後用於在大/工業規模下繁 殖預選病毒株。此外，如本文所述以最小細胞密度起始具 有例如以下優點：與若起始細胞密度低於如本文所述之最 小細胞密度時達到適合且用於接種之細胞密度之時段相 比’達到適合且用於接種病毒粒子之特定細胞密度之時段 較短。其亦加速疫苗產生過程，藉此減少疫苗投放前置時 間。使用以下病毒繁殖培養基尤其有利，其與先前用於培 養細胞之培養基相比’重量莫耳滲透濃度為細胞培養基之 重量莫耳滲透濃度的至少80%、較佳至少85%、更佳至少 154987.doc -20- 201202425 嶋且最佳至少95%，且其不具有顯著較低量較佳不少 於5〇。/。、更佳W6G%、甚至更佳不少於抓且最佳不 /於75/〇之蛋白質、生長因子及/或無機鹽總量。其意謂不 ^重量莫耳滲透濃錢著小於用於培#細就培養基之重 莫耳α透/農度的病毒繁瘦培養基置換欲用於培養細胞之 細胞培養基（在病毒添加之前）為有利@。在另一實施例 中蛋白質豐富的培養基用作用於培養細胞之細胞培養基 且蛋白質缺乏的培養基㈣用於繁瘦病毒之培養基。或者 或另外較佳言之，用於繁殖病毒之培養基中所含的游離胺 ，酸總量不高於用於培養細胞之細胞培養基中之胺基酸總 量。藉此可能額外增加病毒組分之產量。 不又任何理論所束缚，所用預選病毒株、添加有感染性 病母粒子之細胞的量（細胞/毫升）及所用μ〇ι之平衡似乎使 細胞培養組合物中之繁瘦病毒粒子及所獲得之病毒組分之 產量增加。 、’息而s之，藉由應用本發明之方法，可實現繁殖病毒粒 子及病毒組分之產量增加，藉此加速疫苗產生過程且減少 疫苗投放前置時間。 在一特定態樣中，本發明係關於一種繁殖包含免疫原性 求凝集素（HA)之病毒粒子（例如流感病毒）的方法，其中 在第步驟中將細胞培養於細胞培養物中且其中隨後在第 一步驟中將感染性流感粒子添加至該細胞培養物，其中用 於培養該等細胞之培養基在病毒添加步驟之前或期間經置 換為與先前用於培養該等細胞之培養基的重量莫耳滲透濃 154987.doc •21 · 201202425 度相比具有至少80%之重量莫耳渗透漠度的培養基且其 與先前用於培養該等細胞之培養基相比不具有顯著較低 量’較佳不少於50%之蛋白質、生長因子及/或無機鹽總 量，其中在病毒添加時該細胞培養物中之起始細胞量為至 y 0.5 1 〇個細胞/毫升，其中在病毒添加後12至％小時 内活、”田胞之密度不低於病毒添加時細胞密度之4〇%，其 中在病毒添加步驟冑間所添加之感染性病毒粒子總數/細 胞（感染倍率，MOI)小於1()·5。在另一較佳實施例中，在病 毒添加後12至36小時内活細胞之密度不低於病毒添加時細 胞密度之60%。在另-較佳實施例中，在病毒添加後以 36小時内活細胞之密度不低於病毒感染時細胞密度之 8〇%。在另一較佳實施例中，在病毒添加後^至刊小時内 活細胞之密度不低於病毒添加時細胞密度之1〇〇%。在另 一較佳實施例中，ΜΟΙ等於或小於10-6、等於或小於1〇_7， 或等於或小於1〇·8。 在本發明之含義中，術語「感染倍率」表示感染細胞所 必需之感染性病毒粒子的數目/細胞。換言之，Μ0Ι為感染 性病毒粒子與細胞之比率。因此，例如10_5之厘〇1意謂每 100000個細胞使用1個病毒粒子。 在本發明之情形中，已意外發現以小於1〇_5之總皿〇1接 種特定起始量之細胞可有效增加繁殖病毒粒子的量，其限 制條件為以至少〇.5xl〇6個細胞/毫升之特定最小細胞密度 (始，且由此產生欲製造之病毒組分。其可例如加速疫苗 製備過程且減少疫苗投放前置時間。若出現病毒感染性疾 154987.doc -22- 201202425 病之季節性'尤其流行性或大流行性蔓延或爆發，且尤其 當出現病毒流感蔓延時，其為有利的。藉由應用本發明之 方法，甚至可增加來源於早已適應滿足特定性質（諸如高 生長或在無血清培養基中生長）之病毒株的病毒粒子及病 毒化a物產量。其使提供疫苗組合物所需的時間進一步減 少。此外，甚至可繁殖野生型病毒粒子，以便可獲得足以 用於工業應用之病毒粒子及/或病毒組分之產量。 根據本發明，病毒粒子可適當地選自所需病毒粒子。 病毒粒子為僅可在宿主細胞内再生之感染性或非感染性 病毒粒子。術語「感染性」表示病毒（或病毒粒子）在引入 佰主、..田胞中時此夠產生繁殖性感染（pr〇ductive infecti〇n、|。 非感染性病毒粒子或病毒分別不能產生該感染；然而此粒 子將忐表現其編碼之基因。病毒粒子較佳為感染性病毒粒 子。 一般而言，病毒粒子含有可由衣殼包圍之核酸（去氧核 糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA))，其可由相同蛋白質次單 位衣殼體形成。病毒粒子亦可具有可能來源於已感染病毒 粒子之宿主細胞之膜的包膜。核酸可為線狀 '環狀或分段 之單股核酸、雙股核酸或其混合物，且該等股可為正義 (positive-sense)或負義（negative_sense)。在一較佳實施例 中’病毒粒子含有RNA。含有RNA且已發現在極低起始 M0I下有效繁殖之病毒粒子為例如流感病毒。 流感病毒由含有分段單股RNA基因組之内部核糖核蛋白 核心及由基質蛋白排列之外部脂蛋白包膜組成。流感病毒 154987.doc •23- 201202425 成員為例如A型、B型及C型流感病毒。A型流感病毒及B 型流感病毒各含有八個單股負義RNA區段。 病毒粒子較佳選自由以下病毒組成之群：正黏液病毒科 (Orthomyxoviridae)，諸如A型、B型或C型流感病毒；副黏 液病毒科（Paramyxoviridae)，諸如麻療病毒（measles virus)、 腿腺炎病毒（mumps virus)、副流感病毒（parainfluenza virus)及呼吸道融合性病毒（respiratory syncytial virus);披 膜病毒科（Togaviridae)，諸如辛德畢斯病毒（Sindbis virus) 及風療病毒（rubella virus);癌療病毒科（Herpesviridae)， 諸如單純性癌療病毒（Herpes Simplex virus)、艾伯斯坦-巴 爾病毒（Epstein-Barr virus)及水痘帶狀疮療病毒（Varicella Zoster virus);桿狀病毒科（Rhabdoviridae)，諸如狂犬病毒 (rabies virus);反轉錄病毒科（Retroviridae)，諸如人類免 疫缺乏病毒（human immunodeficiency virus，HIV);呼腸 孤病毒科（Reoviridae)，諸如輪狀病毒（rotavirus)及科洛拉 多碑傳熱病毒（Colorado tick fever virus);黃病毒科 (Flaviviridae)，諸如黃熱病毒（yellow fever virus);腺病毒 科（Adenoviridae)，諸如腺病毒（adenovirus);小核糠核酸 病毒科（Picornaviridae)，諸如脊髓灰質炎病毒（poliovirus); 沙粒病毒科（Arenaviridae)，諸如淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎 病毒（lymphocytic choriomeningitis virus);及痘病毒科 (Poxviridae)，諸如天花病毒（variola virus);感染性病毒粒 子較佳係選自由諸如A型、B型或C型流感病毒之正黏液病 毒科組成之群。在另一較佳實施例中，病毒粒子為選自由 154987.doc -24- 201202425 A型流感、B型流感或C型流感組成之群之流感病毒粒子。 進一步較佳言之’病毒粒子亦可為含有不同親代基因函段 組合之重配病毒粒子’諸如重配流感病毒粒子。 重配病毒包括彼等包括來源於一種以上親代病毒株或來 源之遺傳及/或多肽組分之病毒。舉例而言，重配病毒在 經批准之主要病毒株（亦稱為主要供體病毒（MDV))之情形 下經製造以併入所選HA及NA抗原。舉例而言，重配病 毒包括7個來源於第一親代病毒之病毒基因組區段（或基因 區段）及1個來源於第二親代病毒之例如編碼Η Α或Ν Α之病 毒基因組區段。6:2重配病毒包括6個來自第一親代病毒之 基因組區段（最通常為6個内部基因）及2個來自第二親代病 毒之基因組區段（例如ΗΑ&ΝΑ)。重配病毒可包括6個 來自第一親代病毒之基因組區段（最通常為6個内部基因）、 1個編碼ΗΑ之來自第二親代病毒之基因組區段及丨個編碼 ΝΑ之來自第三親代病毒之基因組區段。該6個内部基因亦 可為一種以上親代病毒之内部基因。 重配病毒可藉由熟習此項技術者已知的任何方法來產 生，諸如藉由經典重配技術，諸如藉由協同感染方法或藉 由^粒抵救技術。本發明之病毒粒子亦可為不活化或減毒 病毒。感染性病毒粒子亦可稱為病毒粒（vid〇n)。 在本發明之方法中，使用分別含有細胞及培養基之細胞 2组合物或細胞培養物。熟習此項技術者已知細胞培養 :合物之組分可視所用細胞及預期用途而變化。在一較佳 貫施例中’細胞培養組合物制於繁殖如本文所述之病毒 I54987.doc -25- 201202425 粒子及/或用於製造病毒組分。此外，可進一步加工繁殖 病毒粒子，以用於製備不活化病毒粒子，及/或減毒病毒 粒子，及/或分裂病毒抗原，及/或次單位病毒抗原，及/或 病毒體。對於培養目的而言，例如細胞培養物可包含細胞 及用於細胞生長之適合培養基。 一般而言，熟習此項技術者已知的任何合適細胞株之細 胞可用於本發明之方法中。該等細胞可為真核細胞，諸如 酵母細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、鳥類細胞或哺乳動 物細胞（包括人類細胞）。在一較佳實施例中，細胞培養組 合物中所含之細胞為動物細胞，該等細胞較佳為哺乳動物 細胞。該等細胞較佳以黏附細胞之方式培養。 適合之細胞包括（但不限於）Vero(非洲綠猴腎）細胞、 PerC6細胞（人類胚胎視網膜細胞）、BHK(幼倉鼠腎）細胞、 原代雞腎（PCK)細胞、馬丁達比犬腎（MDCK)細胞、馬丁達 比牛腎（MDBK)細胞、293細胞（例如293T細胞或HEK-293(人類胚腎細胞）細胞）、WI-38細胞（來源於獲自約三個 月大女性胎兒之細胞的細胞株；正常人類胎兒肺纖維母細 胞）、MRC-5細胞（來源於14週大男性胎兒之正常肺組織之 細胞株，Nature 227: 168-170，1970)及 COS 細胞（例如 COS 1、C0S7細胞）。適合之細胞亦涵蓋細胞之組合或混合 物’包括例如不同細胞類型或細胞株之混合培養物（例如 Vero及CEK細胞）。該等細胞較佳為MDCK細胞。在另一較 佳實施例中，本發明之細胞可為具有特定所需性質之細 胞，例如可適應在特定所用培養基中（例如在無血清培養 I54987.doc -26- 201202425 基中）生長之細胞’或可展現經改質之倍增時間、經改質 之致瘤概況及/或經改質之病毒製造行為之細胞。適應無 血清生長之細胞株的一個實例為MDCK-SF細胞株。在一 較佳實施例中’用於本發明之方法的細胞為允許及/或支 持接種該等細胞之感染性病毒粒子複製及/或繁殖的細 胞。細胞支持病毒複製及/或繁殖之能力的一個指標為分 別由經接種細胞培養物及經感染細胞培養物獲得之病毒戍 病毒粒子的產量。一般而言，病毒產量，諸如病毒粒子之 量或病毒組分之量，可分別藉由熟習此項技術者已知之任 何合適方法來測定。病毒產量較佳藉由根據量測感染性病 毒粒之半數組織培養感染劑量（TCID5Q)檢定，分別測定存 在於樣品中之病毒或病毒粒子濃度來定量。TCID5Q，通常 以1〇§10 1'(：1〇5()/1111形式表示，可藉由熟習此項技術者已知 之任何方法來測定。諸如TCID5〇檢定之終點稀釋技術為量 測病毒群體之統計方法。分析該資料之若干統計方法可 用，例如Spearman-Karber、Reed & Muench或概率分析。 舉例而言，向細胞（諸如MDCK細胞）中添加病毒之連續稀 釋液。若干天後，記錄細胞病變效應（CPE)且可計算為組 織培養半數感染劑量（TCIDsq)。此外，亦可以pfu(空斑形 成單位）/ml形式表示病毒粒子。 在一較佳實施例中，該等細胞支持病毒複製及/或繁 殖’包括（但不限於）選自由以下組成之群之病毒：正黏液 病毒科，諸如A型、B型或C型流感病毒；副黏液病毒科， 諸如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒及呼吸道融合性 154987.doc -27· 201202425 病毒，披膜病毒科，諸如辛德畢斯病毒及風疹病毒；疱疹 病毒科，諸如單純性疱疹病毒、艾伯斯坦-巴爾病毒及水 痘帶狀疱疹病毒，·桿狀病毒科，諸如狂犬病毒；反轉錄病 毒科，諸如人類免疫缺乏病毒（HIV);呼腸孤病毒科，諸 如輪狀病毒及科洛拉多蜱傳熱病毒；黃病毒科，諸如黃熱 病毒，腺病毒科，諸如腺病毒；小核糖核酸病毒科，諸如 脊髓灰質炎病毒，沙粒病毒科，諸如淋巴細胞性脈絡叢腦 膜炎病毒；及痘病毒科，諸如天花病毒；該等細胞較佳支 持選自由諸如A型、B型及/或c型流感病毒之正黏液病毒 科組成之群的感染性病毒粒子之複製及/或繁殖。此外， 用於本發明之方法的細胞亦支持重配病毒之複製及/或繁 殖。用於本發明之方法的細胞可進一步為展現優越生物學 性質（例如關於病毒製造、致瘤性概況及/或倍增時間）之細 胞。可選殖展現該等優越性質之個別細胞。可在個別細胞 選殖之則、同時或隨後使該等細胞適應特定培養條件，例 如關於溫度、C〇2濃度、p〇2值、pH範圍及所用培養基之 條件。 在本發明方法之一較佳實施例中，分別接種或感染之細 胞培養物中所存在之起始細胞量為至少約〇.5 χ丨〇6個細胞/ 毫升、較佳至少約3.0M06個細胞/毫升、進一步較佳至少 約5.0χ106個細胞/毫升、甚至進一步較佳至少約7〇χΐ〇6個 細胞/毫升、甚至更進一步較佳約9 〇χ1〇6個細胞/毫升且最 佳至少約11·〇χ1〇6個細胞/毫升或至少約13 〇χ1〇6個細胞/毫 升。已出人意料地發現如本文所述藉由以極低Μ〇Ι接種具 154987.doc •28- 201202425 有該最小細胞密度之細胞培養組合物，可顯著增加繁殖病 毒粒子之產量且由此可顯著增加所製造之病毒組分之量。 若以極低MOI接種該細胞培養組合物，則繁殖病毒粒子及 所獲得之病毒組分的產量可增加甚至更多。 用於本發明之方法中的細胞可懸浮培養或以黏附細胞之 方式於其所黏附之表面上培養。該等細胞較佳以黏附細胞 之方式培養。在另一較佳實施例中，該等細胞為固著依賴 !·生細胞。細胞可生長之黏附表面為此項技術中所熟知。黏 附表面包括（但不限於）經表面改質之聚苯乙烯塑料、蛋白 質塗佈表面（例如纖維結合蛋白及/或膠原蛋白塗佈之玻璃/ 塑料）以及可例如獲自Amersham Biosciences之多種市售微 載體（例如Cytodex 3微載體）。微載體珠粒為向每體積細胞 培養物之黏附細胞生長提供較大表面積的小球體。黏附表 面之選擇可受培養細胞（諸如MDCK細胞）所用方法的影 響，且可由熟習此項技術者確定。可分別用於本發明之方 法的適合培養器血或容器可為熟習此項技術者已知的任何 器皿或谷器’諸如轉瓶（spinner b〇ule)、滾瓶丨打 bottle)醱酵罐或生物反應器、或組織培養瓶。可例如在 八有較J體積之器皿（諸如具有例如約mi之體積的組織 培養瓶）中之小規模下進行本發明之方法，例如約50 1至例 如’.々100 1之半工業規模下進行本發明之方法，及具有較大 工作體積之器皿（諸如具有例如1000 1或1000 1以上之工作 體積之酸酵罐或生物反應器）中之卫業規模下進行本發明 之方法。 154987.doc -29· 201202425 在-較佳實施例中，用於本發明之方法的細胞可在分批 培養系統（諸如分批饋料培養系統）中培養。在另一較佳實 施例中，該等細胞亦可在灌注培養系統中培養。 在本發明之-實施例中，用於本發明之方法的細胞係在 特定條件下培養。熟習此項技術者已知何等各別條件適於 何種細胞類型。各別適應條件例如係指c〇2濃度、p〇2值、 pH值、溫度及所用培養基。細胞培養階段包括接種之前的 細胞培養及接種之後的細胞培養（病毒繁殖 各別條件可保持相同；然而，當細胞培養條件在細胞培 養階段期帛，亦即分別在病毒添加之前（或期間）之細胞培 養及接種/病毒繁殖之後之細胞培養期間改變或變化時亦 為可能的且最終更有效，可在接種/病毒繁殖階段之前整 個培養期間的任何時間改變該等細胞培養條件，且該等培 養條件亦可在接種（亦即病毒添加）/病毒繁殖階段之前的細 胞培養過程中不僅改變一次而且改變若干次。另一有效操 作為使條件改變（尤其培養基改變）與病毒添加同時進行（亦 即在病毒添加期間置換培養基）。可改變之細胞培養條件 為任何細胞培養條件，例如關於溫度、c〇2濃度、值、 PH範圍及所用培養基之條件。 在本發明方法之另一較佳實施例中，病毒繁殖培養基與 細胞培養基（亦即先前用於細胞培養之培養基）之重量莫耳 渗透濃度相比’具有至少8〇%、較佳至少85%、更佳至少 90%且最佳至少95%之重量莫耳滲透濃度。此外，病毒繁 殖培養基與先前用於培養細胞之培養基相比，不具有顯著 154987.doc 201202425 較低量，較佳不少於50%、更佳不少於60%、甚至更佳不 少於65%且最佳不少於75%之蛋白質、生長因子及/或無機 鹽之總量。其意謂不用重量莫耳滲透濃度顯著小於細胞培 養所用培養基之重量莫耳滲透濃度且具有顯著較低量之蛋 白質生長因子及/或無機鹽之總量的病毒繁殖培養基置 換欲用於培養細胞之細胞培養基（在感染性病毒粒子添加 至該等細胞之前或期間）為有利的。在另一實施例中蛋 白質豐富的培養基用作用於培養細胞之細胞培養基且蛋白 質缺乏的培養基用作用於繁殖病毒之培養基。或者或另外 較佳言之，用於繁殖病毒之培養基中所含的游離胺基酸總 量不南於用於培養細胞之細胞培養基中之胺基酸總量。 已意外發現（比較圖式）使用如本文所述（與細胞培養基中 所存在之物質的量相比）不具有顯著減小量之物質及/或不 具有重1莫耳滲透濃度小於80%、較佳小於85%、更佳小 於90%且最佳小於95%之細胞培養基之重量莫耳滲透濃度 的病毒繁殖培養基，與使用如本文所述重量莫耳滲透濃度 小於80%、小於85%、小於9〇%或小於95%之細胞培養基之 重量莫耳滲透濃度及/或具有顯著減小量之物質的繁殖培 養基相比’提供產置增加之病毒粒子。細胞培養基之重量 莫耳滲透濃度的測定描述於下文。 在本發明之另一較佳實施例中，用於繁殖病毒之培養基 2先前用於培養細胞之細胞培養基相比’不具有顯著較低 量（較佳不少於50%、更佳不少於55%、甚至更佳不少於 60%且甚至最佳不少於65%，且在另一較佳實施例中較佳 154987.doc •31- 201202425 不少於70%或75%)之蛋白質]長因？及/或無機鹽之總 量。 亦參考如上所述之實施例。 在另:較佳實施例中，用於培養細胞之培養基在用感染 14病毒粒子將病毒添加至該等細胞之前或期間，經置換為 用於病毒繁殖之培養基，其中該欲用於病毒繁殖之培養基 具有與用於細胞培養之細胞培養基相同的類型，但不含 BSA。 在本發明方法之另一較佳實施例中，用於繁殖病毒之培 養基與用於培養細胞之細胞培養基相比，不具有較低量之 選自由生長因子及/或無機鹽組成之群的三種、兩種或一 種個別物質或物質群。 其意明根據本發明，較佳藉由使用如上所述不具有顯著 減小量之個別物質的病毒繁殖培養基進行繁殖步驟。換言 之’與細胞培養基相比’儘可能一樣多的個別物質或物質 群分別相同或至少並非顯著較低量包含於病毒繁殖培養基 中〇 置換培養基，例如由病毒繁殖培養基置換用於細胞培養 之細胞培養基發生在某一時段内，其一般亦視細胞培養規 模而定。若在小規模或半工業規模（例如約3 1或3 1以下， 或例如30 ml或30 ml以下之工作體積）下進行細胞培養，則 培養基置換相比在大/工業規模（諸如具有1〇〇丨以上工作體 積之生物反應器）下之細胞培養物所需之置換時間快得 多。 154987.doc •32- 201202425 若已在工業規模或大規模下進行細胞培養，則術語「接 種之前」或「病毒添加步驟之前」分別表示培養基置換發 生在12小時或12小時以下，較佳1〇小時、9小時、8小時、 7小時或6小時或6小時以下，更佳5小時或5小時以下，甚 至更佳4小時或4小時以下之時段内。若已在小規模或半工 業規模下進打細胞培養，則培養基置換發生在細胞開始接 種之前5小時或5小時以下，較佳4小時、3小時、或2小時 或2小時以下，更佳i小時或丨小時以下，更佳3〇分鐘或3〇 分鐘以下且甚至更佳15分鐘或15分鐘以下之時段内。或者 可在病毒添加期間置換培養基，詳言之使兩種操作同時進 行。 在本發明之方法中，可使用熟習此項技術者已知的任何 合適細胞培養基。一般而言，合適的細胞培養基包含多種 組分（亦分別表示為添加劑及物質），諸如無機鹽、胺基 酸、核酸、維生素、脂質、糖或碳源、蛋白質、生長因 子、界面活性劑及pH值指示劑。 此外，可調配所用培養基，以使得所培養之細胞保留所 需特徵，諸如一或多個以下特徵，其包括（但不限於）非致 瘤、以黏附細胞之方式生長、在培養時支持感染性病毒粒 子複製。 在一實施例中，熟習此項技術者已知的任何合適無機鹽 可存在於細胞培養基中；無機鹽較佳選自由以下組成之 群：CaCl2、CuS04、Fe(N03)3、FeS04、KC1、MgCl2、

MgS04、NaC卜 NaHC03、Na2HP04、NaH2P〇4、Na2Se〇3、 154987.doc -33· 201202425 乙酸納及ZnS04。 在另一較佳實施例中，熟習此項技術者已知的任何合適 胺基酸可存在於細胞培養基中。胺基酸較佳選自由以下組 成之群：L-丙胺酸、L-精胺酸-HC1、L-天冬酿胺（游離 驗）、L-天冬醯胺xH2〇、L-天冬胺酸、L-半胱胺酸_HC1(無 水）、L-半胱胺酸-HCl-H2〇、L-耽胺酸、L-耽胺酸X2HC1、 L-麵胺酸、L-麵胺醯胺、甘胺酸、L-組胺酸-HC1xH20、 異白胺酸、L-離胺酸、L-離胺酸-HC1、L-曱硫胺酸、L·苯 丙胺酸、L-捕胺酸、經基-L-捕胺酸（非動物）、絲胺酸、 L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酷·胺酸、L-酷·胺酸x2Nax2H20及 L-纈胺酸。 在另一較佳實施例中，熟習此項技術者已知的任何合適 核酸可存在於細胞培養基中。核酸較佳選自由以下組成之 群：硫酸腺嘌呤、腺苷-5-構酸鹽、腺苷-5-三磷酸鹽、麵 胱甘肽（還原）、鳥嘴吟斐波那契（guanine Fib〇naccj，jpg)、 鳥嘌呤HC1、D-核糖、2-去氧-D-核糖、胸腺嘧啶、尿嘧 。定、黃嗓吟及次黃嗓吟。 在另一較佳實施例中，熟習此項技術者已知的任何合適 維生素可存在於細胞培養基中。維生素較佳選自由以下組 成之群：對胺基苯甲酸、抗壞血酸、D·泛酸鈣、D·生物 素、氣化膽鹼、鳕魚肝油、麥角鈣化醇、葉酸、^肌醇、 曱萘醌、菸鹼醯胺、菸鹼酸、腐胺2HC丨、吡哆醛_HC1、吡 哆醇-HC1、核黃素、硫胺素_Ηα、二硫辛酸、胸苷、生育 酚磷酸二鈉、DL-生育酚乙酸酯、維生素a乙酸酯及維生 154987.doc •34- 201202425 素〜。 在另一較佳實施例中，熟習此項技術者已知的任何合適 脂質可存在於細胞培養基中。脂質較佳選自由以下組成之 群：膽固醇、次亞麻油酸、亞麻油酸、棕摘油酸、花生四 稀酸、硬脂酸'肉豆蔻酸、棕櫚酸及油酸。 在另一較佳實施例中，熟習此項技術者已知的任何合適 糖或碳源可存在於細胞培養基中。糖或碳源較佳選自由1 葡萄糖、D-果糖及丙酮酸鈉組成之群。 在另一較佳實施例令，熟習此項技術者已知的任何合適 蛋白質可存在於細胞培養基中。蛋白質較佳選自由BSA(牛 血π白蛋白，第V部分）（諸如Albumax I(牛類富含脂質之 BSA))、乳白蛋白水解物及Primat〇ne RL組成之群。 在另一較佳實施例中，熟習此項技術者已知的任何生長 因子可存在於細胞培養基中。生長因子較佳選自由表皮生 長因子（鼠類 '重組鼠類或重組人類表皮生長因子）、胰島 素（諸如人類騰島素（結晶生物合成人類胰島素）)及轉鐵蛋 白（元全牛類轉鐵蛋白）組成之群。 在另-較佳實施财，可使用熟f此項技術者已知的任 何合適界面活性劑。界面活性馳佳選自由P1_ic F68 及Tween 80組成之群。此外亦可使用乙醇。 在另一較佳實施例中，可栋用i11 -., J便用心不劑，諸如pH值指示 劑。可使用熟習此項技術者知 4t 一 何考已知的任何合適指示劑。所用 才曰不劑較佳為酚紅。 在一實施例中 細胞培養基進一 步較佳補充有抗生素。 154987.doc •35- 201202425 一般而言’熟習此項技術者已知的任何合適抗生素可以適 合濃度單獨或與其他抗生素組合使用。在一較佳實施例 中，未使用抗生素。 在另一實施例中，細胞培養基未補充有抗生素。 在另一實施例中’病毒繁殖培養基未補充有抗生素。 在另一實施例中，細胞培養基及病毒繁殖培養基均未補 充有抗生素。 詳言之’細胞培養基及/或病毒繁殖培養基未補充有大 環内酯多烯抗生素或其衍生物或類似物。 使細胞培養基及/或病毒繁殖培養基省去補充抗生素， 尤其大環内醋多稀抗生素或其衍生物或類似物，提供一種 經改良之病毒組分製造方法’其例如關於該方法之穩固性 或操作經改良。藉由應用本發明之方法，儘管如上所述省 去抗生素’甚至在如本文所述使用極低MOI時仍可實現病 毒產量增加。 用於病毒繁殖之培養基（亦即置換培養基）較佳為無Bsa 或基本上無BSA之培養基。基本上無BSA意謂培養基中僅 含有痕量BSA，其對於細胞培養及/或後續進行之加工及/ 或繁殖病毒粒子及/或病毒組分之預期用途不具有任何影 響，較佳不具有任何負面影響。 此外’可使用上述組分及/或添加劑之任何合適組合。 可用於本發明方法之適合培養基的實例為例如Episerf， 其為市售培養基（例如Invitrogen或Lonza)。含有BSA之 Episerf及不含BSA之Episerf具有約360 mOsmol/kg之重量 154987.doc •36· 201202425 莫耳滲透濃度》 在本發明之方法中，向 任病毒添加時含有至少0.5 χΙΟ6個 細胞/毫升之細胞量或如本 , 所夂義之較佳量的細胞梅養 、，且〇物中添加感染性病毒中立； 两每粒子。培養細胞直至已達到相應 理想細胞密度所需的時段主 又主要取決於細胞培養規模。因 此’若以大/工業規模（參見上 兄上文）培養細胞，則用於本發明 之方法的細胞增殖至多4G天，較佳至多30天，直至達到至 少0.5—胞/毫升之細胞密度。因此，若以半工業/小 規模培養細胞，則用於本發明之方法的細胞增殖至多2〇 天，較佳至多10天或10天以下，直至達到所需細胞密度。 然而’ it到該細胞密度所需之相應必需時段為熟習此項技 術者已知，因為例如培養物之細胞密度可容易由常規方法 (諸如細胞計數）測定。在一較佳實施例中，所繁殖之細胞 為MDCK細胞。在另一較佳實施例中，細胞以黏附細胞之 方式培養於組織培養瓶中或黏附於微載體，諸如3 微載體（例如可自Amersham Biosciences獲得）。每毫升細 胞培養物之細胞密度可藉由熟習此項技術者已知的任何方 法來測定。舉例而言，若在諸如微載體珠粒上之黏附細胞 培養物中培養細胞’則可使用NucleoCounter(Chemometec)。 使用此裝置可在未經酶促處理之樣品中測定總細胞濃度》 各別細胞培養器皿之細胞密度可一天測定一次，視情況一 天測定多次。 必要時，在細胞培養之過程中，可如本文所述更換細胞 培養基。 154987.doc •37· 201202425 在本發明方法之另一較佳實施例中，向至少約0.5x10、 起始量、.田胞中添加小於1〇-s(以每個細胞之比率Mm表示； 亦參見本說明書別處)之經使用且添加至該等起始量細胞 中之感染性病毒粒子總數。術語「所用感染性病毒粒子之 〜數」在本發明之含義巾表示外部給予細胞培養組合物之 感染性病毒粒子的總數小於1〇·5。術語「接種」或「病毒 添加」在本發明之含義中分別表示將感染性病#粒子外部 添加至細胞培養組合物。在本發明之含義中，可將感染性 病毒粒子的總數-步添加至細胞培養組合物。然、而，本發 明之MOI亦可分兩步或多步添加至細胞培養物，例如用感 染性病毒粒子總數之一部分進行第一個病毒添加步驟，隨 後用感染性病毒粒子之另一部分進行第二個或多個病毒添 加步驟。各別接種步驟之間的時滯可變化。在一較佳實施 例中，病毒添加作為整體一步進行及/或在2小時或2小時 以下之時段内，較佳在1小時或1小時以下之時段内，甚至 更佳在30分鐘或30分鐘以下之時段内且最佳在15分鐘或1〇 分鐘或10分鐘以下之時段内完成。 一般而言，將病毒添加至細胞培養物中所存在之細胞可 藉由熟習此項技術者已知的任何合適方法來進行。舉例而 吕’可藉由將病毒接種體簡單地添加至細胞培養物來接種 細胞。在本發明之含義中，可在整個培養階段（接種及病 毒繁殖之前的細胞培養）期間使用含有相同組分之細胞培 養基，但亦可置換該培養基且使用與先前所用之培養基相 比含有不同組分/添加劑/物質之培養基。關於此方面，參 154987.doc -38- 201202425 考上文描述。 用於培養細胞之細胞培養基較佳經置換為病毒繁殖培養 基’其重量莫耳滲透濃度為用於培養細胞之培養基之重量 莫耳滲透濃度的至少95%(參見上文）：如例如由圖1及圖2 可推斷出’若用於培養細胞之細胞培養基經置換為具有至 少95。/。之用於培養細胞之細胞培養基之重量莫耳滲透濃度 的病毋繁殖培養基，則該等細胞之蛋白質產量及生存率可 增加。右細胞培養基經置換為與該細胞培養基相比不具有 顯者較低總量之蛋白質、生長因子及/或無機鹽之病毒繁 殖坧養基，或若該病毒繁殖培養基同時具有兩種性質，則 可發現類似有利作用。 在本發明之一較佳實施例中，接種或病毒添加分別進行 如下.在細胞培養結束時、在添加感染性病毒粒子之前或 』門藉㈤於用熟習此項技術者已知的適合洗蘇液進行洗 々步驟而將該細胞培養基置換為病毒培養基。將較佳在添 刖J時以内製備之病毒接種體添加至該細胞培養物。 在已添加病毒接_ m同時在此步射更換培養基 之後’開始用病毒感染細胞且繁殖病毒。在本發明之含義 中，術語「病毒添加後」或「接種後」表示以完成病毒接 種體添加至細胞培養物起始之時段。此外，在本發明之含 義中’術語「病毒添加步驟期間」表示進行接種期間之時 二或至：在時間上存在重疊。病毒添加步驟起始於添加 體：二甘粒：至細胞培養物且結束於完成整個病毒接種 ’”、。病毒添加時之細胞密度可藉由熟習此項技術者 154987.doc •39· 201202425 已知的任何合適方法來測定。 如上所述，可在與培養基之最終體積相比減小之培養基 體積中用病毒（例如用感染性粒子，諸如流感粒子）接種細 胞。舉例而言’減小之體積可相當於約7〇%、較佳約 50%、更佳約40%且最佳約30%之該培養基的最終體積。 在接種階段結束時，用病毒培養基將減少之細胞培養基補 充至100%的最終濃度。如上所述，此補充所用之病毒培 養基可為在接種階段期間所用之培養基，或其可為與在接 種階段期間所用之培養基不同的培養基。其較佳為接種所 用之培養基。 在已完成細胞接種（或分別用病毒懸浮液培養細胞）之 後’其為剛完成病毒接種體添加至細胞培養物之情況（參 見上文），培養細胞另一特定時段（病毒繁殖階段），直至可 觀察到所需CPE(參見下文）。此外，亦可藉由熟習此項技 術者已知的任何指示劑指示病毒製造步驟之結束，諸如藉 由空微載體及/或藉由進入生物反應器之p〇2增加或〇2流減 小。一般而έ，其為約5小時至8天、較佳約1 〇小時至約6 天、約10小時至約5天、更佳約10小時至約4天且最佳約12 小時至約3天之另一培養階段後的情況。CPE為一種致病 效應，其轉而為對細胞生長或維持之不利效應，尤其與微 生物及/或病毒感染有關之效應。致病效應包括（但不限於） 致細胞病變效應、細胞破裂、抑制生長、抑制蛋白質合成 或細胞凋亡^ CPE為可觀察到的細胞結構之改變，其可隨 細胞類型及死亡原因而變化，且可根據此項技術中確立之 154987.doc •40· 201202425 知識來判定。舉例而言，-些最常見的病毒感染效應為形 態變化’諸如細胞變圓且自基底脫離、細胞溶解、合胞體 形成及包涵體形成。CPE可根據熟習此項技術者已知的任 可。適方去來判疋’例如藉由顯微鏡觀察及估計細胞覆蓋 反應器皿及微載體之百分比。 本發明之方法進一步包含一或多個 在一較佳實施例中 進-步加工繁殖病毒粒子之步驟’較佳用於製備經分離或 經純化之繁殖病毒粒子（例如流感病毒粒子）。該等加工病 毒粒子較佳包含不活化病毒粒子、及/或減毒病毒粒子、 及/或分裂病毒抗原、及/或次單位病毒抗原、及/或病毒 體》玄加工病毒粒子進一步較佳包含一或多個流感病毒抗 原，諸如HA及/或NA。 細胞培養基分離繁殖病毒粒子可藉由熟習此項技術者 已去的任何合適方法來進行。舉例而言，病毒粒子可藉由 例如用刀離器或過濾器使細胞或細胞殘餘物與培養基分離 來收集。已知方法包括（但不限於）過濾、超濾、、吸附於硫 自“貝上且溶離’及離心。舉例而言’ &自經接種及感染之 σ養物的粗培養基可首先藉由在例如2〇〇至2〇〇〇 g下（連續） 離心約5分鐘以移除細胞碎片及其他顆粒物質來淨化。或 者，經由例如0.8 0„!乙酸纖維素過濾器過濾培養基，以移 除7C整細胞及其他顆粒物質。隨後視情況使經淨化之培養 基上清液在例如15,000 g下離心約3_5小時，以使病毒（諸 如机感病毒）結成離心塊或藉由使用例如3〇〇 MWCO濾 膜超濾濃縮。之後，可使病毒粒子離心塊再懸浮於適當緩 154987.doc •41 · 201202425 衝液中’諸如STE緩衝液（0.01 M Tris-HCl ; 0.15 Μ NaCl ; 0.0001 Μ EDTA)或在pH 7·4下之PBS(磷酸鹽緩衝鹽 水），隨後可例如藉由蔗糖（60%-12%)或酒石酸钟（5〇%_ 10%)之密度梯度超離心濃縮及/或進一步純化經分離之病 毒粒子。在一定速度下離心梯度溶液且持續一段時間，以 足以使病毒粒子濃縮為可見帶用於回收。可對繁殖病毒粒 子進一步進行離子交換層析或尺寸排阻層析。此外，可酶 促處理繁殖病毒粒子及/或所含之核酸。 此外’可根據熟習此項技術者已知的任何合適方法不活 化、殺死或減毒繁殖病毒粒子。減毒可例如以化學方式咬 藉由標準連續傳代來實現，其中使用在敏感的細胞培養物 中傳代足夠次數，直至使該病毒粒子在不損失免疫原性的 情況下無致病性。此外，可例如藉由清潔劑或甲醛處理來 不活化病毒粒子。 在本發明之另一較佳實施例中，可進一步加工所獲得之 繁殖病毒粒子，以便獲得例如病毒抗原，諸如11八及/或 NA ^在一較佳實施例中，獲得HA ^熟習此項技術者已知 可如何獲得病毒抗原。所獲得之加工病毒粒子可用於製造 流感疫苗。 其他加工步驟可視情況在上述收集及/或分離步驟之後 進行，且可包括提取可與細胞或細胞片段締合之病毒組 分、分隔病毒組分、分離病毒組分且將其純化，該等加工 步驟描述於例WPaul A. Belter (作者），E L Cussier (作 者），WeiShcm Hu(作者）之 Biosep副i〇ns: D〇wnstream I54987.doc -42- 201202425

Processing f〇r Biotechnology的一般教程中。 如上所述，本發明之病毒粒子（諸如流感病毒粒子）包含 例如病毒體。病毒體為單層磷脂雙層小泡’其具有例如在 約70 nm直約150 nm範圍内之合適平均直徑°病毒體本質 上表示重構空病毒包膜，無包括源病毒之遺傳物質之核衣 殼。病毒體不能複製，但為含有功能性病毒包膜醣蛋白 (諸如流感病毒HA及NA)插入磷脂雙層膜中之純融合活性 小泡。 此外，加工病毒粒子包含一或多個流感抗原’諸如HA 及/或NA 此流感病毒抗原可來源於引起流感季節性、大 流行性及/或流行性爆發之病毒株。 HA可例如發現於流感病毒表面上。其為負責使病毒結 合至所感染之細胞的抗原性醣蛋白。迄今已知至少16種不 同流感HA抗原。此等亞型命名為H1至H16。NA為裂解神經 胺糖酸之醣苦鍵的酶。迄今已知至少9種流感神經胺糖酸發 酶之亞型。此等亞型可例如發現於熟習此項技術者已知的資 料庫中，諸如 PubMed 資料庫（例如 http://www_ncbi.nlm.nih.gov/ 、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html 、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore 及 http://www.ncbi.nlm_nih.gov/ nuccore/145284465?ordinalpos=l&itool=EntrezSystem2.PEn trez .Sequence. Sequence一ResultsPanel.Sequence_RVDocSum )。流感病毒蛋白亦可能包含任何單獨或彼此組合之此等 HA及/或NA編碼序列。流感病毒蛋白亦可能僅含有此等序 列之一部分。流感病毒蛋白較佳含有編碼Η1、H2、H3、 154987.doc -43- 201202425 H5、H6、H7、N1、N2、N3或N7之完整序列或單獨或組 合之該等序列的一部分，較佳含有編碼H5之序列。在另一 較佳實施例中，聚核苷酸構築體包含編碼H1N1、H2n2、 H3N2、H6N1、H7N3或H7N7之序列或該等序列之一部 分，較佳包含編碼H5N1之序列或該等序列之一部分。 此外，上述本發明之方法可用於製造病毒疫苗，較佳製 造流感病毒疫苗。為此，可進行將該等病毒粒子或該等病 毒組分或病毒組分之一部分調配成疫苗組合物之步驟。 可藉由熟習此項技術者已知的適合方法調配病毒粒子或 病毒組分或病毒組分之一部分，以提供用於投與個體之病 毒疫苗。調配適用於病毒疫苗之病毒粒子及/或病毒組分 或其部分可包含其他步驟，包括（但不限於）緩衝液更換及 消毒步驟。一般而言，病毒疫苗可與適當載劑或賦形劑一 起分別預防性或治療性投與。該載劑較佳為醫藥學上可接 受之載劑，諸如無菌水、緩衝鹽水溶液、右旋糖溶液、甘 油溶液或其組合。此外，一般選擇使過敏反應或其他不當 效應減到最少且適於具體投藥途徑（例如皮下、肌内、鼻 内等）之載劑。 在另一較佳實施例中，本發明之疫苗組合物可含有其他 組分及/或添加劑，諸如佐劑。佐劑為增加免疫反應之物 質’例如多種金屬之氫氧化物、細菌細胞壁成分、油或息 角苷。 此外’本發明亦關於一種測試添加感染細胞所必需之極 低感染性病毒粒子總數/細胞（MOI)之預選病毒株至用於繁 154987.doc 201202425 殖病毒粒子之細胞培養組合物是否致使病毒粒子及/或加 工病毒粒子產量增加的方法，其包含以下步驟： a) 使細胞在細胞培養組合物中生長，直至達到至少 〇.5xl06個細胞/毫升之細胞密度， b) 將使用極低MOI之總數的預選病毒株感染性病毒粒子添 加至該細胞培養組合物，其中該極低Μ〇ι為小於丨〇·5之 MOI，或其中該河〇1為如本文所定義之較佳μ⑴， c) 將步驟b)之添加該等感染性病毒粒子至該等細胞後所獲 得之扃甘粒子及/或加工病毒粒子的產量與在使用在等於 或高於10-5範圍内之參考]^〇1將相同類型感染性病毒粒子 添加至相同類型細胞時所獲得的病毒粒子及/或加工病毒 粒子之量進行比較。 在一較佳實施例中，在以該參考M0I接種細胞後獲得病 毋粒子及/或病毒組分係在與以極低厘01接種細胞後獲得病 f粒子及/或病毒組分的相同條件下獲得。在本發明之含 義中，術语「相同條件」表示使用相同細胞培養條件，例 如關於溫度、CO2濃度、P02值、pH範圍及培養基。如本 文所述關於繁殖病毒粒子之方法的所有較佳實施例及參數 亦適於本發明之測試方法。 已驚奇地發現，平衡⑴所用預選病毒株、（ii)添加感染 性病毋粒子時之細胞密度（細胞/毫升）及（iii)用於接種細胞 之MOI，使繁殖病毒粒子及/或病毒組分之產量增加，限制 條件為在接種時細胞具有至少〇 5χ1〇6個細胞/毫升之細胞 密度，且限制條件為該ΜΟΙ為小於1〇·5之極低ΜΟΙ。其他 I54987.doc -45. 201202425 合適MOIs描述在本文別處。在先前技術方法中，向細胞 中添加「參考」MOI，其為等於或高於10·5之MOI，該參 考MOI較佳為1〇·3 ^然而，已發現在本發明中以此參考 MOI接種細胞未必分別產生繁殖病毒粒子或病毒組分之最 大產量。反而’若以預選病毒株感染性病毒粒子之總數接 種具有特定最小細胞密度之細胞，則可達到經改良之最佳 化產量’其中該MOI為小於10·5之極低MOI。藉由應用該 測試方法’可確定各預選病毒株分別提供該改良產量之繁 殖病毒粒子及病毒組分之MOI。此外，由於未出現增量效 應，可藉由使用本發明之測試方法同時並行運行多次小規 模測試培養，同時觀察本文中所揭示之最小細胞密度，以 測試使用極低MOI接種是否分別產生較高產量病毒粒子或 病毒組分，若是，則該極低河〇1為提供最高可能產量之 MOI ^此極低M0I可隨後用於大/工業規模繁殖預選病毒 株’無需重新測定適用於大規模方法之極低Μοι。令人驚 奇地，可在小規模細胞培養物中觀察到的關於所獲得之病 毒粒子及/或病毒組分的正面效應相應地轉變至大規模細 胞培養物中。 關於所接種之細胞、細胞培養組合物之接種、分別用於 接種及添加之感染性病毒粒子、感染性病毒粒子的總數、 繁殖之病毒粒子及病毒組分及細胞培養基，請參考以上說 明書。 在該測試方法之-個較佳實施例中，在第一步驟a)中， 使，，，曰胞在培養基中生長’直至達到至少〇5χΐ〇6個細胞/毫 154987.doc •46- 201202425 升之、，’田胞雄度在另一較佳實施例中，細胞生長直至達到 至少3.0x10個細胞/毫升、較佳至少5 〇χ1〇6個細胞/毫升、 進一步較佳至少7.0x1 〇6個細胞/毫升、甚至進一步較佳至 少約9.0><10個細胞/毫升、較佳.至少約11〇><1〇6個細胞/毫 升，或進一步較佳至少13.〇χ1〇6細胞/毫升之細胞密度e 自培養器皿中獲得之樣品的細胞密度可藉由熟習此項技 術者已知的任何方法來敎。若在黏附細胞培養物中培養 細胞，則可藉由使用如實例i中所述之Nucle〇c〇u雜测定 細胞密度。 在-較佳實施例中，該等細胞可如上所述以黏附細胞之 方式培養及增殖。 在該測試方法之-較佳實施例中，在步勸）巾，使用極 低MCH向該等細胞中添加_病毒株之感染性病毒粒子， 較佳如上所狀感染性⑽粒子。該極低顧為如上所述 在小於HT5之範圍内的_。可如上所述接種細胞，亦即 添加感染性病毒粒子。 此外，藉由進行本發明之測試方法及（分別）繁殖流感病 毒（或流感病毒粒子）之方法，可添加蛋白酶’其*ha之前 驅蛋白裂解且由此使病毒粒子或病毒分別吸附於細胞上， 藉此例如額外增加病毒組分之產量。可在病毒(例如流感 病毒）添加至細胞之前不久、同時或之後不久’添加蛋白 酶。亦可在病毒添加後8小時至1〇小時之時段後添加蛋白 酶。若添加蛋白酶與接種同時進行，則該蛋白酶可直接添 加至該細胞培養物，或例如以濃縮物形式與感染性病毒粒 154987.doc •47- 201202425 子接種體一起添加至該細胞培養物。在一較佳實施例中， 在感染性流感病毒粒子添加後，將蛋白酶以i 至％

Hg/ml之濃度範圍添加至置換培養基。在另一較佳實施例 中，蛋白酶以大於1.0 #§/1111至50 pg/ml2濃度範圍較佳 1.5 pg/ml至50 Hg/m丨之濃度範圍、更佳2〇叫/⑹至咒 Kg/ml之濃度範圍及甚至更佳2·5 μ§Λη1至5〇 Rg/m丨之濃度範 圍添加至置換培養基。可添加之適合蛋白酶為熟習此項技 術者已知，例如蛋白酶為絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶 或天冬醯胺蛋白酶。較佳的合適之蛋白酶實例為胰蛋白 酶。 在另一較佳實施例中，在該測試方法之步驟a)之後，較 佳在步驟a)之後且在步驟b)之前或期間，將以極低河⑴及 參考MOI用於培養細胞之培養基置換為病毒繁殖培養基。 關於該病毒繁殖培養基，參考上文描述，可根據熟習此項 技術者已知的任何合適方法置換培養基，例如其可如上所 述進行。 此外，關於可分別用於細胞培養階段及病毒繁殖階段之 培養基，參考上文描述。 接種細胞培養物以及在接種階段（病毒繁殖）後培養細胞 培養物係如上所述進行。 在培養階段已達到結束後，視情況在該測試方法之步驟 c)之前’進行收集及/或分離步驟。此/此等步驟可如本文 別處所述來進行。 可進一步加工所獲得之繁殖病毒粒子。加工病毒粒子 154987.doc • 48 · 201202425 (或病毒組分分別）包含不活化病毒粒子、及/或減毒病毒粒 子、及/或分裂病毒抗原、及/或次單位病毒抗原、及/或病 毒體。此外’可分別測定病毒粒子及/或病毒組分之量戍 產量。 一般而言，可藉由熟習此項技術者已知的任何合適方法 測定繁殖病毒粒子之量。病毒產量較佳可如上所述藉由測 定TCIDso來定量。所獲得之病毒組分的量可藉由熟習此項 技術者已知的任何合適方法來測定。適合之方法之實例為 單向輻射免疫擴散（SRID)測試，其可根據歐洲藥典 (Monograph 2149 (04/2009:2149) Influenza Vaccine (surface antigen，inactivated，prepared in cell cultures))之說明書進 行，用於測定HA。免疫化學法係基於抗體對抗原之選擇 性、可逆且非共價結合。使用此等方法偵測或定量抗原或 杬體。可偵測抗原-抗體複合物之形成，且可藉由多種技 術量測所形成複合物的量。免疫沈澱法（SRID)為一種簡單 的定量免疫擴散技術。當外部反應物與内部反應物之間已 建立平衡時，起源於外部反應物部位之環形沈澱區與所用 抗原之量成正比且與凝膠中之抗體濃度成反比。簡言之， 在凝膠模令洗鑄含有預定量抗血清之瓊脂糖凝膠。使用每 小瓶具有預定含量HA之各別適合病毒株之凍乾血球凝集 素抗原試劑以及每毫升瓊脂糖具有預定含量之各別適合病 毒株之凍乾抗血球凝集素綿羊血清。將參考抗原及單價本 體稀釋至預定濃度且在室溫下用1%兩性洗滌劑（破壞病毒 粒）處理3 0刀鐘。隨後將經處理之抗原及本體接種至刺入 154987.doc -49· 201202425 凝固凝膠中之孔中且在室溫下靜置擴散至少18小時隔夜。 之後，在凝膠黏結膜上乾燥凝膠且用滤紙（諸如沃特曼滤 紙（Whatman filter paper))及紙巾乾燥。一旦乾燥即用考 馬斯亮藍（Coomassie bdlliant bhle)G_25〇將凝膠染色以 便確定抗體/抗原凝集物之存在。使用適合軟體量測所得 沈殿區之直徑。隨後藉由使用統計分析程式計算血球凝集 素含量。 在該測試方法之步驟c)中，將步驟b)之感染性病毒粒子 添加至該等細胞之後所獲得之病毒粒子及/或加工病毒粒 子的產量與當使用在等於或高於1〇-5範圍内之參考Μ〇ι添 加相同類型感染性病毒粒子至相同類型細胞時所獲得之病 毒粒子及/或加工病毒粒子之量進行比較。該參考Μ〇ι較佳 為 10·3 〇 關於術語「參考MOI」，參考上文描述。 為測定最適於繁殖病毒粒子之方法的M〇I，在含有相同 培養基且使用相同加工條件之培養器皿中測試至少兩種不 同MOI。為此，使用至少兩個培養器皿；第一培養器皿含 有以如上所述之參考M0I接種之細胞培養組合物且第二培 養器皿含有使用本發明之極低M〇I接種之細胞培養組合 物。然而，較佳測試一種以上本發明之極低M〇I，以便發 現最適於各別加工條件之M〇I。因此，較佳以參考以⑴進 行 \以上接種及/或以極低MOI進行一次以上接種。此 外，可同時使用本發明不同之極低1^〇1進行一系列培養程 序。此外可在任何規模下進行該測試方法，該測試方法較 154987.doc -50- 201202425 佳首先在小規模下進行，隨後使用極低贿在半工業或大 規模細胞培養物下進行。 在^較佳實__ ’步驟b)之感練病毒粒子添 細:後所獲得之病毒粒子或加工病毒粒子之量為使用在至 少10 5或10·5以上範圍内之兔去 參考MOI添加相同類型感染性病 毒粒子至相同類型細胞後 病毒粒子或加工病毒粒 子之量的至少U倍'較佳至少15倍、更 至少3倍，其中病毒粒子之量較…廣且取佳 篁較佳在病毒添加後24小時測 定。可如上所述測定繁殖病毒粒子及病毒址分之量。、 本發明亦關於一種用於製造病毒粒子及/或病毒組分之 細胞培養組合物，其中 a) 已藉由使用至少〇 5 x〗〇6加Λ ， • 〇個細胞/毫升之起始細胞量製備 該細胞培養組合物，亦κ户 主 ' 卩在病毋添加時該細胞培養物中之 細胞量為至少0.5χ106個細胞/毫升，及 b) 已向步驟a)之細胞培養組合物中添加使用小於—之極 低MOI之總數的感染性病毒粒子，及 C)在病毒添加後1天範圍内，步驟b)之細胞培養組合物中 所存在之活細胞量相當於該細胞培養組合物中所存在之起 始細胞量（亦即在病毒添加時該細胞培養物中之活細胞量） 的至人約60%、較佳至少約7〇%、更佳至少約乃％、甚至 更佳至少約80%且最佳至少約抓。 在另一較佳實施例中，在病毒添加⑴天範圍内，步驟 b)之細胞培養組合物中所存在之活細胞量相當於該細胞培 養組合物中所存左夕xp 釔始細胞量的至少約1〇〇%或至少約 154987.doc 51 201202425 110%。 在另一較佳實施例中，在病毒添加後4 8小時之範圍内， 步驟b)之細胞培養組合物中所存在之活細胞量相當於該細 胞培養組合物中所存在之起始細胞量的至少約5%、較佳 至少約10%、較佳至少約丨5%。 關於例如細胞培養組合物、病毒粒子及/或病毒組分、 起始細胞量、接種細胞培養組合物（亦即添加病毒粒子至 細胞培養物）、MOI及測定細胞培養物中所存在之細胞量的 方法（細胞密度，以細胞/毫升表示），參考上文描述。該細 胞：養組合物可有利地改良病毒組分之製造，例如關於所 獲得之產量及/或關於製造該等病毒組分所需要之時間。 在-較佳實施例中，步驟a)之細胞培養組合物已根據如 本文所述之測試方法以所測試之M〇I接種。 在另-較佳實施财’該細胞培養組合物在病毒添加後 4天之後展現高於8 _ml、較佳高於9μβ/ηιΐ、更佳高於Μ

Kg/ml、甚至更佳高於15 且最佳高於_丨之 HA/ml比率。 關於術語「病毒添加後」，參考上文描述。 此外’本發明㈣於細胞培養組合物繁殖病毒粒子之用 途，其中以感染性病毒粒子接種含有至少MW個細胞/ 毫升之起始細胞量或如本文所定義之其他較佳細胞量之細 組合物；其中所用感染細胞所必需之感染性病毒粒 感染倍率」，)小於…。如上所述關 於病毒粒子兔殖方法或測試方法之其他較佳實施例亦適於 】54987.doc •52- 201202425 製備本發明之細胞培養組合物β 關於細胞培養組合物、病毒粒子、起始細胞量、接種細 胞培養物、感染性病毒粒子及Μ〇Ι ,再次參考上文描述。 此外，可如上所述收集及/或分離繁殖病毒粒子，且可視 情況進行如上所述之其他加工步驟。 本發明亦關於一種製造免疫原性病毒抗原、較佳流感病 毒抗原且更佳免疫原性血球凝集素（ΗΑ)蛋白之方法，其包 含以下步驟： a) 繁殖包含免疫原性ΗΑ之病毒粒子，其中向在病毒添加 時含有至少0.5X 106個細胞/毫升之細胞量的細胞培養組合物 中添加感染性病毒粒子，且其中所用感染細胞所必需之感 染性病毒粒子總數/細胞（Γ感染倍率」，M〇I)小於丨〇_5 ;及 b) 獲得繁殖病毒粒子，且視情況進一步加工該等繁殖病 毒粒子以分離免疫原性血球凝集素（HA)蛋白及/或免疫原 性神經胺糖酸苷酶（NA)蛋白。 在一較佳實施例中，該其他加工步驟包含對繁殖病毒粒 子之分離步驟及視情況選用之純化步驟。此步驟/此等步 驟之後為免疫原性病毒抗原、較佳流感病毒抗原且更佳免 疫原性球凝集素（ΗΑ)蛋白之分離步驟。上述其他加工步 驟為熟習此項技術者已知且為常規方法。其可為適於得到 如上所述之經分離之免疫原性病毒抗原的任何加工步驟。 在一較佳實施例中，藉由溶解進行以下繁殖病毒粒子之分 離步驟及免疫原性HA蛋白之分離步驟，例如評述於

Michael W. Wolff及Udo Reichl之「D〇Wnstream Processi 1 s · 154987.doc •53· 201202425

From Egg to Cell Culture-Derived Influenza Virus

Particles」，Chem. Eng. Technol. 2008, 31，第6期，846_857 中。 較佳首先分離該等病毒粒子且隨後自該等病毒粒子分別 分隔或純化免疫原性血球凝集素（HA)蛋白，且接著分離免 疫原性血球凝集素。如上文更詳細描述’其他加工步驟較 佳在病毒粒子之收集及/或分離步驟之後進行，且可包括 提取可與細胞或細胞片段締合之病毒組分、分隔病毒組 分、分離病毒組分且將其純化。 種藉由本發明之方法製備之免疫 另外，本發明係關於一 原性血球凝集素（HA)。 明 疇 以下圖式及實例更詳細地說明本發明，然而，其僅以說 性目的呈現Μ應理解為以任何方式限制本發明之範 方法 =養基之容積莫耳渗透濃度(—y)及 參透漢度（osmolality) 、 可藉由使用任何已知方時】如藉由使轉 谷積莫耳滲透濃度/重量莫耳滲透 娶叶）測疋 用相同方法測定用於培養細胞之細=養=制條件為使 殖之培養基的容積莫耳滲透濃度/重量莫耳㈣^病毒繁 藉由量測凝D點降低測定重量莫耳 又° 測定培養基之蛋白質含量 度。 可藉由使用任何已知方法測定培養基之蛋白質含量其 154987.doc -54- 201202425 制條件為使用相同方法測定用於培養細胞之細胞培養基 及用於病毒繁殖之培養基的蛋白質含量。若干方法可用， 例如L〇wry或Bradford檢定。 測定物質總量或個別物質之量 可藉由任何已知方法測定胺基酸、生長因子及無機鹽之 里’其限制條件為使用相同方法測定用於培養細胞之細胞 培養基及用於病毒繁殖之細胞培養基中的各別含量。 可例如藉由使用HPLC(高壓液相層析）測定胺基酸之量且 可例如藉由質譜分析測定生長因子之量。可藉由用離子選 擇性電極量測培養基中無機鹽之金屬離子濃度來測定無機 鹽含量。 實例 實例1 :培養MDCK細胞 在Cytodex 3微載體上以黏附細胞之方式培養MDCK細 胞。 製備Cytodex 3微載體： 根據以下方案製備培養MDCK細胞之Cytodex 3微載體且 滅菌：稱取所需量之乾燥微載體且添加至磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS)溶液中，以溶脹微載體。溶脹後，用PBS洗滌微載體 且隨後在121°C下滅菌。滅菌後，用細胞培養基置換PBS且 備用。 在具有31工作體積之生物反應器中培養MDCK細胞如下： 在準備好（校正感測器且滅菌）用於細胞培養之生物反應 器後，將細胞培養基及微載體添加至該生物反應器中。以 154987.doc •55· 201202425 約0.4χ 1 Ο·6個細胞/毫升之細胞密度將細胞接種至該生物反 應器。溫度保持在37°C，pH為7.1且溶解氧（DO)濃度大於 40 %之空氣飽和度。細胞將在3至4天内生長成單層細胞匯 合0 置換細胞培養基 在用感染性病毒粒子接種MDCK細胞之前，用增濃細胞 培養基置換該細胞培養基。根據以下方案置換培養基：停 止攪拌且使微載體沈降在生物反應器底部。在微載體沈降 後，藉由過壓經由80°/。浸潰管移除約80%之培養基，且隨 後用增濃培養基再填充生物反應器。 測定細胞密度（細胞/毫升） 已藉由使用1^11(：160(1：0111^61：((1；1161110111616(：)測定各別細胞培 養物中所存在之細胞的細胞密度。自生物反應器中獲取代 表樣品且在微載體沈降於試管中後，移除培養基。隨後用 溶解緩衝液及中和緩衝液處理微載體，使得能夠對細胞核 計數。 實例2 :病毒培養： 在 35°C、PH 7.1 及 DO > 40% 下培養病毒株 A/Wisc〇nsin/ 67/2005 (H3N2) X-161B。 分析病毒繁殖 在細胞社度達到約3 · 0 χ 106個細胞/毫升與約4. 〇 χ 1 〇6個細 胞/毫升之範圍内之後’以病毒株A/Wiscansin/67/2005 (H3N2) X-161B接種該細胞培養物。根據以下方案接種該 細胞培養組合物： 154987.doc -56- 201202425 在細胞培養基置換後，添加計算量之病毒且單獨添加少 量膜蛋白酶（0.5 mL 2.5 %騰蛋白酶溶液）。繼續繁殖病毒， 直至達到約100%之細胞病變效應（CPE)，其通常需要約3 天。可藉由顯微鏡目視檢查CPE，以估計微載體之細胞覆 蓋率。隨後可收集病毒。 分析病毒樣品 TCID5〇分析 以病毒之連續稀釋液感染MDCK細胞；若干天之後，記 錄細胞病變效應（CPE)且可計算為組織培養半數感染劑量 (TCID5G)。諸如TCID5G檢定之終點稀釋技術為量測病毒群 體之統計方法。分析該等資料之若干統計方法可用，例如 Spearman-Karber、Reed & Muench或概率分析。 SRID分析（HA濃度）： 用兩性洗滌劑處理流感病毒，以便使HA抗原分裂成可 擴散粒子。在擴散穿過含有特異性抗血清之瓊脂糖層之 後，抗原與抗血清一起形成沈澱環。藉由用考馬斯亮藍染 色，使此沈澱環顯而易見。將沈澱環直徑與以同樣方式處 理之標準溶液進行比較。以HA/mL表示含量。（Monograph 2149 (04/2009:2149) Influenza Vaccine (surface antigen, inactivated, prepared in cell cultures))。免疫化學法係基於 抗體對抗原之選擇性、可逆且非共價結合。使用此等方法 偵測或定量抗原或抗體。可偵測抗原-抗體複合物之形 成，且可藉由多種技術量測所形成複合物的量。免疫沈澱 法（SRID)為一種簡單的定量免疫擴散技術。當外部反應物 154987.doc -57- 201202425 與内部反應物之間已建立平衡時，起源於外部反應物部位 之環形沈殿區與所用抗原量成正比且與凝膠中之抗體濃度 成反比。 【圖式簡單說明】 圖1顯示藉由用病毒株A/Wisc〇nsin χ·161Β感染細胞所 產生之ΗΑ蛋白動力學（藉由srid檢定獲得）。 上方的線為條件「培養基置換EPI w/o BSA，ΜΟΙ ΙχΙΟ·6」 。其意謂已使用本發明之極低MOi及不具有顯著較低量蛋 白質、生長因子及/或無機鹽及/或具有用於細胞培養之培 養基之至少95%重量莫耳滲透濃度的病毒繁殖培養基（Ερι w/o BSA)(該病毒繁殖培養基中僅不含BSA)。此較佳方法 提供最佳結果。 中間曲線為條件「培養基置換CM ; MOI 1 X1 〇·6」，其 提供使用本發明之極低M0][的改良。在此條件下，細胞培 養基已經置換為病毒繁殖培養基，病毒繁殖培養基與細胞 培養基相比具有顯著較低量之蛋白質、生長因子及/或無 機鹽，及/或此培養基之重量莫耳滲透濃度小於用於細胞 培養之培養基之重量莫耳滲透濃度的95%。此病毒繁殖培 養基稱為「CM」培養基。 下方曲線為條件「培養基置換Cm ; ΜΟΙ 1χΐ〇·3」。在 此條件下，該細胞培養基已經置換為CM培養基且已以 1χ1〇3之MOI接種。此先前技術之方法提供最低11八蛋白含 量。 條件「培養基置換Epi w/o BSA，MOI lxio·6」在感染後 154987.doc •58· 201202425 第4天之平均血球凝集素蛋白產量為37〇 。條件「培 養基置換CM ; MOI lxio·6」在病毒添加後第4天產生19 Mg/ml之ΗΑ產量，且條件「培養基置換CM ; M〇I lxl〇.3j 在病毒添加後第4天具有8.7 Bg/ml之降低4倍之平均HA產 量。 此圖顯示與以參考MOI(例如MOI 1 X1 〇·3 ,下方曲線）接 種細胞相比’以極低MOI(例如ΜΟΙ 1χΐ〇-6，中間曲線及上 方曲線）接種細胞培養物後之ΗΑ產量顯著增加。此外：.顯 示此效應係歸因於ΜΟΙ降低（ΗΑ產量增加，比較下方曲線 與中間曲線），且若已用於細胞培養之培養基不用CM培養 基置換，而是用不具有顯著降低量蛋白質、生長因子及/ 或無機鹽及/或具有用於細胞培養之培養基之至少95%之重 量莫耳滲透濃度的培養基置換，則此效應可進一步增加。 圖2顯示在病毒株a/Wisconsin X-161B繁殖期間黏附細 胞之細胞動力學。 連續曲線為條件「培養基置換CM ; MOI lxlO·3」。此 條件顯示感染後第1天量測之細胞密度的較快且較大減 ✓J、〇 虛曲線表示條件「培養基置換CM ; MOI 1 X 1 〇-6」。此 處可見所量測之細胞密度輕微減小。 點線為條件「培養基置換EPI w/o BSA，MOI 1χΐ〇-6」。 此處可見感染後第1天所量測之細胞密度輕微增加。 此圖顯示，如各別細胞密度（細胞/毫升）所指示，與以參 考MOI(例如MOI 1 X 10·3)接種細胞相比，在以極低MOI(例 154987.doc -59· 201202425 如MOI 1 χ 1 0·6)接種細胞後，更多細胞存活。此外，顯示此 效應係歸因於ΜΟΙ降低，且根據本發明藉由在感染之前置 換培養基可進一步增加此效應。 圖3 員示在病毒株A/Wisconsin Χ-161Β繁殖期間之 tcid50。 曲：件曰甘培養基置換CM; M01 lxl0·3」A最低處的連續 及「、他條件（「培養基置換Epi w/0 BSA，M01 lxl0_6」 明較高感染性病毒產量，其引起賴 兩條線。車交f換⑽，ΜΟΪ lxl0·6」）為具有類似值之上方 兩條踝較高TCI〇5〇表 高蛋白質產量。 154987.doc 6〇、

Claims (1)

1. 201202425 七、申請專利範圍： ι_ 一種繁殖包含免疫原性血球凝集素（HA)之流感病毒的方 法，其中在第一步驟中於細胞培養物中培養細胞及其中 隨後在第二步驟中添加感染性流感粒子至該細胞培養 物，其中詩培養該等細胞之培養基在該病毒添加步驟 之則或期間置換為與先前用於培養該等細胞之培養基的 重量莫耳滲透濃度（osmolality)相比，具有至少8〇%之重 量莫耳渗透濃度的培#基，J^與先前用於培養該等細 胞之培養基相比不具有顯著較低量，較佳不少於50%之 蛋白質、生長因子及/或無機鹽之總量，其中在病毒添加 時該細胞培養物中之細胞量為至少0.5 X 1 06個細胞/毫 升，其中在病毒添加後12至36小時内活細胞密度不低於 病毒添加時該細胞密度之40%，其中 在該病毒添加步驟期間所添加之感染性病毒粒子總數/ 細胞（感染倍率（Multiplicity 〇f infecti〇n)，MOI)小於 1 〇-ί。 2. 如响求項1之方法，其中該置換培養基不含bsa(牛血清 白蛋白）。 3. 如請求項1或2之方法，其中該置換培養基不補充抗生 素。 .如月求項1或2之方法，其中在感染性流感粒子添加之 後，蛋白酶以1 pg/ml至5〇 μδ/ιη1之濃度範圍添加至該培 養基。 5.如請求項4之方法，其中蛋白酶以大於1〇吨/如至^ pg/ml之濃度範圍、較佳15吨/爪1至5〇叫/…之濃度範 154987.doc 201202425 圍、更佳2,0 pg/ml至5〇 pg/ml之濃度範圍、甚至更佳2 $ pg/ml至5〇 pg/mi之濃度範圍添加至該培養基。 6.如請求項4之方法’其中該蛋白酶為胰蛋白酶。 7·如請求項丨或2之方法，其中該等細胞為固著依賴性 (anchorage-dependent)細胞。 8.如咕求項1或2之方法，其中在該病毒添加步驟期間所添 加之該感染性病毒粒子總數/細胞（感染倍率，Μ〇ι)等於 或小於10·6。 ' 如月求項1或2之方法，其中在該病毒添力口步驟期間所添 加之該感染性病毒粒子總數/細胞（感染倍率，m〇i)等於 或小於10·7。 、 10.如明求項1或2之方法’其中在該病毒添加步驟期間所添 加之該感染性病毒粒子總數/細胞（感染倍率，Μ⑺）等於 或小於10·8。 ' 11. 如請求項!或2之方法’其中在病毒添加後12至36小時内 該活、·田胞在度不低於病毒添加時該細胞密度之。 12. 如請求項1或2之方法’其中在病毒添加後U至36小時内 該活細胞密度不低於病毒添加時該細胞密度之 13. 如清求項1或2之方沐，甘士 m 万法其中用於培養該等細胞之培養基 在該病毒添加步驟之俞赤M 訂次』間置換為與先前用於培養該 等細胞之培養基的重晉苴 更量莫耳滲透濃度相比，具有至少 95%之重量莫耳滲透濃度的培養基。 14.如請求項1或2之方法，其中 丹甲在病毒添加時該細胞培養物 中之細胞量為至少3.〇xl〇6個細胞/毫升。 154987.doc 201202425 15. 如請求項1或2之方法，其中在症皇 病毒添加時該細胞培養物 中之細胞量為至少5.OxlO6個細胞/毫升。 16. 如請求項1或2之方法，其中在病▲ 届毒添加時該細胞培養物 中之細胞量為至少7.Ox 1〇6個細胞/毫升。 17. 如請求項1或2之方法，其中在病基 届蚕添加時該細胞培養物 中之細胞量為至少9.ΟχΙΟ6個細胞/毫升。 18. 如請求項1或2之方法，其中在病毒 用每添加時該細胞培養物 中之細胞量為至少11.0Χ106個細胞/毫升。 19·如請求項1或2之方法，其中在病表 社届蚕添加時該細胞培養物 中之細胞量為至少13.ΟχΙΟ6個細胞/毫升。 20.如請求項1或2之方法，其中所用細 吓用>，·田胞為動物細胞，較佳 為哺乳動物細胞。 •如請求項20之方法，其中所用細胞為mdck細胞。 22. 如請求項_之方法’其中該方法進一步包含一或多個 進一步加工該等繁殖病毒粒子之步驟。 23. 如請求項22之方法’其中該等加工病毒粒子包含不活化 (inactivated)病毒粒子、及/或減毒病毒粒子及/或分裂 病毒抗原、及/或次單位病毒抗原、及/或病毒體 (virosomes)。 24. 如請求項23之方法，其中該等加工病毒粒子包含一或多 種流感抗原。 25. 如請求項丨或2之方法，其係用於製造流感疫苗。 26. 如請求項1之方法，其中該置換培養基不含bsa(牛血清 白蛋白），其中該置換培養基不補充抗生素，且其中在添 154987.doc 201202425 加感染性流感粒子後將蛋白酶以！ pg/m丨至5〇 μ§/ηι1之濃 度範圍添加至該培養基。 27. —種測試添加感染細胞所需之極低數目感染性病毒粒子/ 細胞（ΜΟΙ)之預選病毒株至用於繁殖病毒粒子之細胞培 養組合物是否致使該等病毒粒子及/或加工病毒粒子產量 增加的方法，其包含以下步驟： a) 使細胞在細胞培養組合物中生長，直至達到至少 〇·5 X1 〇6個細胞/毫升之細胞密度， b) 使用極低Μ ΟI將該預選病毒株之感染性病毒粒子總 數添加至該細胞培養組合物，其中該極低ΜΟΙ為小於1〇-5 之 ΜΟΙ， c) 比較步驟b)之感染性病毒粒子添加至細胞後所獲得 之該等病毒粒子及/或加工病毒粒子的產量與使用等於戈 商於1〇·5範圍内之參考MOI將相同類型感染性病毒粒子 添加至相同類型細胞時所獲得之病毒粒子及/或加工病毒 粒子之量。 ’ 154987.doc