TW201215332A - Milk-based protein hydrolysates and infant formulae and nutritional compositions made thereof - Google Patents

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201215332 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於包含基於牛奶之蛋白質水解物的組合物， 其可藉由用來自源於微生物之酶處理基於牛奶之蛋白質材 料的溶液而獲得。該等組合物可併入嬰兒配方及成人食物 補充劑中。本發明係關於兩種不同類型之蛋白質水解物， 其旨在過敏預防及過敏治療。在第一種情況下’嬰兒為健 康的，但其由於家族過敏史而有過敏風險。在第二種情況 下，嬰兒或成人為過敏或有需要者，因此為患病者。 序列表之引用 /本申請案含有電腦可讀形式之序列表。該電腦可讀形式 係以引用的方式併入本文中。 【先前技:術】 就嬰兒營養而言’人類母乳及母乳餵養代表著毫無異議 的最高標準。作為人類母乳之替代品或補充劑的嬰兒配方 應滿足嬰兒之營養需求，具有可接受之味道且當面向有過 敏風險之嬰兒時，其為低過敏原的及致耐受性的（亦即^ 夠誘導口服耐受性）。已於Ep〇827697中描述對牛奶之口月^ 財受性的誘導。眾所周知，牛奶及含有牛奶蛋白質之嬰兒 配方引起過敏係由於牛奶蛋白質不同於母乳蛋白質且复合 構成人類過敏原的事實。公認之主要牛乳過敏原為吨: 蛋白（aLA)、β乳球蛋白（bLG)及牛血清白蛋白⑽a)。 清蛋白及/或酪蛋白诵赍 ? 逋*用作嬰兒配方中之乳蛋白源。 了降低過敏原性，用始u Λ丨π 纵W用S#水解牛奶蛋白質並從而使其分解為

S 159236.doc 201215332 肽。由該等旨在預防過敏之牛奶蛋白質水解物組成的當前 之低過敏原配方亦包含其他營養物，諸如動物油、彳

油、澱粉、麥芽糊精、乳糖及蔗糖。該等蛋白質水解物亦 可併入成人乳飲料或食物補充劑中Q 必須小心監控用於產生該等水解物之水解過程以使得最 終產物水解物保留其營養價值及所要物理性質，但為低過 敏原性及致对受性。 視水解反應進行之程度而定，水解物之特徵可為「部分 孓」或 充釦型」。根據WAO(世界過敏組織，w〇rld Allergy Organization)有關牛奶蛋白質過敏（CMA)之準則， 目前雖對充分水解產物（Extensively Hydr〇lyzed Pr〇duct)沒 有一致之法律上/臨床上的定義，但根據WA〇 一致認為水 解配方已證明為有效及廣泛用於罹患CMA之嬰兒的蛋白質 源。在本發明中，部分水解物為6〇%蛋白質/肽群之分子量 小於1000道爾頓的水解物，而充分水解物為至少95%蛋白 質/肽群之分子量小於1000道爾頓的水解物。該等定義目 則用於行業中。認為部分水解物為低過敏原性（HA)，而認 為充分水解物為非過敏原性。 斗夕團體已展開研究以優化水解過程。包括溫度及反應 益體積、水解循環數、蛋白質受質、酶類型及濃度之選擇 的水解反應條件為影響水解反應並因此影響最終產物之物 理、化學及最終生物性質之諸多因素中的一些。在 EP0353122中，使用胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶活性比率為 〇 ’ 6 6之胰蛋白岭與姨凝乳蛋白酶的混合物來製備低 159236.doc 201215332 過敏原的乳清蛋白質水解物。WO9304593 A1及 US503 9532A亦揭示使用胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶之水解 過程，其包括兩步式水解反應及在兩步之間具有熱變性步 驟，以確保最終水解物實質上無完整的過敏原蛋白質。該 等方法中所用之胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶為藉由提取豬胰 臟所製備之製劑。市場上存在有許多基於該等方法製備的 含有蛋白質水解物之產物。例如，可由用自動物胰臟提取 之胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶製得的水解物製備NestK HA® 配方，且已充分研究並記載其低過敏原的特性。已發表三 篇主要論文，其報導在德國進行之大型隨機化及雙盲干預 研究的結果，其目的在於比較水解配方與標準牛奶配方有 關預防有風險之嬰兒的過敏表現（尤其異位性濕疹）之作 用。該出版物如下所列：在生命第一年中水解牛奶配方有 關過敏預防之作用（The effect of hydrolyzed cow's milk formula for allergy prevention in the first year of life) ·德 國嬰兒營養干預研究（German Infant Nutritional Intervention Study)，一 項隨機化雙盲實驗。von Berg A， Koletzko S, Griibl A, Filipiak-Pittroff B, Wichmann HE, Bauer CP, Reinhardt D，Berdel D;德國嬰兒營養干預研究 組（German Infant Nutritional Intervention Study Group). J Allergy Clin Immunol. 2003年3月；11 1:533-40。 某些水解配方降低異位性皮膚炎發生率，但不降低哮喘 發生率：德國嬰兒營養干預研究之三年結果。von Berg A,

Koletzko S, Filipiak-Pittroff B, Laubereau B, Grubl A,

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Wichmann HE，Bauer CP，Reinhardt D，Berdel D;德國嬰兒 營養干預研究組（German Infant Nutritional Intervention Study Group)· J Allergy Clin Immunol. 2007 年 3 月； 119:718-25 。 水解嬰兒配方之預防作用持續至6歲：來自德國嬰兒營 養干預研究（GINI Study)之長期結果。von Berg A， Filipiak-Pittroff B, Kramer U, Link E, Bollrath C, Brockow I, Koletzko S, Grubl A, Heinrich J, Wichmann HE, Bauer CP, Reinhardt D, Berdel D; GINIplus研究組，J Allergy Clin Immunodol 2008;121:1442-7 0 後一項GINI研究結論為對高風險兒童使用NestlS Η.Α·(ΝΑΝ HA®)嬰兒配方進行早期營養干預時，對異位性 皮膚炎具有直至6歲的長期預防作用，此表示疾病真正的 減輕而非延缓疾病發作。 長期預防作用意謂預防作用持續時間遠遠超過Nan HA® 餵養時間，此顯示已誘導口服耐受性，不過GINI研究中未 檢驗涉及該对受性誘導之免疫機理。 除低過敏原性之外，若欲用作母乳補充劑或替代品的嬰 兒配方能夠在嬰兒中誘導口服耐受性時，將極為有利。口 服耐受性為藉由經口服途徑事先投與某一抗原，而特異性 抑制針對該抗原之細胞及/或體液之免疫反應性。其為生 命第一個月中免疫系統發育之重要部分，且允許嬰兒進食 而無不良反應。口服耐受性建立之失敗會導致過敏。口服 财受性之演變與免疫系統訓練（immune system education) 159236.doc 201215332 有關，其最終將降低對食物抗原之反應。咸信一些可明確 存在於部分水解之嬰兒配方中的肽能夠與免疫系統相互作 =且誘：口服耐受誘導性。咸信該等肽應具有特定性質， 括相田】、的尺寸，以更能支持免疫系統訓練，但其本身 不^成為過敏原。亦咸信特定肽之序列可具有重要作用。 特疋水解物狀型態可實際上為口服耐受性誘導之核心。 目引廣’乏的趨勢為自使用來自動物之酶轉向使用來自微 生物源之酶。在過去的20年中，利用遺傳工程，在酶製造 ，有°午夕進步。此使得可在相當短的時間期内，可再 2性地製備大量高品質、高純度的酶。由於該等原因，將 會希望能约使用來自微生物源之酶來製造欲用於低過敏原 的嬰兒配方之牛奶蛋白質水解物。此外，將會高度希望該 等牛奶蛋白質水解物能夠在嬰兒中誘導口服耐受性。 口此’為了保留哺乳動物酶源性水解物之低過敏原性 質，彼等用微生物酶製得之水解物必須具有類似的化學、 物理及生物性質。此外’市場上任何新的嬰兒配方須遵從 嚴格的f理準則’例如在歐洲指令2_/141/EC中適合。 因此’希望任何新產品具有與已確認之用哺乳動物酶製成 的產品十分類似之肽型態’以便保持過敏預防作用。此 外’將會南度希望該等牛奶蛋白質水解物能夠在嬰兒令誘 導口服耐受性。 —類似地’希望特定言之藉由在完全營養組合物中提供特 定蛋白質水解物來促使過敏或不良反應減少、增強蛋白質 或胺基酸之吸收、有助於蛋白f或胺基酸之利用及/或二 159236.doc 201215332 節患病患者之炎症進程。 需要一種藉由非哺乳動物酶，較佳為微生物酶之作用而 製備的由牛奶獲得之蛋白質水解物，其呈現低致敏性，同 時呈現口服耐受誘導之能力。 需要該等者及水解物㈣包含於以有㈣風險之個體為 目標的嬰兒配方及/或營養組合物中。 而要遠等組合物在今後生命巾降低過敏之風險或嚴重性 且有助於調節過敏症狀之發生。 需要獲得基於細菌酶之水解物，其所具有之肽型離盥由 哺乳動物酶獲得之水解物部分相❻，且甚至因此能夠再現 後者的口服耐受性，且展示能預防過敏症狀。 需要使用與上述相同之酶來製備用於患病或虛弱患者之 營養組合物。 除了製造「部分型」水解物以外，該等微生物酶亦可用 於製造存在於治療时巾之「充分型」蛋白質水解物，諸 如彼等意隸養對牛奶過敏之嬰兒及兒童的物#。在該種 情況下，目標群體將會為已對牛奶蛋白f敏感之患病（過 敏）嬰兒及兒童。 彼等微生物酶亦可用來製造任何類型之用於嬰兒、兒童 或成人產品的蛋白質水解物’除了彼等與過敏相關者以 外’該等產品亦以其他益處為目標’諸如有助於消化、增 強胺基酸、肽及蛋白質之吸收與代謝、促進疾病恢復、^ 化氮源利用、促進組織建立及能量儲存。 為了解決該問題，本發明者已進行大範圍的研究項目， 159236.doc 201215332 且已比較許多作為用於進行水解反應之潛在候選者的微生 物酶。其監測包括水解反應效能、酶特異性及肽分子量型 態之參數且已確定許多特異性酶混合物可提供具有所要之 物理、化學及生物性質的水解物。可有效地及可再現地製 得本文所揭示之牛奶蛋白質水解物，其具有可接受之味 道’具有所需之營養價值及為低過敏原的。此外，本發明 之水解物可誘導口服耐受性。 【發明内容】 本發明係關於包含基於牛奶之蛋白質水解物的組合物， 其可藉由用以下物質處理基於牛奶之蛋白質材料的溶液而 獲得： a)至少—種由微生物產生之胰蛋白酶樣内肽酶，及 )’ 種由彳政生物產生之姨凝乳蛋白酶樣内肽酶。 如由肽分子量型態、肽序列型態（内肽酶特異性）及内肽 酶水解效率所表徵，本發明之水解物具有與彼等由哺乳動 物酶製得的基於牛奶之蛋白質水解物類似的性質。 本發明之水解物具有治療及預防作用，且尤其可用於在 有需要之嬰兒或患者中誘導口服耐受性，或在有需要之嬰 兒或患者中降低過敏風險，或在嬰兒期或在今後生命中降 低過敏之嚴重性，尤其在有需要之嬰兒或患者中。 該等水解物可併人詩需要治療之個體的初生嬰兒配方 (infant starter f〇rmula)、第二階段配方㈦^⑽谓 且該組合物 s fonrnda)、嬰孩食物配方、嬰兒縠物配方或成長牛奶，或 成人營養組合物或基於乳蛋白之成人飲品中， 159236.doc 201215332 較佳為初生嬰兒配方。 在本發明之一態樣中，該至少一種胰蛋白酶樣内肽酶係 由鐮刀菌屬（F⑽aWww)菌株、較佳為尖孢鐮刀菌 OX少獲得，或由庫茨涅爾氏菌屬菌株、 較佳為白色庫茨涅爾氏菌（尤而)獲得。 在本發明之另一態樣中，該至少一種胰凝乳蛋白酶樣内 肽酶係由擬諾卡氏菌屬（iV〇carA〇;?i„·5)菌株、較佳為擬諾卡 氏菌咖㈣加户…办.）獲得，或由綠僵菌屬 (Me_)、較佳為金龜子綠僵菌（输⑽ cmbop/iae)獲得，或由小枝抱屬（忍rflc知、較佳為 小枝孢（^rac/^worfeZ/a料；^如)獲得。 在本發明之另一態樣中，胰蛋白酶樣内肽酶與胰凝乳蛋 白酶樣内肽酶之比率以酶重量計在5:1至35:1、較佳為⑽」 至30:1之範圍内，更佳為27:1。 #在本發明之另一態樣中，當胰蛋白酶樣内肽酶係由鐮刀 囷屬菌株獲得且胰凝乳蛋白酶樣内肽酶係由擬諾卡氏菌屬 菌株獲得時’胰蛋白酶樣内肽酶與胰凝乳蛋白酶樣内狀酶 之比率以酶重量計為9:1。 【實施方式】 本發明之基於牛奶的蛋白質水解物係#由用纟自微生物 源之騰蛋白酶樣内肽酶及胰㈣蛋白酶樣内肽酶處理基於 牛奶之蛋白質材料的溶液而獲得。 基於牛奶之蛋白質材料 在本發明之組合物中，起始物質為基於牛奶之蛋白質材 159236.doc -10- 201215332 料。其可為基於乳清之蛋白質材料、酪蛋白或基於乳清之 蛋白質材料與酪蛋白之混合物。酪蛋白源可為酸酪蛋白或 非脂乳固體（non-fat milk solid)。基於乳清之蛋白質材料 可為來自乳酪製造之乳清，尤其為甜乳清（諸如由凝乳酶 凝聚酪蛋白而產生之甜乳清）、由酸或酸化醱酵凝聚酪蛋 白而產生之酸乳清，或者甚至為由酸及由凝乳酶凝聚而產 生之混合乳清。該起始物質可為已藉由離子交換及/或藉 由電透析而脫礦物質之乳清且被稱為脫礦物質乳清蛋白質 (DWP)。在一個較佳實施例中，該基於乳清之蛋白質材料 的來源為已完全或部分移除酪蛋白糖巨肽（CGMP)之甜乳 清。其被稱為改質甜乳清（MSW)。自甜乳清移除CGMP產 生蘇胺酸及色胺酸含量接近於人乳之蛋白質材料。EP 880902描述自甜乳清移除CGMP之方法。 起始物質可為DWP與MSW之混合物。其可為乳清蛋白 質濃縮物35%至80%蛋白質（WPC)，或若乳清蛋白濃度高 於95%蛋白質時可為分離物（WPI)。可列舉獲自Aria Foods, Denmark之WPC 87 Lacprodan®作為WPC之實例，且可列 舉獲自 Davisco Foods International(Minnesota USA)之 Bipro®作為WPI之實例。 基於牛奶之蛋白質材料可為溶液或懸浮液，且以按重量 計2%至3 0%、更佳為5%至20%、更佳為6°/。至10%蛋白質材 料之濃度存在。 該起始物質甚至可為上述起始物質與乳糖之組合。乳糖 可作為乳清蛋白質濃縮物之一部分而存在或可為添加的。

S 159236.doc - 11 - 201215332 向起始物質中添加乳糖以進行水解之益處在於，乳糖中含 有之任何殘餘蛋白質已水解。乳糖可以0 05%〜&至3〇% W/W'較佳為〇·1〇% W/W至20。/。w/w之濃度存在，或在較低 乳糖含量為較佳之情況下為0·10% w/w至1% w/w，較佳為 0.10% w/w至0.20% w/w。在後者之情況下’最終產物可意 欲用於具有低乳糖耐受性之嬰兒或成人。可將乳糖移除， 例如，藉由超濾（產生UF乳清），視情況接著進行透析來達 成。 §玄起始物質可為真水溶液或勝狀水溶液形式，或為粉末 形式。在後者之情況下，將粉末溶於較佳經脫礦物質之水 中以形成水溶液。 由微生物產生之酶 本發明之胰蛋白酶樣内肽酶及胰凝乳蛋白酶樣内肽酶可 由任何屬之微生物產生。在本文中提供「由.產峰 t • · · /王工」日 在意謂由既定生物體之細胞的礙酵產生。後述之酶可由產 生其之生物體天然產生’或可藉由插入編碼内肽酶之核苦 酸序列而於宿主生物體中工程改造而得。 胰蛋白酶樣内肽酶 胰蛋白酶（EC 3.4.21.4)為一種絲胺酸蛋白酶，其可於許 多脊椎動物之消化系統中發現’且於彼處水解蛋白質。其 作為惰性酶原胰蛋白酶原產生於胰臟中。胰蛋白酶主要裂 解胺基酸離胺酸或精胺酸羧基側處之肽鏈或連接，但離胺 酸或精胺酸後為脯胺酸之情形除外。在本發明中，「騰蛋 白酶樣内肽酶」意謂一種具有類似於哺乳動物胰蛋白酶 159236.doc •12· 201215332 (例如自豬胰臟組織提取之胰蛋白酶）活性之活性的酶。「胰 蛋白酶樣内肽酶」亦意謂一種優先裂解精胺酸及/或離胺 酸’較佳為精胺酸及離胺酸之L異構體C端側處的肽或蛋白 質之内肽酶。胰蛋白酶樣内肽酶可由以下菌株獲得：革蘭 氏陽性細菌（gram-positive bacterial)菌株，諸如桿菌屬 動株、梭菌屬菌株、腸球菌屬 產株、芽抱桿菌屬（(7ec^acz7/WiS)菌株、庫茨 /圼爾氏函屬菌株、乳桿菌屬菌株、乳球菌 屬（Z^ciococcw·?)函株、海洋桿菌屬菌株、 葡萄球菌屬（^otp/^/ococcM·?)菌株、鏈球菌屬 (iSVrepiococcw·?)菌株或鏈黴菌屬（价菌株；或革 蘭氏陰性細菌（gram negative bacterial)菌株，諸如曲狀桿 菌屬（C㈣py/〇6acier)菌株、大腸桿菌屬（心c/^rk/ζ/α)菌株 (較佳為大腸桿菌（五· co//))、黃桿菌屬•謂）菌 株、細梭菌屬（7?⑽0^acierz•謂）菌株、螺旋桿菌屬 (ife//co办acier)囷株、泥桿菌屬（//y〇6acier)菌株、奈瑟菌屬 (TVeher/a)函株、假單胞菌屬（户菌株、沙門氏 囷屬（<Sa/mcme//a)菌株或尿素原體（f/yap/awa)菌株；或真 函囷株’诸如酵母菌屬菌株、克魯維酵母 屬（A^i^yverom^yces)菌株、畢赤酵母屬菌株、念珠 囷屬ij株、麵菌屬菌株、青徽菌屬 菌株、鐮黴菌屬菌株及麥角菌屬（c/aWcepiS) 菌株。在一個較佳實施例中，胰蛋白酶樣内肽酶為真菌内 肽酶，較佳由鐮刀菌屬菌株、更佳為具有已以名稱

S 159236.doc -13- 201215332 SWISSPROT編號P3 5049登記之序列的尖孢鐮刀菌獲得。 胰蛋白酶樣内肽酶與SWISSPROT編號P35049可具有至少 75%、至少80%、至少85%、至少90°/。、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98°/。、至少99%或100%之序列一致 性。已描述由後述序列編碼之酶（US5,288,627 ; US5,693,520) ° 在另一較佳實施例中，胰蛋白酶樣内肽酶係由革蘭氏陽 性細菌、較佳為庫茨淫爾氏菌屬菌株、更佳為由白色庫茨 涅爾氏菌獲得。在另一較佳實施例中，胰蛋白酶樣内肽酶 與SEQ ID ΝΟ:1之成熟多肽具有至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95°/。、至少96%、至少 97%、至少98% '至少99%或100%之序列一致性。 胰蛋白酶樣内肽酶之濃度可為每公克食物蛋白100至 500,000 USP姨蛋白酶單位（USP Trypsin Unit)，例如 250至 250,000或500至100,000。一個USP胰蛋白酶單位為在pH 7.6及25°(：下使用鹽酸>^苯甲醯基-1^精胺酸乙酯（8八££)作 為受質，在253 nm下引起0.003之吸光度變化的活性。 其他以>95%純酶蛋白之毫克數/毫升表述者意謂胰蛋白 酶樣内肽酶濃度可在每公克乳蛋白0.5毫克至4毫克、較佳 為每公克乳蛋白1毫克至3.5毫克且更佳為每公克乳蛋白1.5 毫克至3毫克之範圍内。此與胰凝乳蛋白酶樣内肽酶之存 在無關。 酶類：胰凝乳蛋白酶樣内肽酶 胰凝乳蛋白酶（EC 3.4,21.4)為一種優先裂解醯胺鍵 159236.doc -14- 201215332 置）叛基側為酪胺酸、色胺酸或苯丙胺酸之肽醯胺鍵的絲 胺酸蛋白酶。胰凝乳蛋白酶亦以較慢速率水解肽中之其他 酿胺鍵，尤其彼等在位置含有白胺酸者。「胰凝乳蛋白 酶樣内肽酶」意謂具有類似於哺乳動物胰凝乳蛋白酶（例 如自豬胰臟組織提取之胰凝乳蛋白酶）活性之活性的酶。 其亦意謂針對裂解酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、白胺酸、 曱硫胺酸及組脍酸殘基各自之羧基端侧比裂解精胺酸及賴 胺酸兩者之羧基端側具有較高特異性的酶。 本發明之胰凝乳蛋白酶樣内肽酶可由以下菌株獲得：革 蘭氏陽性細菌菌才朱，諸如桿菌屬菌株、梭菌屬菌株、腸球 菌屬i!株、芽孢桿菌屬菌株、庫茨淫爾氏菌屬菌株、乳桿 囷屬菌株、乳球菌屬菌株、海洋桿菌屬菌株、葡萄球菌屬 菌株、鏈球菌屬菌株或鏈黴菌屬菌株；或革蘭氏陰性細菌 f株，諸如曲狀桿菌屬菌株、大腸桿菌屬菌株（較佳為大 腸桿菌）擬諾卡氏菌屬菌株'黃桿菌屬菌株、細梭菌屬 菌株螺叙杯菌屬菌株、泥桿菌屬菌株、奈瑟菌屬菌株、 假皁胞菌屬菌#、沙門氏菌屬菌株或尿素原體菌株；或真 菌菌株’諸如酵母屬菌株、克魯維酵母屬菌株、畢赤酵母 屬+菌株&珠囷屬菌株、麴菌屬菌株、青黴菌屬菌株、鐮 刀囷屬菌株及麥角菌屬菌株。較佳地，本發明之姨凝乳蛋 白酶樣⑽酶可由革蘭氏陽性細菌菌株或革蘭氏陰性細菌 :株獲付:在—個更佳實施例令’姨凝乳蛋白酶係由擬諾 氏囷屬菌株、較佳為擬諾卡氏菌EMBLCDS CAI94179# 得(先前描述於例如_咖947中)。在另一較佳實施； 159236.doc -15- 201215332 中，胰凝乳蛋白酶樣内肽酶與多肽EMBL CDS CAI94179具 有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或 100%之序列一致性。 在另一個更佳的實施例中，胰凝乳蛋白酶樣内肽酶係由 綠僵菌屬（Meiar/ziz/wwi)、較佳為金龜子綠僵菌 (Metarhizium 獲得，例如具有序列 TREMBL:Q9Y843之成熟多肽的胺基酸序列者。在另一較 佳實施例中，胰凝乳蛋白酶樣内肽酶與多肽 TREMBL:Q9Y843具有至少70%、至少75%、至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%或100%之序列一致性。在另一個更佳的實 施例中，胰凝乳蛋白酶樣内肽酶係由小枝孢屬 (Brachysporiella)、較佳為小枝抱(Brachysporiella gaj；ana)(CGMCC 0865，即 W02004/072279 中所揭示之胺基 酸1至1 86)獲得。在另一較佳實施例中，胰凝乳蛋白酶樣 内肽酶與後述參考多肽具有至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性。 胰凝乳蛋白酶樣内肽酶之濃度較佳為每公克基於牛奶之 蛋白質100至100,000 USP胰凝乳蛋白酶單位（USP Chymotrypsin Unit)，更佳為每公克基於牛奶之蛋白質500 至50,000 USP胰凝乳蛋白酶單位，且最佳為每公克基於牛 奶之蛋白質1,〇〇〇至20,000 USP胰凝乳蛋白酶單位。一個 159236.doc -16- 201215332 USP胰凝乳蛋白酶單位為在pH 7 0及25〇c下，使用N_乙醯 基-L-酿胺酸乙醋（ATEE)作為受質，在237 nm下引起0.0075 之吸光度變化的活性。其他以>95%純酶蛋白之毫克數/毫 升表述者意謂胰凝乳蛋白酶樣内肽酶濃度可在每公克乳蛋 白0.05毫克至2毫克、較佳為每公克乳蛋白〇1毫克至i毫克 且更佳為每公克乳蛋白0.15毫克至〇4毫克之範圍内。此與 胰蛋白酶樣内肽酶之存在無關。 在水解過程期間，以混合物形式一起使用該等酶。例 如，由白色庫茨涅爾氏菌獲得之胰蛋白酶樣内肽酶可與由 擬諾卡氏菌或金龜子綠僵菌或小枝孢獲得之胰凝乳蛋白酶 樣内肽酶結合。例如，由尖孢鐮刀菌獲得之胰蛋白酶樣内 肽酶可與由擬諾卡氏菌或金龜子綠僵菌或小枝孢獲得之胰 凝乳蛋白酶樣内肽酶結合。 本發明者已發現，以酶之重量計，胰蛋白酶樣内肽酶與 胰凝乳蛋白酶樣内肽酶之比率（T/C比率）應在5:1至35:1、 較佳為20:1至30:1之範圍内，更佳為27] ^此外，當姨蛋 白_樣内肽_係由錄刀囷屬囷株獲得且胰凝乳蛋白酶樣内 肽酶係由擬諾卡氏菌屬菌株獲得時，Τ/c比率之較佳範圍 為8:1至11:1，更佳為9:1。 尤為準確的是，由尖孢鐮刀菌獲得之胰蛋白酶樣内肽酶 (T)與由擬法卡氏菌獲得之騰凝乳蛋白酶樣内肽酶⑴）以9 _ I 之Τ/c比率組合，由白色庫茨涅爾氏菌獲得之胰蛋白酶樣 内肽酶（T)與由擬諾卡氏菌獲得之胰凝乳蛋白酶樣内肽酶 (c)以27:1之Τ/c比率組合，及由尖孢鐮刀菌獲得之胰蛋白

S I59236.doc -17- 201215332 酶樣内肽酶（τ)與由擬諾卡氏菌獲得之胰凝乳蛋白酶樣内 肽酶（C)以27:1之τ/C比率組合。 水解過程： 執行水解過程之典型條件已描述於先前技術中。溫度可 在約40。(：至6(TC之範圍内變化，較佳為5(rc ,反應時間為 1至6小時，較佳為4小時，且pH值可屬於6 5至8 5、較佳 為7.0至8.0之範圍。可用已知試劑校準pH值，例如用

Ca(OH)2。在文獻US5〇395324Ep〇63173iAi 中描述一種兩 步式水解反應，在中間有一個熱變性步驟以確保最終的水 解物實質上不含乳蛋白過敏原。該熱變性步驟較佳在95。。 下持續進行5分鐘。 •月況而疋，基於牛奶之蛋白質溶液或懸浮液可被預先 加熱(例如預熱至啊至赋，持續5分鐘至3〇分鐘；或 2到！3〇C ’持續約％秒至6〇秒）以確保乳清蛋白⑼如^乳 白蛋白、β乳球蛋白及血清白蛋白（BSA))之變性。 ^管水解如何進行，水解產物均經歷熱處理，其使執行 二之1Γ。該熱處理包含預熱該水解物至饥以上之 =至3=在彼溫度下（較佳在饥至价下）保持約0,1 气戈在孰…促進酶自消1 ’該處理宜後接藉由注射基 八或在熱父換器中進行之殺菌， ’，、、 125〇C $ 孕乂 L在超咼溫下（例如在 ⑶別下則姆至3分鐘進行。 由此獲得之水解物可被淨化 縮。接著可將其乾燥，例如針對=超慮。亦可將其濃 乾燥法、喷霧乾燥或藉由冷藉由低壓昇華 τ朿乾刼來使其乾燥，或甚至可 159236.doc 201215332 經後續處理。在後者之情況下，可在後續處理期間使酶失 活。 本發明之水解物可具有特徵為NPN/TN%之水解程度。 NPN/TN% 意謂（非蛋白質氮（Non-Protein Nitrogen)/總氮 (Total Nitrogen))X 100。非蛋白質氮為能夠自由地與試劑 (如三硝基苯磺酸（TNBS))反應之胺基氮。NPN/TN%可如 Adler-Nissen J-, 1979, J. Agric. Food Chem., 27 (6), 1256-1 262中詳述來測得。一般而言，充分水解物特徵為 NPN/TN%大於95%，而部分水解的水解物特徵為 NPN/TN%在75%至85%之範圍内。在一個較佳實施例中， 本發明之水解物的NPN/TN%在70°/。至90%之範圍内，較佳 在75%至85%之範圍内。後者之水解物為「部分」水解 物。該等水解物之特徵亦可為60%至70%的其蛋白質/肽群 之分子量為<1000道爾頓（Dalton)。 在「充分」水解物為所要者之另一較佳實施例中，本發 明之水解物的NPN/TN%在大於95%之範圍内。該等水解物 之特徵亦可為至少95%的其蛋白質/肽群之分子量為<1〇〇〇 道爾頓。 本發明之水解物可具有特徵為NPN/TN%之水解程度》 非蛋白質氮/總氮廣泛用作由酶水解產生之可溶性肽之量 度。用於量測NPN之分析方法相當於AOAC方法991.21。 在100%基於乳清蛋白質之水解物中，NPN/TN含量通常在 70%至90%之範圍内。在一個較佳實施例中，本發明之水 解物的NPN/TN%在70%至90%之範圍内，較佳在75%至

S 159236.doc •19· 201215332 85 /。之!&圍内。在充分水解物為所要者之另一較佳實施例 中，本發明之水解物的NPN/TN%在大於95%之範圍内。 所獲得之蛋白質水解物中肽之分子量分佈可例如藉由尺 寸排阻層析法（SEC)來測定。在—個較佳實施例中，本發 明之水解物為部分水解物且其包含肽其中以重量計，小 於1%之肽的分子量超過2G，刪伽。在—個更佳的實施例 中：本發明之水解物的肽重量分佈與由哺乳動物酶(尤其 豬酶例如 Novozyme(Denmark)之 pTN 6.0S®(亦稱為 p™)m得之分解物類似（參見實例⑷）。該參照酶為自 豬騰臟提取之姨蛋㈣，其含有主要成分胰蛋白酶及殘餘 的胰疑礼蛋白酶。其胰蛋白酶活性為胰蛋白酶/ 克且騰凝乳蛋白、*壬从& 曰輙/舌性為80活性USP胰凝乳蛋白酶/公 克。此使得以活性計T/c比率為16。 可藉由對所件水解物中所包含之肽定序來評估水解期間 所用之酶混合物的酶特異性。^LC_MS/MS鑑定狀序 列。在一個更佳實施例中，本發明之水解物具有與由哺乳 動物酶（特別為豬酶，例如上文描述之PTN 6.0S)獲得之水 解物相接近之酶特異性（參見實例蹋小 α藉由里Uc解期間之驗（QH)消耗量來評估水解效率。 更仏’'施例中’本發明之水解物具有與由哺乳動物 酶（特別為_’例如上文描述之咖6•晴得之水解物 相接近之水解效能（參見實例 :使用標準免疫檢定，如ELISA測試來評估水解物 、抗原f生本發明之水解物較佳呈現〈3毫克ΕΝ當量/公 159236.doc -20- 201215332 克蛋白質當量’更佳<2毫克BLG當量，公克蛋白質當量， 最佳u毫克BLG當量/公克蛋白質當量之殘餘β乳：蛋白 (BLG)(參見實例η。 本發明之水解物可併人嬰兒配方、第二階段配方、嬰孩 食物 '嬰兒穀類、成長牛奶、嬰兒或兒童食品補充劑或成 人營養組合物，亦即所有以預防或治療過敏以及蛋白質水 解物可向人類提供之任何其他益處為目標之製劑中，且該 組合物較佳為初生嬰兒配方。 在本發明之一個實施例中，本發明之水解物與所選之益 生菌組合使用，例如在嬰兒配方中。所選之益生菌可為習 知用於嬰兒配方中之任何益生菌。益生菌較佳為彼等能夠 對過敏及/或口服耐受誘導及/或炎症過程提供附加作用或 協同作用的益生菌。 可用於本發明中之適合的益生菌微生物之實例包括：酵 母，諸如酵母屬、德巴利酵母屬、念珠菌 屬、畢赤酵母屬及球擬酵母屬;徽，諸如麵菌 屬、酒麴菌屬（π/π·ζο/7ί^)、白黴菌屬（Mwcor)及青黴菌屬及 球擬酵母屬；及細菌，諸如雙叉桿菌屬 (Bifidobacterium)、擬桿菌屬（Bacieroides)、後菌屬 '結梭 鹵屬、蜂球囷屬、丙酸桿菌屬 、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、 葡萄球菌屬、消化鏈球菌屬（尸、桿菌 屬、小球菌屬（PW/ococcws)、微球菌屬、明 串珠菌屬、魏斯氏菌屬（於/以泛//(3)、氣球菌

S 159236.doc -21 - 201215332 屬（Jerococcws)、酒球菌屬及乳桿菌屬。適合 之益生產微生物的特定實例為：釀酒酵母 cerev/παβ)、凝結芽孢桿菌（5ac///Mly ⑽j)、地衣芽 抱桿痛（Bacillus licheniformis)、枯草擇菌（Bacillus subtUis)、雙故雙又桿菌（Bifidobacterium bifidum)、嬰免 隻又得U (Bifidobacterium k/α仙））、龍根雙叉桿菌 (5 ifi dobacterium l on gum、、原腸球菌(Enterococcus /aecz'ww)、糞腸球菌（五乃ierOCOCCWiS 、嗜酸乳桿菌 {Lactobacillus acW〇p/zZ7WlS)、食品乳桿菌（Ζα£τίο&α<^7/Μ·? a/zmeWariw)、乾酪乳桿菌乾酪亞種（Zacii?6aci//ws casei sw以p. case/)、乾酪乳桿菌代田株（Laci6>Mc"/wi 、幫曲乳酸桿菌（ZacioZ^cz’/Zwj ewrvaiMj)、德氏乳 择窗乳酸泛後（Lactobacillus delbruckii subsp. lactis)、香 腸乳桿菌/'(arci'm/rtw·?)、加氏乳桿菌 {Lactobacillus ga 以 eri)、瑞士 乳桿菌（i：acio6ac///i^ helveticus)、約氏乳择菌[Lactobacillus johnsonii)、洛德乳 桿菌reMierz·)、鼠李糖乳桿菌 r/zamwosws)(乳桿菌 GG^acioZmc///!^ GG))、清酒乳桿菌 saAre)、乳酸乳球菌（jLaciococcws /ac"·?)、易 變微球菌（M/erococcws 、乳酸小球菌 acz'<iz7(3i^/c/)、戊糖小球菌（尸己山、乳 酸小球菌（尸ei/iococcM·? aczW/aciz'cz·)、嗜鹽小球菌 (尸 eiiz'ococcMS /z<3/c>/7/z//wi)、糞鍵球菌（iSVrepiococcws /(aeca/b)、嗜熱鍵球菌（Sire/^ococcws i/^rwop/zz'/ws)、肉葡 159236.doc -22- 201215332 萄球菌car⑽mj)及木糖葡萄球菌 [Staphylococcus xylosus)。 車父k ii生囷細函函株包括可由分闌（Finland)之Valio Oy 獲得的LGG牌鼠李糖乳桿菌ATCC 53 103、可由BioGaia AB 獲得之鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.3724、副乾赂乳桿菌 CNCM 1-2116、洛德乳桿菌ATCC 55730及洛德乳桿菌DSM 17938、尤其由丹麥之Christian Hansen公司出售的Bb 12牌 乳雙叉桿菌CNCM 1-3446及由日本之Morinaga Milk Industry Co. Ltd.出售的BB536牌龍根雙叉桿菌ATcc BAA-999 ° 若存在於本發明之組合物中’則益生菌較佳以每公克組 合物或每毫升組合物103至1012個菌落形成單位，更佳以每 公克組合物或每毫升組合物106至1011個菌落形成單位，尤 其更佳以每公克組合物或每毫升組合物1 〇4至1 〇9個菌落形 成單位，最佳以每公克組合物或每毫升組合物1 〇7至1 〇9個 菌落形成單位之量存在。 實例： 實例1·使用相同的牛奶蛋白質受質及一組6種酶溶液進 行一系列水解反應，該6種酶溶液係由一種標準ptn溶液 及如表1之胰蛋白酶樣内肽酶與胰凝乳蛋白酶樣内肽酶之5 種不同昆合物組成。起始物質為500 ml 8%受質牛奶蛋白 質MWP2 8/DWP28(基於蛋白質重量，比率為83/17)溶液β 受質之最終組成為27·7%總固體、8%蛋白質及18.48%乳 糖0

S 159236.doc -23- 201215332 使蛋白質受質溶解成8%(w/v)水溶液。在反應中，使用 500 ml之總體積。使溫度平衡至55°C。接著用10% Ca (OH)2溶液調節pH值至pH 7.4。在酶添力σ (在第一步水解步 驟中全部適用之酶的一半）之後，在4h内，在55°C下藉由 使用自動滴定器 DL50 Graphix(Mettler Toledo)添加 0.25 Μ NaOH來保持pH值恆定於pH 7.4。在93°C下加熱水解物5分 鐘。在使溫度平衡至55°C後，引入額外的酶（在第二步水 解步驟中全部酶之一半）且如上所述保持pH值。在水解2小 時後，藉由熱處理（在85°C下5分鐘）使酶失活來停止酶促反 應。 表1顯示用各種比率之酶進行的一系列實驗。TL1與TL2 分別表示由尖孢鐮刀菌與白色庫茨涅爾氏菌獲得之胰蛋白 酶樣内肽酶。CTL2與CTL3分別表示由金龜子綠僵菌與擬 諾卡氏菌獲得之胰凝乳蛋白酶樣内肽酶。 蘇:. 酶(毫克/公克蛋白） <'' ·, ·· . ' T/Ctb 率(w/w) 1號 ΡΤΝ 16* 2號 TL1 +CTL3 (1.8+ 0.2) 9 3號 TL2 + CTL3 (1.8+ 0.3) 6 4號 TL2 + CTL3 (2.7 + 0.1) 27 5號 TL2 + CTL2(1.8 + 0.6) 3 6號 TL1 +CTL3 (2.7 + 0.1) 27 16*比率係以酶活性計 使用3種不同的方法（肽尺寸排阻層析法、酶特異性分析 及殘餘抗原性法）來分析所產生之6種水解物。藉由監測 159236.doc -24- 201215332 OH-消耗量來分析6種反應之水解效率。結果分別顯示於圖 1至圖3中。 抗原性：使用經設計用於定量食品中之天然及加工型殘 餘β乳球蛋白的商用酶免疫檢定（RIDASCREEN β乳球蛋白 (BLG)，r-Biopharm公司）來湏J試水解物之殘餘抗原性。用 BLG.標準物（BLG. Standards)塗覆微量滴定孔，添加樣品 溶液及抗-BLG抗體。游離的及固定的BLG競爭抗體結合位 點。在洗滌後，添加用過氧化酶標記之二次抗體且使其與 抗體-BLG-複合物結合。接著藉由洗滌步驟移除所有未結 合的酶結合物。向各孔添加酶受質及色原體（chromogen)。 結合酶結合物使無色色原體轉化成有色產物。用光度法進 行量測且吸收值與樣品中之BLG濃度成反比。 實例1中所測試之6種水解物皆呈現小於0.85毫克BLG當 量/公克蛋白質當量之殘餘β乳球蛋白（BLG)。此結果遠低 於可根據2006年12月5日，JO 6.12.2006 L339/16關於嬰兒 配方公開之歐洲指令2006/125/CE所指示而斷定嬰兒配方 具低過敏原性時的含量。該指令要求免疫反應性蛋白質小 於總含氮物質之1°/◦。此相當於3毫克殘餘β乳球蛋白（BLG/ 公克蛋白質當量）。BLG大致佔乳清中之總免疫反應性物 質的30%至5 0%。因此，BLG含量低於3毫克殘餘β乳球蛋 白/公克蛋白質當量指示產物含有之免疫反應性蛋白質不 超過1%。該含量與歐洲委員會指令（European Commision Directive)2006/125/CE之附件 4(Annex IV)—致，其中該附 件闡述關於據稱能降低過敏風險之嬰兒配方的一些條件。

S 159236.doc -25- 201215332 結論： 一已㈣出許多由微生物源獲得之膝蛋白酶樣内肽酶與姨 凝孔蛋白酶樣内肽酶的混合物適用於製造與由哺乳動物酶 產生之牛奶水解物具有類似性質的牛奶蛋白質水解物。本 叙月者已進行—系列實驗來評估酶之最佳比率以提供具有 所要物理、化學及生物性質之水解物。改變細菌源及姨蛋 白酶樣内肽酶與胰凝乳蛋白酶樣内肽酶（基於酶之重量）之 比率以及酶與蛋白質受質之比率及溫度。 發現由尖孢鐮刀菌或白色庫茨淫爾氏菌獲得之姨蛋白酶 樣⑽酶與由擬諾卡氏菌或金龜子綠僵菌獲得之姨凝乳蛋 白酶樣内肽酶組合的混合物為用於替代當前使用之哺乳動 物酶的良好候選物。本發明之混合物，尤其當以特定比率 吏用騰蛋白酶樣内肽酶與胰凝乳蛋白酶樣内肽酶時，顯然 顯示提供極其類似於彼等用哺乳動物酶製得者之肽型態。 尤為準確的是：由央孢鐮刀菌獲得之胰蛋白酶樣内狀酶 ⑺與由擬諾卡氏菌獲得之姨凝乳蛋白酶樣内肽酶（c)以h 之τ/c比率（基於酶重量）組合，由白色庫茨涅爾氏菌獲得 之騰蛋白酶樣内肽酶（T)與由擬諾卡氏菌獲得之胰凝乳蛋 白酶樣内肽酶⑹以27:1之优比率組合，及由尖孢錄刀菌 獲得之膜蛋白酶樣内肽酶（T)與由擬諾卡氏菌獲得之姨凝 乳蛋白酶樣内肽酶（C)以27:1iT/c比率組合。 如此產生之水解物呈現低過敏原性。其可在今後生命中 降低過敏風險可適合併人以有過敏風險之健康個體為目 軚之嬰兒配方及/或營養組合物中。其適合併入用於成人 159236.doc -26- 201215332 或兒童或嬰兒之任何類型的食品補充劑中。其亦可具有誘 導口服耐受性之能力。 除了過敏預防態樣以外’自微生物源獲得之胰蛋白酶與 跋凝乳蛋白酶之混合物可用於製造治療產物，諸如意欲供 給過敏個體之產物。其亦可用於製造以除預防/治^過敏 外之其他益處為目標的任何類型之蛋白質水解物。 【圖式簡單說明】 圖1 :實例1之水解物之肽尺寸排阻層析分離。肽係基於 其分子量（MW)使用尺寸排阻層析柱（Superdex卜叫心 10/3 00 GL，來自GE)而分離。利用uv於215 nmT監控肽 之溶離。結果顯示，如由自高至低分子量之急劇降低所 示，組合2、4及6之尺寸分佈十分接近於參照ρτΝ(實驗1， 參見正文），而組合3及5反而觀察到一平台（參見趨勢線）。 該等結果表明：相較於參照組，實驗2、4及6之酶促功效 生成尺寸十分類似之肽群，而實驗3及5更多地富含較小的 肽。 圖2 ·貝例1之水解物之酶特異性分析。肽序列係藉由 LC-MS/MS(LTQ-〇rbitrap MS ’ 配備 Allegro HPLC泵，來自 - Thermo Scientific)鑑定。針對各鑑定之序列’抽取分裂位 . 置（位置_ 1)前及後之5個胺基酸，且建立頻率圖（或序列保 守性圖）。自最高（頂部）至最低（底部）頻率繪製胺基酸，且 其垂直尺寸與其頻率成比例。結果顯示實驗4及6中所用之 酶混合物具有與參照PTN(實驗丨）相當的酶特異性。 圖3 :在實驗1之水解反應期間〇H_消耗的動力學（所消耗 的pmole OH-/g蛋白質）。

S 159236.doc 201215332 序列表 <110>瑞士商耐斯泰克公司 <丨20>基於牛奶之蛋白質水解物及由其製造之嬰兒配方及營養組合物 <130> 11148 <140> 100135658 <141> 2011-09-30 <150> 10186222.5 <151> 2010-10-01 <160> 1

<170> Patentin version 3.4 <210> 1 <211> 225 <212> PRT <213>白色庫茨涅爾氏菌 <400> 1 lie val Gly Gly Thr Lys Ala ser Thr ser Thr Tyr Pro Phe Val val 15 10 15

Phe Leu Thr Asp ser Thr Gly Phe Gin Phe Cys Gly Gly Thr Leu val 20 25 30

Lys Pro Asn Lys val val Thr Ala Ala His cys Thr val Gly Glu ser 35 40 45

Ala Ala Asn lie Arg val Val Ala Gly Arg Asp Asp Lys Gin ser Thr 50 55 60

Ala Gly Thr val ser Lys val ser Lys lie Trp lie h1s Pro ser Tyr 65 70 75 80

Gin Asp Ala Thr Lys Gly ser Asp Val ser val Leu Thr Leu ser Thr 85 90 95 ser Leu Thr Gin Phe Thr Pro Leu Pro Leu Ala Ala Thr Thr Asp Thr 100 105 110

Ala Leu Tyr Lys Glu Gly Thr Ala Ala Thr lie Leu Gly Trp Glv Asd 115 120 125

Thr Thr Glu Gly Gly ser Ala Ser Arg Tyr Leu Leu Lys Ala Thr val 130 135 140 pro Leu Thr ser Asp Ala Thr cys Lys Lys Ala Tyr Gly Glu Tvr ser 145 150 155 ^ 160 ser Thr Ala Met val cys Ala Gly Tyr Pro cln Gly Gly Thr ?sp Thr cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Ala Gly Asn Lys Leu lie ISO 185 190 159236-序列表.doc 201215332

Glv lie Thr ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Glu Ala Gly Tyr pro Gly 195 200 205

Val Tvr Thr Arg val Ala Thr Tyr ser Ser Leu lie Thr Gin Gin Leu 210 215 220

Gly 225 159236-序列表.doc

Claims (1)

1. 201215332 七、申請專利範圍： i_ 一種包含基於牛奶之蛋白質水解物的組合物，A可藉由 用以下物質處理基於牛奶之蛋白質材料的溶液而獲二 a) 至少-種由微生物獲得之姨蛋白酶樣内肽酶，及 b) 至少-種由微生物獲得之姨凝乳蛋白酶樣内肽酶， 該組合物係用作藥物或用作呈有二 F 有/α療或預防作用之組 合物。 2. 如請求項!之組合物，其係用於在有需要之嬰兒或患者 中誘導口服耐受性，或用於在有需要之嬰兒或患者中降 低過敏風險’或用於在嬰兒期或在今後生命中降低過敏 嚴重性或頻率，尤其在有需要之嬰兒或患者中。 3. 如請求項1或2之組合物，其中該至少一種胰蛋白酶樣内 肽酶係由鐮刀菌屬（尸似以以⑷菌株、較佳為尖孢鐮刀菌 ㈣讲）獲得’且其與由SWISSPR〇T編號 P35049表示之序列具有至少75%、至少80°/。、至少85%、 至少90°/〇、至少95%、至少96%、至少97% '至少98%、 至少9 9 %或1 〇 〇 %之序列一致性。 4. 如請求項1、2或3之組合物，其中該至少一種胰蛋白酶 樣内肽酶係由庫茨涅爾氏菌屬（尺菌株，較佳為 白色庫次 >圼爾氏菌（欠α/6/而）獲得，且其與成熟 多肽SEQ ID ΝΟ:1具有至少75%、至少80%、至少85%、 至少90°/。、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、 至少99。/。或1 〇〇%之序列一致性。 5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該至少一種胰凝 S 159236.doc 201215332 乳蛋白酶樣内肽酶係由擬諾卡氏菌屬菌 株，較佳為擬諾卡氏菌51/?·)獲得，或由綠 僵菌屬（Meiar/n’z/ww)， 較佳為金龜子綠僵菌 {Metarhizium anisopliae)獲得，或由小枝孢屬 (Brachysporiella)，較佳為小枝抱 gayana)^% ° 6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該至少一種胰凝 乳蛋白酶樣内肽酶與EMBL CDS CAI94179或 TREMBL:Q9Y843 或 CGMCC 0865(W02004/072279 中所 揭示之胺基酸1至186)之多肽序列具有至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性。 7. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該胰蛋白酶樣内 肽酶與該胰凝乳蛋白酶樣内肽酶之比率在5 :1至3 5 :1，較 佳為20:1至30]之範圍内，更佳為27:1，其中該比率係 以酶之重量計。 8. 如請求項6之組合物，其中當該胰蛋白酶樣内肽酶係由 鐮刀菌屬菌株獲得，且該胰凝乳蛋白酶樣内肽酶係由擬 諾卡氏菌屬菌株獲得時，該胰蛋白酶樣内肽酶與該胰凝 乳蛋白酶樣内肽酶之比率為9:1，其中該比率係以酶之重 量計。 9. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該基於牛奶之蛋 白質材料為乳清蛋白、酪蛋白或兩者之混合物，較佳具 有以重量計至少50/50、60/40或70/30之乳清/酪蛋白比 159236.doc 201215332 率，該基於牛奶之蛋白質材料最佳為乳清蛋白。 10.如請求項9之組合物，其中該基於牛奶之蛋白質材料為 甜乳清蛋白，較佳為已自其中完全或部分移除路蛋白糖 巨肽（CaSein〇-glyco-macropeptide)之甜乳清蛋白，或為乳 清蛋白分離物或該等蛋白質源之混合物。 11. 如請求項9或10之組合物，其中該基於牛奶之蛋白質材 料為改質甜乳清與脫礦物質乳清蛋白之混合物。 12. —種包含基於牛奶之蛋白質水解物的組合物，其可藉由 用以下物質處理基於牛奶之蛋白f材料的溶液而獲得： a) 至少-種胰蛋白酶樣内肽酶’其係由鐮刀菌屬菌 株，較佳為尖孢鐮刀菌獲得，且其較佳與序列 SWISSPROT編號P35049具有至少75%、至少8〇% '至少 85%、至少90%、至少95%、至少鳩、至少97%、至少 98%、至少99%或1〇〇。/。之序列一致性， b) 至少-種胰凝乳蛋白酶樣内肽酶，其係由擬諾卡氏 菌屬菌株，較佳為擬諾卡氏菌獲得，且其較佳與序列 EMBL CDS CAI94179具有至少75%、至少8〇%、至少 85〇/〇、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%或1〇0%之序列一致性， 其中該胰蛋白酶才篆内肽酶與該胰凝乳蛋白酶樣内狀酶 之比率以酶之重量計為2〇:1至35:1，較佳為乃：丨至儿。， 更佳為27:1。 13. —種包含基於牛奶之蛋白質水解物的組合物，其可藉由 用以下物質處理基於牛奶之蛋白質材料的溶液而獲得： S 159236.doc 〇 201215332 )至;>' 種姨蛋白驗樣内肽酶，其係由庫茨淫爾氏菌 屬菌株，較佳為白色庫茨涅爾氏菌獲得，且其與seq⑴ NO:〗之成熟多肽序列具有至少75%、至少8〇%、至少 85〇%、至少9〇0/〇、至少95%、至少96%、至少㈣、至少 9S%、至少99%或】〇〇%之序列一致性，及 =)至少—種由微生物獲得之胰凝乳蛋白酶樣内肽酶。 Μ.如請求項13之組合物，其中該騰凝乳蛋白酶樣内狀酶係 由擬諾卡氏菌屬菌株，較佳為擬諾卡氏菌獲得，或由綠 僵菌屬’較佳為金龜子綠僵菌獲得，或由小枝孢屬，較 佳為小技孢獲得。 15.如請求項13或14之組合物，其中姨蛋白酶樣内肽酶與姨 凝礼蛋白酶樣内肽酶之比率以酶重量計在^至训，較 佳為20:1至30:1之範圍内，最佳為27:1。 %如前述請求項中任-項之組合物，其中存在於該蛋白質 水解物中之乳糖含量在0·05% _至3〇% ★，較佳為 〇·1〇% W/W 至 2〇% W/W，更佳為 〇._ w/w 至 0.20% w/w 之 17 _如前述請求項 -X | ^ ^ m ^ M ^ 防或治療過敏為目標之嬰兒 女兄配方、第二階段配方、嬰孩 食物配方、嬰兒穀類配方戋忐 飞成長牛奶'嬰兒或兒童食品 補充劑或成人營養組合物，且 且鑌絚合物較佳為初生嬰兒 配方。 18. —種包含基於牛奶之蛋白質 ^ 貝求解物之組合物的用途，其 係藉由用以下物質處理基於牛 八 十奶之蛋白質材料的溶液而 159236.doc 201215332 獲得： a) 至少一種由微生物產生之胰蛋白酶樣内肽酶，及 b) 至少一種由微生物產生之胰凝乳蛋白酶樣内肽酶， 其係作為嬰兒配方或食品補充劑，用於在有需要之嬰 兒或患者中誘導口服耐受性，或用於在有需要之嬰兒或 患者中降低過敏風險，或用於在嬰兒期或在今後生命中 降低過敏嚴重性’尤其在有需要之嬰兒或患者中。 19.如請求項18之組合物的用途，其中該胰蛋白酶樣内肽酶 係由鐮刀菌屬菌株，較佳為尖孢鐮刀菌獲得，且其與由 SWISSPROT編號P3 5049表示之序列具有至少75%、至少 80〇/〇、至少85%、至少9〇%、至少95%、至少96%、至少 97°/。、至少98% '至少99%或1〇〇%之序列一致性；或係 由庫茨涅爾氏菌屬菌株，較佳為白色庫茨涅爾氏菌獲 得’且其與SEQ ID No:l之多肽具有至少75%、至少 80%、至少85%、至少9〇%、至少95°/。、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性。 20_如請求項1 8或19之組合物的用途，其中該胰凝乳蛋白酶 樣内肽I#係由擬諾卡氏菌屬菌株，較佳為擬諾卡氏菌獲 得，或由綠僵菌屬，較佳為金龜子綠僵菌獲得，或由小 枝孢屬，較佳為小枝孢獲得。 21 ·如請求項20之組合物的用途，其中該胰凝乳蛋白酶樣内 肽酶與序列EMBL CDS CAI94179 或 TREMBL:Q9Y843 或 CGMCC 0865(W02004/072279中所揭示之胺基酸 1至 186) 具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 S 159236.doc 201215332 95%、至少96%、至少97%、至少98°/〇、至少99%或100% 之序列一致性。 22·如請求項18、19、20或21之組合物的用途，其中該組合 物係用作以預防或治療過敏為目標之嬰兒配方、第二階 段配方、嬰孩食物配方、嬰兒穀類配方或成長牛奶、嬰 兒或兒童食品補充劑或成人營養組合物，或用於患病個 體之成人乳飲料，且該組合物較佳為初生嬰兒配方。 159236.doc