TW201417833A - 含有非天然胺基酸之藥物輸送共軛物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文闡述用於靶向療法之藥物輸送共軛物。具體而言，本文闡述包括包含一或多種非天然胺基酸之多價連接體之藥物輸送共軛物，其可用於治療癌症及發炎性疾病。

Description

含有非天然胺基酸之藥物輸送共軛物及使用方法
本文所闡述本發明係關於用於靶向療法之藥物輸送共軛物。具體而言，本文所闡述本發明係關於包括包含一或多種非天然胺基酸之多價連接體之藥物輸送共軛物。
哺乳動物免疫系統提供用於識別及消除病原細胞(例如腫瘤細胞)及其他侵入性外來病原體之方式。儘管免疫系統通常提供強防線，但存在許多如下情形：病原細胞(例如癌細胞)及其他感染物逃避宿主免疫反應並增殖或堅持伴隨宿主病原性。化學治療劑及輻射療法已經研發以消除(例如)複製性贅瘤。然而，許多目前可利用的化學治療劑及輻射療法方案具有不利副效應，此乃因其無法充分選擇優先破壞病原細胞，且因此亦傷害正常宿主細胞，例如造血系統之細胞。該等抗癌藥物之不利副效應突顯研發選擇性針對病原細胞群且降低對宿主之毒性之新穎療法之需要。
已發現，包括自一或多種非天然胺基酸形成之多價連接體之藥物輸送共軛物可有效治療病原細胞群。
在本發明之一個說明性及非限制性實施例中，本文闡述下式之化合物 B-L-Dx。
在另一實施例中，本文亦闡述含有一或多種該等化合物之醫藥組合物。在一個態樣中，該等組合物包括治療有效量之一或多種化合物用於治療患有癌症、發炎及諸如此類之患者。應瞭解，該等組合物可包括其他組份及/或成份，包括(但不限於)其他治療活性化合物及/或一或多種載劑、稀釋劑、賦形劑及諸如此類。在另一實施例中，本文亦闡述使用化合物及醫藥組合物來治療患有癌症、發炎及諸如此類之患者之方法。在一個態樣中，該等方法包括向患有癌症、發炎及諸如此類之患者投與一或多種本文闡述之化合物及/或組合物之步驟。在另一態樣中，該等方法包括投與治療有效量之本文闡述之一或多種化合物及/或組合物來治療患有癌症、發炎及諸如此類之患者。在另一實施例中，本文亦闡述化合物及組合物在製造用於治療患有癌症、發炎及諸如此類之患者之醫藥中之用途。在一個態樣中，該等醫藥包括治療有效量之一或多種化合物及/或組合物用於治療患有癌症、發炎及諸如此類之患者。
圖1A顯示EC1669在KB細胞中在37℃下1h之相對親和力。圖1B顯示EC1669在CHO-β細胞中在37℃下1h之相對親和力。
圖2顯示EC1669對RAW264.7細胞之細胞生長抑制效應，如藉由2h及72h之XTT細胞活力所測定。
圖3A顯示單獨EC1456在nu/nu小鼠中以1μmol/kg每週三次(M/W/F)(TIW)投與達兩個連續週抵抗KB腫瘤之活體內活性(●)，其與EC1456與100μmol/kg之EC0923一起共投與(▲)及未經治療(PBS)對照(■)進行比較。垂直虛線代表最後投與日。圖3B顯示，EC1456未產生任何可觀察到的顯著毒性，如藉由動物體重所測定。
圖4A顯示EC1663在具有皮下KB腫瘤之nu/nu小鼠中之活性，其 中EC1663係在第7天開始以0.5μmol/kg靜脈內投與(▲)，每週三次(M/W/F)投與2週時段，且與未經治療對照(■)進行比較，N=5隻動物/群組。垂直虛線=最後投藥日。圖4A顯示測試動物中之4/4 PR。圖4B顯示EC1663未展現顯著宿主動物毒性。
圖5A顯示EC1456抵抗經證實皮下MDA-MB-231腫瘤之活性。在第17天開始以2μmol/kg(面板A)EC1456靜脈內治療具有皮下MDA-MB-231腫瘤(94-145mm3)之動物(●)，每週三次(M/W/F)治療2週時段，且與未經治療之動物(■)進行比較，如圖5A中所顯示。N=5隻動物/群組。垂直虛線=最後投與日。圖5B顯示，EC1456未造成顯著整體動物毒性，如藉由重量變化%所測定。
圖6A顯示EC1456在具有皮下KB-CR2000腫瘤(98-148mm3)之動物中之活性，其中EC1456係在第6天以2μmol/kg靜脈內投與(●)，每週三次(M/W/F)投與2週時段，或以3mg/kg順鉑投與(▲)，每週兩次(T/Th)投與2週時段，且與未經治療之對照(■)進行比較，N=5隻動物/群組。垂直虛線=最後投藥日。圖6B顯示，在投藥時段期間，EC1456未展現顯著宿主動物毒性，且順鉑展現顯著宿主動物毒性。
圖7顯示EC1496抵抗佐劑誘導之關節炎之活體內效能。箭頭指示治療天數。(a)健康對照組，(b)未經治療之對照組，(c)EC1496，(d)EC1496+EC0923。
圖8A顯示EC1669抵抗關節炎之活體內效能，(a)健康對照組，(a)未經治療之對照組，(b)EC1669(375nmol/kg)，(c)EC1669+500×EC0923。圖8B顯示，EC1669不展現整體動物毒性，(a)未經治療之對照組，(b)EC1669(375nmol/kg)，(c)EC1669+500×EC0923，(d)健康對照。
圖9A顯示EC1669抵抗關節炎之活體內效能，如藉由爪腫脹所測定。圖9B顯示EC1669抵抗關節炎之活體內效能，如藉由骨放射照相 所測定。
圖10A顯示單獨EC1669及EC1669加CellCept組合共療法在AIA大鼠中之活體內效能，其中第0天係誘導後第9天，且箭頭指示治療天數，(a)健康對照組，(b)未經治療之對照組，(c)EC1669(1000nmol/kg，一週一次，皮下)，(d)CellCeptTM(30mg/kg，經口，每天一次，持續5天)，(e)EC1669+CellCeptTM。圖10B顯示每一投與方案相對於對照組之整體動物毒性。
圖11顯示單獨EC1669及EC1669加CellCept組合共療法在AIA大鼠中之活體內效能，如藉由爪腫脹所測定。
圖12A顯示EC1669抵抗EAU之活體內效能(兩隻眼之總眼色素層炎得分值)。在EAU誘導後第8天開始每隔一天利用EC1669(■)、EC1669加EC0923(□)及MTX(◆)治療動物，或來自未經治療動物(●)。第0天係誘導後第8天，且箭頭指示治療天數。圖12B顯示，EC1669未造成整體動物毒性。
圖13A顯示EC1496抵抗EAU之活體內效能(兩隻眼之總眼色素層炎得分值)，(a)未經治療之眼色素層炎對照組，(b)EC1496(375nmol/kg)，(c)EC1496+過量EC0923。圖13B顯示EC1496抵抗EAU之活體內效能，如藉由組織學所測定。
圖14A顯示EC1669抵抗EAE之活體內效能，(a)未經治療之EAE對照組，(b)EC1669(250nmol/kg)，(c)EC1669+過量EC0923。在EAE誘導後第8天開始每隔一天(如箭頭所指示)治療動物，且與未經治療之對照進行比較。圖14B顯示體重變化%(B)，對每一組進行平均。
圖15顯示EC1496抵抗EAE之活體內效能。顯示未經治療之動物及在EAE誘導後第8天開始每隔一天經EC1496及EC1496加EC0923治療之動物之個別EAE得分值，且與未經治療之對照進行比較。
圖16A顯示EC1496(500nmol/kg，皮下)之藥物動力學，及胺基 蝶呤及胺基蝶呤醯肼之產生。圖16B顯示EC0746(對比化合物，500nmol/kg，皮下)之藥物動力學，及胺基蝶呤及胺基蝶呤醯肼之產生。
圖17顯示3H-EC1669之藥物動力學生物分佈，面板(A)、(C)及(E)；及小鼠中之3H-甲胺蝶呤，面板(B)、(D)及(F)。測試化合物係以500nmol/kg皮下投與Balb/c小鼠。
圖18顯示小鼠中3H-EC1669(■)及3H-MTX(▼)之RBC吸收之比較，如對放射性隨時間之量測。
圖19顯示(b)EC1496(3μmol/kg)與(c)EC0746(對比化合物，3μmol/kg)在葉酸鹽缺乏型大鼠中兩週一次投與2週時之相對整體動物毒性，且與媒劑對照(a)進行比價。
圖20顯示EC1456之最大耐受劑量(MTD)，與媒劑對照進行比較。媒劑對照(■)、以0.33μmol/kg投與之EC1456(●)、以0.41μmol/kg投與之EC1456(▲)、以0.51μmol/kg投與之EC1456(▼)及以0.67μmol/kg投與之EC1456(◆)。
本發明之若干說明性實施例係藉由以下條款來闡述：一種式B-L(D)x之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其中B係細胞表面受體結合及/或靶向配體之基團，D在每一情形下皆係獨立選擇之藥物之基團，x係選自1、2、3、4及5之整數；且L係包含一或多種非天然胺基酸之多價可釋放連接體；且其中B共價附接至L，且L共價附接至每一D；且其中該化合物並不為具有以下各式之任一者或任一子群或子集：
及/或其中該化合物並不為具有下式者，
及/或其中該化合物並不為具有以下各式之任一者或任一子群或子集： 及/或其中該化合物並不為具有以下各式之任一者或任一子群或子集：
及/或其中該化合物並不為具有下式者，
及/或上述之任一組合；或其任一醫藥上可接受之鹽。
如前述條款之化合物，其中B-L(D)x能夠結合至細胞表面受體。
如前述條款中任一項之化合物，其中該配體係葉酸鹽受體結合配體。
如前述條款中任一項之化合物，其中該配體係葉酸鹽。
如前述條款中任一項之化合物，其中該配體係包含D-麩胺醯基之葉酸鹽，其在本文中亦稱作D-葉酸鹽或蝶醯基-D-麩胺酸。在本文中應瞭解，當B係D-葉酸鹽之基團時，B所包括之D-麩胺醯基部分並非係連接體L之一部分。
如前述條款中任一項之化合物，其中該配體係葉酸鹽。
如前述條款中任一項之化合物，其中B係下式之非天然葉酸基基團
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種非天然胺基酸具有D-組態。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種非天然胺基酸選自D-丙胺酸、D-天冬胺酸、D-天冬醯胺、D-半胱胺酸、D-麩胺酸、D-苯丙胺酸、D-組胺酸、D-異白胺酸、D-離胺酸、D-白胺酸、D-甲硫胺酸、D-脯胺酸、D-麩醯胺酸、D-精胺酸、D-絲胺酸、D-蘇胺酸、D-纈胺酸、D-色胺酸、D-酪胺酸及D-鳥胺酸以及其任何胺基酸衍生物。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種非天然胺基酸選自D-天冬胺酸、D-天冬醯胺、D-半胱胺酸、D-麩胺酸、D-組胺酸、D-離胺酸、D-甲硫胺酸、D-麩醯胺酸、D-精胺酸、D-絲胺酸、D-蘇胺酸、D-色胺酸、D-酪胺酸及D-鳥胺酸以及其任何胺基酸衍生物。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種非天然胺基酸選自D-天冬胺酸、D-天冬醯胺、D-半胱胺酸、D-麩胺酸、D-組胺酸、D-離胺酸、D-麩醯胺酸、D-精胺酸、D-絲胺酸、D-蘇胺酸、D-色胺酸及D-鳥胺酸以及其任何胺基酸衍生物。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種非天然胺基酸選自D-天冬胺酸、D-半胱胺酸、D-麩胺酸、D-離胺酸、D-精胺酸、D-絲胺酸及D-鳥胺酸以及其任何胺基酸衍生物。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含兩種或更多種非天然胺基酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含三種或更多種非天然胺基酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含四種或更多種非天然胺基酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含一或多個二硫化物。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一個二硫化物包含D-半胱胺醯基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含一或多個二價親水基團。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含兩個或更多個二價親水基團。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含三個或更多個二價親水基團。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含四個或更多個二價親水基團。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含一或多個二價聚氧基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含兩個或更多個二價聚氧基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含三個或更多個二價聚氧基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含四個或更多個二價聚氧基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含一或多個二價多羥基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含兩個或更多個二價多羥基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含三個或更多個二價多羥基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L進一步包含四個或更多個二價多羥基。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種非天然胺基酸包含多羥基。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少兩個非天然胺基酸包含多羥基。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少三種非天然胺基酸包含多羥基。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少四種非天然胺基酸包含多羥基。
如前述條款中任一項之化合物，其中多羥基中之至少一者具有下式CH2-(CH(OH))n-CH2-OH
其中n係選自1、2、3、4、5及6。
如前述條款中任一項之化合物，其中n係選自1、2、3及4。
如前述條款中任一項之化合物，其中n係選自3及4。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含二價聚麩胺酸基團，其中至少一個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含二價聚麩胺酸基團，其中至少兩個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含二價聚麩胺酸基團，其中至少三個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含二價聚麩胺酸基團，其中至少四個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
如前述條款中任一項之化合物，其中麩胺酸中之至少一者係D-麩胺酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少兩個麩胺酸係D-麩胺酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少三個麩胺酸係D-麩胺酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少四個麩胺酸係D-麩胺酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中麩胺酸中之至少一者係未經取代之D-麩胺酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少兩個麩胺酸係未經取代之D-麩胺酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少三個麩胺酸係未經取代之D-麩胺酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少四個麩胺酸係未經取代之D-麩胺酸。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含二價聚(D-麩胺酸)基團，其中至少一個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含二價聚(D-麩胺酸)基團，其中至少兩個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含二價聚(D-麩胺酸)基團，其中至少三個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含二價聚(D-麩胺酸)基團，其中至少四個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含式(K-L)d之二價基團，其中K係二價D-麩胺酸基團，L係與胺基多羥基形成醯胺之二價L-麩胺酸基團，且d係1、2、3或4。
如前述條款之化合物，其中d係2、3或4。
如前述條款中任一項之化合物，其中胺基多羥基中之至少一者具有下式NH-CH2-(CH(OH))m-CH2-OH
其中m係選自1、2、3、4、5及6。
如前述條款中任一項之化合物，其中胺基多羥基中之至少一者具有下式NH-CH2-(CH(OH))m-R
其中m係選自1、2、3、4、5及6；且R係H、烷基、環烷基或芳基烷基。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含下式之二價基團S-CH2CH2-O-C(O)。
如前述條款中任一項之化合物，其中L包含下式之二價基團S-S-CH2CH2-O-C(O)。
如前述條款中任一項之化合物，其中m係選自1、2、3及4。
如前述條款中任一項之化合物，其中m係選自3及4。
如前述條款中任一項之化合物，其中x係3。
如前述條款中任一項之化合物，其中x係2。
如前述條款中任一項之化合物，其中x係1。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係細胞毒性劑。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係癌症治療劑。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係長春花(vinca)生物鹼。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係去乙醯基長春鹼單醯肼。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係微管溶素(tubulysin)。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係微管溶素A。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係微管溶素B。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係微管溶素A醯肼。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係微管溶素B醯肼。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係發炎-治療劑。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係二氫葉酸鹽還原酶抑制劑。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係胺基蝶呤或甲胺蝶呤(methotrexate)。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係雷帕黴素之哺乳動物靶標(mammalian target of rapamycin，mTOR)之抑制劑。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素)、替西羅莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)或地磷莫司(ridaforolimus)。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物並非係T-2黴 菌毒素。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物並非係多卡米星(duocarmycin)。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物並非係絲裂黴素(mitomycin)。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物並非係去乙醯基長春鹼單醯肼。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一個D係下式之基團：
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一個D係下式之基團：
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一個D係下式之基團：
其中n=1、2、3、4、5或6，或另一選擇為，n=1、2或3，或另一選擇為，n=2或3。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一個D係下式之基團：
其中n=1、2、3、4、5或6，或另一選擇為，n=1、2或3，或另一選擇為，n=2或3。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係能夠結合至核酸或DNA轉錄因子或與該核酸或DNA轉錄因子反應之化合物，或其前藥。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係抗發炎劑。
如前述條款中任一項之化合物，其中至少一種藥物係胺基蝶呤。
如前述條款中任一項之化合物，其中B-L係下式之基團
如前述條款中任一項之化合物，其中B-L係下式之基團
如前述條款中任一項之化合物，其中B-L係下式之基團
如前述條款中任一項之化合物，其中B-L係下式之基團
如前述條款中任一項之化合物，其中該化合物具有式EC1456
或其醫藥上可接受之鹽。
如前述條款中任一項之化合物，其中該化合物並不為具有式EC1456者
或其醫藥上可接受之鹽。
如前述條款中任一項之化合物，其中該化合物具有式EC1496
或其醫藥上可接受之鹽。
如前述條款中任一項之化合物，其中該化合物並不為具有式EC1496者
或其醫藥上可接受之鹽。
如前述條款中任一項之化合物，其中該化合物具有式EC1669
或其醫藥上可接受之鹽。
如前述條款中任一項之化合物，其中該化合物並不為具有式EC1669者
或其醫藥上可接受之鹽。
一種醫藥組合物，其包含如前述條款中任一項之化合物以及一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合。
一種單位劑量或單位劑型組合物，其包含治療有效量之一或多種如前述條款中任一項之化合物，視情況與一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合組合。
一種治療宿主動物中癌症或發炎之方法，該方法包含以下步驟：向該宿主動物投與包含治療有效量之一或多種如前述條款中任一項之化合物之組合物；或包含一或多種如前述條款中任一項之化合物之醫藥組合物，該醫藥組合物視情況進一步包含一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合。
一種一或多種如前述條款中任一項之化合物視情況與一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合之組合之用途，其用以製造用於治療宿主動物中癌症或發炎之醫藥。
一種組合物，其用於治療宿主動物中之癌症或發炎，該組合物包含包含治療有效量之一或多種如前述條款中任一項之化合物；或醫藥組合物，其包含治療有效量之一或多種如前述條款中任一項之化合物，其視情況進一步包含一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係耐藥性癌症。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係耐鉑性癌症。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係耐順鉑性癌症。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係卵巢癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係耐藥性卵巢癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係耐順鉑性卵巢癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係耐鉑性卵巢癌，例如NCI/ADR-RES或NCI/ADR-RES相關性卵巢癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係耐鉑性卵巢癌，例如IGROVCDDP或IGROVCDDP相關性卵巢癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係乳癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係耐藥性乳癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係三重陰性乳癌(triple negative breast cancer)，例如MDA-MB-231或MDA-MB-231相關性乳癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係非小細胞肺癌。
如前述條款中任一項之方法或組合物或單位劑量或用途，其中癌症係肝細胞癌瘤或肝細胞癌。
一種中間體，其用於製備技術方案1之下式化合物
或其醫藥上可接受之鹽，其中L係離去基團。
一種中間體，其用於製備技術方案1之下式化合物
或其醫藥上可接受之鹽，其中M係氫或陽離子。
一種中間體，其用於製備技術方案1之下式化合物
或其醫藥上可接受之鹽，其中L係離去基團。
在另一實施例中，本文所闡述化合物可藉由結合至相應細胞表面受體而內在化至靶向病原細胞中。具體而言，維生素受體(例如葉酸鹽受體)特異性結合維生素，且可(例如)藉助受體介導之細胞吞噬達成內在化。在內在化後，包括於本文所闡述化合物中之可釋放連接體容許將藥物負載輸送至靶標細胞之內部，由此降低對非靶標組織之毒性。因此，本文所闡述化合物藉由將藥物輸送至細胞內生化過程而在 細胞內起作用。
在另一實施例中，本文所闡述化合物相比於不包括至少一種非天然胺基酸之化合物展現更大的對葉酸鹽受體之特異性。在另一實施例中，本文所闡述化合物對葉酸鹽受體表現細胞顯示高活性。在另一實施例中，本文所闡述化合物在抵抗病原細胞(例如KB細胞(包括耐順鉑性KB細胞)、NCl/ADR-RES-Cl2細胞、IGROV1細胞及MDA-MB-231細胞)方面展現強效活體外及活體內活性。在另一實施例中，本文所闡述化合物不顯示與葉酸鹽受體陰性細胞顯著結合。在另一實施例中，本文所闡述化合物優先或排他性地經由高親和力葉酸鹽受體(例如葉酸鹽受體α及/或葉酸鹽受體β)進入細胞。在另一實施例中，本文所闡述化合物通常實質上並不經由被動運輸(例如經由還原型葉酸鹽載體(RFC))進入細胞。在另一實施例中，本文所闡述化合物相比於不包括至少一種非天然胺基酸之化合物展現更低的宿主動物毒性。在另一實施例中，本文所闡述化合物相比於不包括至少一種非天然胺基酸之化合物展現更強的血清穩定性。在另一實施例中，本文所闡述化合物相比於不包括至少一種非天然胺基酸之化合物可快速清除。在另一實施例中，本文所闡述化合物主要經由腎清除(相比於肝清除)來清除。
本文所闡述化合物既可用於人類臨床醫學應用又可用於獸醫應用。因此，具有病原細胞群且經本文所闡述化合物治療之宿主動物可為人類，或在獸醫應用之情形下可為實驗室動物、農業動物、家畜或野生動物。本發明可適用於宿主動物，包括(但不限於)人類、實驗室動物(例如齧齒動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠等)、兔、猴、黑猩猩)、家畜(例如狗、貓及兔)、農業動物(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊)及囚禁的野生動物(例如熊、熊貓、獅、虎、豹、象、斑馬、長頸鹿、大猩猩、海豚及鯨)。
本發明適用於在該等宿主動物中引起各種病狀之病原細胞群。根據本發明，「病原細胞」意指癌細胞、感染物(例如細菌及病毒)、細菌或病毒感染之細胞、能夠引起疾病狀態之活化巨噬細胞，及唯一表現、優先表現或過表現維生素受體或結合維生素之類似物或衍生物之受體之任何其他類型病原細胞。病原細胞亦可包括引起疾病狀態之任何細胞，對於該疾病狀態，本文所闡述化合物之治療使得該疾病之症狀有所減輕。例如，病原細胞可為在一些情形下為病原之宿主細胞，例如造成移植物抗宿主疾病之免疫系統細胞，但其在其他情形下不為病原。
因此，病原細胞群可為具有致瘤性的癌細胞群，包括良性腫瘤及惡性腫瘤，或其可為非致瘤性。癌細胞群可自發產生或藉由諸如存在於宿主動物之種系中之突變或體細胞突變等過程產生，或其可為化學、病毒或輻射誘導的。本發明可用以治療諸如以下等癌症：癌、肉瘤、淋巴瘤、何傑金氏病(Hodgekin’s disease)、黑色素瘤、間皮瘤、勃奇氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、鼻咽癌、白血病及骨髓瘤。癌細胞群可包括(但不限於)口腔癌、甲狀腺癌、內分泌癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、胰臟癌、結腸癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、乳癌、睪丸癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、肝癌及肺癌。
在另一實施例中，闡述前述實施例中任一者之方法或醫藥組合物，其中疾病係選自由以下各項組成之群：關節炎(包括類風濕性關節炎及骨關節炎)、腎小球性腎炎、增殖性視網膜病變、再狹窄、潰瘍性結腸炎、克隆氏病(Crohn’s disease)、纖維肌痛、牛皮癬及皮膚之其他發炎、骨髓炎、修格蘭氏症候群(Sjögren’s syndrome)、多發性硬化、糖尿病、動脈粥樣硬化、肺纖維變性、紅斑性狼瘡、類肉瘤病、系統性硬化、器官移植排斥(GVHD)及慢性發炎。
藥物可為能夠調節或以其他方式修改細胞功能之任何分子，包括醫藥活性化合物。適宜分子可包括(但不限於)：肽、寡肽、逆反式寡肽(retro-inverso oligopeptide)、蛋白質、至少一個非肽鍵聯替代肽鍵聯之蛋白質類似物、脫輔基蛋白、糖蛋白、酶、輔酶、酶抑制劑、胺基酸及其衍生物、受體及其他膜蛋白；抗原及其抗體；半抗原及其抗體；激素、脂質、磷脂、脂質體；毒素；抗生素；止痛劑；支氣管擴張藥；β阻斷劑；抗微生物劑；抗高血壓劑；心血管用劑，包括抗心律不整劑、強心苷、抗心絞痛藥及血管舒張劑；中樞神經系統劑，包括刺激劑、精神科藥、抗躁狂藥及憂鬱劑；抗病毒劑；抗組織胺；癌症藥物，包括化學治療劑；鎮靜劑；抗憂鬱劑；H-2拮抗劑；抗痙攣劑；抗噁心劑；前列腺素及前列腺素類似物；肌肉鬆弛劑；抗發炎性物質；免疫抑制劑、刺激劑；去充血劑；止吐劑；利尿劑；鎮痙劑；平喘劑；抗帕金森症劑(anti-Parkinson agent)；祛痰劑；咳嗽抑制劑；黏液溶解劑；及礦物添加劑及營養添加劑。
另外，藥物可為業內已知之任一藥物，該任一藥物具有細胞毒性，增強腫瘤滲透性，抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，降低靶標細胞之抗細胞凋亡活性，用以治療由感染物引起之疾病，增強靶向病原細胞之內生性免疫反應，或可用於治療由任一類型病原細胞引起之疾病狀態。適於根據本發明使用之藥物包括腎上腺皮質素及皮質類固醇、烷基化劑、抗雄激素、抗雌激素、雄激素、阿克拉黴素(aclamycin)及阿克拉黴素衍生物、雌激素、抗代謝藥(例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、嘌呤類似物、嘧啶類似物及甲胺蝶呤)、硫酸布他卡因(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、氯芥苯丁酸、順鉑及其他鉑化合物、他莫昔芬(tamoxiphen)、汰癌勝(taxol)、紫杉醇、紫杉醇衍生物、剋癌易®(Taxotere®)、環磷醯胺、道諾黴素(daunomycin)、利索新(rhizoxin)、T2毒素、植物生物鹼、普賴松(prednisone)、羥基脲、替 尼泊苷(teniposide)、絲裂黴素、圓皮海綿內酯、微管抑制劑、埃坡黴素(epothilone)、微管溶素、環丙基苯并[e]吲哚酮、seco-環丙基苯并[e]吲哚酮、O-Ac-seco-環丙基苯并[e]吲哚酮、博來黴素(bleomycin)及任何其他抗生素、氮芥子氣、亞硝脲、長春花生物鹼(例如長春新鹼、長春鹼、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)及其類似物及衍生物(例如去乙醯基長春鹼單醯肼(DAVLBH)))、秋水仙素(colchicine)、秋水仙素衍生物、別秋水仙素(allocolchicine)、硫秋水仙素、三苯甲基半胱胺酸、軟海綿素B、尾海兔素(例如尾海兔素10)、蠅蕈素(例如α-蠅蕈素)、喜樹鹼、伊立替康(irinotecan)及其其他喜樹鹼衍生物、格爾德黴素(geldanamycin)及格爾德黴素衍生物、雌莫司汀(estramustine)、諾考達唑(nocodazole)、MAP4、乙醯甲基秋水仙素(colcemid)、發炎劑及促發炎劑、肽及擬肽物信號轉導抑制劑，及任何其他為業內公認的藥物或毒素。可根據本發明使用之其他藥物包括雷帕黴素(例如西羅莫司或依維莫司)、青黴素(penicillin)、頭孢菌素(cephalosporin)、梵穀黴素(vancomycin)、紅黴素(erythromycin)、克林達黴素(clindamycin)、雷發平(rifampin)、氯黴素(chloramphenicol)、胺基糖苷抗生素、正大黴素(gentamicin)、雙性殺黴素B(amphotericin B)、阿昔洛韋(acyclovir)、三氟尿苷(trifluridine)、更昔洛韋(ganciclovir)、齊多夫定(zidovudine)、阿曼他丁(amantadine)、利巴韋林(ribavirin)，及任何其他為業內公認的抗微生物化合物。
在另一實施例中，藥物係選自念珠藻素(cryptophycin)、硼替佐米(bortezomib)、硫硼替佐米、微管溶素、胺基蝶呤、雷帕黴素、紫杉醇、歐洲紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、佐柔比星(daunorubicin)、依維莫司、α-蠅蕈素、黏液黴素(verucarin)、膜海鞘素B、格爾德黴素、普爾伐諾A(purvalanol A)、依維莫司、伊斯平斯 (ispinesib)、布地奈德(budesonide)、達沙替尼(dasatinib)、埃坡黴素、美登素(maytansine)及酪胺酸激酶抑制劑，包括上述之類似物及衍生物。在另一實施例中，共軛物包括至少兩種說明性地選自以下之藥物(D)：長春花生物鹼、念珠藻素、硼替佐米、硫硼替佐米、微管溶素、胺基蝶呤、雷帕黴素(例如依維莫司或西羅莫司)、紫杉醇、歐洲紫杉醇、多柔比星、佐柔比星、依維莫司、α-蠅蕈素、黏液黴素、膜海鞘素B、格爾德黴素、普爾伐諾A、伊斯平斯、布地奈德、達沙替尼、埃坡黴素、美登素及酪胺酸激酶抑制劑，包括上述之類似物及衍生物。在一個變化形式中，藥物(D)相同。在另一變化形式中，藥物(D)不同。
本文所闡述之藥物輸送共軛物可以與任何其他已知藥物組合之療法投與，不論該其他藥物是否靶向。說明性其他藥物包括(但不限於)肽、寡肽、逆反式寡肽、蛋白質、至少一個非肽鍵聯替代肽鍵聯之蛋白類似物、脫輔基蛋白、糖蛋白、酶、輔酶、酶抑制劑、胺基酸及其衍生物、受體及其他膜蛋白、抗原及其抗體、半抗原及其抗體、激素、脂質、磷脂、脂質體、毒素、抗生素、止痛劑、支氣管擴張藥、β阻斷劑、抗微生物劑、抗高血壓劑、心血管用劑(包括抗心律不整劑、強心苷、抗心絞痛藥、血管舒張劑)、中樞神經系統劑(包括刺激劑、精神科藥、抗躁狂藥及憂鬱劑)、抗病毒劑、抗組織胺、癌症藥物(包括化學治療劑)、鎮靜劑、抗憂鬱劑、H-2拮抗劑、抗痙攣劑、抗噁心劑、前列腺素及前列腺素類似物、肌肉鬆弛劑、抗發炎性物質、刺激劑、去充血劑、止吐劑、利尿劑、鎮痙劑、平喘劑、抗帕金森症劑、祛痰劑、咳嗽抑制劑、黏液溶解劑及礦物及營養添加劑。
至少一種包含治療因子之其他組合物可與上述詳細方法組合或作為其佐劑投與宿主，從而增強藥物輸送共軛物介導之病原細胞群之消除，或可投與一種以上其他治療因子。治療因子可選自能夠刺激內 生性免疫反應之化合物、化學治療劑或能夠補充所投與藥物輸送共軛物之效能之另一治療因子。本發明方法可藉由除上述共軛物以外向宿主投與能夠刺激內生性免疫反應之化合物或組合物(例如細胞介素)來實施，包括(但不限於)細胞介素或免疫細胞生長因子，例如介白素1-18、幹細胞因子、鹼性FGF、EGF、G-CSF、GM-CSF、FLK-2配體、HILDA、MIP-1α、TGF-α、TGF-β、M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、可溶性CD23、LIF及其組合。
可使用該等因子之治療有效組合。在一個實施例中，例如，治療有效量之IL-2(例如，其在每日多劑量方案中之量為約0.1MIU/m2/劑量/天至約15MIU/m2/劑量/天)及IFN-α(例如，其在每日多劑量方案中之量為約0.1MIU/m2/劑量/天至約7.5MIU/m2/劑量/天)可連同藥物輸送共軛物一起使用來在具有病原細胞之宿主動物中消除、減少或抑制病原細胞(MIU=百萬國際單位；m2=人類之大約平均體表面積)。在另一實施例中，對於介白素及干擾素，IL-12及IFN-α係以上述治療有效量使用，且在再一實施例中，對於介白素及干擾素，IL-15及IFN-α係以上述治療有效量使用。在替代實施例中，IL-2、IFN-α或IFN-γ及GM-CSF係以上述治療有效量組合使用。本發明亦涵蓋使用細胞介素之任何其他有效組合(包括其他介白素及干擾素及群落刺激因子之組合)。
例如，本身具有細胞毒性或可用以增強腫瘤滲透性之化學治療劑亦適於在本發明方法中與藥物輸送共軛物組合使用。該等化學治療劑包括腎上腺皮質素及皮質類固醇、烷基化劑、抗雄激素、抗雌激素、雄激素、阿克拉黴素及阿克拉黴素衍生物、雌激素、抗代謝藥(例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、嘌呤類似物、嘧啶類似物及甲胺蝶呤)、硫酸布他卡因、卡鉑、氯芥苯丁酸、順鉑及其他鉑化合物、他莫昔芬、紫杉醇、紫杉醇、紫杉醇衍生物、剋癌易®、環磷醯胺、道諾黴素、 利索新、T2毒素、植物生物鹼、普賴松、羥基脲、替尼泊苷、絲裂黴素、圓皮海綿內酯、微管抑制劑、埃坡黴素、微管溶素、環丙基苯并[e]吲哚酮、seco-環丙基苯并[e]吲哚酮、O-Ac-seco-環丙基苯并[e]吲哚酮、博來黴素及任何其他抗生素、氮芥子氣、亞硝脲、長春新鹼、長春鹼及其類似物及衍生物(例如去乙醯基長春鹼單醯肼)、秋水仙素、秋水仙素衍生物、別秋水仙素、硫秋水仙素、三苯甲基半胱胺酸、軟海綿素B、尾海兔素(例如尾海兔素10)、蠅蕈素(例如α-蠅蕈素)、喜樹鹼、伊立替康及其其他喜樹鹼衍生物、格爾德黴素及格爾德黴素衍生物、雌莫司汀、諾考達唑、MAP4、乙醯甲基秋水仙素、發炎劑及促發炎劑、肽及擬肽物信號轉導抑制劑，及任何其他為業內公認的藥物或毒素。可根據本發明使用之其他藥物包括青黴素、頭孢菌素、梵穀黴素、紅黴素、克林達黴素、雷發平、氯黴素、胺基糖苷抗生素、正大黴素、雙性殺黴素B、阿昔洛韋、三氟尿苷、更昔洛韋、齊多夫定、阿曼他丁、利巴韋林、美登素及其類似物及衍生物、吉西他濱(gemcitabine)，及任何其他為業內公認的抗微生物化合物。
在另一實施例中，闡述具有下式之葉酸鹽配體中間體
其中m、n及q係獨立地選自0至約8之範圍之整數；AA係胺基酸，R1係氫、烷基或氮保護基團，且藥物視情況在(*)原子處附接。在一個態樣中，AA係具有天然或非天然組態之天然胺基酸。在另一態樣中，AA中之一或多者係親水胺基酸。在另一態樣中，AA中之一或多者係Asp及/或Arg。在另一態樣中，整數n係1或更大。在另一態樣中，整數n係2或更大。在另一態樣中，整數n係3或更大。在另一態 樣中，整數n係4或更大。在另一態樣中，整數n係5或更大。在另一態樣中，整數q係1或更大。在另一態樣中，整數q係1。在另一態樣中，整數m係1或更大。在另一態樣中，整數m係1。在另一態樣中，R1係氫。藥物及視情況其他連接體及其他受體結合配體可在2,ω-二胺基烷酸片段之自由NH側鏈處或在如其中由自由價指示之末端羧酸根處連接至上述式。
在另一實施例中，闡述具有下式之葉酸鹽配體中間體
其中m、n、q及p係獨立地選自0至約8之範圍之整數；AA係胺基酸，R1係氫、烷基或氮保護基團，且藥物視情況在(*)原子處附接。在一個態樣中，AA係呈具有天然或非天然組態之天然胺基酸。在另一態樣中，AA中之一或多者係親水胺基酸。在另一態樣中，AA中之一或多者係Asp及/或Arg。在另一態樣中，整數n係1或更大。在另一態樣中，整數n係2或更大。在另一態樣中，整數n係3或更大。在另一態樣中，整數n係4或更大。在另一態樣中，整數n係5或更大。在另一態樣中，整數q及/或p係1或更大。在另一態樣中，整數q係1。在另一態樣中，整數m係1或更大。在另一態樣中，整數m係1。在另一態樣中，R1係氫。藥物及視情況其他連接體及其他受體結合配體可在2,ω-二胺基烷酸片段之自由NH側鏈處、在半胱胺酸硫醇基處或在如其中由自由價指示之末端羧酸根處連接至上述式。
在另一實施例中，闡述具有下式之葉酸鹽配體中間體
其中m、n、q、p及r係獨立地選自0至約8之範圍之整數；AA係胺基酸，R1係氫、烷基或氮保護基團，且藥物視情況在(*)原子處附接。在一個態樣中，AA係呈具有天然或非天然組態之天然胺基酸。在另一態樣中，AA中之一或多者係親水胺基酸。在另一態樣中，AA中之一或多者係Asp及/或Arg。在另一態樣中，整數n係1或更大。在另一態樣中，整數n係2或更大。在另一態樣中，整數n係3或更大。在另一態樣中，整數n係4或更大。在另一態樣中，整數n係5或更大。在另一態樣中，整數q及/或p及/或r係1或更大。在另一態樣中，整數q及/或p及/或r係1。在另一態樣中，整數m係1或更大。在另一態樣中，整數m係1。在另一態樣中，R1係氫。藥物及視情況其他連接體及其他受體結合配體可在2,ω-二胺基烷酸片段之自由NH側鏈處、在半胱胺醯硫醇基處、在絲胺醯羥基處或在如其中由自由價指示之末端羧酸根處連接至上述式。
在另一實施例中，本文闡述共軛物在本文所闡述之每一微管溶素之末端羧酸基團或末端醯肼基團處形成之化合物。
應瞭解，各種親水連接體之佈置及/或定向可呈直鏈或具支鏈方式或二者。例如，親水連接體可形成連接體之主鏈，從而形成葉酸鹽與藥物、顯像劑或診斷劑之間之共軛物。另一選擇為，連接體之親水部分可懸掛於或附接至原子鏈之主鏈，從而將結合配體B與藥物D連接。在此後一佈置中，親水部分可在原子主鏈之近端或遠端。
在另一實施例中，連接體或多或少地係直鏈，且親水基團主要係串聯佈置以在共軛物中形成鏈樣連接體。換言之，在此直鏈實施例中，親水基團形成連接體之一部分或所有主鏈。
在另一實施例中，連接體具有親水基團之支鏈。在此具支鏈實施例中，親水基團可在主鏈之近端或主鏈之遠端。在該等佈置中之每一者中，連接體之形狀更呈球形或圓柱形。在一個變化形式中，連接體經成形如瓶刷。在一個態樣中，連接體之主鏈係藉由一系列直鏈醯胺形成，且連接體之親水部分係藉由平行佈置之分支側鏈形成，例如藉由連接單糖、磺酸酯及諸如此類及其衍生物及類似物形成。
應瞭解，連接體在某些條件(例如在活體內遇到的生理條件)下可為中性或可電離的。對於可電離連接體而言，在所選條件下，連接體可去質子化而形成陰離子，或另一選擇為變得質子化而形成陽離子。應瞭解，可發生一個以上去質子化或質子化事件。此外，應瞭解，相同連接體可去質子化及質子化而形成內鹽或兩性離子化合物。
在另一實施例中，親水間隔基連接體係中性的，即在生理條件下，該等連接體既不顯著質子化亦不去質子化。在另一實施例中，親水間隔基連接體可經質子化而攜載一或多個正電荷。應瞭解，質子化能力具有條件依賴性。在一個態樣中，該等條件係生理條件，且連接體係在活體內經質子化。在另一實施例中，間隔基包括為中性的區域及可經質子化而攜載一或多個正電荷之區域二者。在另一實施例中，間隔基包括可經去質子化而攜載一或多個負電荷之區域及可經質子化而攜載一或多個正電荷之區域二者。應瞭解，在此後一實施例中，可形成兩性離子或內鹽。
在一個態樣中，可經去質子化而攜載負電荷之連接體區域包括羧酸(例如天冬胺酸、麩胺酸及較長鏈羧酸基團)及硫酸酯(例如硫酸之烷基酯)。在另一態樣中，可經質子化而攜載正電荷之連接體區域包括胺基(例如聚胺基伸烷基，包括乙二胺、丙二胺、丁二胺及諸如此類)及/或雜環(包括吡咯啶、六氫吡啶、六氫吡嗪及其他胺基)，其每一者皆視情況經取代。在另一實施例中，呈中性之連接體區域包括多 羥基(例如糖(sugar)、碳水化合物、糖(saccharide)、肌醇及諸如此類)及/或聚醚基團(例如聚氧基伸烷基，包括聚氧基伸乙基、聚氧基伸丙基及諸如此類)。
在一個實施例中，本文闡述之親水間隔基連接體包括主要係自碳、氫及氧形成，且碳/氧比為約3：1或更小或者約2：1或更小。在一個態樣中，本文闡述之親水連接體包括複數個醚官能基。在另一態樣中，本文闡述之親水連接體包括複數個羥基官能基。可用以形成該等連接體之說明性片段包括多羥基化合物(例如碳水化合物)、聚醚化合物(例如聚乙二醇單元)及酸基團(例如羧基及烷基硫酸)。在一個變化形式中，寡醯胺間隔基及諸如此類亦可包括在連接體內。
說明性碳水化合物間隔基包括本文闡述之糖肽，其包括肽特徵及糖特徵二者；葡萄糖醛酸酐，其可經由[2+3]Huisgen環化(亦稱為點擊化學(click chemistry))納入；β-烷基糖苷，例如2-去氧吡喃己糖(2-去氧葡萄糖、2-去氧葡萄糖醛酸酐及諸如此類)之β-烷基糖苷，及β-烷基吡喃甘露糖苷。說明性PEG基團包括彼等特定長度範圍為約4個至約20個PEG基團者。說明性烷基硫酸酯亦可利用點擊化學直接引入至主鏈中。說明性寡醯胺間隔基包括EDTA及DTPA間隔基、β-胺基酸及諸如此類。
在另一實施例中，本文闡述之親水間隔基連接體包括聚醚，例如以下各式之連接體：
其中m在每一情形下皆係獨立地選自1至約8之整數；p係選自1至 約10之整數；且n在每一情形下皆係獨立地選自1至約3之整數。在一個態樣中，m在每一情形下皆獨立係1至約3。在另一態樣中，n在每一情形下皆係1。在另一態樣中，p在每一情形下皆獨立地係約4至約6。說明性地，對應於上述之相應聚丙烯聚醚涵蓋在本文中，且可作為親水間隔基連接體包括在共軛物中。此外，應瞭解，混合聚乙烯聚醚及聚丙烯聚醚可作為親水間隔基連接體包括在共軛物中。另外，本文涵蓋上述聚醚化合物之環狀變化形式，例如包括四氫呋喃基、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷及諸如此類者。
在另一說明性實施例中，本文闡述之親水間隔基連接體包括複數個羥基官能基，例如納入單糖、寡糖、多糖及諸如此類之連接體。應瞭解，含有多羥基之間隔基連接體包含複數個-(CROH)-基團，其中R係氫或烷基。
在另一實施例中，間隔基連接體包括以下片段中之一或多者：
其中R係H、烷基、環烷基或芳基烷基；m係1至約3之整數；n係1至約5之整數，p係1至約5之整數，且r係選自1至約3之整數。在一個態樣中，整數n係3或4。在另一態樣中，整數p係3或4。在另一態樣中，整數r係1。
在另一實施例中，間隔基連接體包括以下片段中之一或多者：
其中R係H、烷基、環烷基或芳基烷基；m係1至約3之整數；n係1至約5或2至約5之整數，p係1至約5之整數，且r係選自1至約3之整數。在一個態樣中，整數n係3或4。在另一態樣中，整數p係3或4。在另一態樣中，整數r係1。
在另一實施例中，間隔基連接體包括以下環狀多羥基中之一或多者：
其中n係2至約5之整數，p係1至約5之整數，且r係1至約4之整數。在一個態樣中，整數n係3或4。在另一態樣中，整數p係3或4。在另一態樣中，整數r係2或3。應瞭解，本文涵蓋連接體之該等部分之所有立體化學形式。例如，在上述式中，該部分可源於核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或其他糖且保持存在於彼等分子上之懸掛羥基及烷基之立體化學佈置。此外，應瞭解，在上述式中，亦涵蓋各種 去氧基化合物。說明性地，涵蓋以下各式之化合物：
其中n等於或小於r，例如當r係2或3時，n分別係1或2或者1、2或3。
在另一實施例中，間隔基連接體包括下式之多羥基化合物：
其中n及r各自係選自1至約3之整數。在一個態樣中，間隔基連接體包括一或多種呈以下各式之多羥基化合物：
應瞭解，本文涵蓋連接體之該等部分之所有立體化學形式。例如，在上述式中，該部分可源於核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或其他糖且保持存在於彼等分子上之懸掛羥基及烷基之立體化學佈置。
在另一組態中，本文闡述之親水連接體L包括經間隔遠離連接體之主鏈之多羥基。在一個實施例中，該等碳水化合物基團或多羥基藉由三唑基團連接至主鏈，從而形成三唑鏈接之親水間隔基連接體。說明性地，該等連接體包括以下各式之片段：
其中n、m及r係整數，且各自在每一情形下皆獨立地選自1至約5。在一個說明性態樣中，m在每一情形下皆獨立地係2或3。在另一態樣中，r在每一情形下皆係1。在另一態樣中，n在每一情形下皆係1。在一個變化形式中，將多羥基連接至連接體之主鏈之基團係不同的雜芳基，包括(但不限於)吡咯、吡唑、1,2,4-三唑、呋喃、噁唑、異噁唑、噻吩基、噻唑、異噻唑、噁二唑及諸如此類。類似地，涵蓋二價6員環雜芳基。上述說明性親水間隔基連接體之其他變化形式包括氧基伸烷基，例如以下各式：
其中n及r係整數，且各自在每一情形下皆獨立地選自1至約5；且p係選自1至約4之整數。
在另一實施例中，該等碳水化合物基團或多羥基藉由醯胺基連接至主鏈，從而形成醯胺鏈接之親水間隔基連接體。說明性地，該等連接體包括以下各式之片段：
其中n係選自1至約3之整數，且m係選自1至約22之整數。在一個說明性態樣中，n係1或2。在另一說明性態樣中，m係選自約6至約10、說明性地8。在一個變化形式中，將多羥基連接至連接體之主鏈之基團係不同的官能基，包括(但不限於)酯、脲、胺基甲酸酯、醯腙及諸如此類。類似地，涵蓋環狀變化形式。上述說明性親水間隔基連接體之其他變化形式包括氧基伸烷基，例如以下各式：
其中n及r係整數且各自在每一情形下皆獨立地選自1至約5；且p係選自1至約4之整數。
在另一實施例中，間隔基連接體包括以下片段中之一或多者：
其中R係H、烷基、環烷基或芳基烷基；m獨立地選自1至約3之整數；n係1至約6之整數，p係1至約5之整數，且r係選自1至約3之整數。在一個變化形式中，整數n係3或4。在另一變化形式中，整數p係3或4。在另一變化形式中，整數r係1。
在另一實施例中，間隔基連接體包括以下片段中之一或多者：
其中R係H、烷基、環烷基或芳基烷基；m獨立地選自1至約3之整數；n係2至約6之整數，p係1至約5之整數，且r係選自1至約3之整數。在一個變化形式中，整數n係3或4。在另一變化形式中，整數p係3或4。在另一變化形式中，整數r係1。
在另一實施例中，間隔基連接體包括以下片段中之一或多者：
其中m獨立地選自1至約3之整數；n係1至約6之整數，p係1至約5之整數，且r係選自1至約3之整數。在一個變化形式中，整數n係3或4。在另一變化形式中，整數p係3或4。在另一變化形式中，整數r係 1。
在另一實施例中，間隔基連接體包括以下片段中之一或多者：
其中m獨立地選自1至約3之整數；n係2至約6之整數，p係1至約5之整數，且r係選自1至約3之整數。在一個變化形式中，整數n係3或4。在另一變化形式中，整數p係3或4。在另一變化形式中，整數r係1。
在另一實施例中，間隔基連接體包括以下片段中之一或多者：
其中m獨立地選自1至約3之整數；n係1至約6之整數，p係1至約5之整數，且r係選自1至約3之整數。在一個變化形式中，整數n係3或4。在另一變化形式中，整數p係3或4。在另一變化形式中，整數r係1。
在另一實施例中，親水間隔基連接體係主鏈及分支側基序之組合，如由以下各式說明：
其中n在每一情形下皆係獨立地選自0至約3之整數。上述式意欲代表4員、5員、6員及甚至更多員的環狀糖。此外，應瞭解，上述式可經修飾而代表去氧基糖，其中存在於該等式上之一或多個羥基由氫、烷基或胺基替代。此外，應瞭解，上述式涵蓋相應羰基化合物，其中一或多個羥基被氧化成相應羰基。此外，在此說明性實施例中，吡喃糖包括羧基官能基及胺基官能基二者，且(a)可插入至主鏈中，且(b)可在此實施例之變化形式中為分支側鏈提供合成柄(synthetic handle)。懸掛羥基中之任一者皆可用以附接其他化學片段，包括附接 其他糖來製備相應寡糖。亦涵蓋此實施例之其他變化形式，包括將吡喃糖或其他糖在單一碳處(即呈螺狀佈置)、在偕碳對(geminal pair of carbons)處及類似佈置插入至主鏈中。例如，連接體或藥物D或結合配體B之一端或兩端可以1,1、1,2、1,3、1,4、2,3或其他佈置連接至欲插入至主鏈中之糖。
在另一實施例中，本文闡述之親水間隔基連接體包括主要係自碳、氫及氮形成，且碳/氮比為約3：1或更小或者約2：1或更小。在一個態樣中，本文闡述之親水連接體包括複數個胺基官能基。
在另一實施例中，間隔基連接體包括一或多個具有以下各式之胺基：
其中n在每一情形下皆係獨立地選自1至約3之整數。在一個態樣中，整數n在每一情形下皆獨立地係1或2。在另一態樣中，整數n在每一情形下皆係1。
在另一實施例中，親水間隔基連接體係硫酸酯，例如硫酸之烷基酯。說明性地，間隔基連接體具有下式：
其中n在每一情形下皆係獨立地選自1至約3之整數。說明性地，n在每一情形下皆獨立地係1或2。
應瞭解，在該等多羥基、聚胺基、羧酸、硫酸連接體及包括結合至雜原子之自由氫之相似連接體中，彼等自由氫原子中之一或多者可分別經適當羥基、胺基或酸保護基團保護，或另一選擇為可經封端作為相應前藥，後者經選擇用於具體用途，例如在一般或特定生理條件下釋放母藥之前藥。
在另一實施例中，多價連接體包含以下二價基團中之一或多者：
其中n係2至約5之整數，p係1至約5之整數，且r係1至約4之整數，如上文所闡述。
應進一步瞭解，在上述實施例中，諸如(*)原子等開放位置係用 於附接結合配體(B)或欲輸送之任一藥物(D)之部位。此外，應瞭解，B及任一D或二者之該附接可係直接的或經由包含本文闡述之一或多個基團之插入連接體達成。此外，(*)原子可與任何藥物D或連接體L之其他部分形成可釋放連接體。
在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個含碳水化合物或含多羥基之連接體。在另一實施例中，親水間隔基連接體包含至少三個含碳水化合物或含多羥基之連接體。在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個含碳水化合物或含多羥基之連接體及一或多個天冬胺酸。在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個含碳水化合物或含多羥基之連接體及一或多個麩胺酸。在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個含碳水化合物或含多羥基之連接體、一或多個麩胺酸、一或多個天冬胺酸及一或多個β胺基丙胺酸。在一系列變化形式中，在上述實施例中之每一者中，親水間隔基連接體亦包括一或多個半胱胺酸。在另一系列變化形式中，在上述實施例中之每一者中，親水間隔基連接體亦包括至少一個精胺酸。
在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個將結合配體(L)中之至少一者與藥物(D)中之至少一者連接之原子鏈中所包括之二價1,4-六氫吡嗪。在一個變化形式中，親水間隔基連接體包括一或多個含碳水化合物或含多羥基之連接體。在另一變化形式中，親水間隔基連接體包括一或多個含碳水化合物或含多羥基之連接體及一或多個天冬胺酸。在另一變化形式中，親水間隔基連接體包括一或多個含碳水化合物或含多羥基之連接體及一或多個麩胺酸。在一系列變化形式中，在上述實施例中之每一者中，親水間隔基連接體亦包括一或多個半胱胺酸。在另一系列變化形式中，在上述實施例中之每一者中，親水間隔基連接體亦包括至少一個精胺酸。
在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個寡醯胺親水 間隔基，例如(但不限於)胺基乙基六氫吡嗪基乙醯胺。
在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個三唑鏈接之含碳水化合物或含多羥基之連接體。在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個醯胺鏈接之含碳水化合物或含多羥基之連接體。在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多個PEG基團及一或多個半胱胺酸。在另一實施例中，親水間隔基連接體包含一或多種EDTE衍生物。
在另一實施例中，闡述本文闡述之任一實施例之化合物，其中L包含下式之二價連接體
其中*指示至葉酸鹽之附接點且**指示至藥物之附接點；且F及G各自獨立地係1、2、3或4。
在另一實施例中，本文闡述其中L係連接體之任一實施例之化合物包含下式之二價連接體
其中*、**、***各自指示至葉酸鹽受體結合部分B之附接點，及一或多種藥物D。應瞭解，當有較少藥物時，*、**、***經氫或雜原子取代。F及G各自獨立地係1、2、3或4；且W1係NH或O。在另一態樣中，m1係0或1。
在本文闡述之任一實施例中，雜原子連接體可為-NR1R2-、氧、硫及式-(NHR1NHR2)-、-SO-、-(SO2)-及-N(R3)O-，其中R1、R2及R3各自獨立地選自氫、烷基、芳基、芳基烷基、經取代之芳基、經取代之芳基烷基、雜芳基、經取代之雜芳基及烷氧基烷基。
本文闡述之說明性可釋放連接體包括包含半縮醛及其硫變化形式、縮醛及其硫變化形式、半胺縮醛、胺縮醛及諸如此類之多價連接體，且其可自經至少一個雜原子取代之亞甲基片段、1-烷氧基伸烷基、1-烷氧基伸環烷基、1-烷氧基伸烷基羰基、1-烷氧基伸環烷基羰基及諸如此類形成。本文闡述之說明性可釋放連接體包括包含羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(雙羧基芳基)羰基、鹵伸烷基羰基及諸如此類之多價連接體。本文闡述之說明性可釋放連接體包括包含伸烷基(二烷基矽烷基)、伸烷基(烷基芳基矽烷基)、伸烷基(二芳基矽烷基)、(二烷基矽烷基)芳基、(烷基芳基矽烷基)芳基、(二芳基矽烷基)芳基及諸如此類之多價連接體。本文闡述之說明性可釋放連接 體包括氧基羰基氧基、氧基羰基氧基烷基、磺醯基氧基、氧基磺醯基烷基及諸如此類。本文闡述之說明性可釋放連接體包括包含亞胺基亞烷基、羰基亞烷基亞胺基(carbonylalkylideniminyl)、亞胺基環亞烷基、羰基環亞烷基亞胺基及諸如此類之多價連接體。本文闡述之說明性可釋放連接體包括包含伸烷基硫基、伸烷基芳基硫基及羰基烷基硫基及諸如此類之多價連接體。上述片段中之每一者皆視情況經如本文所定義之取代基X2取代。
取代基X2可為烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、羥基烷基、胺基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、鹵基、鹵烷基、巰基烷基、烷基硫基烷基、芳基、經取代之芳基、芳基烷基、經取代之芳基烷基、雜芳基、經取代之雜芳基、羧基、羧基烷基、羧酸烷基酯、烷酸烷基酯、胍基烷基、R4-羰基、R5-羰基烷基、R6-醯基胺基及R7-醯基胺基烷基，其中R4及R5各自獨立地選自胺基酸、胺基酸衍生物及肽，且其中R6及R7各自獨立地選自胺基酸、胺基酸衍生物及肽。在此實施例中，雜原子連接體可為氮，且取代基X2及雜原子連接體可連同其所結合之可釋放連接體一起形成雜環。
雜環可為吡咯啶、六氫吡啶、噁唑啶、異噁唑啶、噻唑啶、異噻唑啶、吡咯啶酮、六氫吡啶酮、噁唑啶酮、異噁唑啶酮、噻唑啶酮、異噻唑啶酮及琥珀醯亞胺。
在本文闡述之任一實施例中，可釋放連接體可包括氧，氧鍵結至亞甲基、1-烷氧基伸烷基、1-烷氧基伸環烷基、1-烷氧基伸烷基羰基及1-烷氧基伸環烷基羰基從而形成縮醛或縮酮，其中該等片段中之每一者皆視情況經如本文所定義之取代基X2取代。另一選擇為，亞甲基或伸烷基經視情況經取代之芳基取代。
在本文闡述之任一實施例中，可釋放連接體可包括氧，氧鍵結至磺醯基烷基從而形成磺酸烷基酯。
在本文闡述之任一實施例中，可釋放連接體可包括氮，氮鍵結至亞胺基亞烷基、羰基亞烷基亞胺自由基、亞胺基環亞烷基及羰基環亞烷基亞胺基，從而形成腙，該等中之每一者皆視情況經如本文所定義之取代基X2取代。在替代組態中，腙可經羧酸衍生物、原甲酸酯衍生物或胺甲醯基衍生物醯化而形成含有各種醯腙之可釋放連接體。
在本文闡述之任一實施例中，可釋放連接體可包括氧，氧鍵結至伸烷基(二烷基矽烷基)、伸烷基(烷基芳基矽烷基)、伸烷基(二芳基矽烷基)、(二烷基矽烷基)芳基、(烷基芳基矽烷基)芳基及(二芳基矽烷基)芳基，從而形成矽醇，該等中之每一者皆視情況經如本文所定義之取代基X2取代。
在本文闡述之任一實施例中，可釋放連接體可包括氮，氮鍵結至羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(雙羧基芳基)羰基從而形成醯胺，或另一選擇為與藥物氮形成醯胺。
在本文闡述之任一實施例中，可釋放連接體可包括氧，氧鍵結至羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(雙羧基芳基)羰基從而形成酯，或另一選擇為與藥物氧形成酯。
形成連接體之一部分之說明性二價基團。
形成連接體之一部分之其他說明性二價基團。
應瞭解，二價間隔基連接體可以任一化學相關方式直接組合或經由插入雜原子組合來構築本文闡述之可釋放連接體。應進一步瞭解，間隔基及雜原子連接體之佈置之性質界定可釋放連接體將在活體內哪個地方解離。例如，以硫原子封端之兩個間隔基連接體在組合時形成二硫化物，該二硫化物在由此形成之可釋放連接體中係可解離鍵。
在一個態樣中，多價連接體包含3-硫琥珀醯亞胺-1-基烷基氧基甲基氧基部分，其中甲基視情況經烷基或經取代之芳基取代。
在另一態樣中，多價連接體包含3-硫琥珀醯亞胺-1-基烷基羰基，其中羰基與藥物形成醯基氮丙啶。
在另一態樣中，多價連接體包含1-烷氧基伸環烷基氧基部分。
在另一態樣中，多價連接體包含伸烷基胺基羰基(二羧基伸芳基) 羧酸酯。
在另一態樣中，多價連接體包含二硫烷基羰基醯肼，其中醯肼與藥物形成腙。
在另一態樣中，多價連接體包含3-硫琥珀醯亞胺-1-基烷基羰基醯肼，其中醯肼與藥物形成腙。
在另一態樣中，多價連接體包含3-硫烷基磺醯基烷基(二取代之矽烷基)氧基，其中二取代之矽烷基經烷基或視情況經取代之芳基取代。
在另一態樣中，多價連接體包含複數個選自由天然胺基酸及其立體異構物組成之群之間隔基連接體。
在另一態樣中，多價連接體包含2-二硫烷基氧基羰基，其中羰基與藥物形成碳酸酯。
在另一態樣中，多價連接體包含2-二硫芳基烷基氧基羰基，其中羰基與藥物形成碳酸酯且芳基視情況經取代。
在另一態樣中，多價連接體包含4-二硫芳基烷基氧基羰基，其中羰基與藥物形成碳酸酯，且芳基視情況經取代。
在另一態樣中，多價連接體包含3-硫琥珀醯亞胺-1-基烷基氧基烷基氧基亞烷基，其中亞烷基與藥物形成腙，每一烷基皆經獨立選擇，且氧基烷基氧基視情況經烷基或視情況經取代之芳基取代。
在另一態樣中，多價連接體包含2-二硫烷基氧基羰基醯肼。
在另一態樣中，多價連接體包含2-或3-二硫烷基胺基，其中胺基與藥物形成插烯醯胺。
在另一態樣中，多價連接體包含2-二硫烷基胺基，其中胺基與藥物形成插烯醯胺，且烷基係乙基。
在另一態樣中，多價連接體包含2-或3-二硫烷基胺基羰基，其中羰基與藥物形成胺基甲酸酯。
在另一態樣中，多價連接體包含2-二硫烷基胺基羰基，其中羰基與藥物形成胺基甲酸酯。在另一態樣中，烷基係乙基。
在另一態樣中，多價連接體包含2-二硫烷基氧基羰基，其中羰基與藥物形成胺基甲酸酯。在另一態樣中，烷基係乙基。
在另一態樣中，多價連接體包含2-二硫芳基烷基氧基羰基，其中羰基與藥物形成胺基甲酸酯或胺甲醯基氮丙啶。
在另一態樣中，多價連接體包含4-二硫芳基烷基氧基羰基，其中羰基與藥物形成胺基甲酸酯或胺甲醯基氮丙啶。
在另一實施例中，本文闡述之多價連接體包含式(II)之二價連接體
其中n係選自1至約4之整數；Ra及Rb各自獨立地選自由氫及視情況具支鏈之烷基(包括低碳數烷基，例如C1-C4烷基)組成之群；或Ra及Rb連同所附接之碳原子一起形成碳環；R係視情況經取代之烷基、視情況經取代之醯基或適宜選擇之氮保護基團；且(*)指示藥物、維生素、顯像劑、診斷劑、其他二價連接體或共軛物之其他部分之附接點。
在另一實施例中，本文闡述之多價連接體包含式(III)之二價連接體
其中m係選自1至約4之整數；R係視情況經取代之烷基、視情況經取代之醯基或適宜選擇之氮保護基團；且(*)指示藥物、維生素、顯像劑、診斷劑、其他二價連接體或共軛物之其他部分之附接點。
在另一實施例中，本文闡述之多價連接體包含式(IV)之二價連接體
其中m係選自1至約4之整數；R係視情況經取代之烷基、視情況經取代之醯基或適宜選擇之氮保護基團；且(*)指示藥物、維生素、顯像劑、診斷劑、其他二價連接體或共軛物之其他部分之附接點。
在另一實施例中，本文所闡述之化合物包含一或多個選自下式之二價連接體：
其中X係NH、O或S。
在另一實施例中，本文闡述之多價連接體包含具有下式之基團：
另一實施例，本文闡述之多價連接體包含具有下式之基團：
其中X係雜原子，例如氮、氧或硫，n係選自0、1、2及3之整數，R係氫或取代基(包括能夠以誘導方式或藉由芳基環上之共振使正電荷穩定之取代基，例如烷氧基)及諸如此類，且符號(*)指示附接點。應瞭解，其他取代基可存在於芳基環、苄基碳、烷酸或亞甲基橋上，包括(但不限於)羥基、烷基、烷氧基、烷基硫基、鹵基及諸如此類。
在另一實施例中，本文闡述之多價連接體包含選自由以下各項組成之群之間隔基連接體：羰基、硫代羰基(thionocarbonyl)、伸烷基、伸環烷基、伸烷基環烷基、伸烷基羰基、伸環烷基羰基、羰基烷基羰基、1-伸烷基琥珀醯亞胺-3-基、1-(羰基烷基)琥珀醯亞胺-3-基、伸烷基亞硫醯基、磺醯基烷基、伸烷基亞硫醯基烷基、伸烷基磺醯基烷基、羰基四氫-2H-吡喃基、羰基四氫呋喃基、1-(羰基四氫-2H-吡喃基)琥珀醯亞胺-3-基及1-(羰基四氫呋喃基)琥珀醯亞胺-3-基，其中該等間隔基連接體中之每一者皆視情況經一或多個取代基X1取代；
其中每一取代基X1皆獨立地選自由以下各項組成之群：烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、羥基烷基、胺基、胺基烷基、烷基胺基 烷基、二烷基胺基烷基、鹵基、鹵烷基、巰基烷基、烷基硫基烷基、芳基、經取代之芳基、芳基烷基、經取代之芳基烷基、雜芳基、經取代之雜芳基、羧基、羧基烷基、烷基羧酸酯、烷基烷酸酯、胍基烷基、R4-羰基、R5-羰基烷基、R6-醯基胺基及R7-醯基胺基烷基，其中R4及R5各自獨立地選自由胺基酸、胺基酸衍生物及肽組成之群，且其中R6及R7各自獨立地選自由胺基酸、胺基酸衍生物及肽組成之群。
本文所闡述化合物可含有一或多個對掌性中心，或否則可能夠以多重立體異構物形式存在。應瞭解，在一個實施例中，除非其中有明確指示，否則本文所闡述本發明並不限於任何具體立體化學要求，且化合物及包括其之組合物、方法、用途及醫藥可為光學純，或可為各種立體異構混合物中之任一者，包括鏡像異構物之外消旋及其他混合物、非鏡像異構物之其他混合物及諸如此類。亦應瞭解，立體異構物之該等混合物可包括於一或多個對掌性中心處之單一立體化學組態，同時包括於一或多個其他對掌性中心處之立體化學組態之混合物。
類似地，本文所闡述化合物可包括幾何中心，例如順式、反式、E及Z雙鍵。應瞭解，在另一實施例中，本文所闡述本發明並不限於任何具體幾何異構物要求，且化合物及包括其之組合物、方法、用途及醫藥可為純的，或可為各種幾何異構物混合物中之任一者。亦應瞭解，該等幾何異構物混合物可包括於一或多個雙鍵處之單一組態，同時包括於一或多個其他雙鍵處之幾何混合物。
如本文所使用，術語細胞表面受體結合或靶向配體通常係指結合至及/或靶向於細胞表面上發現且具體而言彼等於病原細胞之表面上發現、由該等病原細胞過表現及/或優先表現之受體之化合物。說明性配體包括(但不限於)維生素及維生素受體結合化合物。
說明性維生素部分包括肉鹼、肌醇、類脂酸、吡哆醛、抗壞血 酸、菸鹼酸、泛酸、葉酸、核黃素、硫胺素、生物素、維生素B12及脂質可溶性維生素A、D、E及K。該等維生素及其受體結合類似物及衍生物構成靶向實體，自該靶向實體可形成用於共價附接至多價連接體L之基團。結合至生物素受體之說明性生物素類似物包括(但不限於)生物細胞素、生物素亞碸、氧生物素及諸如此類)。
結合至葉酸鹽受體之說明性葉酸類似物包括(但不限於)醛葉酸、蝶醯聚麩胺酸，及葉酸鹽受體結合蝶啶，例如四氫蝶呤、二氫葉酸鹽、四氫葉酸鹽以及其去氮及二去氮類似物。術語「去氮」及「二去氮」類似物係指為業內公認的在天然葉酸結構中由碳原子取代一個或兩個氮原子之類似物，或其類似物或衍生物。例如，去氮類似物包括葉酸鹽、醛葉酸、蝶醯聚麩胺酸及葉酸鹽受體結合蝶啶(例如四氫蝶呤、二氫葉酸鹽及四氫葉酸鹽)之1-去氮、3-去氮、5-去氮、8-去氮及10-去氮類似物。二去氮類似物包括(例如)葉酸鹽、醛葉酸、蝶醯聚麩胺酸及葉酸鹽受體結合蝶啶(例如四氫蝶呤、二氫葉酸鹽及四氫葉酸鹽)之1,5-二去氮、5,10-二去氮、8,10-二去氮及5,8-二去氮類似物。可用作形成本發明配體之複合物之其他葉酸鹽係葉酸鹽受體結合類似物胺基蝶呤、胺甲蝶呤(亦稱為甲胺蝶呤(methotrexate))、N10-甲基葉酸鹽、2-去胺基-羥基葉酸鹽、去氮類似物(例如1-去氮甲胺蝶呤(1-deazamethopterin)或3-去氮甲胺蝶呤)及3’,5’-二氯-4-胺基-4-去氧基-N10-甲基蝶醯基麩胺酸(二氯甲胺蝶呤)。上述葉酸類似物及/或衍生物照慣例稱為「葉酸鹽」，此反應其與葉酸鹽受體結合之能力，且該等配體在與外生性分子共軛時(例如)經由如本文所闡述之葉酸鹽介導之細胞吞噬有效增強跨膜運輸。
結合至葉酸受體之葉酸之其他類似物闡述於美國專利申請公開案第2005/0227985號及第2004/0242582號中，該等案件之揭示內容以引用方式併入本文中。說明性地，該等葉酸鹽類似物具有以下通式：
其中X及Y各自獨立地選自由鹵基、R2、OR2、SR3及NR4R5組成之群；U、V及W代表二價部分，其各自獨立地選自由-(R6a)C=、-N=、-(R6a)C(R7a)-及-N(R4a)-組成之群；Q係選自由C及CH組成之群；T係選自由S、O、N及-C=C-組成之群；A1及A2各自獨立地選自由以下各項組成之群：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12伸烷基及C1-C12伸烷基氧基，其中Z係氧或硫；R1係選自由氫、鹵基、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基組成之群；R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b及R7b各自獨立地選自由以下各項組成之群：氫、鹵基、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷醯基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基及(C1-C12烷基胺基)羰基；R6及R7各自獨立地選自由氫、鹵基、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基組成之群；或者，R6及R7一起形成羰基；R6a及R7a各自獨立地選自由氫、鹵基、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基組成之群；或R6a及R7a一起形成羰基；L係如本文闡述之二價連接體；且n、p、r、s及t各自獨立地係0或1。
如本文所使用，術語胺基酸通常係指β胺基酸、γ胺基酸及更長的胺基酸，例如下式之胺基酸： -N(R)-(CR'R")q-C(O)-
其中R係氫、烷基、醯基或適宜氮保護基團，R'及R"係氫或取代基，其每一者在每次出現時皆經獨立選擇，且q係諸如1、2、3、4或5等整數。說明性地，R'及/或R"獨立地對應於(但不限於)氫或存在於天然胺基酸上之側鏈，例如甲基、苄基、羥基甲基、硫甲基、羧基、羧基甲基、胍基丙基及諸如此類，及其衍生物及經保護衍生物。上述式包括所有立體異構變化形式。例如，胺基酸可選自天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、鳥胺酸、蘇胺酸及諸如此類。
如本文所使用，術語「胺基酸衍生物」通常係指如本文所定義胺基及/或側鏈或二者經取代之胺基酸。說明性胺基酸衍生物包括胺基及/或側鏈之前藥及保護基團，例如胺、醯胺、羥基、羧酸及硫前藥及保護基團。其他說明性胺基酸衍生物包括如本文所闡述之胺基酸之經取代變化形式，例如(但不限於)羥基之醚及酯、醯胺、胺基甲酸酯及胺基之脲、酯、醯胺，及羧酸基團之氰基衍生物，及諸如此類。
如本文所使用，微管溶素通常係指下式之四肽化合物
及其醫藥鹽，其中n係1至3；V係H、OR2或鹵基，且W係H、OR2或烷基，其中R2在每一情形下皆獨立地選自H、烷基及C(O)R3，其中R3係烷基、環烷基、烯基、芳基或芳基烷基，其每一者皆視情況經取代；前提條件係當V及W皆為OR2時R2不為H；或V及W連同所附接碳一起形成羰基；X=H、C1-4烷基、烯基，其每一者皆視情況經取代，或CH2QR9； 其中Q係-N-、-O-或-S-；R9=H、C1-4烷基、烯基、芳基或C(O)R10；且R10=C1-6烷基、烯基、芳基或雜芳基，其每一者皆視情況經取代；Z係烷基且Y係O；或Z係烷基或C(O)R4，且Y不存在，其中R4係烷基、CF3或芳基；R1係H，或R1代表1至3個選自鹵基、硝基、羧酸酯或其衍生物、氰基、羥基、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基及OR6之取代基，其中R6係氫或視情況經取代之芳基、苯酚保護基團、前藥部分、烷基、芳基烷基、C(O)R7、P(O)(OR8)2或SO3R8，其中R7及R8在每一情形下皆獨立地選自H、烷基、烯基、環烷基、雜環基、芳基及芳基烷基，其每一者皆視情況經取代，或R8係金屬陽離子；且R係OH或離去基團，或R形成羧酸衍生物，例如醯基醯肼。
本文闡述上述微管溶素中之每一者之共軛物。在一個變化形式中，Z係甲基。在另一變化形式中，R1係H。在另一變化形式中，R1在C(4)處係OR6，其中R6係H、烷基或COR7。在另一變化形式中，V係H，且W係OC(O)R3。在另一變化形式中，X=CH2QR9。在另一變化形式中，X=CH2OR9。在另一變化形式中，R9係烷基或烯基。在另一變化形式中，R9係C(O)R10。在另一變化形式中，R10=視情況經取代之C1-6烷基。在另一變化形式中，R10=C1-6烷基。在另一變化形式中，R形成醯基醯肼。應瞭解，上述闡述明確闡述一般微管溶素結構之變化形式之每一化學可能組合。例如，應瞭解，上述闡述闡述變化形式，其中Z係甲基，且R1係H；其中R1在C(4)處係OR6，且R6係H；其中Z係甲基，R1在C(4)處係OR6，R6係H，且X=CH2OR9；及諸如此類。
天然微管溶素通常係由以下組成之直鏈四肽：N-甲基六氫菸鹼酸(Mep)、異白胺酸(Ile)、稱為微管纈胺酸(tubuvalin，Tuv)之非天然胺基酸，及稱為微管酪胺酸(Tut，酪胺酸之類似物)之非天然胺基酸或 稱為微管苯丙胺酸(Tup，苯丙胺酸之類似物)之非天然胺基酸。在另一實施例中，闡述以下通式之天然微管溶素及其類似物及衍生物
及其醫藥鹽，其中R、R1及R10係如本文各個實施例中所闡述。本文闡述上述微管溶素中之每一者之共軛物。
在另一實施例中，闡述以下通式之天然微管溶素之共軛物
及其醫藥鹽。
如本文所使用，術語「雷帕黴素」應理解為包括西羅莫司(雷帕黴素)、替西羅莫司、依維莫司及地磷莫司及相關化合物，且闡述下式之化合物
及其醫藥上可接受之鹽，其中YA係ORC或OCH2CH2ORC；RA、RB或RC中之一者係連接至L之鍵；且RA、RB及RC中之另外兩者在每一情形下皆獨立地選自由氫、視情況經取代之雜烷基、前藥形成性基團及C(O)RD組成之群，其中RD在每一情形下皆獨立地選自由氫及烷基、烯基、雜烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基及雜芳基烷基組成之群，該等基團中之每一者皆視情況經取代。
如本文所使用，術語可釋放連接體係指包括至少一個可在生理條件下斷裂之鍵之連接體，例如pH不穩定鍵、酸不穩定鍵、鹼不穩定鍵、氧化不穩定鍵、代謝不穩定鍵、生化不穩定鍵或酶不穩定鍵。應瞭解，造成鍵斷裂之該等生理條件並不一定包括生物或代謝過程，而是可能包括標準化學反應，例如，例如在生理pH下或由於隔室化成細胞器(例如具有低於細胞溶質pH之pH之核內體)而引起之水解反應。
應瞭解，可解離鍵可在可釋放連接體內連接兩個毗鄰原子及/或在可釋放連接體之一端或兩端連接如本文所闡述之其他連接體或B及/或任一D。在可解離鍵在可釋放連接體內連接兩個毗鄰原子之情形下，在鍵斷裂後，可釋放連接體斷裂成兩個或更多個片段。另一選擇 為，在可解離鍵介於可釋放連接體與另一部分(例如其他雜原子、間隔基連接體、另一可釋放連接體、藥物或其任一基團，或結合配體)之間之情形下，在鍵斷裂後，可釋放連接體與其他部分分離。因此，亦應瞭解，間隔基及可釋放連接體中之每一者皆係多價的，例如二價。
如本文所使用，術語「烷基」包括碳原子之鏈，其視情況具支鏈。如本文所使用，術語「烯基」及「炔基」包括碳原子之鏈，其視情況具支鏈，且分別包括至少一個雙鍵或三鍵。應瞭解，炔基亦可包括一或多個雙鍵。應進一步瞭解，在某些實施例中，烷基有利地具有有限長度，包括C1-C24、C1-C12、C1-C8、C1-C6及C1-C4。說明性地，該等尤其有限長度的烷基(包括C1-C8、C1-C6及C1-C4)可稱作低碳數烷基。應進一步瞭解，在某些實施例中，烯基及/或炔基可各自有利地具有有限長度，包括C2-C24、C2-C12、C2-C8、C2-C6及C2-C4。說明性地，該等尤其有限長度的烯基及/或炔基(包括C2-C8、C2-C6及C2-C4)可稱作低碳數烯基及/或炔基。在本文中應瞭解，較短烷基、烯基及/或炔基可使化合物具有較低親油性且因此將具有不同的藥物動力學性質。在本文所闡述本發明之實施例中，應瞭解，在每一情形下，所列舉烷基係指如本文所定義之烷基，且視情況係指低碳數烷基。在本文所闡述本發明之實施例中，應瞭解，在每一情形下，所列舉烯基係指如本文所定義之烯基，且視情況係指低碳數烯基。在本文所闡述本發明之實施例中，應瞭解，在每一情形下，所列舉炔基係指如本文所定義之炔基，且視情況係指低碳數炔基。說明性烷基、烯基及炔基係(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、己基、庚基、辛基及諸如此類，及含有一或多個雙鍵及/或三鍵之相應基團，或其組合。
如本文所使用，術語「伸烷基」包括碳原子之二價鏈，其視情況具支鏈。如本文所使用，術語「伸烯基」及「伸炔基」包括碳原子之二價鏈，其視情況具支鏈，且分別包括至少一個雙鍵或三鍵。應瞭解，伸炔基亦可包括一或多個雙鍵。應進一步瞭解，在某些實施例中，伸烷基有利地具有有限長度，包括C1-C24、C1-C12、C1-C8、C1-C6及C1-C4。說明性地，該等尤其有限長度的伸烷基(包括C1-C8、C1-C6及C1-C4)可稱作低碳數伸烷基。應進一步瞭解，在某些實施例中，伸烯基及/或伸炔基可各自有利地具有有限長度，包括C2-C24、C2-C12、C2-C8、C2-C6及C2-C4。說明性地，該等尤其有限長度的伸烯基及/或伸炔基(包括C2-C8、C2-C6及C2-C4)可稱作低碳數伸烯基及/或伸炔基。在本文中應瞭解，較短伸烷基、伸烯基及/或伸炔基可使化合物具有較低親油性且因此將具有不同的藥物動力學性質。在本文所闡述本發明之實施例中，應瞭解，在每一情形下，所列舉伸烷基、伸烯基及伸炔基係指如本文所定義之伸烷基、伸烯基及伸炔基，且視情況係指低碳數伸烷基、伸烯基及伸炔基。說明性烷基係(但不限於)亞甲基、伸乙基、正伸丙基、異伸丙基、正伸丁基、異伸丁基、第二伸丁基、伸戊基、1,2-伸戊基、1,3-伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基及諸如此類。
如本文所使用，術語「環烷基」包括碳原子之鏈，其視情況具支鏈，其中該鏈之至少一部分呈環狀。應瞭解，環烷基烷基係環烷基子集。應瞭解，環烷基可為多環。說明性環烷基包括(但不限於)、環丙基、環戊基、環己基、2-甲基環丙基、環戊基乙-2-基、金剛烷基及諸如此類。如本文所使用，術語「環烯基」包括碳原子之鏈，其視情況具支鏈，且包括至少一個雙鍵，其中該鏈之至少一部分呈環狀。應瞭解，一或多個雙鍵可位於環烯基之環狀部分及/或環烯基之非環狀部分中。應瞭解，環烯基烷基及環烷基烯基各自係環烯基之子集。應 瞭解，環烷基可為多環。說明性環烯基包括(但不限於)環戊烯基、環己基乙烯-2-基、環庚烯基丙烯基及諸如此類。應進一步瞭解，鏈形成性環烷基及/或環烯基有利地具有有限長度，包括C3-C24、C3-C12、C3-C8、C3-C6及C5-C6。在本文中應瞭解，分別形成較短烷基鏈及/或烯基鏈之環烷基及/或環烯基可使化合物具有較低親油性且因此將具有不同的藥物動力學性質。
如本文所使用，術語「雜烷基」包括包含碳及至少一個雜原子二者之原子鏈，且視情況具支鏈。說明性雜原子包括氮、氧及硫。在某些變化形式中，說明性雜原子亦包括磷及硒。如本文所使用，術語包括雜環基及雜環之「雜環烷基」包括包含碳及至少一個雜原子二者之原子鏈(例如雜烷基)，且視情況具支鏈，其中該鏈之至少一部分為環狀。說明性雜原子包括氮、氧及硫。在某些變化形式中，說明性雜原子亦包括磷及硒。說明性雜環烷基包括(但不限於)四氫呋喃基、吡咯啶基、四氫吡喃基、六氫吡啶基、嗎啉基、六氫吡嗪基、高六氫吡嗪基、奎寧環基及諸如此類。
如本文所使用，術語「芳基」包括單環及多環狀芳香族碳環基團，其每一者皆可視情況經取代。本文闡述之說明性芳香族碳環基團包括(但不限於)苯基、萘基及諸如此類。如本文所使用，術語「雜芳基」包括芳香族雜環基團，其每一者皆可視情況經取代。說明性芳香族雜環基團包括(但不限於)吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并異噁唑基、苯并異噻唑基及諸如此類。
如本文所使用，術語「胺基」包括基團NH2、烷基胺基及二烷基胺基，其中二烷基胺基中之兩個烷基可相同或不同，即烷基烷基胺 基。說明性地，胺基包括甲基胺基、乙基胺基、二甲基胺基、甲基乙基胺基及諸如此類。此外，應瞭解，當胺基修飾或由另一術語修飾時，例如胺基烷基或醯基胺基，術語胺基之上述變化形式包括在內。說明性地，胺基烷基包括H2N-烷基、甲基胺基烷基、乙基胺基烷基、二甲基胺基烷基、甲基乙基胺基烷基及諸如此類。說明性地，醯基胺基包括醯基甲基胺基、醯基乙基胺基及諸如此類。
如本文所使用，術語「胺基及其衍生物」包括如本文所闡述之胺基，及烷基胺基、烯基胺基、炔基胺基、雜烷基胺基、雜烯基胺基、雜炔基胺基、環烷基胺基、環烯基胺基、雜環烷基胺基、雜環烯基胺基、芳基胺基、芳基烷基胺基、芳基烯基胺基、芳基炔基胺基、雜芳基胺基、雜芳基烷基胺基、雜芳基烯基胺基、雜芳基炔基胺基、醯基胺基及諸如此類，其每一者皆視情況經取代。術語「胺基衍生物」亦包括脲、胺基甲酸酯及諸如此類。
如本文所使用，術語「羥基及其衍生物」包括OH，及烷基氧基、烯基氧基、炔基氧基、雜烷基氧基、雜烯基氧基、雜炔基氧基、環烷基氧基、環烯基氧基、雜環烷基氧基、雜環烯基氧基、芳基氧基、芳基烷基氧基、芳基烯基氧基、芳基炔基氧基、雜芳基氧基、雜芳基烷基氧基、雜芳基烯基氧基、雜芳基炔基氧基、醯基氧基及諸如此類，其每一者皆視情況經取代。術語「羥基衍生物」亦包括胺基甲酸酯及諸如此類。
如本文所使用，術語「硫基及其衍生物」包括SH，及烷基硫基、烯基硫基、炔基硫基、雜烷基硫基、雜烯基硫基、雜炔基硫基、環烷基硫基、環烯基硫基、雜環烷基硫基、雜環烯基硫基、芳基硫基、芳基烷基硫基、芳基烯基硫基、芳基炔基硫基、雜芳基硫基、雜芳基烷基硫基、雜芳基烯基硫基、雜芳基炔基硫基、醯基硫基及諸如此類，其每一者皆視情況經取代。術語「硫基衍生物」亦包括硫胺基 甲酸酯及諸如此類。
如本文所使用，術語「醯基」包括甲醯基，及烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、雜烷基羰基、雜烯基羰基、雜炔基羰基、環烷基羰基、環烯基羰基、雜環烷基羰基、雜環烯基羰基、芳基羰基、芳基烷基羰基、芳基烯基羰基、芳基炔基羰基、雜芳基羰基、雜芳基烷基羰基、雜芳基烯基羰基、雜芳基炔基羰基、醯基羰基及諸如此類，其每一者皆視情況經取代。
如本文所使用，術語「羰基及其衍生物」包括基團C(O)、C(S)、C(NH)及其經取代之胺基衍生物。
如本文所使用，術語「羧酸及其衍生物」包括基團CO2H及其鹽、及其酯及醯胺及CN。
如本文所使用，術語「視情況經取代」包括氫原子經視情況經取代之基團上之其他官能基之替代。該等其他官能基說明性地包括(但不限於)胺基、羥基、鹵基、硫基、烷基、鹵烷基、雜烷基、芳基、芳基烷基、芳基雜烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基雜烷基、硝基、磺酸及其衍生物、羧酸及其衍生物及諸如此類。說明性地，胺基、羥基、硫基、烷基、鹵烷基、雜烷基、芳基、芳基烷基、芳基雜烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基雜烷基及/或磺酸中之任一者視情況經取代。
如本文所使用，術語「視情況經取代之芳基」及「視情況經取代之雜芳基」包括氫原子經視情況經取代之芳基或雜芳基上之其他官能基之替代。該等其他官能基說明性地包括(但不限於)胺基、羥基、鹵基、硫基、烷基、鹵烷基、雜烷基、芳基、芳基烷基、芳基雜烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基雜烷基、硝基、磺酸及其衍生物、羧酸及其衍生物及諸如此類。說明性地，胺基、羥基、硫基、烷基、鹵烷基、雜烷基、芳基、芳基烷基、芳基雜烷基、雜芳基、雜芳基烷 基、雜芳基雜烷基及/或磺酸中之任一者視情況經取代。
說明性取代基包括(但不限於)基團-(CH2)xZX，其中x係0至6之整數，且ZX係選自鹵素、羥基、烷醯基氧基(包括C1-C6烷醯基氧基)、視情況經取代之芳醯基氧基、烷基(包括C1-C6烷基)、烷氧基(包括C1-C6烷氧基)、環烷基(包括C3-C8環烷基)、環烷氧基(包括C3-C8環烷氧基)、烯基(包括C2-C6烯基)、炔基(包括C2-C6炔基)、鹵烷基(包括C1-C6鹵烷基)、鹵烷氧基(包括C1-C6鹵烷氧基)、鹵環烷基(包括C3-C8鹵環烷基)、鹵環烷氧基(包括C3-C8鹵環烷氧基)、胺基、C1-C6烷基胺基、(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)胺基、烷基羰基胺基、N-(C1-C6烷基)烷基羰基胺基、胺基烷基、C1-C6烷基胺基烷基、(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)胺基烷基、烷基羰基胺基烷基、N-(C1-C6烷基)烷基羰基胺基烷基、氰基及硝基；或ZX係選自-CO2R4及-CONR5R6，其中R4、R5及R6在每次出現時皆各自獨立地選自氫、C1-C6烷基、芳基-C1-C6烷基及雜芳基-C1-C6烷基。
如本文所使用，術語「連接體」包括將分子之兩個或更多個官能部分連接從而形成共軛物之原子鏈。說明性地，原子鏈係選自C、N、O、S、Si及P，或C、N、O、S及P，C、N、O及S。原子鏈共價連接具有不同功能性能力之共軛物，例如結合配體、藥物、診斷劑、顯像劑及諸如此類。連接體可具有眾多長度，例如在連續主鏈中約2至約100個原子範圍內。用於形成連接體之原子可以所有化學相關方式組合，例如碳原子之鏈，其形成伸烷基、伸烯基及伸炔基及諸如此類；碳及氧原子之鏈，其形成醚、聚氧基伸烷基或當與羰基組合時形成酯及碳酸酯及諸如此類；碳及氮原子之鏈，其形成胺、亞胺、聚胺、肼、腙或當與羰基組合時形成醯胺、脲、半卡肼、卡肼及諸如此類；碳、氮及氧原子之鏈，其形成烷氧基胺、烷氧基胺或當與羰基組合時形成胺基甲酸酯、胺基酸、醯基氧基胺、羥肟酸及諸如此類；及 許多其他鏈。此外，應瞭解，在上述說明性實施例中之每一者中形成鏈之原子可為飽和或不飽和的，由此形成單鍵、雙鍵或三鍵，從而使得(例如)烷烴、烯烴、炔烴、亞胺及諸如此類可為包括在連接體中之基團。此外，應瞭解，形成連接體之原子亦可彼此間進行環化或為環狀結構之一部分，從而形成形成連接體之二價環狀結構，包括連接體中之環烷烴、環醚、環胺及其他雜環、伸芳基、雜伸芳基及諸如此類。在此後一佈置中，應瞭解，連接體長度可藉由任一路徑藉助一或多個環狀結構來界定。說明性地，連接體長度係藉由最短的路徑藉助每一環狀結構來界定。應瞭解，連接體可視情況沿原子之鏈在任一或多個開放價下經取代，例如在碳、氮、矽或磷原子中之任一者上進行可選取代。亦應瞭解，連接體可連接分子之兩個或更多個官能部分以在任一開放價下形成共軛物，且並非需要形成共軛物之分子之兩個或更多個官能部分中之任一者皆在連接體之任一明顯末端處附接。
如本文所使用，術語「基團」在提及(例如)細胞表面受體結合及/或靶向配體及/或獨立選擇之藥物時係指如本文所闡述之細胞表面受體結合及/或靶向配體及/或獨立選擇之藥物，其中一或多個原子或基團(例如氫原子或雜原子上之烷基及諸如此類)經移除以提供與多價連接體L共軛之基團。該等配體基團及藥物基團在本文中亦可分別稱作配體類似物及藥物類似物。
如本文所使用，術語「離去基團」係指反應性官能基，其在其所附接之原子上生成親電子位點從而使得可將親和劑添加至該原子上之親電子位點。說明性離去基團包括(但不限於)鹵素、視情況經取代之苯酚、醯基氧基、磺醯氧基及諸如此類。應瞭解，該等離去基團可在烷基、醯基及諸如此類上。例如當離去基團存在於醯基上時，該等離去基團在本文中亦可稱作活化基團。
應瞭解，在本文所揭示之每一情形下，對任一變量之整數範圍 之列舉闡述所列舉範圍、該範圍中之每一個別成員及該變量之每一可能子範圍。例如，對n係0至8之整數之列舉闡述0、1、2、3、4、5、6、7及8之範圍、個別及可選值，例如n係0，或n係1，或n係2等。此外，對n係0至8之整數之列舉亦闡述每一子範圍，其每一者可係另一實施例之基礎，例如n係1至8、1至7、1至6、2至8、2至7、1至3、2至4等之整數。
如本文所使用，術語「組合物」通常係指包含指定量指定成份的任何產品以及直接或間接地由指定量指定成份之組合產生的任何產品。應瞭解，本文闡述之組合物可自本文所闡述之經分離化合物或自本文所闡述化合物之鹽、溶液、水合物、溶劑合物及其他形式來製備。應瞭解，某些官能基(例如羥基、胺基及類似基團)與水及/或各種溶劑以該等化合物之各種物理形式形成複合物及/或配位化合物。亦應瞭解，該等組合物可自本文所闡述化合物之各種非晶形、非非晶形、部分結晶、結晶及/或其他形態形式來製備。亦應瞭解，該等組合物可自本文所闡述化合物之各種水合物及/或溶劑合物來製備。因此，列舉本文所闡述化合物之該等醫藥組合物應理解為包括本文所闡述化合物之各種形態形式及/或溶劑合物或水合物形式中之每一者或其任一組合。此外，應瞭解，該等組合物可自本文所闡述化合物之各種共晶體來製備。
說明性地，組合物可包括一或多種載劑、稀釋劑及/或賦形劑。本文所闡述化合物或含有其之組合物可以治療有效量以適於本文所闡述方法之任何習用劑型來調配。本文所闡述化合物或含有其之組合物(包括該等調配物)可藉由用於本文所闡述方法之眾多習用途徑且以眾多劑型利用已知程序來投與(通常參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy，(第21版，2005))。
如本文所使用，術語「治療有效量」係指活性化合物或醫藥劑 在組織系統、動物或人類中引發研究者、獸醫師、醫師或其他臨床醫師所尋求之生物或醫學反應的量，該生物或醫學反應包括所治療疾病或病症之症狀之緩解。在一個態樣中，治療有效量係可以適用於任一醫學治療的合理益處/風險比治療或緩解疾病或疾病之症狀的量。然而，應瞭解，本文所闡述化合物及組合物之總日用量可由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內確定。任一具體患者之特定治療有效劑量量將取決於各種因素，包括所治療病症及該病症之嚴重程度；所用特定化合物之活性；所用特定組合物；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；所用特定化合物之投與時間、投與途徑及排泄速率；治療之持續時間；與所用特定化合物組合或同時使用之藥物；及熟習此項技術之研究者、獸醫師、醫師或其他臨床醫師熟知之類似因素。
如本文所使用，術語「投與」包括將本文所闡述之化合物及組合物引入至患者中之所有方式，包括(但不限於)經口(po)、靜脈內(iv)、肌內(im)、皮下(sc)、經皮、吸入、經頰、經眼、舌下、陰道、直腸及諸如此類。本文闡述之化合物及組合物可以含有習用無毒性的醫藥上可接受之載劑、佐劑及媒劑之單位劑型及/或調配物來投與。
用於經口投與之說明性型式包括錠劑、膠囊、酏劑、糖漿及諸如此類。
非經腸投與之說明性途徑包括靜脈內、動脈內、腹膜內、硬膜外、尿道內、胸骨內、肌內及皮下以及任何其他為業內公認的非經腸投與途徑。
端視如本文所闡述之疾病、投與途徑，及/或不論化合物及/或組合物係局部投與抑或全身投與，本文皆涵蓋寬範圍之許可劑量，包括在約1μg/kg至約1g/kg範圍內之劑量。該等劑量可為單一或分開的，且可根據眾多方案(包括每天一次、每天兩次、每天三次或甚至每隔一天、每週一次、每月一次、每季一次及諸如此類)來投與。在該等 情形之每一者下，應瞭解，本文闡述之治療有效量對應於投與之情況，或另一選擇為對應於總日劑量、週劑量、月劑量或季劑量，如藉由投藥方案所確定。
如本文所使用，術語「前藥」通常係指當投與生物系統時因一或多種自發化學反應、酶催化之化學反應及/或代謝化學反應或其組合而生成生物活性化合物之任一化合物。在活體內，前藥通常係藉由酶(例如酯酶、醯胺酶、磷酸酶及諸如此類)、簡單生物化學或其他活體內過程來起作用，從而釋放或再生更具藥理學活性之藥物。此活化可藉助在投與前藥之前、之後或期間投與宿主之內生性宿主酶或非內生性酶之作用來達成。前藥應用之其他細節闡述於以下文獻中：美國專利第5,627,165號；及Pathalk等人，Enzymic protecting group techniques in organic synthesis,Stereosel.Biocatal.775-797(2000)。應瞭解，一達成諸如靶向輸送、安全性、穩定性及諸如此類等目標，前藥即有利地轉化成初始藥物，隨後快速消除形成前藥之基團之所釋放剩餘部分。
前藥可自本文所闡述化合物藉由附接最終在活體內解離成一或多個存在於化合物上之官能基(例如-OH-、-SH、-CO2H、-NR2)之基團來製備。說明性前藥包括(但不限於)羧酸酯，其中基團係烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、醯基氧基烷基、烷氧基羰基氧基烷基；以及羥基、硫醇及胺之酯，其中所附接基團係醯基、烷氧基羰基、胺基羰基、磷酸酯或硫酸酯。說明性酯(亦稱作活性酯)包括(但不限於)1-二氫茚基、N-氧基琥珀醯亞胺；醯基氧基烷基，例如乙醯氧基甲基、三甲基乙醯基氧基甲基、β-乙醯氧基乙基、β-三甲基乙醯基氧基乙基、1-(環己基羰基氧基)丙-1-基、(1-胺基乙基)羰基氧基甲基及諸如此類；烷氧基羰基氧基烷基，例如乙氧基羰基氧基甲基、α-乙氧基羰基氧基乙基、β-乙氧基羰基氧基乙基及諸如此類；二烷基胺 基烷基，包括二低碳數烷基胺基烷基，例如二甲基胺基甲基、二甲基胺基乙基、二乙基胺基甲基、二乙基胺基乙基及諸如此類；2-(烷氧基羰基)-2-烯基，例如2-(異丁氧基羰基)戊-2-烯基、2-(乙氧基羰基)丁-2-烯基及諸如此類；及內酯基團，例如酞基、二甲氧基酞基及諸如此類。
其他說明性前藥含有諸如醯胺或磷基團等用以增加本文所闡述化合物之溶解性及/或穩定性之化學部分。其他說明性前藥之胺基包括(但不限於)(C3-C20)烷醯基；鹵基-(C3-C20)烷醯基；(C3-C20)烯醯基；(C4-C7)環烷醯基；(C3-C6)-環烷基(C2-C16)烷醯基；視情況經取代之芳醯基，例如未經取代之芳醯基或經1至3個選自由鹵素、氰基、三氟甲烷磺醯基氧基、(C1-C3)烷基及(C1-C3)烷氧基組成之群之取代基取代之芳醯基，該等取代基中之每一者皆視情況進一步經1至3個鹵素原子中之一或多者取代；視情況經取代之芳基(C2-C16)烷醯基及視情況經取代之雜芳基(C2-C16)烷醯基，例如未經取代或經1至3個選自由鹵素、(C1-C3)烷基及(C1-C3)烷氧基組成之群之取代基取代之芳基或雜芳基，該等取代基中之每一者皆視情況進一步經1至3個鹵素原子取代；及視情況經取代之雜芳基烷醯基，其在雜芳基部分中具有一至三個選自O、S及N之雜原子且在烷醯基部分中具有2至10個碳原子，例如未經取代或經1至3個選自由鹵素、氰基、三氟甲烷磺醯基氧基、(C1-C3)烷基及(C1-C3)烷氧基組成之群之取代基取代之雜芳基，該等取代基中之每一者皆視情況進一步經1至3個鹵素原子取代。所說明之該等基團係例示性的而非係窮盡的，且其可藉由習用製程來製備。
應瞭解，該等前藥本身可能不具有顯著生物活性，而是在活體內投與後經歷一或多種自發化學反應、酶催化之化學反應及/或代謝化學反應或其組合而產生具有生物活性或係生物活性化合物之前體之本文所闡述化合物。然而，應瞭解，在一些情形下，前藥具有生物活 性。亦應瞭解，前藥通常可用以藉助改良之口服生物利用度、藥效動力學半衰期及諸如此類來改良藥物效能或安全性。前藥亦係指本文所闡述化合物之衍生物，其包括僅遮蔽不合意藥物性質或改良藥物輸送之基團。例如，本文所闡述之一或多種化合物可能展現不合意性質，該等不合意性質可有利地阻止或最小化且可在臨床藥物應用中成為藥理學、醫藥或藥物動力學障壁，例如低口服藥物吸收、缺乏位點特異性、化學不穩定性、毒性及患者差接受性(口味差、惡臭、注射位點疼痛及諸如此類)及其他。在本文中應瞭解，前藥或使用可逆衍生物之其他策略可用於最佳化藥物之臨床應用。
本文闡述之化合物、連接體、中間體及共軛物可使用習用製程來製備，該等習用製程包括彼等闡述於國際專利公開案第WO 2009/002993號、第WO 2004/069159號、第WO 2007/022494號及第WO 2006/012527號及美國專利申請案第13/837539號(2013年3月15日申請)中者。上述案件中之每一者之揭示內容係以全文引用方式併入本文中。
本文引用之每一出版物皆係以引用方式併入本文中。
以下實例進一步說明本發明之特定實施例；然而，以下說明性實例不應視為以任何方式限制本發明。
實例 化合物實例
本文所闡述化合物可使用本文闡述之製程及合成以及使用一般有機合成方法來製備。具體而言，製備該等化合物之方法闡述於美國專利申請公開案2005/0002942中，該案之揭示內容係以引用方式併入本文中。
實例。葉酸鹽-肽之一般形成。含葉酸鹽之肽基片段Pte-Glu-(AA)n-NH(CHR2)CO2H(3)係藉由聚合物支持之依序方法使用標準方法 (例如酸敏感性Fmoc-AA-Wang樹脂(1)上之Fmoc策略)來製備，如以下反應圖所顯示：
(a)20%六氫吡啶/DMF；(b)Fmoc-AA-OH、PyBop、DIPEA、DMF；(c)Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH、PyBop、DIPEA、DMF；(d)1.N10(TFA)-Pte-OH；PyBop、DIPEA、DMSO；(e)TFAA、(CH2SH)2、i-Pr3SiH；(f)NH4OH，pH 10.3。
應瞭解，可使用適當起始材料將非天然胺基酸包括在上述製程中。
在本文所闡述製程之此說明性實施例中，R1係Fmoc，R2係期望之經適當保護之胺基酸側鏈，且DIPEA係二異丙基乙胺。使用諸如PyBOP及本文闡述或業內已知之其他等標準偶合程序，其中說明性地施加偶合劑作為活化試劑來確保有效偶合。在每一偶合步驟後在標準條件下(例如在經六氫吡啶、四丁基氟化銨(TBAF)及諸如此類處理後)移除Fmoc保護基團。使用諸如Fmoc-Glu-OtBu、Fmoc-D-Glu-OtBu、N10-TFA-Pte-OH及諸如此類等經適當保護之胺基酸結構單元，如反應圖中所闡述，且在步驟(b)中由Fmoc-AA-OH代表。因此，AA係指任何經適當保護之胺基酸起始材料。應瞭解，如本文所使用，術語胺基酸意欲係指任何具有由一或多個碳隔開之胺官能基及羧酸官能基二者之試劑，且包括天然α胺基酸及β胺基酸，以及胺基酸衍生物及該等胺 基酸之類似物。具體而言，具有側鏈之經保護胺基酸(例如經保護絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸及諸如此類)亦可用於本文闡述之葉酸鹽-肽合成中。另外，γ、δ或更長的同源胺基酸亦可經包括作為本文闡述之葉酸鹽-肽合成中之起始材料。另外，具有同源側鏈或替代分支結構之胺基酸類似物(例如正白胺酸、異纈胺酸、β-甲基蘇胺酸、β-甲基半胱胺酸、β,β-二甲基半胱胺酸及諸如此類)亦可經包括作為本文闡述之葉酸鹽-肽合成中之起始材料。
涉及Fmoc-AA-OH之偶合順序(步驟(a)及(b))經實施「n」次以製備固體支持肽(2)，其中n係整數且可等於0至約100。在最後偶合步驟後，移除剩餘Fmoc基團(步驟(a))，並將肽依序偶合至麩胺酸酯衍生物(步驟(c))，進行去保護，並偶合至TFA保護之蝶酸(步驟(d))。隨後，使肽在經三氟乙酸、乙二硫醇及三異丙基矽烷處理後自聚合支持物解離(步驟(e))。該等反應條件使得同時移除可形成經適當保護之胺基酸側鏈之一部分之t-Bu保護基團、t-Boc保護基團及Trt保護基團。在經鹼處理後移除TFA保護基團(步驟(f))，從而得到含葉酸鹽之肽基片段(3)。
LCMS[ESI[M+H]+：1046；部分1H NMR(D2O,300MHz)：δ 8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J=8.4Hz,FA H-12 &16),6.67(d,2H,J=9Hz,FA H-13 &15),4.40-4.75(m系列，5H),4.35(m,2H),4.16(m,1H),3.02(m,2H),2.55-2.95(m系列，8H),2.42(m,2H),2.00-2.30(m,2H),1.55-1.90(m,2H),1.48(m,2H)ppm。
實例。亦可製備含有一或多種D-胺基酸之相應化合物，例如下式之化合物：
LCMS[ESI,[M+H]+1)1046。部分1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：8.6(s),7.5(d),6.6(d),3.8-4.6(m),2.8-3.2(m),2.2-2.8(m),1-2.2(m)
MS(ESI,[M+H]+1)=1046.5。部分1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：8.6(s),7.5(d),6.6(d),3.8-4.6(m),2.8-3.2(m),2.2-2.8(m),1-2.2(m)
MS(ESI,[M+H]+1)=1046.4。部分1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：8.6(s),7.6(d),6.6(d),4-4.6(m),3.4-3.8(m),3-3.15(m),1-2.8(m)
[M+H]+=1047.52。部分1H NMR(D2O)：8.6(s,1H),7.5(d,2H),6.65(d,2H),4.4(dd,2H),4.18(m,4H),2.9(t,2H),2.75(t,2H),2.6-2.15(m,10H),2.1-1.8(m,3H),1.7-1.4(m,3H),1.3(m,3H)。
MS(ESI[M+H]+)：1046。部分1H NMR數據(D2O,300MHz)：δ(ppm)8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J=8.4Hz,FA H-12 &16),6.67(d,2H,J=9Hz,FA H-13 &15)。
MS(ESI,[M+H]+)=1046.7。部分1H-NMR(D2O)δ(ppm)：8.6(s),7.5(d),6.6(d),4.4-4.8(m),4-4.2(m)2.2-3(m),1.8-2.2(m),1.3-1.7(m)
及諸如此類。
實例。微管溶素醯肼之製備。藉由製備EC0347(TubB-H)來說明。在-15℃下經由注射器將N,N-二異丙基乙胺(DIPEA,6.1μL)及氯甲酸異丁基酯(3.0μL)先後添加至微管溶素B(0.15mg)於無水EtOAc(2.0mL)中之溶液中。在-15℃及氬下攪拌45分鐘後，將反應混合物冷卻至-20℃，並向其中添加無水肼(5.0μL)。將反應混合物在氬下在-20℃下攪拌3小時，用1.0mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0,1.0mL)淬滅，並注入至製備型HPLC中用於純化。管柱：Waters XTerra Prep MS C18 10μm,19×250mm；流動相A：1.0mM磷酸鈉緩衝液，pH 7.0；流動相B：乙腈；方法：10%B至80%B，經20分鐘，流速=25mL/min。收集來自15.14-15.54分鐘之流份，並凍乾，從而產生白色固體狀EC0347(2.7mg)。上述方法同樣適用於藉由適當選擇微管溶素起始化合物來製備其他微管溶素醯肼。
實例。偶合試劑EC0311之合成。
在0℃下將DIPEA(0.60mL)添加至HOBt-OCO2-(CH2)2-SS-2-吡啶HCl(685mg,91%)於無水DCM(5.0mL)中之懸浮液中，在氬下攪拌2分鐘，並向其中添加無水肼(0.10mL)。將反應混合物在氬下在0℃下攪拌10分鐘並在室溫下再攪拌30分鐘，過濾，並藉由急驟層析(矽膠，2% MeOH，存於DCM中)純化濾液，從而得到澄清稠油狀EC0311(371mg)，其在靜置時固化。
實例。微管溶素二硫化物之製備(逐步製程)。
針對EC0312來說明。在-15℃下藉由注射器將DIPEA(36μL)及氯甲酸異丁基酯(13μL)先後添加至微管溶素B(82mg)於無水EtOAc(2.0mL)中之溶液中。在-15℃及氬下攪拌45分鐘後，向反應混合物中添加EC0311於無水EtOAc(1.0mL)中之溶液。將所得溶液在氬下在-15℃下攪拌15分鐘並在室溫下再攪拌45分鐘，濃縮，並藉由急驟層析(矽膠，2%至8% MeOH，存於DCM中)純化殘餘物，從而得到白色固體狀EC0312(98mg)。上述方法同樣適用於藉由適當選擇微管溶素起始化合物來製備其他微管溶素衍生物。
實例。
向多柔比星(100mg,0.184mmol)及2-[苯并三唑-1-基-(氧基羰基 氧基)-乙基二硫基]-吡啶(77.8mg,0.184mmol)於DCM(4ml)中之溶液中添加DIPEA(0.064ml,0.368mmol.)。將反應物攪拌2小時。TLC(10% MeOH，存於DCM中)指示反應完全。在減壓下移除DCM並在SiO2管柱(10% MeOH，存於DCM中)上純化，從而得到純產物(90mg,65%)。LCMS(ESI)：針對C35H36N2O13S2計算，(M+H)+ 757.17；觀測值757.30，1H NMR(300MHz,CDCl3/CD3OD)：δ 8.44(br s,1H),8.00(d,1H),7.65-7.82(m,3H),7.38(d,1H),7.18(br s,1H),5.45(s,1H),5.25(s,3H),4.70(m,2H),4.3(m,1H),4.22-3.90(m,2H),3.75(s,1H),3.62(s,1H),3.35-2.90(m,2H),2.45-2.10(m,2H),1.85(m,5H),1.32(d,3H)。
實例。微管溶素B吡啶基二硫化物。
類似地，此化合物係如本文所闡述來製備。
實例。D-EC0488。
此化合物係藉由SPPS根據本文闡述之一般肽合成程序自H-Cys(4-甲氧基三苯甲基)-2-氯三苯甲基-樹脂起始及以下SPPS試劑來製備：
偶合步驟。在肽合成容器中，添加樹脂，添加胺基酸溶液、DIPEA及PyBOP。使氬鼓泡1hr並用DMF及IPA洗滌3次。使用20%存於DMF中之六氫吡啶進行3次(10min)Fmoc去保護，之後進行每一胺基酸偶合。繼續完成所有9個偶合步驟。在結束時，用2%存於DMF中之肼將樹脂處理3次(5min)以使蝶酸上之TFA保護基團解離，用DMF(3×)、IPA(3×)、MeOH(3×)洗滌樹脂，並用氬將樹脂鼓泡30min。
解離步驟。試劑：92.5% TFA、2.5% H2O、2.5%三異丙基矽烷、2.5%乙二硫醇。在氬鼓泡下用解離試劑將樹脂處理3次(10min、5min、5min)，排乾，用解離試劑將樹脂洗滌一次，併合併溶液。進行旋轉蒸發直至剩餘5ml為止，並在乙醚(35mL)中沈澱。離心，用乙醚洗滌，並乾燥。藉由HPLC純化約一半粗製固體(約100mg)。
HPLC純化步驟。管柱：Waters Xterra Prep MS C18 10μm 19×250mm；溶劑A：10mM乙酸銨，pH 5；溶劑B：ACN；方法：5min 0% B至25min 20% B，26mL/min。收集含產物流份，並冷凍乾燥，從而得到43mg EC0488(51%產率)。1H NMR及LC/MS(準確質量1678.62)與產物一致。
實例。
MS(ESI,[M+H]+)=1681。部分1H NMR(D2O)：8.96(s),7.65(d),6.81(d),4.66(s),4.40-4.15(m),3.90-3.54(m),3.50-3.18(m),2.97-2.90(m),2.51-1.80(m)。
實例。含二硫化物之微管溶素共軛物之一般合成。
用某些天然微管溶素之吡啶基二硫化物衍生物來說明，其中R1係H或OH，且R10係烷基或烯基。將含有硫醇基團之結合配體-連接體中間體溶於去離子水(約20mg/mL，使用前用氬鼓泡10分鐘)中，並藉由飽和NaHCO3(使用前用氬鼓泡10分鐘)將懸浮液之pH調整至約6.9(懸 浮液在pH增加時可變成溶液)。若需要，將另一去離子水(約20-25%)添加至溶液中，並向水溶液中立即添加EC0312於THF中之溶液(約20mg/mL)。反應混合物迅速變得均質。在氬下攪拌(例如)45分鐘後，用2.0mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0，約150體積%)稀釋反應混合物，並藉由抽真空移除THF。過濾所得懸浮液，並可藉由製備型HPLC純化濾液(如本文所闡述)。凍乾流份以分離共軛物。上述方法同樣適用於藉由適當選擇微管溶素起始化合物來製備其他微管溶素共軛物。
實例。製備共軛物之一般方法2(一罐式)。
借助EC1456之製備來說明。在-15℃下借助注射器將DIPEA(7.8μL)及氯甲酸異丁基酯(3.1μL)先後添加至微管溶素A(18mg)於無水EtOAc(0.50mL)中之溶液中。在-15℃及氬下攪拌35分鐘後，向反應混合物中添加EC0311(5.8mg)於無水EtOAc(0.50mL)中之溶液。移除冷卻，並將反應混合物在氬下再攪拌45分鐘，濃縮，真空化，並將殘餘物溶解於THF(2.0mL)中。同時，將D-EC0488(40mg)溶解於去離子水(使用前用氬鼓泡10分鐘)中，並藉由飽和NaHCO3將水溶液之pH調整至6.9。將另一去離子水添加至D-EC0488溶液中，從而得到2.0mL之總體積，並向其中立即添加含有活化微管溶素之THF溶液。將迅速變得均質之反應混合物在氬下攪拌50分鐘，並用2.0mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0,15mL)淬滅。過濾所得渾濁溶液，並將濾液注入至製備型HPLC中用於純化。管柱：Waters XTerra Prep MS C18 10μm,19×250mm；流動相A：2.0mM磷酸鈉緩衝液，pH 7.0；流動相B：乙 腈；方法：1%B 5分鐘，然後經接下來30分鐘1%B至60%B，流速=26mL/min。收集來自20.75-24.50分鐘之流份，並凍乾，從而得到淺黃色蓬鬆固體狀EC1456(26mg)。上述方法同樣適用於藉由適當選擇微管溶素或其他藥物起始化合物來製備其他微管溶素及其他共軛物。
實例。EC1663及EC1664 以下其他化合物可使用本文闡述之方法及製程來製備：
實例。EC1426係根據以下製程來製備。
實例 EC1456係根據以下製程來製備。
實例。N10-TFA保護之EC1454係根據以下製程來製備。
實例。EC1454係根據以下製程來製備。
MS(ESI,[M+2H]2+)=840.90,[M+H]+=1681.3。部分1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：8.6(s),7.6(d),6.6(d),4.45(s),4.35(t),4.15-4.3(m),3.3-3.6(m),3.25(m),3.0(m),2.7-2.9(m),2-2.3(m),1.6-2(m)。
EC1415
[M+H]+=1709.69,[M+2H]2+=855.22。部分1H NMR(D2O,300MHz)δ(ppm)：8.6(s,1H),7.45(d,2H),6.5(d,2H),4.5(s,2H),4.3-4.1(m,6H),3.95(t,1H),3.8-3.4(m,19H),3.4-2.95(m,7H),2.4-1.7(m,26H),1.6(m,1H),1.25(s,2H),1.05(s,3H)。
實例。EC1004係根據以下製程來製備。
向配備有磁性攪拌棒及溫度探針之圓底燒瓶中添加二肽EC1458、咪唑及二氯甲烷。在所有固體皆已溶解後，使用冰浴冷卻溶液。逐滴添加氯三乙基矽烷(TESCl)，並移除冰浴。監測反應之完成。若需要，添加第二部分氯三乙基矽烷及/或咪唑。藉由過濾移除咪唑HCl鹽，並添加二氯甲烷。用飽和氯化鈉溶液(鹽水)洗滌有機層，用二氯甲烷將水層反萃取一次，並用鹽水洗滌合併之有機層。將有機層經硫酸鈉乾燥並在旋轉蒸發器上濃縮。將殘餘物溶解於四氫呋喃(THF)中並冷卻至大約-45℃。逐滴添加雙(三甲基矽烷基)醯胺鉀(KHMDS)於甲苯中之溶液。在攪拌下，添加丁酸氯甲酯，並監測反應。用甲醇且然後用乙酸乙酯淬滅反應，並添加鹽水。棄去水層，並用鹽水將有機層洗滌一次。在旋轉蒸發器上濃縮有機層，並使油狀殘餘物通過短的矽膠塞。用乙酸乙酯於石油醚中之20%溶液洗滌該塞。在旋轉蒸發器上濃縮合併之有機層直至停止蒸餾為止。藉由LC及NMR分析粗製EC1004油，並將其儲存於冷凍器中直至使用。
實例。EC1005係根據以下製程來製備。
向適當大小的氫化燒瓶中放置R-2-六氫吡啶甲酸甲酯(R-N-methyl pipecolinate,MEP)、五氟苯酚、N-甲基吡咯啶酮(NMP)及乙基 二甲基胺基丙基碳化二亞胺(EDC)。將混合物攪拌至少16h。將EC1004溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP)中，並添加10wt% Pd/C。在氫壓力下攪拌/振盪反應混合物直至反應完全(藉由LC分析)為止。藉由經由矽藻土過濾來移除Pd/C。用乙酸乙酯洗滌矽藻土，並用1%碳酸氫鈉/10%氯化鈉溶液將合併之有機層洗滌三次。將有機層經硫酸鈉乾燥，並在旋轉蒸發器上濃縮。將殘餘物溶解於DCM中，並藉由矽膠層析使用乙酸乙酯及石油醚作為洗脫劑來純化。收集流份，檢查純度，合併並在旋轉蒸發器上乾燥。藉由LC分析EC1005油並將其儲存於冷凍器中直至使用。
實例。EC1008係根據以下製程來製備。
將EC1005溶解於1,2-二氯乙烷(DCE)中，並添加三甲基氫氧化錫。加熱反應混合物，並藉由LC監測反應。在完成後，用冰浴冷卻混合物並過濾。然後，用DCE洗滌固體。用水將有機層洗滌一次且經硫酸鈉乾燥。在旋轉蒸發器上濃縮溶液，並將殘餘物溶解於四氫呋喃(THF)中。添加三乙胺三氟化氫，並攪拌混合物同時利用LC監測。添加吡啶、二甲基胺基吡啶(DMAP)及乙酸酐。攪拌反應物並藉由LC監測。將反應混合物濃縮成殘餘物，並藉由C18管柱層析利用乙腈及水作為洗脫劑來純化產物。收集產物流份，濃縮，並凍乾，從而得到白色至灰白色粉末。
實例。EC1426係根據以下製程來製備。
將EC1422溶解於四氫呋喃(THF)中，並添加六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶鏻(PyBop)及二異丙基乙胺(DIPEA)。在所有固體皆溶解後，添加肼並攪拌反應物並監測完成。添加EC0607，並攪拌混合物並藉由LC監測完成。添加乙酸乙酯，並用飽和氯化銨將有機層洗滌一次，用飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，並用飽和氯化鈉洗滌一次。將有機層經硫酸鈉乾燥，並在旋轉蒸發器上濃縮。藉由二氧化矽管柱層析利用二氯甲烷及甲醇作為洗脫劑來純化粗製EC1426。收集流份，並在旋轉蒸發器上濃縮合併之產物流份，從而得到黃色固體。
實例。EC1428係根據以下製程來製備。
將EC1008溶解於二氯甲烷中，並連同N-環己基碳化二亞胺、N’-甲基聚苯乙烯(DCC-樹脂)一起添加溶解於DCM中之五氟苯酚。攪拌混合物，並藉由LC監測反應之完成。過濾混合物以移除樹脂，並在旋轉蒸發器上濃縮有機層，從而得到活化EC1008。在單獨燒瓶中，將EC1426溶解於二氯甲烷中，並添加三氟乙酸。攪拌反應混合物，並藉由LC監測完成。在旋轉蒸發器上濃縮反應混合物，從而得到去保護之EC1426。將活化EC1008溶解於DMF中，並添加二異丙基乙胺(DIPEA)。將去保護之EC1426溶解於DMF中並添加至反應混合物中。攪拌反應物並藉由LC監測完成。添加乙酸乙酯，並利用飽和氯化鈉 水溶液將有機層洗滌三次。將有機層經硫酸鈉乾燥，並藉由旋轉蒸發移除揮發物。藉由二氧化矽管柱層析使用二氯甲烷及甲醇作為洗脫劑來純化粗製EC1428。收集流份，檢查純度，並藉由旋轉蒸發濃縮合併之產物流份，從而得到黃色固體。將EC1428儲存冷凍器中。
實例。其他微管溶素及微管溶素中間體可根據闡述於WO 2012/019123、WO 2009/055562、PCT國際申請案第US2013/034672號及美國臨時申請案第61/793082號中之製程來製備，該等案件中之每一者之揭示內容皆以全文引用方式併入本文中。
實例。說明性微管溶素如下：
實例。EC1454係根據以下製程來製備。
N10-TFA保護之EC1454之固相合成以樹脂結合之三苯甲基保護之D-半胱胺酸起始。將樹脂懸浮於二甲基甲醯胺(DMF)中，並用DMF洗滌兩次。將EC0475(還原葡糖胺改質之L-麩胺酸)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶鏻(PyBOP)及二異丙基乙胺(DIPEA)添加至反應混合物中。在至少1小時後，實施凱澤測試(Kaiser test)以確保偶合完成。將樹脂用DMF洗滌三次，用IPA洗滌三次且用DMF洗滌三次。將樹脂用存於DMF中之六氫吡啶緩慢洗滌三次，用DMF緩慢洗滌三次冰用IPA緩慢洗滌三次。實施凱澤測試來證實去保護。用DMF將樹脂洗滌三次，並遵循相同製程偶合序列中之下一個胺基酸。以下列順序偶合單體：1)EC0475、2)Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH、3)EC0475、4)Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH、5)EC0475、6)Fmoc-D-Glu-OtBu及7)N10-TFA-Pte-OH。
在完成最後偶合後，用甲醇將樹脂洗滌三次，並藉由在室溫下使氬通過樹脂進行乾燥。將經乾燥樹脂懸浮於TFA、水、乙二硫醇及三異丙基矽烷之混合物中。在1小時後，藉由過濾移除樹脂，並用TFA洗滌。藉由將產物添加至冷乙醚中使其沈澱，過濾，並用醚洗滌。在真空及室溫下乾燥固體，並將其儲存於冷凍器中。
將N10-TFA EC1454溶解於噴有氬之水中。添加碳酸鈉(1M，存於水中，噴有氬)來達成9.4-10.1之pH。將反應混合物攪拌至少20分鐘。在反應完全後，如藉由LC所測定，藉由用2M HCl將pH調整至1.9-2.3來淬滅該反應。藉由C18管柱層析使用乙腈及pH 5之乙酸銨緩衝液作為洗脫劑來純化產物。收集流份並藉由HPLC檢查純度。在旋轉蒸發器上濃縮合併之產物流份且然後凍乾，從而得到黃色固體狀EC1454。MS(ESI,[M+2H]2+)=840.90，[M+H1]+=1681.3。所選1H-NMR(DMSO,300MHz)δ(ppm)：8.6(s),7.6(d),6.6(d),4.45(s),4.35(t),4.15-4.3(m),3.3-3.6(m),3.25(m),3.0(m),2.7-2.9(m),2-2.3(m),1.6-2(m)。將產物儲存於-20℃下。
實例。EC1456係根據以下製程來製備。
將EC1428溶解於乙腈中，並添加EC1454於pH 7.4之磷酸鈉緩衝液中之溶液。在添加之前及之後用氬噴灑溶液。將反應混合物攪拌至少15分鐘且然後檢查完成。藉由C18管柱層析使用乙腈及pH 7.4之磷酸鹽緩衝液作為洗脫劑來純化期望之產物。收集產物流份，檢查純度，合併並藉由超過濾濃縮，從而得到為10-20mg/mL EC1456之水溶液。取最終產物溶液之試樣來分析，且然後將其儲存於冷凍器中。
在高解析Waters Acquity UPLC Xevo Gs-S QTOF質譜分光計上獲得EC1456之正性電噴射質譜。在UPLC進樣系統上在分離主要組份後獲得光譜，解析力為大約35,000。對於式C110H166N23O45S3之離子，M+H單同位素峰之精確質量經量測為2625.0598，其與理論值2625.0570之誤差差值為1.1ppm。同位素分佈亦與該式一致。
EC1456之ES+光譜之質譜特徵
將約30mg EC1456之試樣溶解於665μL氘化二甲基亞碸與氘化水之9：1混合物中。在安裝有含有寬帶及質子觀察線圈二者之2通道探針之Agilent模型DD2分光計上在500MHz下在26度下獲得1H NMR光譜。在相同儀器上在相同條件下在125MHz下獲得13C NMR光譜。所有光譜皆參照2.5ppm(1H)及39.50ppm(13C)下之DMSO溶劑殘留信號。
所有光譜特徵皆針對下表中之兩種NMR光譜(1H及13C)使用下圖中之原子編號來指派，其中*符號指示二硫化物鍵之連接。
指派係基於1D及2D NMR實驗二者來達成，包括藉助鍵H-H連接性使用COSY及TCSY 2D實驗，藉助空間H-H接近性使用2D NOESY，使用1D DEPT實驗進行碳多重性量測且藉助鍵C-H連接性使用檢測質子之2D實驗HSQC及HMBC。在1D光譜中重疊(不同質子或碳在相同化學位移下共振)之大多數情形下，可在2D光譜中解析，在該等情形下，該等表反映自2D光譜量測但對同時共振物質之群之積分求和之化學位移。在1D重疊(例如幾乎相同的麩胺酸及還原葡糖胺亞單元)之一些情形下，在2D相關光譜中亦存在重疊，此使得不可能在多個原子序數之間明確指派單一共振或多重共振，在該等情形下，在單一表列中存在化學位移及/或原子序數指派之多個項目。
NH及OH質子交換為D2O氘原子且通常不存在於光譜中，5-10ppm區域中之弱寬峰除外。光譜中未列示於表中之1H峰包括3.75ppm下之寬HOD峰及2.50ppm下之DMSO峰。HOD峰不遮蔽任何共振，但由於寬基線上升而提高4.2ppm及3.4-3.7ppm下之近共振之積分。DMSO峰遮蔽H129之共振，其出於此原因不可積分。光譜中未列示於表中之13C峰包括39.50ppm下之極大DMSO溶劑。DMSO峰遮蔽來自C91及C93二者之信號。C116峰由於近醯胺基團周圍組態改變引起的廣泛增寬而不可在13C光譜中觀察到。所有三個化學位移(C91、C93、C116)皆可在檢測質子之2D相關光譜中看到並量測到。
EC1456之質子NMR指派
EC1456之碳NMR指派
在配備有Ever-Glo中/遠IR源、擴展範圍的溴化鉀(KBr)分束器及氘化硫酸三甘肽(DTGS)檢測器之Nexus 6700®傅裏葉轉換紅外(Fourier transform infrared，FT-IR)分光光度計(Thermo Nicolet)上獲取EC1456之IR光譜。使用具有鍺(Ge)晶體之衰減全反射(ATR)附件 (ThunderdomeTM,Thermo Spectra-Tech)獲取數據。光譜代表在4cm-1之光譜解析率下收集之256次共加和掃描(co-added scan)。利用清潔Ge晶體獲取背景數據集。藉由將該兩個數據集彼此相比來獲取Log1/R(R=反射比)光譜。使用聚苯乙烯校準波長。
EC1456參考物質之紅外波段指派
在Perkin-Elmer Lambda 25UV/V之分光計上獲取EC1456之紫外光譜。在25度下在1cm光程長樣品池上記錄40.7uM存於0.1M NaOH溶劑中者下之光譜。366nm、288nm及243nm下之局部最大值主要分別取決於蝶酸、苯甲醯胺/苯酚及噻唑-醯胺之次結構，但該分子含有數個發色團且在UV區域中具有重疊吸收。
實例。N10-TFA保護之EC1579係根據以下製程來製備。
實例。EC1579係根據以下製程來製備。
EC1579 MS(ESI,[M+2H]2+)=840.89(M+1H)1+=1681.0。部分1H-NMR(D2O)δ(ppm)：8.6(s),7.5(d),6.65(d),4.4-4.8(m),4-4.2(m),3.4-3.8(m)3-3.3(m)2.75(s),1.6-2.4(m)。
EC0948係藉由本文闡述之製程來製備。
EC0848
MS(ESI,[M+2H]2+)=840.8。[M+H]+=1681.1。所選1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：s,8.6；d,7.6；d,6.6；s,4.45；m,4-4.2；m,3.3-3.8；m,3.1-3.3；m,3-3.1；m,2.7-2.9；m,1.7-2.3；s,1.15
實例。EC1669係根據本文闡述之製程自EC1579及EC0469如下來製備：
將EC1579(200mg,1.0當量)溶解於去氧(氬鼓泡)20mM PO4(pH=7)緩衝液(4.0mL)中並在室溫及氬鼓泡下逐滴添加至EC0469(80mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(4.0mL)中之攪拌溶液中。在30min後，在0-30%乙腈/50mM pH7 NH4HCO3緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1669(132mg)並凍乾(49%產率)。化學式：C87H122N26O40S2；準確質量：2234.78；MW 2236.18。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1118.39，觀測值1119.52
部分1H NMR(DMSO w/10% D2O)δ(ppm)8.67(s),8.59(2),7.61(d),7.56(d),6.71(d),6.61(d),3.34-3.39(m)’
實例。以下其他化合物經闡述且係根據本文闡述之一般製程來製備。
EC1456
EC1586
EC1739(C113H173N23O44S3；MW 2653.91)
將EC1454(8.5mg,1.5當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM pH7磷酸鹽緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC1717(3.8mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(2.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/50mM pH7 NH4HCO3緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1739(5.3mg,59%)並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)=1327.06，觀測值1327.73
EC1664(C111H169N23O44S3；分子量2625.85)
將EC1454(5.5mg,1.0當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM pH7磷酸鹽緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC1662(3.6mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(2.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/50mM pH7 NH4HCO3緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1664(4.6mg,54%)並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1313.05，觀測值1313.37。部分1H NMR(DMSO w/10% D2O,300 MHz)δ(ppm)8.61(s),8.15(s),7.58(d),6.94(d),6.60(m),5.78(d),5.22(d),4.47(m),4.09-4.33(m),0.99(d),0.93(d),0.76(t),0.71(t),0.61(d)。
EC1663(化學式：C110H167N23O44S3；MW 2611.83)
將EC1454(16.1mg,1.2當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM pH7磷酸酯緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC1661(8.7mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(2.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/50mM pH7 NH4HCO3緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1663(15.8mg,76%) 並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1306.04，觀測值1306.82。
EC1416(C112H169N23O45S3；MW 2653.87)
將EC1415(20mg)溶解於pH7磷酸鹽(pH 7.75，經氬吹掃)中。向此溶液中添加EC0312(14mg)於等體積MeOH中之懸浮液。將反應混合物在環境溫度下在氬下攪拌45min，且然後裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(18mg)。MS(ESI,[M+2H]2+)1328,1H NMR(DMSO-d6,D2O,300MHz)：8.6(s,1H),8.15(s,1H),7.85(bd,1H),7.55(d,2H),6.95(d,2H),6.6(m,4H),6.2(d,1H),5.68(d,1H),5.2(d,1H),4.5(bs,3H),4.5-4.3(m,4H),4.3-4.0(m,10H),3.5-3.3(m,13H),3.2(bd,5H),3.1-2.8(m,8H),2.75(bs,5H),2.6-1.6(m,50H),1.4(m,9H),1.2(m,9H),1.0(dd,9H),0.7(m,11H),0.6(d,3H)。
EC1299(C85H118N22O28S3；MW 1992.18)
將EC0259(35mg)於20mM pH7磷酸鹽緩衝液(3.0mL)中之溶液及飽和NaHCO3溶液(1.5mL)先後添加至EC0312(39mg)於MeOH(5.5mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(25mg)。 MS(ESI,[M+H]+)1993。
EC1549(C85H118N22O28S3；MW 1992.17)
將EC0259(35mg)於20mM pH7磷酸鹽緩衝液(3.0mL)中之溶液及飽和NaHCO3溶液(1.5mL)先後添加至EC0312(39mg)於MeOH(5.5mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(25mg)。 MS(ESI,[M+H]+)1993。
EC1548(C85H118N22O28S3；MW 1992.17)
將EC1544(55.1mg)於20mM pH7磷酸鹽緩衝液(1.95mL)中之溶液及飽和NaHCO3溶液(0.30mL)先後添加至EC1248(58.0mg)於MeOH(2.30mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(61.5mg)。MS(ESI,[M+H]+)1993。
EC1393(C87H122N22O28S3；MW 2020.23)
用飽和NaHCO3溶液將EC1392(20mg)於40mM pH7磷酸鹽緩衝液中之溶液之pH調整至8。向該溶液中添加EC0312(20mg)於等體積MeOH中之懸浮液。將反應混合物在環境溫度下在氬下攪拌30min，且然後裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(15mg)。MS(ESI,[M+2H]2+)1011.39。1H NMR(DMSO-d6,D2O,300MHz)：8.6(s,1H),8.15(s,1H),7.85(bd,1H),7.55(d,2H),6.95(d,2H),6.6(m,4H),6.2(d,1H),5.68(d,1H),5.2(d,1H),4.6(t,1H),4.5(m,3H),4.5-4.0(m,11H),3.2-2.8(m,6H),2.8-2.5(m,8H),2.4(m,5H),2.2-2.0(m,14H),2.0-1.7(m,7H),1.6-1.3(m,13H),1.25(d,8H),1.1-0.95(dd,8H),0.75(m,10H),0.6(d,2H)。
本文所闡述之化合物亦可藉由以下兩種方法來製備：方法A：在氬吹掃下藉由將NaHCO3溶液溶液之pH調整至pH=7來將葉酸間隔基溶解於水中。然後，添加存於有機溶劑(MeOH、ACN、THF或DMSO)中之深脫硫劑。在室溫下在氬吹掃下攪拌反應混合物。藉由分析HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0；B=ACN)監測反應之進程。在反應完全後，蒸發有機溶劑，且然後藉由prep-HPLC利用C18管柱(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液或2mM磷酸鹽緩衝液，pH=7.0；B=ACN)來純化所得溶液。
方法B：將葉酸間隔基溶解於水中，並利用酸(AcOH或稀HCl)將pH調整至2。將所得經pH調整之間隔基凍乾，且然後再溶解於DMSO中。用氬吹掃反應混合物，並添加10莫耳當量Et3N(或DIPEA)。向此溶液中添加存於有機溶劑(DMSO、THF、ACN等)中之深脫硫劑。藉由HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液或2mM磷酸鹽緩衝液，pH=7.0。B=ACN)監測反應之進程。在反應完全後，藉由prep-HPLC利用C18管柱(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液或2mM磷酸鹽緩衝液，pH=7.0；B=ACN)純化反應混合物。
本文闡述其他說明性連接體中間體(亦稱作葉酸鹽間隔基)：
EC0014
1H NMR(D2O,500MHz)δ(ppm)8.73(s,1H,FA H-7),7.56(d,2H,FA H-12&H16),6.73(d,2H,FA H-13&H15),4.45(m,2H),4.1(m,2H),3.61(d,2H),2.82(m,3H),2.74(dd,1H),2.37(m,2H),2.18(m,1H), 2.09(m,3H),1.74(m,1H)
EC0020
MS(ESI,[M+H]+)746。1H NMR(D2O,500MHz)δ(ppm)8.76(s,1H,FA H-7),7.68(d,2H,FA H-12&H16),6.8(d,2H,FA H-13&H15),4.71(dd,1H,Asp H-2),4.64(s,2H FA H-9),4.41(dd,1H,D-Glu H-2),4.3(dd,1H,Cys H-2),4.1(dd,Dpr H-2),3.72(dd,1H,Dpr H-3A),3.52(dd,1H,Dpr H-3B),2.89(dd,1H,Cys H-3A),2.85(dd,1H,Cys H-3B),2.81(dd,1H,Asp H-3A),2.62(dd,1H,Asp H-3B),2.44(dd,2H,D-Glu H-4),2.27(m,1H,D-Glu H-3A),2.08(m,1H,D-Glu H-3B)。13C NMR(DMSO-d6+D2O,75MHz)：δ174.78,174.42,172.68(2C),170.45,168.25,167.08,162.24,156.24,154.38,151.24,149.41(2C),129.52,128.14,121.74,111.98,55.76,53.02(2C),52.77,50.89,46.16,36.61,32.26,27.32,26.60
EC0028
EC0048
EC0049
MS(ESI,[M+H]+)795。
EC0053
MS(ESI,[M+H]+)746
EC0055
EC0059
MS(ESI,[M+H]+)816
EC0066
MS(ESI,[M+H]+)1317
EC0067
MS(ESI,[M+H]+)699
EC0073
N10-TFA-EC073 MS(ESI,[M+H]+)1183。
EC0075
MS(ESI,[M+H]+)931
EC0076
MS(ESI,[M+H]+)731
EC0149
[M+H]+=631。1H NMR(D2O)：8.55(s,1H),7.5(d,2H),6.61(d,2H),4.42(s,2H),4.35(dd,1H),4.25(m,2H),4.1(s,1H),3.68(m,1H),3.5(m,1H),3.35-3.2(m,3H),3.1(dd,1H),2.4-2.1(m,3H),2.1-1.9(m,4H)。
EC0150
MS(ESI,[M+H]+)631。所選1H NMR(D2O)δ(ppm)8.42(s,1H,FA H-7),7.50(d,2H,FA H-12&16),6.65(d,2H,FA H-13&15),4.42(s,2H),4.3-4.1(m,2H),4.0-3.85(m,1H),3.35-3.30(m,1H),3.30-3.10(m,2H),3.10-2.90(m,2H),2.80-2.70(m,1H),2.65-2.50(m,2H),2.30-2.10(m,3H),2.10-1.85(m,2H),1.95-1.80(m,2H)。
EC0151
MS(ESI,[M+H]+)630。所選1H NMR(D2O)δ(ppm)8.42(s,1H,FA H-7),7.50(d,2H,FA H-12&16),6.65(d,2H,FA H-13&15),4.42(s,2H),4.3-4.1(m,2H),4.0-3.85(m,1H),3.35-3.30(m,1H),3.30-3.10(m,2H),3.10-2.90(m,2H),2.80-2.70(m,1H),2.65-2.50(m,2H),2.30-2.10(m,3H),2.10-1.85(m,2H),1.95-1.80(m,2H)。
EC0232
MS(ESI,[M+H]+)774。1H NMR(D2O)：8.56(s),7.50(d),6.65(d),4.48-4.41(m),4.21(dd),4.08(dd),3.48-3.42(m),3.28-3.09(m),2.61-2.35(m),2.28-2.18(m),2.16-2.02(m),1.97-1.62(m)。
EC0252
[M+H]+=1046.83。1H NMR(D2O)：8.58(s,1H),7.5(d,2H),6.6(d,2H),3.05-2.6(m,5H),2.3-1.9(m,4H),1.8-1.2(m,7H)。
EC0259
[M+H]+=1047.52。1H NMR(D2O)：8.6(s,1H),7.5(d,2H),6.65(d,2H),4.4(dd,2H),4.18(m,4H),2.9(t,2H),2.75(t,2H),2.6-2.15 (m,10H),2.1-1.8(m,3H),1.7-1.4(m,3H),1.3(m,3H)。
EC1213
LCMS(ESI[M+H]+)：1046。所選1H NMR數據(D2O,300MHz)：δ 8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J=8.4Hz,FA H-12 &16),6.67(d,2H,J=9Hz,FA H-13 &15)。
EC1214
LCMS(ESI[M+H]+)：1046。所選1H NMR數據(D2O,300MHz)：δ 8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J=8.4Hz,FA H-12 &16),6.67(d,2H,J=9Hz,FA H-13 &15)。
EC1215
LCMS(ESI[M+H]+)：1046。所選1H NMR數據(D2O,300MHz)：δ 8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J=8.4Hz,FA H-12 &16),6.67(d,2H,J=9Hz,FA H-13 &15)。
EC1216
LCMS(ESI[M+H]+)：1046
所選1H NMR數據(D2O,300MHz)：δ 8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J=8.4Hz,FA H-12 &16),6.67(d,2H,J=9Hz,FA H-13 &15)。
EC1217
LCMS(ESI[M+H]+)：1046。所選1H NMR數據(D2O,300MHz)：δ 8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J=8.4Hz,FA H-12 &16),6.67(d,2H,J=9Hz,FA H-13 &15)。
EC1392
[M+H]+=1074.85。1H NMR(D2O,300MHz)δ(ppm)：8.55(s,1H),7.45(d,2H),6.5(d,2H),4.6(m,2H),4.45(t,1H),4.35(bs,2H),4.2(m,1H),4.1(s,1H),4.05(m,1H),2.9(t,2H),2.75-2.4(m,6H),2.3(m,2H),2.2-1.9(m,2H),1.8-1.4(m,2H),1.2(m,2H),1.3(s,3H),1.2(s,3H)。
EC1347
MS(ESI,[M+H]+)=701.57。所選1H-NMR(DMSO,300MHz)δ(ppm)：8.65(s),7.6(d),6.6(d),4.2-4.6(m),2.6-3.2(m),1.8-2.6(m),1.1-1.7(m)
EC0589
MS(ESI,[M+H]+)746。所選1H NMR(DMSO-d6+D2O,300MHz)：δ 8.46(s,1H),7.45(d,J=8.4Hz,2H),6.47(d,J=8.4Hz,2H), 4.39(t,J=6.6Hz,1H)。
EC0819
MS(ESI,[M+H]+)=1046.4。所選1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：8.6(s),7.6(d),6.6(d),4-4.6(m),3.4-3.8(m),3-3.15(m),1-2.8(m)。
EC0823
MS(ESI,[M+H]+)=672.3。所選1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：8.8(s),7.6(d),6.6(d),4.4-4.6(m),4.2-4.4(m),3.4-3.8(m),1.8-2.8(m),1.15(s)。
EC0835
MS(ESI,[M+H]+)=1046.5。所選1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：8.6(s),7.5(d),6.6(d),3.8-4.6(m),2.8-3.2(m),2.2-2.8(m),1-2.2(m)。
EC0923
MS(ESI,[M+H]+)=672.3。所選1H-NMR(D2O)δ(ppm)：8.8(s),7.75(d),6.85(d),4.4-5(m),2.6-2.9(m),2.4-2.6(m),2-2.6(m)。
EC0879
MS(ESI,[M+H]+)=442.3。所選1H-NMR(DMSO)δ(ppm)：8.7(s), 7.6(d),6.6(d),4.55(s),4.3(m),2.2-2.6(m),1.8-2.2(m),1-1.2(m)。
EC0306
[M+H]+=1100.51。1H NMR(D2O)：δ 8.75(s,1H),7.6(d,2H),6.75(d,2H),4.7-4.5(m,5H),4.38(m,2H),4.2(m,2H),4.1(d,1H),3.85-3.5(m,10H),2.95-2.6(m,4H),2.45(m,2H),2.3-2.0(m,2H)。
EC0368
[M+H]+=2175.5。1H NMR(D2O)：8.6(s,1H),7.5(d,2H),6.6(d,2H),4.45(bs,3H),4.35-4.2(m,4H),4.05(t,1H),3.6-3.35(bs, 114H),3.2(s,6H),2.77(t,2H),2.65(dd,1H),2.55-2.45(m,3H),2.4-2.2(m,6H),2.1-1.8(m,2H)。
EC0373
[M+H]+=1346.0。1H NMR(D2O)：8.55(s,1H),7.5(d,2H),6.6(d,2H),4.4(s,2H),4.25(m,2H),4.05(t,1H),3.7(dd,1H),3.6-3.3(m,50H),3.25(dd,3H),3.05(dd,3H),2.8(t,2H),2.7(dd,2H),2.6(dd,1H),2.4(t,2H),2.2-1.9(m,4H)。
EC0536
[M+2H]2+=941.2。1H NMR(D2O)：8.55(s,1H),7.5(d,2H),6.6(d,2H),4.4(s,2H),4.25(m,2H),4.1(m,5H),3.85(t,1H),3.8-3.4(m,21H),3.4-2.95(m,7H),2.8(s,2H),2.7-2.4(ddd,2H),2.4-1.7(m,22H), 1.55(m,1H)。
本文闡述其他說明性化合物及用於製備該等化合物之製程：EC1579之共軛物
EC1840
EC1833
EC1828
EC1824
EC1823
將EC1579(經酸化，13.0mg,0.0077mmole)於DMSO(0.4mL)中之溶液及12μL DIPEA(0.070mmole,13.5當量)先後添加至EC1822(5.6mg,0.0052mmole)於DMSO(0.2mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(12.4mg)。所選1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm)8.62(s,1H),8.20(s,1H),7.60(d,2H),7.56(d),6.93(d,2H),6.61(m,3H),5.25(d,1H),4.51(d,1H),4.50-4.40(m,3H),4.32-4.10(m,10H),3.65-3,50(m,10H),3.40-3.30(m,10H),3.30-3.10(m,7H),3.10-2.95(m,3H),2.95-2.80(m,3H),2.75-2.60(br,3H),2.40-2.00(m,14H),2.0-1.3(m,24H),1.30-1.05(m,6H),0.99(d,3H),0.88(d,3H),0.86(d,3H),0.79(t,6H),0.73(t,3H),0.64(br,3H)
EC1818
EC1756
EC1746之合成
將EC1579(30.9mg)於20mM pH7磷酸鹽緩衝液(4.2mL)中之溶液及飽和NaHCO3溶液(0.30mL)先後添加至EC1662(16.9mg)於MeOH(4.8mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到蓬鬆黃色固體狀 產物(33.1mg)。MS(ESI,M+H)=2627。EC1746 1H NMR(D2O)：8.66(s),8.10(s),7.62(b),6.99(b),6.69(b),5.81(b),5.18(b),4.60-4.18(m),3.91-0.57(m)。
EC1669之合成
將EC1579(200mg,1.0當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7緩衝液(4.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至粗製EC0469(80mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(4.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在0-30%乙腈/50mM NH4HCO3 pH7緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1669(132mg,49%)並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1118.39，觀測值1119.52。部分1H NMR(DMSO w/10% D2O)d(ppm)8.67(s),8.59(2),7.61(d),7.56(d),6.71(d),6.61(d),3.34-3.39(m)。
EC1665之合成
將EC1579(15mg,1.0當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC0564(10.5mg, 1.0當量)於無水二甲基亞碸(4.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/10mM NH4OAc pH5緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1665(13.4mg,55%)並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1368.09，觀測值1368.30
EC1454之共軛物
EC1751之合成
將EC1454(21.1mg,1.3當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC1716(10.8mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(2.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/50mM NH4HCO3 pH7緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1751(8.5mg,33%)並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1320.05，觀測值1320.72。所選1H NMR(DMSO w/10% D2O)d(ppm)8.61(s),8.15(s),7.58(d),6.94(d),6.60(m),5.79(d),5.22(d),4.47(m),4.09-4.33(m),0.98(d),0.93(d),0.75(m),0.61(d)
EC1750之合成
EC1454(31.1mg,1.3當量)將溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7 緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC1715(15.3mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(2.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/50mM NH4HCO3 pH7緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1750(18.0mg,97%)並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1299.03，觀測值1299.19。部分1H NMR(DMSO w/10% D2O)d(ppm)8.61(s),8.14(s),7.57(d),6.93(d),6.60(m),5.77(d),5.23(d),4.47(m),0.98(d),0.92(d),0.76(m),0.71(t),0.61(d)
EC1739之合成
將EC1454(8.5mg,1.5當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC1717(3.8mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(2.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/50mM NH4HCO3 pH7緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1739(5.3mg,59%)並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1327.06，觀測值1327.73
MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1313.05，觀測值1313.37。所選1H NMR(DMSO w/10% D2O)d(ppm)8.61(s),8.15(s),7.58(d),6.94(d),6.60(m),5.78(d),5.22(d),4.47(m),4.09-4.33(m),0.99(d),0.93(d),0.76(t),0.71(t),0.61(d)
EC1664之合成
將EC1454(5.5mg,1.0當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC1662(3.6mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(2.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/50mM NH4HCO3 pH7緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1664(4.6mg,54%)並凍乾。
EC1663之合成
將EC1454(16.1mg,1.2當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC1661(8.7mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(2.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/50mM NH4HCO3 pH7緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1663(15.8mg,76%)並凍乾。MS(ESI,[M+2H]2+)預測值1306.04，觀測值1306.82
EC1653之合成
將EC1454(8.3mg,1.0當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7緩衝液(2.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至EC0564(5.8mg,1.0當量)於無水二甲基亞碸(4.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在10-100%乙腈/10mM NH4OAc pH5緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1653(6.3mg,46%)並凍乾。MS(ESI,((M-2)/2))預測值1368.09，觀測值1368.74
EC1647
EC1642
EC1496之合成
將EC1454(324mg,1.0當量)溶解於脫氣(Ar鼓泡)20mM PO4 pH7緩衝液(4.0mL)中，並在室溫及Ar鼓泡下逐滴添加至粗製EC0469(142mg,1.1當量)於無水二甲基亞碸(4.0mL,Aldrich)中之攪拌溶液中。在30min後，在0-30%乙腈/50mM NH4HCO3 pH7緩衝液中藉由製備型HPLC來純化EC1496(221mg,51%)並凍乾。MS(ESI,((M+2)/2))預測值1118.39，觀測值1119.02
EC1456
EC1415之共軛物
EC1438
EC1416之合成
將EC1415(20mg)溶解於pH7磷酸鹽(pH 7.75，經氬吹掃)中。向此溶液中添加EC0312(14mg)於等體積MeOH中之懸浮液。將反應混合物在環境溫度下在氬下攪拌45min，且然後裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(18mg)。MS(ESI,[M+2H]2+)1328。1H NMR(DMSO-d6,D2O,300MHz)：8.6(s,1H),8.15(s,1H),7.85(bd,1H),7.55(d,2H),6.95(d,2H),6.6(m,4H),6.2(d,1H),5.68(d,1H),5.2(d,1H),4.5(bs,3H),4.5-4.3(m,4H),4.3-4.0(m,10H),3.5-3.3(m,13H),3.2(bd,5H),3.1-2.8(m,8H),2.75(bs,5H),2.6-1.6(m,50H),1.4(m,9H),1.2(m,9H),1.0(dd,9H),0.7(m,11H),0.6(d,3H)。
EC1392之共軛物
MS(ESI,[M+2H]2+)1011.39
EC59之共軛物
將EC59(13.2mg)於20mM pH7.1磷酸鹽緩衝液(2.4mL)中之溶液添加至EC0312(14.2mg)於MeOH(2.4mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到蓬鬆黃色固體狀產物(15.3mg)。
EC1347之共軛物
EC145 D-異構物
EC1208
LCMS[ESI(M+H)+：1918]。EC145之所選1H NMR數據(D2O,300MHz)：δ 8.67(s,1H,FA H-7),7.50(br s,1H,VLB H-11’),7.30-7.40(br s,1H,VLB H-14’),7.35(d,2H,J=7.8Hz,FA H-12 &16),7.25(m,1H,VLB H-13’),7.05(br s,1H,VLB H-12’),6.51(d,2H,J=8.7Hz,FA H-13 &15),6.4(s,2H,VLB H-14 & 17),5.65(m,1H,VLB H-7),5.5(m,1H,VLB H-6),4.15(m,1H,VLB H-8’),3.82(s,3H,VLB C18’-CO2CH3),3.69(s,3H,VLB C16-OCH3),2.8(s,3H,VLB N-CH3),1.35(br s,1H,VLB H-3’),1.15(m,1H,VLB H-2’),0.9(t,3H,J=7Hz,VLB H-21’),0.55(t,3H,J=6.9Hz,VLB H-21)ppm。
EC1209
LCMS[ESI(M+H)+：1918]。EC145之所選1H NMR數據(D2O,300MHz)：δ 8.67(s,1H,FA H-7),7.50(br s,1H,VLB H-11’),7.30-7.40(br s,1H,VLB H-14’),7.35(d,2H,J=7.8Hz,FA H-12 &16),7.25(m,1H,VLB H-13’),7.05(br s,1H,VLB H-12’),6.51(d,2H,J=8.7Hz,FA H-13 &15),6.4(s,2H,VLB H-14 & 17),5.65(m,1H,VLB H-7),5.5(m,1H,VLB H-6),4.15(m,1H,VLB H-8’),3.82(s,3H,VLB C18’-CO2CH3),3.69(s,3H,VLB C16-OCH3),2.8(s,3H,VLB N-CH3),1.35(br s,1H,VLB H-3’),1.15(m,1H,VLB H-2’),0.9(t,3H,J=7Hz,VLB H-21’),0.55(t,3H,J=6.9Hz,VLB H-21)ppm。
EC1575
將EC1577(9.5mg)於20mM pH7磷酸鹽緩衝液(2.0mL)中之溶液及飽和NaHCO3溶液(0.50mL)先後添加至EC0312(10.1mg)於MeOH(2.0mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝 液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B in 20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(9.5mg)。LCMS[ESI(M+H)+：2627]。1H NMR(D2O,300MHz)：8.70(s),8.11(s),7.62(d),7.00(d),6.71(dd),6.11(d),5.80(d),5.33(d),4.60-4.50(m),4.40-4.15(m),3.88-3.51(m),3.50-3.20(m),3.19-2.80(m),2.76(s),2.60-1.43(m),1.40-1.27(m),1.18(d),1.02(d),0.97-0.82(m),0.76-0.63(m)。
EC1548
將EC1544(55.1mg)於20mM pH7磷酸鹽緩衝液(1.95mL)中之溶液及飽和NaHCO3溶液(0.30mL)先後添加至EC1248(58.0mg)於MeOH(2.30mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(61.5mg)。MS(ESI,M+1)1993
EC1549
將EC1547(23.5mg)於20mM pH7磷酸鹽緩衝液(2.0mL)中之溶液及飽和NaHCO3溶液(0.30mL)先後添加至EC1248(24.7mg)於MeOH(2.3mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(29.2mg)。MS(ESI,M+1)1993
EC1349
EC1299
將EC0259(35mg)於20mM pH7磷酸鹽緩衝液(3.0mL)中之溶液及飽和NaHCO3溶液(1.5mL)先後添加至EC0312(39mg)於ACN(5.5mL)中之溶液中。將所得均質溶液在環境溫度下在氬下攪拌20min，且然後直接裝載至預備HPLC(流動相A=50mM NH4HCO3緩衝液，pH=7.0。B=ACN。方法：5-80% B，20min)上用於純化。收集含有期望產物之流份，合併，並冷凍乾燥，從而得到淺黃色固體狀產物(25mg)。MS(ESI,M+1)1993
EC0836
EC0821
EC153
MS(ESI,[M+H]+)1023；(ESI,[M-H]-)1021
1H NMR(DMSO-d6,300MHz)：8.84(s,1H),7.70(d,2H),6.80(d,2H),4.60(m,1H),4.56(s,2H),4.34(m,2H),4.10(m,2H),3.85(m,2H),3.60-3.30(m,5H),3.20(s,2H),318-3.05(m,1H),3.0(br,2H),2.90-2.70(m,2H),2.40-2.00(m,4H),1.95(m,3H)， 以下化合物係根據本文闡述之製程自EC0059起始來製備：
EC1391
EC1390
EC74
MS(ESI,[M+H]+)1438.3；(ESI,[M-H]-)1436.4
比較實例。
EC0746(C87H122N26O40S2；MW 2236.18)
比較實例。
EC0531(C110H165N23O45S3；MW 2625.81)
比較實例。EC0923。
EC0923(C27H29N9O12；MW 671.57)
方法及實例
概述。本文使用以下縮寫：部分反應(PR)；完全反應(CR)，每週三次(M/W/F)(TIW)。
方法。相對親和力分析。葉酸鹽受體(FR)相對於葉酸鹽之親和力係根據略加修改之先前文獻闡述之方法(Westerhof,G.R.,J.H.Schornagel等人，(1995)Mol.Pharm.48：459-471)來測定。簡言之，將FR陽性KB細胞大量接種至24孔細胞培養板中，並使其與塑膠黏附並保持18h。在不存在及存在增加濃度之測試物品或葉酸下，將指定孔中之耗盡培育培養基用補充有100nM 3H-葉酸之不含葉酸鹽之RPMI(FFRPMI)替代。將細胞在37℃下培育60min，且然後用PBS(pH 7.4)沖洗3次。每孔添加五百微升1%存於PBS中之SDS(pH 7.4)。然後，收集細胞溶解物，並添加至含有5mL閃爍液之個別小瓶中，且然後針對放射性計數。陰性對照管僅在FFRPMI中含有3H-葉酸(無競爭劑)。陽性對照管含有最終濃度為1mM之葉酸，且自所有試樣減去 於該等試樣(代表標記之非特異結合)中量測之CPM。相對親和力定義為置換50%結合至KB細胞上FR之3H-葉酸所需化合物之反莫耳比，其中將葉酸對於FR之相對親和力設定為1。
實例。EC1669顯示對葉酸鹽受體之高結合親和力，如藉由活體外競爭結合分析所測定，該競爭結合分析量測配體在結合至細胞表面葉酸鹽受體(FR)方面與3H-葉酸競爭之能力。EC1669()。EC1669之相對親和力值(相對於葉酸正規化，將該葉酸之親和力值設為1)針對KB及CHO-FRβ細胞經測定分別為0.53及0.13(參見圖1A及圖1B)。相比之下，甲胺蝶呤(MTX)顯示與細胞表面FR之結合較差。不欲受限於理論，在本文中相信，EC1669之高結合親和力容許經由FR介導之細胞吞噬達成有效細胞吸收。
方法。細胞DNA合成之抑制。本文所闡述化合物係使用活體外細胞毒性分析來評估，該細胞毒性分析預測藥物抑制葉酸鹽受體陽性細胞(例如KB細胞、RAW264.7巨噬細胞及諸如此類)之生長之能力。應瞭解，可基於彼等所選細胞對形成共軛物之藥物之易感性來選擇細胞類型。測試化合物包括連接至各別化學治療性藥物之葉酸鹽，如根據本文闡述之製程所製備。將測試細胞暴露於不同濃度之葉酸鹽-藥物共軛物，且亦在不存在或存在至少100倍過量之葉酸下來評估特異於葉酸鹽受體介導之活性。
實例。本文闡述之細胞毒性藥物之共軛物抵抗KB細胞有活性。該活性係藉由葉酸鹽受體來介導，如藉由使用共投與之葉酸之競爭實驗所指示。在不存在或存在至少100倍過量之葉酸下將KB細胞在37℃下暴露於所指示濃度之葉酸鹽-藥物共軛物長達7h。然後，用新鮮培養基將細胞沖洗一次，並在37℃下在新鮮培養基中培育72小時。使用3H-胸苷併入分析來評估細胞活力。對於本文所闡述化合物，劑量依賴性細胞毒性通常係可量測的，且在大多數情形下，IC50值(將50%所 併入3H-胸苷還原成新合成之DNA所需藥物共軛物之濃度)係在低奈莫耳範圍內。儘管不欲受限於理論，但當共軛物之細胞毒性在存在過量游離葉酸下有所降低時，在本文中相信，該等結果指示所觀察到的細胞死亡係藉由結合至葉酸鹽受體介導的。
實例。EC1669顯示抵抗鼠科動物RAW264.7巨噬細胞之強效細胞生長抑制效應。EC1669之抗增殖活性係在XTT細胞活力分析(圖2)中針對RAW264.7細胞在2h暴露及總計72h培育後量測。RAW264.7巨噬細胞易受形成EC1669共軛物之藥物胺基蝶呤之影響。細胞活力係藉由遵循製造商之說明書添加XTT(2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基-苯基)-2H-四唑鎓-5-甲醯苯胺)來評估。EC1669顯示細胞增殖之劑量依賴性抑制，且相對IC50值為約1.2nM。所觀察到之抗增殖效應在存在100倍過量葉酸(FA)下係100%競爭的，從而指示EC1669之FR-特異性作用模式。
方法。抵抗各種癌細胞系之活體外活性。生成各種細胞系之IC50值。將細胞大量接種於24孔Falcon板中，並使其過夜形成幾乎匯合的單層。在添加測試化合物前30分鐘，自所有孔吸出耗盡培養基，並將其用新鮮的葉酸鹽缺乏型RPMI培養基(FFRPMI)替代。指定一部分孔接收含有100μM葉酸之培養基。使用指定孔中之細胞來測定靶向特異性。不欲受限於理論，在本文中相信，測試化合物在過量葉酸存在下(即其中對於FR結合存在競爭)產生之細胞毒性活性對應於總活性中與FR-特異輸送無關之部分。在用1mL含有10%熱去活化之胎牛血清之新鮮FFRPMI沖洗一次後，在如所指示之100μM游離葉酸存在或不存在下使每孔接收1mL含有增加濃度之測試化合物(每個試樣4個孔)之培養基。使經處理細胞在37℃下脈衝2h，用0.5mL培養基沖洗4次，且然後在1mL新鮮培養基中追蹤長達70h。自所有孔吸出耗盡培養基並用含有5μCi/mL 3H-胸苷之新鮮培養基替代。在於37℃下再培 育2h後，用0.5mL PBS將細胞洗滌3次，且然後每孔用0.5mL冰冷的5%三氯乙酸處理。在15min後，吸出三氯乙酸並藉由添加0.5mL 0.25N氫氧化鈉使細胞材料溶解15min。將各個溶解試樣的450μL等份試樣轉移至含有3mL Ecolume閃爍液之閃爍小瓶中，且然後在液體閃爍計數器中計數。最終結果係以所併入3H-胸苷相對於未經處理對照之%來表示。
實例。本文所闡述化合物展現抵抗諸如KB細胞等病原細胞之強效活體外活性。本文所闡述化合物相比於不包括至少一種非天然胺基酸之化合物對葉酸鹽受體展現更大特異性。例如，EC1456展現對葉酸鹽受體約1000倍的特異性，如藉由葉酸競爭(特異性=競爭之組與非競爭之組間之IC50差值)所測定，且相比於不包括具有非天然胺基酸之連接體L之對比化合物EC0531之特異性提高4倍。
實例。表現葉酸鹽受體之細胞之選擇性。本文所闡述化合物對於表現葉酸鹽受體之細胞顯示高活性。本文所闡述化合物未顯示與葉酸鹽受體陰性細胞顯著結合。EC1456顯示與低及高FR表現細胞(FR+)之高競爭結合，且未顯示與不表現FR(FR-)之細胞結合。
EC1456在(FR+)及(FR-)細胞系中之活性
(a)活性係自0.1nM至100nM以抵抗該等經特異選擇之(FR-)細胞系(A549、H23、HepG2、AN3CA、LNCaP)來評估；NA=不適用。
方法。對小鼠中腫瘤生長之抑制。自Harlan Sprague Dawley公司(Indianapolis,IN)購得四週至七週齡小鼠(Balb/c或nu/nu品系)。正常齧齒動物飼料含有高濃度葉酸(6mg/kg飼料)；因此，在腫瘤移植前約1週測試動物維持不含葉酸鹽之飲食(Harlan飲食編號TD00434)以使血清葉酸鹽濃度接近正常人類血清之範圍，且在該方法期間亦如此。對於腫瘤細胞接種，在Balb/c品系中將存於100μL中之1×106個M109細胞(同源肺癌)或在nu/nu品系中1×106個KB細胞注射於背內側區(右腋窩)之皮下層中。每2-3天使用測徑器在兩個垂直方向上量測腫瘤，且以0.5×L×W2計算其體積，其中L=最長軸之量測值(mm)且W=垂直於L之軸之量測值(mm)。然後，根據公開之程序計算細胞對數殺滅(log cell kill，LCK)及經治療/對照(T/C)值(例如參見Lee等人之「BMS-247550：a novel epothilone analog with a mode of action similar to paclitaxel but possessing superior antitumor efficacy」Clin Cancer Res 7：1429-1437(2001)；Rose,「Taxol-based combination chemotherapy and other in vivo preclinical antitumor studies」J Natl Cancer Inst Monogr 47-53(1993))。
當皮下腫瘤之平均體積在50-100mm3之間時(t0)開始投藥，通常對於KB腫瘤係在腫瘤接種後(PTI)8天開始投藥，且對於M109腫瘤係在PTI 11天開始投藥。除非另有指示，否則通常以不同劑量(例如以1μmol/kg至5μmol/kg)之藥物輸送共軛物或以相等劑量體積之PBS(對照)每週三次(TIW)將測試動物(5隻/組)靜脈內注射3週。投藥溶液係每 天在PBS中進行新鮮製備且經由小鼠之側尾靜脈投與。
方法。一般4T-1腫瘤分析。自Harlan公司，Indianapolis,IN獲得六週至七週齡小鼠(雌性Balb/c品系)。在該方法開始前及該方法期間以Harlan之不含葉酸鹽之飼料將小鼠維持總計三週。將葉酸鹽受體陰性4T-1腫瘤細胞(1×106個細胞/動物)接種於右腋窩之皮下層中。除非本文另有指示，否則在腫瘤接種後大約5天當4T-1腫瘤平均體積為約100mm3時(t0)，以不同劑量(例如3μmol/kg)藥物輸送共軛物或相等劑量體積之PBS(對照)每週三次(TIW)將小鼠(5隻/組)靜脈內注射3週。在每一處理組中間隔2天或3天使用測徑器量測腫瘤生長。使用等式V=a×b2/2計算腫瘤體積，其中「a」係腫瘤之長度且「b」係以毫米表示之寬度。
方法。藥物毒性。持續藥物毒性係藉由經由心臟穿刺收集血液並提交血清用於獨立分析血脲氮(BUN)、肌酐、總蛋白、AST-SGOT、ALT-SGPT加上Ani-Lytics公司(Gaithersburg,MD)之標準血液細胞面板來評估。此外，藉由公認的病理學家在動物參考病理學實驗室(Animal Reference Pathology Laboratories)(ARUP；Salt Lake City,Utah)對福爾馬林固定之心臟、肺、肝臟、脾、腎、腸、骨骼肌及骨(脛骨/腓骨)實施組織病理學評估。
方法。如藉由重量減輕量測之毒性。在腫瘤接種後(PTI)之所選日期及投藥期間測定測試動物之重量變化%。結果係用圖表來表示。
實例。抵抗抗腫瘤之活體內活性。本文所闡述化合物顯示在nu/nu小鼠中抵抗KB腫瘤之高效力及效能。本文所闡述化合物顯示抵抗表現葉酸鹽受體之腫瘤之特異活性，且具有低宿主動物毒性。例如，EC1456當TIW以1μmol/kg靜脈內投與2wk時在4/4測試動物中顯示完全反應。EC1456亦顯示由葉酸鹽受體介導之特異活性，如由與過量對比化合物EC0923(50μmol/kg或100μmol/kg)之競爭所證實， 如圖3A中所顯示。EC1456未顯示對整體動物毒性之任何證據，如圖3B中所顯示。
實例。評估EC1663抵抗人類KB腫瘤之治療性能。圖4A中之數據顯示4/4部分反應，其中腫瘤體積相對於對照組顯著降低，但未降至零，且腫瘤在投藥結束後開始再生長。在本文中相信，較高劑量可產生完全反應及/或治癒。圖4B中之數據顯示，在所投與有效劑量下，未觀察到整體動物毒性。
方法。TNBC腫瘤分析。三重陰性乳癌(TNBC)係特徵為缺乏雌激素、黃體固酮及Her2/neu之基因表現之亞型。TNBC難以治療，且據報導在患者中造成之死亡率不成比例地高於乳癌之任何其他亞型。TNBC異體移植模型係以與本文闡述之KB及M109模型類似之方式藉由在nu/nu小鼠中移植MDA-MB-231乳癌細胞來生成。在皮下腫瘤之平均體積介於110至150(通常130)mm3之間時(t0)開始投藥，通常係在腫瘤接種(PTI)後17天開始投藥。除非另有指示，否則通常以不同劑量(例如1μmol/kg至5μmol/kg)的藥物輸送共軛物或相等劑量體積的PBS(對照)每週三次(TIW)將測試動物(5隻/組)靜脈內注射2-3週。投藥溶液係每天在PBS中進行新鮮製備且經由小鼠之側尾靜脈投與。
實例。當針對經證實的三重陰性FR陽性皮下MDA-MB-231乳癌異體移植測試時，發現EC1456以每週三次的2個連續週的時間表以2μmol/kg靜脈內劑量投與具有高度活性。該治療產生4/5完全反應，其中腫瘤體積降至零，且在近135天的觀察窗期間不會再生長。不欲受限於理論，在本文中相信，測試動物之三重陰性乳癌得以治癒。EC1456之結果顯示於圖5A中。在測試動物中抗腫瘤活性並未伴隨顯著重量減輕，如圖5B中所顯示。
方法。人類耐順鉑細胞系。人類耐順鉑細胞系係藉由在增加之順鉑濃度(100nM→2000nM；經>12個月之時段)存在下培養FR陽性 KB細胞來產生。發現耐順鉑細胞(標記為KB-CR2000細胞)係致瘤性的，且發現其在活體內保持FR表現狀態。KB-CR2000腫瘤經證實對順鉑療法具有耐性。利用高且有毒劑量的順鉑(平均重量減輕為10.3%，如圖6B中所顯示)治療甚至並未產生單一部分反應(PR)，如圖6A中所顯示。相反，發現EC1456抵抗KB-CR腫瘤極具活性，其中觀察到5/5CR。此外，僅在1/5測試動物中觀察到腫瘤之再生長。不欲受限於理論，在本文中相信，4/5測試動物之耐順鉑癌症得以治癒，其中在近70天之觀察時段期間並未再生長。此外，與順鉑不同，EC1456在此群組小鼠中未造成任何重量減輕，且因此在投藥時段期間未展現顯著動物毒性之任何證據。
實例。共軛藥物與非共軛藥物之比較。評估非共軛微管溶素B及非共軛TubB-H(EC0347)藥物在小鼠活體內抵抗人類KB腫瘤之治療性能。將每一非共軛藥物之抗腫瘤效能及顯著毒性(如藉由體重變化所測定)與EC1456共軛物進行比較。EC1456在此模型中產生劑量反應性抗腫瘤活性。在產生極少重量減輕至不產生重量減輕之治療條件下觀察到完全反應。相反，即使當向小鼠投與極有毒劑量時，兩種基於非共軛微管溶素之藥物皆無法得到任何抗腫瘤反應。結果顯示於下表中。
*未經治療之對照組之平均重量減輕為2.4%
1該組由於毒性僅接收2個劑量。
該等結果證實，儘管微管溶素B及TubBH對培養之細胞具有高細胞毒性(典型IC50為約1nM)，但兩種藥劑皆在不產生可量測抗腫瘤效應之量下在小鼠中產生劑量限制性毒性。因此，非共軛化合物未展現治療窗。相反，藥物之共軛形式(例如共軛TubBH(EC1456))產生抗腫瘤反應且對具有經充分證實的人類腫瘤異體移植之小鼠無顯著毒性。如本文所闡述之共軛提供高度有毒藥物之治療窗。
實例。本文所闡述化合物相比於葉酸(相對親和力=1)在10%血清/FDRPMI中展現高葉酸鹽受體親和力，相比於非共軛藥物展現強效活體外活性、強效活體內活性、對葉酸鹽受體之特異性及相當高的治療指數。
(a)相比於葉酸；(b)如藉由胸苷併入所測定；(c)測試化合物在與過量葉酸競爭時之IC50；IC50愈高，葉酸鹽介導之特異性愈強；(d)活體外特異性=競爭之組與非競爭之組間之IC50之差值；(e)如在nu/nu小鼠中在皮下KB腫瘤中所測定；CR=完全反應，其中對於該組中所有測試動物，在觀察時段期間的如本文所定義之腫瘤體積皆為零；(f)母體微管溶素；NT=未測試。
方法。佐劑誘導之關節炎(AIA)模型。餵養雌性Lewis大鼠葉酸鹽缺乏型飲食(Harlan Teklad,Indianapolis,IN)達9-10天，之後進行關節炎誘導。佐劑誘導之關節炎(AIA)係藉由皮內接種(在尾根部)存於100μL輕礦物油(Sigma)中之0.4-0.5mg熱殺滅之乳酪分枝桿菌(Mycobacteria butyricum)(BD Diagnostic Systems,Sparks,MD)來誘導。在關節炎誘導後10天，使用修改之關節炎得分系統評估大鼠中之爪水腫(關節炎之程度)：0=無關節炎；1=在一種類型關節中腫脹；2=在兩種類型關節中腫脹；3=在三種類型關節中腫脹；4=整個爪皆腫脹。藉由總結四種爪中之每一者之得分值來計算每一大鼠之總分，對於每一大鼠皆得到16之最大得分值。在關節炎誘導後第10天，自該研究移除總關節炎得分值2之大鼠，並將剩餘大鼠均勻分配於對照組及治療組間(對於所有組n=5，健康對照組之n=2-3除外)。除非另有指示，否則所有治療皆於第10天開始。亦以放射照相術評估大鼠爪來評估並測定骨損害。
實例。本文所闡述化合物可強效治療發炎性疾病，例如發炎及伴隨關節炎之骨損害。EC1496在佐劑誘導之關節炎之大鼠模型中強效且有效降低爪發炎，如圖7中所顯示。圖7顯示，基於爪水腫之評估，EC1496有效防止關節炎之發生。EC1496(跡線(d))與未經治療之對照(跡線(b))顯著不同。此外，數據指示，該效應係葉酸鹽受體介導的，此乃因EC1496(跡線(d))與共投與EC1496及過量葉酸之競爭對照組(跡線(d))亦顯著不同。
實例。本文所闡述化合物可強效治療發炎性疾病，例如伴隨關節炎出現之發炎及骨損害。說明性地，EC1496可在佐劑誘導之關節炎之大鼠模型中強效且有效降低及/或防止骨損害，如藉由放射照相分析所測定。放射照相顯示，基於視覺得分，經治療動物未展現在未經治療之對照動物中看到的骨損害。而是，經治療動物及健康動物顯示類似的骨結構。
實例。EC1669展現抵抗佐劑關節炎之葉酸鹽受體特異活性。在誘導後第9天開始，根據關節炎得分值將發生AIA之大鼠分配至三個組(n=5)中：(1)未經治療之AIA對照組，(2)EC1669治療組，及(3)EC1669加EC0923之競爭組。所有治療皆持續2個連續週。使AIA對照組中之動物未經治療。一週兩次將EC1669以375nmol/kg之劑量皮下投與EC1669治療組中之動物。一週兩次將EC1669以375nmol/kg之劑量且將EC0923以187.5μmol/kg之劑量皮下投與EC1669加EC0923組中之動物。研究終點示於圖8A、圖8B、圖9A及圖9B中：(a)關節炎得分值；(b)體重變化；及(c)爪腫脹，藉由爪重量(在最後劑量後4天收集)%之增加來評估，及(d)骨放射照相。發現EC1669可高度有效緩解爪腫脹(相對於對照組提高約80%)及骨損害(相對於對照組提高約80%)。EC1669之抗關節炎活性與葉酸鹽競爭劑(EC0923)競爭(阻斷)。
實例。在後續投藥研究中，評估各種EC1669投藥方案，包括一 週一次以1000nml/kg投藥、一週兩次以250nmol/kg投藥及一週兩次以500nmol/kg投藥。令人驚訝地，一週兩次以250nmol/kg投藥優於一週一次以1000nml/kg投藥，總劑量減少二分之一。發現EC1669在兩週一次投藥時較一週一次可更有效降低爪腫脹，兩週一次以500nmol/kg投藥降低81%，且兩週一次以250nmol/kg投藥降低64%，相比之下一週一次以1000nmol/kg投藥降低44%。
實例。EC1669加CellCept較任一單獨藥劑更有效抵抗佐劑誘導之關節炎。CellCept係黴酚酸之前藥，其係用於防止移植器官排斥之免疫抑制劑藥物。CellCept係在活體內活化且釋放活性產物，可以抑制T細胞增殖且干擾白血球黏附至內皮細胞。為測試EC1669及CellCept之組合效應，根據關節炎得分值將發生AIA之大鼠分配至四個組(n=5)中：(1)未經治療之AIA對照組，(2)EC1669治療組，(3)CellCept治療組及(4)EC1669及CellCept組合組。所有治療皆於AIA誘導後第9天開始且持續2個連續週。AIA對照組動物未接受治療。EC1669治療組中之動物係每週以1000nmol/kg之劑量皮下投與EC1669。CellCept治療組中之動物係每天以30mg/kg之劑量(每週5天)經口投與CellCept。EC1669及CellCept組合治療組中之動物係每週以1000nmol/kg之劑量皮下投與EC1669且每天以30mg/kg之劑量(每週5天)經口投與CellCept。如圖10A及圖11中所顯示，EC1669及CellCept組合療法較單獨藥劑可更有效降低關節炎得分值、爪腫脹及由於疾病進展引起之重量減輕。圖10B顯示，EC1669及CellCept組合療法較單獨投與之藥物產生之毒性更低。
方法。膠原蛋白誘導之關節炎(CIA)模型。膠原蛋白誘導之關節炎(CIA)係在餵以葉酸鹽缺乏型飲食(Harlan Teklad,Indianapolis,IN)之雌性Lewis大鼠中誘導。在第0天，用500μg調配有弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)之II型牛膠原蛋白(Chondrex,Redmond, WA)免疫大鼠。在第7天用250μg調配有弗氏不完全佐劑之牛膠原蛋白加強免疫。藉由製造商(Chondrex,Redmond,WA)闡述之定性臨床評分系統來評估關節炎疾病：0=正常，1=輕度，但明顯發紅且踝或腕腫脹，或顯然發紅且限於個別趾之腫脹，不論受影響趾之數量如何，2=中度發紅且腕踝腫脹，3=嚴重發紅且整個爪(包括趾)腫脹，且4=四肢最大程度發炎且涉及多個關節。在第一免疫次後第10天，將大鼠均勻分配(根據關節炎得分值)至對照組及治療組中。在第10天至第19天，連續十次皮下投與CIA大鼠測試化合物。對於每一藥物，在第10天及第15天投與誘導劑量(例如，500nmol/kg)，且在第11天至第14天及第16天至第19天投與維持劑量(例如，100nmol/kg)。使關節炎對照組中之動物未經治療。一週五次記錄關節炎得分值及動物體重。
方法。動物實驗自體免疫眼色素層炎模型。實驗自體免疫眼色素層炎(EAU)係在餵以葉酸鹽缺乏型飲食(Harlan Teklad,Indianapolis,IN)維持之雌性Lewis大鼠中誘導。在第0天，用25μg調配有弗氏不完全佐劑含有0.5mg研磨結核分枝桿菌(M.Tuberculosis)H37Ra之牛S-Ag PDSAg肽皮下免疫動物。在同一天經由腹膜內注射以1μg/動物之劑量投與純化百日咳毒素(PT)。藉由定性視覺評分系統評估每隻眼之眼色素層炎之嚴重性：0=沒有疾病，眼係半透明的且反射光(紅光反射)；0.5(痕量)=虹膜中之血管膨脹，1=虹膜中之血管充血，異常瞳孔縮小；2=眼前房渾濁，紅光反射降低；3=眼前房中度不透明，但瞳孔仍可見，對紅光反射遲鈍；且4=眼前房不透明且瞳孔遮蔽，不存在紅光反射，凸眼。此評估得到每隻動物的最大眼色素層炎得分值為8。
實例。本文所闡述化合物可強效治療自體免疫眼色素層炎。EC1669展現抵抗自體免疫眼色素層炎之葉酸鹽受體特異活性。將呈 現EAU之動物隨機化並分配至三個組中：(1)未經治療之EAU對照(n=11)，(2)測試化合物治療組(n=7)，例如EC1669，(3)測試化合物及競爭劑化合物治療組(n=7)，例如EC1669加EC0923，及(4)陽性對照治療組(n=7)，例如甲胺蝶呤(MTX)。所有治療皆於EAU誘導後第8天開始。EAU對照組動物未接受治療。每隔一天(q2d)將EC1669以250nmol/kg之劑量皮下投與EC1669治療組中之動物五次。每隔一天將EC1669以250nmol/kg之劑量皮下投與且將500倍過量之EC0923作為葉酸鹽競爭劑以125μmol/kg之劑量投與EC1669加EC0923治療組中之動物五次。每隔一天將MTX以250nmol/kg之劑量皮下投與MTX治療組中之動物五次。以預定頻率記錄每隻動物之眼色素層炎得分值及動物體重。每天使用檢眼鏡監測EAU之臨床嚴重性並按照每隻眼0至4之等級分級，且每隻動物之最大可能得分值為8。在第16天，使動物安樂死並在福爾馬林中固定大鼠眼球用於組織學。如圖12A中所顯示，在疾病開始時進行EC1669治療可以FR依賴性方式有效降低EAU之症狀且其活性可與皮下MTX競爭。在本文所闡述包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之共軛物化合物之情況下，未觀察到與治療相關之重量減輕，如圖12B中所顯示。
實例。EC1496可強效且有效抵抗葉酸鹽受體特異自體免疫眼色素層炎，如圖13A中所顯示。藉由組織學評估組織，如圖13B中所顯示。
方法。自體免疫腦脊髓炎(EAE)模型。EAE係在大鼠中藉由針對25μg調配有CFA含有1mg研磨結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra之天竺鼠髓鞘鹼性蛋白(MBP)免疫來誘導。腹膜內投與百日咳毒素(1μg/大鼠)來增強器官特異性自體免疫。在誘導後第8天開始，將大鼠分至4個組中：(1)未經治療之對照(n=8)，(2)測試化合物(n=7)，及(3)測試化合物加競爭劑化合物(n=7)，例如 EC0923競爭。所有治療皆於EAE誘導後第8天開始。使EAE對照組中之動物未經治療。每隔一天(q2d)將測試化合物以250nmol/kg之劑量皮下投與測試化合物治療組中之動物四次。每隔一天將測試化合物以250nmol/kg之劑量以及500倍過量之競爭劑化合物(例如125μmol/kg劑量下之EC0923作為說明性葉酸鹽受體競爭劑)皮下投與測試化合物加競爭劑化合物治療組中之動物四次。每天監測EAE之臨床嚴重性，並按照每隻動物0至5之等級分級。將EAE大鼠之上行性麻痺之臨床體徵分成0-5等級：0=沒有疾病，0.5=遠位跛行尾部，1=跛行尾部，2=輕度後驅輕癱；運動失調-後肢削弱，3=中度後驅輕癱；後肢輕癱，4=完全性後肢麻痺，5=完全性後肢麻痺及失禁(安樂死)。在第16天，使動物安樂死，並在福爾馬林中固定腦及脊髓用於組織學。
實例。本文所闡述化合物可強效治療實驗自體免疫腦脊髓炎(EAE)。EC1669展現抵抗EAE之葉酸鹽受體特異活性。如圖14A中所顯示，在疾病開始下進行EC1669治療可在EAE之急性階段期間有效抑制神經症狀。在單獨投與EC1669時未觀察到治療相關之重量減輕，如圖14B中所顯示。EC1669之治療效應被葉酸鹽受體競爭劑EC0923阻斷。
實例。EC1496可強效且有效抵抗EAE，如圖15中所顯示。在單獨投與EC1496時未觀察到治療相關之重量減輕。
方法。人類血清穩定性。使用習用方案及方法測試本文所闡述化合物在人類血清中之穩定性。簡言之，例如藉由皮下注射將測試化合物投與測試動物。隨時間監測血漿中共軛物及視情況一或多種代謝產物之濃度。用圖表表示結果來測定測試化合物及代謝產物之Cmax、Tmax、半衰期及AUC。
實例。本文所闡述包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之共軛物化合物較不具有包含至少一種非天然胺基酸之連接體之對比共 軛物化合物在血漿中更穩定。EC1495及EC0746(對比化合物)各自藉由皮下注射以500nmol/kg來投與。隨時間監測血漿中共軛物及代謝產物(胺基蝶呤及胺基蝶呤醯肼)之濃度。EC1496顯示之Cmax高於EC0746，分別如圖16A及圖16B中所顯示。此外，圖16A及圖16B顯示，EC1496較EC0746在血漿中釋放實質上更少之藥物。亦如下表中所顯示，釋放作為母體胺基蝶呤及醯肼衍生物(EC0470)之游離藥物。
不欲受限於理論，在本文中相信，數據指示本文所闡述包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之化合物(例如EC1496)展現較強的血漿穩定性。此外，不包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之比較實例EC0746在皮下投與後在大鼠中釋放的藥物為EC1496之2倍。EC1496亦顯示高於EC0746之Cmax，此使得有效治療劑量更高。最後，EC1496顯示更短的半衰期。不欲受限於理論，在本文中相信，快速清除可另外使得毒性更低，此乃因相比於不包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之化合物，暴露於自本文闡述之共軛物過早釋放之藥物之持續時間亦將有所降低。
方法。血漿清除。活體內研究每時間點包括最少3隻測試動物(例如大鼠)。說明性地，將測試化合物(例如EC1669)以500nmol/kg單次皮下注射具有頸靜脈導管之雌性Lewis大鼠(Harlan，常規齧齒動物飲食)。在以下時間點收集全血試樣(300μL)：注射後1min、10min、30min、1h、2h、3h、4h、8h及12h。將血液試樣置於含有存於0.15%乙酸溶液中之1.7mg/mL K3-EDTA及0.35mg/mL N-順丁烯二醯 基-β-丙胺酸(0.35mg/mL)之抗凝管中。藉由以約2,000g離心3min來獲得血漿試樣，並將其儲存於-80℃下。藉由LC-MS/MS分別定量血漿中測試化合物及任何代謝產物(例如EC1669及其兩種活性代謝產物胺基蝶呤(AMT)及AMT醯肼(EC0470))之量。
實例。EC1669顯示在皮下投與後在大鼠中之快速血漿清除。可在血流中在數分鐘內檢測EC1669，其中在投與後約30min出現約472nM之Cmax，且其維持平穩狀態直至注射後60min。EC1669衍生之AMT及EC0470經檢測分別具有27nM及21nM之類似Cmax值，但相比於EC1669 Cmax延遲30min。儘管EC1669本身可自血液快速清除且消除半衰期為約37min，但兩種代謝產物之消除半衰期為大約2-3倍，分別為66min(AMT)及112min(EC0470)。EC1669、AMT及EC0470之相應曲線下面積(AUC)值分別為52nmol*min/mL、5.9nmol*min/mL及3.9nmol*min/mL。基於其AUC反應，估計經12h收集時段血漿中活性藥物暴露/釋放(AMT加EC0470)為約15.8%，如下表中所顯示。
不欲受限於理論，在本文中相信，針對本文所闡述化合物(例如EC1669)所觀察到之快速血漿清除可產生較低之宿主動物毒性，此乃因相比於不包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之化合物，暴露於自本文闡述之共軛物過早釋放之藥物之持續時間亦將有所降低。
方法。藥物動力學生物分佈。此部分中之研究每時間點包括最少3隻測試動物(小鼠)。觀察餵以葉酸鹽缺乏型飲食之雌性Balb/c小鼠中測試化合物(例如3H-EC1669(藥物上之標記))相比於陽性對照(例如3H-甲胺蝶呤(3H-MTX))之藥物動力學生物分佈。化合物係以500 nmol/kg單次皮下(SC)注射來投與。在各個時間點(例如10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h及72h)收集全血(>300μL)且對於各個目標組織各收集約100mg。將血液試樣置於BD微量采血管(肝素)並離心(4,000g×3min,4℃)以分離血漿(>100μL)。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS,pH 7.4)將剩餘紅血球(RBC)團塊洗滌2次來獲得RBC。稱重所收集組織並進行處理以測定3H-EC1669及3H-MTX分佈：血漿、RBC、心臟、肺、肝(最小葉)、脾、腎(1)、腸(上方盲腸)、糞便材料(來自結腸)、肌肉及腦。
實例。皮下投與後3H-EC1669及3H-甲胺蝶呤之藥物動力學生物分佈之比較。比較藥物動力學生物分佈結果顯示於圖17中(以%所注射劑量/克(%ID/g)表示)。在投與後10min，肝捕獲31% ID/g之3H-MTX。發現血漿中之3H-EC1669為3H-MTX之兩倍(12% ID/g對5.2% ID/g)。在RBC、脾、肝、腸及糞便中之3H-MTX滯留在整個取樣時段期間亦始終如一地高於3H-EC1669。RBC數據亦繪製於圖18中，顯示3H-MTX滯留高於EC1669。不欲受限於理論，在本文中相信該等數據表明，EC1669與MTX在肝清除方面顯著不同，其中MTX優先被肝清除。不欲受限於理論，在本文中亦相信該等數據表明，EC1669與MTX在RBC吸收方面顯著不同，表明細胞進入方法不同。據報導，MTX以非特異性方式進入細胞，其通常經由普遍表現之還原型葉酸鹽載體(RFC)。顯示本文所闡述化合物係特異經由功能葉酸鹽受體進入細胞。不欲受限於理論，在本文中相信，RBC數據進一步支持本文所闡述共軛物之葉酸鹽受體介導之活性。
在後續腎/肝分泌研究中，在代謝籠中圈養小鼠且禁食6h，之後皮下投與3H-EC1669或3H-MTX。在投與後24h，發現投與3H-EC1669之動物之蓄尿中之放射性較投與3H-MTX之動物高約14%。相反，發現投與3H-MTX之動物之蓄便中之放射性為投與EC1669之動物之兩 倍。不欲受限於理論，在本文中相信該等數據表明，EC1669與MTX在腎對肝之清除比率方面顯著不同，其中EC1669優先被腎而非肝清除。據報導，MTX尤其在長期使用後引起之主要副效應為肝毒性。不欲受限於理論，在本文中相信，本文所闡述化合物之優先腎清除將產生較少副效應(例如肝毒性)。
實例。本文所闡述化合物之毒性少於不具有包含至少一種非天然胺基酸之連接體之化合物。測試化合物係以相等劑量靜脈內投與葉酸鹽缺乏型大鼠。如圖19中所顯示，本文所闡述包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之共軛物(例如EC1496)之毒性少於不包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之相應共軛物(例如比較實例EC0746)。
實例。最大耐受劑量(MTD)。本文所闡述包括包含至少一種非天然胺基酸之連接體之共軛物化合物顯示高MTD，該等MTD較不具有包含一或多種非天然胺基酸之連接體之化合物有所改良。測試化合物係在雌性Sprague-Dawley大鼠中兩週一次靜脈內投與2週。對比化合物EC0531具有0.33μmol/kg之MTD，而EC1456具有至少0.51μmol/kg之MTD，改良65%，如圖20中所顯示。以等於或低於MTD之劑量投與EC1456，未觀察到組織病理學改變。

Claims (46)

  1. 一種式B-L(D)x之化合物，或其醫藥上可接受之鹽，其中B係細胞表面受體結合及/或靶向配體之基團，D在每一情形下皆係獨立選擇之藥物之基團，x係選自1、2、3、4及5之整數；且L係包含一或多種非天然胺基酸之多價可釋放連接體；且其中B共價附接至L，且L共價附接至每一D；且其中該化合物並不為具有以下各式之任一者或任一子群或子集： 及/或其中該化合物並不為具有下式者 及/或其中該化合物並不為具有以下各式之任一者或任一子群或子集： 及/或其中該化合物並不為具有以下各式之任一者或任一子群或子集： 及/或其中該化合物並不為具有下式者 及/或上述之任一組合；或其任一醫藥上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其中至少一種非天然胺基酸具有D-組態。
  3. 如請求項1之化合物，其中至少一種非天然胺基酸係選自D-丙胺酸、D-天冬胺酸、D-天冬醯胺、D-半胱胺酸、D-麩胺酸、D-苯 丙胺酸、D-組胺酸、D-異白胺酸、D-離胺酸、D-白胺酸、D-甲硫胺酸、D-脯胺酸、D-麩醯胺酸、D-精胺酸、D-絲胺酸、D-蘇胺酸、D-纈胺酸、D-色胺酸、D-酪胺酸及D-鳥胺酸，及其任何胺基酸衍生物。
  4. 如請求項1中任一項之化合物，其中L包含兩種或更多種非天然胺基酸。
  5. 如請求項1之化合物，其中L包含三種或更多種非天然胺基酸。
  6. 如請求項1之化合物，其中L包含四種或更多種非天然胺基酸。
  7. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中該配體係葉酸鹽受體結合配體。
  8. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中該配體係包含D-麩胺醯基之葉酸鹽。
  9. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L進一步包含一或多個二硫化物。
  10. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L進一步包含一或多個二價親水基團。
  11. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L進一步包含一或多個二價聚氧基。
  12. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L進一步包含一或多個二價多羥基。
  13. 如請求項12之化合物，其中該等多羥基中之至少一者具有下式CH2-(CH(OH))n-CH2-OH其中n係選自1、2、3、4、5及6。
  14. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L包含二價聚麩胺酸基團，其中至少一個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
  15. 如請求項14之化合物，其中該至少一個麩胺酸係D-麩胺酸。
  16. 如請求項15之化合物，其中該至少一個麩胺酸係未經取代之D-麩胺酸。
  17. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L包含二價聚(D-麩胺酸)基團，其中至少一個麩胺酸與胺基多羥基形成醯胺。
  18. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L包含式(K-L)d之二價基團，其中K係二價D-麩胺酸基團，L係與胺基多羥基形成醯胺之二價L-麩胺酸基團，且d係1、2、3或4。
  19. 如請求項14之化合物，其中該至少一個胺基多羥基具有下式NH-CH2-(CH(OH))m-CH2-OH其中m係選自1、2、3、4、5及6。
  20. 如請求項17之化合物，其中該至少一個胺基多羥基具有下式NH-CH2-(CH(OH))m-CH2-OH其中m係選自1、2、3、4、5及6。
  21. 如請求項14之化合物，其中該至少一個胺基多羥基具有下式NH-CH2-(CH(OH))m-R其中m係選自1、2、3、4、5及6；且R係H、烷基、環烷基或芳基烷基。
  22. 如請求項17之化合物，其中該至少一個胺基多羥基具有下式NH-CH2-(CH(OH))m-R其中m係選自1、2、3、4、5及6；且R係H、烷基、環烷基或芳基烷基。
  23. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L包含下式之二價基團S-CH2CH2-O-C(O)。
  24. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中L包含下式之二價基團S-S-CH2CH2-O-C(O)。
  25. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中x係1。
  26. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中至少一種藥物係細胞毒性劑。
  27. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中至少一種藥物係癌症治療劑。
  28. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中至少一種藥物係微管溶素(tubulysin)。
  29. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中至少一種藥物係發炎治療劑。
  30. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中至少一種藥物係二氫葉酸鹽還原酶抑制劑。
  31. 如請求項1至6中任一項之化合物，其中至少一種藥物係雷帕黴素之哺乳動物靶標(mammalian target of rapamycin，mTOR)之抑制劑。
  32. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中B-L係下式之基團
  33. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中B-L係下式之基團
  34. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中B-L係下式之基團
  35. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中B-L係下式之基團
  36. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中該化合物具有式EC1456 或其醫藥上可接受之鹽。
  37. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中該化合物具有式EC1669 或其醫藥上可接受之鹽。
  38. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之化合物，及一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合。
  39. 一種單位劑量或單位劑型組合物，其包含治療有效量之一或多種如請求項1至6中任一項之化合物，視情況與一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合之組合。
  40. 一種組合物，其用於治療宿主動物中之癌症或發炎，該組合物包含治療有效量之一或多種如請求項1至6中任一項之化合物；或一種醫藥組合物，其包含治療有效量之一或多種如請求項1至6中任一項之化合物，其視情況進一步包含一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合。
  41. 一種以一或多種如請求項1至6中任一項之化合物視情況與一或多種載劑、稀釋劑或賦形劑或其組合之組合之用途，其用以製造用於治療宿主動物之癌症或發炎之醫藥。
  42. 如請求項41之用途，其中該癌症係耐藥性癌症。
  43. 如請求項41之用途，其中該癌症係卵巢癌。
  44. 如請求項41之用途，其中該癌症係乳癌。
  45. 如請求項41之用途，其中該癌症係非小細胞肺癌。
  46. 如請求項41之用途，其中該癌症係肝細胞癌瘤或肝細胞癌。
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