TW201519902A - 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白：治療β細胞再生之方法及功能 - Google Patents

Abstract

提供於試管內、活體內及活體外改善β細胞功能和促進胰臟β細胞增殖的組合物及使用方法，本發明之活性劑包含絲胺酸蛋白酶抑制蛋白家族肽類(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)、絲胺酸蛋白酶抑制蛋白家族之肽類，及編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白家族肽類之核酸的功能和結構類似物，以及其活性片段。

Description

絲胺酸蛋白酶抑制蛋白：治療β細胞再生之方法及功能

本發明係根據國立衛生研究院授予授權號RO1 DK607536的政府支持創作，政府對本發明具有一定之權利。

本發明涉及於試管內、活體內及活體外改善β細胞功能和促進胰臟β細胞增殖的組合物及使用方法，本發明之活性劑包含絲胺酸蛋白酶抑制蛋白家族肽類(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)、絲胺酸蛋白酶抑制蛋白家族之肽類，及編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白家族肽類之核酸的功能和結構類似物，以及其活性片段。

糖尿病在已開發及開發中國家已到達流行病的程度，且治療失控的高血糖症所造成併發症患者的成本是世界主要的經濟負擔，一種有前景但仍然未實現之改善糖尿病療法的目標是識別可促進胰臟β細胞(β細胞)再生之新因子，其長期目標為增加第一或第二型糖尿病患者功能性β細胞質量，功能性β細胞質量減少是這兩種形式糖尿病及與糖尿病相關肥胖症的核心特徵(Muoio,D.M.,and Newgard,C.B.(2008).Mechanisms of disease：molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9,193-205)。β細胞自身免疫性破壞是第一型糖尿病β細胞損失的主要原因，而β細胞無法補償細胞周圍胰島素抗性，導致第二型糖尿病失控的高血糖症。

因此，需要能有效地促進β細胞增殖的組合物和方法，特別是需要改進β細胞功能的受試者。

治療策略旨在增加β細胞質量，數十年的研究指出β細胞具備補償生理性(懷孕)和病理性(肥胖症)兩種胰島素抗性的能力(Ogilvie,R.F.(1933).The islands of langerhans in 19 cases of obesity.J.Pathol.Bacteriol.37,473-481；Van Assche,F.A.,et al.,(1978).A morphological study of the endocrine pancreas in human pregnancy.Br.J.Obstet.Gynaecol.85,818-820)。雖然人類和囓齒類β細胞的增生已被證明可經由已存在的β細胞自我複製而產生(Dor,Y.,et al.,(2004).Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.Nature 429,41-46；Meier,J.J.,et al.,(2008).Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.Diabetes 57,1584-1594；Teta,M.,et al.,(2007).Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors.Dev.Cell 12,817-826)，即使量低，尤其是在胰島素抗性的情況下，可調節此過程的假設生長因子之來源仍然不明。其中β細胞質量可能的系統性調節因子為腸源性腸促胰液素，諸如：類升糖素肽-1(GLP-1)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)(Renner,S.,et al.,(2010).Glucose intolerance and reduced proliferation of pancreatic beta-cells in transgenic pigs with impaired glucose-dependent insulinotropic polypeptide function.Diabetes 59,1228-1238.Glucose intolerance and reduced proliferation of pancreatic beta-cells in transgenic pigs with impaired glucose-dependent insulinotropic polypeptide function.Diabetes 59,1228-1238；Saxena,R.,et al.；GIANT consortium；MAGIC investigators.(2010).Genetic variation in GIPR influences the glucose and insulin responses to an oral glucose challenge.Nat.Genet.42,142-148)，源自脂肪細胞的脂肪細胞激素，包括：瘦素(Morioka,T.,et al.,(2007).Disruption of leptin receptor expression in the pancreas directly affects beta cell growth and function in mice.J.Clin.Invest.117,2860-2868)和脂聯素(Holland,W.L.,et al.,(2011).Receptor-mediated activation of ceramidase activity initiates the pleiotropic actions of adiponectin.Nat.Med.17,55-63)，源自肌肉細胞的肌肉細胞激素，諸如：介白素-6(Ellingsgaard,H.,et al.,(2008).Interleukin-6 regulates pancreatic alpha-cell mass expansion.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,13163-13168；Suzuki,T.,et al.,(2011).Interleukin-6 enhances glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells：potential involvement of the PLC-IP3-dependent pathway.Diabetes 60,537-547)，源自巨噬細胞的細胞介素，包括：介白素-1b、干擾素γ和腫瘤壞死因子-α(Wang,C.,et al.,(2010).Cytokines in the Progression of Pancreatic b-Cell Dysfunction.Int.J.Endocrinol.2010,515136)，骨源性骨鈣化素(Ferron,M.,et al.,(2008).Osteocalcin differentially regulates beta cell and adipocyte gene expression and affects the development of metabolic diseases in wild-type mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,5266-5270)，甲狀腺衍生的T3/T4激素(Jörns,A.,et al.,(2010).Beta cell mass regulation in the rat pancreas through glucocorticoids and thyroid hormones.Pancreas 39,1167-1172；Verga Falzacappa,C.,et al.,(2010).The thyroid hormone T3 improves function and survival of rat pancreatic islets during in vitro culture.Islets 2,96-103)，血小板衍生生長因子(PDGF)(Chen,H.,et al.,(2011).PDGF signaling controls age-dependent proliferation in pancreatic b-cells.Nature 478,349-355)，血清素(Kim,H.,et al.,(2010).Serotonin regulates pancreatic beta cell mass during pregnancy.Nat.Med.16,804-808)，及纖維母細胞生長因子21(Wente,W.,et al.,(2006).Fibroblast growth factor-21 improves pancreatic beta-cell function and survival by activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Akt signaling pathways.Diabetes 55,2470-2478)已分別包含在內。然而，在周邊血液中這些已知因子缺乏顯著和一致的變化，因此可以充分考慮具胰島素抗性的LIRKO(肝臟胰島素受器基因剔除)小鼠模型中β細胞的增殖(參見表1)，促使我們去探索一種源自胰島素抗性肝臟的尚未確定因子之存在。

整合的器官連結交流可調控能量衡定之關鍵環節，且其失調可能造成代謝紊亂，諸如：肥胖症和糖尿病。為了測試因應胰島素抗性而肝臟和胰小島之間的連結交流可調節β細胞生長的假設，我們使用肝臟特異性胰島素受器基因剔除(LIRKO)小鼠，一種表現劇烈胰島增生的獨特模式動物，使用互補活體內連體動物和移殖試驗，以及試管內胰島培養的方法，我們證明體液的、非神經性、非細胞自主性因子可誘導LIRKO小鼠的β細胞增殖。

此外，我們已經發現在活體外試驗中，一種肝細胞源性因子刺激小鼠和人類β細胞增殖，與周圍的葡萄糖和胰島素濃度無關。這些結果顯示於胰島素抗性狀態下，肝臟作為一種β細胞生長因子的重要來源。

絲胺酸蛋白酶抑制因子B1(SerpinB1)是一種42仟道耳頓(kD)的蛋白質，已知可調節嗜中性球蛋白酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、蛋白酶-3、凝乳酶、胰凝乳蛋白酶及胰舒血管素-3的活性，因此，推測絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的功用為細胞蛋白質水解。於人類，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1也被稱為白血球彈性蛋白酶抑制蛋白(LEI)或單核球/嗜中性球彈性蛋白酶抑制蛋白(M/NEI)，並由一種單一的絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1基因(Serpinb1)所編碼。四種鼠類同源物已被選殖，包括絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1a基因(Serpinb1a)、絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1b基因(Serpinb1b)、絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1c基因(Serpinb1c)及絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1d基因(Serpinb1d)，且絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1a基因是人類絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1基因的異種同源基因(Benarafa et al.,2002)。於本發明中，使用來自LIRKO小鼠的血清、淋巴細胞條件培養液(LCM)及肝細胞條件培養液(HCM)樣本經由基因晶片分析和蛋白質體學篩選，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1被確認為β細胞生長因子的頭號候選者，我們最近的研究指出一種血清因子作為一個潛在的促增殖候選者之結果支持此發現。此外，我們以酵素免疫測定法證實在LIRKO血清中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的流通濃度被調高，為了直接測試絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1對β細胞增殖的影響，採用西維來司他(Sivelestat)及GW311616A(絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的功能性類似物，亦即絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1活性的藥理模仿物)及絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1，顯示西維來司他、GW311616A及絲胺酸 蛋白酶抑制蛋白B1以劑量依存的方式直接促進活體內和試管內胰島β細胞之增殖。

關於絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1在β細胞生理作用的可能「直接」功用的早期觀測結果，證實在施打促胰島素分泌素(Exendin-4)或部分胰臟切除的小鼠再生胰臟中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的mRNA濃度通常會增加，這些結果表明促胰島素分泌素及部分切除胰腺後引發的β細胞增殖與絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1活性有關(見De León,et al.,Identification of transcriptional targets during pancreatic growth after partial pancreatectomy and exendin-4 treatment.Physiol Genomics.2006,24：133-143)，亦使用晶片研究說明絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1在β細胞生物學上的重要性。另據報告，β細胞轉錄因子pdx-1結合至絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1基因座近端啟動子，暗示絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1在調節pdx-1作用於胰臟β細胞的功能上可能扮演的角色(見Sachdeva,et al.,Pdx1(MODY4)regulates pancreatic beta cell susceptibility to ER stress.PNAS.2009,106(45)：19090-19095)。然而，這些因子沒有表現參與絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1於β細胞的增殖作用，而不支持調查此方向之建議或動機。

本發明涉及更多實施方式，其概述如下：於一代表實例中，本發明涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其一種類似物，以作為藥物。

於另一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於再另一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物。

於再另一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的結構性類似物。

於進一步代表實例中，該研究對象罹患糖尿病。

於更進一步代表實例中，該研究對象存在罹患糖尿病的風險。

在本發明的另一方面，其涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或它的一種類似物，以改善研究對象之β細胞功能的一種方法。

於另一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於再另一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物。

於進一步代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的結構性類似物。

在更進一步代表實例中，該研究對象罹患糖尿病。

在另更進一步的代表實例中，該研究對象存在罹患糖尿病的風險。

在本發明的另一方面，其涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或它的一種類似物，以促進研究對象之胰臟β細胞增殖的一種方法。

於另一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於再另一代表實例中，該胰臟β細胞群位於活體內。

於另一代表實例中，該胰臟β細胞群位於試管內。

於進一步代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物。

於更進一步代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的結構性類似物。

於更進一步代表實例中，測得該研究對象升糖控管良好表示活體內胰臟β細胞增殖作用良好。

在本發明的另一方面，其涉及一種表現構築體，該構築體編碼一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其類似物，以改善研究對象之β細胞功能的一種方法。

於一代表實例中，上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於另一代表實例中，上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽類似物係一種已知的功能性類似物。

於再另一代表實例中，上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽類似物係一種已知的結構性類似物。

於進一步代表實例中，該研究對象罹患糖尿病。

於更進一步代表實例中，該研究對象存在罹患糖尿病的風險。

於更進一步代表實例中，其涉及上述一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或它的一種類似物的用途，以製造一種改善研究對象β細胞功能的藥物。

本發明另一方面涉及前文所提到的用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

本發明再另一方面涉及前文所提到的用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物。

本發明再另一方面涉及前文所提到的用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的結構性類似物。

本發明再另一方面涉及前文所提到的用途，其中該研究對象罹患糖尿病。

本發明再另一方面涉及前文所提到的用途，其中該研究對象具有罹患糖尿病的風險。

本發明另一方面涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其一種類似物的用途，以製造一種促進研究對象β細胞增殖的藥物。

於一代表實例中，其涉及上述用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於另一代表實例中，其涉及上述用途，其中該胰臟β細胞群位於活體內。

於再另一代表實例中，其涉及上述用途，其中該胰臟β細胞群位於試管內。

於進一步代表實例中，其涉及上述用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物。

於進一步代表實例中，其涉及上述用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的結構性類似物。

於進一步代表實例中，其涉及上述用途，其中經由測得該研究對象升糖控管良好表示活體內胰臟β細胞增殖作用良好。

本發明另一方面涉及使用一種表現構築體，該構築體編碼一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其類似物，以製造一種改善研究對象β細胞功能的藥物。

於一代表實例中，其涉及上述用途，其中上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於另一代表實例中，其涉及上述用途，其中上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽類似物係一種已知的功能性類似物。

於再另一代表實例中，其涉及上述用途，其中上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽類似物係一種已知的結構性類似物。

於再另一代表實例中，其涉及上述用途，其中該研究對象罹患糖尿病。

於再另一代表實例中，其涉及上述用途，其中該研究對象具有罹患糖尿病的風險。

本發明另一方面發明涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其類似物，以改善研究對象之β細胞功能的一種方法，上述方法包含：a)提供i)一個需要改善β細胞功能的研究對象，及ii)位於一個藥物性載體內達治療量的一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其類似物；b)經施用或導致被施用於上述研究對象，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或類似物從而改善該研究對象之β細胞功能。

於一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於另一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物，或一種已知的結構性類似物。

於再另一代表實例中，該研究對象罹患糖尿病，或具有罹患糖尿病的風險。

本發明另一方面發明涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其類似物，以促進胰臟β細胞增殖的一種方法，上述方法包含：a)提供i)一群胰臟β細胞，及ii)位於一個藥物性載體內的一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或其活性片段，或其類似物；b)以上述絲胺酸蛋白酶抑制蛋白之胜肽或類似物接觸該群胰臟β細胞，從而促進胰臟β細胞增殖。

於一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於一代表實例中，該群胰臟β細胞位於活體內。

於另一代表實例中，該群胰臟β細胞位於試管內。

於一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物，或一種已知的結構性類似物。

於一代表實例中，測得該研究對象升糖控管良好表示活體內胰臟β細胞增殖作用良好。

本發明另一方面發明涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其類似物，以改善研究對象之β細胞功能的一種方法，上述方法包含：a)提供i)一個需要改善β細胞功能的研究對象，及ii)位於一個藥物性載體內的一種編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其胜肽類似物的表現構築體；b)經施用或導致被施用於上述研究對象，該表現構築體編碼一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或類似物，從而改善該研究對象之β細胞功能。

於一代表實例中，上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於一代表實例中，上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物，或一種已知的結構性類似物。

於一代表實例中，該研究對象罹患糖尿病，或具有罹患糖尿病的風險。

本發明另一方面涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或其活性片段，用於作為一種胰島素抗性及/或β細胞增殖的診斷標記。

於一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

本發明再另一方面涉及診斷研究對象胰島素抗性及/或β細胞增生作用增強的一種方法，上述方法包含：a)判定由上述研究對象獲得樣本中的一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或其活性片段的表現量；及b)比較步驟a)之表現量與對照組樣本中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽及其活性片段之表現量，其中，與對照組樣本表現量相較，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或其活性片段表現量增加，則表示胰島素抗性及/或β細胞增生作用增強。

於一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於一代表實例中，該表現量取決於mRNA或蛋白質的量。

於一代表實例中，該樣本係血清或血漿。

於一代表實例中，該對照組樣本係自一個健康個體或一群健康個體獲得。

本發明另一方面涉及一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白特異性黏合劑或絲胺酸蛋白酶抑制蛋白特異性核酸分子，用於診斷研究對象胰島素抗性及/或細胞增生作用增強的方法。

於一代表實例中，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。

於一代表實例中，該黏合劑係一種抗體或其一種抗原結合片段。

於一代表實例中，該核酸分子係一種引子或探針。

圖1顯示LIRKO小鼠選擇性的β細胞增殖。於犧牲實驗動物5小時之前，將3至4月齡的LIRKO及對照組小鼠腹膜內注射溴化去氧尿嘧啶(BrdU)(100毫克/公斤體重)，之後將組織進行切片、固定，及染色，如圖所示。(A)將胰臟切片針對胰島素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、胰島素/Ki67蛋白/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚、胰島素/末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記(TUNEL)，或升糖素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚進行免疫染色，如圖所示；(B)β細胞質量定量；(C及D)溴化去氧尿嘧啶(+)胰島素(+)細胞與Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之定量：於對照組及LIRKO胰臟中分別計算到每一小鼠有2,000及5,000個胰島素(+)細胞；(E)末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記(+)胰島素(+)細胞之定量：於對照組及LIRKO胰臟中分別計算到每一小鼠有2,000及5,000個胰島素(+)細胞；(F)溴化去氧尿嘧啶(+)升糖素(+)細胞之定量：於對照組及LIRKO胰臟中分別計算到每一小鼠有2,000及5,000個胰島素(+)細胞；(G)於指定組織內細胞核溴化去氧尿嘧啶(+)之定量：於肝臟、腎臟、脾臟，及肺臟中計算到每一小鼠有4,000-5,000個細胞，而於內臟(Visc.)與皮下(Sc.)脂肪組織及骨骼肌(Sk)中計算到每一小鼠有1,500個細胞；(H)溴化去氧尿嘧啶染色之組織切片中增殖細胞的示例圖像，數據表示平均值±均值標準誤差，*p% 0.05與***p% 0.001(每一組個數為6(n=6))，亦參見圖6及表2。

圖2顯示循環的非神經性非自律性因子促使LIRKO小鼠β細胞複製。(A)連體動物實驗簡圖，亦參見圖7、8及9；(B-E)於犧牲實驗動物5小時之前，將單隻及連體模式小鼠腹膜內注射溴化去氧尿嘧啶(100毫克/公斤體重)，之後將胰臟切片，並針對胰島素、溴化去氧尿嘧啶，及4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚進行免疫染色；(F)溴化去氧尿嘧啶(+)胰島素(+)細胞之定量：將間隔80毫米的三個切片進行分析，並在每一組中計算到介於2,000及10,000個細胞(每一連體動物組中n=5-6)；(G)移殖實驗簡圖；(H)胰島移植物中溴化去氧尿嘧啶(+)胰島素(+)細胞之定量，如圖所示：將3至6個胰島移植物切片進行分析，並在每一組中計算到介於2,000及10,000個細胞(每一組n=3-5)，數據表示平均值±均值標準誤差，*p% 0.05。

圖3顯示LIRKO血清於活體內引發有選擇性的β細胞複製作用，於第1、3及5日，對5-6週齡小鼠每日兩次腹膜內注射150毫升來自6月齡對照組或LIRKO小鼠之血清，於第2、4及6日，腹膜內注射溴化去氧尿嘧啶(100毫克/公斤體重)，於犧牲實驗動物5小時之前，最後一次注射溴化去氧尿嘧啶，並將組織進行切片以供免疫染色研究。(A)實驗設計簡圖；(B及C)示例圖像及溴化去氧尿嘧啶(+)胰島素(+)細胞之定量：將切片間隔80毫米的兩個切片進行分析，並在每一隻動物中計算到至少4,000個胰島素(+)細胞；(D及E)示例圖像及溴化去氧尿嘧啶(+)升糖素(+)細胞之定量：在每一隻動物中計算到400-600個升糖素(+)細胞；(F及G)示例圖像及末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記(+)胰島素(+)細胞之定量：在每一隻動物中計算到至少2,000個胰島素(+)；(H)示例圖像及於指定組織內細胞核溴化去氧尿嘧啶(+)之定量：在每一隻動物中，於肝臟、腎臟、脾臟，及肺臟的切片中計算到4,000-5,000個細胞，並於內臟(Visc.)與皮下(Sc.)脂肪組織及骨骼肌的切片中計算到1,500個細胞，數值代表平均值±均值標準誤差，*p% 0.05(每一組n=3)。

圖4顯示LIRKO血清於試管內增進小鼠與人類胰島β細胞複製作用，以對照組或LIRKO血清刺激5-6週齡小鼠的胰島達48小時，將胰島包埋於瓊脂糖凝膠中，並用於免疫染色研究，將培養基進行葡萄糖及胰島素之測定，WT：野生型(wild type)。(A)實驗流程簡圖，亦參見圖10及11；(B)被來自3月齡動物之血清(上圖)及12月齡動物之血清(下圖)刺激的小鼠胰島之示例圖像；(C)圖4B的Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之定量：對切片間隔80毫米的兩組三次連續切片進行分析，在每一實驗組中計算到至少4,000-5,000個細胞(每一組n=5)；(D)圖4B的末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記(+)胰島素(+)細胞之定量：在每一組中計算到至少3,000-4,000個細胞(每一組n=5)；(E及F)被對照組血清或LIRKO血清刺激24小時之健康及第二型糖尿病供給者之胰島的示例圖像，亦參見表3；(G)圖4E及4F的Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之定量：對間隔80毫米的兩組三次連續切片進行分析，在每一組中計算到至少3,000-4,000個細胞，亦參見表3，數據代表平均值±均值標準誤差，*p% 0.05(參見實驗步驟中血清刺激作用與人類胰島研究之章節)。

圖5顯示肝細胞衍生因子於試管內刺激小鼠及人類胰島β細胞複製，以來自對照組或LIRKO小鼠的肝培植體條件培養液(LECM)或肝細胞條件培養液(HCM)刺激5-6週齡小鼠的胰島達24小時，將胰島包埋於瓊脂糖凝膠中，之後以免疫染色法進行分析，將培養基進行葡萄糖及胰島素之測定。(A)實驗流程簡圖，亦參見圖11；(B)被來自3月齡動物之肝培植體條件培養液(上圖)及12月齡動物之肝培植體條件培養液(下圖)刺激的小鼠胰島之示例圖像；(C)Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞(上圖)及末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記(+)胰島素(+)細胞(下圖)之定量：在每一實驗組中計算到至少3,000-5,000個細胞(每一組n=5)；(D)以來自對照組或LIRKO小鼠的肝培植體條件培養液處理24小時的健康人類供給者胰島(上圖)與第二型糖尿病供給者胰島(下圖)之示例圖像，亦參見表3；(E)圖5D的Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之定量：在對照組胰島中，於每一實驗條件下(對照組肝培植體條件培養液相對於LIRKO肝培植體條件培養液)計算到介於3,000及4,000個細胞，而在第二型糖尿病胰島中，於每一實驗組中計算到至少2,000個細胞，亦參見表3；(F)以來自6月齡小鼠之對照組或LIRKO小鼠的肝培植體條件培養液，或纖維母細胞條件培養液(FCM)刺激的小鼠胰島之示例圖像；(G)Ki67(+)胰島素(+)細胞(上圖)及末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記(+)胰島素(+)細胞(下圖)之定量：在每一實驗組中計算到介於4,000及5,000個細胞(對照組肝培植體條件培養液相對於LIRKO肝培植體條件培養液)(每一組n=5)；(H)以對照組或LIRKO肝細胞條件培養液刺激的第二型糖尿病供給者胰島之示例圖像，亦參見表3；(I)圖5H的Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之定量：於每一實驗條件下計算到至少2,000個細胞，亦參見表3，數據代表平均值±均值標準誤差，*p% 0.05(參見實驗步驟中肝培植體條件培養液刺激作用、肝細胞條件培養液刺激作用，及人類胰島研究之章節)。

圖6顯示來自對照組及LIRKO小鼠之組織切片的蘇木精與伊紅染色，這些資料與圖1及表2的資料有關連，其代表LIRKO小鼠組織之蘇木精與伊紅染色的組織學研究結果。

圖7顯示每週測得的連體動物體重與血糖值，這些數據與顯示於圖2A的資料有關，該數據表示兩組小鼠體重增加，且顯示在超過16周的期間中，連體動物模型有相似的血糖值。

圖8顯示連體動物配對在術前及術後的血糖及胰島素測定結果，這些數據與顯示於圖2A的資料有關，該數據表示連體動物模型在16週連體生活期間之前與之後的胰島素及血糖值。

圖9顯示在連體動物實驗中的磷酸組織蛋白H3(pHH3)(+)胰島素(+)細胞之定量，這些數據與顯示於圖2A的資料有關，這些數據支持圖2A中關於在不同連體動物模型內經由溴化去氧尿嘧啶嵌入作用確認β細胞增殖的發現。

圖10顯示以血清刺激的小鼠胰島內Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之定量，這些資料與圖4A的資料有關連，此圖呈現的時間過程研究涉及圖4A的血清刺激作用實驗。

圖11顯示培養基中葡萄糖及胰島素的化驗結果，這些數據與圖4A及5A的資料有關連，這些資料涉及試管內胰島培養實驗，其表示在圖4A中胰島與血清培養之前及之後，培養基中葡萄糖及胰島素的值，以及在圖5A中胰島與肝培植體條件培養液或肝細胞條件培養液培養之前及之後，培養基中葡萄糖及胰島素的值。

圖12顯示於試管內刺激胰島β細胞複製。

圖13顯示鼠類絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的示例核苷酸序列(序列識別碼：1；對應的胺基酸序列為序列識別碼：3)。

圖14顯示人類絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的示例核苷酸序列(序列識別碼：2；對應的胺基酸序列為序列識別碼：10)。

圖15顯示經奈米沸石濃縮之前或之後的來自對照組及LIRKO小鼠的肝細胞條件培養液(HCM)之聚丙烯醯胺膠體電泳分析結果，以銀染色檢測蛋白質，分子量標示於右側。

圖16(A與B)顯示經由液相層析質譜儀鑑定小鼠絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。(A)顯示由液相層析質譜儀鑑定之小鼠絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的胰蛋白酶肽序列(粗體部分)(小鼠絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1 胺基酸序列為序列識別碼：3)；(B)顯示來自LIRKO小鼠之肝細胞條件培養液的蛋白質體分析結果。

圖17顯示LIRKO及野生型小鼠肝臟樣本的絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1a基因表現(以針對絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1a的基因晶片探針組1416318之基因表現強度的箱型圖與條狀圖資料)。

圖18顯示加入LIRKO血清，Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之數量增加兩倍，而LIRKO血清的複製能力被之後的熱不活化降低80%。

圖19(A-C)顯示來自高脂飲食與肥胖基因(ob/ob)小鼠之血清及肝培植體條件培養液刺激β細胞複製，以來自飼料飲食(CD)或高脂飲食(HFD)，肥胖基因或對照組(野生型)雄性小鼠之血清或肝培植體條件培養液(LECM)刺激5-6週齡小鼠之胰島，24小時後，將胰島包埋於瓊脂糖凝膠中，以供免疫染色研究。(A)實驗流程簡圖；(B)對被來自飼料或高脂飲食之雄性小鼠血清或肝培植體條件培養液刺激的胰島進行胰島素/Ki67蛋白/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚，或升糖素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚之免疫染色，胰島素(+)Ki67蛋白(+)細胞之定量；(C)對被來自肥胖基因或對照組雄性小鼠血清或肝培植體條件培養液刺激的胰島進行胰島素/Ki67蛋白/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚，或升糖素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚之免疫染色，胰島素(+)Ki67蛋白(+)細胞之定量。

圖20(A-D)顯示絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1之擬似藥物增進活體內胰島β細胞複製，對5-6週齡小鼠給予西維來司他(Sivelestat)或GW311616A達2週，以免疫染色法評估胰島的β細胞與α細胞複製現象。(A)西維來司他給藥實驗流程簡圖；(B)來自經西維來司他刺激之動物，並對胰島素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚或升糖素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚免疫染色的胰臟切片之定量；(C)GW311616A給藥實驗流程簡圖；(D)來自經GW311616A處理之雄性小鼠，並對胰島素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚或升糖素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚免疫染色的胰臟切片之定量。

圖21(A及B)顯示絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1直接作用，促進β細胞特異性複製，將5-6週齡雄性小鼠胰島與不同分子培養48小時，以免 疫染色法評估胰島β細胞複製現象。(A)實驗流程簡圖；(B)以西維來司他或GW311616A或對照組條件刺激24小時的人類胰島之示例圖像。

圖22(A-G)顯示彈性蛋白酶抑制因子GW311616A於活體內增加β細胞質量，5-6週齡雄性小鼠每日灌食GW311616A或載體(水)達2週，於第2週期間對小鼠注射溴化去氧尿嘧啶(100毫克/公斤體重)，並於犧牲動物之前5小時最後一次注射溴化去氧尿嘧啶，收取胰臟及其他組織以供形態學研究。(A)GW311616給藥實驗流程簡圖；(B)來自經GW311616刺激之動物，並對胰島素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(上圖)，或升糖素/溴化去氧尿嘧啶/4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(下圖)免疫染色的胰臟切片；(C)β細胞質量之定量；(D)胰島素(+)溴化去氧尿嘧啶(+)細胞之定量；(E)升糖素(+)溴化去氧尿嘧啶(+)細胞之定量；(F-G)於肝臟、腎臟、脾臟、內臟與皮下脂肪組織，及骨骼肌組織中，細胞核溴化去氧尿嘧啶(+)之示例圖像與定量。

圖23(A-F)顯示彈性蛋白酶抑制因子西維來司他於活體內增進β細胞增殖，5-6週齡雄性小鼠連續灌注載體或西維來司他150或300微克/公斤/日達2週，於第2週期間對小鼠注射溴化去氧尿嘧啶(100毫克/公斤體重)，並於犧牲動物之前5小時最後一次注射溴化去氧尿嘧啶，收取胰臟以供形態學研究。(A-B)於胰島素(+)細胞中，細胞核溴化去氧尿嘧啶(+)之示例圖像與定量；(C-D))於胰島素(+)細胞中，細胞核磷酸組織蛋白H3(+)之示例圖像與定量；(E-F)於升糖素(+)細胞中，細胞核溴化去氧尿嘧啶(+)之示例圖像與定量。

圖24(A-G)顯示絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1於活體內增進β細胞質量次要於增加β細胞增殖，經由尾靜脈注射編碼增強型綠色螢光蛋白II或絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1之腺關連性病毒(AAVs)，而轉導8-10週齡雄性小鼠，轉導作用3週後，犧牲小鼠並收集血液，收取胰臟以供形態學研究。(A)研究設計簡圖；(B)循環性絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1之西方墨點轉漬法分析結果；(C)胰臟中胰島以胰島素(紅色)及4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(藍色)染色之示例圖像；(D-G)胰島素(+)細胞中，細胞核Ki67蛋白(+)、β細胞質量、血清胰島素值及血糖之定量。

圖25(A-D)顯示絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1及彈性蛋白酶抑制因子的化學藥物於試管內增進β細胞增殖，將5-6週齡雄性小鼠胰島與不同分子培養48小時，以Ki67蛋白免疫染色評估胰島β細胞複製現象。(A)以100或1000奈克/毫升人類重組絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1刺激的胰島之示例圖像；(B)以1至1000奈克/毫升重組絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1或1000奈克/毫升卵白蛋白(OVA)刺激的胰島中，Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之定量；(C)以西維來司他(50微克/毫升)或GW311616A(100微克/毫升)刺激的胰島中，Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞之示例圖像(左圖)與定量(右圖)；(D)以西維來司他或GW311616A或對照組條件刺激24小時的人類胰島之示例圖像。

圖26(A-B)顯示腺關連性病毒轉導作用7及15週之後，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1增進葡萄糖刺激的胰島素分泌作用，經由尾靜脈注射編碼增強型綠色螢光蛋白II或絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1之腺關連性病毒，而轉導8-10週齡雄性小鼠，轉導作用7及15週之後，進行活體內葡萄糖刺激的胰島素分泌作用實驗(劑量：3克/公斤體重)。

圖27顯示的資料推測絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1以一種急性胰島素抗性的模式，造成適應性增加β細胞增殖作用。(A)將15-16週齡對照組或絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1基因剔除小鼠麻醉，並皮下植入含有100微克磷酸鹽緩衝液或S961蛋白(10奈莫耳/週，達2週)的滲透壓幫浦(植入式滲透壓膠囊幫浦(ALZET))，復原後1週，將小鼠注射溴化去氧尿嘧啶(100毫克/公斤體重)；(B)每3天監測一次血糖；(C)於實驗最後，收取胰臟並對Ki67蛋白(一種增殖作用的標記蛋白)進行免疫染色；(D)胰島素(+)細胞中，Ki67蛋白(+)之定量。

圖28總結經由基因晶片與蛋白質體學分析的絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1之鑑定結果。(A)由3月齡雄性對照組或LIRKO小鼠獲取的肝臟之基因晶片分析結果(n=6)；(B)由6月齡雄性對照組或年齡相當的LIRKO動物之肝細胞條件培養液所萃取的蛋白質之蛋白質體學(液相層析質譜儀)分析結果(n=3)。

圖29(A-M)顯示的資料確認由基因晶片與蛋白質體學分析所獲得的結果。(A-C)LIRKO及對照組小鼠中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1 表現量的評估；(D-F)肝培植體條件培養液中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1之西方墨點轉漬法分析；(G)3及12月齡LIRKO及對照組小鼠血清及血漿中循環性絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的量之分析；(H-M)肥胖基因及高脂飲食(HFD)小鼠肝臟中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1表現量之評估；(N)於瘦健康個體、肥胖個體，及具非酒精性脂肪肝炎(NASH)之肥胖個體的人類血清樣本中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1表現量之評估，每一血清樣本取2微升加注入10%聚丙烯醯胺膠體電泳凝膠上，將蛋白質轉漬到硝纖維素膜上，並以兔子絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1抗體(1/1000稀釋)進行西方墨點轉漬法，使用1/3000稀釋的山羊抗兔子次級抗體，為了定量，以麗春紅S溶液將該硝纖維素膜染色(下圖)。

圖30顯示經由免疫染色法對缺乏彈性蛋白酶之小鼠(彈性蛋白酶基因剔除，ELAKO)細胞增殖作用之分析，及Ki67蛋白陽性細胞之定量。

Serpins(絲胺酸蛋白酶抑制蛋白)是一種具有高度保守三級結構，約45仟道耳頓(kD)的超級蛋白質家族，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白調節重要的細胞內與細胞外蛋白質分解活動，包括：細胞凋亡、補體活化、纖維蛋白分解，及血液凝結，本領域技術人員已知的一篇文獻綜述列舉如下：Benarafa,et al.,Characterization of Four Murine Homologs of the Human ov-serpin Monocyte Neurophil Elastase Inhibitor MNE1(SERPINB1),2002,J.Biol Chem.,277(44)：42028-42033。其他絲胺酸蛋白酶抑制蛋白及絲胺酸蛋白酶抑制蛋白之類似物亦為本領域技術人員所知，並可被搜尋，例如在www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/，及其他適宜的資料庫。

此外，本文所用專有名詞「絲胺酸蛋白酶抑制蛋白質家族」概指絲胺酸蛋白酶抑制蛋白的一個家族，其在胺基酸序列及抑制機制上相似，但它們對蛋白質分解酶的特異性可能不同，此蛋白質家族包括例如：α1-抗胰蛋白酶(A1-Pi)、血管收縮素原、卵白蛋白、抗血纖維蛋白溶酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、甲狀腺素結合蛋白、補體1去活因子、抗凝血酶III、肝素輔因子II、血纖維蛋白溶酶原去活因子、基因Y蛋白、胎盤的血纖維蛋白溶 酶原活化劑抑制因子，及大麥Z蛋白。絲胺酸蛋白酶抑制蛋白家族的一些成員可做為絲胺酸肽鏈內切酶的受質，而不是抑制因子，且一些絲胺酸蛋白酶抑制蛋白存在於植物中，其功能未知，參考例如：美國專利公開號20120195859及其中的參考文獻。

於一代表實例中，本文所用專有名詞「活性片段」意指一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(多)肽(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)的所有片段，其表現出一種細胞增殖活性，此細胞增殖活性可透過使用本文所述測定法進行確認。

依據本發明所使用的示例性(功能性)類似物包括西維來司他及GW311616A。

專有名詞「細胞的增殖」與「細胞增殖」意指由於細胞生長及細胞分裂，造成細胞數量的增加，細胞或細胞的增殖可能包括誘導休眠細胞或老化細胞分裂，並可能包括使已進行細胞分裂的細胞加速分裂。

本文所述之方法包括藥物組合物的製造及使用，其中包括經本文所述方法鑑定為活性成分的化合物，亦包括該藥物組合物本身。

藥物組合物典型包括藥物可用之載體，本文所用術語「藥理組合物」、「藥理載體」或「藥物可用之載體」包括組合物及載體，包含一或多種可與藥物給藥方式相容的載體，例如：鹽水、溶劑、分散介質、塗料、抗菌劑與抗真菌劑、等滲劑與吸收延遲劑、緩衝劑...等，附加的活性化合物亦可併入該組合物中，本文定義的適宜藥物組合物及載體包括適用於試管內的組合物及載體，例：用於診斷用途、研究用途，及於活體外處理細胞與組織。

藥物組合物通常配合其預期給藥途徑來配製，給藥途徑的例子包括注射，例：靜脈注射、皮內注射、皮下注射、口服(例：吸入劑)、經皮膚給藥(局部的)、經黏膜給藥，及直腸給藥。

適用於藥物組合物的配製方法為本領域技術人員所知，參見例如該一系列書籍Drugs and the Pharmaceutical Sciences：a Series of Textbooks and Monographs(Dekker,NY)。例如：用於非口服的、皮內注射，或皮下給藥的溶液或懸浮液可包括下列成分：一種無菌的稀釋劑，諸如：注射用的水、鹽水溶液、固定油、聚乙烯二醇類、甘油、丙二醇，或其他 合成溶劑；抗菌劑，諸如：苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯類；抗氧化劑，諸如：抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑，諸如：乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如：醋酸鹽、檸檬酸鹽，或磷酸鹽，以及調節液體滲性的藥劑，諸如：氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼調節酸鹼值，諸如：鹽酸或氫氧化鈉。該注射製劑可封裝於安瓿、拋棄式針筒，或玻璃或塑膠製成的多劑量小瓶中。

適用於注射的藥物組合物可包括無菌水溶液或分散液，及可即時製備為無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。對於靜脈注射給藥，適宜的載體包括生理食鹽水、抑菌水、蓖麻油聚氧乙烯醚^TM(巴斯夫，帕瑟伯尼，紐澤西)，或磷酸鹽緩衝液(PBS)。在所有情況下，該組合物必須無菌或可消毒的，且應為液體而易於注射，在製造及儲存狀態下，它應為穩定的，且保存上必須防止微生物，諸如：細菌及真菌的汙染。該載體可為一種溶劑或分散介質，其含有例如：水、乙醇、多元醇(例如：甘油、丙二醇，及液態聚乙二醇...等)，及其適宜的混合物，可保持適當的流動性，例如：經由使用塗料，諸如：卵磷脂，在分散狀況下經由保持必要的顆粒大小，及使用界面活性劑。可經由各種抗菌劑與抗真菌劑防止微生物作用，例如：對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉...等，在許多狀況下，它最好包括等滲劑於成分中，例如：糖類、多元醇，諸如：甘露、山梨醇，氯化鈉，該可注射組合物可經由加入延遲吸收作用的藥劑，例如：單硬脂酸鋁及明膠，而延長吸收。

無菌注射溶液的製備可經由加入溶於適當溶劑中所需量的活性化合物，及上述列舉的一種成份或成份的一種組合，假使需要，接著再過濾滅菌。一般而言，分散液的製備是經由加入活性化合物至無菌載體中，其含有一種基本分散介質，及上述列舉的所需其他成份。在用來製備無菌注射溶液的無菌粉末的例子中，最好的製法為真空乾燥及冷凍乾燥，可得到活性成份加上來自先前無菌過濾液的任何附加所需成份的粉末。

口服組合物通常包括一種惰性稀釋劑或一種可食用載體，為了口服治療給藥的效果，活性化合物可摻入賦形劑，並以片劑、錠劑，或膠囊的型式使用，例：明膠膠囊；口服組合物的製備亦可使用液態載體，以作為漱口水使用；藥物相容的黏合劑及/或佐劑材料亦可作為組合物的一部分，片劑、丸劑、膠囊、錠劑...等可含有任何下列成分，或具相似性質 的化合物：黏合劑，諸如：微晶質纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如：澱粉或乳糖；崩散劑，諸如：海藻酸、普孟鳩®(PRIMOGEL®)(澱粉乙醇酸鈉)，或玉米澱粉；潤滑劑，諸如：硬脂酸鎂或氫化植物油s；助流劑，諸如：膠態二氧化矽；甜味劑，諸如：蔗糖或糖精；或調味劑，諸如：薄荷、柳酸甲酯，或柑橙調味劑。

對於吸入給藥，可將化合物以氣溶膠噴霧的形式由加壓容器或分配器送出，該加壓容器或分配器含有適宜的推進劑，例如；氣體，諸如：二氧化碳或噴霧器，此方法說明於美國專利編號6,468,798。

本文所述治療性化合物的全身性給藥亦可經由黏膜給藥或皮膚給藥方式，對於經黏膜給藥或經皮膚給藥，製劑中使用適合滲過屏障的滲透劑，該滲透劑為本領域所知，並包括例如：用於經黏膜給藥的清潔劑、膽鹽，及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜給藥亦可經由使用鼻腔噴霧劑或栓劑來完成；對於經皮膚給藥，活性化合物被製成本領域一般已知的軟膏、油膏、凝膠，或乳膏，或製成本領域一般已知的黏合墊料。

藥物組合物亦可製成栓劑形式(例：含習用的栓劑基質，諸如：可可脂及其他甘油酯類)，用於直腸給藥的固位灌腸劑。

身為核酸或可能包含核酸(亦即編碼一或多種本發明之絲胺酸蛋白酶抑制蛋白或絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物的核酸)的治療性化合物可經由任何適宜核酸製劑的給藥方法施用，諸如：DNA疫苗，這些方法包括：基因槍、生物注射器，皮膚貼片，以及無針方法，諸如：美國專利編號6,194,389公開的微粒子DNA疫苗技術，及美國專利編號6,168,587公開的哺乳動物經皮膚無針接種粉狀疫苗。此外，尤其是如濱島等人所述可能經鼻腔內給藥，Hamajima et al.,Clin.Immunol.Immunopathol.88(2),205-10(1998)。亦可使用微脂體(例：美國專利編號6,472,375所述)及微膠囊，也可以使用可生物分解的標靶微粒子輸送系統(例：美國專利編號6,471,996所述)。

於一代表實例中，該治療性化合物與載體一同製備，載體可保護治療性化合物免於快速自身體排除，譬如：控釋製劑，包括植入物及微膠囊化輸送系統，可以使用可生物分解的、可生物相容的聚合物，諸如：乙烯醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯，及聚乳酸。 可使用本領域技術人源已知的標準技術製備此製劑，材料可購自阿爾薩公司(Alza Corporation)及華諾醫藥有限公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)。微脂體懸浮液(含有以被感染細胞為目標的微脂體，具針對病毒抗原的單株抗體)亦可作為藥物可用的載體，可依據本領域技術人員已知方法製備這些製劑，例如：美國專利編號4,522,811所述。

該藥物組合物可連同施藥說明書一起包裝於套組盒、容器、包裹或自動販售機中。

治療方法

本文所述方法包括治療葡萄糖耐受性損傷相關病症的方法，例：經由促進β細胞增殖，而改善升糖控制與胰島素敏感性，於一些具體實例中，該病症為第一型或第二型糖尿病。一般而言，該方法包括給予有此需求，或已被確認有此需求的研究對象治療有效量之本文所述治療性化合物，諸如此類的療法。

第一型糖尿病的特徵為絕對性胰島素不足，由於失去80%以上β細胞；第二型糖尿病的特徵為相對性胰島素不足，歸因於出現胰島素抗性時(亦即胰島素需求增加)β細胞質量不足，在第二型糖尿病患者中，功能衰退的β細胞質量與胰島素抗性的相對關連可因人而異。於本發明特定具體實例中，該病症為第一型糖尿病或第二型糖尿病，其中與第二型糖尿病患者的平均β細胞數相較，第二型糖尿病的特徵為更明顯的β細胞不足(例：更明顯的減少功能性β細胞質量)。

當用於上下文中，進行「治療」意指去改善與葡萄糖耐受性損傷相關病症的至少一種症狀。通常，葡萄糖耐受性損傷會導致高血糖症；因此，治療可造成恢復或接近血糖濃度正常/正常胰島素敏感性。當用於上下文中，「預防糖尿病」、「預防第一型糖尿病」，或「預防第二型糖尿病(type 2 DM)」(亦即第二型糖尿病(type 2 diabetes mellitus))，或類似病症，意為降低研究對象分別發生糖尿病、第一型糖尿病或第二型糖尿病的可能性，本領域技術人員應瞭解不要求預防性治療為100%有效，但可以替代為延遲第一型糖尿病、第二型糖尿病的發生，或是減緩症狀，例：改善葡萄糖耐受性。

可測定該化合物的劑量、毒性及療效，例：經由在細胞培養物或實驗動物中進行的標準藥物程序，例：用於測定半數致死劑量(LD50)(造成群體總數50%死亡的劑量)，及半數有效劑量(ED50)(造成群體總數50%治療有效的劑量)，介於毒性和治療效果之間的劑量比為治療指數，它可以表示為半數致死劑量/半數有效劑量的比率，表現出高治療指數的化合物較佳，雖然可以使用有毒性副作用的化合物，但應謹慎設計輸送系統，使此化合物目標訂為患部組織位置，以最小化對未感染細胞的潛在損害，並由此減少副作用。

由細胞培養分析及動物研究獲得的資料可用來制定用於人類的劑量範圍，這類化合物的劑量最好定於循環濃度的範圍內，其中涵蓋具少許或無毒性的半數有效劑量，該劑量可根據所採用的劑型和給藥途徑於此範圍內變化，對於本發明方法中使用的任何化合物，最初可由細胞培養分析估算治療有效劑量，如同於細胞培養物中確認劑量，可於動物模型中訂定劑量，以達循環血漿濃度範圍，其涵蓋半數最大抑制濃度(IC₅₀)(亦即，該濃度的測試化合物可達成半數最大化抑制症狀)，這類資訊可用來更準確的定出用於人類的有效劑量，可測量血漿值，例如：經由高效液相層析儀。

「有效量」、「治療量」或「足夠量」為一種足以造成有益效果或預想結果的量，例如：治療量是一種可達成所欲療效的量，此量可相同或不同於預防有效量，預防有效量為一種防止疾病或疾病症狀發作的必須量，有效量的給藥可一或多次給藥、敷用或配藥，組合物的治療有效量取決於所選的成份，該組合物可每日，或一日多次，或一週多次給藥，包括隔日一次給藥。本領域技術人員將理解，某些因素可能影響有效治療研究對象所需的劑量和時機，包括但不限於：疾病或病症的嚴重性、先前治療方法、研究對象的全面健康狀況及/或年齡，及其他罹患的疾病。此外，以本文所述該組合物的治療有效量治療研究對象可包括單次治療或一系列的治療。

該藥物組合物可連同施藥說明書一起包裝於套組盒、容器、包裹或自動販售機中。

於一些具體實例中，該藥物組合物被注射入組織中，例：胰臟組織或肝臟組織。

絲胺酸蛋白酶抑制蛋白的核酸

編碼本文所述胜肽的核酸分子(例如：圖13及14的序列(序列識別碼：1及序列識別碼：2)，或其一部分)可被插入到載體中，並作為表現載體與基因療法載體，其他絲胺酸蛋白酶抑制蛋白序列為本領域技術人員所知，並可被搜尋，例如在www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/，及其他類似的資料庫。適宜的功能性表現構築體與表現載體的構築方法為本領域技術人員所知，於本發明一個代表實例中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽的表現方向為圖13及14所列出的序列開放讀序框方向(參見例如：序列數據庫序列編號NM_030666.3與NM_025429.2)。無需經由過度的實驗，一種本領域常用技術將可偵測活性片段，例如：將胜肽裂解為片段，並於活體內與試管內試驗中測試該片段的活性，如下文舉例說明。相同地，如同本領域技術人員所知，表現絲胺酸蛋白酶抑制蛋白片段的構築體可被轉染進入適於反應絲胺酸蛋白酶抑制蛋白活性的初級細胞與培養細胞株中，或活體模式系統中，於下文中舉例說明。一位本領域技術人員，熟知蛋白質二級、三級和四級結構及蛋白質功能，將能夠識別適於測試的蛋白片段。

可經由例如靜脈注射、局部給藥(參見美國專利號5,328,470)，或經由立體定位注射(參見例：Chen et al.,PNAS 91：3054-3057(1994))傳送基因療法載體給研究對象，基因療法載體的藥物製劑可包含該基因療法載體溶於一種可用的稀釋劑中，或包括一種緩慢釋放的基質，該基因傳送載體包埋於其中；或者，完整的基因傳送載體可產自重組型細胞，例：反轉錄病毒載體，則該藥物製劑可包含一或多種製造該基因傳送系統的細胞。再者，反義股核酸、短小干擾RNA(siRNA)、干擾RNA(RNAi)，及微小RNA(miRNA)可用來控制目標絲胺酸蛋白酶抑制蛋白基因及相關調節胜肽的表現，反義股核酸技術、干擾RNA、短小干擾RNA及微小RNA技術為本領域技術人員所知及實行。

絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)已知存在於血漿中，使得它們有希望作為一種生物標記，以本發明學說的 觀點，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白可作為生物標記，例如：監測影響β細胞增殖及糖尿病的治療。本文公開之組合物可包括作用劑，其偵測或結合(例：專一性的偵測或結合)本文所述的一種生物標記(例：本文所述一或多種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白，及該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白家族之成員)，此作用劑可包括但不限於，例如：抗體、抗體片段、胜肽，及已知小分子作用劑。在一些例子中，該組合物可為一種套組的形式，此套組可包括一或多種可偵測或結合(例：專一性的偵測或結合)本文所述的一或多種生物標記的作用劑，及使用說明書。

基因療法

本文所述核酸，例：本文所述的一種反義股核酸，或一種編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)多肽的核酸，可被併入基因構築體中，作為基因療法流程的一部分，以傳送編碼本文所述作用劑的催動或拮抗型式的核酸，例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)，或其活性片段，或其功能性或結構性類似物。本發明特色為表現載體，用於活體內轉染及表現，例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白多肽(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)，或其活性片段，或其功能性或結構性類似物。如此組成的表現構築體可被裝載入任何生物性有效載體，例：為本領域技術人員所知的任何能夠有效傳送該成份至活體內細胞的製劑或組成物，方法包括由病毒載體插入於研究對象基因中，該載體包括：重組反轉錄病毒、腺病毒、腺關連性病毒，及疱疹單純型病毒-1，或重組的細菌或真核質體。病毒載體直接轉染細胞，質體DNA可藉由本領域技術人員已知的輔助而被傳送，例如：陽離子微脂體(例：脂質體^TM(LIPOFECTIN^TM))或被衍生化(例：被抗體綴合)、聚離胺酸綴合物、短杆菌肽、人造病毒外套膜或其他這樣的細胞內載體，以及直接注射該基因構築體，或於活體內進行磷酸鈣沉澱。

於活體內導入核酸至細胞內的一種方法是使用含有核酸的病毒載體，該核酸例如：編碼本文所述的替代途徑成份的互補DNA(cDNA)。以病毒載體傳染細胞具有絕大比例的標靶細胞可接收到核酸的 優點，此外，在病毒載體內經由例：包含於該病毒載體內的互補DNA所編碼的分子，可在已收取病毒載體核酸的細胞中充分表現。

反轉錄病毒載體及腺關連性病毒載體可作為一種重組基因傳送系統，以傳送外源基因至活體內，特別是人體內，這些載體有效率地輸送基因到細胞中，而被傳送的核酸穩定的嵌入宿主染色體DNA中。只會產生複製功能缺失之反轉錄病毒的專門細胞株(稱為「組裝細胞」)的研發，已增加反轉錄病毒對基因療法的實用性，且有缺失的反轉錄病毒被特別用於傳送基因，達到基因療法之目的(文獻綜述參見例：Miller,Blood 76：271-78(1990))。複製功能缺失的反轉錄病毒可被組裝到病毒顆粒中，經由標準技術透過使用輔助病毒，而可用來感染標靶細胞。製造重組反轉錄病毒並在試管內或活體內以此病毒感染細胞的實驗流程可參考Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,et al.,(eds.)Greene Publishing Associates,(1989),Sections 9.10-9.14，及其他標準實驗手冊。適宜的反轉錄病毒的非限定例證包括：pLJ、pZIP、pWE及pEM，為本領域技術人員所知。用來製備親嗜性及兼嗜性反轉錄病毒系統之適合的組裝病毒株的例證包括：*Crip、*Cre、*2及*Am。反轉錄病毒已被用於導入多種基因至許多不同種類細胞中，包括：試管內及/或活體內的上皮細胞(參見例如：Eglitis,et al.,Science 230：1395-1398(1985)；Danos and Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464(1988)；Wilson,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3014-3018(1988)；Armentano,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-6145(1990)；Huber,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8039-8043(1991)；Ferry,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-8381(1991)；Chowdhury,et al.,Science 254：1802-1805(1991)；van Beusechem,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7640-7644(1992)；Kay,et al.,Human Gene Therapy 3：641-647(1992)；Dai,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10892-10895(1992)；Hwu,et al.,J.Immunol.150：4104-4115(1993)；美國專利號4,868,116；美國專利號4,980,286；專利合作條約申請WO 89/07136；專利合作條約申請WO 89/02468；專利合作條約申請WO 89/05345；及專利合作條約申請WO 92/07573)。

有益於本發明的另一種病毒基因輸送系統採用腺病毒衍生載體，腺病毒的基因體可以被操縱，使得它編碼並表現所要的基因產物，但在一般病毒的裂解生命週期中，它的複製能力並不活躍，參見例如：Berkner,et al.,BioTechniques 6：616(1988)；Rosenfeld,et al.,Science 252：431-434(1991)；and Rosenfeld,et al.,Cell 68：143-155(1992)。源自腺病毒品系Ad型5 d1324或腺病毒的其他品系(例：Ad2、Ad3、Ad7...等)之適宜腺病毒載體為本領域技術人員所知。重組腺病毒在某些情況下是有利的，由於它們無法感染非分裂細胞，並可用來感染多種細胞類型，包括上皮細胞(Rosenfeld,et al.(1992)，見上)；再者，該病毒顆粒相對穩定，並可經受純化及濃縮，以及如上所述，可以進行修飾以便改變感染的範圍；此外，被導入的腺病毒DNA(及其中含有的外源DNA)不嵌入到宿主細胞的基因體中，而保持游離基因體狀態，從而避免在導入DNA插入宿主基因體(例：反轉錄病毒DNA)的位置插入式誘變造成的潛在問題；況且，相對於其他基因輸送載體，腺病毒基因體對外源DNA的的承載能力大(可達8仟鹼基對)(Berkner,et al.(1998)，見上；Haj-Ahmand and Graham,J.Virol.57：267(1986))。

再另一種幫助輸送研究對象基因的病毒載體系統為腺關連性病毒(AAV)，腺關連性病毒是一種天然存在的缺陷型病毒，需要另一種病毒，諸如：腺病毒或皰疹病毒，作為輔助病毒以進行有效的複製及生產性生命週期(文獻綜述參見Muzyczka,et al.,Curr.Topics in Micro.and Immunol.158：97-129(1992))。它也是少數的一種可嵌入其DNA至非分裂細胞中，並展現高頻率穩定嵌入作用的病毒(參見例如：Flotte,et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-356(1992)；Samulski,et al.,J.Virol.63：3822-3828(1989)；and McLaughlin,et al.,J.Virol.62：1963-1973(1989))。含有少至300鹼基對的腺關連性病毒載體可被組裝成一體，可容納外源DNA的空間限於約4.5kb(仟鹼基對)，Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.5：3251-3260(1985)記載的一種腺關連性病毒載體可被用來導入DNA至細胞中，經由使用腺關連性病毒載體，多種核酸已被導入不同細胞種類中(參見例如：Hermonat,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470(1984)；Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4：2072-2081(1985)；Wondisford,et al.,Mol. Endocrinol.2：32-39(1988)；Tratschin,et al.,J.Virol.51：611-619(1984)；and Flotte,et al.,J.Biol.Chem.268：3781-3790(1993))。

除了上文列舉的那些病毒傳送方法，亦可採用非病毒性方法，使本文所述核酸(編碼例如：一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)、它的一種活性片段，或它的一種功能性或結構性類似物胜肽之核酸)於研究對象的組織中表現，大部分基因傳送的非病毒性方法仰賴哺乳動物細胞的攝取巨分子與細胞內運輸巨分子的正常機制。於一些具體實例中，本發明之非病毒性基因輸送系統依靠胞吞途徑，使得標靶細胞攝入研究對象的基因，這類典型的基因輸送系統包括：微脂體輸送系統、聚離胺酸綴合物，及人造病毒外套膜；其他具體實例包括：質體注射系統，如：Meuli,et al.,J.Invest.Dermatol.116(1)：131-135(2001)；Cohen,et al.,Gene Ther 7(22)：1896-905(2000)；or Tam,et al.,Gene Ther.7(21)：1867-74(2000)。

於一代表性具體實例中，編碼本文所述絲胺酸蛋白酶抑制蛋白肽的基因可被包裹於其表面帶有正電荷的微脂體中(例：脂質體)，且(可自由選擇)該微脂體可被標記上針對標靶組織細胞表面抗原的抗體(Mizuno,et al.,No Shinkei Geka 20：547-551(1992)；專利合作條約公開WO91/06309；日本專利申請1047381；及歐洲專利公開EP-A-43075)。

在臨床上，可經由一些方法將治療性基因的基因輸送系統引入到患者體內，其中每一種方法皆為本領域所熟知，例如：基因輸送系統的藥物製劑可被全身性引入，例：經由靜脈注射。基因輸送載體提供的專一性轉染作用使蛋白質的特定轉導作用主要發生在標靶細胞中，由於轉錄調節序列控制接受者基因或其組合的表現，造成細胞類型或組織類型的表現。於其他具體實例中，初期輸送重組基因較為有限，導入動物局部體內，例如：經由導管(參見美國專利號5,328,470)，或經由立體定位注射(例：Chen,et al.,PNAS 91：3054-3057(1994))導入基因輸送載體。

基因療法構築體的藥物製劑本質上可含有基因輸送系統溶於一種可用的稀釋劑中，或包括一種緩慢釋放的基質，該基因傳送載體包埋於其中；或者，完整的基因傳送系統可產自重組型細胞，例：反轉錄病毒載體，則該藥物製劑可包含一或多種製造該基因傳送系統的細胞。

於本發明的一個特定具體實例中，編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽，或活性片段，或其類似物的表現構築體為一種腺關連性病毒(AAV)；於進一步具體實例中，上述腺關連性病毒含有一種遍存性的細胞巨大病毒(CMV)啟動子，或一種肝臟專一性啟動子，例：一種肝臟專一性性白蛋白啟動子。

細胞療法

本文所述的作用因子，適於例如：改善胰臟β細胞功能，或增進胰臟β細胞增殖，例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)，或其活性片段，或其功能性或結構性類似物；亦可經由導入編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)，或其活性片段，或其功能性或結構性類似物的核酸序列到細胞中，例：胰臟β細胞，而在研究對象中增加該作用因子，該核苷酸序列可包括：啟動子序列，例：來自絲胺酸蛋白酶抑制蛋白基因，或來自其他基因的啟動子序列；強化子序列，例：5'非轉譯區(UTR)，例：5'UTR、3'UTR；多腺核苷酸化位點；絕緣子序列；或其它可調節絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)，或其活性片段，或其功能性或結構性類似物之表現的序列，之後該細胞可經由本領域技術人員所知之方法導入研究對象中。

進行基因工程的初級與次級細胞可由多種組織中獲得，並包含可於培養基中保持與繼代的細胞，例如：初級與次級細胞包括：脂肪細胞、纖維母細胞、角質細胞、上皮細胞(例：乳房上皮細胞、腸上皮細胞)、內皮細胞、神經膠細胞、神經細胞、血液形成成份(例：淋巴細胞、骨髓細胞)、肌肉細胞(肌原細胞)，及這些體細胞的前身。最好由被給施予該基因工程處理的初級或次級細胞的個體獲取初級細胞，然而，初級細胞可能用於供給者(除了該接受者之外)，用於本發明之組合物及方法的最佳細胞為胰臟β細胞或肝臟細胞。

專有名詞「初級細胞」包括：存在於懸浮液中，由脊椎動物組織來源(在細胞被平化之前，亦即吸附到組織培養基底，諸如：培養皿或瓶)分離出的細胞；存在於移植物，源自組織的細胞；第一次平化的前兩種類型的細胞，及源自這些平化細胞的懸浮細胞。專有名詞「次級細 胞」或「細胞品系」意指在培養過程中所有接續步驟的細胞，細胞品系是已繼代一或多次的次級細胞。

脊椎動物，特別是哺乳動物的初級或次級細胞可被轉染外源的核酸序列，該序列包含編碼訊息肽的核酸序列及/或異源性核酸序列，例：編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)，或其活性片段，或其功能性或結構性類似物，並於一段持續的期間內(亦即小時、天、週，或更長時間)，在試管內及活體內穩定且重複地產生所編碼的產物。異源性胺基酸亦可為調節序列，例：引發表現的啟動子，例：內源性序列的誘發性表現或上調作用。外源的核酸序列可經由同源重組被導入初級或次級細胞中，例如：美國專利號5,641,670所述。被轉染的初級或次級細胞也可能包含編碼可篩選標記的DNA，該篩選標記賦予它們可篩選的表現型，方便識別及隔離它們。

可經由標準方法得到脊椎動物組織，諸如：穿刺活體細胞檢察，或其它獲得所要的初級細胞之組織來源的外科手術方法，例如：穿刺活體細胞檢察是用來得到皮膚，以作為纖維母細胞或角質細胞的來源。使用已知方法，諸如：酶分解或移植，由組織中得到初級細胞的混合物，若使用酶分解，可使用例如：膠原蛋白酶、玻尿酸酶、分散酶、鏈蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶，及胰凝乳蛋白酶。

所得到的初級細胞混合物可被直接轉染，或是先被培養，在轉染作用之前，由培養皿移出並進行再懸浮。初級細胞或次級細胞與外源核酸序列結合，進而例如：穩定地嵌入它們的基因體中，並進行處理以完成轉染作用。本文所用專有名詞「轉染作用」包括用於導入外原核酸至細胞中的多種技術，包括：磷酸鈣或氯化鈣沉澱、顯微注射、二乙胺乙糊精調控的轉染作用、脂質轉染法，或電穿孔法，皆為本領域常規技術。

被轉染的初級或次級細胞歷經足夠次的複製，而產生足夠量的無性細胞品系或異種細胞品系，以提供研究對象有效量的治療性蛋白質，用於轉染作用所需的無性異種細胞品系的細胞數量不定，取決於多種因素，包括但不限於：所使用的轉染細胞、外源DNA在被轉染細胞中起作用的量、被轉染細胞的植入部位(例如：可使用的細胞數量受限於植入解剖位置)，及年齡、表面積，與患者的臨床狀況。

被轉染細胞，例：依本文所述產生的細胞，可被導入個體中，其中該產物被輸送到該個體中，可使用各種施藥途徑及各種位置(例：腎包膜下、皮下、中樞神經系統(包括硬膜內)、血管內、肝內、內臟內、腹膜內(包括網膜內)、肌內植入)，最好的植入位置是胰臟或肝臟。一旦導入個體中，被轉染的細胞產生由異源性DNA所編碼之產物，或是受異源性DNA本身所影響，例如：罹患胰臟β細胞功能損傷相關疾病的個體為植入細胞的可能人選，該細胞產生本文所述作用因子，例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(例：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)，或其活性片段，或其功能性或結構性類似物，或如本文所述它的模擬物，或本領域技術人員已知的分子。

免疫抑制劑，例：藥劑或抗體，可被施用於研究對象，其劑量足以達到預期療效(例：抑制細胞的排斥作用)，免疫抑制藥劑的劑量範圍為本領域已知，參見例：Freed,et al.,N.Engl.J.Med.327：1549(1992)；Spencer,et al.,N.Engl.J.Med.327：1541(1992)；Widner,et al.,N.Engl.J.Med.327：1556(1992))。劑量值可能依據不同因素而異，諸如：個體的病況、年齡、性別及體重。

實施例 實例1

糖尿病研究的共同努力目標為鑑別分子，其可專門促進β細胞再生，而不損害其他組織內細胞增殖作用，為了確認顯現內分泌腺胰臟劇烈過度增生的肝臟胰島素受器基因剔除(LIRKO)小鼠是否會在額外增生的的胰臟組織中出現增殖作用增加的現象，我們對3月齡的LIRKO小鼠腹膜內注射溴化去氧尿嘧啶(BrdU；100毫克/公斤體重)，並評估β細胞、α細胞，及代謝性器官，諸如：肝臟、脂肪及骨骼肌的細胞，與非代謝性組織，諸如：肺臟、腎臟及脾臟的細胞之增殖現象，我們發現與同窩對照組相較，LIRKO小鼠的β細胞質量增加2倍(LIRKO 1.32±0.2與對照組0.68±0.08毫克；p<0.05；n=6)，其歸因於在LIRKO小鼠中，溴化去氧尿嘧啶嵌入(LIRKO 1%±0.08%與對照組0.4%±0.07%的溴化去氧尿嘧啶(+)β細胞s；p<0.001；n=6)及Ki67蛋白染色(LIRKO 1.34%±0.1%與對照組0.51%±0.08%的Ki67(+)β細胞s；p<0.001；n=6)增加2.5倍，而證實β細胞增殖作用增加，末 端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記染色並未發現兩組之間凋亡β細胞數量上有顯著差別。我們亦發現α細胞的增殖作用並無差別(LIRKO 0.24%±0.09%與對照組0.29%±0.1%溴化去氧尿嘧啶(+)α細胞；n=6)(圖1A-1F)，或是多種非β細胞組織，包括：內臟脂肪、皮下脂肪、肌肉、腎臟、肝臟或脾臟的細胞增殖作用並無差別。雖然我們確實發現肺臟細胞的增殖作用增加(LIRKO 0.7%±0.02%與對照組0.43%±0.08%溴化去氧尿嘧啶(+)細胞；n=6；p<0.05)(圖1G及1H)，12月齡的LIRKO小鼠組織切片的組織學分析顯示沒有類似腫瘤的表現型(圖6；表2)，且該LIRKO小鼠的壽命近似於同窩對照組，這些結果表明LIRKO小鼠因應胰島素抗性，而顯示出強大的β細胞特異性增殖作用。

實例2 循環的非神經性非自律性因子促使LIRKO小鼠β細胞複製。

為了直接解答LIRKO小鼠的β細胞增殖作用是否受全身性因子調控，我們首先使用連體動物模型(Bunster,E.,and Meyer,R.K.(1933).An improved method of parabiosis.Anat.Rec.57,339-43)，將5-6週齡雄性小鼠進行外科手術，連結肩部及臀腰部，並於2週內以伊凡氏藍染劑注射確認連結手術成功(資料未顯示)，動物維持連體生活達16週，接著以溴化去氧尿嘧啶嵌入測定β細胞複製作用(圖2A)。有三種手術模型：對照組/對照組、 對照組/LIRKO，及LIRKO/LIRKO，所有連體動物組生長正常，每週體重增加，且連體動物配對者的血糖在正常範圍內，各組間並無顯著不同(圖7A-7C)。連體生活16週之後，LIRKO及對照組連體動物呈現相似的飯前血糖值，而與LIRKO小鼠連體的對照組配對者小鼠之循環性胰島素值比未連體對照組小鼠及與對照組連體的對照組小鼠高(圖8A-8D)。如同預期，溴化去氧尿嘧啶嵌入結果顯示在對照組小鼠中β細胞有絲分裂作用少，而在LIRKO動物中明顯提升(對照組0.03%±0.005%與LIRKO 0.14%±0.02%溴化去氧尿嘧啶(+)β細胞；p<0.005；n=5-6)。我們也注意到與單一對照組相較(圖1C及1D)，在對照組連體動物中有低量的β細胞增殖(圖2F及9)，我們認為這可能繼發於該連體過程本身，需要進一步研究。在相同基因型的連體動物胰臟β細胞中，有類似的溴化去氧尿嘧啶嵌入率：於對照組/對照組為低(~0.03%溴化去氧尿嘧啶(+)β細胞；n=5-6)；於LIRKO/LIRKO為高(~0.19%溴化去氧尿嘧啶(+)β細胞；n=5-6)，有趣的是，在與LIRKO小鼠接合的對照組小鼠胰臟β細胞中，溴化去氧尿嘧啶嵌入率顯著增加(對照組/LIRKO連體動物中的對照組0.09%±0.01%與對照組/對照組連體動物中的對照組[0.03%±0.004%及0.03%±0.008%]溴化去氧尿嘧啶(+)β細胞s；p<0.01；n=5-6)(圖2B-2F)，後者的發現經由針對磷酸組織蛋白H3(pHH3)的免疫染色進行確認(圖9)，這些結果顯示LIRKO小鼠產生細胞非自律性循環性因子，其促進β細胞複製作用，先前研究已經暗指神經途徑以一種細胞非自律性形式，調節β細胞增殖作用(Imai,J.,et al.,(2008).Regulation of pancreatic beta cell mass by neuronal signals from the liver.Science 322,1250-1254)。為了評估該神經作用對LIRKO模型中β細胞增殖的可能影響，我們進行移植研究以評估β細胞複製作用，共有125個才剛從對照組或LIRKO小鼠分離的尺寸適合的胰島，被移植到對照組或LIRKO接受者的腎球囊下，為了盡量減少系統誤差，每一隻接受者小鼠(對照組或LIRKO)左右腎臟分別被移植兩個胰島移植物，一個來自對照組，另一個來自LIRKO供給者(圖2G)。移殖16週之後，收取胰島移植物，切片，並分析β細胞溴化去氧尿嘧啶嵌入率，如同預期，移植入對照組動物的對照組胰島表現最低限度的β細胞增殖作用(0.017%±0.017%溴化去氧尿嘧啶(+)β細胞)，有趣的是，來自相同供給者卻移植入LIRKO接受者的對照組胰島表現出約8 倍增加的β細胞複製作用(0.139%±0.03%溴化去氧尿嘧啶(+)β細胞s；p<0.05；n=3-5)。值得注意的是，移植入LIRKO接受者的LIRKO胰島表現出強健的β細胞複製作用，使人聯想到在未經處理的LIRKO小鼠胰臟中增加的β細胞增殖作用，但是當LIRKO胰島被移植入對照組動物中，此反應減弱(圖2H)，總括而言，這兩個互補的實驗策略提供證據，證明循環的非神經性非細胞自律性因子有助於擴大β細胞質量，因應胰島素抗性。

實例3 LIRKO血清於活體內引發有選擇性的β細胞複製作用

我們接下來試圖去評估在LIRKO模型之β細胞增殖作用的誘發過程中，產自血液的分子對細胞的相對重要性。在第1天、第3天，及第5天，一日兩次分別對5-6週齡雄性小鼠腹膜內注射剛才從6月齡對照組或LIRKO小鼠分離的血清(每次注射150毫升)；在第2天、第4天，及第6天，一日一次對該接受者注射溴化去氧尿嘧啶(100毫克/公斤體重)，在第6天收取胰臟，以評估β及α細胞複製作用(圖3A)。與注射對照組血清(control(s))的同窩對照組小鼠相較，注射LIRKO血清(LIRKO(s))的對照組小鼠其內源性β細胞複製作用呈現約2倍的增加，但α細胞複製作用沒增加(圖3B-3E)。我們觀察到在LIRKO及對照注射組之間，末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記(+)β細胞的數目沒有顯著差異(圖3F及3G)。於胰臟之外的組織，包括：肝臟、皮下脂肪、肌肉、腎臟、脾臟，及肺臟，溴化去氧尿嘧啶嵌入率的評估顯示各組間的增殖作用無顯著差異，但在內臟脂肪中發現增殖作用略微降低(圖3H)。此活體內研究證實一種循環性分子，穩定存在於血清中，於LIRKO模型中有選擇性的促進β細胞增殖。

實例4 LIRKO血清於試管內增進小鼠與人類胰島β細胞複製作用

為了進一步了解此循環性β細胞生長因子的作用模式，我們接下來建立一種試管內功能性測定法，以直接評估在被分離的小鼠胰島中，LIRKO或對照組血清對β細胞複製作用的影響。我們在含有LIRKO或對照組血清的培養基中培養胰島，之後使用Ki67蛋白免疫染色及螢光顯微鏡 評估β細胞增殖作用，在所有實驗中使用螢光顯微鏡確認在每一組中隨機選擇的Ki67蛋白(+)β細胞(圖4A)。

為了評估該因子的性質，我們使LIRKO血清暴露於攝氏100度達15分鐘，使它加熱不活化，經由布萊德福蛋白質濃度測定法(Bradford assay)測得該血清處理導致失去高達80%的蛋白質，並在麗春紅S溶液染色的丙烯醯胺凝膠上看到此一情形；雖然LIRKO血清有明顯的增殖作用使Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞的數目增加2倍，經加熱不活化之後，LIRKO血清的複製能力減少80%(圖18)，推測該調節β細胞增殖作用的活性物質為一種蛋白質。

我們下一步測試6月齡小鼠的LIRKO血清刺激β細胞增殖的能力，並發現在24及48小時，來自LIRKO小鼠1：10倍稀釋的血清可增加初級胰島的β細胞增殖作用(圖10)，來自3月齡小鼠的LIRKO血清也增加小鼠胰島的β細胞增殖作用(LIRKO血清1.58%±0.3%與對照組血清0.52%±0.1% Ki67蛋白(+)β細胞；p<0.05；n=6)。此外，與培養在年齡相近之對照組血清的胰島相比較，培養在12月齡LIRKO血清的小鼠胰島顯現大量複製中的β細胞(LIRKO血清1.3%±0.5%與對照組血清0.7%±0.2% Ki67蛋白(+)β細胞；p=0.3；n=4-6)(圖4B及4C)；此增加量失去統計顯著性，可能是由於成熟對照組中提高的胰島素抗性本身有助於β細胞增殖(Kulkarni,R.N.,et al.,(2003).Impact of genetic background on development of hyperinsulinemia and diabetes in insulin receptor/insulin receptor substrate-1 double heterozygous mice.Diabetes 52,1528-1534；Mori,M.A.,et al.,(2010).A systems biology approach identifies inflammatory abnormalities between mouse strains prior to development of metabolic disease.Diabetes 59,2960-2971)。末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記染色顯示，在培養於LIRKO血清或對照組血清之胰島的細胞凋亡情形沒有顯著差別(圖4D)。初步結果指出當遭遇加熱不活化時，LIRKO血清刺激β細胞增殖的能力會降低，這表示假定的循環性因子可能是蛋白質(資料未顯示)。為了檢驗LIRKO血清的增殖作用是否為保守性跨物種的，我們接下來將來自9位健康供給者及2位糖尿病供給者的人類胰島(供給者特徵參見表3)，培養在12-18月齡雄性LIRKO或對照組小鼠的血清中，類似於對小鼠β細胞的作用，LIRKO小鼠血清可增進人 類胰島β細胞增殖作用，雖然比瑞艾克(Rieck)等人最近的研究報告中的值低(Rieck,S.,et al.,(2012))。

肝細胞核因子-4a的過度表現會引發進入細胞週期，但不足以促使β細胞在人類胰島中擴大(Mol.Endocrinol.26,1590-1602)，重要的是，LIRKO血清亦有效的促進第二型糖尿病患者的胰島β細胞增殖(圖4E-4G)，因此，存在於LIRKO小鼠循環系統中的β細胞促分裂原，對小鼠及人類胰島(包括第二型糖尿病患者的胰島)表現出保守性的活性，葡萄糖及胰島素已被報導可促進β細胞生長(Assmann,A.,et al.,(2009).Growth factor control of pancreatic islet regeneration and function.Pediatr.Diabetes 10,14-32；Assmann,A.,et al.,(2009b).Glucose effects on beta-cell growth and survival require activation of insulin receptors and insulin receptor substrate 2.Mol.Cell.Biol.29,3219-3228；Bonner-Weir,S.,et al.,(1989).Compensatory growth of pancreatic beta-cells in adult rats after short-term glucose infusion. Diabetes 38,49-53)，且為表現葡萄糖不耐受性與高胰島素血症之LIRKO模型的潛在可能因子(Michael,M.D.,et al.,(2000).Loss of insulin signaling in hepatocytes leads to severe insulin resistance and progressive hepatic dysfunction.Mol.Cell 6,87-97)。然而，我們的觀察報告表示葡萄糖並非LIRKO小鼠的主要因素，有幾個原因：第一，儘管在連體生活期間血糖值正常(約120毫克/分升)，與LIRKO小鼠連體16週的對照組小鼠表現出增加高達7倍的增殖作用(圖7A及7C)；第二，用來檢驗對β細胞增殖作用影響之血清(參見圖4A)是來自正常血糖的3月齡或低血糖的12月齡動物(資料未顯示)；最後，為了進一步排除葡萄糖的可能性，我們在實驗中將胰島培養在固定濃度的5.5mM葡萄糖與LIRKO或對照組小鼠血清中(血清：培養基為1：10稀釋)，並觀察到只有在LIRKO血清組中β細胞增殖作用增加；再者，在胰島培養初期及末期，兩組培養基的葡萄糖濃度值相近(圖11A)。在我們的模型中，我們相信胰島素可能負責複製作用，但未必能負責高量的β細胞增殖作用，因為用於試管內研究(參見圖4)的稀釋血清中的胰島素值(圖11B)明顯較LIRKO小鼠循環系統中的胰島素值低(11.63±2.4奈克/毫升[3月齡LIRKO小鼠]與2.59±1奈克/毫升[培養基中稀釋的血清]，及17.8±4.4奈克/毫升[12月齡LIRKO小鼠]與1.4±1.3奈克/毫升[培養基中稀釋的血清])(表1；Michael,M.D.,et al.,(2000).Loss of insulin signaling in hepatocytes leads to severe insulin resistance and progressive hepatic dysfunction.Mol.Cell 6,87-97)。綜上，這些結果支持存在一種葡萄糖與胰島素依賴型肝臟衍生因子，其可促進β細胞團的擴大。

實例5 肝細胞衍生因子於試管內刺激小鼠及人類胰島β細胞複製

肝臟及胰臟的共同胚胎起源(Zaret,K.S.(2008).Genetic programming of liver and pancreas progenitors：lessons for stem-cell differentiation.Nat.Rev.Genet.9,329-340)加上強健的β細胞增殖作用，在肝臟中會去反應組織特異的胰島素抗性，而當胰島素抗性被限制在肌肉(Brüning,J.C.,et al.,(1998).A muscle-specific insulin receptor knockout exhibits features of the metabolic syndrome of NIDDM without altering glucose tolerance.Mol.Cell 2,559-569)、脂肪(Blüher,M.,et al.,(2002).Adipose tissue selective insulin receptor knockout protects against obesity and obesity-related glucose intolerance.Dev.Cell 3,25-38)，或腦部(Brüning,J.C.,et al.,(2000).Role of brain insulin receptor in control of body weight and reproduction.Science 289,2122-2125)，則缺乏實質上的代償反應，這促使我們假設肝臟是β細胞生長因子的來源，以因應新陳代謝的損傷，諸如：胰島素抗性。為了測試此假設，我們收集來自3或12月齡LIRKO或對照組動物之肝移植體培養物的條件培養液(LECM)，並評估它們對小鼠胰島β細胞增殖作用的影響(圖5A)，與培養在來自年齡相近對照組肝培植體條件培養液的細胞相較(圖5B)，於培養在來自3或6月齡LIRKO小鼠肝培植體條件培養液的胰島中，Ki67蛋白呈陽性的β細胞明顯增加，有趣的是，雖然培養在來自3或6月齡對照組肝培植體條件培養液的小鼠胰島中呈現類似的增殖作用，培養在含有12月齡LIRKO肝培植體條件培養液之細胞的增殖作用是3月齡對照組肝培植體條件培養液的2倍(圖5C)，這種LIRKO肝培植體條件培養液的年齡依存效應與LIRKO小鼠β細胞增殖作用的年齡依存性增加是一致的(Okada,T.,et al.,(2007).Insulin receptors in beta-cells are critical for islet compensatory growth response to insulin resistance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104,8977-8982)。同樣的，與培養在對照組肝培植體條件培養液的相同供給者之胰島相比較，培養在LIRKO肝培植體條件培養液的健康人類對照組及第二型糖尿病患者(供給者之特徵參見表3)之胰島β細胞顯現增殖作用增加(圖5D及5E)。肝臟含有多種細胞類型，包括：肝細胞、庫弗細胞，及內皮細胞(Si-Tayeb,K.,et al.,(2010).Organogenesis and development of the liver.Dev.Cell 18,175-189)，為了確定LIRKO血清的生長因子功能是否為肝細胞或非肝臟細胞的產物，我們使用來自初級肝細胞培養物的條件培養液(HCM)，該肝細胞取自試管內β細胞增殖測定實驗的對照組或LIRKO小鼠，與被對照組肝細胞條件培養液刺激的胰島相較，培養在LIRKO肝細胞條件培養液的初級小鼠胰島表現出明顯增加的β細胞增殖作用(對照組肝細胞條件培養液0.13%±0.03%與LIRKO肝細胞條件培養液0.64%±0.12%；p<0.05；n=5)；兩組的末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記(+)β細胞的數目相近(圖5F及5G)。此外，當第二型糖尿病患者(供 給者之特徵參見表3)的胰島被置於LIRKO肝細胞條件培養液中，LIRKO肝細胞條件培養液的增殖效果亦較對照組肝細胞條件培養液明顯(圖5H及5I)，因此，有胰島素抗性的肝細胞產生β細胞生長促進因子，其可提高小鼠及人類β細胞的增殖作用。雖然影響β細胞生長的許多訊息傳遞途徑已被記錄在案(Kulkarni,R.N.,et al.,(2012).Human β-cell proliferation and intracellular signaling：driving in the dark without a road map.Diabetes 61,2205-2213)，就我們所知，可因應胰島素抗性誘發β細胞複製作用的特定血源性分子尚未見報導，在LIRKO小鼠血清中，缺乏一或多種生長因子一致性增加的現象(表1)，以支持「需要另外的未知分子，以促進在LIRKO模型中所觀察到的最大量增殖作用」的觀點。綜上所述，我們提供的證據表示有一種保守的系統性肝細胞衍生生長因子促進小鼠及人類胰島β細胞的增殖作用，證實反應胰島素抗性由肝臟到胰臟位向的適應性β細胞生長。

實例6 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1及相關蛋白家族成員在小鼠及人類β細胞增殖作用扮演的角色

胰臟β細胞功能異常是造成第一型與第二型糖尿病的原因，雖然這兩種形式的糖尿病的病程不同，功能性β細胞團減少是這兩種疾病的共同特點，再生方法是一種有吸引力的策略，以增加功能性β細胞的數目。於本文中，我們近來公布(El Ouaamari,et al,Cell Reports,2013,3：1-10)，可能存在肝臟衍生的系統性因子，能夠刺激肝臟胰島素受器基因剔除小鼠(LIRKO)β細胞增殖，其中LIRKO小鼠是一種由胰島素抗性造成β細胞質量增加，胰島過度增生的模式動物。

使用全面性的基因晶片及蛋白質體學方法，我們目前已確定絲胺酸蛋白酶抑制蛋白超級家族的蛋白質是β細胞生長因子，在該家族成員中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1被確定是一種持續增量調節的肝細胞衍生系統性β細胞生長因子。

鑑定絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1是一種來自LIRKO小鼠的新潛在β細胞生長因子-方法：肝細胞條件培養液之蛋白質體學分析 在奈米沸石上預先濃縮

奈米沸石LTL奈米粒子由德國的奈米前景公司(NanoScape AG,Germany)獲得，將來自肝細胞條件培養液的蛋白質與(0.1毫克/毫升)與奈米粒子懸浮液(0.1毫克/毫升)於磷酸鹽緩衝溶液中，在攝氏4度下培養90分鐘，使蛋白質吸附在奈米沸石LTL表面上，經過重力加速度16000g，20分鐘的離心分離之後，結合到奈米粒子的蛋白質以酸鹼值8.0的0.1M碳酸銨緩衝液洗滌2次。

依據製造商的說明書(英濰捷基公司，格蘭德島，紐約(Invitrogen,Grand Island,NY))，使用預製膠蛋白蛋泳系統(NuPAGE®)正十二烷硫酸鈉電泳緩衝劑，在預製膠蛋白蛋泳系統(NuPAGE® Novex®)4-12%雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷凝膠上，以聚丙烯醯胺膠體電泳分析蛋白質樣本，並使用英濰捷基公司的銀染色套組SilverQuest^TM進行染色。

蛋白分解作用

將結合在奈米沸石上的蛋白質在含有10mM二硫蘇糖醇、0.05% AALS(陰離子酸不穩定界面活性劑，得自普羅梯亞木生物科學公司(Protea Biosciences))酸鹼值為8.0的50mM碳酸銨緩衝劑中，置於攝氏56度下30分鐘以進行還原，之後加入20mM碘乙醯胺，在黑暗環境置於室溫下30分鐘，以烷基化蛋白質。

還原及烷基化步驟之後，於攝氏37度下4小時以天冬胺酸激酶(重量重量比1/50)分解結合的蛋白質，之後於攝氏37度下18小時以胰蛋白酶(重量重量比1/50)分解蛋白質。

離心之後，收集蛋白質分解物，於攝氏37度下？分鐘以1%三氟乙酸進行陰離子酸不穩定界面活性劑水解，最後將酶分解物送至質譜儀分析。

液相層析質譜儀分析

以極致效能液相層析分析系統(NanoAcquity UPLC)(沃特世公司，米爾福德，麻薩諸塞州(Waters,Milford,MA))連結配備有奈米 級電霧源的組合型線性離子阱高分辨質譜儀(LTQ Orbitrap Velos^TM mass spectrometer)(賽默飛世爾科技公司，沃爾瑟姆，麻薩諸塞州(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA))來進行液相層析質譜儀(LC-MS)實驗，將蛋白質分解物注入極致效能液相層析管柱(液相層析柱C18(Symmetry C18)，5微米，180微米×20毫米，沃特世公司)，並以0.2%甲酸在20微升/分鐘的流速下洗滌5分鐘，之後在C18反相極致效能液相層析管柱(BEH130 C18，1.7微米，75微米×250毫米，沃特世公司)中，以250奈升/分鐘的流速，使用線性梯度的7-30%溶劑B(水/乙氰/甲酸，體積比10：90：0.2)達120分鐘，30-90%溶劑B達20分鐘，及90%溶劑B達5分鐘，洗析出胜肽。

該質譜儀以數據依存模式進行操作，在質譜探測及串連式質譜探測之間自動轉換，使用解析度為60,000的高分辨質譜儀在質荷比為400時，獲得全掃描質譜(質荷比300-1700)的測定結果；自動增益控制(AGC)被設定為1×10⁶，500毫秒的最大噴射時間，分離出的最強離子(高達20)，使用預設啟動q值0.25的28%標準化碰撞能量，且自動增益控制設定為2×10⁴，200毫秒的最大噴射時間，在線性離子阱質譜儀中進行碎斷作用，動態排除時間窗設定為150秒，樣品分為三份注入。

液相層析串連式質譜儀數據處理

使用質譜分析軟體(Xcalibur software)(版本2.07，賽默飛世爾科技公司)所得到的液相層析串連式質譜儀數據，經由使用原始檔案庫(XRawfile libraries，由賽默飛世爾科技公司公布)所開發的視覺培基程式軟體進行處理，本領域技術人員已知有類似的程式，並可自行開發類似程式。由此軟體產生三個不同檔案：第一個檔案對應串連式質譜的峰值清單(MGF檔案)，其將被用於資料庫檢索，此MGF檔案包含確切母核質量及有關每個線性離子阱串連式質譜儀的滯留時間(RT)，確切母核質量是高解析度的高分辨質譜儀並行掃描所偵測到，並納入線性離子阱串連式質譜儀選擇視窗的最強同位素圖譜的¹²C同位素離子質量，滯留時間則由線性離子阱串連式質譜儀掃描得出；第二個檔案是串連式質譜的對數檔案，其記述每個所獲得之串連式質譜的掃描數、¹²C同位素精確質量、滯留時間，及母 核過濾(線性離子阱質譜儀選擇視窗)；第三個檔案對應將高解析度質譜儀原始數據轉換為「逗號分隔值」形式的檔案，期將可用於定量分析。

資料庫檢索

使用我們內部的多存取系統控制終端(Mascot)伺服器(版本2.1，基質科技公司(matrix Science)；www.matrixscience.com/)，及使用內含402,482條目的瑞士蛋白質體人類資料庫(Swiss-Prot human database)進行資料庫檢索，轉譯後修飾作用的搜尋參數為半胱胺酸殘基+57.02146Da(羧基醯胺基甲基化)的固定修飾作用，及甲硫胺酸殘基+15.99491(氧化)、蛋白質胺基末端殘基+42.010565(胺基末端乙醯化)，及胺基末端麩醯胺酸殘基-17.026549(N-Pyroglu)的變動修飾作用，前驅物質量容限設定為5ppm，而斷片離子容限設定為0.5Da，胰蛋白酶錯失切割位點的數目設定為2。將多存取系統控制終端結果檔案(「.dat」檔案)輸入蛋白質體學軟體(Scaffold software)(www.proteomesoftware.com/)，也用於XTandem並行資料庫檢索，而輸出兩資料庫檢索的彙集結果。

定量分析與統計分析

使用無標籤分析及本機構內部的微分傅立葉轉換分析(DIFferential Fourier Transform Analysis,DIFFTAL)軟體演算法進行蛋白質的定量微分分析，微分傅立葉轉換分析是由賽諾菲公司(Sanofi)在矩陣實驗室(MatLab)(www.mathworks.com)所開發的一套軟體工具，用以無標籤微分分析複雜的蛋白質體混合物，致力於記錄高解析度串聯式質譜儀的數據。

微分傅立葉轉換分析的運作有6個主要步驟，這些步驟包括以下內容：(1)特性檢測；(2)質譜配對；(3)串聯式質譜註釋；(4)串聯式質譜配對；(5)胜肽定量報告；及(6)蛋白質的相對量化。

步驟1：特徵檢測。每個液相層析質譜儀檔案被獨立處理以進行特徵檢測，經由分析3次連續掃描的平均訊號演變，而偵測到訊號幻影，使用以「平均計算(Averagine)」演算法計算的胜肽同位素圖譜完成特徵檢測，當過程結束時，在三度空間(質荷比(質量/電荷)、滯留時間(RT) 及強度)中所檢驗特徵的矩陣已被儲存，此矩陣包含鏈結，以復原儲存在臨時資料庫的對應處理訊號。

步驟2：質譜配對。所有液相層析質譜儀的數據以漸進比對方法進行配對，首先，依照使用者訂定的質荷比及滯留時間精密性視窗，配對所檢測到的最強特徵；之後，所有胜肽被用來估算特定的滯留時間校準模型，依據實際滯留時間與預測滯留時間之滯留時間之間的離散值，來計算確實的滯留時間視窗；最後，重頭檢視特徵檢測期間所儲存之經處理訊號，以核對每一個剩餘未配對的質荷比，最後這一點使未配對特徵類的測定具極高可信度。

步驟3：串聯式質譜註釋。此步驟相當於在前文「資料庫檢索」段落所報告的資料庫搜尋。

步驟4：串聯式質譜配對。使用相應取得的串連式質譜對數檔案(參見液相層析串連式質譜儀數據處理)，將蛋白質體學軟體輸出的串聯式質譜儀的質譜報告與特徵檢測的矩陣進行配對，這項配對需要每一個特徵開始與結束的時間點，實際上，滯留時間特徵是所觀察到最大強度質譜訊號的時間，其中在胜肽洗析期間隨時記錄串連式質譜儀的質譜。假使發生不明確的情形，比較由串連式質譜程式所計算的精確同位素圖表，與在特徵滯留時間所測得的訊號，以做區分。軟體也採用其他例行程式，其依據下列方案僅定量被串連式質譜儀識別的胜肽：每一個被鑑定胜肽的2個主要同位素的時間圖表，在已記錄串連式質譜儀質譜的小型時間視窗中進行估算，只分析與這些2同位素一起析出的訊號，以測定胜肽滯留時間，集中在這個時間的3次掃描之平均訊號之後與完全理論性的胜肽同位素圖像作比較，這個附加的量化相當於第一個產生最終結果報告的資料，這兩個例行量化的共同點可增加定量的可信度及識別範圍。

步驟5：胜肽定量報告。從先前矩陣的統計分析來計算胜肽定量，以但丁R統計程式(DanteR program)進行統計分析，該程式是湯瑪士塔佛納所編寫的一種基於R程式語言的軟體(Thomas.Taverner@pnl.gov and Ashoka Polpitiya for the U.S.Department of Energy(PNNL,Richland,WA,USA：on the World Wide Web(www)：omics.pnl.gov/software)。所測得的特徵群組的中值強度值被用來標準化相同樣本的三次重複注入，只留下被偵測 到至少兩次(超過重複實驗中的一次)的胜肽，並計算每一樣本中個別胜肽的平均強度值，使用閾值取代未被偵測到的胜肽之定量，來代表最低可偵測的訊號值。

當未被偵測到的胜肽之強度由檢測閾值取代，則一種經識別的蛋白質，例如：在處理樣本中經鑑定，但未在對照組樣本中偵測到的蛋白質，可用最小正倍數變化來表示，該倍數變化是以最小可偵測訊號值除以經處理訊號值的結果。

步驟6：蛋白質的相對量化。最後，將相同蛋白質產生的胜肽分組，以評估胜肽倍數變化的影響度，利用所有可用的胜肽豐度及概度比檢定計算出的p值(Karpievitch,et al.,2009a)來推斷蛋白質等級，由樣本類型及重複分析的假設檢定p值來對顯著上升或下降的蛋白質表現變化進行分類與繪圖。

結果：對照組及LIRKO肝細胞條件培養液之差異性蛋白質體分析

將對照組及LIRKO小鼠肝細胞培養於不含血清的培養基中，並於18小時後收取上清液。

為了濃縮存在於稀釋的肝細胞條件培養液中的分泌蛋白質，及排除培養基中無法進行液相層析質譜儀分析的人造小分子，我們研發一種蛋白質體學方法，該方法基於使用曹氏(Cao J.,et al.)等人所描述的沸石LTL奈米結晶物以濃縮蛋白質(Nanozeolite-driven approach for enrichment of secretory proteins in human hepatocellular carcinoma cells,Proteomics.2009,9,(21)：4881-8)，隨後直接在奈米粒子上進行蛋白質的酶分解作用。

在酶分解作用之前，經由聚丙烯醯胺膠體電泳檢查該蛋白質的吸附作用(圖15)，於吸附到奈米顆粒之前與之後，LIRKO及對照組兩者的上清液呈現相似的高度複雜蛋白質圖譜。

使用高效液相層析串連式質譜儀(LC-MS/MS)分析來鑑定所產生的胜肽，經由使用多存取系統控制終端搜尋引擎對生物資訊資料庫(UniProtKB/Swiss-Prot)的蛋白質知識庫，檢索質譜儀及串連式質譜儀的胜肽資料而鑑定蛋白質，之後使用本機構內部的微分傅立葉轉換分析軟體 演算法，經由無標籤定量液相色層分析質譜儀分析而定量蛋白質，個別蛋白質的相對定量如實驗步驟所述，將所獲胜肽中三個(或是兩個所獲胜肽，假使只有兩個特別的胜肽被鑑定出來)最強烈胜肽的強度比值平均。

我們進行3次獨立的蛋白質體分析，以比較來自個別肝細胞培養物與來自不同小鼠的LIRKO及對照組肝細胞條件培養液。

據可得到的蛋白質之濃度與數量，我們在這3次不同的分析中，鑑定出514、1670及1280種蛋白質。

在這些蛋白質中，我們鑑別出12種被調升的蛋白質，及8種在LIRKO肝細胞條件培養液中被調降的蛋白質，在所有實驗中，個別比值大於2或小於5，且p值小於0.05。

經由給定37%蛋白值範圍的12種獨特的胰蛋白酶肽，透過液相層析串連式質譜儀鑑定出小鼠絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1，並且在3次獨立實驗中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1於LIRKO肝細胞上清液中被調升，其中個別比值為17.5、11.6，及18.4，p值小於0.01(圖16A及16B)。

經由小鼠肝臟移植體的轉錄體學分析，在RNA層級證實絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1在LIRKO肝細胞中的增量調節現象，顯示所觀察到的蛋白質層級上差異是由於該蛋白質的過度表現，而非LIRKO小鼠肝臟分泌途徑的改變。

LIRKOA模型之肝臟樣本的轉錄體學分析

根據上述結果，我們接下來分析LIRKO小鼠肝臟的基因表現。

動物及樣本之製備：

用於基因表現分析之小鼠總數為20隻動物(3月齡[n=12隻動物]，及24月齡[n=8隻動物])。從動物迅速切下肝臟組織樣本，急速冷凍於液態氮中，並儲存於攝氏-80度。

基因晶片分析：

使用寡核苷酸陣列來監測基因表現的方法已於美國專利號6,177,248中說明，在我們的實際應用中，所使用的微陣列(基因晶片)出自美國加州聖克拉拉的昂飛公司(Affymetrix,Santa Clara,CA.USA)，其含有來自超過34,000個已完整鑑定小鼠基因，約計39,000個小鼠轉錄本及變異體的去氧核苷酸序列(小鼠基因體430 2.0基因晶片)，每一個轉錄本及變異體由11個長度為25鹼基對的不同寡核苷酸探針所組成，用於設計該陣列的序列選自基因序列資料庫(GenBank)、表現序列資料庫(dbEST)，及參考序列資料庫(RefSeq)，該序列群由獨立基因資料庫(UniGene database)所創建(創建107個，2002年六月)，之後與公共可用的懷特黑德研究所基因組研究中心(MGSC，2002年4月)小鼠基因體的集合草圖進行分析及比較而更加完善。

將150毫克肝臟組織以高速均質機(UtraTurrax homogenizer)細胞溶解於凱杰公司(Qiagen)的RLT緩衝劑中，使用凱杰公司RNA抽取套組(Qiagen RNeasy kit)由組織細胞溶解物中分離出總RNA，其中該套組包含製造商(凱杰公司)建議的蛋白酶K分解作用、DNA水解酶分解作用，及附加的RNA清除步驟，由RNA微米測定法(安捷倫2100生物分析儀；安捷倫公司，聖克拉拉，加州)確認RNA樣本的完整性。

使用超轉錄SSII反轉錄酶系統(SuperScript SSII RT polymerase system)(英濰捷基公司)及連結T7 RNA聚合酶啟動子與寡(去氧胸苷)24的T7(dT)24引子，由每一個總RNA中取10微克以進行第一股及第二股互補DNA的合成，使用酚-氯仿萃取雙股互補DNA，隨後進行酒精沉澱，並再次溶於12微升不含RNA水解酶的水中，使用恩佐生物陣列高產RNA轉錄物標記套組(Enzo BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit)(恩佐公司，紐約，紐約州(Enzo Diagnostics,NY,NY))在試管內轉錄生物素-尿核苷三磷酸及生物素-胞苷三磷酸標記的互補RNA，並以RNA清除套組及酒精沉澱步驟進行純化，每次純化步驟前後均以紫外光分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳及RNA納米測定法(安捷倫2100生物分析儀)檢驗每個總RNA和互補RNA的等分試樣。將15微克的互補RNA樣本置於40mM参(羥甲)胺甲烷/醋酸鹽，酸鹼值8.1，100mM醋酸鉀及30mM醋酸鎂，於攝 氏94度達35分鐘，以進行碎斷作用，加入雜合緩衝劑，並置於每分鐘轉速60轉的旋轉式晶片雜合反應箱(晶片雜合反應箱640，昂飛公司)中，於攝氏45度達16-18小時，使RNA雜合至基因晶片上。微陣列置於流體控制裝置(基因晶片流體控制裝置450，昂飛公司)中清洗，並依據昂飛公司所述方法，以抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅素綴合物(分子探針，生物科技公司，格蘭德島，紐約(Life Technologies,Grand Island,NY))、抗-抗生物素蛋白鏈菌素抗體進行雙重染色，並以抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅素綴合物再次染色，以增加訊號強度。清洗之後，以基因晶片掃描儀3000 7G(昂飛公司)掃描微陣列，其中該掃描儀由昂飛軟體基因晶片操作系統(GCOS)版本1.4所控制。根據昂飛公司品質標準對每一個晶片進行品質控管，包括平均值差、原始強度，及管家基因β-肌動蛋白與甘油醛-3-磷酸脫氫酶的3'/5'比值。

對於即時實驗，使用RNA萃取迷你套組(RNeasy Mini Kit)(凱杰公司，瓦倫西亞，加州)萃取總RNA，取1微克RNA用於反轉錄作用步驟中，該步驟使用高量互補DNA製備套組(high-capacity cDNA Archive Kit)(應用生物系統公司(Applied Biosystems))。使用ABI 7900HT系統(應用生物系統公司)來分析互補DNA，TATA結合蛋白作為內對照組。絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的引子：5'-GCTGCTACAGGAGGCATTGC-3'(前置引子)[序列識別碼：4]及5'-CGGATGGTCCACTGTGAATTC-3'(反置引子)[序列識別碼：5]；促進β細胞因子的引子：5'-CACTGTACGGAGACTACAAGTGC-3'(前置引子)[序列識別碼：6]及5'-GTGGCTCTGCTTATCAGCTCG-3'(反置引子)[序列識別碼：7]；及TATA結合蛋白的引子：5’-ACCCTTCACCAATGACTCCTATG-3’(前置引子)[序列識別碼：8]及5’-ATGATGACTGCAGCAAATCGC-3’(反置引子)[序列識別碼：9]。

數據分析

由美國北卡羅萊納州卡瑞鎮歐米克軟體公司(OmicSoft Corp.Cary,NC,USA.)的陣列工作室軟體套件(Array Studio software package)對昂飛基因晶片(Affymetrix)原始數據進行生物資訊分析，首先以穩健多晶片平均化分析(RMA)作為一種標準化方法來處理此基因晶片檔 案，之後將數據進行對數轉化。為了偵測已表現的基因，將至少25%LIRKO及野生型樣本中所有訊號強度小於6的基因晶片探針組過濾排除，對所有樣本使用主成分分析(PCA)，以作為品管措施。為了偵測差異性表現的基因，對LIRKO及野生型對照組進行成對變異數統計分析，以統顯著性測定差異性表現基因的標準為表現量的變化高於2倍，及P值小於0.05。特別針對絲胺酸蛋白酶抑制蛋白b1a的基因晶片探針組1416318對於絲胺酸蛋白酶抑制蛋白b1a基因表現的分析結果顯示於圖17，在3月齡LIRKO小鼠肝臟樣本中，發現絲胺酸蛋白酶抑制蛋白b1a基因表現被調升3.3倍，在24月齡LIRKO小鼠中，也確認肝臟中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白b1的增量(參見圖17)，由昂飛基因晶片及蛋白質體學分析而確認絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的結果總結於圖28。

昂飛基因晶片及蛋白質體學數據的證實

為了證實我們的昂飛基因晶片及蛋白質體學的結果，我們檢驗肝臟中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1基因的表現，並評估LIRKO小鼠中循環性絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的量，我們發現在3月齡LIRKO小鼠中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的訊息RNA(LIRKO 2.4±0.6與對照組0.6±0.1，p<0.05，n=6)，及蛋白質量(LIRKO 5.1±0.9與對照組1.1±0.06，p<0.05，n=4-5)為同齡對照組小鼠的5倍(圖29 A-C)，西方墨點轉漬法分析顯示在肝培植體條件培養液中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的增加量(圖29D)。重要的是，在LIRKO肝細胞分解物中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1增加，其中未偵測到嗜中性球標記物，諸如：蛋白酶3與嗜中性球彈性蛋白酶，而排除可作為絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1來源的血液細胞的汙染(圖29F)。此外，在3月齡LIRKO小鼠血清(LIRKO 7.9±1.4與對照組3.6±0.3，p<0.05，n=5-6)及12月齡LIRKO小鼠血清(LIRKO 10.6±0.9與對照組7.7±0.5，p<0.05，n=4-5)，循環性絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1增加，測定血漿中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1得到相似結果(圖29G)。我們接下來評估具胰島素抗性的其他模型(瘦素不足(ob/ob)小鼠與高脂飲食(HFD)小鼠)肝臟中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的表現量，與LIRKO小鼠相似，我們證明ob/ob小鼠肝臟中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的訊息RNA(ob/ob 4.9±1.5與對照組1.3±0.2，p=0.07，n=5) 及蛋白質(ob/ob 3.4±0.5與對照組1.3±0.2，p<0.05，n=5)之表現被調升(圖29 H-J)。與同齡對照組的肝培植體條件培養液相較，來自ob/ob小鼠肝臟的肝培植體條件培養液有高量的絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1(圖29K)。再者，高脂飲食小鼠肝臟的絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的蛋白豐度為對照組動物的2倍(高脂飲食3.2±0.3與對照組1.6±0.3，p<0.01，n=6)(圖29M)，儘管我們並未發現對應的肝臟訊息RNA量有統計顯著性偏差(高脂飲食1.7±0.5與對照組2.2±0.5，p=0.5，n=6；圖29L)。訊息RNA量未增加，而蛋白質量增加，則表示在高脂飲食模型中，絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1是在後轉錄層級受到調控，是一種與其它蛋白質觀察到的特徵(He,et al.,2009；Vannay,et al.,2004)。綜上所述，這些資料強烈暗示絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1為胰島素抗性的可能標記物，及/或與細胞再生/增殖有關的標記物。

對(1)瘦健康個體、(2)肥胖個體，及(3)具非酒精性脂肪肝炎(NASH)的肥胖個體血清樣本中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1表現量的評估，顯示肥胖個體比瘦的個體於血清中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的表現有潛在增加的可能性，而與其他兩組相較，肥胖加上非酒精性脂肪肝炎的實驗組則顯現較低的表現量(圖29N)。

實例7 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1及嗜中性球彈性蛋白酶抑制因子對β細胞增殖的影響

為了檢驗絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1是否為一種β細胞生長因子，我們將剛剛分離的初級小鼠胰島培養於不同劑量的重組人類絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1或卵白蛋白(絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B14)中，並以Ki67蛋白免疫螢光染色法(為本領域技術人員所知)評估β細胞增質作用，我們發現當小鼠胰島培養於卵白蛋白(1微克/毫升)中，顯現正常低量β細胞增殖作用，被分離的胰島培養於重組絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1中，表現出一種以劑量依存型式增加的Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞；與對照組相較(胰島培養於類似濃度的卵白蛋白中)，當胰島培養於濃度為1微克/毫升的絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1時，該結果達到統計顯著性。

為了評估肝臟中增加的絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1是否有助於在胰島素抗性模型中增加內源性β細胞的複製，我們檢測取自高脂飲食小鼠及ob/ob小鼠的肝臟移植體培養液(肝培植體條件培養液，LECM)及血清於試管內刺激胰島β細胞增殖的能力。為此，將5-6週齡C57BL/6J雄性小鼠胰島培養於含有血清(稀釋1：10)，或來自飼料飲食(CD)、高脂飲食(HFD)、ob/ob動物，及個別的對照組動物的肝培植體條件培養液(稀釋1：10)的培養液中達24小時，隨後以Ki67蛋白免疫染色及螢光顯微鏡評估β細胞的增殖作用(圖19A)，我們發現高脂飲食血清(高脂飲食血清0.85%±0.1%與飼料飲食血清0.04%±0.1%，p=0.03，n=7)及ob/ob血清(ob/ob血清0.69%±0.1%與野生型血清0.26%±0.05%，p=0.09，n=3-5)兩者明顯可刺激β細胞增殖，與野生型肝培植體條件培養液相較，將小鼠胰島培養於ob/ob肝培植體條件培養液表現細胞複製作用增加2倍(ob/ob肝培植體條件培養液0.27%±0.03%與野生型肝培植體條件培養液0.16%±0.03%，p=0.04，n=4)，與飼料飲食肝培植體條件培養液相較，高脂飲食肝培植體條件培養液的效果亦較好，但未達統計顯著性(高脂飲食肝培植體條件培養液2%±0.4%與飼料飲食肝培植體條件培養液1.5%±0.3%，p=0.39，n=6)(圖19B及19C)。這些發現提供在胰島素抗性模式中，肝臟絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的增加與加強的胰島β細胞過度增生兩者之間功能關連性(亦參見圖27)。

為了解答絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1是否直接作用刺激β細胞增殖，我們將小鼠胰島培養於不同劑量的人類重組絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1及對照組(卵白蛋白)中，並以Ki67蛋白螢光免疫染色法評估β細胞增殖作用(圖21A)。我們發現經對照組(卵白蛋白；1微克/毫升)處理的小鼠胰島如同預期顯現低量β細胞增殖，而經重組絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1處理的小鼠胰島表現出一種以劑量依存形式增加的Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞，並在劑量為1微克/毫升時達到統計顯著性(圖25A及B)。

絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的主要受質為嗜中性球彈性蛋白酶，為了探討絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的增殖活性是否經由拮抗嗜中性球彈性蛋白酶活性來進行調節，我們評估嗜中性球彈性蛋白酶抑制因子，西維來司他(西維來司他為國際非專利藥品名稱(INN)，由國際衛生組織(WHO)命名；化學名稱為：N-{2-[({4-[(2,2-二甲基丙醯基)氧基]苯基}磺 醯基)胺基]苯甲醯基}甘胺酸)，在試管內刺激胰島β細胞增殖的能力。透過使用各種劑量，我們發現低劑量(1微克/毫升及5微克/毫升；參見圖12)無法增進β細胞增殖，相反地，在培養於高劑量(例：10微克/毫升及50微克/毫升)西維來司它的胰島中發現正在增殖中的胰島素(+)細胞數目有實質上的增加，重要的是，與未處理細胞相較，100微克/毫升劑量的西維來司它可增加人類(EndoC-βH1)Ki67蛋白陽性的β細胞數目。

模擬絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的藥物分子促進活體內β細胞複製

為了探討絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1活性增強之後使β細胞複製增加的現象是否可在活體內發生，我們使用藥物化合物西維來司他(Kawabata,et al.,1991)及GW311616A(Macdonald,et al.,2001)，其為彈性蛋白酶有選擇性的抑制因子，其中彈性蛋白酶是絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的主要受質之一。經由使用滲透壓幫浦，我們對實驗動物持續灌注西維來司他達2週，隨後以溴化去氧尿嘧啶嵌入率評估複製的β細胞數目(圖20A)，我們發現300微克/公斤/日的劑量有顯著效果，並且重要的是，該增殖作用只限於β細胞，而在產生升糖素的α細胞改變並不明顯(圖20B及圖23A及B，E及F)。對β細胞的影響也由磷酸組織蛋白H3染色而得到證實(圖23C及D)，在第二個方法中，我們對小鼠灌食劑量為2毫克/公斤/日的嗜中性球彈性蛋白酶抑制因子，GW311616A，達2週(圖20C及圖22A)，與西維來司他效果類似，我們以溴化去氧尿嘧啶嵌入率評估，發現β細胞質量明顯增加，且β細胞增殖作用增加，但α細胞增殖作用未增加(圖20D及圖22B-E)。此外，在胰臟之外的組織，包括：肝臟、骨骼肌、內臟與皮下脂肪組織、脾臟及腎臟中，細胞增殖作用未增加(圖22F及G)。我們也顯示GW311616A及西維來司他兩者可在試管內直接增進小鼠胰島β細胞增殖作用(圖25C)。最後，與同齡動物相較，缺乏彈性蛋白酶的小鼠顯現出增加的β細胞增殖作用(圖30)。總之，這些結果指出絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1經由抑制彈性蛋白酶，而可促進局部β細胞增殖。

我們下一步經由以模擬絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1活性的藥劑處理人類胰島β細胞，來檢驗該作用是否為保守性的，對Ki67蛋白(+)胰島素(+)細胞的評估顯示，當胰島被培養於西維來司他或GW311616A 時，正在複製中的胰島素製造細胞的數目會顯著增加(圖21A及B與圖25D)，這些結果指出絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1直接作用以促進人類β細胞增殖，並顯示出西維來司他及GW311616A對治療α細胞及β細胞相關病症的治療意義。

實例8 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1於試管內及活體內對小鼠及人類β細胞增殖作用的影響

為了直接確定絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1對試管內β細胞複製的功用，將小鼠肝細胞轉染過度表現絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的構築體，或是對照組構築體，達24、48或96小時，本領域技術人員可構築適宜的表現載體，被轉染細胞之培養液將用來刺激小鼠或人類初級胰島，並以試管內測定法評估β細胞的增殖作用。為了評估絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1對活體內β細胞增殖的影響，我們製造腺關連性病毒(AAV)，透過使用通用的細胞巨大病毒啟動子或肝臟特異性白蛋白啟動子，操縱絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1之表現(使用，例如：圖13及14的序列，亦即序列識別碼：1及序列識別碼：2)，經由尾部注射腺關連性病毒-白蛋白-絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1，將使絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1在肝臟中過度表現，於注射該腺關連性病毒12-16週之後，評估此過度表現對β細胞增殖的影響。

作為初步實驗，我們構築編碼增強型綠色螢光蛋白II或小鼠絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的腺關連性病毒，並經由尾部注射至8-10週齡小鼠中，評估活體內短期(3週)肝臟過度表現絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的影響(圖24A)。伴隨著絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1循環量的增加(圖24B)，被轉導腺關連性病毒-絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的小鼠經由Ki67蛋白免疫染色的評估，而顯現β細胞質量增加、血清胰島素量增加，及β細胞複製作用增加(圖24C-G)。胰島/胰臟面積也如同β細胞團以類似程度增加(資料未顯示)，以肝臟特異性α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子作為啟動子。

接下來，經由尾部注射編碼增強型綠色螢光蛋白II或絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的腺關連性病毒，於活體內轉導8-10週齡小鼠(圖26)，在轉導作用後7及15週，進行活體內葡萄糖刺激胰島素分泌的實驗(劑量： 3克/公斤體重)。過度表現絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的小鼠在腺關連性病毒轉導作用後7週及15週，表現出經葡萄糖刺激的胰島素分泌作用增加(圖26A及B)。這些結果強烈表示於活體內長期過度表現絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1，經葡萄糖刺激的胰島素分泌作用增加。

在第二個模型中，在肝臟中過度表現腺關連性病毒-絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的小鼠將會被移植人類胰島，以製造一種「人類化小鼠模型」，將監測小鼠的體重、血糖達2、4及16週，在實驗最後，收取胰島移植物及胰臟，並分析內分泌細胞的增殖及存活狀況。此模型將直接顯示在活體內改變肝臟中絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的表現是否會促進人類β細胞增殖，對人類治療具有重要意義。

實例9 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1作用的相關機制

為了深入了解絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1作用的相關機制，我們將採取如下所述的數種方法：

a)進一步研究在肝臟中使用腺關連性病毒表現絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1(腺關連性病毒-絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1)如何可能會影響β細胞增殖。

b)在肝細胞及胰臟β細胞膜上定位絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1受質。我們首先經由肝細胞及β細胞的免疫染色及西方墨點法，分析絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的定位，以研究絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的主要受質(嗜中性球彈性蛋白酶)是否存在細胞膜上，我們亦將分析其他受質，包括：蛋白酶3及凝乳酶的表現與定位。

c)絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1下游的傳訊級聯反應的鑑定。經絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1及西維來司他處理達5、10及60分鐘的小鼠及人類胰島將進行蛋白質體學分析，以鑑別關鍵磷酸化蛋白訊號傳導分子實質性的變化。

d)我們將經由創造在b)所鑑定出之可能候選者的功能獲得與功能喪失的小鼠模型，以剖析絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的傳訊途徑。

e)絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1作為胰島素傳訊許可因子的作用：我們將檢驗絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1如何與蛋白質或其他生長因子(例：胰島素及似胰島素生長因子1)交互作用，以研究該作用是否為累加性或協同性。

f)一項近來的研究顯示，注射重組嗜中性球彈性蛋白酶的小鼠呈現肝臟中胰島素受器受質-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)的量及下游傳訊降低(Saswata,et al,Nature Medicine 2012)，因此，一種可能的機制為：絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1及西維來司他的作用，可能直接與它們限制嗜中性球彈性蛋白酶調降胰島素受器受質-1的能力有關。在本文中，我們計畫去分析絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1是否為增進胰島素傳訊分子表現及活化的因子，其中胰島素傳訊分子包括胰島素受器受質-1及下游傳訊分子。

g)我們計畫從事人類胰島及人類β細胞的研究，以進一步制定絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1及相關家族成員於其功能上的角色，而安全並顯著的增強β細胞增殖作用，長期目標為利用此方法來提升糖尿病患者的功能性β細胞質量。以上討論的所有研究具有治療意義。

5)預期結果：我們描述了一種新的肝臟衍生之β細胞生長因子的鑑定，該生長因子在胰島素抗性的情況下促進β細胞增殖，初步結果證實「絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1」為增進β細胞質量所必須，正在進行且計畫的研究方案將提供更多的資料，以支持絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1的潛在用途，及/或絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1產生與功能的調節，及其一或多種家族成員(例：分支B族)作為可能的治療藥劑，以增進人類功能性β細胞質量，治療及/或預防第一型與第2型。

實驗步驟-未於本文它處說明 動物

小鼠被安置在波士頓的佳斯林糖尿病中心(Joslin Diabetes Center)及麻薩諸塞州沃爾瑟姆的布蘭戴斯大學福斯特生物醫學研究實驗室 (Foster Biomedical Research Laboratory,Brandeis University)的無病原體設施，並保持在12小時的光/暗週期的動物房中，所有進行研究及使用步驟已獲佳斯林糖尿病中心與布蘭戴斯大學的動物護理機構和使用委員會同意，並均符合美國國立衛生研究院的指導方針。LIRKO小鼠的產生是經由將Albumin-Cre小鼠與具混合性遺傳背景的IR^flox/flox小鼠雜交，並於C57/Bl6遺傳背景下回交超過15代，LIRKO小鼠(Albumin-Cre^+/-,IR^flox/flox)及它們同窩的Lox對照組(Albumin-Cre^-/-,IR^flox/flox)已被基因定型，如同先前岡田等人所述(2007,Insulin receptors in beta-cells are critical for islet compensatory growth response to insulin resistance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104,8977-8982)。使用自動葡萄糖監測儀(血糖儀(Glucometer Elite)；拜耳公司)監測血糖，並以酵素免疫測定法(晶體化學公司(Crystal Chem))偵測血漿胰島素。為了產生高脂飲食動物，實驗之前對C57/Bl6小鼠餵食含有450卡熱量的高脂飲食達12週，10週齡ob/ob小鼠及其同齡對照組購自傑克遜實驗室(Jackson Laboratory)(緬因州巴港(Bar Harbor,ME))。

連體生物

連體生物手術的進行如先前艾甘(Eggan)等人所述(2006,Ovulated oocytes in adult mice derive from non-circulating germ cells.Nature 441,1109-1114)，術後2週以伊凡氏藍傳導(Pietramaggiori,G.,et al.,(2009).Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation.J.Invest.Dermatol.129,2265-2274)確認交叉循環，每週監測連體動物的體重及血糖，16週的異種共生期間之後，犧牲實驗動物，並收集胰臟以供形態學分析。

胰島的分離與移植

使用管內膠原蛋白酶技術(Kulkarni,R.N.,et al.,(1999)；El Ouaamari,et al.,2013,Cell Rep.,3(2)：401-410).Altered function of insulin receptor substrate-1-deficient mouse islets and cultured beta-cell lines.J.Clin.Invest.104,R69-R75)自9月齡的小鼠分離出胰島，精選出胰島，集中成小球，並保存於冰上直到進行移殖(Flier,S.N.,et al.,(2001).Evidence for a circulating islet cell growth factor in insullin-resistant states.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,7475-7480)，小鼠腹膜內注射(15毫升/克體重)1：1(重量體積比)混合的2,2,2-三溴乙醇及三級戊醇，並以磷酸鹽緩衝液(酸鹼值7.4)1：50稀釋的混合液之後，再進行手術，切開腎臟的腎囊，並將胰島植入5月齡雄性小鼠每個腎臟上端，燒灼該腎囊，而小鼠可在加熱墊上復原。

生長因子及激素測定

使用基於酵素免疫測定法的方法測量生長因子及激素，包括：似胰島素生長因子-1(產品編號#MG100；安迪生物公司(R&D Systems))、肝細胞生長因子(產品編號#ab100686；艾博抗公司(Abcam))、表皮生長因子(產品編號#IB39411；IBL美國，明尼阿波利斯，明尼蘇達州(IBL-America,Minneapolis,MN))、血小板衍生生長因子AA(產品編號#DAA00B；安迪生物公司)、血小板衍生生長因子BB(產品編號#MBB00；安迪生物公司，明尼阿波利斯，明尼蘇達州)、血管內皮生長因子(密理博公司，比爾里卡，麻薩諸塞州(Millipore,Billerica,MA))、纖維母細胞生長因子21(產品編號#EZRMMFGF21-26K；密理博公司)、胃泌素(產品編號#E91224mu；USCN生命科學學院，湖北430056，中國(USCN Life Science,Hubei 430056,PRC))、脂聯素(產品編號#EZMADP-60K；密理博公司)、骨橋蛋白(產品編號#MOST00；安迪生物公司)，及骨鈣化素(產品編號#EIA4010；國際公司(International))。使用多元測定法測量內分泌激素(產品編號#MENDO-75；密理博公司)、腸激素(產品編號#MGT-78K；密理博公司)、脂肪細胞激素(產品編號#MADPK-71K；密理博公司)，及細胞介素/化學激活素(產品編號#MPXMCYTO-70K.lxt；密理博公司)。

血清刺激作用

凝固的血液於攝氏4度，每分鐘轉速8,000轉，離心15分鐘兩次之後獲得血清，並儲存於攝氏-80度下備用。經由釋放酶及嗜熱菌蛋白酶(羅氏公司)分解作用，自5週齡雄性小鼠中分離出胰島，精選出胰島，並於含7mM葡萄糖及10%(體積體積比)胎牛血清的RPMI 1640培養基中培養16小時。總共150個尺寸符合的小鼠胰島以含3mM葡萄糖及0.1%(體積 體積比)牛血清蛋白的RPMI 1640培養基進行肌餓處理達3小時，其後以含5.5mM葡萄糖，每12小時補充來自3或12月齡LIRKO或對照組小鼠之10%(體積體積比)血清的RPMI 1640培養基進行處理。24至48小時後，挑選出胰島，以4%聚甲醛固定，包埋於瓊脂/石蠟中，並切片供免疫組織學研究。為了評估β細胞複製作用，切片經Ki67蛋白、末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記及胰島素免疫染色後，以螢光顯微鏡進行分析。

肝培植體條件培養液刺激作用

肝培植體條件培養液(LECM)之製備法改編自尼可留(Nicoleau)等人(2009,Endogenous hepatocyte growth factor is a niche signal for subventricular zone neural stem cell amplification and self-renewal.Stem Cells 27,408-419)。以阿佛丁(240毫克/公斤，腹膜內注射)麻醉小鼠，並切下LIRKO或對照組小鼠100毫克之肝移植體，以冰磷酸鹽緩衝液清洗移植體兩次，培育於磷酸鹽緩衝液中，於攝氏37度達30分鐘，之後培養於含5.5mM葡萄糖，不含血清的DMEM培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中。3天培養期之後，收集肝培植體條件培養液，離心，並儲存於攝氏-80度下備用。胰島最初於含有3mM葡萄糖及0.1%牛血清蛋白的DMEM培養液中肌餓處理達3小時，之後以含有10%肝培植體條件培養液的DMEM/5.5mM葡萄糖培養液刺激達24小時。經Ki67蛋白、末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記及胰島素免疫染色後，以螢光顯微鏡分析胰島β細胞增殖作用及細胞凋亡。

肝細胞條件培養液刺激作用

透過門靜脈灌流，經由膠原蛋白酶分解作用自6月齡LIRKO及對照組小鼠中分離出肝細胞(Sun,R.,et al.,(2005).IL-6 modulates hepatocyte proliferation via induction of HGF/p21cip1：regulation by SOCS3.Biochem.Biophys.Res.Commun.338,1943-1949)。以阿佛丁(240毫克/公斤，腹膜內注射)麻醉小鼠，並將門靜脈插入JELCO 22G x 1吋導管(史密斯醫療集團，杜柏林，俄亥俄州(Smiths Medical,Dublin,OH))，將肝臟以乙二醇雙氨乙基醚四乙酸溶液(5.4毫莫耳/公升氯化鉀，0.44毫莫耳/公升 磷酸二氫鉀，140毫莫耳/公升氯化鈉，0.34毫莫耳/公升磷酸氫鈉，及0.5毫莫耳/公升乙二醇雙氨乙基醚四乙酸(EGTA)[酸鹼值7.4])進行灌流，並以含0.075%第I型膠原蛋白酶的DMEM培養液進行分解作用，於肝細胞洗滌培養液(英濰捷基公司，格蘭德島，紐約)中清洗肝細胞兩次，將分離的小鼠肝細胞以106細胞/孔的密度，種入含25mM葡萄糖及10%胎牛血清(體積體積比)的DMEM培養液，塗覆膠原蛋白的六孔盤中(巴傲得生物科技，聖荷西，加州(BD BioCoat,San Jose,CA))。16小時後，將肝細胞培養於含5.5mM葡萄糖，不含血清的DMEM培養液達24小時，收集肝細胞條件培養液，離心，並儲存於攝氏-80度下備用。胰島最初於含有3mM葡萄糖及0.1%牛血清蛋白的DMEM培養液中肌餓處理達3小時，之後以含有50%肝細胞條件培養液的DMEM/5.5mM葡萄糖培養液培養達24小時。經Ki67蛋白、末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端標記及胰島素免疫染色後，以螢光顯微鏡分析胰島β細胞增殖作用及細胞凋亡。

人類胰島研究

由聯合胰島分配方案獲得人類胰島，所有研究專案及使用的流程已獲得佳斯林糖尿病中心委員會人類專案之認證(CHS#5-05)。送達後，胰島於邁阿米培養基#1A(Miami Media #1A)(康寧公司(Cellgro))隔夜培養，之後該胰島於最終洗滌/培育培養基(康寧公司，瑪納薩斯，維吉尼亞州(Cellgro,Manassas,VA))中進行肌餓處理達3小時，然後以血清(稀釋至10%體積體積比)、肝培植體條件培養液(稀釋至10%體積體積比)，或肝細胞條件培養液(稀釋至50%體積體積比)，或補充西維來司他或GW311616A的邁阿米培養基#1A刺激達24小時，用於免疫染色研究的胰島如所述(El Ouaamari,et al.,2013)。

免疫染色研究

使用抗Ki67蛋白(巴傲得生物科技)、抗胰島素(艾博抗公司，劍橋，麻薩諸塞州(Abcam,Cambridge,MA))，或抗升糖素(西格瑪奧德里奇公司，聖路易斯，密蘇里州(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))抗體， 經由免疫染色法分析胰臟及胰島，複製中的β及α細胞之定量如先前所述(El Ouaamari,et al.,2013)。

增殖β細胞之計數

於所有實驗中，細胞計數以隱蔽形式由單一觀測員手工操作進行。溴化去氧尿嘧啶(+)或Ki67蛋白(+)β細胞由螢光顯微鏡評估，顯現出細胞核4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚染色的胰島素(+)細胞被視為β細胞，顯現出4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(+)及Ki67蛋白(+)(或溴化去氧尿嘧啶(+))細胞核共定位染色的胰島素(+)細胞被計算為增殖中的β細胞。在所有實驗中隨機選擇細胞，經由共軛焦顯微鏡驗證雙重陽性細胞(胰島素(+)/溴化去氧尿嘧啶(+)或胰島素(+)/Ki67蛋白(+))。

溴化去氧尿嘧啶注射研究

為了免疫染色胰臟，於犧牲實驗動物5小時以前，小鼠經腹膜內注射溴化去氧尿嘧啶(100毫克/公斤體重)，在活體內血清注射實驗中，進行3次溴化去氧尿嘧啶注射，如圖2A所示。

西維來司他及GW311616A給藥

對於西維來司他給藥，將小鼠麻醉，並將含有100微升載體或西維來司他(聖克魯斯生物技術公司(Santa Cruz))的滲透壓幫浦(植入式滲透壓膠囊幫浦(ALZET))植入皮下，西維來司他溶解於50%二甲亞碸中，並以150或300微克/公斤/日的劑量施打，對照組小鼠單獨注入50%二甲亞碸。GW311616A經由每日口腔灌食小鼠給藥達2週，小鼠接受GW311616A(2毫克/公斤體重)或載體。

蛋白質體學

萃取自肝細胞條件培養液的蛋白質在奈米粒子(奈米前景公司，德國)上預先濃縮，經由聚丙烯醯胺膠體電泳預製膠蛋白蛋泳系統4-12%雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷凝膠分散樣本，並使用銀染色套組SilverQuest(英濰捷基公司)進行染色，將結合在奈米沸石上的蛋白質 還原及烷基化，之後於攝氏37度下4小時以天冬胺酸激酶(重量重量比1/50)分解蛋白質，然後於攝氏37度下18小時以胰蛋白酶(重量重量比1/50)分解蛋白質，將酶分解物送至液相層析質譜儀(LC-MS)分析。以極致效能液相層析分析系統(沃特世公司，米爾福德，麻薩諸塞州)連結配備有奈米級電霧源的組合型線性離子阱高分辨質譜儀(賽默飛世爾科技公司，沃爾瑟姆，麻薩諸塞州)來進行液相層析質譜儀實驗，將蛋白質分解物注入極致效能液相層析管柱(液相層析柱C18，5微米，180微米×20毫米，沃特世公司)，並在C18反相極致效能液相層析管柱(BEH130 C18，1.7微米，75微米×250毫米，沃特世公司)中，以250奈升/分鐘的流速，使用線性梯度的7-30%溶劑B(水/乙氰/甲酸，體積比10：90：0.2)達120分鐘，30-90%溶劑B達20分鐘，及90%溶劑B達5分鐘，洗析出胜肽。樣品分為三份注入，使用質譜分析軟體(版本2.07，賽默飛世爾科技公司)得到液相層析質譜儀數據，並經由使用原始檔案庫(由賽默飛世爾科技公司公布)所開發的視覺培基程式軟體進行處理。使用多存取系統控制終端伺服器(版本2.1，基質科技公司；www.matrixscience.com/)，及瑞士蛋白質體資料庫進行資料庫檢索。

西方墨點轉漬法

於裂解緩衝劑(RIPA buffer)中裂解150毫克肝臟，並使用蛋白質濃度測定法(BCA assay)(皮爾斯公司，羅克福德，伊利諾州(Pierce,Rockford,IL))測定總蛋白質濃度，將樣品再懸浮於蛋白質分離緩衝劑(Laemmli buffer)中，煮沸，並經由正十二烷硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白質轉漬至硝基纖維素膜，於阻斷緩衝劑(含5%牛血清蛋白及0.1%聚山梨醇酯20的磷酸鹽緩衝液)中阻斷轉漬膜，並與初級抗體絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1(聖克魯斯，sc-34305；聖克魯斯生物技術公司，聖克魯斯，加州)或肌動蛋白(聖克魯斯，sc-1615)分別培養隔夜或1小時，之後使用次級兔抗山羊抗體(聖克魯斯，sc-2922)，使用影像定量軟體(ImageJ software)(美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州)估算蛋白質之定量。

統計分析

所有數據表示為平均值±均值標準誤差，並使用非配對雙尾學生t檢驗法進行分析，p值小於0.05視為顯著。

參考文獻：

Benarafa, C., Cooley, J., Zeng, W., Bird, P.I., and Remold-O'Donnell, E. (2002). Characterization of four murine homologs of the human ov-serpin monocyte neutrophil elastase inhibitor MNEI (SERPINB1). J Biol Chem 277, 42028-42033.

Benarafa, C., and Remold-O'Donnell, E. (2005). The ovalbumin serpins revisited: perspective from the chicken genome of clade B serpin evolution in vertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 11367-11372.

Boitard, C. (2012). Pancreatic islet autoimmunity. Presse Med 41, e636-650. Butler, A.E., Janson, J., Bonner-Weir, S., Ritzel, R., Rizza, R.A., and Butler, P.C. (2003). Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes 52, 102-110.

Cooley, J., Takayama, T.K., Shapiro, S.D., Schechter, N.M., and Remold-O’Donnell, E. (2001). The serpin MNEI inhibits elastase-like and chymotrypsin-like serine proteases through efficient reactions at two active sites. In Biochemistry, pp. 15762-15770.

D'Amour, K.A., Bang, A.G., Eliazer, S., Kelly, O.G., Agulnick, A.D., Smart, N.G., Moorman, M.A., Kroon, E., Carpenter, M.K., and Baetge, E.E. (2006). Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 24, 1392-1401.

El Ouaamari, A., Kawamori, D., Dirice, E., Liew, C.W., Shadrach, J.L., Hu, J., Katsuta, H., Hollister-Lock, J., Qian, W.J., Wagers, A.J., et al. (2013). Liver-derived systemic factors drive beta cell hyperplasia in insulin-resistant states. Cell Rep 3, 401-410.

Flier, S.N., Kulkarni, R.N., and Kahn, C.R. (2001). Evidence for a circulating islet cell growth factor in insulin-resistant states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 7475-7480.

He, L.M., Sartori, D.J., Teta, M., Opare-Addo, L.M., Rankin, M.M., Long, S.Y., Diehl, J.A., and Kushner, J.A. (2009). Cyclin D2 protein stability is regulated in pancreatic beta-cells. Mol Endocrinol 23, 1865-1875.

Henquin, J.C., and Rahier, J. (2011). Pancreatic alpha cell mass in European subjects with type 2 diabetes. Diabetologia 54, 1720-1725.

Huntington, J.A. (2011). Serpin structure, function and dysfunction. J Thromb Haemost 9 Suppl 1, 26-34.

Kawabata, K., Suzuki, M., Sugitani, M., Imaki, K., Toda, M., and Miyamoto, T. (1991). ONO-5046, a novel inhibitor of human neutrophil elastase. Biochemical and biophysical research communications 177, 814-820.

Kroon, E., Martinson, L.A., Kadoya, K., Bang, A.G., Kelly, O.G., Eliazer, S., Young, H., Richardson, M., Smart, N.G., Cunningham, J., et al. (2008). Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-452.

Macdonald, S.J., Dowle, M.D., Harrison, L.A., Shah, P., Johnson, M.R., Inglis, G.G., Clarke, G.D., Smith, R.A., Humphreys, D., Molloy, C.R., et al. (2001). The discovery of a potent, intracellular, orally bioavailable, long duration inhibitor of human neutrophil elastase--GW311616A a development candidate. Bioorganic & medicinal chemistry letters 11, 895-898.

Muoio, D.M., and Newgard, C.B. (2008). Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 193-205.

Okada, T., Liew, C.W., Hu, J., Hinault, C., Michael, M.D., Krtzfeldt, J., Yin, C., Holzenberger, M., Stoffel, M., and Kulkarni, R.N. (2007). Insulin receptors in beta-cells are critical for islet compensatory growth response to insulin resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 8977-8982.

Qian, W.J., Kaleta, D.T., Petritis, B.O., Jiang, H., Liu, T., Zhang, X., Mottaz, H.M., Varnum, S.M., Camp, D.G., 2nd, Huang, L., et al. (2008). Enhanced detection of low abundance human plasma proteins using a tandem IgY12-SuperMix immunoaffinity separation strategy. Molecular & cellular proteomics : MCP 7, 1963-1973.

Remold-O'Donnell, E., Chin, J., and Alberts, M. (1992). Sequence and molecular characterization of human monocyte/neutrophil elastase inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 5635-5639.

Sennels, L., Salek, M., Lomas, L., Boschetti, E., Righetti, P.G., and Rappsilber, J. (2007). Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. Journal of proteome research 6, 4055-4062.

Talukdar, S., Oh da, Y., Bandyopadhyay, G., Li, D., Xu, J., McNelis, J., Lu, M., Li, P., Yan, Q., Zhu, Y., et al. (2012). Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature medicine 18, 1407-1412.

Vannay, A., Fekete, A., Adori, C., Toth, T., Losonczy, G., Laszlo, L., Vasarhelyi, B., Tulassay, T., and Szabo, A. (2004). Divergence of renal vascular endothelial growth factor mRNA expression and protein level in post-ischaemic rat kidneys. Experimental physiology 89, 435-444.

Yi, P., Park, J.S., and Melton, D.A. (2013). Betatrophin: A Hormone that Controls Pancreatic beta Cell Proliferation. Cell.

<110> 賽諾菲公司 加斯林糖尿病中心公司

<120> 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白：治療β細胞再生之方法及功能

<130> DE2013/025G

<150> EP13305204.3

<151> 2013-02-22

<150> US61/767948

<151> 2013-02-22

<150> EP13306284.4

<151> 2013-09-20

<150> US61/880240

<151> 2013-09-20

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1931

<212> DNA

<213> 小鼠肌肉

<400> 1

<210> 2

<211> 2678

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 379

<212> 蛋白質

<213> 小鼠肌肉

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1前置引子

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1反置引子

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 重組β細胞營養因子前置引子

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 重組β細胞營養因子反置引子

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> TATA結合蛋白前置引子

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> TATA結合蛋白反置引子

<400> 9

<210> 10

<211> 379

<212> 蛋白質

<213> 智人

<400> 10

Claims (44)

1. 一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物作為藥物之用途。
2. 如請求項1之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。
3. 如請求項1之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物。
4. 如請求項1之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的結構性類似物。
5. 如請求項1之用途，其中該研究對象罹患糖尿病。
6. 如請求項1之用途，其中該研究對象具有罹患糖尿病的風險。
7. 一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物，其用以改善研究對象之β細胞功能。
8. 如請求項7之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。
9. 如請求項7之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物。
10. 如請求項7之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的結構性類似物。
11. 如請求項7之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該研究對象罹患糖尿病。
12. 如請求項7之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該研究對象具有罹患糖尿病的風險。
13. 一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物，其用以促進研究對象之β細胞增殖。
14. 如請求項13之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。
15. 如請求項13之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該胰臟β細胞群位於活體內。
16. 如請求項13之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該胰臟β細胞群位於試管內。
17. 如請求項13之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的功能性類似物。
18. 如請求項13之胜肽或活性片段、或其類似物，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係一種已知的結構性類似物。
19. 如請求項13之胜肽或活性片段、或其類似物，其中經由測得該研究對象升糖控管良好表示活體內胰臟β細胞增殖作用良好。
20. 一種編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物之表現構築體，該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物用以改善研究對象β細胞功能。
21. 如請求項20之編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段，或其類似物的表現構築體，其中上述所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。
22. 如請求項20之編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物的表現構築體，其中該所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽類似物係一種已知的功能性類似物。
23. 如請求項20之編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物的表現構築體，其中該所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽類似物係一種已知的結構性類似物。
24. 如請求項20之編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物的表現構築體，其中該研究對象罹患糖尿病。
25. 如請求項20之編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物的表現構築體，其中該研究對象具有罹患糖尿病的風險。
26. 一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物於製造改善研究對象β細胞功能的藥物之用途。
27. 如請求項26之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。
28. 如請求項26之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係已知的功能性類似物。
29. 如請求項26之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係已知的結構性類似物。
30. 如請求項26之用途，其中該研究對象罹患糖尿病。
31. 如請求項26之用途，其中該研究對象具有罹患糖尿病的風險。
32. 一種絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物於製造促進研究對象胰臟β細胞增殖的藥物之用途。
33. 如請求項32之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。
34. 如請求項32之用途，其中該胰臟β細胞群位於活體內。
35. 如請求項32之用途，其中該胰臟β細胞群位於試管內。
36. 如請求項32之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係已知的功能性類似物。
37. 如請求項32之用途，其中該絲胺酸蛋白酶抑制蛋白類似物係已知的結構性類似物。
38. 如請求項32之用途，其中經由測得該研究對象升糖控管良好表示活體內胰臟β細胞增殖作用良好。
39. 一種編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽或活性片段、或其類似物之表現構築體於製造改善研究對象β細胞功能的藥物之用途。
40. 如請求項39之用途，其中該所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽係絲胺酸蛋白酶抑制蛋白B1。
41. 如請求項39之用途，其中該所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽類似物係已知的功能性類似物。
42. 如請求項39之用途，其中該所編碼絲胺酸蛋白酶抑制蛋白胜肽類似物係已知的結構性類似物。
43. 如請求項39之用途，其中該研究對象罹患糖尿病。
44. 如請求項39之用途，其中該研究對象具有罹患糖尿病的風險。