TW201529602A - 對抗抗凝血酶β之單株抗體 - Google Patents

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Abstract

本專利文件係有關針對對抗與肝素及/或肝素樣結構複合之人類抗凝血酶β(ATβH)之抗體、抗原結合抗體片段(Fabs)、及其他蛋白鷹架(protein scaffolds)。彼等ATβH結合蛋白能封阻ATβ之抗凝血活性以誘導凝血。本文敘述彼等抗體與結合劑之治療用途以及淘選(panning)與篩選特異性抗體之方法。

Description

對抗抗凝血酶β之單株抗體
本專利文件係有關針對對抗與肝素及/或肝素樣結構複合之人類抗凝血酶β(ATβH)之抗體、抗原結合抗體片段(Fabs)、及其他蛋白鷹架(protein scaffolds)。彼等ATβH結合蛋白能封阻ATβ之抗凝血活性以誘導凝血。本文敘述彼等抗體與結合劑之治療用途以及淘選(panning)與篩選特異性抗體之方法。
相關申請案之交叉參考
本申請案請求2013年3月15日提出申請的美國臨時申請案No.61/799,629之優先權，其全部揭示內容併入本文以資參考。
序列表提交
與本申請案關聯之序列表係經由EFS-Web呈電子版式歸檔，其全部內容併入本說明書以資參考。於此所用章節標題僅供組織目的，決不擬對所述主題構成侷限。
背景
當前血友病領域未滿足之醫療需求主要為：(1)以抑制劑治療血友病病患(~30%血友病病患)；及(2)長效且有效之凝血因子(FVIII/FIX)及/或其替代物[旁通藥物(bypass drugs)](WFH report 2012,Paris)。以抑制劑治療血友病病患最廣泛使用之旁通藥物為rFVII，其具有例如血栓形成 之風險、於血漿中之半衰期短及生產成本高等主要缺點。對抗例如組織因子蛋白抑制劑(TFPI)、APC(活化蛋白C)與抗凝血酶(AT)等抗凝血因子之抗體代表新穎之治療模式。彼等抗體不僅於使用抑制劑之血友病病患中越過(bypass)或減少對FVIII或FIX凝血因子之需求，同時亦展現較長之血漿半衰期(減少給藥頻率)，因而，增加病患順從性。迄今，於臨床前開發或研究階段已有數種抗體系促凝血藥物，例如抗TFPI與抗APC。
AT為人類血漿中之主要抗凝血劑；其抑制凝血酶、FXa及於凝血途徑中具有作用之其他絲胺酸蛋白酶；其係由432個胺基酸構成，由肝細胞產生及具有三天之長血漿半衰期(Collen,Schetz et al.1977)。AT之胺基酸序列具高度保守性，與牛、羊、兔、小鼠與人類間之同源性為84%-89%(Olson and Bjork 1994)。AT之主要生理標靶雖為凝血酶與FXa，其亦較少程度地抑制FIXa、FXIa、FXIIa、以及FVIIa。AT與肝素一起發揮其抑制作用。於肝素存在下，AT對凝血酶與FXa之抑制率分別從7-11 x 103M-1s-1至1.5-4 X 107M-1s-1和從2.5 x 10-3M-1s-1至1.25-2.5M-1s-1，增加幅度為3至4階(order)(Olson,Swanson et al.2004)。
不同於TFPI與APC分別僅於開始階段及擴大階段抑制凝血，AT於開始及擴大兩個階段均發揮其對凝血之抑制作用。因此，封阻AT可能比單獨封阻TFPI或者APC具更有利之促凝血作用。降低之AT量與活性已被證實與人類之血栓形成增加相關聯。缺乏AT之病患有顯現復發性靜脈血栓形成及肺栓塞之傾向(van Boven and Lane 1997)。再者，同型接合AT基因剔除小鼠以極端高凝血狀態於胚胎階段死亡(Ishiguro,Kojima et al.2000)。最近之研究證實，於夾尾出血模式中，其中AT減少50%之異型接合AT基因剔除hema小鼠失血量(blood loss)明顯較少及凝血酶產生提高(Bolliger,Szlam et al.2010)。
AT係基於Asn135上之醣基化差別而具ATα與ATβ兩種同功型(isoform)之醣蛋白(Bjork 1997)。ATβ於Asn135未醣基化，為較小之醣同功型，佔人類血漿AT之10%。Asn135位於鄰接初始之肝素連接部位，於異位活化及D螺旋延伸後，構成延伸之肝素結合部位之一部分(dela Cruz,Jairajpuri et al.2006)。Asn135處缺少體積龐大的聚醣，以兩個方式深深影響ATβ之活化：1)於抑制FXa與FIXa所需之肝素結合後，異位活化較快；及2)利用橋接機制之針對抑制FXa與凝血酶之較高親和性肝素結合之額外可接近之結合部位。的確，於生理鹽濃度下，血漿衍生之ATβ以36+/- 3nm之KD結合於肝素，而ATα則以500+/- 50nm之KD結合於肝素(Turk IV.et al.,1993)。ATβ對肝素之較高親和性導使其優先分佈至富含肝素樣結構-醣胺聚醣-之內皮下層。因此，ATβ被提出在血管傷害部位之FXa與凝血酶之抑制上扮演主要且強有力之角色(Carlson and Atencio 1982；McCoy AJ,Pei XY.et al.2003；Turk B,Brieditis I.et al.1997；Witmer MR,Hatton MW.1991；Frebelius S,et al.1996)。於臨床研究中，ATβ相對於ATα之重要性與較強效力亦見報導。於病患中，利用β型AT使肝素結合中之AT同型接合突變缺陷獲得改善(Martinez-Martinez,Navarro-Fernandez et al.2012)。於另一研究中，AT之臨界量(正常AT抗原與活性之~70%)由血漿中之20%~30% ATβ補償(compensated)(Bayston,Tripodi et al.1999)。
概述
本發明提供針對人類ATβH(與肝素及/或肝素樣結構複合之ATβ)之單株抗體。於至少一具體實例中，抗ATβH單株抗體展現結合於與肝素複合之ATβ。
於其他具體實例中，針對ATβH之單株抗體可予以最適化 以例如具有增加之親和性或增加之功能活性；亦提供可能在人類ATβH上及與單離之單株抗體結合之特異性抗原決定區；進一步提供編碼該單株抗體之單離核酸分子。
本發明亦提供包含抗ATβH單株抗體之醫藥組成物，及治療例如A型與B型血友病之遺傳性及後天性凝血缺失或缺陷之方法。
本發明亦提供利用投予有其需要之病患抗ATβH單株抗體以縮短出血時間之方法；亦提供產生結合人類ATβH之單株抗體之方法。
熟習技藝者將理解，下文敘述之圖式僅供說明用途；決不擬對本發明之教示或專利申請之範圍構成侷限。
圖1顯示結合於肝素之ATβ及ATβ不同結合功能區之示意圖式。
圖2A-2C顯示由於缺少一個N-聚醣之ATβ與ATα之區別。
圖3A-3D顯示ATβ與肝素較快結合且比ATα具更強力之抑制作用。
圖4A-4C顯示利用噬菌體呈現發現抗體之各種策略。
圖5顯示用於識別能功能性抑制ATβ：：肝素的抗體之篩選方法。
圖6A與6B分別顯示下列諸抗體輕鏈功能區與重鏈功能區胺基酸序列之序列排比：抗體TPP-2009(分別為SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2)、TPP-2015(分別為SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4)、TPP-2016(分別為SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6)、TPP-2019(分別為SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8)、及TPP-2803(分別為SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：10)。
圖7A-7C顯示利用Biacore(圖7A)與ELISA(圖7B)等試驗測定之抗體結合特異性，及針對人類AtβH之抗體結合親和性(圖7C)。
圖8A-8B顯示說明人類HEM-A血漿中，TPP抗體對凝血酶產生影響之圖示(圖8A)及對應數據(圖8B)，並說明抗體存在增加人類HEM-A血漿 中之峰值凝血酶產生。
圖9係於HEM-A小鼠中，使用0.3、3與30毫克/公斤之IV給藥，每個時間點三隻小鼠(21天10個時間點)之抗體TPP 2009之PK圖示，及相關PK參數。
圖10A與10B顯示尾靜脈橫切(TVT)模式HemA中之實驗流程及抗體TPP-2009於TVT模式HemA小鼠中之效力。
圖11A與11B顯示有/無肝素複合之原態ATβ三維結構之分子模式(圖11A)，與結合於肝素之完全活化抗體TPP2009及其預測之抗原決定區結構。
圖12使用FXa活化之凝血試驗顯示，於正常人類血漿以及血友病病患血漿二者中，TPP2803展現劑量依賴性地縮短凝血時間。CT：凝血時間，HEM-A：A型血友病血漿。
圖13顯示肝素抗凝(heparinized)兔出血模式之實驗設計；實驗組別：媒劑，PBS；正對照組，硫酸魚精蛋白(28毫克/公斤IV)；負對照組，M14 IgG2；處理：30毫克/公斤；TPP2803，3毫克/公斤；TPP2803，30毫克/公斤。
圖14顯示於肝素抗凝兔出血模式中，LMWH及化合物給藥前後，對照組及TPP2803對出血時間之影響。
圖15顯示對照組及TPP2803對出血時間差量(delta)之影響；與PBS顯著不同(p<0.05；T檢定)。
圖16顯示LMWH及抗體給藥前後，對照組及TPP2803對失血量之影響(經由T檢定具顯著性)。
詳細說明
本發明提供特異性地結合於活化型ATβ，惟針對ATα型展現相對少或無反應性之原態或者活化之抗體，包括單株抗體及其他結合蛋白。
界定
為了解釋本說明書之目的，將應用下述界定。下文提出之任何界定與該語詞於任何其他文件(包括併入本文中參考之任何文件)中之用法不一致之情況下，除非明確意指相反意義(例如於原本使用該術語之文件中)，否則為了解釋本說明書及其相關專利申請之目的，將以下文提出之界定為主(shall always control)。
適當時，呈單數形使用之術語亦涵蓋其複數形意義，反之亦然。本文所用之“a”除非另行陳述或者使用“一或多個”顯然不適當，否則係意指“一或多個”。除非另行陳述，否則使用"或"意指"及/或"。“comprise”、“comprises”、“comprising”、“include”、“includes”、與“including”可互換使用而無限制性。術語“such as”、“for example”、與“e.g.”亦不擬具限制性。舉例而言，“包括”一詞將意指“包括，惟不限於”。
本文所用之“約”係指所提供單位數值之+/- 10%。本文所用之“實質上”係指表示所關注特徵或性質之全部或近似程度之定性狀況。一般熟習生物學技藝者將理解，由於影響生物及化學組成物與材料之測試、製造、與貯存的許多變數，及由於化學組成物與材料之測試、製造、與貯存中所用儀器和設備之固有誤差，生物及化學現象很少，若有的話，達成或避開絕對結果。因此實質上一詞在本文中係用以擷取許多生物及化學現象中固有之潛在缺乏完整性。
本文所用之“ATβ”或“ATβH”等詞係指由細胞自然表現，存在血漿中，而與ATα呈不同形式之AT之任何變異體、同功型、及/或物種 同源物。進一步，本文所用之“ATβ”或“ATβH”等詞亦可指與肝素或肝素樣結構複合之活化型ATβ。
本文所用之“抗體”一詞係指整個抗體及其任何抗原結合片段(亦即，“抗原結合部分”)或單鏈。此術語包括天然存在或經由正常免疫球蛋白基因片段重組程序形成之全長免疫球蛋白分子(例如，IgG抗體)，或保留特異性結合活性之免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如抗體片段。與結構無關地，抗體片段與由全長抗體識別之相同抗原結合。舉例而言，抗ATβH單株抗體片段結合於ATβH之抗原決定區。抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。抗體之“抗原結合部分”一詞中涵蓋的結合片段之實例包括：(i)由VL、VH、CL與CH1功能區構成之Fab片段、單價片段；(ii)包含於絞鏈區利用雙硫橋鍵連接的兩個Fab片段之F(ab’)2片段、雙價片段；(iii)由VH與CH1功能區構成的Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL與VH功能區構成之Fv片段；(v)由VH功能區構成之dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341：544-546)；(vi)單離之互補決定區(CDR)；(vii)微型抗體、二聚抗體(diabodies)、三聚抗體(triabodies)、四聚抗體(tetrabodies)、與κ體(參見，例如，Ill et al.,Protein Eng 1997；10：949-57)；(viii)camel IgG；及(ix)IgNAR。再者，雖然Fv片段、VL與VH的兩個功能區係由不同基因編碼，惟彼等可利用合成連接子，使用重組方法接合，使其能製成其中VL與VH區配對形成單價分子之單一蛋白鏈(所謂單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird et al.(1988)Science 242：423-426；與Huston et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體亦涵蓋於抗體之“抗原結合部分”一詞內。彼等抗體片段係使用熟習此項技藝者已知之習用技術製得，該等片段以如完整抗體之相同方式進行效用分析。
此外，可設想的是，抗原結合片段涵蓋於抗體模擬物中。 本文所用之“抗體模擬物”或“模擬物”係指展現類似於特定抗體結合活性之蛋白質，惟係較小之替代抗體或非抗體蛋白。此類抗體模擬物可包含於支架(scaffold)中。“支架”係指用於建造具專用(tailored)功能與特徵的新產物之多肽平臺。
本文所用之“抗ATβ抗體”一詞係指特異性結合於與肝素或肝素樣組合的ATβ之抗原決定區之抗體。於活體內結合於ATβH之抗原決定區時，本文揭示之抗ATβ抗體增加一或多方面之血液凝結級聯。
本文所用之“抑制結合”與“封阻結合”(例如，參照ATβ基質結合於ATβH之抑制/封阻)等術語可互換使用且涵蓋蛋白質與其基質之部分及完全抑制或封阻二者，例如抑制作用或封阻by至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或約100%。
關於ATβ基質結合於ATβ之抑制及/或封阻，抑制及封阻等詞亦包括相較於ATβ未與抗ATβ抗體接觸，於與抗ATβ抗體接觸時，ATβ及/或AtβH與生理基質結合親和性任何可測量之減少例如，封阻ATβ與其基質之相互作用至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或約100%。
本文所用之“單株抗體”或“單株抗體組成物”等術語係指單一分子組成之抗體分子。單株抗體組成物針對特定抗原決定區表現單一結合特異性與親和性。因此，本文所用之“人類單株抗體”一詞係指表現具有衍生自人類胚原免疫球蛋白序列之變異區與恆定區之單一結合特異性之抗體。人類抗體可包含不為人類胚原免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，由活體外隨機或定位突變或由活體內體細胞突變引起之突變)。
本文所用之“單離抗體”一詞擬意指實質上不含其他生物分子之抗體，包括具不同抗原特異性之抗體(例如，結合於ATβH之單離抗體實質上不含結合ATβH以外的其他抗原之抗體)。於若干具體實例中，單離抗體以乾重計，為至少約75%、約80%、約90%、約95%、約97%、約99%、約99.9%或約100%純。於若干具體實例中，純度可利用例如管柱層析法、聚丙烯醯胺凝膠電泳法、或HPLC分析等方法測定。然而，結合於人類ATβH抗原決定區、同功型或變異體之單離抗體，可與例如得自其他物種之其他相關抗原(例如，ATβH物種同源物)具交叉反應性。此外，單離之抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學品。
本文所用之“特異性結合”一詞係指抗體結合於預定抗原。展現特異性結合之抗體通常以至少約105M-1之親和性結合於抗原，及以較其針對不相關抗原(例如，BSA、酪蛋白)之結合親和性高出，例如至少兩倍以上之親和性結合於該抗原。“識別抗原之抗體”與“對抗原具特異性之抗體”等詞組於本文中可與“特異性結合於抗原之抗體”互換使用。本文所用之“最小結合”一詞係指不結合於特定抗原及/或對特定抗原展現低親和性之抗體。通常，對抗原具最小結合之抗體，以低於約102M-1之親和性結合於該抗原，且不以較其結合於不相關抗原更高之親和性結合於預定抗原。
於本文中用於抗體例如IgG抗體時，“高親和性”係指至少約107M-1之結合親和性；於至少一具體實例中，至少約108M-1；於若干具體實例中，至少約109M-1、約1010M-1、約1011M-1或更高，例如，高達約1013M-1或更高。然而，其他同型抗體之“高親和性”結合則可不同；例如，同型IgM之“高親和性”結合係指至少約107M-1之結合親和性。
本文所用之“同型”一詞係指由重鏈恆定區基因碼編之抗 體類別(例如，IgM或IgG1)。
本文所用之“互補決定區”或“CDR”等術語係指形成與所結合抗原之三維結構互補之N端抗原結合表面的抗體分子重鏈變異區或輕鏈變異區內三個高度變異區之一者。從重鏈或輕鏈之N端開始，彼等互補決定區分別以“CDR1”、“CDR2”與“CDR3”表示[Wu TT,Kabat EA,Bilofsky H,Proc Natl Acad Sci U S A.1975Dec；72(12)：5107與Wu TT,Kabat EA,J Exp Med.1970 Aug 1；132(2)：211]。CDR涉及抗原-抗體結合，CDR3包含對抗原-抗體結合具特異性之獨特區域。因此，抗原結合部位可包括由得自各個重鏈與輕鏈V區之CDR區構成之六個CDR。“抗原決定區”一詞係指與抗體特異性結合或相互作用的抗原之區域或部位，於若干具體實例中，係表示抗原與抗體物理接觸之處。相反地，“抗原互補位”係指抗原特異性結合其上之抗體之區域或部位。特徵為競爭性結合之抗原決定區，若對應抗體之結合互相排斥，亦即，一抗體之結合排除另一抗體之同時結合，則被稱為是重疊的；若抗原能容納兩個對應抗體同時結合，則該等抗原決定區被稱為是分離(獨特)的。
本文所用之“競爭抗體”一詞指如本文所述之對抗ATβH之抗體，乃結合於大約相同、實質上相同、基本上相同、或甚至相同抗原決定區之抗體。競爭抗體包括具重疊抗原決定區特異性之抗體。競爭抗體因而能有效地與如本文所述之抗體競爭結合於ATβH。於若干具體實例中，競爭抗體可結合於與本文所述抗體相同之抗原決定區。替代地觀察，競爭抗體具有與本文所述抗體相同之抗原決定區特異性。
本文所用之“保守性置換”一詞係指涉及以不會導致多肽喪失生物或生化功能之具類似生化性質之胺基酸置換一或多個胺基酸之多肽修飾。保守性胺基酸置換係其中以具類似側鏈之胺基酸殘基替換胺基 酸殘基者。有類似側鏈之胺基酸殘基家族於此項技藝中已界定。彼等家族包括具鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、無電荷之極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。本發明之抗體可具有一或多個保守性胺基酸置換惟仍保留抗原結合活性。
就核酸與多肽而言，本文所用之“實質同源性”表示，具適當核苷酸或胺基酸插入或刪除之兩個核酸或兩個多肽，或其指定序列，於最適序列排比及相較時，至少約80%核苷酸或胺基酸，通常至少約85%，於若干具體實例中，約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、或約95%，於至少一具體實例中，至少約96%、約97%、約98%、約99%、約99.1%、約99.2%、約99.3%、約99.4%、或約99.5%之核苷酸或胺基酸具同一性。替代地，當區段於選擇性雜交條件下與互補股(complement of the strand)雜交時，即存在核酸之實質同源性；亦包括與本文詳述之特異性核酸序列與胺基酸序列具實質同源性之核酸序列與多肽序列。慮及為了兩個序列之最適序列排比需要引入之間隙(gap)數與各間隙長度下，兩個序列間之同一性百分比為該等序列共有之同一性位置數(亦即，%同源性=同一性位置#/總位置# x 100)之函數。兩個序列間之序列比較及同一性百分比之測定可使用數學演算法完成，例如惟不限於VectorNTITM之AlignXTM模組(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。關於AlignXTM，多序列排比之內定參數為：間隙開口懲罰值(penalty)：10；間隙延伸懲罰值：0.05；間隙分離懲罰值範圍：8；序列排比延緩(delay)同一性%：40。
慮及為了兩個序列之最適序列排比需要引入之間隙(gap)數與各間隙長度下，兩個序列間之同一性百分比為該等序列共有之同一性位置數(亦即，%同源性=同一性位置#/總位置# x 100)之函數。兩個序列間之序列比較及同一性百分比之測定可使用數學演算法完成，例如惟不限於VectorNTITM之AlignXTM模組(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。關於AlignXTM，多序列排比之內定參數為：間隙開口懲罰值：10；間隙延伸懲罰值：0.05；間隙分離懲罰值範圍：8；序列排比延緩(delay)同一性%：40。(進一步細節見http：//www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEACommunities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html)。
測定查詢序列(本發明序列)與主題序列間之整體匹配性(overall match)(亦稱為總體序列排比)之另一方法可使用CLUSTALW電腦程式(Thompson et al.,Nucleic Acids Research,1994,2(22)：4673-4680)，其係根據Higgins et al.,Computer Applications in the Biosciences(CABIOS),1992,8(2)：189-191之演算法。於序列排比中，該查詢序列與主題序列皆為DNA序列。該總體序列排比之結果為同一性百分比。可用於DNA序列之CLUSTALW序列排比中之經由成對序列排比計算同一性百分比之參數為：Matrix=IUB、k-元組=1、頂對角線數(Number of Top Diagonals)=5、間隙懲罰值=3、間隙開口懲罰值=10、間隙延伸懲罰值(penalty)=0.1。關於多序列排比，可使用下述CLUSTALW參數：間隙開口懲罰值=10、間隙延伸參數=0.05；間隙分離懲罰值範圍=8；序列排比延緩同一性%=40。
核酸可存在完整細胞、細胞溶解物中，或呈部分純化或實質上之純型。與天然環境中通常相關之其他細胞成分純化分離時之核酸為 “單離”或“成為實質上純”之核酸。欲單離核酸，可使用例如下述標準技術：鹼/SDS處理、CsCl顯帶(banding)、管柱層析法、瓊脂凝膠電泳法及此項技藝中悉知之其他技術。
對抗ATβH之單株抗體
於血友病中體內平衡失調或於創傷病患中傷口造成暫時喪失止血功能之出血性疾患可利用AT抑制劑治療。抗體、其抗原結合片段及其他AT特異性蛋白鷹架可用於提供靶向特異性以抑制AT蛋白質功能之子集而同時保持其餘功能。鑑於ATβ(<12微克/毫升)對ATα(120微克/毫升)血漿濃度之至少10倍差異，於高循環過量ATα存在下，任何潛在ATβ抑制劑療法增加之特異性有助於封阻ATβ功能。封阻ATβ抗凝血功能之ATβ特異性抗體可作為出血性疾患病患之治療劑用。出血性疾患之實例包括血友病、使用抑制劑之血友病病患、創傷引起之凝血病變、以AT治療敗血症期間嚴重出血之病患、非急需手術(elective surgery)例如移植、心臟手術、整型外科手術造成之出血、及由於月經過多之出血。具長循環半衰期之抗ATβH抗體可用於治療慢性疾病如血友病。具較短半衰期之ATβH抗體片段或ATβH結合蛋白鷹架可更有效地用於急性用途(例如創傷治療用途)。利用淘選及篩選對抗於肝素複合物中之人類ATβ之人類抗體庫，以鑑定ATβH結合抗體。經所鑑定抗體展現結合於人類ATβH。將各單離單株抗體之重鏈變異區與輕鏈變異區定序，並鑑定其CDR區。茲將對應於ATβH特異性單株抗體重鏈與輕鏈變異區之序列識別符編號(“SEQ ID NO”)概述於表1A中。
表1A-人類抗ATβH(與肝素複合之ATβ)抗體
於至少若干可能之具體實例中，單離之單株抗體結合於人類ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含由選自包括SEQ ID NOS：2、4、6、8、與10之組群之胺基酸序列構成之重鏈變異區。
於至少若干可能之具體實例中，單離之單株抗體結合於人類ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含由選自包括SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9之組群之胺基酸序列構成之輕鏈變異區。
於至少若干可能之具體實例中，單離之單株抗體結合於人類ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含由選自包括SEQ ID NOS：2、4、6、8、與10之組群之胺基酸序列構成之重鏈變異區及由選自包括SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9之組群之胺基酸序列構成之輕鏈變異區。
於至少若干可能之具體實例中，抗體包含重鏈與輕鏈變異區，其包含： (a)由SEQ ID NO：2之胺基酸序列構成之重鏈變異區，及由SEQ ID NO：1之胺基酸序列構成之輕鏈變異區；(b)由SEQ ID NO：4之胺基酸序列構成之重鏈變異區，及由SEQ ID NO：3之胺基酸序列構成之輕鏈變異區；(c)由SEQ ID NO：6之胺基酸序列構成之重鏈變異區，及由SEQ ID NO：5之胺基酸序列構成之輕鏈變異區；或(d)由SEQ ID NO：8之胺基酸序列構成之重鏈變異區，及由SEQ ID NO：7之胺基酸序列構成之輕鏈變異區；或(e)由SEQ ID NO：10之胺基酸序列構成之重鏈變異區，及由SEQ ID NO：9之胺基酸序列構成之輕鏈變異區。
表1B顯示關於擬人化IgG mAb之重鏈與輕鏈胺基酸序列。
表1C-顯示胚原化及轉化為IgG2之TPP2803 IgG2。TPP2803 IgG2輕鏈G2，λ，胺基酸序列示於表1C，為SEQ ID NO：59及示於表1C之TPP2803重鏈胺基酸序列，為SEQ ID NO：60。
表2A提供結合於人類ATβH之單株抗體重鏈與輕鏈CDR區(“CDR1”、“CDR2”、與“CDR3”)之SEQ ID NO摘要。
表2B提供結合於人類ATβH之單株抗體重鏈與輕鏈CDR區(“CDR1”、“CDR2”、與“CDR3”)之SEQ ID NO序列。
於至少若干可能之具體實例中，係提供單離之單株抗體，其結合於人類ATβH，其中該抗體包含由SEQ ID NOS：46-50之任一胺基酸序列構成之CDR3。彼等CDR3得自淘選及篩選過程中所鑑定抗體之重鏈。
於進一步具體實例中，此抗體進一步包含：(a)由選自包括SEQ ID NOS：36-40之組群之胺基酸序列構成之CDR1；(b)由選自包括SEQ ID NOS：41-45之組群之胺基酸序列構成之CDR2；或(c)由選自包括SEQ ID NOS：36-40之組群之胺基酸序列構成之CDR1與由選自包括SEQ ID NOS：41-45之組群之胺基酸序列構成之CDR2二者。
於至少若干可能之具體實例中，該等抗體共用得自淘選及篩選過程中所鑑定抗體輕鏈之一者之CDR3。因而，本發明亦提供單離之 單株抗體，其中該抗體結合於ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含由選自包括SEQ ID NOS：31-35之組群之胺基酸序列構成之CDR3。於進一步具體實例中，抗體進一步包含(a)由選自包括SEQ ID NOS：21-25之組群之胺基酸序列構成之CDR1、(b)由選自包括SEQ ID NOS：26-30之組群之胺基酸序列構成之CDR2、或(c)由選自包括SEQ ID NOS：21-25之組群之胺基酸序列構成之CDR1與由選自包括SEQ ID NOS：26-30之組群之胺基酸序列構成之CDR2二者。
於至少若干可能之具體實例中，抗體包含得自篩選及淘選中鑑定之抗體重鏈與輕鏈之CDR3。所提供者為單離之單株抗體，其中該抗體結合於ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含由選自包括SEQ ID NOS：46-50之組群之胺基酸序列構成之CDR3及由選自包括SEQ ID NOS：31-35之組群之胺基酸序列構成之CDR3。於進一步具體實例中，抗體進一步包含：(a)由選自包括SEQ ID NOS：36-40之組群之胺基酸序列構成之CDR1；(b)由選自包括SEQ ID NOS：41-45之組群之胺基酸序列構成之CDR2；(c)由選自包括SEQ ID NOS：21-25之組群之胺基酸序列構成之CDR1；及/或(d)由選自包括SEQ ID NOS：26-30之組群之胺基酸序列構成之CDR2。
於若干具體實例中，抗體包含重鏈與輕鏈變異區，其包含：(a)由包含SEQ ID NOS：21、26、與31之胺基酸序列構成之輕鏈變異區及由包含SEQ ID NOS：36、41、與46之胺基酸序列構成之重鏈變異區；(b)由包含SEQ ID NOS：22、27、與32之胺基酸序列構成之輕鏈變異區及由包含SEQ ID NOS：37、42、與47之胺基酸序列構成之重鏈變異區； (c)由包含SEQ ID NOS：23、28、與33之胺基酸序列構成之輕鏈變異區及由包含SEQ ID NOS：38、43、與48之胺基酸序列構成之重鏈變異區；(d)由包含SEQ ID NOS：24、29、與34之胺基酸序列構成之輕鏈變異區及由包含SEQ ID NOS：39、44、與49之胺基酸序列構成之重鏈變異區；(e)由包含SEQ ID NOS：25、30、與35之胺基酸序列構成之輕鏈變異區及由包含SEQ ID NOS：40、45、與50之胺基酸序列構成之重鏈變異區。
本發明亦提供單離之單株抗體，其結合於ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含與選自包括SEQ ID NOS：1-10中提出之胺基酸序列組群之胺基酸序列具有至少約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或約99.5%同一性之胺基酸序列。
抗體可具物種特異性或可與多個物種交叉反應。於若干具體實例中，抗體可與人類、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猴、豬、狗、貓或其他哺乳類物種之ATβH特異性地反應或交叉反應。
抗體可為任何各類別之抗體，例如惟不限於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、與IgD、及IgE抗體。
於一具體實例中，所提供者為針對人類ATIII之單離之完全人類單株抗體。
抗ATβH抗體之最適化變異體
於若干具體實例中，可淘選、篩選及最適化抗體，舉例而言，以增加對ATβH之親和性、進一步減少對ATα之任何親和性、增進與 不同物種之交叉反應性、或增進ATβH之封阻活性。此類最適化可，舉例而言，利用抗體之CDRs或緊鄰CDRs(亦即，與CDRs相鄰約3或4個殘基)之胺基酸殘基之位點飽和誘變進行。
本發明亦提供對ATβH具有增加或高親和性之單株抗體。於若干具體實例中，抗ATβH抗體可具有至少約108M-1，於若干其他具體實例中，可具有至少約109M-1、約1010M-1、約1011M-1或更高，例如，高達約1013M-1或更高之結合親和性。
於若干具體實例中，可引入另外之胺基酸修飾以減少與胚原序列趨異(divergence)。於其他具體實例中，可引入胺基酸修飾以促進大規模生產程序之抗體產生。
於若干具體實例中，本發明提供單離之特異性地結合於人類ATβ之抗ATβH單株抗體，該抗體可包含一或多個胺基酸修飾。於若干具體實例中，抗體可包含約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、或約20或更多個修飾。
抗原決定區
本發明亦提供可結合於人類ATβH之預測抗原決定區之單離單株抗體，其中抗原決定區包含如圖11所示之得自人類ATβH之一或多個殘基。
於若干具體實例中，抗原決定區包含人類AtβH之N135位點。於其他具體實例中，該位點可包含人類ATβH RCL環之部分胺基酸殘基序列。
本發明亦提供可與本文所述之任何抗體競爭結合於人類ATβH之抗體。舉例而言，此類競爭抗體可結合於上文敘述之一或多個抗 原決定區。
核酸、載體與宿主細胞
本發明亦提供編碼本文所述之任何單株抗體之單離核酸分子。因此，本發明亦提供編碼結合於人類ATβH之抗體之單離核酸分子。表3顯示若干抗ATβH抗體之核苷酸序列。
於若干具體實例中，單離之核酸分子編碼結合於ATβH並抑制抗凝血活性惟對ATα具最小結合之抗體，其中抗體包含由選自包括SEQ ID NOS：2、4、6、8、與10之組群之胺基酸序列構成之重鏈變異區。
於若干具體實例中，單離之核酸分子編碼結合於ATβH並抑制抗凝血活性之抗體對ATα具最小結合之抗體，其中抗體包含由選自包括SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9之組群之胺基酸序列構成之輕鏈變異區。
於其他具體實例中，單離之核酸分子編碼結合於ATβH並抑制ATβ之抗凝血活性之抗體，其中抗體包含由選自包括SEQ ID NOS：2、4、6、8、與10之組群之胺基酸序列構成之重鏈變異區或由選自包括SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9之組群之胺基酸序列構成之輕鏈變異區及於該重鏈變異區或輕鏈變異區中之一或多個胺基酸修飾。
此外，本發明亦提供包含編碼上文敘述之任何單株抗體的 單離核酸分子之載體及包含此類載體之宿主細胞。
針對ATβH的抗體之製備方法
單株抗體可利用於宿主細胞中表現編碼根據本發明一具體實例單株抗體變異區之核苷酸序列而重組產生。於表現載體幫助下，含核苷酸序列之核酸於適用於生產之宿主細胞中轉染及表現。因此，用於生產與人類ATβH結合之單株抗體之例示方法可包括：(a)轉染編碼單株抗體之核酸分子入宿主細胞中；(b)培養宿主細胞，以於該宿主細胞表現單株抗體，及(c)視需要單離及純化所產生之單株抗體，其中核酸分子包含編碼單株抗體之核苷酸序列。
於一實例中，欲表現抗體、或其抗體片段，乃將利用標準分子生物學技術製得之編碼部分或全長輕鏈與重鏈之該等DNA嵌入表現載體中，使該等基因可操作地連接於轉錄及轉譯控制序列。於本說明書中，“可操作地連接”一詞係指將抗體基因連接於載體，俾使該載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控轉錄及轉譯該抗體基因之預期功能。該等表現載體與表現控制序列係經挑選而與所用之表現宿主細胞相容。抗體輕鏈基因與抗體重鏈基因可嵌入不同載體中或，替代地，兩個基因均嵌入相同表現載體中。該等抗體基因係利用標準方法嵌入表現載體中(例如，連接抗體基因片段上之互補限制位點與載體，或若無限制位點則鈍端連接)。本文所述抗體之輕鏈與重鏈變異區可藉由將其嵌入已編碼所期望同型重鏈恆定區與輕鏈恆定區之表現載體中，俾使VH區段可操作地連接於載體內之CH區段及VL區段可操作地連接於載體內之CL區段，用以產生任何同型抗體之全長抗體基因。
此外，或替代地，重組表現載體可編碼促進從宿主細胞分泌抗體鏈之訊息胜肽。抗體鏈基因可選殖至載體中，俾使訊息胜肽連接至 抗體鏈基因之胺基端框架內。訊息胜肽可為免疫球蛋白訊息胜肽或異源訊息胜肽(亦即，得自非免疫球蛋白蛋白質之訊息胜肽)。除抗體鏈編碼基因外，重組表現載體攜帶控制抗體鏈基因於宿主細胞中表現之調控序列。“調控序列”一詞包括啟動子、增強子、與控制抗體鏈基因轉錄或轉譯之其他表現控制元件(例如，多聚腺苷酸化訊息)。此類調控序列見述於，例如，Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中。熟習此項技藝者將理解，表現載體之設計(包括調控序列之選擇)可取決於如欲轉形宿主細胞之選擇、所期望蛋白質之表現量等因素。用於哺乳類宿主細胞表現之調控序列實例包括引導於哺乳類細胞中大量表現蛋白質之病毒元件，例如衍生自細胞巨大病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒[例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)]與多瘤病毒之啟動子及/或增強子。替代地，可使用非病毒調控序列，例如泛蛋白啟動子或ß-球蛋白啟動子。
除抗體鏈基因與調控序列外，重組表現載體可攜帶額外序列，例如調控載體於宿主細胞中之複製(例如，複製起始點)與可篩選標記基因之序列。可篩選標記基因促進其中已引入載體之宿主細胞之選擇(參見，例如，Axel等之美國專利案Nos.4,399,216；4,634,665；與5,179,017)。舉例而言，可篩選標記基因通常賦予其中已引入載體之宿主細胞對藥物(例如G418、潮黴素或胺甲喋呤)之抗性。可篩選標記基因之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於dhfr-宿主細胞中使用胺甲喋呤之篩選/擴增)及新(neo)基因(用於G418篩選)。
關於輕鏈與重鏈之表現，係利用標準技術將編碼重鏈與輕鏈之表現載體轉染入宿主細胞中。各種形式之“轉染”一詞涵蓋常見用於引入外源DNA至原核或真核宿主細胞中之寬廣範圍之各種技術，例如，電穿 孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染等。理論上雖然可能於原核或者真核宿主細胞中表現抗體，惟由於此類真核細胞(特別是哺乳類細胞)比原核細胞更可能組裝與分泌正確摺疊及具免疫活性之抗體，因此以於真核細胞(包括哺乳類宿主細胞)中之抗體表現具代表性。用於表現重組抗體之哺乳類宿主細胞之實例包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)[包括見述於Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220之與例如見述於R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621之DHFR可篩選標記一起使用之dhfr-CHO細胞]、NSO骨髓癌細胞、COS細胞、HKB11細胞與SP2細胞。當編碼抗體基因之重組表現載體被引入哺乳類宿主細胞時，可藉由培養宿主細胞足以令抗體於宿主細胞中表現或分泌抗體至宿主細胞生長之培養基中之一段時間，以產生抗體。抗體可使用標準蛋白質純化方法，例如超過濾、粒徑排阻層析、離子交換層析及離心，從培養基中回收。
使用部分抗體序列以表現完整抗體
抗體主要經由位於六個重鏈與輕鏈CDR之胺基酸殘基而與標靶抗原交互作用。基於此因，於各個抗體之間，CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列更加多樣化。由於CDR序列負責大多數抗體-抗原之交互作用，因此藉由建構包含移植得自特定天然存在抗體之CDR序列至得自具不同性質之不同抗體之架構序列上之表現載體，則可能表現模擬特定天然存在抗體性質之重組抗體(參見，例如，Riechmann,L.et al.,1998,Nature 332：323-327；Jones,P.et al.,1986,Nature 321：522-525；與Queen,C.et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。此類架構序列可得自包含胚原抗體基因序列之公用DNA資料庫。由於彼等胚原序列不包含於B細胞成熟期間經由V(D)J連接形成之完全組裝變異基因，因此將與成熟之 抗體基因序列不同。沒有必要獲得特定抗體之整個DNA序列，以重現(recreate)具有與原始抗體類似之結合性質之完整重組抗體(參見WO 99/45962)。
跨越CDR區之部分重鏈與輕鏈序列通常即足以供此用途。使用該部分序列以確定促成重組之抗體變異基因之胚原變異與結合之基因區段。然後使用該胚原序列填充變異區之缺失部分。重鏈與輕鏈前導序列於蛋白質成熟期間被切割，對最終抗體之性質無貢獻。基於此因，乃使用對應之胚原前導序列表現建構體。欲添加缺失序列，可藉由連接或PCR擴增使選殖之cDNA序列與合成之寡核苷酸結合。替代地，可將整個變異區合成為一組短而具重疊性之寡核苷酸，利用PCR擴增結合，以產生完全合成變異區之選殖株。此方法具有例如排除或包含或特定限制位點、或最適化特定密碼子之優點。使用該重鏈與輕鏈轉錄本之核苷酸序列設計一組重疊之合成寡核苷酸，以產生具有與天然序列相同胺基酸編碼能力之合成V序列。該合成重鏈與輕鏈序列可與天然序列不同。舉例而言，打斷核苷酸鹼基串以促進寡核苷酸合成及PCR擴增；根據科扎克規則(Kozak,1991,J.Biol.Chem.266：19867-19870)合併諸最適轉譯起始位點；並於諸轉譯起始位點上游或下游建造限制位點。針對重鏈以及輕鏈變異區，於對應非編碼寡核苷酸之大約中點處，使最適化之編碼及對應之非編碼股序列斷裂成30至50個核苷酸之片段。針對各鏈，可將寡核苷酸組裝成跨越150至400個核苷酸區段之重疊性雙股組。然後使用匯集物(pools)作為模板以產生150至400個核苷酸之PCR擴增產物。
通常，單一變異區寡核苷酸組將斷裂成為兩個匯集物，其可分別擴增以產生兩個重疊PCR產物。然後利用PCR擴增使彼等重疊產物結合形成完全變異區。亦可期望於PCR擴增中包含重鏈或輕鏈恆定區之重 疊片段，以產生易於選殖入表現載體建構體之片段。然後使該再建構之重鏈與輕鏈變異區和選殖啟動子、轉譯起始、恆定區、3’非轉譯、多聚腺苷酸化、及轉錄終止諸序列結合，以形成表現載體建構體。該等重鏈與輕鏈表現建構體可於單一載體中結合，共轉染、連續轉染或分別轉染入宿主細胞中，然後融合形成表現該二鏈之宿主細胞。於另一態樣中，係使用人類抗ATβH抗體之結構特徵產生保留結合ATβ功能之結構相關之人類抗ATβH抗體。舉例而言，單株抗體經特異性鑑定之重鏈與輕鏈之一或多個CDRs可與已知之人類架構區及CDRs重組結合，以產生另外、重組建造之人類抗ATβH抗體。
抗AtβH單株抗體之促凝血效力
使用各種分析法探討抗ATβH單株抗體之促凝血效力。
表4顯示於FXa-活化凝血測定法中，抗ATβH單株抗體TPP2009與TPP2803於得自各種動物物種血漿中之促凝血效力。
NDR：無劑量反應，ND：未測定，dPT：稀釋之凝血酶原時間，HEM-A：A型血友病血漿。
於FXa-活化凝血測定法中，抗ATβH單株抗體TPP2009以及TPP2803於人類正常血漿與A型血友病血漿中均展現促凝血效力。詳言之，於FXa-活化凝血測定法中，TPP2009於人類正常血漿與A型血友病血漿中分別展現EC50為10.5nM與4.7nM之促凝血效力；TPP2803於人類正常血漿與A型血友病血漿中，分別展現EC50為2.4與2.7nM之促凝血效力。
此外，如圖12所示，使用FXa活化凝血測定法，抗ATβH單株抗體TPP2803於正常人類血漿以及血友病病患血漿中，均展現劑量依賴性地縮短凝血時間。CT：凝血時間，HEM-A：A型血友病血漿。
使用圖13中概述之肝素抗凝兔出血模式，證明抗ATβH單株抗體TPP2803之活體內促凝血效力。於肝素抗凝兔出血模式中，LMWH及化合物給藥前後，對照組與TPP2803對出血時間之影響示於圖14。相較於PBS中LMWH給藥後，LMWH及測試項目(3毫克/公斤或30毫克/公斤TPP2803)給藥後之出血時間顯著降低。如圖15所示，測試項目(3毫克/公斤或30毫克/公斤TPP2803)或硫酸魚精蛋白正對照組之出血時間差量與PBS顯著不同(p<0.05；*經由T檢定具顯著性)。LMWH及抗體給藥前後，對照組及TPP2803對失血量之影響示於圖16。TPP2803(3毫克/公斤)以及硫酸魚精蛋白正對照組二者於LMWH給藥後，在失血量上展現顯著變化(*經由T檢定具顯著性)。
醫藥組成物
本發明亦提供包含治療有效量之抗ATβH單株抗體與醫藥上可接受載劑之醫藥組成物。本文所用“醫藥上可接受之載劑”係指可添加 於活性成分以幫助調配或穩定製劑，且不會對病患引起顯著有害毒理作用之物質。此類載劑之實例為熟習此項技藝人士所悉知，包括水、糖類例如麥芽糖或蔗糖、白蛋白、鹽類例如氯化鈉等。其他載劑見述於，例如，E.W.Martin之Remington’s Pharmaceutical Sciences。此類組成物包含治療有效量之至少一種單株抗體。
醫藥上可接受之載劑包括用於無菌注射用溶液或分散液即時製劑之無菌水性溶液或分散液。有關醫藥上活性物質之此類介質與製劑之使用為此項技藝中已知。該組成物於若干具體實例中係用於調配非經腸注射液。組成物可調配為溶液、微乳劑、脂質體、或適於高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、與液態聚乙二醇等)、及其適當混合物之溶劑或分散液介質。於若干情況下，載劑之組成包括等滲劑，舉例而言，糖類、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化鈉。
無菌注射液可利用合併於適當溶劑中之需要量活性化合物與視需要之上述列舉之一種或組合成分，隨後微過濾滅菌，予以製備。通常，分散液係利用合併活性化合物至含有基本分散液介質及得自上述列舉之所需其他成分之無菌媒劑而製備。於用於製備無菌注射液之無菌粉劑之情形下，若干製備方法為真空乾燥與凍乾(冷凍乾燥)，係自先前之無菌過濾溶液中產生活性成分加上任何附加所需成分之粉劑。
醫藥用途
該單株抗體可用於治療遺傳性及後天性凝血缺失或缺陷之治療用途。舉例而言，上述具體實例中之單株抗體可用於封阻ATβH與其基質(可包括Factor Xa或Factor IIa)之交互作用。該單株抗體具有治療止血異常例如血小板減少症、血小板疾患與出血性疾患(例如，A型血友病、 B型血友病與C型血友病)之治療用途。此等疾患可利用投予有其需要之病患治療有效量之抗ATβH單株抗體進行治療。該單株抗體於治療例如創傷與出血性中風等跡象中之失控出血亦具治療用途。因此，本發明亦提供縮短出血時間之方法，該方法包括投予有其需要之病患治療有效量之抗ATβH單株抗體。
於另一具體實例中，抗ATβH抗體可作為AT治療病患(包括例如其中AT係用於治療敗血症或出血性疾患)之解毒劑用。
該抗體可呈單一藥療法使用或與其他療法組合以對付止血異常。舉例而言，一或多個抗體與凝血因子(例如Factor VIIa、Factor VIII或Factor IX)之共同投予，被認為對治療血友病有效。於至少若干具體實例中，用於治療遺傳性與後天性凝血缺失或缺陷之方法包括投予：(a)第一用量之結合於人類組織因子途徑抑制劑之單株抗體；及(b)第二用量之Factor VIII或Factor IX；其中該第一與第二用量一起可有效治療該缺失或缺陷。於至少若干具體實例中，用於治療遺傳性與後天性凝血缺失或缺陷之方法包括投予：(a)第一用量之結合於人類組織因子途徑抑制劑之單株抗體；及(b)第二用量之Factor VIII或Factor IX；其中該第一與第二用量一起可有效治療該缺失或缺陷，進一步地，其中未共同投予Factor VII。本發明亦提供包含治療有效量之單株抗體與Factor VIII或Factor IX之組合物之醫藥組成物，其中該組成物不包含Factor VII。“Factor VII”包括Factor VII與Factor VIIa。彼等組合療法很可能減少凝血因子必要輸注頻率。共同投予或組合療法意指投予各自分開調配或一起調配成單一組成物之兩種治療藥物；分開調配時，係於大約相同時間或不同時間(惟於相同治療期間)投予。
於若干具體實例中，本文敘述之一或多種抗體可組合使用以對付止血異常。舉例而言，二或多種本文所述抗體之共同投予被認為對 治療血友病或其他止血異常有效。
該等醫藥組成物可非經腸投予罹患A或B型血友病對象，其劑量與頻率可隨出血發作之嚴重性而不同或，於預防性治療之情形下，可隨病患凝血缺失之嚴重性而不同。
該等組成物可呈推注劑(bolus)或經由連續輸注投予有需要之病患。舉例而言，呈Fab片段抗體之推注給藥量可為約0.0025至約100毫克/公斤體重、約0.025至約0.25毫克/公斤、約0.010至約0.10毫克/公斤或約0.10至約0.50毫克/公斤。就連續輸注而言，則可以約0.001至約100毫克/公斤體重/分鐘、約0.0125至約1.25毫克/公斤/分鐘、約0.010至約0.75毫克/公斤/分鐘、約0.010至約1.0毫克/公斤/分鐘、或約0.10至約0.50毫克/公斤/分鐘之呈Fab片段之本發明抗體，投予約1至24小時、約1至12小時、約2至12小時、約6至12小時、約2至8小時、或約1至2小時。至於呈全長抗體(具有全部恆定區)之本發明抗體之給藥，劑量可為約1至10毫克/公斤體重、約2至8毫克/公斤、或約5至6毫克/公斤。此類全長抗體通常係經由延續30分鐘至3小時期間之輸注進行投予。給藥頻率將取決於症狀之嚴重性；可從每週三次至每兩週至六個月一次不等。
此外，該等組成物可經由皮下注射投予病患。舉例而言，每週、每兩週或每個月，可經由皮下注射投予病患約10至約100毫克抗ATβH抗體之劑量。本文所用之“治療有效量”意指針對有其需要之病患，有效增加活體內凝血時間或者於活體內引致重大益處所需之抗ATβH單株抗體之量或此抗體與Factor VIII或Factor IX組合之量。精確量將取決於多項因素，包括治療組成物之成分與物理特性、預期之病患族群、個別病患考量等，可容易地由熟習此項技藝者決定。
根據下述實例可對本揭示內容各方面獲得進一步理解，惟 不以任何方式對本發明教示構成局限。
實例1-人類及兔ATα與ATβ純化
根據Enzyme Research laboratory(South Bend,IN)先前敘述之方法，利用肝素-瓊脂糖凝膠親和層析法，從人類及兔血漿純化ATα與ATβ(Carlson and Atencio 1982；Peterson and Blackburn 1985)。簡言之，將得自硫酸葡聚糖/氯化鈣沈澱之上清液施加於肝素-瓊脂糖凝膠親和性管柱(Pharmacia)。以NaCl梯度分離ATα與ATβ：ATα與ATβ分別於0.8M與1.3M NaCl處溶洗出。使用陰離子交換層析法(HiTrap-Q,Pharmacia)進一步純化ATβ。利用蛋白質SDS-PAGE與LC-MS評估ATα與ATβ之純度及聚醣概況(profile)。
實例2-利用質譜儀分析確定ATα與ATβ之聚醣數量及位置
由於聚醣之獨特數量，ATα與ATβ可利用配備duo-ESI(或奈米ChipCube)源、MassHunter獲取軟體及包括Bioconfirm之定性分析軟體之Agilent 6520 LC-MS系統，根據其質量予以區分。利用由下而上之方法確定醣基化位點，其中係以胰蛋白酶及Arg-c分解蛋白質，隨後利用標靶MSMS鑑定醣基化與單醣基化胜肽序列。數據收集自兩個實驗：斷裂器電壓(Fragmentor voltage)175v及430v。
實例3-AT抗原生物素化
於人類及兔ATα與ATβ表面之離胺酸殘基，利用NHS-生物素，以生物素標識。關於離胺酸之生物素化，首先係於PBS/Ca++緩衝液(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)中，使該等蛋白質脫鹽，以移除可能抑制生物素化反應之任何胺類。使用超微量分光光度計(NanoDrop)，以OD280測定脫鹽蛋白質之濃度。然後，使蛋白質與Sulfo-NHS-生物素(Pierce Thermo Scientific,Rockford,IL)以AT：NHS-生物素為1：5及/或1：3之莫耳比 (亦即，生物素過量)，於室溫(RT)培育1小時。利用置於PBS/Ca++緩衝液中之隔夜透析移除游離生物素。使用生物素定量套組(Biotin Quantitation Kit)(Pierce Thermo Scientific,Rockford,IL)定量生物素化蛋白質中之生物素量。利用SDS-PAGE分析生物素化之ATα與ATβ；使用鏈黴抗生物素蛋白-HRP(Pierce Thermo Scientific,Rockford,IL)作為探針，利用西方墨漬法分析確認生物素化。利用FXa抑制試驗評估生物素化AT之功能活性。比較生物素化之ATα與ATβ及未生物素化之ATα與ATβ，觀察到生物素化後，AT抑制活性僅輕微下降，表示以此方法製備之生物素化ATβ與ATα具有代表性，可用於淘選作為選擇性抗凝血封阻劑之ATβH結合劑。
實例4-利用噬菌體呈現及淘選發現人類單株抗體
設計四臂淘選策略，從人類Fab資料庫(Dyax Fab310)發現特異性對抗ATβH之Fabs。首先以結合生物素化肝素/Fondaparinux之ATα與生物素化ATα耗盡(depleted)該資料庫，然後分別淘選對抗結合肝素/Fondaparinux之ATβ及鏈黴抗生物素蛋白珠粒上之生物素化ATβ。每輪淘選，結合緩衝液中包含與肝素結合之ATα(ATαH)作為競爭劑(competitor)。為了保持hATβ之活性構形(結合肝素型)，於全部三輪淘選中，均於洗滌緩衝液中添加肝素。淘選後，從匯集之選殖株篩選hATβ與hATβH特異性結合，並以ELISA逆向篩選(counter-screened)hATα。亦檢驗彼等選殖株針對兔ATβ及兔ATα之差別結合。針對hATβH與rATβH二者以及hATα與rATα二者顯示差別結合之選殖株以加標(spike-in)hATβ進一步進行FXa-去抑制(deinhibition)試驗。將陽性中選者(Positive hits)(Fabs)重整(reformatted)入IgG1中，於HEK293細胞中表現，並以蛋白質A管柱進行純化。彼等純化IgG1s於AT耗盡之人類血漿與hemA病患血漿中廣泛進行TGA試驗(凝血酶生成試驗)與dPT(稀釋之凝血酶原時間)試驗等測試，以 測定凝血時間。
實例5-ELISA(酵素免疫分析法)
將含或不含肝素(50微克/毫升，肝素-鈉-5000，Apotheke，Fa.Ratiopharm)之於PBS中之2微克/毫升生物素化AT抗原塗覆於鏈黴抗生物素蛋白微量盤(Greiner，781997)上。於4℃進行抗原塗覆隔夜後，以PBST +/-肝素洗滌諸盤，並以含5%牛奶之PBST +/-肝素於37℃封阻1小時。移除封阻緩衝液後，接著添加於封阻緩衝液(含5%牛奶之PBST +/-肝素)中之20微克/毫升Fab或4微克/毫升IgG至盤中，於室溫培育諸盤1小時，然後洗滌盤三次。添加於封阻緩衝液之抗人類IgGPOD(Sigma，A0170)於諸盤，於室溫培育諸盤30分鐘。使用1：1000之Amplex red(In vitrogen，Cat#A22170)以及H2O2進行檢測。經30分鐘培育後，以螢光微量盤讀取計，於Ex535、Em 590讀取諸盤。
實例6-FXa去抑制試驗-AT加上肝素
使肝素與ATβ或ATα一起培育以形成穩定之ATH複合物。然後添加抗體至ATβH或ATαH複合物中。同時，於另一盤中混合10微升之200奈克/毫升FXa(HTI)與20微升之50微克/毫升Fluophen FXa螢光基質(Hyphen Biomed)。迅速添加抗體ATH混合物至FXa/基質溶液中，立即啟動於Ex360nm與Em465nm之螢光動力學測量。所有必要之稀釋係使用100mM NaCl、20mM Tris、2.5mM CaCl2、0,1% BSA、0,1% PEG8000。
實例7-FVIII缺失人類血漿之凝血酶生成試驗(TGA)
於HemA人類血漿中，進行ATβH抗體從最終濃度1uM開始至0.015uM之1：2系列稀釋。於各抗體溶液中添加肝素至最終濃度為50nM。然後添加80微升抗體-肝素-血漿混合物至96槽TGA盤中含有20微升再組成PPP試劑或校準劑之各槽。將盤置於TGA儀器中，機器自動分注20 微升FluCa(螢光基質+CaCl2)至各槽；令反應進行60分鐘。單僅使用血漿作為負對照組。
實例8-分別加標ATα與ATβ之AT耗盡之人類血漿中之凝血酶生成試驗(TGA)
添加抗體至以15nM ATα或ATβ加標之人類AT缺乏血漿中。然後於各反應中以吸管添加肝素，最終濃度為50nM。添加80微升含ATH特異性抗體、肝素與ATα或ATβ之血漿試樣至帶有20微升PPP試劑或校準劑之96槽TGA盤諸槽中。將盤置於TGA儀器中，然後於各槽分注20微升FluCa(螢光基質+CaCl2)。令反應繼續進行60分鐘。
實例9-人類hemA血漿與AT缺乏血漿中之稀釋之凝血酶原時間試驗(dPT)
於hemA血漿中，從帶有0.1單位/毫升肝素之250nM開始，進行抗ATβH hmAbs之系列稀釋。此抗體、血漿與肝素之混合物於室溫培育20至30分鐘。然後，添加50微升此混合物至50微升經稀釋之Innovin(1/2000)(Dade Behring)中，於37℃培育4分鐘，隨後添加50微升25mM CaCl2(HemSil)。於ACL Top凝血計上設置dPT測試程式，採樣時間360秒。針對AT缺乏血漿之dTP，AT-DP以帶有0.1單位/毫升肝素之最終濃度0.2uM之ATα或者ATβ加標。添加抗ATβH mAbs至AT-DP/肝素/ATα或AT-DP/肝素/ATβ混合物中，最終濃度為0.25uM，於室溫培育20至30分鐘。針對各反應，如上述，添加50微升血漿/抗體/肝素混合物至50微升經稀釋之Innovin(1/4000)中，於37℃培育4分鐘，隨後添加50微升25mM CaCl2(HemSil)。
實例10-抗體純化
使預洗滌過之蛋白質A瓊脂珠粒與於結合緩衝液(容積 比：1：1)中之抗體於4℃旋轉培育隔夜。然後裝填珠粒於管柱中，並以1 X PBS洗滌至O.D.280<0.05。排出殘餘溶液。以溶洗緩衝液溶洗抗體並收集於含中和緩衝液之試管中。溶洗區分於4℃，1 x PBS中透析隔夜，其間至少更換兩次緩衝液。IgG濃度利用超微量分光光度計於280nm進行測量。抗體純度利用ELISA、SDS-PAGE或SSC檢驗。
實例11-利用Biacore之抗體結合親和性研究
使用Biacore T100或T200處理單元進行抗體親和性測量。將抗人類Fc抗體或鏈黴抗生物素蛋白固定於CM5晶片上。注射hATβH或生物素化hmAb抗體並補捉於晶片上。注射不同濃度之有/無肝素之ATβ或ATα。只有結合於抗體之AT與ATH產生結合常數。結合結果以nM表示之平衡解離常數(KD)記述。分析AT/肝素複合物時，電泳緩衝液中含1uM之肝素。
實例12-肝素抗凝兔出血模式
肝素抗凝兔出血模式之實驗設計概述於圖13。準備兔頸靜脈(右靜脈：靜脈淤血；左靜脈：插管)後，於時間0進行PBS媒劑中低分子量肝素(LMWH)之兔靜脈內投予(1800單位/公斤)。10分鐘後，投予測試項目。實驗組別包括媒劑，PBS；正對照組，硫酸魚精蛋白(28毫克/公斤IV)；負對照組，M14 IgG2；治療：30毫克/公斤；TPP2803，3毫克/公斤；TPP2803，30毫克/公斤。投予測試項目五分鐘後，進行耳穿刺(3-5毫米)，於30分鐘期間，監測於原位之血栓形成(淤血)。每隔15秒以濾紙移除切口處之血液至停止出血為止。
前述揭示內容與實例不擬以任何方式限制專利申請之範圍。應理解的是，前述具體實例及教示可進行各種修飾及改變，同等物可被取代而不偏離隨附專利申請之真實精神與範圍。說明書及實例，因此， 可被認為係具說明性意義而不具限制性。再者，本文提及之所有文件、書籍、專利申請案、專利案、及其他物料之全部揭示內容均併入本文以資參考。
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<212> PRT
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<220>
<223> TPP-2803，hIgG2，重_鏈
<400> 60

Claims (30)

  1. 一種能結合抗凝血酶(β)肝素複合物(ATβH)之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：SEQ ID NO：2胺基酸31至35(AYRMG)之CDR1序列、SEQ ID NO：2胺基酸50至66(RIYSSGGRTRYADSVKG)之CDR2序列、與SEQ ID NO：2胺基酸97至114(AREKASDLSGSFSEALDY)之CDR3序列；及其中該抗體之輕鏈包含：SEQ ID NO：1胺基酸24至34(QGDSLRSYYAS)之CDR1序列、SEQ ID NO：1胺基酸50至56(GKNNRPS)之CDR2序列；及SEQ ID NO：1胺基酸89至99(NSRDSSGNHLV)之CDR3序列。
  2. 一種能結合ATβH之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：SEQ ID NO：4胺基酸31至35(KYKMD)之CDR1序列、SEQ ID NO：4胺基酸50至66(RIGPSGGKTM YADSVKG)之CDR2序列、與SEQ ID NO：4胺基酸97至114(AREKASDLSG TYSEALDY)之CDR3序列；及其中該抗體之輕鏈包含：SEQ ID NO：3胺基酸26至37(RASQSVSSSYLA)之CDR1序列、SEQ ID NO：3胺基酸53至59(GASSRAT)之CDR2序列、與SEQ ID NO：3胺基酸92至99(QQYGSSRT)之CDR3序列。
  3. 一種能結合ATβH之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：SEQ ID NO：6胺基酸31至35(KYRMD)之CDR1序列、SEQ ID NO：6胺基酸50至66(RIGPSGGKTT YADSVKG)之CDR2序列、與SEQ ID NO：6胺基酸97至114(AREKTSDLSG SYSEALDY)之CDR3序列；及其中該抗體之輕鏈包含：SEQ ID NO：5胺基酸26至36(RASQNINRNLA)之CDR1序列、SEQ ID NO：5胺基酸52至58(TASTRAP)之CDR2序列、與SEQ ID NO：6胺基酸91至99 (QQYASPPRT)之CDR3序列。
  4. 一種能結合ATβH之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：SEQ ID NO：8胺基酸31至35(RYAMY)之CDR1序列、SEQ ID NO：8胺基酸50至66(RISPSGGKTH YADSVKG)之CDR2序列、與SEQ ID NO：8胺基酸97至115(ARLSQTGYYP HYHYYGMDV)之CDR3序列；及其中該抗體之輕鏈包含：SEQ ID NO：7胺基酸26至37(RASQRVSSSYLT)之CDR1序列、SEQ ID NO：7胺基酸53至59(GASSRAT)之CDR2序列；與SEQ ID NO：7胺基酸92至101(QQYDSTPPLTT)之CDR3序列。
  5. 一種能結合ATβH之單株抗體，其中該抗體之重鏈包含：SEQ ID NO：10胺基酸31至35(SYRMS)之CDR1序列、SEQ ID NO：10胺基酸50至66(RIYSSGGRTR YADSVKG)之CDR2序列、與SEQ ID NO：10胺基酸97至114(AREKASDLSG SFSEALDY)之CDR3序列；及其中該抗體之輕鏈包含：SEQ ID NO：9胺基酸23至33(QGDSLRSYYAS)之CDR1序列、SEQ ID NO：9胺基酸49至55(GKNNRPS)之CDR2序列；與SEQ ID NO：9胺基酸88至96(NSRDSSGNHT)之CDR3序列。
  6. 一種單離之單株抗體，其結合於ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含重鏈變異區，其包含選自包括SEQ ID NOS：2、4、6、8、與10的組群之胺基酸序列，及和SEQ ID NOS：2、4、6、8、與10具有實質上同源性之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第6項之單離之單株抗體，進一步包含輕鏈變異區，其包含選自包括SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9的組群之胺基酸序列，及和SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9具有實質上同源性之胺基酸序列。
  8. 一種單離之單株抗體，其結合於ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體進一步包含輕鏈變異區，其包含選自包括SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9的組群之胺基酸序列，及和SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9具有實質上同源性之胺基酸序列。
  9. 一種單離之單株抗體，其結合於ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含CDR3，其包含選自包括SEQ ID NOS：46-50的組群之胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第9項之單離之單株抗體，進一步包含：(a)包含選自包括SEQ ID NO：36-40的組群之胺基酸序列之CDR1；(b)包含選自包括SEQ ID NO：41-45的組群之胺基酸序列之CDR2；或(c)包含選自包括SEQ ID NO：36-40的組群之胺基酸序列之CDR1以及包含選自包括SEQ ID NO：41-45的組群之胺基酸序列之CDR2二者。
  11. 一種單離之單株抗體，其結合於ATβH並抑制抗凝血活性，其中該抗體包含CDR3，其包含選自包括SEQ ID NOS：31、32、33、34、與35的組群之胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第11項之單離之單株抗體，進一步包含：(a)包含選自包括SEQ ID NO：21、22、23、24、與25的組群之胺基酸序列之CDR1；(b)包含選自包括SEQ ID NO：26、27、28、29、與30的組群之胺基酸序列之CDR2；或(c)包含選自包括SEQ ID NO：21、22、23、24、與25的組群之胺基酸序列之CDR1以及包含選自包括SEQ ID NO：26、27、28、29、與30的組群之胺基酸序列之CDR2二者。
  13. 一種單離之單株抗體，其結合於ATβH之活性位點。
  14. 一種單離之單株抗體，其結合於ATβH並提供抗凝血活性，其中單離之單株抗體展現與AT最小之結合及其中該抗體為完全人類抗體。
  15. 如申請專利範圍第1至14項之任一項之單離之單株抗體，其中抗體係選 自包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD、IgE抗體、與抗體片段之組群。
  16. 一種單離之單株抗體，其結合於人類ATβH。
  17. 如申請專利範圍第16項之單離之單株抗體，其中抗體進一步結合於非人類物種之ATβH。
  18. 如申請專利範圍第1至14項之任一項之單離之單株抗體，其中於抗體存在下，血液凝結時間縮短。
  19. 一種抗體，其與如申請專利範圍第1至14項之任一項之單離之單株抗體競爭。
  20. 一種醫藥組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第1至14項之任一項之單株抗體與醫藥上可接受之載劑。
  21. 一種用於治療遺傳性或後天性凝血缺失或缺陷之方法，該方法包括投予病患治療有效量之如申請專利範圍第1至14項之任一項之醫藥組成物。
  22. 一種用於治療凝血病變之方法，該方法包括投予病患治療有效量之如申請專利範圍第20項之醫藥組成物。
  23. 如申請專利範圍第21或22項之方法，其中凝血病變為A型血友病、B型血友病、或C型血友病。
  24. 如申請專利範圍第21或22項之方法，其中凝血病變係選自包括創傷引起之凝血病變與嚴重出血之組群。
  25. 如申請專利範圍第22項之方法，進一步包含投予凝血因子。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中凝血因子係選自包括Factor VIIa、Factor VIII、與Factor IX之組群。
  27. 一種用於縮短出血時間之方法，該方法包括投予病患治療有效量之如 申請專利範圍第20項之醫藥組成物。
  28. 一種編碼結合於ATβH並抑制抗凝血活性之抗體之單離核酸分子，其中抗體包含輕鏈變異區，其包含選自包括SEQ ID NOS：1、3、5、7、與9的組群之胺基酸序列。
  29. 一種編碼結合於ATβH並抑制抗凝血活性之抗體之單離核酸分子，其中抗體包含重鏈變異區，其包含選自包括之組群SEQ ID NOS：2、4、6、8、與10的組群胺基酸序列。
  30. 如申請專利範圍第21項之方法，其中凝血缺陷為A型血友病、血友病B或C型血友病。
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