JPH0266458A - ビトロネクチン及びビトロネクチン‐トロンビン‐アンチトロンビン３複合体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血液凝固及び補体系更にはガンの転移に関与
するビトロネクチン及びビトロネクチン−トロンビン−
アンチトロンビン■複合体の新規な測定方法に関するも
のであシ、特に臨床検査の分野で利用されるものである
。

〔従来の技術〕

ビトロネクチンは細胞接着・伸展因子として血中、ｍ織
中よシ見出され、Ｓ、スズキ（ｓ、　８ｕ−ｚｕｋｉ　
）　　らによりその全塩基配列も決定されてイル（工／
ｙＮ　　シーＹ−すＡ／（ＥＭＢＯＪ、　）第４巻、第
２５１９〜２５２４頁（１９８４））。ビトロネクチン
は７５０００の分子量を持ちその生理学的役割は完全に
は明確ではない。

しかしながら、ガン細胞の転移に関連していること（Ｍ
、Ｌ、バサフ（Ｍ、　Ｌ、　Ｂａ５ａｒａ　）　　ら、
キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）第
４５巻、第２４８７〜２４９４頁（１９８５）”ｌ、ト
ロンビノーアンチトランビン瓜複合体と結合すること（
Ｃ，Ｒ，イｌｖ（Ｃ，Ｒ，Ｉｌｌ　）ら、ジャーナルオ
ブ　パイオロジカＩＶ　　ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２６０巻、第１５６１０
〜１５６１５頁）（１９８５））、更に最近、補体系の
タンパク質として知られていたＳ−タンパク質がビトロ
ネクチンと同一であることが示され（Ｋ、Ｔ、プライス
ナー（Ｋ、Ｔ、Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ　）ら、バイオケミ
カル　アンド　バイオフイジカμ　リサーチ　コミュニ
ケーションズ（Ｂ１０Ｃｈｅ＆　Ｂｉｏ−ｐｈｙｓｉｃ
ａｌ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　）第１３４巻、第９５１
〜９５６頁（１９８６））、ガン、血液凝固、補体にま
たがる重要な因子としてその測定方法の開発が望まれて
いた。

従来のビトロネクチンの測定方法としてはり。

Ｗ、バーネス（Ｄ、Ｗ、Ｂａｒｎｅａ　）　　ら〔アナ
リチカルバイオケミストリー（ＡｎａＬＢｉｏｃｈｅｍ
、　）第１３７巻、第１９６〜２０４頁（１９８４））
の方法が知られている。すなわち、サンプルをポリスチ
レン製マイクロタイタープレートＫｔｌｆ接度応させ、
サンプル中のビトロネクチンをグレート固相に吸着させ
、洗浄後抗ビトロネクチンモノクローナｙ抗体（Ｄ、Ｗ
、パーネスら、プロシーディング　オプ　ナショナμ　
アカデミ−オブサイｘ７ス　オプ　ザ　Ｕ　Ｓ　Ａ　（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）第８０巻、第１３６
２〜１３６６頁（ｆ９８３））と反応させ、洗浄後更に
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）ｐＪ識抗マク、ＸＩｇと反
応させ洗浄後発色させる方法である。

一方、ビＦロネクチンーＦロンビンーアンチＦロンビン
■（以下、ＶＴＡＴと略記する）複合体の測定方法とし
て抗トロンビンポリクローナル抗体を固相化し、ラジオ
アイソトープ標識した抗ビトロネクチンポリクローナル
抗体を用いてサン令゛イツチ法によυ測定する方法が報
告されてる（Ｋ、Ｔ、プライスナーら、ザ　バイオケミ
力μ　リサーチ／Ｌ’　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）
第２４３巻、第１０５〜１１１頁（１９８７））。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記ビトロネクチン測定方法は、ビトロネクチンの固相
への物理的吸着という共存物質の影１を受けやすい、ま
た、特異性の低い方法であシ、誤差が生じやすく、臨床
検査の場で使用できるものではない。一方、上記ＶＴＡ
Ｔ測定方法はポリクローナル抗体を用いている点から特
異性に問題があること、更には、ビトロネクチンはトロ
ンビンとは結合するがアンチトロンビン■とは結合しな
いことが報告されておυ（Ｅ。

Ｒ，ポダツク（Ｅ、Ｒ，ＰＯｄＰＬｃｋ　）　　ら、ジ
ャーナルオプ　パイオロジカμ　ケミストリー　第２６
１巻、第７３８７〜７３９２頁（１９８６））、したが
って、ＶＴＡＴばかりでなくビトロネクチン−トロンビ
ン複合体をも測定している危険性がある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はビトロネク
チンの測定方法に関する発明であって、免疫学的方法に
より試料中のビトロネクチンを測定する方法において抗
原認識部位の異なる２ｍの抗ビトロネクチンモノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とする。

そして、本発明の第２の発明はＶＴＡＴ複合体の測定方
法に関する発明であって、免疫学的方法により試料中の
ＶＴＡＴ複合体を測定する方法において抗ビトロネクチ
ンモノクローナル抗体ト抗アンチトロンビン■モノクロ
ーナ゛ル抗体を用いることを特徴とする。

本発明者らは前記の事情にかんがみて、ビトロネクチン
又はｖＴＡＴ複合体を特異的にかつ簡便に測定する方法
を開発すべく鋭意研究の結果、ビ）ロネクチンに対する
抗原確認部位の異なる２種のモノクローナル抗体を用い
ることで、また、ビトロネクチンに対するモノクローナ
ル抗体とアンチトロンビン■に対するモノクローナル抗
体を用いることで各々ビトロネクチンまた、ＶＴＡＴ複
合体を特異的にがつ簡便に測定することが可能であるこ
とを確認し、本発明を完成した。

本発明において使用されるモノクローナル抗体の作成法
の概略は次の通夛である。ビトロネクチン又はアンチト
ロンビン■を抗原として異種動物に免疫すると、その多
数の抗原決定基に対する抗体が抗体産生細胞群より産生
される。

これらの抗体産生細胞を、無限増殖能を持った骨髄腫細
胞と融合させ、融合細胞をクローニングして目的として
いる抗体を産生じている細胞をスクリーニングする。こ
れら細胞群の個々の産生ずる抗体はビトロネクチン又は
アンチトロンビン■に特異的な抗体である。本発明にお
いてはその中からビトロネクチンの２抗体サンドイツ千
法に適した抗ビトロネクチンモノクローナル抗体例えば
ＶＮ−４７とＶＮ−５８を選び出した。一方、ＶＴＡＴ
複合体の２抗体サンドイッチ法に適した抗ビトロネクチ
ンモノクローナル抗体例えばＶＮ−５と抗アンチトロン
ビン■モノクローナル抗体例えばＡＴ−２を選び出した
。

本発明のビトロネクチン測定方法は、固相に固定した第
１の抗ビトロネクチンモノクローナル抗体と、ヒト血し
よう体液又はビトロネクチン含有溶液等の試料と、酵素
標識した第２の抗ビトロネクチンモノクローナル抗体の
３者を同時に反応させることによって実施することがで
きる。

一方、ＶＴＡＴ複合体測定方法は、固相に固定した抗ア
ンチトロンビン■モノクローナル抗体を、ヒト血しよう
、体液、又はＶＴＡＴ複合体を含有する溶液等の試料と
接触させることにより得られる固相抗体と結合したＶＴ
ＡＴ複合体に対し、酵素標識した抗ビトロネクチンモノ
クローナル抗体を作用させることによって実施すること
ができる。

モノクローナル抗体を本発明における固相抗体として用
いる場合、固定化の方法は公知の方法を採用でき、担体
としては例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン等を用いたボール　ビーズ、マイクロプレートが
使用される。一方、標識化合物としての酵素は西洋ワサ
ビ由来べ〜オキシダーゼ、β−Ｄ−ガヲクトシダーゼ、
アルカリホスファターゼ等の酵素が使用される。更に、
これら酵素の活性を測定するために基質が用いられる。

基質としては例えば西洋ワサビ由来べμオキシダーゼの
場合は、０−フ二二レンジアミンーＨ２０！、２，２′
−アジノー！／−［！５−エチルベンズチアゾリンスル
ホン酸（６）］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）−Ｈ，Ｏ鵞
などが用いられる。

〔実施例〕

以下に実施例を示し、本発明をよシ具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１　モノクローナル抗体の作製 （１）抗原 アンチトロンビン■はミドリ十字社製、ヒドロネクチン
は寅酒造社製を用いた。

（２）　　マウスへの免疫 アンチトロンビン■とビトロネクチンを各々０、１５　
Ｍ　ＮａＣｔ　を含む１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐ
Ｈ７，４）に溶解し、フロイントの完全アジュバントと
１　：　１　（ｖ／ｖ　）の割合でよく混合し、マウス
１匹当りアンチトロンビン■又はビトロネクチンが５０
μｔとなるように腹腔内に免疫した。初回免疫から２１
日後にアンチトロンビン■又はビトロネクチン５０μｔ
をフロイントの不完全アジュバントと混合し腹腔内投与
し、更にその１４日後、アンチトロンビン■又はビトロ
ネクチン２０μ？を尾静脈よシ投与した。

（３）細胞融合及びクローニング 最終免液の３日後にマウスの膵臓を取出し、そのＫＷ細
胞とマウス　ミエローマ　Ｐ３Ｕ１とを１０＝１の割合
で混合し、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第
４９５頁（１９７５）記載のケラ−（Ｇ、にぢｈｌｅｒ
　）らの方法に準じて細胞融合を行った。次に９６ウエ
ルマイクロプＶ−トに植え込み、ＨＡＴ（ヒボキサンチ
ンｌＸｌ０Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０Ｍ、チミジン１
．６ＸＩＱ−’Ｍ）を含んだＴ）ＭＥＭ−Ｉ　Ｇ％ＦＣ
８培地（ＨＡＴ培地）で１０〜１７日間培養後、ＨＴ（
ヒボキサンチンｌＸ１０Ｍ、チミジン１．６×１０　Ｍ
）を含んだＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８（ＨＴ培地）に移行
し、更にフラスコ（２５ｄ）に培養できるようになって
からＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８培地にて培養を続けた。増
殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法
により測定し、適切なウニｐから限界希釈法により求め
るハイブリドーマのクローニングを行った。すなわち、
マイクロプレートにウェル当、り、２．５Ｘ１０４個の
マウス胸腺細胞を植え込み、次にＤＭＥＭ培地で５．１
、（Ｌ５個／α１−となるようにハイブリドーマを希釈
し、これを上記マイクロプレートにα１−／ウェルずつ
植え込み培養した。培養開始後１０〜１４日で肉眼で認
められるコロニーが形成され、クローン株を得た。

（４）　　スクリーニング法 ハイブリドーマ及びクローンが増殖したウニμの培養上
清を分取し、エンザイム　リンクドイムノツルベンＦ　
アッセイ（ｌｌｉ；ｎｚｙｍｅ　ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　：　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ
　Ａ　）法によシビトロネクチン又はアンチトロンビン
■に対する抗体産生能を調べた。マイクロタイターデレ
ー）Ｋビトロネクチン又はアンチトロンビン■をα５μ
２１５０μｔ／ウニμとなるように分注し、４℃で１８
時間静置してビトロネクチン又はアンチトロンビン■を
固相に吸着させた。１０吐リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　
Ｂ　Ｓ　）　（１）Ｈｙ、　４　）２００μｔで５同各
ウェルを洗浄した後、１％ウシ血清アμプミン（ＢｓＡ
）含有ｐＢｓｅ１００μｔ／ウェル加え、３７°Ｃで１
時間静置し、各ウェルの未吸着部分をブロックした。次
いで、試料である培養液を５０μＬ／ウェル加え３７°
Ｃで１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、１０
００倍希釈したべ〃オキシダーゼ標識抗マウスＩ９Ｇ　
（カベル社製）を５０μｍ／ウェル添加し、３７°Ｃで
１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄し、０．０１％過酸化
水素、ｏ、　ｓ　ｓ　ｍｙ／１ｎｔＡＢＴｓ（２，２’
−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリンースルホネ
ー）））（ベーリンガーマンハイム社製）を含む（ＬＩ
Ｍクエン酸バッファー（ｐＨａ、ｏ）を加え、波長４０
５　ｎｍでの吸光度を測定した。試料中ビトロネクチン
又はアンチトｇ／ビ／ＩＩＴに対する抗体が存在した場
合強い発色がみられた。

この結果得られた抗体産生能の高いクローンの中からビ
トロネクチンの２抗体サンドイッチＥＩＡ法に適したモ
ノクローナル抗体を産生ずるりｏ−ンＶＮ−４７及びＶ
Ｎ−５８を、また、ＶＴＡＴ複合体のサンドイッチＥＩ
Ａ法に画したモノクローナル抗体を産生ずるクローンＶ
Ｎ−５及びＡＴ−２が得られた。

前記クローン株は各々Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｖ　Ｎ　−
４７と表示し微工研菌寄第１０２２８号（ＦＥＲＭＰ　
−１０２２８）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｖ　Ｎ　−５８
と表示し、倣工研菌寄第１０２２９号（ＦＥＢＭ　Ｐ−
１０２２９）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｖ　Ｎ　−５と表
示し微工研菌寄第１０２２７号（ＦＥＢＭ　Ｐ−１０２
２７）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａ’Ｉ’−２と表示し微
工研菌寄第１０２３０号（ＦＥＢＭ　Ｐ　−１０２５０
）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。

（５）　　モノクローナル抗体の作製 ７凋令以上のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ糸マウヌにプリス
タン（アルドリッチ社１！りα５−を腹腔内に投与し、
１週間以上経過した後、培養、増殖させたクローン株１
〜９　Ｘ　１０Ｍ個／マウスを腹腔内接種した。１０〜
１４日後にマウスを殺し、腹水を採取した。これをＳ、
　ＯＯＯｒｐｍ　１０分間遠心分層し、５〜１５ｆｎｔ
／匹のモノクローナル抗体含有腹水を得た。

（６）モノクローナル抗体の精製 上記（５）によって得られた腹水を脱脂扁で濾過して脂
肪を除き−５０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７：３）
−で２倍希釈した後、等量の１００％飽和硫酸アンモニ
ウムを加え、沈殿画分を分取した。この画分をなるべく
少量の上記リン酸バッファーに溶解させ、同バッファー
に対して透析した。このサンプルをＤＥＡＥ−セルロー
スカラムＫかけ、モノクローナル抗体を得た。

実施例２ （１）　　ペルオキシダーゼ標識抗ビトロネクチンモノ
クローナル抗体の調製 抗ビトロネクチンモノクローナル抗体Ｖ　Ｎ−５８又は
Ｖ　Ｎ、５をナカネ（Ｎａｋａｎｅ　）　　法（Ｐ、に
、ナカネ（ｐ、に、　Ｎａｋａｎｅ　）ら、ジャーナル
　オブ　ヒストケミヌトリー　アンド　サイトケミスト
リー（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　
）第２２巻、第１０８４頁（１９７４）］によってペル
オキシダーゼ標識した。

２）　抗ビトロネクチンモノクローナル抗体のマイクロ
プレートへの固定 抗ビトロネクチンモノクローナル抗体ＶＮ−４７をタン
パク濃度２０μｍ／−となるようにリン酸バッファー生
理食［水（ｐＢｓ％ｐＨ７，４）にて調整し、これをＥ
ＩＡ用マイクロプレートに各１００μｔ／ウエル加え、
−昼夜４”Ｃで放置し、ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ含
有ＰＢＳを各２００μｔ／ウニμ加えブロッキングし、
ＶＮ−４７固定マイクロブＶ−）を得た。

（３）抗アンチトロンビンモノクローナμ抗体のマイク
ロプレートへの固定化 抗アンテトロンビンモノクローナｐ抗体ＡＴ−２を実施
例２−１２）と同様にしてマイクロプレートに固定化し
、ＡＴ−２固定マイクロプレートを得た。

（４）　　抗ビトロネクチンモノクローナル抗体ワンス
テップサンドインチＥＩＡ法による健常人血しよう中の
ビトロネクチンの測定 前記（２）によって得られたＶＮ−４７固定化マイクロ
プレートに健常人血しようを１０００倍希釈した液５０
μｔと前記（１）で得られたＰＯＤ−ＶＮ−５８溶液ｓ
　ｏ　ｐｔを加え３７°Ｃで３０分間反応させた。ＰＢ
Ｓで洗浄後、ＰＯＤ用基質１２００μｔ　（ＡＢＴＳ（
Ｌ５＋＋ｖ／−と（ＬＯ０５％Ｈ，Ｏ！を含むｃＬ１Ｍ
クエン酸、リン酸バッファーｐＨ４，５）を加え、２５
°Ｃで３０分間発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。末法により健常人（３（１人）ブール血しようを検
量線用標準物質として、ヒト血しよう中ビトロネクチン
を測定し、検量線は第１図に、１０人の測定値は表１に
示した。なお、第１図は本発明のビトロネクチン測定方
法による健常人プール血しようを倍々希釈したものを測
定した時の検量線を示すグラフであシ、横軸は健常人プ
ール血しようの希釈率を縦軸は吸光度ｏＤ（４ｏｓｎｍ
）を示す。

表　　１ ＊％：健常人ブーμ血しよう中のビトロネクチン値を１
００％とした 実施例５ 健常人血しよう及び脳梗塞、心筋梗塞８例血しようにお
けるＶＴＡＴ複合体の測定 前記実施例２−＋２）によって得られたＡＴ−２固定化
マイクロプレートに血しようサンプμの２倍希釈液５０
μｔを加え３７°Ｃで３０分間反応後、ＰＢＳで洗浄し
、前記実施例２−　（１）で得られたＰＯＤ−ＶＮ−５
溶液５０μｔを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた後
ＰＢＳで洗浄した。これにＰＯＤ用基質液１００μｔを
加え、２５°Ｃで３０分間発色させ、４０５　ｎｍの吸
光度を測定した。末法によシ健常人（３０人）プール血
しようを検量線用標準物質として健常人８例、脳梗塞８
例、心筋梗塞８例の血しよう中ＶＴＡＴ複合体を測定し
た。検量線を第２図に、健常人及び患者血しようの測定
値は表２に示した。患者血しようでは高値を示した。

なお、第２図は本発明のＶＴＡＴ複合体測定方法による
健常人プール血しようを倍々希釈したものを測定した時
の検量線を示すグラフであυ、横軸は健常人ブーμ血し
ようの希釈率を縦軸は吸光度ＯＤ（４０５ｎｍ）を示す
。

表　　２ 人 梗 塞 筋 塞 ＊％：健常健常人プール上う中のＶＴＡＴ値を１００％
とした 四に、ＶＴＡＴ複合体とビトロネクチン−トロンビン複
合体の交差反応性を検討した。ＶＴＡＴ複合体及びビト
ロネクチン−トロンビン複合体はＥ、　Ｒ，ポダツクら
の方法（ジャーナル　オプ　バイオロジカル　ケミスト
リー　前出）により調製した。すなわち、ビトロネクチ
ン　５０μ？とトロンビン４０μ２をＴＢＳ　１００μ
を中に加え３７”Ｃで３０分間反応させ、ビトロネクチ
ン−トロンビン複合体を調製した。一方、ビトロネクチ
ン８０μｔとトロンビン８０！ｔｆとアンチトロンビン
Ｉ［１４０μｔをＴＢＳ１００μを中に加え３７°Ｃで
３０分間反応させ、ＶＴＡＴ複合体を調製した。これら
複合体を本発明によるＶＴＡＴ複合体測定方法で測定し
たところ、ビＦロネクチンートロンビン複合体との交差
反応は認められなかった。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明した通り、本発明によりビトロネクチン
及びＶＴＡＴ？Ｊ合体の簡便で特異的な測定方法が提供
され、特に血液の凝固線溶系の疾患の診断に有用である
ことが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のビトロネクチン測定方法による健常人
プール血しようを倍々希釈したものを測定した時の検量
線を示すグラフ、第２図は本発明のＶＴＡＴ複合体測定
方法による健常人ブーμ血しようを倍々希釈したものを
測定した時の検−１線を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫学的方法により試料中のビトロネクチンを測定
   する方法において抗原認識部位の異なる２種の抗ビトロ
   ネクチンモノクローナル抗体を用いることを特徴とする
   ビトロネクチンの測定方法。 ２、免疫学的方法により試料中のビトロネクチン−トロ
   ンビン−アンチトロンビンIII複合体を測定する方法に
   おいて抗ビトロネクチンモノクローナル抗体と抗アンチ
   トロンビンIIIモノクローナル抗体を用いることを特徴
   とするビトロネクチン−トロンビン−アンチトロンビン
   III複合体の測定方法。