TW201710285A - 表皮生長因子受體變體ｉｉｉ－間皮素融合物及使用其之方法 - Google Patents

表皮生長因子受體變體ｉｉｉ－間皮素融合物及使用其之方法 Download PDF

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Abstract

本文提供用於引發個體之免疫反應的組成物及方法。詳言之，本發明係關於包含表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)多肽及間皮素多肽之融合蛋白及使用包含編碼該融合蛋白之核酸分子的宿主細胞引發免疫反應的方法。在一些具體實例中，該核酸分子可編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白，該融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。

Description

表皮生長因子受體變體III-間皮素融合物及使用其之方法 【相關申請案】
本申請案主張2015年4月13日申請之美國臨時申請案第62/146,559號及2015年10月19日申請之美國臨時申請案第62/243,397號之權益。以上申請案之全部教示內容以引用之方式併入本文中。
【以引用的方式併入ASCII正文檔案中之材料】
本申請案以引用的方式併入與本申請案同時提交之以下ASCII正文檔案中所含之序列表： a)檔案名稱：[ ].txt；創建[ ]，[ ]KB大小。
肺癌為全球頭號癌症死亡原因且發病率據估計為每年130萬新病例。在美國，其為第二最常診斷出之癌症，每年診斷出超過200,000人患有此疾病且其為癌症相關死亡之主要原因，據估計每年幾乎160,000人死於該疾病。新診斷之肺癌病例的大致80%至85%為非小細胞肺癌(NSCLC)(腺癌、鱗狀癌及大細胞癌)且15%至20%為小細胞肺癌。手術切除為最 一貫且成功的治癒選項，但要求癌症可完全切除，其對大多數患者而言並非可行的，因為70%之患者存在不可切除及/或不可治癒之疾病。
在最近數十年期間癌症診斷及治療之進步已獲得結果之實質上改良，但一些腫瘤(諸如NSCLC)仍難以在疾病早期診斷出且首先存在晚期疾病或在初步治療之後進展之患者的總存活率(OS)持續不佳。此等患者需要其他療法。
本文揭示包含表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)多肽與間皮素多肽融合之融合蛋白。在一些具體實例中，該融合蛋白可包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
亦提供編碼所揭示之融合蛋白的核酸分子。在一些具體實例中，該核酸分子可包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
本文揭示包含所揭示之核酸分子的宿主細胞。在一些具體實例中，該宿主細胞可包含如下核酸分子，該核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
亦提供引發個體之免疫反應的方法。在一些具體實例中，該方法可包含向該個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。在一些態樣中，該核酸分子可包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
亦揭示增加間皮素多肽之表現的方法，其包含在宿主細胞中表現包含EGFRvIII聚核苷酸及編碼該間皮素多肽之間皮素聚核苷酸的核酸分子。在一些具體實例中，該核酸分子可包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
亦提供治療需要治療之個體之癌症的方法。在一些具體實例中，該方法可包含向該個體投予治療有效量之包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。在一些具體實例中，該核酸分子可編碼如下融合蛋白，該融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。在一些態樣中，該核酸分子可包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
【發明詳述】
參照與附圖結合之以下詳細描述可更易於理解所揭示之組成物及方法，以下詳細描述形成本發明之一部分。應理解，所揭示之組成物及方法不限於本文中所描述及/或展示之特定組成物及方法，且本文所用之術語僅用於藉助於實施例描述特定具體實例的目的，且不意欲限制所主張之組成物及方法。
除非另外具體陳述，否則任何關於可能機制或作用模式或改良原因之描述僅意謂為說明性的，且所揭示之組成物及方法不受任何此類所提出之機制或作用模式或改良原因之正確性或不正確性限制。
在此正文通篇，描述涉及組成物及使用該組成物之方法。當本發明描述或主張與組成物相關聯之特徵或具體實例時，此類特徵或具體實例同樣適用於使用該組成物之方法。類似地，當本發明描述或主張與使用組成物之方法相關聯之特徵或具體實例時，此類特徵或具體實例同樣適用於該組成物。
應瞭解，所揭示之組成物及方法為了清楚起見在本文中在單獨具體實例之情形下描述的某些特徵亦可組合提供於單個具體實例中。相反地，所揭示之組成物及方法為了簡便起見在單個具體實例之情形下描述的各種特徵亦可單獨或以任何子組合形式提供。
如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數。
在本發明通篇使用以下縮寫：EGFRvIII(表皮生長因子受體變體III新抗原接合區)；EGFRvIIIx5(EGFRvIII之5個複本)；Meso(間皮素)；ADU-214(EGFRvIIIx5-間皮素35-622)；Lm(單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes))；LADD(雙重缺失之單核球增多性李氏菌)。
△符號(△或「.DELTA.」)係指缺失。舉例而言，「△ actA」(或「.DELTA.actA」)意指全部或部分actA基因缺失。
術語「約」在用於提及數值範圍、截止值或特定值時用於指示列舉值可與列出值相差至多高達10%。因此，術語「約」用於涵蓋規定值之±10%或10%以下之差異、±5%或5%以下之差異、±1%或1%以下之差異、±0.5%或0.5%以下之差異或±0.1%或0.1%以下之差異。
如本文所用，術語「個體」係指人類或非人類生物體。因此，本文所述之方法及組成物適用於人類及獸醫學疾病。在某些具體實例中，個體為「患者」，亦即正接受疾病或病狀之醫療護理的活人。此包括正接受病理學病徵研究之患有不確定疾病的人員。較佳為患有表現EGFRvIII及間皮素中之一或多者且較佳每一者之惡性病的個體。在某些具體實例中，個體罹患肺癌且較佳晚期(第IIIb期)或轉移性(第IV期)非小細胞肺癌(NSCLC)腺癌。
如本文所用，術語「一致百分比」、「序列一致性」及「一致性百分比」係指兩個或兩個以上多肽之間相同(亦即一致)的胺基酸的百分比。兩個或兩個以上多肽之間的序列一致性可藉由比對多肽之胺基酸序列且對經比對多肽中含有相同胺基酸殘基之位置數目進行評分並比較經比對多肽中不同之位置數目來測定。多肽可例如藉由含有不同胺基酸(亦即取代或突變)或藉由缺乏胺基酸(一個或兩個多肽中之胺基酸插入或胺基酸缺失)而在一個位置處不同。序列一致性可藉由用含有相同胺基酸殘基之位置數目除以多肽中胺基酸殘基之總數來計算。舉例而言，可藉由用含有相同胺基酸殘基之位置數目除以多肽中胺基酸殘基之總數且乘以100來 計算一致性百分比。
「其免疫原性片段」包括能夠引發個體之免疫原性反應的融合蛋白部分。在一些態樣中，免疫原性片段包含EGFRvIII-間皮素、由EGFRvIII-間皮素組成或基本上由EGFRvIII-間皮素組成。在其他態樣中，免疫原性片段包含信號序列-EGFRvIII-間皮素、由信號序列-EGFRvIII-間皮素組成或基本上由信號序列-EGFRvIII-間皮素組成。
如本文所用，「融合蛋白」係指由兩個或兩個以上多肽接合而製成之蛋白質。可藉由以化學方式結合多肽來產生融合蛋白。較佳地，藉由基因融合產生融合蛋白，其中編碼個別多肽之核酸分子同框接合，使得該核酸分子之轉錄及轉譯產生包含該個別多肽之單個蛋白質。所揭示之融合蛋白可在多肽之間具有一或多個連接子殘基。
如本文所用，「信號序列」係指多肽序列及編碼其之核苷酸序列，其用於驅動融合蛋白之分泌。信號序列可操作地連接於包含融合蛋白之多肽且為具有包含融合蛋白之多肽的轉譯閱讀框架。「信號序列」亦可稱為「分泌信號序列」。
如本文所用，「可操作地連接」係指控制序列(諸如啟動子核糖體結合位點)以維持組件正常功能之方式的併接。「控制序列」典型地指可操作地連接之編碼序列在宿主生物體中之表現所必需的DNA序列。控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及視情況選用之夏因/達爾加諾序列(Shine/Dalgarno sequence)。因此，編碼序列「可操作地連接」於經編碼信號序列係指編碼序列以使得信號肽經宿主細胞加工且分泌經加工蛋白之方式接合至信號序列的組態。必要時，可操作地連接於啟動子之信號序列以 使得分泌信號序列之轉錄及轉譯由啟動子、核糖體結合位點及夏因/達爾加諾序列控制之方式接合至啟動子。
如本文所用，「i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致」涵蓋與參考項目(例如生物序列)至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致。
對於EGFRvIII多肽及含有其之免疫原性融合蛋白，本文所述之任何序列變異性必須存在於SEQ ID NO：9之胺基酸殘基7至14(EEKKGNYV)之外。換言之，序列變異性可存在於SEQ ID NO：9之胺基酸殘基1至6(PASRAL)或含有其之免疫原性融合蛋白及/或SEQ ID NO：9之胺基酸殘基15至21(VTDHGSC)或含有其之免疫原性融合蛋白中。舉例而言，包含與SEQ ID NO：9至少90%一致的胺基酸序列的EGFRvIII多肽涵蓋與SEQ ID NO：9 90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列，其中變異性存在於SEQ ID NO：9之胺基酸殘基1至6或15至21中。因此，各EGFRvIII多肽及含有其之免疫原性融合蛋白將含有SEQ ID NO：9之胺基酸殘基7至14(EEKKGNYV)。
可調節EGFRvIII多肽之長度以包括SEQ ID NO：9之較短部分。舉例而言，在一些具體實例中，EGFRvIII多肽可包含與SEQ ID NO：9之胺基酸殘基6至18至少90%一致的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。在一些具體實例中，EGFRvIII多肽之一或多個複本可包含與SEQ ID NO：9之胺基酸殘基6至14至少90%一致的胺基酸 序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。如上所述，此等較短多肽中之變異性將存在於SEQ ID NO：9之胺基酸殘基1至6或15至21中。因此，對於與SEQ ID NO：9之胺基酸殘基6至18至少90%一致的胺基酸序列，變異性可存在於SEQ ID NO：9之胺基酸殘基6或15至18中。對於與SEQ ID NO：9之胺基酸殘基6至14至少90%一致的胺基酸序列，變異性可存在於胺基酸殘基6。
所揭示之融合蛋白可包含EGFRvIII抗原及間皮素抗原、由EGFRvIII抗原及間皮素抗原組成或基本上由EGFRvIII抗原及間皮素抗原組成。本文所述之抗原可包括作為來自全長蛋白序列之MHC I類抗原決定基或MHC II類抗原決定基的序列。在一個具體實例中，所述EGFRvIII聚核苷酸包含編碼至少一個MHC I類抗原決定基或至少一個MHC II類抗原決定基的序列。類似地，本文所述之EGFRvIII多肽包括至少一個MHC I類抗原決定基或至少一個MHC II類抗原決定基。在一個具體實例中，所述間皮素聚核苷酸包含編碼至少一個MHC I類抗原決定基或至少一個MHC II類抗原決定基的序列。類似地，本文所述之間皮素多肽包括至少一個MHC I類抗原決定基或至少一個MHC II類抗原決定基。
EGFR為對細胞生長及存活至關重要的受體酪胺酸激酶。EGFR基因常常在人類癌症中過度表現或突變，包括頭頸癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、腎臟癌及惡性神經膠質瘤。EGFR受體變體III(EGFRvIII)由外顯子2至7之267胺基酸缺失及外顯子1與外顯子8之融合產生，從而產生在接合點處具有新穎甘胺酸之腫瘤特異性肽。EGFRvIII呈現組成性、非配位體依賴性信號傳導。
間皮素為存在於覆蓋胸膜、腹膜及心包膜之正常間皮細胞上的糖基化磷脂醯肌醇連接之細胞表面醣蛋白。間皮素亦為由數種人類腫瘤(包括胰腺癌、間皮瘤、NSCLC及卵巢癌)高度表現之腫瘤相關抗原。
預測算法「BIMAS」根據肽/HLA複合物之預測半衰期離解排列可能的HLA結合抗原決定基。「SYFPEITHI」算法根據說明存在一級及二級HLA結合錨定殘基之評分來排列肽。兩種電腦化算法基於給定蛋白質內與先前公開之HLA結合抗原決定基具有類似結合基元的胺基酸序列而對候選抗原決定基進行評分。其他算法亦可用於鑑別候選物以用於其他生物學測試。
融合蛋白及該融合蛋白之抗原部分的例示性核苷酸及胺基酸序列以及編碼其之核酸分子提供於表2中。
融合蛋白
本文揭示包含表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)多肽與間皮素多肽融合之融合蛋白(EGFRvIII-間皮素融合蛋白)。
融合蛋白可包含EGFRvIII多肽之一或多個複本。在一些具體實例中，融合蛋白可包含一個EGFRvIII多肽。在其他具體實例中，融合蛋白可包含複數個EGFRvIII多肽。EGFRvIII多肽之適合複本數包括(但不限於)2個、3個、4個、5個或更多個複本。在一些具體實例中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽之一個複本(EGFRvIIIx1)。在一些具體實例中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽之兩個複本(EGFRvIIIx2)。在一些具體實例中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽之三個複本(EGFRvIIIx3)。在一些具體實例中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽之四個複本(EGFRvIIIx4)。在一些具體 實例中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽之五個複本(EGFRvIIIx5)。
在一些態樣中，EGFRvIII多肽之一或多個複本中之每一者可包含與SEQ ID NO：9至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列。在一些具體實例中，舉例而言，EGFRvIII多肽可包含與SEQ ID NO：9至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。在其他具體實例中，EGFRvIII多肽可包含EGFRvIII多肽之2個、3個、4個、5個或更多個複本，各複本具有與SEQ ID NO：9至少90%一致的胺基酸序列。
在一些態樣中，EGFRvIII多肽之一或多個複本中之每一者可由與SEQ ID NO：9至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列組成。在一些態樣中，EGFRvIII多肽之一或多個複本中之每一者可基本上由與SEQ ID NO：9至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列組成。
在一些具體實例中，EGFRvIII多肽之一或多個複本可包含與SEQ ID NO：9之胺基酸殘基6至18至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。在一些具體實例中，EGFRvIII多肽之一或多個複本可包含與SEQ ID NO：9之胺基酸殘基6至14至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。
EGFRvIII多肽可在EGFRvIII多肽之N端、C端或N端及C 端處由一或多個切割序列(cleaver sequence)側接。切割序列經組態以由個體中存在之蛋白酶加工。當EGFRvIII多肽包含EGFRvIII多肽之2個或2個以上複本時，切割序列可存在於EGFRvIII多肽之個別複本之間。舉例而言且不意欲限制，SEQ ID NO：10含有EGFRvIII多肽之5個複本(EGFRvIII多肽之各複本闡述於SEQ ID NO：9中)及切割序列(ASKVL/ADGSVKTS(SEQ ID NO：26)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO：27)、LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO：28)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO：29)及LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO：30)；其中「/」表示EGFRvIII多肽)。此等切割序列實際上僅為例示性的。適合的切割序列描述於美國專利申請案第13/988,076號(美國專利公開案第2014/037662號)；Toes等人，J.Exp.Med.(2001)194：1-12；Lauer等人，Infect.Immun.(2008)76：3742-53；及Sinnathamby等人，J.Immunother.(2009)32：856-69中，其各自以全文引用的方式併入本文中。
EGFRvIII多肽可為間皮素多肽之N端或C端。在一些具體實例中，EGFRvIII多肽可為間皮素多肽之N端。
適合的間皮素多肽包括具有與間皮素之胺基酸35-622(在本文中稱為「間皮素35-622」)至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的間皮素多肽。
在一些態樣中，間皮素多肽可包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列。因此，在一些具體實例中，間皮素多肽可包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序 列。在一些態樣中，間皮素多肽可由與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列組成。在一些態樣中，間皮素多肽可基本上由與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列組成。
融合蛋白可包含以下各物、由以下各物組成或基本上由以下各物組成：一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。融合蛋白可包含以下各物、由以下各物組成或基本上由以下各物組成：EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。在一些具體實例中，融合蛋白可包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。舉例而言，在一些態樣中，融合蛋白可包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列。在一些態樣中，融合蛋白可由 與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列組成。在一些態樣中，融合蛋白可基本上由與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致、94%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致或100%一致的胺基酸序列組成。
所揭示之融合蛋白可另外包含信號序列。在一些具體實例中，融合蛋白可另外包含信號序列，其中該信號序列與EGFRvIII多肽及間皮素多肽一起位於轉譯閱讀框架中。適合的信號序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO：32中所闡述)、ActAN100*(如SEQ ID NO：12中所闡述)、LLO441(如SEQ ID NO：20中所闡述)、LLO441 △ PEST(如SEQ ID NO：22中所闡述)及LLO441 △ 26(如SEQ ID NO：24中所闡述)。在一些具體實例中，信號序列可包含與如SEQ ID NO：32中所闡述之ActAN100至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。在一些具體實例中，融合蛋白可另外包含信號序列，其中該信號序列包含與如SEQ ID NO：12中所闡述之ActAN100*信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。因此，融合蛋白可包含與如SEQ ID NO：8中所闡述之ActAN100*-EGFRvIIIx5-間皮素35-622或其免疫原性片段至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。在其他態樣中，融合蛋白可由與如SEQ ID NO：8中所闡述之ActAN100*-EGFRvIIIx5-間皮素35-622或其免疫原性片段至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列組成。在又其他態樣中，融合蛋白可 基本上由與如SEQ ID NO：8中所闡述之ActAN100*-EGFRvIIIx5-間皮素35-622或其免疫原性片段至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列組成。
所揭示之融合蛋白可在如本文別處所揭示之許多適合的宿主細胞中表現。在一些具體實例中，舉例而言，融合蛋白可在細菌中表現，諸如單核球增多性李氏菌或其經遺傳修飾之形式。
所揭示之融合蛋白可用作免疫原性多肽以引發接受融合蛋白之個體之體液反應、抗原特異性T細胞反應(CD4+及/或CD8+)或兩者。
核酸分子
本文揭示編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。所揭示之核酸分子可編碼本文所揭示之EGFRvIII-間皮素融合蛋白中之任一者。
在本發明通篇，描述包含一或多個EGFRvIII多肽的EGFRvIII-間皮素融合蛋白及編碼包含一或多個EGFRvIII多肽的該融合蛋白的核酸。EGFRvIII多肽可由表1中所提供之EGFRvIII核苷酸序列中之任一者編碼。因此，在本發明通篇，當EGFRvIII聚核苷酸稱為「與SEQ ID NO：4(表1中之共同序列)至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致」時，其意欲包括：與SEQ ID NO：13至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致；與SEQ ID NO：14至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致；與SEQ ID NO：15至少90%一致；與SEQ ID NO：16至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致；及/或與SEQ ID NO：17至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。類似地，編碼各種免疫原性融合蛋白之核苷酸序列可包含SEQ ID NO：13-17中之任一者。因此，本文所提供之各EGFRvIII-間皮素融合蛋白可由核酸分 子編碼，其中該核酸分子包含與SEQ ID NO：13至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、與SEQ ID NO：14至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、與SEQ ID NO：15至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、與SEQ ID NO：16至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致及/或與SEQ ID NO：17至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個聚核苷酸。
核酸分子可編碼具有一或多個EGFRvIII多肽之EGFRvIII-間皮素融合蛋白。在一些具體實例中，核酸分子可編碼具有一個EGFRvIII多肽(EGFRvIIIx1)之EGFRvIII-間皮素融合蛋白。在其他具體實例中，核酸分子可編碼具有複數個EGFRvIII多肽之EGFRvIII-間皮素融合蛋白。由所揭示之核酸分子編碼之EGFRvIII多肽之適合數目包括(但不限於)2個、3個、4個、5個或更多個複本。在一些具體實例中，核酸分子可編碼具有EGFRvIII多肽之2個複本(EGFRvIIIx2)的EGFRvIII-間皮素融合蛋白。在一些具體實例中，核酸分子可編碼具有EGFRvIII多肽之3個複本(EGFRvIIIx3)的 EGFRvIII-間皮素融合蛋白。在一些具體實例中，核酸分子可編碼具有EGFRvIII多肽之4個複本(EGFRvIIIx4)的EGFRvIII-間皮素融合蛋白。在一些具體實例中，核酸分子可編碼具有EGFRvIII多肽之5個複本(EGFRvIIIx5)的EGFRvIII-間皮素融合蛋白。
編碼EGFRvIII多肽之EGFRvIII聚核苷酸的例示性核酸序列闡述於SEQ ID NO：4中。在一些具體實例中，所揭示之核酸分子可包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸。編碼EGFRvIIIx5多肽之EGFRvIIIx5聚核苷酸的例示性核酸序列闡述於SEQ ID NO：5中。在一些具體實例中，所揭示之核酸分子可包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的EGFRvIIIx5聚核苷酸。
由核酸分子編碼之適合的間皮素多肽包括間皮素35-622。間皮素 35-622 之核酸序列闡述於SEQ ID NO：6中。因此，所揭示之核酸分子可編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白，其中間皮素多肽由與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸編碼。
在一些具體實例中，核酸分子可包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。在一些具體實例中，核酸分子可包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚 核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。在一些具體實例中，核酸分子可包含與SEQ ID NO：7至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的EGFRvIIIx5-間皮素 35-622 聚核苷酸。
所揭示之核酸分子可另外包含啟動子、信號序列或兩者。信號序列可用於引導經編碼融合蛋白自宿主細胞分泌。適合的啟動子包括例如actA(如SEQ ID NO：2中所闡述)或hly(如SEQ ID NO：18中所闡述)。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含啟動子，其中該啟動子包含與如SEQ ID NO：2中所闡述之actA啟動子至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含啟動子，其中該啟動子包含與如SEQ ID NO：18中所闡述之hly啟動子至少90%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含與編碼EGFRvIII多肽之核苷酸序列及編碼間皮素多肽之核苷酸序列一起位於轉譯框架中之信號序列。信號序列可用於引導經編碼融合蛋白自宿主細胞分泌。適合的信號序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO：31中所闡述)、ActAN100*(如SEQ ID NO：3中所闡述)、LLO441(如SEQ ID NO：19中所闡述)、LLO441 △ PEST(如SEQ ID NO：21中所闡述)及LLO441 △ 26(如SEQ ID NO：23中所闡述)。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含信號序列，其中該信號序列可包含與如SEQ ID NO：31中所闡述之ActAN100信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含信號序列，其中該信號序列可包含與如SEQ ID NO：3中所闡述之ActAN100*信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷 酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含信號序列，其中該信號序列可包含與如SEQ ID NO：19中所闡述之LLO441信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含信號序列，其中該信號序列可包含與如SEQ ID NO：21中所闡述之LLO441 △ PEST信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含信號序列，其中該信號序列可包含與如SEQ ID NO：23中所闡述之LLO441 △ 26信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。因此，在一些具體實例中，核酸分子可包含與如SEQ ID NO：1中所闡述之鹼基對actAp-ActAN100*-EFGRvIIIx5-間皮素 35-622 至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸、由該聚核苷酸組成或基本上由該聚核苷酸組成。
在一些具體實例中，核酸分子可編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白，其中該融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，核酸分子可編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白，其中該融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，核酸分子編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋 白，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。
核酸分子可另外包含其他核酸序列，包括(但不限於)限制性核酸內切酶裂解位點(選殖連接子)。核酸分子可使用多種適合的限制性核酸內切酶產生，其中核酸內切酶裂解位點可保持於最終核酸分子中。SEQ ID NO：1包括BamHI選殖連接子(GGATCC)及MfeI選殖連接子(CAATTG)。熟習此項技術者應知曉，其他選殖連接子可代替BamHI及/或MfeI使用。
核酸分子中可包括之其他核酸序列包括「切割序列」(如本文別處所述)，其側接個別EGFRvIII聚核苷酸。
核酸分子可為表現卡匣之一部分。表現卡匣可包含啟動子、包含所揭示之核酸分子的開放閱讀框架及3'非轉譯區。表現卡匣可用於引導宿主細胞之機構產生所揭示之融合蛋白。
亦提供包含所揭示之核酸分子的載體。適合的載體包括例如細菌載體、病毒載體、裸DNA載體及裸RNA載體。
宿主細胞
亦提供包含本文所揭示之核酸分子中之任一者的宿主細胞。
適合的宿主細胞包括例如細菌。宿主細胞可為減毒、共生及/或殺死的，但具有代謝活性。在一例示性具體實例中，宿主細胞可為減毒、共生及/或殺死，但具有代謝活性之細菌。適合的細菌包括(但不限於)單核球增多性李氏菌、弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、大腸桿菌(Escherichia coli)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)或分枝桿菌屬(mycobacterium species)，或其經修飾之形式。在一些具體實例中，舉例而言，宿主細胞可為單核球增多性李氏菌或其經修飾之形式。修飾包括突變、改變及其他遺傳變化/變異，以及熱處理或化學修飾，其降低宿主細胞對個體之毒性。細菌可經修飾例如以減少與個體內之細胞的結合、減少個體內自一個細胞傳播至另一個細胞、減少個體中之細胞外生長或減少個體中之細胞內生長。
適合作為宿主細胞之細菌菌株包括美國專利申請案第13/988,076號(美國專利公開案第2014/037662號)中所述之細菌菌株，該申請案以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，宿主細胞可為單核球增多性李氏菌之活減毒菌株，其經遺傳修飾以在actA及/或inlB中包含減毒突變，且較佳缺失actA及inlB之全部或一部分(在本文中稱為「Lm △ actA/△ inlB」)，且含有編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。在一些具體實例中，單核球增多性李氏菌可為actA缺失(△ actA)突變體、actA插入突變體、inlB缺失(△ inlB)突變體、inlB插入突變體或其組合。舉例而言，單核球增多性李氏菌可為△ actA/△ inlB突變體。
宿主細胞可包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該核酸分子整合至宿主細胞基因體中。核酸分子可整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至actA基因座中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至inlB基因座中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。此類宿主細胞含 有受宿主細胞表現序列控制之核酸且從而無需真核轉錄或轉譯元件。
宿主細胞可包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該核酸分子以染色體外的方式位於宿主細胞內。舉例而言，編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子可插入至宿主細胞內之附加型(episomal)質體上的表現卡匣中。
本文提供經修飾以包含所揭示之核酸分子中之任一者的重組李氏菌。核酸分子可以染色體外的方式存在於李氏菌中，或可整合至細菌基因體中。在一些具體實例中，舉例而言，宿主細胞可為具有編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子整合至tRNAArg基因座中之單核球增多性李氏菌△ actA/△ inlB突變體。李氏菌可用作表現平台以用於表現對宿主細胞而言為異源的所揭示之融合蛋白。此類表現可引起例如針對含有宿主細胞之個體中之異源融合蛋白之免疫反應。
ADU-214為經工程改造以表現EGFRvIII及間皮素之Lm的活減毒菌株(Lm △ actA/△ inlB)。EGFRvIII-hMeso之表現由Lm actA啟動子驅動，該啟動子在Lm已感染宿主細胞時具有高度誘導性。actA基因存在於PrfA調節子中，PrfA調節子為表現受PrfA控制及誘導之一系列Lm毒性基因，PrfA為在經感染宿主細胞之情形下誘導之轉錄活化因子蛋白。ADU-214中之EGFRvIII-間皮素表現卡匣僅僅利用Lm轉錄、轉譯及分泌機構且其不含有任何哺乳動物表現元件(諸如哺乳動物表現系統之啟動子或終止子區特徵)。因此，與必須利用哺乳動物宿主細胞機構表現指定相關基因之基於質體DNA或病毒的載體不同，且根據定義，當基因轉移為基因表現之前提條件時，Lm為「自含型」自由活生物體。在經疫苗接種之宿主的經感染細 胞內，僅僅採用ADU-214之原核表現機構在細菌內合成EGFRvIII-間皮素融合蛋白，其隨後分泌至宿主細胞細胞質中用於抗原加工及呈現。
宿主細胞可與醫藥學上可接受之賦形劑組合。
本文亦提供包含所揭示之宿主細胞及醫藥學上可接受之賦形劑的疫苗。疫苗可以足以引發如本文所揭示之適當免疫反應的量投予個體。
引發免疫反應之方法
本文亦揭示引發個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。
所揭示之方法可使用包含所揭示之核酸分子中之任一者的宿主細胞來進行。在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，該核酸分子包含與如SEQ ID NO：1中所闡述之actAp-ActAN100*-EGFRvIII-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素35-622聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii) 95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素35-622聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含與SEQ ID NO：7至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的EGFRvIIIx5-間皮素35-622聚核苷酸。
本文所揭示之宿主細胞中之任一者適用於所揭示之方法。舉例而言，宿主細胞可為單核球增多性李氏菌之活減毒菌株，其經遺傳修飾以在actA及/或inlB中包含減毒突變，且較佳缺失actA及inlB之全部或一部分(在本文中稱為「Lm △ actA/△ inlB」)，且含有編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。在一些具體實例中，單核球增多性李氏菌可為actA缺失突變體、actA插入突變體、inlB缺失突變體、inlB插入突變體或其組合。舉例而言，單核球增多性李氏菌可為△ actA/△ inlB突變體。
投予個體之宿主細胞可包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該核酸分子整合至宿主細胞基因體中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至actA基因座中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至inlB基因座中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。投予個體之宿主細胞可包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該核酸分子以染色體外的方式位於宿主細胞內。
向個體投予宿主細胞之適合模式包括(但不限於)靜脈內、經口、皮下、皮內、肌肉內、腹膜內、經黏膜、經鼻投予或其任何組合。在一些具體實例中，靜脈內進行投予步驟。
宿主細胞可用作表現平台以在個體內表現所揭示之融合蛋 白，由此引發針對含有宿主細胞之個體中之異源融合蛋白的免疫反應。舉例而言，融合蛋白可由個體內經感染細胞之細胞質液中之宿主細胞表現及分泌。經感染細胞包括個體內可吸收宿主細胞之任何細胞。在一些具體實例中，經感染細胞可為抗原呈現細胞。抗原呈現細胞(APC)為用於向T細胞呈現抗原之免疫系統之細胞。APC包括樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞、邊緣區庫普弗細胞(marginal zone Kupffer cell)、微神經膠質細胞、朗格罕氏細胞(Langerhans cell)、T細胞及B細胞。在一些具體實例中，融合蛋白可在個體之一或多種細胞中表現。
所揭示之融合蛋白中之任一者可用作免疫原性多肽以引發個體之免疫反應。在一些具體實例中，舉例而言，該方法可包含向個體投予包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子的宿主細胞，其中該融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8中所闡述之ActAN100*-EGFRvIIIx5-間皮素35-622或其免疫原性片段至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子的宿主細胞，其中該融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子的宿主細胞，其中該融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間 皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，舉例而言，該方法可包含向個體投予包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子的宿主細胞，其中該融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
所揭示之方法可用於引發間皮素免疫反應、EGFRvIII免疫反應、針對李氏菌之免疫性或其任何組合。因此，提供引發個體之間皮素免疫反應的方法，其包含向該個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。亦提供引發個體之EGFRvIII免疫反應的方法，其包含向該個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。另外提供引發個體之針對李氏菌之免疫性的方法，其包含向該個體投予包含單核球增多性李氏菌之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。
所揭示之方法可引發體液反應、抗原特異性T細胞反應(CD4+及/或CD8+)或兩者。舉例而言，在ADU-214進入經感染真核宿主細胞之細胞質液後，EGFRvIII-間皮素融合蛋白可由宿主細胞表現及分泌，且隨後由經感染細胞之蛋白酶體機構加工。在MHCI類及II類分子在APC表面上之情形下，可呈現EGFRvIII-間皮素融合蛋白之蛋白質片段，其可導 致誘導全身性EGFRvIII特異性及間皮素特異性CD4+及CD8+ T細胞免疫性。此外，在IV投予之後，ADU-214之主要目標細胞咸信為肝臟及脾臟中之吞噬細胞。此等細胞之感染可導致誘導由I型干擾素早期生產起始的促炎性細胞激素級聯。重要的是，當ADU-214表現並分泌經編碼之EGFRvIII-間皮素抗原(除了其他細菌產物之外)時，ADU-214自吞噬溶菌體離開進入經感染宿主細胞之細胞質液中。由於免疫刺激性環境及宿主細胞表現EGFRvIII-間皮素抗原，故而ADU-214隨後能夠激活全身性EGFRvIII-間皮素特異性T細胞免疫性。
增加間皮素多肽之表現的方法
本文揭示增加間皮素多肽之表現的方法，其包含在宿主細胞中表現包含EGFRvIII聚核苷酸及編碼間皮素多肽之間皮素聚核苷酸的核酸分子。
所揭示之方法可在支持或可經組態以支持所揭示之核酸分子之轉錄及間皮素多肽之表現的任何宿主細胞中進行，包括(但不限於)細菌細胞、病毒細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。表現步驟可藉由將核酸分子引入至宿主細胞中且使宿主細胞機構產生間皮素多肽來進行。或者，表現步驟可藉由向感興趣的細胞投予宿主細胞來進行，其中間皮素多肽在該感興趣的細胞內產生。在一些具體實例中，表現步驟可藉由用宿主細胞感染感興趣的細胞來進行，其中間皮素多肽在感興趣的細胞內產生。在一些具體實例中，表現步驟可藉由向個體投予宿主細胞來進行，其中間皮素多肽在個體內產生。
因此，所揭示之方法可用於增加個體之間皮素的表現。該方 法可包含在個體中表現包含EGFRvIII聚核苷酸及編碼間皮素多肽之間皮素聚核苷酸的核酸分子。
增加個體之間皮素的表現可藉由向該個體投予包含編碼間皮素多肽之核酸的宿主細胞來進行。本文所揭示之任何宿主細胞可與所揭示之方法一起使用。舉例而言，宿主細胞可為活減毒菌株，諸如單核球增多性李氏菌。單核球增多性李氏菌可經遺傳修飾以在actA及/或inlB中包含減毒突變，且較佳缺失actA及inlB之全部或一部分(在本文中稱為「Lm △ actA/△ inlB」)，且含有編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。在一些具體實例中，單核球增多性李氏菌可為actA缺失突變體、actA插入突變體、inlB缺失突變體、inlB插入突變體或其組合。舉例而言，單核球增多性李氏菌可為△ actA/△ inlB突變體。
宿主細胞可包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該核酸分子整合至宿主細胞基因體中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至actA基因座中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至inlB基因座中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。宿主細胞可包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該核酸分子以染色體外的方式位於宿主細胞內。
適用於所揭示之方法的核酸分子包括本文別處所揭示之彼等核酸分子。核酸分子可包含EGFRvIII聚核苷酸之單個複本或EGFRvIII聚核苷酸之一或多個複本，其中該EGFRvIII聚核苷酸包含與SEQ ID NO：4至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。EGFRvIII聚核苷酸之適合複本數包括(但不限於)2個、3個、4個、5個或更多個複本。 EGFRvIII聚核苷酸可由編碼切割序列之一或多個核苷酸序列側接。
在一些具體實例中，增加間皮素多肽之表現的方法可包含在宿主細胞中表現如下核酸分子，該核酸分子包含與如SEQ ID NO：1中所闡述之actAp-ActAN100*-EGFRvIII-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，增加間皮素多肽之表現的方法可包含在宿主細胞中表現如下核酸分子，該核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。在一些具體實例中，增加間皮素多肽之表現的方法可包含在宿主細胞中表現如下核酸分子，該核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素35-622聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。在一些具體實例中，增加間皮素多肽之表現的方法可包含在宿主細胞中表現如下核酸分子，該核酸分子包含與SEQ ID NO：7至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的EGFRvIIIx5-間皮素35-622聚核苷酸。
間皮素聚核苷酸可編碼間皮素35-622多肽。在一些具體實例中，間皮素多肽可包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。因此，所揭示之方法可用於增加間皮素35-622的表現量。
核酸分子可另外包含信號序列、啟動子或兩者。在一些具體 實例中，核酸分子可另外包含信號序列，其中該信號序列包含與如SEQ ID NO：3中所闡述之ActAN100*至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含啟動子，其中該啟動子包含與如SEQ ID NO：2中所闡述之actA啟動子至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可另外包含信號序列及啟動子，其中該信號序列包含與如SEQ ID NO：3中所闡述之ActAN100*至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列，且該啟動子包含與如SEQ ID NO：2中所闡述之actA啟動子至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
治療個體之癌症的方法
癌症疫苗之治療概念涵蓋意欲誘導及增強針對惡性腫瘤細胞之特異性適應性免疫反應之廣泛範圍的平台技術。最初在相關非臨床癌症模型中開發的多種疫苗技術已進入現患有疾病或作為在治癒性腫瘤移除之後的輔助治療之患者群體的臨床測試中。令人遺憾的是，在全世界癌症相關死亡之主要原因NSCLC中，使用疫苗之活性免疫治療干預尚未達成藉由展現關於腫瘤反應、腫瘤復發或進展之延遲及最終總存活率(OS)之延長的顯著益處的臨床概念驗證。據相信，此臨床功效之缺乏主要歸因於特異性抗性機制，其使得NSCLC細胞能夠避開免疫識別及避免由治療性癌症疫苗接種之後誘導及活化之抗原定向T淋巴球的細胞毒性摧毀。所揭示之方法解決此等及其他問題。
本文揭示在有需要的個體中治療癌症的方法，該方法包含向該個體投予治療有效量之包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編 碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。
EGFRvIII為僅在包括NSCLC之腫瘤細胞中發現且在體內正常細胞未發現的獨特突變。引發有效及長期EGFRvIII特異性T細胞及抗體反應可消除表現EGFRvIII之細胞及施加有利於不表現EGFRvIII之細胞的免疫選擇壓力，潛在地促進用現有靶向治療劑治療殘餘腫瘤。所揭示之方法僅特異性靶向腫瘤細胞中藉由缺失EGFR之外顯子2至7所表現之EGFRvIII新抗原區，而非正常功能細胞群體中信號轉導所需的天然EGFR。因此，預期EGFRvIII特異性免疫反應侷限於表現此EGFR變體之患者群體。另外，EGFRvIII可增強間皮素的表現，間皮素為在正常組織表面上有限表現、但由包括NSCLC之數種人類腫瘤高度表現的腫瘤相關抗原。藉由用所揭示之組成物免疫誘導之細胞毒性T淋巴球(CTL)經特定設計以識別及選擇性破壞經宿主細胞感染之細胞及過度表現EGFRvIII及間皮素之腫瘤細胞。舉例而言，由於免疫刺激性環境及宿主細胞表現EGFRvIII及間皮素，故而EGFRvIII-間皮素融合蛋白(諸如ADU-214)隨後能夠激活全身性EGFRvIII特異性及間皮素特異性T細胞免疫性，由此局部限制表現抗原之腫瘤的生長。因此，可用所揭示之方法治療之適合的癌症包括表現間皮素之癌症、表現EGFRvIII之癌症或兩者。在一些具體實例中，癌症可為表現間皮素之癌症。在一些態樣中，舉例而言，癌症可具有高程度的間皮素表現。如本文所用，「高程度的間皮素表現」係指與非癌性組織中間皮素表現程度相比，癌性組織中間皮素蛋白的過度表現。在一些具體實例中，癌症可為表現EGFRvIII之癌症。在一些具體實例中，癌症可為表現間皮素之癌症及表現EGFRvIII之癌症。
較佳地，表現間皮素之癌症、表現EGFRvIII之癌症或表現間皮素之癌症及表現EGFRvIII之癌症為肺癌。肺癌包括非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌。在一較佳態樣中，可對患有NSCLC之個體進行所揭示之方法。NSCLC包括NSCLC腺癌、NSCLC鱗狀細胞癌、大細胞癌或其任何組合。在一些具體實例中，癌症可為NSCLC腺癌。在一些具體實例中，癌症可為NSCLC鱗狀細胞癌。在一些具體實例中，癌症可為大細胞癌。在一些具體實例中，癌症可為NSCLC腺癌、NSCLC鱗狀細胞癌及大細胞癌之任何組合。
所揭示之方法可用於治療患有晚期(第IIIb期)或轉移性(第IV期)NSCLC腺癌且標準療法已失敗及/或正在進行的個體。在一些具體實例中，肺癌可為晚期NSCLC腺癌。在其他具體實例中肺癌可為轉移性NSCLC腺癌。NSCLC之標準療法包括(但不限於)手術、輻射、化學療法或其任何組合。因此，在一些態樣中，所揭示之方法可用於治療經受手術之個體。在其他態樣中，所揭示之方法可用於治療經受輻射之個體。在其他態樣中，所揭示之方法可用於治療經受化學療法之個體。在又其他態樣中，所揭示之方法可用於治療經受先前手術、輻射及化學療法之任何組合的個體。
本文所揭示之宿主細胞中之任一者適用於所揭示之方法。舉例而言，宿主細胞可為單核球增多性李氏菌。在一較佳態樣中，宿主細胞可為單核球增多性李氏菌之活減毒菌株，其經遺傳修飾以在actA及/或inlB中包含減毒突變，且較佳缺失actA及inlB之全部或一部分(在本文中稱為「Lm △ actA/△ inlB」)，且含有編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。 在一些具體實例中，單核球增多性李氏菌可為actA缺失(△ actA)突變體、actA插入突變體、inlB缺失(△ inlB)突變體、inlB插入突變體或其組合。舉例而言，單核球增多性李氏菌可為△ actA/△ inlB突變體。
投予個體之宿主細胞可包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該核酸分子整合至宿主細胞基因體中。在一些具體實例中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。投予個體之宿主細胞可包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該核酸分子以染色體外的方式位於宿主細胞內。
宿主細胞可用作表現平台以在個體內表現EGFRvIII-間皮素融合蛋白，由此引發針對表現EGFRvIII之腫瘤細胞、表現間皮素之腫瘤細胞或表現EGFRvIII之腫瘤細胞及表現間皮素之腫瘤細胞兩者的抗腫瘤反應。融合蛋白可由個體內經感染細胞之細胞質液中之宿主細胞表現及分泌。經感染細胞包括個體內可吸收宿主細胞之任何細胞。在一些具體實例中，經感染細胞可為抗原呈現細胞。
所揭示之融合蛋白中之任一者可用作免疫原性多肽以引發個體之抗腫瘤反應。舉例而言，融合蛋白可包含一或多個EGFRvIII多肽。在一些具體實例中，融合蛋白可包含一個EGFRvIII多肽。在其他具體實例中，融合蛋白可包含複數個EGFRvIII多肽。EGFRvIII多肽之適合複本數包括(但不限於)2個、3個、4個、5個或更多個複本。在一些具體實例中，舉例而言，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽之2個、3個、4個、5個或更多個複本。EGFRvIII-間皮素融合蛋白可包含一或多個EGFRvIII多肽，其具有與SEQ ID NO：9至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
適合的間皮素多肽包括具有與間皮素之胺基酸35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的間皮素多肽。舉例而言，EGFRvIII-間皮素融合蛋白可包含具有與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的間皮素多肽。
在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。在一些態樣中，融合蛋白可包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。在其他態樣中，融合蛋白可由與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列組成。在又其他態樣中，融合蛋白可基本上由與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列組成。
在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該融合蛋白包含以下各物、由以下各物組成或基本上由以下各物組成：一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列； 及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該融合蛋白包含以下各物、由以下各物組成或基本上由以下各物組成：EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
所揭示之融合蛋白可另外包含信號序列。因此，在一些具體實例中，該方法可包含向個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8中所闡述之ActAN100*-EGFRvIIIx5-間皮素35-622或其免疫原性片段至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列、由該胺基酸序列組成或基本上由該胺基酸序列組成。
適用於該方法之核酸分子包括本文所揭示之核酸分子中之任一者。例示性核酸分子為如SEQ ID NO：7中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622聚核苷酸。在一些具體實例中，舉例而言，核酸分子可包含與如SEQ ID NO：7中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子可由與如SEQ ID NO：7中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列組成。在一些具體實例中，核酸分子可基本上由與如SEQ ID NO：7中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或 iii)99%一致的核苷酸序列組成。
在一些具體實例中，核酸分子可包含以下各物、由以下各物組成或基本上由以下各物組成：與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素35-622聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。在一些具體實例中，核酸分子可包含以下各物、由以下各物組成或基本上由以下各物組成：與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素35-622聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
適合的核酸分子可另外包含編碼啟動子、信號序列或兩者之核苷酸序列。舉例而言，在一些具體實例中，核酸分子可包含與如SEQ ID NO：1中所闡述之actAp-ActAN100*-EGFRvIII-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列、由該核苷酸序列組成或基本上由該核苷酸序列組成。在其他具體實例中，核酸分子可由與SEQ ID NO：1至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列組成。在又其他具體實例中，核酸分子可基本上由與SEQ ID NO：1至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列組成。
所揭示之方法可另外包含在投予組成物之前，在來自個體之生物樣品中量測間皮素含量、偵測EGFRvIII或兩者。在來自個體之生物樣品中量測間皮素含量及/或偵測EGFRvIII之存在的方法包括(但不限於)免疫組織化學(IHC)、西方墨點法、顯微法、免疫沈澱、BCA分析、分光光 度法或其任何組合。可在包括(但不限於)血液、淋巴液、骨髓、實體腫瘤樣品或其任何組合之生物樣品中偵測間皮素含量及/或EGFRvIII。
組成物可另外包含醫藥學上可接受之賦形劑。舉例而言，宿主細胞可與任何適合之緩衝液組合，包括(但不限於)磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)及甘油。在一例示性具體實例中，組成物可調配於杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Dulbecco's phosphate-buffered saline；PBS)及甘油中，冷凍儲存(處於或低於-60℃)直至投藥，且在氯化鈉中藉由靜脈內(IV)輸注經適合的時間段投予。熟習此項技術者應知曉，投予組成物之時間段部分取決於癌症類型、癌症的嚴重程度及個體的年齡、體重等。較佳地，組成物可經數小時時段投予。舉例而言，組成物可經1-2小時時段投予。在其他具體實例中，組成物可在小於1-2小時內投予。在又其他具體實例中，組成物可在大於1-2小時內投予。
治療可包括單劑量組成物或多劑量組成物。因此，所揭示之方法可包含向個體投予一或多次劑量之包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。可決定劑量數目之因素包括例如癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合。不意欲為限制性，劑量數目可基於癌症之進程或降低進程失敗、癌症症狀之嚴重程度增加或嚴重程度無變化、癌症症狀之頻率增加或頻率無變化、腫瘤尺寸增加或尺寸無變化或其任何組合來增加。舉例而言，可投予個體1至100次劑量或更多次劑量的組成物。
可決定宿主細胞之劑量的因素包括例如癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合。在一些具體實 例中，組成物可包含約1×108至約1×109個菌落形成單位(CFU)的宿主細胞。在一些態樣中，組成物可包含約1×108個CFU的宿主細胞。在一些態樣中，組成物可包含約1×109個CFU的宿主細胞。
組成物可約每7天投予一次、約每14天投予一次、約每21天投予一次、約每28天投予一次、約每35天投予一次、約每42天投予一次、約每49天投予一次、約每56天投予一次、約每63天投予一次、約每70天投予一次、約每77天投予一次、約每84天投予一次或約每91天投予一次。
基於前述內容，熟習此項技術者應理解，可藉由投予所述劑量之本文所述之組成物中之任一者來治療個體之癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥以所述規則間隔重複。因此，在一個具體實例中，組成物可以約1×108至約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每7天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108至約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每14天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108至約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每21天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投 予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108至約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每35天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108至約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每45天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108至約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每60天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108至約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每90天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每7天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每14天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑 形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每21天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每35天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每45天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每60天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×108個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每90天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每7天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×109個CFU 之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每14天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每21天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每35天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每45天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每60天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。在一個具體實例中，組成物可以約1×109個CFU之劑量投予個體以治療癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合，其中給藥約每90天重複一次。此外，本文所述之組成物可以適於此類劑量以此方式投予之醫藥製劑形式製備。
較佳地，治療可在劑量之間包括不向個體投予組成物之時間 段。舉例而言，該方法可包含向個體投予第一劑量之包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，監測第一劑量之功效，且若第一劑量無效，則向個體投予一或多次劑量之組成物。可決定組成物之功效的因素包括例如癌症之進程、癌症症狀之嚴重程度、癌症症狀之頻率、腫瘤尺寸或其任何組合。不意欲為限制性，癌症之進程或降低進程失敗、癌症症狀之嚴重程度增加或嚴重程度無變化、癌症症狀之頻率增加或頻率無變化、腫瘤尺寸增加或尺寸無變化或其任何組合可為第一劑量之組成物無效的指示。在劑量之間的適合時間段包括數天、數週或數月。在一些具體實例中，在劑量之間的時間段可為約1天至約90天、約5天至約80天、約10天至約70天、約15天至約60天、約20天至約50天或約25天至約40天。舉例而言，在劑量之間的時間段可為約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約14天、約21天、約28天、約35天、約42天、約49天、約56天、約60天、約65天、約70天、約80天、約85天或約90天。
向個體投予組成物之適合模式包括(但不限於)靜脈內、經口、皮下、皮內、肌肉內、腹膜內、經黏膜、經鼻投予或其任何組合。在一些具體實例中，可靜脈內進行投予步驟。
治療可另外包含在投予組成物之後，向個體投予抗生素。舉例而言，一旦向患者投予最後一劑之組成物且在適合的間隔時間之後，可給予患者抗生素。因此，在一較佳態樣中，在最後一劑之組成物之後，投予抗生素。在對青黴素(penicillin)過敏的個體中，適合的抗生素包括(但不限於)阿莫西林(amoxicillin)或甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲基異噁 唑(sulfamethoxazole)。熟習此項技術者將能夠確定向個體投予抗生素之足夠的劑量及給藥時程。
提供以下實施例以進一步描述一些本文所揭示之具體實例。實施例意欲說明而非限制所揭示之具體實例。
實施例
方法
細菌菌株
所揭示之研究中所用的細菌菌株在表2中列出。
ADU-214之分子構築
將221個鹼基對(bp)actA啟動子及258 bp經修飾之信號序列ActAN100*選殖至pPL2整合載體之衍生物中作為KpnI-BamHI片段。將486 bp編碼EGFRvIII新抗原接合區之5個複本(EGFRvIIIx5)之序列選殖於具有ActAN100*之框架中作為BamHI-MfeI片段。同框選殖1767 bp編碼人類間皮素之胺基酸35-622(間皮素35-622)之序列作為MfeI-EagI片段。如以引用的方式併入本文中之Lauer,P.等人，Construction,Characterization and Use of Two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.J.Bacteriology(2002)184(15)：4177-4186)中所述，將整個表現卡匣插入在LADD平台菌株(Lm11，亦稱為Lm △ actA △ inlB)之tRNA Arg基因座，且移除載體骨架序列。
ADU-214及CRS-207之示意圖分別繪示在圖1A及圖1B中。
肉汁培養生長細胞之西方墨點及細胞內感染
對於肉汁培養生長西方墨點，使李氏菌菌株在酵母培養基中生長至OD600為2.0。藉由離心移除細菌且清液層在冰上進行TCA沈澱。離心清液層，離心塊用丙酮洗滌且再懸浮於還原性LDS緩衝液(Invitrogen)中。將樣品加熱至95℃持續10分鐘，且在4-12%聚丙烯醯胺凝膠上操作等效量並轉移至硝化纖維素膜以用於西方墨點分析。用針對ActA蛋白之成熟N端培養的多株抗體探測墨點。用Licor Odyssey IR偵測系統對偵測進行目測及定量。
對於細胞內西方墨點，DC2.4細胞以感染倍率(MOI)10用各Lm菌株接種1小時，且細胞用PBS及補充有50μg/mL健大黴素(gentamycin)之DMEM培養基洗滌3次。在感染後7小時收集細胞。細胞用SDS樣品緩衝液溶解，收集且在4-12%聚丙烯醯胺凝膠上操作並轉移至硝化纖維素膜以用於西方墨點分析。細胞內西方墨點採用針對ActA蛋白之成熟N端培養之多株抗體且用抗p60單株抗體正規化至p60表現(無關Lm蛋白)。用Licor Odyssey IR偵測系統對抗原偵測進行目測及定量。
經疫苗接種之小鼠中之抗原特異性免疫反應
對於間皮素特異性免疫原性，Balb/c小鼠(n=5)用2×106cfu ADU-214靜脈內(IV)疫苗接種。在七天之後，收集脾臟且藉由IFN γ ELIspot分析，使用間皮素之重疊肽庫(153個由11個胺基酸重疊之15聚肽)或未刺激的培養基對照物量測免疫反應。對於EGFRvIII特異性免疫原性，C3H/HeN小鼠(n=4)用5×106cfu ADU-214靜脈內疫苗接種。在七天之後， 收集脾臟且藉由IFN γ ELIspot分析，使用EGFRvIII26-33(Kk結合肽EEKKGNYV)量測免疫反應。
針對野生型李氏菌攻擊之保護性免疫
Balb/c小鼠用2×106cfu各Lm菌株靜脈內疫苗接種一次。四十天後，小鼠用5×104cfu(2倍LD50劑量)野生型(WT)Lm菌株DP-L4056靜脈內攻擊(描述於Lauer,P.等人，Construction,Characterization and Use of Two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.J.Bacteriology(2002)184(15)：4177-4186)，其以引用的方式併入本文中)。三天後，收集脾臟且均質化。將稀釋液塗覆於含有200μg/mL鏈黴素(streptomycin)之BHI盤上以測定每個器官之cfu。此分析中之偵測極限(LOD)為50CFU。
腫瘤研究
CT26腫瘤細胞經表現人類間皮素之DNA質體轉染以產生穩定細胞系CT26-hMeso純系3。在即將植入之前，使等分試樣之冷凍腫瘤細胞融化且在T細胞培養基中生長至匯合。當匯合時，收集細胞且再懸浮於HBSS中達到1×106個細胞/毫升之濃度以植入每隻小鼠每200μL劑量2×105個細胞。在第0天，Balb/c小鼠(每組10隻小鼠)用2×105CT26-hMeso細胞靜脈內(IV)植入。在腫瘤植入後第3天，靜脈內給予小鼠：HBSS；5×106cfu、1×105cfu或5×103cfu之ADU-214；或5×106cfu Lm11(空平台菌株)。監測小鼠之存活率。
癌症之治療
在標準療法已失敗及在篩選時正在進行標準療法之患有晚期(第IIIb期)或轉移性(第IV期)NSCLC(腺癌)之個體中進行首次應 用於人類(FiH)的第1階段開放標記多中心研究(2部分研究)，以評估單一藥劑ADU-214之安全性、確定推薦的第2階段劑量(RP2D)及測定初步臨床功效及免疫反應。投予治療直至確認放射線攝影疾病進程、不可接受之毒性、撤回同意、研究者決定停止治療、開始後續抗癌療法或發起者終止研究。
第1部分(劑量遞增)：經設計以基於安全性及藥力學評定確定RP2D。依次投予兩種劑量之ADU-214(劑量群組1-A：1×108個菌落形成單位(CFU)及劑量群組1-B：1×109CFU)，應用經修改之毒性概率區間(mTPI)設計。在各劑量群組中之最後一名個體已在DLT觀察期完成治療之後，研究評估隊(SET)評估所有安全性資料且作出第二組待治療個體是否遞增、保持在當前劑量或遞減劑量群組之決定。
第2部分(劑量擴增)：第2部分經設計以在ADU-214之RP2D確定之後評估兩個擴增群組。在第2部分徵選大致30名個體(群組2-A[n=20]及群組2B[n=10])且以RP2D加以治療。所存檔的用於間皮素之集中免疫組織化學評定的腫瘤材料可用於第2部分的所有個體。僅具有過度表現間皮素之腫瘤且具有可經受腫瘤核心活組織檢查之原發性腫瘤或轉移性病灶的個體徵選至群組2B中。群組2B中之個體同意治療前及治療後活組織檢查。雖然對於群組1A及1B以及群組2A而言為任選的，但強烈需要轉移性病灶之治療前及治療後活組織檢查以進一步理解研究之分子活性。使用CT或PET CT成像進行活組織檢查程序。
在開放標記治療時段期間，每21天靜脈內投予ADU-214一次。經1小時時段靜脈內投予ADU-214，必要時視情況增加輸注持續時間。 投予治療直至確認放射線攝影疾病進程、不可接受之毒性、撤回同意、研究者決定停止治療、開始後續抗癌療法或發起者終止研究。評估安全性及功效。
研究群體-在此研究中徵選18歲的患有組織學或細胞學記錄之NSCLC腺癌；第III b或IV期疾病；基於電腦斷層攝影(CT)成像記錄之腫瘤進程；至少1個可量測之疾病部位(僅第2部分)及東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group；ECOG)機能狀態評分為0或1的個體組合用於第1部分及第2部分。個體必須已接受至少2個前線美國食品與藥物管理局(FDA)批准之全身性療法，其中一種療法必須為含鉑方案(不包括：在一線含鉑化學療法之後拒絕二線方案之個體)。
功效評估-研究者根據實體腫瘤之反應評估準則(V1.1；Eur.J.Cancer 45：228,2009)及免疫相關反應準則(Clin.Cancer Res.15：7412,2009)評估功效評定。使用具有頸部、胸部、腹部及骨盆之IV對比的CT掃描評定疾病反應。不耐受IV CT對比劑之個體用口服對比劑進行CT掃描。可使用磁共振成像(MRI)評估無法使用CT充分成像之疾病部位。僅當臨床上指定時才需要腦部MRI。視需要藉由放射成像、身體檢查或其他程序之所有功效評估(包括其他疾病部位)在該部位進行。在整個研究中，在各時間點使用與用於在基線評定疾病之相同評定方法進行此等評定。亦在後續抗癌療法及治療後隨訪期之整個存活期中收集資料。
結果
ADU-214在肉汁培養物中之表現
如圖2中所說明，EGFRvIII與間皮素35-622融合導致肉汁培養 物中之蛋白比CRS-207增加大致50倍。ADU-214融合蛋白經預測為大致88kDa(標記為EGFRvIII-Meso)。CRS-207蛋白經預測為大致72kDa(標記為Meso)。未偵測到陰性對照平台菌株Lm11之條帶。
ADU-214在經感染細胞中之表現
如圖2中所說明，EGFRvIII與間皮素35-622融合導致蛋白之細胞內表現比CRS-207增加大致42倍。ADU-214融合蛋白經預測為大致88kDa。CRS-207蛋白經預測為大致72kDa。p60為與經感染細胞中之細菌數目相關的組成性Lm蛋白，且大致為60kDa。上圖展示用ActA多株抗體偵測融合蛋白之表現。下圖展示用單株抗體偵測之p60表現。未偵測到陰性對照平台菌株Lm11之條帶。
經疫苗接種之小鼠中之抗原特異性T細胞免疫反應
ADU-214在Balb/c小鼠中誘導穩固的間皮素特異性T細胞介導之免疫反應(圖4A)。ADU-214在C3H/HeN小鼠中誘導穩固的EGFRvIII特異性CD8+ T細胞免疫反應(圖3A及圖3B)。
用ADU-214疫苗接種誘導針對WT李氏菌攻擊之保護性免疫
用ADU-214之單一疫苗接種誘導針對WT李氏菌攻擊之完全保護性、長期免疫，達到與疫苗平台菌株Lm11相當的程度(圖4)。用ADU-214疫苗接種導致在WT-Lm攻擊之後cfu減少大於6-log。功能性免疫為抗原特異性免疫反應之量值與免疫反應保護免受未來的攻擊之能力的組合。在此情況下，用完全毒力野生型李氏菌攻擊測試功能性。
用ADU-214之治療性疫苗接種產生劑量依賴性抗腫瘤反應
在治療性CT26-hMeso肺癌轉移模型中，在Balb/c小鼠中測定ADU-214之抗腫瘤功效(圖5)。小鼠用不同劑量之ADU-214、空Lm △ actA △ inlB平台菌株(ANZ-100)或漢克氏平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution；HBSS)靜脈內疫苗接種。與疫苗之有效免疫原性一致，接受ADU-214之動物與接受ANZ-100(稱為Lm11)或HBSS之動物相比具有改良的存活率。在ADU-214投予後延長的存活期具有劑量依賴性，其中在接受最高劑量(5×106CFU)之組中長期存活者為70%，在中間劑量(1×105CFU)組中之長期存活者為60%且在最低劑量(5×103CFU)組中之長期存活者為20%。
熟習此項技術者應瞭解，可對本文所揭示之較佳具體實例進行許多變化及修改，且此類變化及修改可在不背離本發明之精神的情況下進行。因此，隨附申請專利範圍意欲涵蓋所有此類等效變化作為屬於所揭示之組成物及方法的真正精神及範疇內。
此文件中所引用或所描述之各專利、專利申請案及公開案的揭示內容在此以全文引用之方式併入本文中。
actAp-ActAN100*-EGFRvIIIx5-間皮素35-622-終止子(SEQ ID NO：1)之組件 為：actA啟動子(小寫字母)；ActAN100*(大寫字母)；BamHI選殖連接子(第一下劃線)；EGFRvIIIx5(斜體字)；MfeI選殖連接子(第二下劃線)；間皮素35-622(粗體)；終止密碼子(taa)。
ADU-214融合蛋白胺基酸序列(SEQ ID NO：8)之組件為：ActAN100*(正常文字)；GS：BamHI選殖連接子(雙下劃線)；QL：MfeI選殖連接子(虛線下劃線)；EGFRvIIIx5(斜體字)；間皮素35-622(粗體)。
在一些具體實例中，本發明提供一種融合蛋白，其包含與間皮素多肽融合之表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)多肽。
在一些具體實例中，該EGFRvIII多肽包含與SEQ ID NO：9至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，該融合蛋白包含複數個EGFRvIII多肽。在一個具體實例中，該融合蛋白包含EGFRvIII多肽之五個複本。
在一些具體實例中，該EGFRvIII多肽由一或多個切割序列側接。在一些具體實例中，EGFRvIII多肽為間皮素多肽之N端。
在一些具體實例中，間皮素多肽包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，融合蛋白另外包含信號序列，其中該信號序列與EGFRvIII多肽及間皮素多肽一起位於轉譯閱讀框架中。在一些具體實例中，信號序列與如SEQ ID NO：12中所闡述之ActAN100*至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
在一些具體實例中，前述具體實例中任一者之融合蛋白包含與SEQ ID NO：8至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，該融合蛋白在細菌中表現。在一個具體實例中，該細菌為單核球增多性李氏菌。
在一些具體實例中，本發明提供一種編碼前述具體實例中任一者之融合蛋白的核酸分子。
在一些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
在一些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
在一些具體實例中，該核酸分子為表現卡匣之一部分。
在一些具體實例中，本發明提供一種宿主細胞，其包含前述具體實例中任一者之核酸分子。在一些具體實例中，該宿主細胞為細菌。在一個具體實例中，該細菌為單核球增多性李氏菌。在一些具體實例中，單核球增多性李氏菌為actA缺失突變體、actA插入突變體、inlB缺失突變體、inlB插入突變體或其組合。在某些具體實例中，單核球增多性李氏菌為△ actA/△ inlB突變體。
在某些具體實例中，核酸分子整合至宿主細胞基因體中。在一些具體實例中，核酸分子整合至tRNA Arg 基因座中。
在一些具體實例中，本發明提供一種載體，其包含前述具體實例中任一者之核酸分子。
在一些具體實例中，本發明提供一種編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在某些具體實例中，EGFR-間皮素融合蛋白包含EGFRvIIIx5 多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在某些具體實例中，EGFR-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，核酸另外包含信號序列，其中該信號序列與編碼EGFRvIII多肽之核苷酸序列及編碼間皮素多肽之核苷酸序列一起位於轉譯框架中。在某些具體實例中，信號序列與如SEQ ID NO：3中所闡述之ActAN100*至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。在一些具體實例中，核酸另外包含啟動子。在各種具體實例中，啟動子與如SEQ ID NO：2中所闡述之actA啟動子至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。在一些具體實例中，啟動子與如SEQ ID NO：18中所闡述之hly啟動子至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
在一些具體實例中，前述具體實例中任一者之核酸分子包含與SEQ ID NO：1至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
在一些具體實例中，本發明提供一種宿主細胞，其包含前述具體實例中任一者之核酸分子。在某些具體實例中，該宿主細胞為細菌。在一個具體實例中，該細菌為單核球增多性李氏菌。在各種具體實例中，單核球增多性李氏菌為actA缺失突變體、actA插入突變體、inlB缺失突變體、inlB插入突變體或其組合。在某些具體實例中，單核球增多性李氏菌為 △ actA/△ inlB突變體。在一些具體實例中，核酸分子整合至宿主細胞基因體中。舉例而言，核酸分子整合至tRNA Arg 基因座中。
在一些具體實例中，宿主細胞與醫藥學上可接受之賦形劑組合。
在一些具體實例中，本發明提供一種疫苗，其包含前述具體實例中任一者之宿主細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些具體實例中，本發明提供一種載體，其編碼前述具體實例中任一者之核酸分子。
在一些具體實例中，本發明提供一種引發個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。
在一些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
在一些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
在各種具體實例中，核酸分子包含與SEQ ID NO：1至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
在一些具體實例中，核酸分子整合至該宿主細胞之基因體 中。舉例而言，核酸分子整合至tRNA Arg 基因座中。
在前述方法中任一者之一些具體實例中，宿主細胞為單核球增多性李氏菌。在某些具體實例中，單核球增多性李氏菌為actA缺失突變體、actA插入突變體、inlB缺失突變體、inlB插入突變體或其組合。在一個具體實例中，單核球增多性李氏菌為△ actA/△ inlB突變體。
在前述方法中任一者之一些具體實例中，靜脈內進行投予步驟。在某些具體實例中，融合蛋白由個體內經感染細胞之細胞質液中之宿主細胞表現及分泌。在一個具體實例中，經感染細胞為抗原呈現細胞。
在前述方法中任一者之一些具體實例中，EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在前述方法中任一者之一些具體實例中，EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在前述方法中任一者之一些具體實例中，EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在某些具體實例中，本發明提供一種增加間皮素多肽之表現的方法，其包含在宿主細胞中表現包含EGFRvIII聚核苷酸及編碼間皮素多肽之間皮素聚核苷酸的核酸分子。
在一些具體實例中，EGFRvIII聚核苷酸與SEQ ID NO：4至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
在某些具體實例中，核酸分子包含複數個EGFRvIII聚核苷酸，其中各EGFRvIII聚核苷酸包含與SEQ ID NO：4至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在一些具體實例中，核酸分子包含EGFRvIII聚核苷酸之五個複本，其中該EGFRvIII聚核苷酸與SEQ ID NO：5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
在各種具體實例中，間皮素多肽包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。在某些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。在一些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
在某些具體實例中，核酸分子另外包含信號序列、啟動子或兩者，其中該啟動子、信號序列或兩者可操作地與編碼EGFRvIII多肽之核 苷酸序列及編碼間皮素多肽之核苷酸序列連接。
在一些具體實例中，核酸分子包含與SEQ ID NO：1至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。在前述方法中任一者之一些具體實例中，宿主細胞為單核球增多性李氏菌。
在前述方法中任一者之一些具體實例中，該表現步驟包含用宿主細胞感染感興趣的細胞。在一些具體實例中，該表現步驟包含向個體投予宿主細胞。
在一些具體實例中，本發明提供一種在有需要的個體中治療癌症的方法，該方法包含向該個體投予治療有效量之包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。在一些具體實例中，癌症為表現間皮素之癌症、表現EGFRvIII之癌症或兩者。 在一些具體實例中，癌症具有高程度的間皮素表現。在某些具體實例中，癌症為肺癌。在各種具體實例中，肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)腺癌、NSCLC鱗狀細胞癌、大細胞癌或其任何組合。在一些具體實例中，肺癌為晚期NSCLC腺癌或轉移性NSCLC腺癌。在一個具體實例中，個體的標準療法失敗。在一些具體實例中，個體經受手術、輻射、化學療法或其任何組合。
在一些具體實例中，EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含具有與SEQ ID NO：9至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的EGFRvIII多肽。在某些具體實例中，融合蛋白包含複數個EGFRvIII多肽。在一個具體實例中，融合蛋白包含EGFRvIII多肽之五個複本。
在某些具體實例中，EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含具有與 如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的間皮素多肽。
在一些具體實例中，EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列及包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的間皮素多肽。
在一些具體實例中，融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在一些具體實例中，EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
在某些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
在一些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡 述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
在一些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：1中所闡述之actAp-ActAN100*-EGFRvIII-間皮素 35-622 至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
在一些具體實例中，核酸分子包含與如SEQ ID NO：7中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素 35-622 至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
在某些具體實例中，該核酸分子整合至宿主細胞基因體中。在一個具體實例中，該核酸分子整合至tRNA Arg 基因座中。在某些具體實例中，宿主細胞為單核球增多性李氏菌。在某些具體實例中，單核球增多性李氏菌為actA缺失(△ actA)突變體、actA插入突變體、inlB缺失(△ inlB)突變體、inlB插入突變體或其組合。在一些具體實例中，單核球增多性李氏菌為△ actA/△ inlB突變體。
在各種具體實例中，融合蛋白由個體內經感染細胞之細胞質液中之宿主細胞表現及分泌。在一些具體實例中，經感染細胞為抗原呈現細胞。在一些具體實例中，方法另外包含在投予組成物之前，在來自個體之生物樣品中量測間皮素含量、偵測EGFRvIII或兩者。
在前述方法中任一者之一些具體實例中，組成物另外包含醫藥學上可接受之賦形劑。在某些具體實例中，醫藥學上可接受之賦形劑包含磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)及甘油。在某些具體實例中，靜脈內進行 投予步驟。在一些具體實例中，方法另外包含在投予組成物之後，向個體投予抗生素。在一些具體實例中，抗生素在最後劑量的組成物之後投予。在某些具體實例中，抗生素為阿莫西林或甲氧苄啶/磺胺甲基異噁唑。
在某些具體實例中，前述具體實例中任一者之宿主細胞的核酸分子插入至宿主細胞內之附加型質體上的表現卡匣中。
在一些具體實例中，前述具體實例中任一者之融合蛋白另外包含信號序列，其中該信號序列與EGFRvIII多肽及間皮素多肽一起位於轉譯閱讀框架中：該信號序列與如SEQ ID NO：20中所闡述之LLO441信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、與如SEQ ID NO：22中所闡述之LLO441 △ PEST信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、或與如SEQ ID NO：24中所闡述之LLO441 △ 26信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
在一些具體實例中，前述具體實例中任一者之核酸另外包含信號序列，其中該信號序列與編碼EGFRvIII多肽之核苷酸序列及編碼間皮素多肽之核苷酸序列一起位於轉譯框架中：該信號序列與如SEQ ID NO：20中所闡述之LLO441信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、與如SEQ ID NO：22中所闡述之LLO441 △ PEST信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、或與如SEQ ID NO：24中所闡述之LLO441 △ 26信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
本文中所引用之所有專利、公開申請案及參考文獻之教示以全文引用的方式併入本文中。
儘管本發明已參照其例示性具體實例特定展示及描述，但熟 習此項技術者應瞭解，在不背離由隨附申請專利範圍涵蓋的本發明之範疇之情況下，可在其中做出形式及細節之各種改變。
當結合附圖閱讀時，進一步理解發明內容以及以下實施方式。出於說明所揭示之組成物及方法的目的，圖式中展示組成物及方法之例示性具體實例；然而，組成物及方法不限於所揭示之特定具體實例。在圖式中：圖1包含圖1A至圖1B，說明(A)EGFRvIIIx5-間皮素35-622(在本文中亦稱為ADU-214)及(B)CRS-207(展示用於參考)之例示性示意圖。
圖2說明ADU-214在肉汁培養物中之表現。EGFRvIII-Meso=ADU-214融合蛋白；Meso=CRS-207融合蛋白。Lm11用作陰性對照物。
圖3包含圖4A至圖4B，說明經疫苗接種之小鼠的抗原特異性T細胞免疫反應。(A)ADU-214在Balb/c小鼠中誘導之穩固的間皮素特異性T細胞介導之免疫反應。(B)ADU-214在C3H/HeN小鼠中誘導之穩固的EGFRvIII特異性CD8+ T細胞免疫反應。
圖4說明用ADU-214疫苗接種針對野生型李氏菌(Listeria)攻擊之保護性免疫。
圖5說明用ADU-214之治療性疫苗接種。HBSS及空平台菌株用作對照物。
<110> 勞爾,彼得M 韓森,威廉G
<120> 表皮生長因子受體變體III-間皮素融合物及使用其之方法
<130> 0148.2008-001
<150> 62/146,559
<151> 2015-04-13
<150> 62/243,397
<151> 2015-10-19
<160> 32
<170> Windows適用之FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 2744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合物
<400> 1
<210> 2
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 啟動子
<400> 2
<210> 3
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 啟動子
<400> 3
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> 33,42
<223> n=A、T、C或G
<220>
<223> EGFRvIII共同序列
<400> 4
<210> 5
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合物
<400> 5
<210> 6
<211> 1764
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 6
<210> 7
<211> 2256
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 7
<210> 8
<211> 840
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合物
<400> 8
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 9
<210> 10
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 10
<210> 11
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 11
<210> 12
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合物
<400> 12
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 13
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 14
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 15
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 16
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 17
<210> 18
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 啟動子
<400> 18
<210> 19
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO441序列
<400> 19
<210> 20
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO441序列
<400> 20
<210> 21
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 21
<210> 22
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 22
<210> 23
<211> 1245
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 23
<210> 24
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 24
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 25
<210> 26
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 26
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 27
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 28
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 29
<210> 30
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段
<400> 30
<210> 31
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ActAN100
<400> 31
<210> 32
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ActAN100
<400> 32

Claims (110)

  1. 一種融合蛋白，其包含與間皮素多肽融合之表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)多肽。
  2. 如申請專利範圍第1項之融合蛋白，其中該EGFRvIII多肽包含與SEQ ID NO：9至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含複數個EGFRvIII多肽。
  4. 如申請專利範圍第3項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含該EGFRvIII多肽之五個複本。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其中該EGFRvIII多肽由一或多個切割序列(cleaver sequence)側接。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其中該EGFRvIII多肽在該間皮素多肽之N端。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其中該間皮素多肽包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  8. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含 EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  10. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  11. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其另外包含信號序列，其中該信號序列與該EGFRvIII多肽及該間皮素多肽一起位於轉譯閱讀框架中。
  12. 如申請專利範圍第9項之融合蛋白，其中該信號序列與如SEQ ID NO：12中所闡述之ActAN100*至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
  13. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含與SEQ ID NO：8至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  14. 如前述申請專利範圍中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白在細菌中表現。
  15. 如申請專利範圍第14項之融合蛋白，其中該細菌為單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)。
  16. 一種核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之融合蛋白。
  17. 如申請專利範圍第16項之核酸分子，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii) 99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
  18. 如申請專利範圍第16項或第17項之核酸分子，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
  19. 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項之核酸分子，該核酸分子為表現卡匣之一部分。
  20. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第19項之核酸分子。
  21. 如申請專利範圍第20項之宿主細胞，其中該宿主細胞為細菌。
  22. 如申請專利範圍第21項之宿主細胞，其中該細菌為單核球增多性李氏菌。
  23. 如申請專利範圍第22項之宿主細胞，其中該單核球增多性李氏菌為actA缺失突變體、actA插入突變體、inlB缺失突變體、inlB插入突變體或其組合。
  24. 如申請專利範圍第23項之宿主細胞，其中該單核球增多性李氏菌為△ actA/△ inlB突變體。
  25. 如申請專利範圍第20項至第24項中任一項之宿主細胞，其中該核酸分子整合至該宿主細胞基因體中。
  26. 如申請專利範圍第25項之宿主細胞，其中該核酸分子整合至tRNA Arg 基因座中。
  27. 一種載體，其包含如申請專利範圍第19項之核酸分子。
  28. 一種編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子，其中該融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  29. 如申請專利範圍第28項之核酸分子，其中該EGFR-間皮素融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  30. 如申請專利範圍第28項或第29項之核酸分子，其中該EGFR-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  31. 如申請專利範圍第30項之核酸分子，其另外包含信號序列，其中該信號序列與編碼該EGFRvIII多肽之核苷酸序列及編碼該間皮素多肽之核苷酸序列一起位於轉譯框架中。
  32. 如申請專利範圍第31項之核酸分子，其中該信號序列與如SEQ ID NO：3中所闡述之ActAN100*至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
  33. 如申請專利範圍第28項至第32項中任一項之核酸分子，其另外包含啟 動子。
  34. 如申請專利範圍第33項之核酸分子，其中該啟動子與如SEQ ID NO：2中所闡述之actA啟動子至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
  35. 如申請專利範圍第30項至第34項中任一項之核酸分子，其中該核酸分子包含與SEQ ID NO：1至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
  36. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第30項至第35項中任一項之核酸分子。
  37. 如申請專利範圍第36項之宿主細胞，其中該宿主細胞為細菌。
  38. 如申請專利範圍第37項之宿主細胞，其中該細菌為單核球增多性李氏菌。
  39. 如申請專利範圍第38項之宿主細胞，其中該單核球增多性李氏菌為actA缺失突變體、actA插入突變體、inlB缺失突變體、inlB插入突變體或其組合。
  40. 如申請專利範圍第39項之宿主細胞，其中該單核球增多性李氏菌為△ actA/△ inlB突變體。
  41. 如申請專利範圍第36項至第40項中任一項之宿主細胞，其中該核酸分子整合至該宿主細胞基因體中。
  42. 如申請專利範圍第41項之宿主細胞，其中該核酸分子整合至tRNA Arg 基因座中。
  43. 如申請專利範圍第36項至第42項中任一項之宿主細胞，其與醫藥學上可接受之賦形劑組合。
  44. 一種疫苗，其包含如申請專利範圍第36項至第42項中任一項之宿主細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。
  45. 一種載體，其編碼如申請專利範圍第28項至第35項中任一項之核酸分子。
  46. 一種引發個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投予包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
  48. 如申請專利範圍第46項或第47項之方法，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
  49. 如申請專利範圍第46項至第48項中任一項之方法，其中該核酸分子包含與SEQ ID NO：1至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
  50. 如申請專利範圍第46項至第49項中任一項之方法，其中該核酸分子整合至該宿主細胞之基因體中。
  51. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該核酸分子整合至tRNA Arg 基因座 中。
  52. 如申請專利範圍第46項至第51項中任一項之方法，其中該宿主細胞為單核球增多性李氏菌。
  53. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該單核球增多性李氏菌為actA缺失突變體、actA插入突變體、inlB缺失突變體、inlB插入突變體或其組合。
  54. 如申請專利範圍第53項之方法，其中該單核球增多性李氏菌為△ actA/△ inlB突變體。
  55. 如申請專利範圍第46項至第54項中任一項之方法，其中該投予步驟係靜脈內進行。
  56. 如申請專利範圍第46項至第55項中任一項之方法，其中該融合蛋白由該個體內經感染細胞之細胞質液中之該宿主細胞表現及分泌。
  57. 如申請專利範圍第56項之方法，其中該經感染細胞為抗原呈現細胞。
  58. 如申請專利範圍第46項至第57項中任一項之方法，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  59. 如申請專利範圍第46項至第58項中任一項之方法，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽，其包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基 酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  60. 如申請專利範圍第46項至第59項中任一項之方法，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  61. 一種增加間皮素多肽之表現的方法，其包含在宿主細胞中表現包含EGFRvIII聚核苷酸及編碼該間皮素多肽之間皮素聚核苷酸的核酸分子。
  62. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該EGFRvIII聚核苷酸與SEQ ID NO：4至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
  63. 如申請專利範圍第61項或第62項之方法，其中該核酸分子包含複數個EGFRvIII聚核苷酸，其中各EGFRvIII聚核苷酸包含與SEQ ID NO：4至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
  64. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該核酸分子包含該EGFRvIII聚核苷酸之五個複本，其中該EGFRvIII聚核苷酸與SEQ ID NO：5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
  65. 如申請專利範圍第61項至第64項中任一項之方法，其中該間皮素多肽包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  66. 如申請專利範圍第61項至第65項中任一項之方法，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii) 95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
  67. 如申請專利範圍第61項至第66項中任一項之方法，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
  68. 如申請專利範圍第61項至第67項中任一項之方法，其中該核酸分子另外包含信號序列、啟動子或兩者，其中該啟動子、信號序列或兩者可操作地與編碼該EGFRvIII多肽之核苷酸序列及編碼該間皮素多肽之核苷酸序列連接。
  69. 如申請專利範圍第61項至第68項中任一項之方法，其中該核酸分子包含與SEQ ID NO：1至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
  70. 如申請專利範圍第61項至第69項中任一項之方法，其中該宿主細胞為單核球增多性李氏菌。
  71. 如申請專利範圍第61項至第70項中任一項之方法，其中該表現步驟包含用該宿主細胞感染感興趣的細胞。
  72. 如申請專利範圍第61項至第70項中任一項之方法，其中該表現步驟包含向個體投予該宿主細胞。
  73. 一種在有需要的個體中治療癌症的方法，該方法包含向該個體投予治 療有效量之包含宿主細胞之組成物，其中該宿主細胞包含編碼EGFRvIII-間皮素融合蛋白之核酸分子。
  74. 如申請專利範圍第73項之方法，其中該癌症為表現間皮素之癌症、表現EGFRvIII之癌症或兩者。
  75. 如申請專利範圍第73項或第74項之方法，其中該癌症具有高程度的間皮素表現。
  76. 如申請專利範圍第73項至第75項中任一項之方法，其中該癌症為肺癌。
  77. 如申請專利範圍第76項之方法，其中該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)腺癌、NSCLC鱗狀細胞癌、大細胞癌或其任何組合。
  78. 如申請專利範圍第77項之方法，其中該肺癌為晚期NSCLC腺癌或轉移性NSCLC腺癌。
  79. 如申請專利範圍第73項至第78項中任一項之方法，其中標準療法已對該個體失敗。
  80. 如申請專利範圍第73項至第79項中任一項之方法，其中該個體已經受手術、輻射、化學療法或其任何組合。
  81. 如申請專利範圍第73項至第80項中任一項之方法，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含具有與SEQ ID NO：9至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的EGFRvIII多肽。
  82. 如申請專利範圍第81項之方法，其中該融合蛋白包含複數個EGFRvIII多肽。
  83. 如申請專利範圍第82項之方法，其中該融合蛋白包含該EGFRvIII多肽之五個複本。
  84. 如申請專利範圍第73項至第83項中任一項之方法，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含具有與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的間皮素多肽。
  85. 如申請專利範圍第73項至第84項中任一項之方法，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含一或多個EGFRvIII多肽，其中之每一者包含與如SEQ ID NO：9中所闡述之EGFRvIII至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列；及間皮素多肽，其包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  86. 如申請專利範圍第73項至第85項中任一項之方法，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：10中所闡述之EGFRvIIIx5至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列及包含與如SEQ ID NO：11中所闡述之間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列的間皮素多肽。
  87. 如申請專利範圍第73項至第86項中任一項之方法，其中該融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8之胺基酸殘基89至840中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  88. 如申請專利範圍第73項至第87項中任一項之方法，其中該EGFRvIII-間皮素融合蛋白包含與如SEQ ID NO：8中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素35-622至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的胺基酸序列。
  89. 如申請專利範圍第73項至第88項中任一項之方法，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：4中所闡述之EGFRvIII聚核苷酸至少i)90%一致、ii) 95%一致或iii)99%一致的一或多個EGFRvIII聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的間皮素聚核苷酸。
  90. 如申請專利範圍第73項至第89項中任一項之方法，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：5中所闡述之EGFRvIIIx5聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸及與如SEQ ID NO：6中所闡述之間皮素 35-622 聚核苷酸至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的聚核苷酸。
  91. 如申請專利範圍第73項至第90項中任一項之方法，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：1中所闡述之actAp-ActAN100*-EGFRvIII-間皮素 35-622 至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
  92. 如申請專利範圍第73項至第91項中任一項之方法，其中該核酸分子包含與如SEQ ID NO：7中所闡述之EGFRvIIIx5-間皮素 35-622 至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致的核苷酸序列。
  93. 如申請專利範圍第73項至第92項中任一項之方法，其中該核酸分子整合至該宿主細胞基因體中。
  94. 如申請專利範圍第93項之方法，其中該核酸分子整合至tRNA Arg 基因座中。
  95. 如申請專利範圍第73項至第94項中任一項之方法，其中該宿主細胞為單核球增多性李氏菌。
  96. 如申請專利範圍第95項之方法，其中該單核球增多性李氏菌為actA缺失(△ actA)突變體、actA插入突變體、inlB缺失(△ inlB)突變體、 inlB插入突變體或其組合。
  97. 如申請專利範圍第96項之方法，其中該單核球增多性李氏菌為△ actA/△ inlB突變體。
  98. 如申請專利範圍第73項至第97項中任一項之方法，其中該融合蛋白由該個體內經感染細胞之細胞質液中之該宿主細胞表現及分泌。
  99. 如申請專利範圍第98項之方法，其中該經感染細胞為抗原呈現細胞。
  100. 如申請專利範圍第73項至第99項中任一項之方法，其另外包含在投予該組成物之前，在來自該個體之生物樣品中量測間皮素含量、偵測EGFRvIII或兩者。
  101. 如申請專利範圍第73項至第100項中任一項之方法，其中該組成物另外包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  102. 如申請專利範圍第101項之方法，其中該醫藥學上可接受之賦形劑包含磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)及甘油。
  103. 如申請專利範圍第73項至第102項中任一項之方法，其中該投予步驟係靜脈內進行。
  104. 如申請專利範圍第73項至第103項中任一項之方法，其另外包含在投予該組成物之後，向該個體投予抗生素。
  105. 如申請專利範圍第104項之方法，其中該抗生素在最後一劑之該組成物之後投予。
  106. 如申請專利範圍第104項或第105項之方法，其中該抗生素為阿莫西林(amoxicillin)或甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲基異噁唑(sulfamethoxazole)。
  107. 如申請專利範圍第20項至第24項中任一項之宿主細胞，其中該核酸分子插入至該宿主細胞內之附加型(episomal)質體上的表現卡匣中。
  108. 如申請專利範圍第36項至第40項中任一項之宿主細胞，其中該核酸分子插入至該宿主細胞內之附加型質體上的表現卡匣中。
  109. 如申請專利範圍第11項或第31項之融合蛋白，其中該信號序列與如SEQ ID NO：20中所闡述之LLO441信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、與如SEQ ID NO：22中所闡述之LLO441 △ PEST信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致、或與如SEQ ID NO：24中所闡述之LLO441 △ 26信號序列至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
  110. 如申請專利範圍第33項之核酸分子，其中該啟動子與如SEQ ID NO：18中所闡述之hly啟動子至少i)90%一致、ii)95%一致或iii)99%一致。
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