RS59615B1

RS59615B1 - Inhibitori ezh2

Info

Publication number: RS59615B1
Application number: RS20191526A
Authority: RS
Inventors: Esteban Dominguez; Deqi Guo; Mary Margaret Mader; Anh-Quan Hannah Nguyen; Prado Miriam Filadelfa Del; Michael Enrico Richett; Michael John Rodriguez; Yvonne Yee Mai Yip; Kuo-Long Yu
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2016-08-22
Publication date: 2020-01-31
Also published as: MD3341379T2; KR20180030704A; US9718838B2; IL257061A; JP2018530527A; CY1122364T1; MX2018002484A; HUE047630T2; TW201718598A; AU2016313541A1; CA2994428A1; HRP20192101T1; ME03650B; TN2018000058A1; PH12018500423A1; US20170066780A1; WO2017035060A1; SI3341379T1; PL3341379T3; ECSP18014798A

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja inhibiraju aktivnost histon lizin metiltransferaze, pojačivača Zeste Homologa 2 (EZH2), na farmaceutske kompozicije koje uključuju jedinjenja i na postupke koji koriste jedinjenja za lečenje kancera, kao što su hematološki i solidni tumori.

[0002] EZH2 je enkodiran EZH2 genom i predstavlja katalitičku komponentu unutar polikomb represivnog kompleksa 2 (PRC2) koji je odgovoran za metilaciju lizina 27 na histonu 3 (H3K27) na hromatinu. Smatra se da prekomerna ekspresija EZH2 podstiče kancer kao rezultat povećanja metilacije histona čime se ometa ekspresija gena supresora tumora. Za katalitičku aktivnost EZH2 je posrednik 130 amino kiselina Su(var)3-9, pojačivač Zeste i trihoraks (SET) domen, koji obezbeđuje džepove vezivanja za S-adenozilmetionin (SAM) kofaktor i ostatak lizin substrata. Jezgro PRC2 kompleksa čine EZH2 i proteini EED (Embryonic Ectoderm Development), SUZ12 (supresor Zeste 12 homologa) i RbAp46/48 (takođe poznat kao RBBP7/4) i takođe može da uključi druge proteine kao što su JARID2, AEBP2 i Polycomblike (PCL) 1/2/3.

[0003] Osim zbog prekomerne ekspresije EZH2, do povećane metilacije H3K27 može takođe da dođe zbog mutacija koje povećavaju katalitičku efikasnost EZH2, kao što su Y641N, A677G i A678V. Pored toga, takođe je zabeleženo da vrednosti metilacije H3K27 mogu da se preinače u solidne tumore preko različitih puteva signalizacije, kao što su putevi koji uključuju VEGFR2 i PI3K/AKT.

[0004] SWI/SNF i PRC2 kompleksi igraju antagonističke uloge u aktivaciji i represiji transkripcije, tim redom. Tumori koji nemaju ili su deficitarni u SWI/SNF proteinu SNF5 (takođe poznat kao SMARCB1/INI1) mogu da pokažu nenormalnu metilaciju i represiju sa PRC2 i inhibiran im je rast nakon tretmana sa EZH2 inhibitorima male molekule. Pored toga, tumorima koji nemaju ili su deficitarni sa SWI/SNF proteinom ARID1A (takođe poznat kao BAF250), kombinovani sa konstitutivno aktivirajućim mutacijama u komponentama PI3K puta kao što je PIK3CA, je takođe inhibiran rast nakon tretmana sa EZH2 inhibitorima male molekule. Pored toga, tumorima koji nemaju ili su deficitarni i u SMARCA2 (takođe poznat kao BRM) i u SMARCA4 (takođe poznat kao BRG1) je takođe inhibiran rast nakon tretmana sa EZH2 inhibitorima male molekule.

[0005] H3K4 metiltransferaza (takođe poznata kao MLL ili COMPASS) kompleksi zajedno sa SWI/SNF kompleksom dovode do antagonizacije represivnih efekata PRC2 (objavili Van der Meulen, J. i saradnici (2014) Epigenetics 9:658-68, Xu, B. i saradnici (2015) Exp.

Hematol. 43:698-712) Tumorima koji nemaju ili su deficitarni u komponentama kompleksa H3K4 metiltransferaze, uključujući ali bez ograničenja na MLL2 (rezultati ovde pokazani za kombinovani tretman sa EZH2 inhibitorom plus vodič za hemoterapiju na ksenograft modelu kancera želuca dobijenog od pacijenta), MLL3 (ovde pokazani rezultati za kombinovani tretman sa EZH2 inhibitorom plus vodič za hemoterapiju na ksenograft modelu kancera pluća dobijenog od pacijenta), lizin-specifičnu demetilazu 6A, takođe poznatu kao ponovljeni sveprisutni transkribovani tetratrikopeptid, X hromozom (UTX, takođe poznat kao KDM6A [Ezponda, T. i saradnici (2014) Blood 124:611]), sam ili u kombinaciji sa SWI/SNF kompleksom bez ili deficitarnim sa prethodno opisanom komponentama, uključujući ali bez ograničenja na ARID1A (ovde pokazani rezultati za kombinovani tretman sa EZH2 inhibitorom plus vodič za hemoterapiju ksenograft modela kancera želuca dobijenog od pacijenta), je inhibiran rast nakon tretmana sa EZH2 inhibitorima male molekule kao pojedinačnog agensa ili u kombinaciji sa agensima vodiča (SOC) za hemoterapiju.

Limfomima koji potiču od germinalnog centra B-ćelija je rast ograničen perturbacijama u EZH2 (Beguelin i saradnici (2013) Cancer Cell 23:677-92; Velichutina, i saradnici (2010) Blood 116:5247-5255) i takođe imaju veliku brzinu mutacija u MLL2, CREBBP, EP300, ARID1A i SMARCA4 (Lunning, M.A. and Green, M.R. (2015) Blood Cancer Journal 5, e361; Carbone, A. i saradnici (2014) Ann. Hematol.93:1263-1277).

[0006] Neki EZH2 inhibitori su već poznati u literaturi. Videti na primer, WO2012/142504, WO2012/142513, WO2013/120104, WO2013/173441, WO2013/075083, WO2014/177982, WO2014/097041 i WO2016/066697.

[0007] Ostaje potreba da se obezbede alternativni EZH2 inhibitori za tretman kancera. U skladu sa tim, ovaj pronalazak obezbeđuje neke inhibitore EZH2 koji mogu da budu korisni za lečenje kancera.

[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa;

Y’ je -NR<4>R<5>, CH(CH3)-cikloheks-4-il-dimetilamino, CH(CH3)-cikloheks-4-il-N-metil-N-metoksietilamino ili -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il grupa gde je azetidin-1-il je opciono supstituisan sa metoksi, 2-propoksi, metoksimetil, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, N-triazolil, N-pirolidinil, morfolinil, tetrahidrofuran-3-iloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom;

R<4>je piperidin-4-il ili cikloheks-4-il grupa supstituisana sa dimetilamino, N-metil-N-metoksietilamino, N-metil-N-ciklopropilamino ili azetidin-1-il grupom gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi, etoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom;

R<5>je metil ili etil grupa; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0009] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa;

Y’ je -NR<4>R<5>, -CH(CH3)-cikloheksil-4-il-N-metil-N-metoksietil ili -CH(CH3)-cikloheks-4-ilazetidin-1-il gde je azetidin-1-il opciono supstituisan sa metoksi, 2-propoksi, metoksimetil, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, pirazolil, metilpirazolil, triazolil, pirolidinil, tetrahidrofuraniloksi ili morfolinil grupom;

R<4>je cikloheks-4-il supstituisan sa N-metil-N-metoksietilamino, N-metil-N-ciklopropilamino ili azetidin-1-il grupom gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi, etoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi ili pirazolil grupom;

R<5>je metil ili etil grupa; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0010] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- grupa;

Y’ je -NR<4>R<5>, CH(CH3)-cikloheks-4-il-dimetilamino, CH(CH3)-cikloheks-4-il-N-metil-N-metoksietilamino, ili -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il grupa gde je azetidin-1-il opciono supstituisan sa metoksi, 2-propoksi, metoksimetil, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, N-triazolil, N-pirolidinil, morfolinil, tetrahidrofuran-3-iloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom;

R<4>je cikloheks-4-il supstituisan sa dimetilamino, N-metil-N-metoksietilamino, N-metil-N-ciklopropilamino ili azetidin-1-il grupom gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi, etoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom;

R<5>je metil ili eti grupa l; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0011] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- grupa;

Y’ je -NR<4>R<5>, CH(CH3)-cikloheks-4-il-N-metil-N-metoksietilamino ili -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il grupa gde je azetidin-1-il opciono supstituisan sa metoksi, 2-propoksi, metoksimetil, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, N-triazolil, N-pirolidinil, morfolinil, tetrahidrofuran-3-iloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom;

R<4>je cikloheks-4-il grupa supstituisana sa N-metil-N-metoksietilamino, N-metil-N-ciklopropilamino ili azetidin-1-il grupom gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi, etoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom;

R<5>je metil ili etil grupa; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0012] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa;

Y’ je -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il grupa gde je azetidin-1-il opciono supstituisan sa metoksi, propoksi, metilmetoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, morfolinil, N-triazolil, N-pirolidinil, tetrahidrofuran-3-iloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom; i

R<6>je metil grupa; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0013] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- grupa;

R<6>je metil grupa; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0014] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2-CH2- grupa;

R<6>je metil grupa; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0015] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

gde je:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa;

Y’ je -NR<4>R<5>grupa;

R<4>je cikloheks-4-il-azetidin-1-il, gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi, etoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom; i

R<5>je metil ili etil grupa; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0016] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- grupa;

Y’ je -NR<4>R<5>grupa;

R<4>je cikloheks-4-il-azetidin-1-il grupa, gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi, etoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom;

R<5>je metil ili etil grupa; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0017] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2-CH2- grupa;

Y’ je -NR<4>R<5>grupa;

R<5>je metil ili etil grupa; i

R<6>je metil grupa; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0018] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa;

Y’ is-CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il grupa, gde je azetidin-1-il opciono supstituisan sa metoksi, propoksi, metilmetoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, morfolinil, N-triazolil, N-pirolidinil, tetrahidrofuran-3-iloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so; pri čemu je atom ugljenika vezan na položaju 26,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona u (R) konfiguraciji.

[0019] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa;

Y’ is-CH[CH3]-cikloheks-4-il-azetidin-1-il grupa, gde je azetidin-1-il opciono supstituisan sa metoksi, propoksi, metilmetoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, morfolinil, N-triazolil, N-pirolidinil, tetrahidrofuran-3-iloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so; pri čemu je atom ugljenika vezan na položaju 26,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona u (R) konfiguraciji a cikloheksan prsten je u trans konfiguraciji.

[0020] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa;

Y’ je -NR<4>R<5>grupa;

R<4>je cikloheks-4-il-azetidin-1-il grupa, gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi, etoksi,

1

metoksietoksi, ciklopropiloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom;

R<5>je metil ili etil grupa; i

R<6>je metil grupa ili hlor; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so; gde je cikloheksan prsten u trans konfiguraciji.

[0021] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa; i

Y je CHCH3, N(CH3) ili N(CH2CH3) grupa; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0022] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa; i

Y je CHCH3, N(CH3) ili N(CH2CH3) grupa; i

R<7>je vodonik, metoksi, etoksi, propoksi, metilmetoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, morfolinil, N-triazolil, N-pirolidinil, tetrahidrofuran-3-iloksi ili N-pirazolil grupa opciono supstituisana sa metil grupom; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0023] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa;

Y je CHCH3, N(CH3) ili N(CH2CH3) grupa; i

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0024] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule:

pri čemu:

X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa; i

Y je CHCH3, N(CH3) ili N(CH2CH3) grupa; ili

njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0025] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0026] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0027] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0028] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

1

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0029] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0030] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0031] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0032] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0033] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0034] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0035] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

1

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0036] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0037] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0038] Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegovu so i jednu ili više farmaceutski prihvatljivih podloga, nosača ili razblaživača.

[0039] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegovu so za upotrebu u terapiji. Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegovu so za upotrebu u tretmanu kancera pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od limfoma, rabdoidnih tumora, tumora koji nemaju ili su deficitarni u jednoj ili više komponenti SWI/SNF kompleksa (na primer, SNF5), MLL kompleksa i konstitutivno aktivnog PI3K puta, sarkoma, multiple mijeloma, melanoma, gastrointestinalnog kancera,

1

kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika i kancera prostate. Preferirano, kancer je difuzni limfom velikih B ćelija ili folikularni limfom. Preferirano, kancer je difuzni limfom velikih B ćelija. Preferirano, kancer je kancer želuca. Preferirano, kancer je kancer jajnika. Preferirano, kancer je multiple mijeloma. Preferirano, kancer je kancer pluća. Preferirano, kancer je kolorektalni kancer. Preferirano, kancer je solidni ili hematološki tumor koji nosi izvorni tip (IT) EZH2 kao i solidni ili hematološki tumor koji nosi mutant EZH2. Preferirano, kancer je solidni ili hematološki tumor koji nosi IT EZH2. Preferirano, kancer je solidni ili hematološki tumor koji nosi mutant EZH2.

[0040] U skladu sa narednim aspektom ovog pronalaska, dato je jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegova so za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa karboplatinom i paklitakselom u tretmanu kancera jajnika.

[0041] U skladu sa narednim aspektom ovog pronalaska, dato je jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegova so za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa oksaliplatinom i paklitakselom u tretmanu kancera želuca.

[0042] U skladu sa narednim aspektom ovog pronalaska, dato je jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegova so za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa gemcitabinom i cisplatinom u tretmanu kancera pluća.

[0043] U skladu sa narednim aspektom ovog pronalaska, dato je jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegova so za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa irinotekanom i oksiplatinom u tretmanu kolorektalnog kancera.

[0044] U narednim paragrafima su opisane preferirane grupe ovog pronalaska:

a) X je -CH2-b) X je -CH2-CH2-;

c) Y’ je -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il gde je azetidin-1-il opciono supstituisan sa metoksi, ciklopropiloksi ili tetrahidrofuran-3-iloksi grupom;

d) Y’ je NR<4>R<5>;

e) R<4>je cikloheks-4-il-azetidin-1-il, pri čemu je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi ili metoksietoksi grupom;

f) R<5>je etil;

g) R<6>je metil;

h) X je -CH2-, Y’ je -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi grupom i R<6>je metil;

1

i) X je -CH2-, Y’ je -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il gde je azetidin-1-il supstituisan sa ciklopropiloksi grupom i R<6>je metil;

j) X je -CH2-, Y’ je -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il gde je azetidin-1-il supstituisan sa tetrahidrofuran- 3-iloksi grupom i R<6>je metil;

k) X je -CH2-, Y’ je NR<4>R<5>, R<4>je cikloheks-4-il-azetidin-1-il, pri čemu je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi grupom, R<5>je etil i R<6>je metil;

l) X je -CH2-CH2-, Y’ je NR<4>R<5>, R<4>je cikloheks-4-il-azetidin-1-il, pri čemu je azetidin-1-il supstituisan sa metoksietoksi grupom, R<5>je etil i R<6>je metil; i

m) X je -CH2-CH2-, Y’ je -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il pri čemu je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi grupom i R<6>je metil.

[0045] Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici će da razume da je naziv "trans-" kako je niže opisano, pri čemu su supstituenti na položajima 1,4 oko cikloheksil radikala trans- u odnosu jedan na drugi:

gde je R izabran između dimetilamino, N-metil-N-metoksietilamino, N-ciklopropil-N-metilamino ili azetidin-1-il grupe, opciono supstituisane sa metoksi, etoksi, propoksi, metilmetoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, morfolinil, N -triazolil, pirolidin-4-il, tetrahidrofuran-3-iloksi ili N-pirazolil grupom opciono supstituisanom sa metil grupom, a X i Y su kako je prethodno definisano.

[0046] Čitaocu sa iskukstvom će da bude jasno da je jedinjenje iz ovog pronalaska sposobno da formira soli. Jedinjenje iz ovog pronalaska je baza i u skladu sa tim reaguje sa bilo kojom od brojnih neorganskih i organskih kiselina da formira farmaceutski prihvatljive soli. Ovakve farmaceutski prihvatljive soli nastale dodatkom kiselina i uobičajena metodologija za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, P. Stahl, i saradnici, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008); S.M. Berge, i saradnici, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No.1, January 1977.

1

[0047] Jedinjenje iz ovog pronalaska ili njegova so mogu da se izrade različitim procedurama poznatim u tehnici od kojih su neke pokazane u niže datim Izradama i Primerima. Opisane specifične faze sinteza mogu da se kombinuju na različite načine da se izrade jedinjenja ili soli iz ovog pronalaska. Produkti faza sinteza mogu da se povrate uobičajenim postupcima dobro poznatim u tehnici, uključujući ekstrakciju, evaporaciju, precipitaciju, hromatografiju, filtraciju, trituraciju i kristalizaciju. Reagense i početne materijale stručnjak sa uobičajenim iskustom može lako da nabavi.

[0048] Neki međuproizvodi ili jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da imaju jedan ili više asimetričnih centara. Ovaj pronalazak sagledava sve pojedinačne enantiomere ili diastereomere kao i smeše enantiomera i diastereomera ovih jedinjenja, uključujući racemate. Poželjno je da jedinjenja iz ovog pronalaska koja sadrže najmanje jedan asimetrični centar egzistiraju kao pojedinačni enantiomeri ili diastereomeri. Pojedinačni enantiomeri ili diastereomeri mogu da se izrade od početka sa asimetričnim reagensima ili stereoselektivnim ili stereospecifičnim tehnikama sinteze. Alternativno, pojedinačni enantiomeri ili diastereomeri mogu da se izoluju iz smeša standardnom asimetričnom hromatografijom ili tehnikama kristalizacije. Stručnjak sa iskustvom će da razume da u nekim okolnostima redosled eluacije enantiomera ili diastereomera može da bude različit zbog različitih hromatografskih kolona i mobilnih faza.

[0049] Izvesni stereohemijski centri su ostavljeni neoznačeni a neki supstituenti su eliminisani u niže datim šemama zbog jasnoće a bez namere da se na bilo koji način ograniči objašnjenje šema. Pored toga, pojedinačne izomere, enantiomere ili diastereomere stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici može da izdvoji ili razdvoji u bilo kojoj odgovarajućoj tački sinteze jedinjenja iz ovog pronalaska postupcima kao što su tehnike selektivne kristalizacije ili asimetrična hromatografija (videti na primer, J. Jacques, i saradnici, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981 i E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Pored toga, međuproizvodi opisani u niže datim šemama sadrže brojne zaštitne grupe za N. Promenljive zaštitne grupe mogu da budu iste ili različite u svakoj situaciji u zavisnosti od određenih uslova reakcije i od određenih transformacija koje se vrše. Uslovi protekcije i deprotekcije su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom i opisani su u literaturi (videti na primer "Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc.2007).

[0050] Neke skraćenice su definisane kako sledi: "AcOH" se odnosi na sirćetnu kiselinu ili

1

glacijalnu sirćetnu kiselinu; "ACN" se odnosi na acetonitril; "AdoMet" se odnosi na S-adenozil-L-metionin; "AEBP" se odnosi na adipocit- pojačivač vezujući protein; "AUC" se odnosi na oblast ispod krive; "BOC" se odnosi na terc-butoksikarbonil; "bid" se odnosi na doziranje dva puta dnevno; "bm" se odnosi na široki multiplet; "Bn" se odnosi na benzil; "BSA" se odnosi na albumin seruma govečeta; "c" se odnosi na koncentraciju u gramima po mililitru; "CAT. #" se odnosi na kataloški broj; "CDI" se odnosi na karbonildiimidazol; "CO2" se odnosi na ugljen dioksid; "CV" se odnosi na zapreminu kolone; "Ci" se odnosi na Kiri; "CPM" se odnosi na broj po milion; "cPr" se odnosi na ciklopropil; "DCE" se odnosi na 1,2-dihloretan; "DCM" se odnosi na metilen hlorid ili dihlormetan; "DIBAL-H" se odnosi na diizobutil aluminijum hidrid; "DIPEA" se odnosi na diizopropiletil amin; "dm" se odnosi na decimetre ili 10 centimetara; "DMA" se odnosi na dimetilacetamid; "DMEA" se odnosi na N,N-dimetiletilamin; "DMF" se odnosi na dimetilformamid ili N,N-dimetilformamid;

"DMSO" se odnosi na dimetil sulfoksid; "DNase" se odnosi na deoksiribonukleazu; "DTT" se odnosi na ditiotreitol; "EED" se odnosi na razvoj ektoderma embriona; "Et2O" se odnosi na dietil etar; "EtOAc" se odnosi na etil acetat; "ES/MS" se odnosi na elektrosprej masenu spektrometriju; "EtOH" se odnosi na etanol ili etil alkohol; "Ex" se odnosi na primer;

"GAPDH" se odnosi na gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu; "hr" se odnosi na sat ili sate; "HEC" se odnosi na hidroksi etil celulozu; "HOAt" se odnosi na hidroksiazabenzotriazol; "HOBt" se odnosi na hidroksibenzotriazol; "HSQC" se odnosi na heteronuklearnu jednokvantnu korelisanu spektroskopiju; "IPAm" se odnosi na izopropilamin, propan-2-amin ili 2-aminopropan; "iPr" se odnosi na izopropil ili 1-metiletil; "IrMeO(COD)2" se odnosi na (1,5-ciklooktadien)(metoksi)iridijum(I) dimer ili bis(1,5-ciklooktadien)di-m-metoksidiiridijum(I); "kPa" se odnosi na kilopaskal ili kilopaskale; "KHMDS" se odnosi na kalijum bis(trimetilsilil)amid; "KOtBu" se odnosi na kalijum-terc-butoksid ili kalijum-t-butoksid; "LAH" se odnosi na litijum aluminijum hidrid; "LiBH4" se odnosi na litijum borohidrid; "LC" se odnosi na tečnu hromatografiju; "LiHMDS" se odnosi na litijum bis(trimetilsilil)amid; "LOF" se odnosi na gubitak funkcije; "<3>H-SAM" se odnosi na adenozil-L-metionin, S[metil-<3>H]; "IC50" se odnosi na koncentraciju agensa koja produkuje 50% maksimalnog inhibitornog odgovora od mogućeg za taj agens; "Me" se odnosi na metil; "MgSO4" se odnosi na magnezijum sulfat; "mpk" se odnosi na miligrame po kilogramu; "min" se odnosi na minut ili minute; "NaH" se odnosi na natrijum hidrid; "NBS" se odnosi na N-bromosukcinimid; "NH3" se odnosi na amonijak; "nm" se odnosi na nanometer ili nanometere; "MeOH" se odnosi na metanol ili metil alkohol; "MsOH" se odnosi na metansulfonsku kiselinu; "MTBE" se odnosi

2

na metil terc-butil etar; "mut" se odnosi na mutant; "OAc" se odnosi na acetat; "PBS" se odnosi na puferovane fosfatne soli; "PCR" se odnosi na lančanu reakciju polimeraze; "PDX" se odnosi na ksenograft koji potiče od pacijenta; "PRC2" se odnosi na polikomb represivni kompleks 2"; "Prep" se odnosi na uzradu; "psi" se odnosi na funte po kvadratnom inču;

"PTSA" se odnosi na para-toluen sulfonsku kiselinu; "kvantitativni prinos" se u osnovi odnosi na prinos veći od 99%; "RBBP4" se odnosi na retinoblastoma vezujući protein 4; "RNase" se odnosi na ribonukleazu; "rpm" se odnosi na obrtaje po minutu; "RT" se odnosi na sobnu temperaturu; "Rt" se odnosi na vreme zadržavanja u minutima; "RuPhos-G3-paladaciklil" se odnosi na (2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-diizopropoksi-1,1’-bi-fenil)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat; "SCX" se odnosi na selektivnu izmenu katjona; "SFC" se odnosi na suzperkritičnu tečnu hromatografiju; "SPA" se odnosi na scintilaciono ispitivanje bliskosti; "NaHCO3" se odnosi na natrijum bikarbonat; " Na2SO4" se odnosi na natrijum sulfat; "SoC" se odnosi na vodič za terapiju; "THF" se odnosi na tetrahidrofuran, "TEA" se odnosi na trietilamin; "Tris" se odnosi na tris(hidroksimetil)-aminometan; "WT" se odnosi na izvorni tip; "XPhos Pd Gen 2" se odnosi na hlor(2-dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil)-[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]-paladijum(II); "Å" se odnosi na angstrem ili angstreme; "λ" se odnosi na talasnu dužinu; i "[α]D<20>" se odnosi na optičku rotaciju jedinjenja koje rotira ravnu polarizovanu svetlost korišćenjem D-linije natrijumove lampe (talasna dužina 589.3 nm) u polarimetru, sa merenjem α uočene polarimetrije u pogodnom rastvaraču kao što je MeOH, mereno na 20 °C, pri definisanoj koncentraciji c, zapremini od 2 mL i dužine puta od 1 dm.

[0051] U niže datim šemama, svi supstituenti, ukoliko nije drugačije navedeno, su kako je prethodno definisano. Stručnjak sa iskustvom u tehnici može lako da nabavi reagense i početne materijale. Niže date šeme, Izrade, Primeri i analize dalje ilustruju pronalazak, ali ih ne treba tumačiti kao ograničenje okvira pronalaska na bilo koji način.

Izrade i Primeri

[0052] Naredne Izrade i Primeri dalje ilustruju pronalazak i predstavljaju karakteristične sinteze jedinjenja iz pronalaska. Reagensi i početni materijali su lako raspoloživi ili stručnjak sa iskustvom u tehnici može lako da ih sintetiše. Treba da bude jasno da su Izrade i Primeri dati samo kao način ilustracije a ne kao ograničenje i da stručnjak sa iskustvom u tehnici može da izvrši različite modifikacije.

[0053] R- ili S- konfiguracija jedinjenja iz pronalaska može da se odredi standardnim tehnikama kao što su analize X-zracima.<1>H NMR, asimetrična HPLC i korelacija sa vremenom zadržavanja u asimetričnoj HPLC mogu da se koriste za dalje razjašnjenje stereoizomerizma ukoliko je poznat jedan centar.

[0054] LC-ES/MS se izvodi na Agilent HP1100 sistemu tečne hromatografije. Merenja elektrosprej masenom spektrometrijom (stečena u pozitivnom i/ili negativnom obliku) se izvode na Mass Selective Detector četvorokanalnom masenom spektrometru povezanim sa HP1100 HPLC. Uslovi LC-MS (nizak pH): kolona: Phenomenex GEMINI® NX C-182.1 3 50 mm 3.0 µm; gradijent: 5-100% B u 3 min, nakon toga 100% B za 0.75 min temperatura kolone: 50 °C /-10 °C; brzina protoka: 1.2 mL/min; rastvarač A: dejonizovana voda sa 0.1% HCOOH; rastvarač B: ACN sa 0.1% mravlje kiseline; talasna dužina 214 nm. Uslovi alternativne LC-MS (visoki pH): kolona: WATERS™ XTERRA® MS C-18 kolone 2.1 x 50 mm, 3.5 µm; gradijent: 5% rastvarača A za 0.25 min, gradijent od 5% do 100% rastvarača B za 3 min i 100% rastvarača B za 0.5 min ili 10% do 100% rastvarača B za 3 min i 100% rastvarača B za 0.75 min; temperatura kolone: 50 °C /- 10 °C; brzina protoka: 1.2 mL/min; rastvarač A: 10 mM NH4HCO3pH 9; rastvarač B: ACN ; talasna dužina: 214 nm.

[0055] Preparativna reverzno fazna hromatografija se izvodi na Agilent 1200 LC-ES/MS opremljenom sa Mass Selective Detector masenim spektrometrom i Leap uređajem za samostalno uzimanje uzoraka/kolektorom frakcija. Postupci pri visokom pH se izvode na koloni 75 X 30 mm Phenomenex GEMINI®-NX, 5 µm veličini čestica sa zaklonom od 10 X 20 mm. Brzina protoka od 85 mL/min. Eluent je 10 mM amonijum bikarbonat (pH 10) u ACN.

[0056] NMR spektar se izvodi na Bruker AVIII HD 400 MHz NMR spektrometru i dobija kao CDCl3ili (CD3)2SO rastvori izraženi u ppm, korišćenjem rezidualnog rastvarača [CDCl3, 7.26 ppm; (CD3)2SO, 2.50 ppm] kao referentnog standarda. Kada su zabeleženi multiplikovani pikovi, mogu da se koriste sledeće skraćenice: s (singlet), d (dablet), t (triplet), q (kvartet), m (multiplet), br-s (široki singlet), dd (dvostruki dablet), dt (dvostruki tripleti). Konstante udvajanja (J), kada su zabeležene, su izražene u hercima (Hz).

Šema 1

PG = zaštitna grupa

[0057] Šema 1 ilustruje fomrmiranje supstituisanog 1,4-dioksaspiro[4,5]dekana (jedinjenje 5) počevši od zaštićenog 4-oksocikloheksankarboksilata (jedinjenje 1). Zaštićeni 4-oksocikloheksankarboksilat može da se tretira sa p-toluensulfonskom kiselinom, trietil ortoformatom i etilen glikolom u rastvaraču kao što je EtOH da se dobije zaštićeni 1,4-dioksaspiro[4,5]dekan-8-karboksilni estar koji može nakon toga da se deprotektuje procedurama dobro poznatim u tehnici, kao što je upotreba vodenog rastvora baze, da se nakon dve faze dobije 1,4-dioksaspiro[4,5]dekan-8-karboksilna kiselina (jedinjenje 2, Šema 1, Faza A). Weinreb amid (jedinjenje 3) može da se izradi od kiselog produkta iz Faze A dodavanjem reagensa za udvajanje kao što su CDI ili HOBt u malim porcijama a nakon toga dodavanjem N-metoksimetanamin hidrohlorida u malim porcijama (Šema 1, Faza B).

Weinreb amid (jedinjenje 3) može da se konvertuje u keton (jedinjenje 4) upotrebom organometalnog reagensa kao što su Grignardov reagens ili organolitijum reagens (Šema 1, Faza C). Konkretno, metil magnezijum bromid može da se doda u odgovarajući rastvarač kao što su E2O i/ili THF da se dobije metil keton (jedinjenje 4). Metil keton (jedinjenje 4) može da se konvertuje u vinil fosfonat (jedinjenje 5) dodavanjem u kapima ne-nukleofilne baze kao što je LiHMDS, u rastvaraču kao što je THF uz dodavanje difenil fosforhloridata (Šema 1, Faza D).

2

Šema 2

Šema 3

R<2>= OCH3, OCH2CH3, O-cPr, O-iPr, OCH2-cPr, CH2OCH3,

O(CH2)2OCH3, N-pirazolil, N-(supstituisani pirazolil),

N-triazolil, tetrahidrofuran-3-il, morfolinil, N-pirolidinil

[0058] Šeme 2 i 3 ilustruju sinteze supstituisanih azetidina. N-zaštićeni viniloksiazetidin (jedinjenje 7a, R<1>= alil) može da se izradi alkilacijom odgovarajuće supstituisanog 3-hidroksiazetidina (jedinjenje 6) sa alkil halidom i ne-nukleofilnom bazom kao što je DIPEA, ili, alternativno, eterifikacijom posredstvom metala sa izvorom paladijuma (II) u prisustvu dibaznog liganda kao što je 1,10-fenantrolin u prisustvu ne-nukleofilne baze kao što su DIPEA ili TEA korišćenjem asimetričnog vinil etra kao rastvarača. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da prepozna da azetidin može da se zaštiti širokim spektrom zaštitnih grupa kao što su alkil grupa, supstituisana alkil, aralkil, amidna grupa ili alkil karbamat. Još preciznije, rastvor N-BOC-3-hidroksiazetidina može da se tretira sa paladijum(II) acetatom u prisustvu TEA i 4,7-difenil-1,10-fenantrolina u n-butil vinil etru da se dobije N-zaaštićeni viniloksiazetidin (jedinjenje 7a, R<1>= alil, Šema 2, Faza A). Vinil grupa može da se konvertuje u zaštićeni 3-ciklopropoksiazetidin (jedinjenje 8) Simmons-Smith reakcijom ili sličnim uslovima za generisanje karbena, na primer, upotrebom hlorjodometana i alkilcink reagensa u DCE, kako je pokazano u Šemi 2, Faza B. Deprotekcija zaštićenog 3-ciklopropoksiazetidina (jedinjenje 8) pod standardnim uslovima kao što je dobro opisano u tehnici, nakon toga tretman slobodne baze sa rastvorom mineralne kiseline u organskom rastvaraču, kao što je HCl u dietil etru ili 1,4-dioksanu, može da obezbedi stabilnu azetidin so (jedinjenje 9a). Još preciznije, kada je zaštitna grupa BOC, stručnjak sa iskustvom u tehnici će da prepozna da tretman zaštićenog 3-ciklopropoksiazetidina (jedinjenje 8) sa kiselinom kao što je HCl u 1,4-dioksanu, a nakon toga uparavanje rastvarača, može da obezbedi sirovi 3-ciklopropoksiazetidin hidrohlorid (jedinjenje 9a, Šema 2, Faza C). Pored toga, ciklopropilmetoksiazetidin (jedinjenje 7b, R<1>= ciklopropilmetil, Šema 2, Faza A) može da se izradi alkilacijom odgovarajuće supstituisanog 3-hidroksiazetidina (jedinjenje 6) sa bromometilciklopropanom pod uslovima jake bazne deprotonacije, na primer, sa NaH u polarnom rastvaraču kao što su DMF ili DMSO, a nakon toga deprotekcijom zaštićenog ciklopropilmetoksiazetidina (jedinjenje 7b, R<1>= ciklopropilmetil) da se dobije sirovi ciklopropilmetoksiazetidin hidrohlorid (jedinjenje 9b, Šema 2, Faza D).

[0059] Drugi supstituisani azetidini mogu da se izrade od komercijalno raspoloživog benzhidrilazetidin mesilata (jedinjenje 10) tretmanom sa velikim brojem N, O, C i S koji sadrže nukleofile pod uslovima nukleofilne supstitucije upotrebom odgovarajuće baze kao što su NaHCO3, K2CO3, DIPEA ili TEA i zagrevanjem mikrotalasima ili tretmanom sa jakom bazom kao što su NaH, KOtBu ili LHMDS i zagrevanjem u polarnom organskom rastvaraču kao što su DMF ili DMSO, da se dobije supstituisani benzhidrilazetidin (jedinjenje 11, Šema 3, Faza A). Daljom deprotekcijom pod uslovima katalitičke hidrogenacije (Šema 3, Faza B) može da se dobije traženi supstituisani azetidin (jedinjenje 12).

2

Šema 4

[0060] Šema 4 opisuje izradu 2-alkoksi-3-hlormetil-4,6-dimetilpiridina (jedinjenje 17, gde je R<a>CH3,CH2CH3ili Bn), koji može da se izradi počevši od komercijalno raspoloživog 3-cijano-4,6-dimetilpiridona (jedinjenje 13). Alkilacijom 3-cijano-4,6-dimetilpiridona (jedinjenje 13) sa odgovarajućim alkil halidom pod standardnim uslovima iz literature poznatim stručnjaku sa iskustvom u tehnici može da se dobije traženi 2-alkoksi-3-cijano-4,6-dimetil-piridin (jedinjenje 14). Preciznije, tretmanom 3-cijano-4,6-dimetilpiridona (jedinjenje 13) sa metil jodidom ili benzil hloridom sa AgCO3ili Ag2O u aprotičnom rastvaraču kao što su 1,4-dioksan, DMF, toluen ili CHCl3a nakon toga zagrevanjem, može da se dobije potrebni 2-metoksi- ili 2-benziloksi-3-cijano-4,6-dimetilpiridin (jedinjenje 14, Šema 4, Faza A).

Daljom redukcijom cijano grupe u 2-alkoksi-3-cijano-4,6-dimetilpiridinu (jedinjenje 14) pod standardnim uslovima dobro poznatim iz literature stručnjacima sa iskustvom u tehnici, kao što je spori tretman sa redukcionim sredstvom kao što je DIBAL-H u aprotičnom rastvaraču kao što je DCM na 0 °C ili RT može da se dobije odgovarajući piridin aldehid (jedinjenje 15, Šema 4, Faza B). Dalja redukcija do karbinola (jedinjenje 16, Šema 4, Faza C) može da se realizuje pod standardnim uslovima dobro poznatim stručnjaku sa iskustvom u tehnici; preciznije, tretiranjem piridin aldehida (jedinjenje 15) u porcijama sa uobičajenim redukcionim sredstvom kao što je NaBH4na 0 °C ili nižoj temperaturi, da se dobije karbinol (jedinjenje 16). Daljom hlorinacijom karbinola (jedinjenje 16) sa uobičajenim sredstvom za hlorinaciju kao što su SOCl2ili POCl3u aprotičnom rastvaraču kao što je DCM, na nižim temperaturama kao što su -40 °C do -60 °C može da se dobije potrebni hlormetilpiridin

2

(jedinjenje 17, Šema 4, Faza D).

Šema 5

[0061] Šema 5 ilustruje sintezu metil 4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)tiofen-3-karboksilata (jedinjenje 20). Kao što je dobro poznato u tehnici, aril bromid (jedinjenje 18) može da se karboniluje upotrebom mnoštva paladijum(II) katalizatora i velikog broja odgovarajućih fosfin liganda, posebno paladijum(II) acetata i 1,1’-bis(difenilfosfino)ferocena, u prisustvu alkohola kao što je MeOH, u polarnom rastvaraču kao što su DMF ili DMA, sa ili bez ne-nukleofilne organske baze kao što su DIPEA ili TEA, u atmosferi pod pritiskom ugljen monoksida, da se dobije estar (jedinjenje 19, Šema 5, Faza A). Dalja esterifikacija borolana može da se izvede ili deprotekcijom sa alkil metalirajućim reagensom kao što su n-butil-, s-butil- ili t-butillitijum sa neutralisanjem aril anjona sa borat estrom ili tranzicijom metala koordinacionih kompleksa upotrebom paladijum(II), iridijum(I) ili gvožđe(III), da se dobije traženi bor estar. Preciznije, estar (jedinjenje 19) može da se tretira sa bis(1,5-ciklooktadien)di-m-metoksidiiridijumom(I) i 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolanom u porcijama u nepolarnom rastvaraču kao što je cikloheksan uz istovremeno zagrevanje da se dobije metil 4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)tiofen-3-karboksilat (jedinjenje 20, Šema 5, Faza B).

Šema 6

2

[0062] 2-etoksipiridin (jedinjenje 27) može da se izradi u skladu sa načinom opisanim u Šemi 6, počevši sa kondenzacijom malononitrila sa acetil ketenom pod baznim uslovima u odgovarajućem polarnom organskom rastvaraču kao što su natrijum hidrid i THF, da se dobije 2-amino-3-cijanopiranon (jedinjenje 21, Šema 6, Faza A). Daljom toplotnom preraspodelom sa neorganskom kiselinom, kao što je HCl, može da se dobije 3-cijano-4-hidroksi-6-metilpiridon (jedinjenje 22, Šema 6, Faza B). Hlorinacija u 4-hlorpiridon (jedinjenje 23) može da se izvede upotrebom brojnih sredstava za hlorinaciju dobro poznatih u tehnici, preciznije smešom POCl3i PCl5(Šema 6, Faza C); alkilacija nastalog piridona (jedinjenje 23) može da se izvede eterifikacijom posredstvom metala sa alkil halidom u odgovarajućem nepolarnom organskom rastvaraču, još preciznije upotrebom srebro(I) oksida i jodetana u toluenu, da se dobije 2-etoksi-3-cijano-4-hlorpiridin (jedinjenje 24, Šema 6, Faza D). Dvofaznom redukcijom upotrebom redukcionih sredstava kao što je DIBAL-H a nakon toga sa NaBH4ili NaCNBH3može da se dobije alkohol (jedinjenje 26, Šema 6, Faze E-F) a nakon toga hlorinacijom sa sredstvom za hlorinaciju kao što su POCl3ili PCl5u odgovarajućem organskom rastvaraču može da se dobije etoksipiridin (jedinjenje 27). Još preciznije, hlorinacija alkohola (jedinjenje 26) može da se izvede in situ izradom mesilata tretmanom sa metansulfonil hloridom u DCM, od 0 °C do RT, da se dobije etoksipiridin (jedinjenje 27, Šema 6, Faza G).

2

Šema 7

[0063] Šema 7 opisuje sintezu jedinjenja Formule I. Udvajanjem izrađenog vinil fosfata (jedinjenje 5, Šema 1, Faza D) sa aril boronat estrom (jedinjenje 20, Šema 5, Faza B) pod standardnim uslovima udvajanja tipa Suzuki korišćenjem paladijum(II) katalizatora i fosfin liganda sa slabom neorganskom bazom kao što je K3PO4u polarnom organskom rastvaraču kao što je 1,4-dioksan može da se dobije vinil tiofen estar (jedinjenje 28, Šema 7, Faza A). Redukcija vinil grupe može da se izvrši procedurama dobro poznatim u tehnici da se dobije α-metil tiofen estar (jedinjenje 29, Šema 7, Faza B). Stereoselektivna redukcija vinil grupe može da se izvrši korišćenjem brojnih katalizatora i liganda dobro poznatih u tehnici, posebno sa kompleksom iridijum(I) katalizator/ligand kao što je [(4R,5R)-(+)-O-[1-benzil-1-(5-metil-2-fenil-4,5-dihidrooksazol-4-il)-2-feniletil] (dicikloheksilfosfit) (1,5-COD) iridijum(I) tetrakis (3,5-bis(trifluorometil)fenilborat da se dobije traženi stereospecifični estar (jedinjenje 29). Dalja brominacija u Šemi 7, Faza C da se dobije 5-bromotiofen estar (jedinjenje 30), može da

2

se izvede upotrebom sredstva za brominaciju kao što su elementarni brom ili NBS u pogodnom organskom rastvaraču kao što su CHCl3, DCM, EtOAc, 1,4-dioksan ili CCl4. Alkilacija u metil 2-[2-(benziloksikarbonilamino)etil]-5-[1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat (jedinjenje 31) pod standardnim uslovima udvajanja posredstvom paladijuma, konkretno korišćenjem RuPhos-G3-paladacikla (Šema 7, Faza D) a nakon toga deprotekcija karbobenziloksi amina (jedinjenje 31) pod uobičajenim uslovima hidrogenolize dobro poznatim u tehnici, posebno, ciklizacija in situ u polarnom organskom alkoholnom rastvaraču kao što je MeOH (Šema 7, Faza E) i oslobađanjem u keton pod standardnim kiselim uslovima, na primer, korišćenjem HCl u pogodnom polarnom rastvaraču kao što su THF ili EtOH, može da se izvede da se dobije 3- metil-2-[1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidro-5H-tieno[3,2-c]piridin-4-on (jedinjenje 33, Šema 7, Faza F). Reduktivna aminacija može da se izvede u prisustvu Luisove kiseline kao što je titanijum izopropoksid i redukcionog sredstva kao što su NaBH4, Na(OAc3)BH ili NaCNBH3u odgovarajućem rastvaraču kao što su DCM ili MeOH, da se dobije smeša trans- i-ciscikloheksana (jedinjenje 34, Šema 7, Faza G), koja može da se razdvoji postupcima kristalizacije ili hromatografije dobro poznatim u tehnici. Dalje, stručnjak sa iskustvom u tehnici može da prepozna da upotreba LiBH4kao redukcionog sredstva može prvenstveno da dovede do trans-stereoizomera. Alkilacijom pod dobro poznatim uslovima sa odgovarajuće supstituisanim aralkil halidom, kao što je benzil halid, a nakon toga ili demetilacijom ili debenzilacijom pod kiselim uslovima, na primer, upotrebom LiCl u prisustvu PTSA uz zagrevanje, može da se dobije jedinjenje Formule I (Šema 7, Faze H and M).

[0064] Alternativno, karbobenziloksi amin (jedinjenje 31, Šema 7, Faza D) može da se podvrgne hidrogenolizi pod uslovima dobro poznatim u tehnici, na primer, sa Pd(OH)2na ugljeniku u pogodnom organskom rastvaraču kao što je MeOH a hidrogenoliza može da se izvrši u prisustvu piridin aldehida (na primer, jedinjenje 15, Šema 4, Faza B), da se dobije metil 5-[1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-il)etil]-4-metil-2-[2-[(6-metil-3-piridil)metilamino]etil]tiofen-3-karboksilat (jedinjenje 35, Šema 7, Faza I). Nakon oslobađanja u keton, reduktivnom aminacijom, ciklizacijom pod kiselim uslovima uz zagrevanje i O-deprotekcijom, kao gore, mogu da se dobiju jedinjenja Formule I (Šema 7, Faze J-M).

[0065] Alternativno, amin kao što je jedinjenje 38, u kome su R<3>=H, R<4>=benzil grupa, može da se podvrgne hidrogenolizi pod uslovima dobro poznatim u tehnici da se dobije amin u kome su R<3>=R<4>=H. Podvrgavanjem ovog amina uslovima reduktivne aminacije i Odeprotekciji kao prethodno, mogu da se dobiju jedinjenja Formule I. Preciznije, upotreba kiseline, formaldehida i triacetoksiborohidrida može da rezultira produktom reduktivne aminacije u kome su R<3>=R<4>=Me.

Šema 8

[0066] Šema 8 opisuje sintezu jedinjenja Formule II. Nitracijom estra (jedinjenje 19, Šema 5, Faza A) a nakon toga nitroredukcijom pod standardnim uslovima može da se dobije metil 5-amino-4-metil-tiofen-3-karboksilat (jedinjenje 40, Šema 8, Faze A-B). Amino zaštita sa pogodnom zaštitnom grupom amina, kao što je BOC a nakon toga alkilacijom pod uobičajenim uslovima, na primer alkilacijom sa metil jodidom u prisustvu slabe baze kao što su K2CO3ili Cs2CO3u polarnom rastvaraču kao što je DMF, može da se dobije odgovarajući N-alkilovani zaštićeni amino tiofen, nakon čega in situ cepanjem karbamata a nakon toga reduktivnom aminacijom, na primer sa cikloheksanom, kao što je 1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-on i Na(OAc3)BH ili NaCHBH3, u pogodnom organskom rastvaraču kao što je DCE, da se dobije potrebni tercijerni amin (jedinjenje 41, Šema 8, Faza C, gde je R<5>= CH3).

Alternativno, 5-amino-4-metil-tiofen-3-karboksilat (jedinjenje 40) možće prvo da se podvrgne uslovima reduktivne aminacije sa cikloheksanonom, kao što je 1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-on, u prisustvu Na(OAc)3BH ili NaCNBH3u pogodnom organskom rastvaraču kao što je

1

DCE, a nakon toga drugom reduktivnom aminacijom in situ sa acetaldehidom, da se dobije potrebni tercijerni amin (jedinjenje 41, Šema 8, Faza C, gde je R<5>= CH2CH3). Nakon toga brominacija, alkilacija posredstvom metala, ciklizacija u biciklični laktam (jedinjenje 44), laktam N-alkilacija, oslobađanje u keton, reduktivna aminacija i finalna demetilacija ili debenzilacija mogu da se izvrše slično postupcima u Šemi 7 da se dobiju finalna jedinjenja Formule II (Šema 8, faze D-J).

[0067] Alternativno, ketal (jedinjenje 45, Šema 8, Faza G) može prvo da se dealkiluje da se dobije piridon keton (jedinjenje 48, Šema 8, Faza K) pod uslovima sličnim kako je opisano u Šemi 7. Nakon toga mogu da se izvrše alkilacija a zatim reduktivna aminacija ili dvostruka reduktivna aminacija (pod uslovima sličnim sa Šemom 8, Faza C) da se dobiju jedinjenja Formule II (Šema 8, Faza L)

Šema 9

[0068] Šema 9 opisuje sintezu jedinjenja Formule III. N-alkilovani metil 2-bromo-5-[R<5>-(1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-il)amino]-4-metil-tiofen-3-karboksilat (jedinjenje 42, Šema 8, Faza D) može da se alkiniluje procedurama udvajanja posredstvom prolaznog metala kako je poznato u tehnici. Još preciznije, bromotiofen (jedinjenje 42) može da se tretira sa benzil prop-2-in-1-il karbamatom u prisustvu CuI, odgovarajućeg kompleksa paladijum(II)-ligand, kao što je bis(trifenilfosfin)paladijum(II) dihlorid i ne-nukleofilne organske baze kao što je

2

TEA, da se dobije alkin (jedinjenje 49, Šema 9, Faza A). Nakon toga, redukcija alkina i deprotekcija amino grupe su dobro poznati u tehnici. Preciznije, tretmanom alkina (jedinjenje 49) pod standardnim uslvoima katalitičke hidrogenacije i in situ hidrogenolizom sa H2u prisustvu Pd na ugljeniku ili Pd(OH)2na ugljeniku u pogodnom organskom rastvaraču, kao što su MeOH, EtOH ili EtOAc pod pritiskom, može da se dobije amin (jedinjenje 50, Šema 9, Faza B), koji nakon toga može da se ciklizuje pod baznim uslovima kao što je KOtBu i zagrevanjem da se dobije laktam (jedinjenje 51, Šema 9, Faza C). Alkilacija azota laktama, oslobađanje u keton, reduktivna aminacija i finalna dealkilacija mogu da se izvedu na sličan način kako je opisano u Šemi 8, da se dobiju jedinjenja Formule III (Šema 9, Faze D-F).

Šema 10

[0069] Šema 10 opisuje sintezu jedinjenja Formule IV počevši od odgovarajuće supstituisanog 5-bromotiofen estra (jedinjenje 30), po postupcima sličnim onima opisanim u Šemi 9 (Šema 10, Faze A-F).

Šema 11

[0070] Izrada jedinjenja Formule V je opisana u Šemi 11. Tretiranjem aminotiofena (jedinjenje 40, Šema 8, Faza B) sa odgovarajuće zaštićenim aminoalkil ketonom pod uslovima reduktivne aminacije dobro poznatim u tehnici a nakon toga alkilacijom, korišćenjem alkilacionog sredstva kao što su CH3I ili CH3CH3l pod baznim uslovima sa odgovarajućom bazom kao što su NaH ili K2CO3ili alkilacijom preko druge reduktivne aminacije sa, na primer, acetaldehidom, (Šema 11, Faza A), može da se dobije N-alkilovani N-piperidinil tiofen estar (jedinjenje 59). Još preciznije, 3,4-dimetiltiofen-2-amin (jedinjenje 40) može da se tretira sa terc-butil-4-oksopiperidin-1-karboksilatom u odgovarajućem organskom rastvaraču kao što je DCE i dodavanjem u porcijama pogodnog redukcionog sredstva kao što je Na(OAc)3BH, nakon toga dodavanjem formaldehida ili acetaldehida da se dobije N-alkilovani N-piperidinil tiofen (jedinjenje 59). Nakon toga se izvrše brominacija, alkilacija aril bromida (jedinjenje 60) pod uslovima udvajanja uz Pd katalizator da se dobije alkiltiofen (jedinjenje 61), ciklizacijom laktama, alkilacijom laktam-N i konačno deprotekcijom na način sličan kako je opisano u Šemi 8 mogu da se dobiju jedinjenja Formule V (Šema 11, Faze B-F).

4

Šema 12

[0071] Šema 12 pokazuje sintezu jedinjenja Formule VI. Dvostrukom alkilacijom aminotiofena (jedinjenje 40) pod uslovima reduktivne aminacije, konkretno koristeći prvo odgovarajuće zaštićeni 4-aminocikloheksanon a nakon toga acetaldehid u prisustvu Na(OAc)3BH, može da se dobije N-alkilovani tienilcikloheksilamin (jedinjenje 64, Šema 12, Faza A). Pored toga, N-metilacija u ovaj N-alkilovani tienilcikloheksil amin (jedinjenje 64) može da se izvrši prvo zaštitom amino tiofena sa odgovarajućom amino zaštitnom grupom, kao što je BOC, a nakon toga tretmanom dobijenog karbamata sa jakom bazom, kao što su NaH ili KOtBu, tretmanom dobijenog anjona sa alkil halidom kao što je CH3I, uklanjanjem zaštitne grupe i konačno reduktivnom aminacijom sa odgovarajuće zaštićenim 4-aminocikloheksanom. Deprotekcija cikloheksilamino grupe kojom se dobija 4-aminocikloheksan (jedinjenje 65) može lako da se izvrši pod brojnim uslovima dobro poznatim stručnjaku sa iskustvom u tehnici (Šema 12, Faza B). Alkilacija (Šema 12, Faza C) ovog 4-aminocikloheksana (jedinjenje 65, Šema 12, Faza C) može da se izvrši korišćenjem in situ-generisanog triflata 2-metoksipropan-1,3-diola (jedinjenje 66), a nakon toga brominacijom, upotrebom ili elementarnog broma ili NBS, da se dobije bromotiofen (jedinjenje 69, Šema 12, Faza E). Alkilacija arilbromida (jedinjenje 69) pod uslovima katalizacije paladijumom, na primer upotrebom supstituisane kalijum trifluoroboratne soli sa katalitičkim RuPhos-G3-Palladaciklusom u smeši toluena i vode u prisustvu neorganske baze kao što je K2CO3i uz zagrevanje, može za rezultat da ima N-alkilovani metil 2-[2-(benziloksikarbonilamino)etil]-5-[[4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat (jedinjenje 70, Šema 12, Faza F). Deprotekcijom pod uslovima dobro opisanim u tehnici, uz istovremenu reduktivnu aminaciju in situ korišćenjem odgovarajuće supstituisanog heteroaril aldehida, na primer, u prisustvu Pd(OH)2na ugljeniku u alkoholnom rastvaraču, kao što je EtOH, pod pritiskom i uz zagrevanje, može da se dobije supstituisani aminometil piridin (jedinjenje 71, R<a>= CH3ili Bn, Šema 12, Faza G). Daljom ciklizacijom i deprotekcijom pod uslovima sličnim kako je opisano u Šemi 8 mogu da se dobiju jedinjenja Formule VI (Šema 12, Faze H-I).

Šema 13

[0072] Šema 13 opisuje alternativnu sintezu jedinjenja Formule II. Oslobođanjem ketala (jedinjenje 42, Šema 8, Faza D) pod kiselim uslovima slično kako je opisano u Šemi 7, Faza J ili Šemi 8, Faza K, može da se dobije odgovarajući keton (jedinjenje 73, Šema 13, Faza A). Dvostruka reduktivna aminacija pod uslovima sličnim kao u Šemi 8, Faza L, može za rezultat da ima cikloheksilamin (jedinjenje 74, Šema 13, Faza B) a nakon toga udvajanjem posredstvom prolaznog metala pod uslovima opisanim u Šemi 7, Faza D, a zatim deprotekcijom amina dobro opisanoj u literaturi, može da se dobije aminocikloheksan (jedinjenje 75, Šema 13, Faza C). Ciklizacijom u 6,7-dihidro-5H-tieno[3,2-c]piridin-4-on (jedinjenje 76) pod sličnim uslovima kako je opisano u Šemi 11, Faza D, a nakon toga alkilacijom pod uslovima sličnim kako je opisano u Šemi 7, Faza H, može da se dobije supstituisani piridin (jedinjenje 77, Šema 13, Faza E) a finalna dealkilacija pod sličnim uslovima kako je opisano u Šemi 7, Faza M, može za rezultat da ima jedinjenje Formule II (Šema 13, Faza F).

Šema 14

[0073] Šema 14 ilustruje alternativni put sinteze u jedinjenje Formule IV. Alkin jedinjenje 54 (Šema 10, Faza A) može istovremeno da bude redukovano i deprotektovano korišćenjem brojnih postupaka dobro poznatih u tehnici, kao što su katalitička hidrogenacija sa paladijum(II) hidroksidom i in situ reduktivna aminacija sa odgovarajuće supstituisanim 2-alkoksipiridinom, kao što je 4,6-dimetil-2-alkoksipiridin, može da se izvede pod uslovima sličnim kako je opisano u Šemi 9, faza B da se dobije ketal jedinjenje 78. Nakon oslobađanja u keton jedinjenje 79, ciklizacijom u laktam jedinjenje 80, reduktivnom aminacijom sa odgovarajuće supstituisanim aminom da se dobije jedinjenje 81 i finalnom dealkilacijom, sve pod sličnim uslovima kako je opisano u Šemi 7 (faze J-M), mogu da se dobiju jedinjenja Formule IV.

[0074] Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da prepozna da odvajanje svih relevantnih trans- i cis-izomera opisanih u Šemama 7-12 može da se izvrši standardnimi postupcima dobro poznatim u tehnici, na primer, ili korišćenjem standardne fleš hromatografije na silika gelu ili odgovarajuće smeše organskih rastvarača (na primer, EtOAc/heksani) ili reverzno fazne hromatografije preko C-18 silika gela korišćenjem odgovarajuće smeše voda/organski rastvarač (na primer, H2O puferovana sa NH4OAc ili NH4HCO3i ACN).

Izrada 1

terc-Butil 3-viniloksiazetidin-1-karboksilat

[0075]

[0076] Terc-butil 3-hidroksiazetidin-1-karboksilat (12.0 g, 69.3 mmol), n-butil vinil etar (125.0 mL, 961 mmol) i TEA (4.1 mL, 29 mmol) se dodaju u bocu i zatvore. Kroz smešu se intenzivno propušta N2u mehurićima u toku 10 min. Dodaju se 4,7-difenil-1,10- fenantrolin (1.0 g, 2.92 mmol) i Pd(OAc)2(0.66 g, 2.91 mmol). Boca se zatvori i smeša meša 7 dana pod pritiskom N2na 80 °C. Smeša se filtrira kroz diatomejsku zemlju i filter ploča ispere sa EtOAc. Filtrat se koncentruje i dobijeni ostatak podvrgne hromatografiji na silika gelu, eluira sa gradijentom 0-20% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (9.95 g, 72% prinos) kao žuto ulje.<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3) δ 1.44 (s, 9H), 3.90 (dd, J = 4.2, 10.1 Hz, 2H), 3.97 (dd, J = 2.5, 14.5 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 2.5, 6.8 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 6.5, 10.1 Hz, 2H), 4.55-4.61 (m, 1H), 6.37 (dd, J = 6.8, 14.5 Hz, 1H).

Izrada 2

terc-Butil 3-(ciklopropoksi)azetidin-1-karboksilat

[0077]

[0078] Rastvor terc-butil 3-viniloksiazetidin-1-karboksilata (9.9 g, 50 mmol) i hlorjodometana (12 mL,159.8 mmol) u DCE (50 mL) se ohladi na -5 °C i nakon toga se u kapima u toku 60 min dodaje 1M rastvor dietilcinka u heptanu (80 mL, 80 mmol) uz održavanje unutrašnje temperature između 0 i -5 °C. Zagreje se na RT i smeša meša 30 min. Smeša se ponovo ohladi u ledenom kupatilu i reakcija neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl. Doda se koncentrovani rastvor NH4OH i nakon toga dobijena smeša ekstrahuje tri puta sa MTBE. Kombinovani ekstrakti se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl, suše preko anhidrovanog K2CO3, filtriraju i koncentruju pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-20% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (4.90 g, 46% prinos) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3) δ 0.45-0.50 (m, 2H), 0.57-0.62 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 3.21-3.26 (m, 1H), 3.85 (dd, J = 4.2, 9.8 Hz, 2H), 4.08 (dd, J = 6.6, 9.8 Hz, 2H), 4.32 (m, 1H). Izrada 3

3-(Ciklopropoksi)azetidin hidrohlorid

[0079]

[0080] Rastvor terc-butil 3-(ciklopropoksi)azetidin-1-karboksilata (4.45 g, 20.9 mmol) u THF (10 mL, 123 mmol) se ohladi u ledenom kupatilu i u kapima doda 4N rastvor HCl u 1,4-dioksanu (20 mL, 80 mmol). Rastvor se meša 3 h na RT i koncentruje pod vakuumom.

Ostatak se rastvori u 2-propanolu, koncentruje i suši pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (3.0 g, 96% prinos) koje može da se koristi bez dodatnog prečišćavanja.<1>H NMR (400.1 MHz, CD3OD) δ 0.48-0.54 (m, 2H), 0.56-0.61 (m, 2H), 3.35-3.40 (m, 1H), 3.98 (dd, J = 4.8, 11.8 Hz, 2H), 4.29 (dd, J = 6.8, 11.8 Hz, 2H), 4.51-4.58 (m, 1H).

Izrada 4

1-Benzhidril-3-[(3S)-tetrahidrofuran-3-il]oksi-azetidin

[0082] Smeša (3S)-tetrahidrofuran-3-ola (10 mL, 122.0 mmol) i 1-benzhidrilazetidin-3-il metansulfonata (3.0 g, 9.3 mmol) se zagreva 20 min na 100 °C u mikrotalasnoj pećnici.

Smeša se ohladi na RT i razblaži sa EtOAc i zasićenim vodenim rastvorom Na2CO3. Slojevi se razdvoje, organski sloj ispere po redu sa vodom i zasićenim vodenim rastvorom NaCl i suši preko Mg2SO4. Filtrira i koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 10-30% EtOAc u heksanima da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.9 g, 30% prinos) kao bezbojno ulje. ES/MS (m/z): 310 (M+H).

[0083] Izrada 5 se dobija u suštini isto kao po postupku za Izradu 4 koristeći (3R)-tetrahidrofuran-3-ol.

Izrada 6

3-[(3S)-Tetrahidrofuran-3-il]oksiazetidin

[0084]

4

[0085] Smeša 1-benzhidril-3-[(3S)-tetrahidrofuran-3-il]oksi-azetidina (0.85 g, 2.7 mmol), MeOH (20 mL), EtOAc (5 mL) i AcOH (1 mL) se 10 min ispira se N2. Doda se 10% Pd na ugljeniku (0.50 g) i dobijena žitka masa meša 18 h u atmosferi H2pod pritiskom od 60 psi. Katalizator se ukloni filtriranjem i filter pogača ispere sa MeOH. Ostatak se koncentruje i suši pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.39 g, 95% prinos) pogodno da se koristi bez naknadnog prečišćavanja.<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3): δ 1.85-2.05 (m, 2H), 2.05 (bs, 1H), 3.58-3.72 (m, 5H), 3.74 (d, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.89 (m 1H), 4.07 (m, 1H), 4.34 (m, 1H).

[0086] Izrada 7 se u suštini dobija isto kao po postupku za Izradu 6 koristeći 1-benzhidril-3-[(3R)-tetrahidrofuran- 3-il]oksi-azetidin.

Izrada 8

1-[1-(Difenilmetil)azetidin-3-il]-3-metil-1H-pirazol i 1-(1-benzhidrilazetidin-3-il)-5-metilpirazol (smeša regioizomera)

[0087]

[0088] U rastvor (1-benzhidrilazetidin-3-il) metansulfonata (7 g, 22.05 mmol) u DMF (15 mL), se u zatvorenoj kiveti dodaju 3-metil-1H-pirazol (2.17 g, 26.47 mmol) i Cs2CO3(8.6 g, 26.47 mmol) i smeša meša 24 h na 120 °C. Ohladi se na RT, smeša sipa u ledenu vodu i ekstrahuje sa 5% rastvorom MeOH u DCM. Slojevi se razdvoje, organska faza suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 7-30% EtOH u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao smeša regioizomera kao žuto ulje (3.5 g, 49% prinos). ES/MS (m/z): 304 (M+H).

[0089] Naredna jedinjenja se izrađuju u suštini isto kao po postupku za Izradu 8.

Izrada 11

1-(Azetidin-3-il)-3-metil-1H-pirazol i 1-(Azetidin-3-il)-5-metil-pirazol (smeša regioizomera)

[0090]

[0091] U Parr autoklav zapremine 300 mL se doda smeša 1-[1-(difenilmetil)azetidin-3-il]-3-metil-1H-pirazola (3.5 g, 11.5 mmol) i 1-(1-benzhidrilazetidin-3-il)-5-metil-pirazola (smeša regioizomera) sa 10% Pd na ugljeniku (3.5 g, 1 g/g) u rastvoru MeOH (75 mL) i EtOAc (25 mL). Posuda se prečisti tri puta sa H2, podvrgne pritisku H2od 50 psi i energično meša 24 h na RT. Filtrira se preko ploče diatomejske zemlje i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao smeša regioizomera kao bezbojno ulje (1.58 g, 93% prinos). ES/MS (m/z): 138 (M+H).

[0092] Naredna jedinjenja se u suštini izrađuju isto kao po postupku za Izradu 11 koristeći odgovarajući 1-(difenilmetil)azetidin.

Izrada 14

terc-Butil 3-(ciklopropilmetoksi)azetidin-1-karboksilat

[0093]

[0094] U rastvor terc-butil 3-hidroksiazetidin-1-karboksilata (3 g, 17.32 mmol) u DMF (10 mL) se na 0 °C doda NaH (60% u ulju, 900 mg, 22.5 mmol). Smeša se meša 1.5 h na RT, nakon toga se polako dodaje bromometilciklopropan (2.80 g, 20.7 mmol) i meša 72 h. Smeša se razblaži sa EtOAc i Et2O, ispere dva puta sa vodom, jedanput sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, slojevi razdvoje, organski ekstrakti suše preko MgSO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz

4

eluiranje sa gradijentom 0-20% EtOAc u heksanima da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (1.91 g, 48% prinos) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3) δ 0.18-0.22 (m, 2H), 0.54-0.58 (m, 2H), 1.00-1.04 (m, 1H), 1.43 (s, 9H), 3.23 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 3.85 (dd, J = 4.3, 10.1 Hz, 2H), 4.06 (dd, J = 6.5, 10.1 Hz, 2H), 4.20-4.26 (m, 1H).

Izrada 15

3-(Ciklopropilmetoksi)azetidin hidrohlorid

[0095]

[0096] 4N rastvor HCl u 1,4-dioksanu (15 mL, 60 mmol) se doda u terc-butil 3-(ciklopropilmetoksi)-azetidin-1-karboksilat (1.91 g, 8.40 mmol) u boci okruglog dna i meša na RT u toku noći. Reaktivna smeša se koncetruje pod vakuumom i dobijeni ostatak suši pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.68 g, kvantitativni prinos), pogodno da se koristi bez naknadnog prečišćavanja.<1>H NMR (400.1 MHz, DMSO-d6) δ 0.14-0.18 (m, 2H), 0.44-0.48 (m, 2H), 0.91-0.99 (m, 1H), 3.21 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 3.72-3.82 (m, 2H), 4.02-4.12 (m, 2H), 4.30-4.37 (m, 1H), 9.17 (bs, 2H).

Izrada 16

2-metoksi-4,6-dimetil-piridin-3-karbonitril

[0097]

[0098] Rastvor NaOCH3u MeOH (30 masenih %, 175 mL, 940 mmol) se u kapima doda u rastvor 2-hlor-4,6- dimetil-piridin-3-karbonitrila (75 g, 441.1 mmol) u MeOH (450 mL) u vodenom kupatilu a nakon toga ponovo u kapima doda NaOCH3u MeOH (25 masenih %, 250 mL, 1090 mmol). Dobijena smeša se meša 1 h, sipa u ledeno hladnu vodu, meša 30 min i dobijena čvrsta supstanca filtrira. Filter pogača se ispere sa heksanom i suši u vakuumskoj pećnici u toku noći. Vodeni filtrat se ekstrahuje sa DCM, organska faza suši preko MgSO4, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Čvrste filtrirane supstance se kombinuju i ostatak upari da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (71.8 g, kvantitativni prinos). ES/MS (m/z): 163 (M+H).

Izrada 17

2-metoksi-4,6-dimetil-piridin-3-karbaldehid

[0099]

[0100] U rastvor 2-metoksi-4,6-dimetil-piridin-3-karbonitrila (48 g, 295.95 mmol) u DCM (480 mL) se na 0 °C u toku 2 h dodaje 1M rastvor DIBAL-H u toluenu (240 mL, 240 mmol). Ledeno kupatilo se ukloni nakon 1 h i smeša meša na RT u toku noći. Ohladi se u vodenom kupatilu na RT i neutrališe sporim dodavanjem smeše 1M vodenog rastvora HCl (192 mL) i AcOH (192 mL). Doda se DCM, slojevi razdvoje, organska faza ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-20% EtOAc/heksan da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (22.6 g, 46% prinos). ES/MS (m/z): 166 (M+H).<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3) δ 2.43 (s, 3H), 2.54 (s, 3H), 4.01 (s, 3H), 6.61 (s, 1H), 10.48 (s, 1H).

Izrada 18

(2-Metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metanol

[0101]

4

[0102] U rastvor 2-metoksi-4,6-dimetil-piridin-3-karbaldehida (22.6 g, 137 mmol) u MeOH (500 mL) se u porcijama na 0 °C doda NaBH4(6.4 g, 170 mmol). Rastvor se zagreje na RT i meša u toku noći. Doda se još NaBH4(1.0 g) i smeša meša 1 h. Boca se ohladi na 0° C, doda se ledeno ladna voda (50 mL) i dobijena smeša koncentruje do ~ 1/2 zapremine pod vakuumom. U dobijeni ostatak se doda zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje, organska faza ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl i organska faza suši preko Na2SO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao ulje (23 g, kvantitativni prinos). ES/MS (m/z): 168 (M+H).

Izrada 19

3-(Hlorometil)-2-metoksi-4,6-dimetil-piridin

[0103]

[0104] Rastvor metansulfonil hlorida (22 mL, 281 mmol) rastvoren u DCM (100 mL) se na 0 °C doda u rastvor (2- metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metanola (39 g, 233.25 mmol) u DCM (500 mL) koji sadrži DIPEA (54 mL). Polako se zagreje na RT i meša približno 48 h.

Reaktivna smeša se koncetruje pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 2-5% EtOAc/heksan, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (30.85 g, 71% prinos).<1>H NMR (399.8 MHz, DMSO-d6): 2.28 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 4.69 (s, 2H), 6.70 (s, 1H).

Izrada 20

2-(Benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-karbonitril

4

[0106] U smešu 2-hidroksi-4,6-dimetil-piridin-3-karbonitrila (100 g, 675 mmol) i srebro oksida (174 g, 747 mmol) u toluenu (1 L) u boci sa tri grla zapremine 2 L opremljenu sa mehaničkom mešalicom se u kapima doda benzil hlorid (100 mL, 859.5 mmol). Smeša se meša 6 h na 110 °C. Smeša se ohladi na ~60 °C, filtrira preko diatomejske zemlje, ispere sa DCM i filtrat koncentruje pod vakuumom. Sirovi produkt se rastvori u DCM i u kapima dodaje MeOH sve dok se ne pojavi čvrsta susptanca. Dobijena čvrsta supstanca se filtrira i sakupi da se dobije naslovljeni produkt kao braon čvrsta supstanca (144.9 g, 90% prinos). ES/MS (m/z): 239 (M+H).

Izrada 21

2-(Benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-karbaldehid

[0107]

[0108] 1M rastvor DIBAL-H u toluenu (200 mL, 200 mmol) se u kapima na 0 °C dodaje u rastvor 2-(benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-karbonitrila (40.3 g, 169 mmol) u DCM (400 mL) u toku 3 h. Reaktivna smeša se zagreje na RT i meša 3 h. Reakcija se veoma polako na RT neutrališe sa 1:1 smešom 1N HCl (160 mL) i sirćetne kiseline (160 mL). Doda se zasićeni vodeni rastvor NaCl (100 mL) i ekstrahuje sa DCM. Slojevi se razdvoje i organski ekstrakti

4

suše preko Na2SO4u toku noći. Filtrat se filtrira i koncentruje pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-5% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (24.47 g, 60% prinos). ES/MS (m/z): 242 (M+H).

Izrada 22

(2-Benziloksi-4,6-dimetil-3-piridil)metanol

[0109]

[0110] 2-(benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-karbaldehid (46.5 g, 193 mmol) se rastvori u MeOH (1 L) u ledenom kupatilu u boci sa tri grla zapremine 2 L opremljenoj sa mehaničkom mešalicom i u malim porcijama se dodaje NaBH4(8.7 g, 230 mmol) u toku 1 h. Smeša se zagreje na RT i meša 3 h. Smeša se ponovo ohladi na 0 °C i neutrališe sa ledeno hladnom vodom (50 mL). Reaktivna smeša se koncetruje pod vakuumom i doda se zasićeni vodeni rastvor NaHCO3. Ekstrahuje se tri puta sa DCM, kombinovani ekstrakti isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl i suše preko Na2SO4. Filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (46.8 g, 99.8% prinos) kao bezbojno ulje. ES/MS (m/z): 244 (M+H).

Izrada 23

2-Benziloksi-3-(hlormetil)-4,6-dimetil-piridin

[0111]

4

[0112] U rastvor (2-benziloksi-4,6-dimetil-3-piridil)metanola (6.0 g, 25 mmol) u DCM (100 mL) se na -60 °C u atmosferi N2polako dodaje SOCl2(4.0 g, 33 mmol) i nakon toga zagreva 30 min na -40 °C. Hladna reaktivna smeša se sipa u smešu led/voda (100 mL). pH smeše se podesi sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3do blago baznog, a nakon toga se vodena smeša po redu ekstrahuje dva puta sa DCM, organski ekstrakti kombinuju i suše preko MgSO4. Filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-30% EtOAc u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje (4.90 g, 76% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3) δ 2.35 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 4.71 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 6.61 (s, 1H), 7.28-7.33 (m, 1H), 7.35-7.40 (m, 2H), 7.47-7.51 (m, 2H).

Izrada 24

2-Amino-6-metil-4-okso-4H-piran-3-karbonitril

[0113]

[0114] Suspenzija NaH (85.4 g, 2.10 mol) u anhidrovanom THF (0.70 L) se ohladi na 0 °C. U izmešanu suspenziju se u kapima doda čist malononitril (238 g, 3.6 mol). Meša 10 min na 0 °C, nakon toga ohladi na -10 °C i u kapima doda rastvor acetil ketena (163 g, 1.91 mol) u THF (0.6 L). Meša 1 h na -10 do 0 °C, nakon toga neutrališe koristeći koncentrovanu HCl i razblaži sa vodom (1.0 L). Meša se 16 h na RT. Čvrsta susptanca se sakupi filtriranjem i suši na vazduhu da se dobije žuta čvrsta supstanca. Rekristališe iz EtOH da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuti prašak (120 g, 42% prinos).<1>H NMR (400.1 MHz, DMSO-d6) δ 2.15 (3H,

4

s) 5.87 (1H, s), 8.50 (2H, s).

Izrada 25

4-Hidroksi-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-karbonitril

[0115]

[0116] Suspenzija 2-amino-6-metil-4-okso-4H-piran-3-karbonitrila (120 g, 0.80 mol) u 10% vodenom rastvoru HCl (1.0 L) se zagreva 12 h na 100 °C uz mešanje. Ohladi na RT i koncentruje pod sniženim pritiskom. U dobijeni ostatak se doda EtOH (0.40 L) i čvrsta susptanca sakupi filtriranjem da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (103 g, 86% prinos).<1>H NMR (400.1 MHz, DMSO-d6,) δ 2.15 (3H, s), 5.87 (1H, s), 11.68 (1H, s), 12.49 (bs).

Izrada 26

4-Hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-karbonitril

[0117]

[0118] 4-hidroksi-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-karbonitril (103 g, 0.69 mol) se suspenduje u CHCl3(1.0 L) i dodaju se fosforil hlorid (210 g, 1.37 mol) i fosfor pentahlorid (286 g, 1.37 mol). Zagreva se 8 h na 70 °C uz mešanje. Ohladi na RT, polako sipa u ledenu vodu uz energično mešanje, smeša neutrališe koristeći vodeni rastvor koncentrovanog NH3i dobijeni precipitat sakupi filtriranjem i nakon sušenja u vakuumskoj pećnici se dobija naslovljeno jedinjenje kao braon čvrsta supstanca (77 g, 65% prinos).<1>H NMR (DMSO-d6, 400.1 MHz, ppm) δ 2.27 (3H, s), 6.50 (1H, s).

Izrada 27

4-Hloro-2-etoksi-6-metilpiridin-3-karbonitril

[0119]

[0120] U smešu 4-hlor-6-metil-2-okso-1H-piridin-3-karbonitrila (4.6 g, 27 mmol) i Ag2O (13 g, 55.8 mmol) u toluenu (250 mL) se doda jodoetan (3.3 mL, 41 mmol) i dobijena smeša meša 4 h pod refluksom. Smeša se ohladi na 60 °C, filtrira kroz diatomejsku zemlju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-100% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (2.5 g, 47% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): (<35>Cl /<37>Cl) 197/199 (M+H).

Izrada 28

4-Hloro-2-etoksi-6-metilpiridin-3-karbaldehid

[0121]

[0122] U rastvor 4-hlor-2-etoksi-6-metilpiridin-3-karbonitrila (2.2 g, 11 mmol) u DCM (100 mL) se u kapima na 0 °C doda 1M DIBAL-H u toluenu (18 mL, 18 mmol). Smeša se postepeno zagreje na RT, meša u toku noći, boca stavi u vodeno kupatilo na RT i reakcija

1

neutrališe dodavanjem u kapima smeše 1M vodenog rastvora HCl (9 mL) i AcOH (9 mL). Dobijena smeša se razblaži sa DCM, dobijeni slojevi razdvoje, organski ekstrakt ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl i organski ekstrakt suši preko anhidrovanog Na2SO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.7 g, 76% prinos) kao narandžasta čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): (<35>Cl/<37>Cl) 200/202 (M+H).

Izrada 29

(4-Hloro-2-etoksi-6-metilpiridin-3-il)metanol

[0123]

[0124] NaBH4(0.230 g, 6.08 mmol) se na 0 °C doda u rastvor 4-hlor-2-etoksi-6-metilpiridin-3-karbaldehida (1 g, 5 mmol) u MeOH (50 mL). Smeša se postepeno zagreje na RT, meša približno 2 h, smeša neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, smeša koncentruje pod vakuumom, dobijeni ostatak razblaži sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i ekstrahuje sa DCM. Slojevi se razdvoje, organski sloj suši preko anhidrovanog Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.03 g, 82% prinos) kao žuto ulje. ES/MS (m/z): (<35>Cl/<37>Cl) 202/204 (M+H).

Izrada 30

4-Hloro-3-(hlormetil)-2-etoksi-6-metilpiridin

[0125]

2

[0126] U rastvor (4-hlor-2-etoksi-6-metilpiridin-3-il)metanola (1.03 g, 4.09 mmol, 80% čistoće) u DCM (40 mL) se na RT doda DIPEA (0.762 mL, 4.33 mmol). Rastvor se ohladi na 0 °C, nakon toga se u kapima doda metansulfonil hlorid (0.335 mL, 4.28 mmol). Rastvor se postepeno zagreje na RT, dobijena smeša meša približno 3 h na RT i smeša koncentruje pod vakuumom. Doda se zasićeni vodeni rastvor NaHCO3i ekstrahuje sa EtOAc. Slojevi se razdvoje, organski ekstrakt suši preko anhidrovanog Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 5-30% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.788 g, 88% prinos) kao žuto ulje.<1>H NMR δ (400.1 MHz, DMSO): 1.31 (t, J= 7.0 Hz, 3H), 2.37 (s, 3H), 4.37 (q, J= 7.0 Hz, 2H), 4.71 (s, 2H), 7.05 (s, 1H).

Izrada 31

1,4-Dioksaspiro[4.5]dekan-8-karboksilna kiselina

[0127]

[0128] U rastvor etil 4-oksocikloheksankarboksilata (900 g, 5.29 mol) u EtOH (4 L) se dodaju trietil ortoformat (2.35 kg, 2.65 L, 15.9 mol), PTSA (2.8 g, 16 mmol) i etilen glikol (1.64 kg, 26.4 mol) i smeša meša 1 h na 50 °C. Ohladi na RT i polako se u toku 20 min dodaje 5M vodeni rastvor NaOH (4.24 L, 21.18 mol); dobijena smeša se meša 2 h. Veći deo EtOH se upari pod sniženim pritiskom, dodaju se voda (5 L) i MTBE (4 L), mešaju, faze razdvoje i organska faza odbaci. Vodena faza se ohladi na 15 °C i zakiseli sporim dodavanjem 5M vodenog rastvora HCl do pH~3.3 (~3.7 L). Doda se DCM (8 L), slojevi razdvoje, organska faza suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao viskozno ulje koje stajanjem polako očvrsne kao bela slabo topljiva čvrsta supstanca (887 g, 90% prinos), pogodna da se koristi u sledećoj fazi bez naknadnog prečišćavanja. (GC-MS) MS (m/z): 99 (M-87).

Izrada 32

N-Metoksi-N-metil-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-karboksamid

[0129]

[0130] U rastvor 1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-karboksilne kiseline (988.6 g, 5.31 mol) u DCM (10 L) se polako u malim porcijama u toku 20 min dodaje CDI (915 g, 5.64 mol) i meša 1 h. U malim porcijama se u toku 15 min dodaje N-metoksimetanamin hidrohlorid (577 g, 5.92 mol) i meša 12 h. Doda se još N-metoksimetanamin hidrohlorida (53 g, 0.55 mol) i meša dodatnih 12 h. Doda se voda (10 L), faze razdvoje, organska faza po redu ispere sa vodom (5 L) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (5 L), suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bezbojno ulje (1.24 kg, kvantitativni prinos) pogodno da se koristi u sledećoj fazi bez dodatnog prečišćavanja.

ES/MS (m/z): 230 (M+H).

Izrada 33

1-(1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etanon

[0131]

[0132] Rastvor N-metoksi-N-metil-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-karboksamida (400 g, 1.74 mol) u THF (3.5 L) se ohladi na 0 °C u atmosferi N2i u toku 30 min se dodaje 3M rastvor

4

MeMgBr u Et2O (697.87 mL, 2.1 mol). Meša se 30 min uz zagrevanje na RT. Reakcija se neutrališe sporim dodavanjem zasićenog vodenog rastvora NH4Cl (1 L) i ekstrahuje sa MTBE (500 mL x 3). Slojevi se razdvoje i organski sloj ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl. Suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje kao svetlo žuto ulje (275 g, 86% prinos), pogodno da se koristi bez daljeg prečišćavanja. (GC-MS) MS (m/z): 184 (M+).

Izrada 34

1-(1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etenildifenil fosfat

[0133]

[0134] Rastvor 1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etanona (150 g, 0.81 mol) u THF (1 L) se ohladi na -70 °C i u kapima u toku 30 min dodaje 1M rastvor LiHMDS u THF (896 mL, 0.89 mol). Smeša se meša 15 min na -60 °C i nakon toga se u kapima na -70 °C doda difenil fosforhloridat (240.6 g, 896 mmol) u THF (450 mL). Reaktivna smeša se meša 14 h uz zagrevanje na RT. Reakcija se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(1 L) i meša 1 h. Ekstrahuje sa MTBE (8 L x 3), slojevi razdvoje, kombinovani organski ekstrakti se suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 2-33 % EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (190 g, 56% prinos). ES/MS (m/z): 417 (M+H).

Izrada 35

Metil 4-metiltiofen-3-karboksilat

[0136] Izmešaju se 3-bromo-4-metiltiofen (200 g, 1.13 mol), MeOH (800 mL), DMA (1200 mL) i TEA (390 mL, 2.8 mol) i prečiste sa azotom u toku 10 min. Dodaju se 1,1’-bis(difenilfosfino) ferocen (50 g, 0.09 mol) i paladijum (II) acetat (20 g, 0.09 mol) i mešaju 30 h u atmosferi CO pod pritiskom od 60 psi na 80 °C. Smeša se ohladi na RT, razblaži sa EtOAc, po redu ispere sa vodom i zasićenim vodenim rastvorom NaCl i organska faza suši preko Na2SO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (360 g) kao žuto ulje, dovoljno za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 157 (M+H).

Alternativna izrada metil 4-metiltiofen-3-karboksilata

[0137] 3-bromo-4-metiltiofen (1.00 kg, 5.65 mol) i TEA (1.43 kg, 14.12 mol) se rastvore u DMA (2.5 L) i MeOH (1.32 L) i doda se 1,1-bis-difenilphophinoferocen (187.9 g, 0.34 mol) a nakon toga Pd(OAc)2(63.4 g, 0.28 mol). Dobijena smeša se meša 16 h na 80 °C u atmosferi CO pod pritiskom od 50 psi. Nakon hlađenja na RT, doda se EtOAc (5 L), po redu ispere sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline (1.6 L x 2), zasićenim vodenmi rastvorom NaHCO3(1.6 L x 2), vodom (1.2 L x 2) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (1 L x 2). Slojevi se razdvoje, organska faza suši preko MgSO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa 5% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (653 g, 74% prinos). ES/MS (m/z): 157 (M+H).

Izrada 36

Metil 4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)tiofen-3-karboksilat

[0139] Metil 4-metiltiofen-3-karboksilat (250 g, 1.60 mol), 4-terc-butil-2-(4-terc-butil-2-piridil)piridin (8.59 g, 32.01 mmol) i [IrMeO(COD)]2(5.37 g, 8.00 mmol) se izmešaju u cikloheksanu (2.5 L). Smeša se degasira pod vakuumom, potpuno prečisti sa N2i nakon toga se u toku 1 h dodaje 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan (409.67 g, 3.20 mol) u malim porcijama. Dobijena smeša se meša 3 h na 70 °C. Smeša se ohladi na RT, koncentruje pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-1% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (300 g, 66% prinos). ES/MS (m/z): 283 (M+H).

Izrada 37

Metil 5-[1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etenil]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0140]

[0141] Smeša 1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etenil difenil fosfata (240 g, 576.37 mmol), metil 4-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)tiofen-3-karboksilata (211.4 g, 749.28 mmol) i 2M vodenog rastvora K3PO4(367 g, 1.73 mol) se izmeša u dioksanu (2.4 L) na RT. Doda se hlor(2-dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) (9.07 g, 11.53 mmol) i meša 3 h na 80 °C. Rastvarač upari pod sniženim pritiskom, ekstrahuje sa EtOAc (750 mL x 2), slojevi razdvoje, po redu isperu kombinovane organske faze sa vodom (150 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa 5% EtOAc u heksanima, da se nakon uklanjanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (375 g, 67% prinos). ES/MS (m/z): 323 (M+H).

Izrada 38

Metil 5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0142]

[0143] [(4R,5R)-(+)-O-[1-benzil-1-(5-metil-2-fenil-4,5-dihidrooksazol-4-il)-2-feniletil] (dicikloheksilfosfit) (1,5-COD) iridijum(I) tetrakis (3,5-bis(trifluorometil) fenilborat (1.61 g, 0.93 mmol) se doda u rastvor metil 5-[1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etenil]-4-metiltiofen-3-karboksilata (60 g, 186 mmol) u DCM (1.9 L) i rastvor eluira 2 h u reaktoru od nerđajućeg čelika zapremine 48 mL u atmosferi vodonika pod pritiskom od 80 para pri 12 mL/min na RT. Rastvor se filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje kao braon ulje (60 g, kvantitativni prinos), pogodno da se koristi u sledećoj fazi bez naknadnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 325 (M+H).

Izrada 39

Metil 4-metil-5-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]tiofen-3-karboksilat

[0144]

[0145] U rastvor metil 5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilata (64.7 g, 178 mmol) u THF (450 mL) se doda 1N rastvor HCl (450 mL, 5.53 mol) i meša 16 sati na RT a nakon toga 2 sata na 45 °C. Reaktivna smeša se koncetruje pod vakuumom, doda se MTBE (500 mL) i faze razdvoje. Organska faza se po redu ispere sa vodom (200 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(100 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (100 mL). Organska faza se suši preko MgSO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje kao braon ulje (53.3 g, 96% prinos) koje može da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 281 (M+H).

Izrada 40a

Metil 5-[(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0146]

[0147] Rastvor 3-metoksiazetidin hidrohlorida (43.4 g, 351 mmol) i DIPEA (65 mL, 373 mmol) u MeOH (500 mL) se meša 45 min na RT. Ova smeša se doda u rastvor metil 4-metil-5-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]tiofen-3-karboksilata (50.0 g, 160 mmol) u THF (250 mL) i meša 40 min na RT. Smeša se ohladi na -70 °C i u pet porcija se dodaje LiBH4(4.9 g, 220 mmol) u toku 25 min. Ostavi se 4 h da se meša uz zagrevanje na -20 °C. Smeša se polako sipa u 1M vodeni rastvor HCl (500 mL) i meša 10 min. Veći deo organskog rastvarača se upari pod vakuumom, dodaju se DCM (500 mL) i 5M vodeni rastvor K2CO3(~ pH 9), slojevi razdvoje i vodena faza ponovo ispere sa DCM (250 mL). Organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, organska faza suši preko MgSO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Doda se EtOAc (50 mL) i ponovo koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa 20% EtOAc u 2% trietilamin/heksani da se nakon uparavanja rastvarača dobije ulje. Dobijeno ulje se rastvori u MTBE (200 mL), ispere sa 1M vodenim rastvorom HCl (200 mL) i u vodenu fazu doda 2M vodeni rastvor K3PO4(~pH 7.5). Vodeni rastvor se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 300 mL), suši preko MgSO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo žuto ulje (15.5 g, 57% prinos). ES/MS (m/z): 352 (M+H).

Izrada 40b

Metil 5-[(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat hidrohlorid

[0148]

[0149] Metil 5-[(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat hidrohlorid množe da se izradi u suštini kako je opisano u Izradi 40a, sa uparavanjem rastvarača sirove reaktivne smeše a nakon toga neutralisanjem sa HCl i hromatografijom na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-100% 2M NH3/MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije ulje, koje delimično kristališe posle sušenja pod vakuumom. Naknadnom rekristalizacijom iz EtOAc i tragova MeOH dobija se kristalni materijal dovoljan za kristalografiju X-zracima. ES/MS (m/z): 352 (M+H).

[0150] Izradi se pojedinačni kristal metil 5-[(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat hidrohlorida rekristalizacijom u EtOAc i MeOH. Montira se na tanko vlakno na -173 °C. Rezultati se dobiju pomoću iµ CuKαizvorom radijacije (λ = 1.54178 Å) i Bruker D8 na bazi 3-kružnog goniometra difraktometru opremljenim sa SMART® 6000CCD detektorom oblasti (dimenzije kristala = 0.150 x 0.080 x 0.020 mm). Izvrši se prečišćavanje ćelije i rezultati redukcije pomoću SAINT programa V8.32b. Indeks jedinice ćelije, sa monokliničkim parametrima od 12.2214(3) Å, b = 7.0314(2) Å, c = 12.8284(3) Å i β = 108.8099(15)° (zapremina ćelije od strukture kristala = 1043.52(5) Å<3>, izračunata gustina strukture = 1.235 g/cm<3>na -173 °C). Struktura se odredi direktnim postupcima pomoću SHELXS programa. Nezavisno se definišu svi atomski anizotropski parameti izuzev za atome vodonika. Stave se na idealne izračunate pozicije.

Potvrdi se izabrana prostorna grupa, to jest P21, uspešnom konvergencijom najmanjih kvadrata sa punim matriksom prečišćavanja na F<2>koristeći SHELXL program, koji ima finalno dobro punjenje od 1.110. Finalni R indeksi (I>2sigma(I)) su R1 = 0.0603, R2 = 0.1242. Prečišćeni parametar apsolutne strukture je do 0.081(12). Odredi se struktura.

Određeno je da je struktura hidrohloridna so a određena apsolutna struktura je da je to R-konfiguracija na stereocentru a trans-ckonfiguracija oko cikloheksan prstena.

Izrada 41

Metil 2-bromo-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-il)etil]-4-metil-tiofen-3-karboksilat

[0151]

[0152] N-bromosukcinimid (6.18 g, 34.7 mmol) se doda u rastvor metil 5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8- yl)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilata (15.56 g, 47.97 mmol) u EtOAc (60 mL) i smeša meša 30 min na 55 °C, a zatim na 40 °C u toku noći. Reaktivna smeša se ispere dva puta sa zasićenim vodenim rastvorom NaHSO3, slojevi razdvoje i kombinovani organski slojevi suše preko MgSO4. Filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-20% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (15.67 g, 81% prinos). ES/MS (m/z) (<79>Br /<81>Br): 403/405 (M+H).

Izrada 42

Metil 2-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat

1

[0154] Metil 2-bromo-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat (15.44 g, 38.28 mmol), toluen (350 mL) i voda (40 mL) se dodaju u bocu sa tri grla zapremine 1 L opremljenu sa mehaničkom mešalicom. Smeša se degasira pod vakuumom 15 min. Dodaju se kalijum benzil N-[2-(trifluoroboranuidil)etil]karbamat (17.3 g, 57.6 mmol), Cs2CO3(37.4 g, 115 mmol) i RuPhos-G3-paladaciklil (2.30 g, 2.69 mmol). Smeša se degasira još 15 min i nakon toga meša u atmosferi N2na 80-85 °C u toku noći. Doda se zasićeni vodeni rastvor NaHCO3i ekstrahuje tri puta sa EtOAc; kombinovani ekstrakti isperu po redu sa vodom i zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko MgSO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-50% EtOAc u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje (14.72 g, 76% prinos) kao ulje. ES/MS (m/z): 502 (M+H).

Izrada 43

2-[(1R)-1-(1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0155]

[0156] Smeša metil 2-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilata (14.72 g, 29.35 mmol) i bezvodnog

2

10% Pd na ugljeniku (3.0 g) u MeOH (80 mL) se meša u atmosferi H2pod pritiskom od 60 psi u toku noći. Reaktivna smeša se filtrira preko diatomejske zemlje, filtrat meša 24 h na RT i koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 20-100% EtOAc u heksanima i nakon toga gradijentom 10% MeOH u EtOAc, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (8.20 g, 83% prinos). ES/MS (m/z): 336 (M+H).

Izrada 44

3-Metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0157]

[0158] Rastvor 2-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (6.18 g, 18.4 mmol) u smeši THF (30 mL) i 1N HCl (30 mL) se meša na RT u toku noći, nakon toga 2 h na 55 °C. Reakcija se neutrališe sa čvrstim Na2CO3i ekstrahuje sa EtOAc. Kombinovani ekstrakti se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl i suše preko MgSO4. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-100 % EtOAc u heksanima, da se nakon uklanjanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (4.69 g, 87% prinos) kao pena. ES/MS (m/z): 292 (M+H).

Izrada 45

Metil 4-metil-5-nitrotiofen-3-karboksilat

[0159]

[0160] Anhidrid sirćetne kiseline (2.5 L) se na temperaturi ispod 25 °C doda u rastvor metil 4-metiltiofen-3-karboksilata (150 g, 0.96 mol) u AcOH (4.5 L). Smeša se ohladi na 10 °C, polako dodaje pušljiva HNO3(220 mL), održavajući temperaturu ispod 15 °C, zagreje na RT i meša 1 h. Reakcija se polako sipa u ledenu vodu i ekstrahuje sa EtOAc (2 x 3 L). Dobijeni slojevi se razdvoje, organska faza po redu ispere sa vodom (4 x 3 L) i zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa 5% EtOAc/heksan, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (91 g, 47% prinos) kao narandžasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400.1 MHz, DMSO-d6) δ 2.77 (s, 3H); 3.83 (s, 3H); 8.61 (s, 1H).

Izrada 46

Metil 5-amino-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0161]

[0162] Gvožđe (166 g, 2.98 mol) se polako dodaje u rastvor metil 4-metil-5-nitrotiofen-3-karboksilata (120 g, 0.55 mol) u AcOH (1200 mL) i EtOH (1200 mL). Smeša se meša 15 min na 80 °C. Reakcija se ohladi, polako sipa u ledenu vodu i doda zasićeni vodeni rastvor NaHCO3do pH 7-7.5. Ekstrahuje sa EtOAc (2 x 3 L), slojevi razdvoje, kombinovani organski slojevi isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat upari pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (98 g, 98% prinos) kao žuto ulje, dovoljno za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 172 (M+H).

Izrada 47

4

Metil 5-[(terc-butoksikarbonil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0163]

[0164] U rastvor metil 5-amino-4-metiltiofen-3-karboksilata (7.79 g, 37.3 mmol) u 1,4-dioksanu (40 mL) se doda terc-butoksikarbonil terc-butil karbonat (16.3 g, 74.6 mmol), zagreva pod refluksom 2 h, nakon toga ohladi na RT i reaktivna smeša koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (8.88 g, 88% prinos) kao gusto žuto ulje. ES/MS (m/z): 272 (M+H).

Izrada 48

Metil 5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0165]

[0166] U rastvor metil 5-[(terc-butoksikarbonil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (2.01 g, 7.41 mmol) u DMF (20 mL) se dodaju Cs2CO3(6.03 g, 18.5 mmol) i CH3I (1.05 g, 7.41 mmol). Smeša se zagreva 10 min na 80 °C i reaktivna smeša ohladi na RT. Razblaži sa DCM (50 mL) i vodom (10 mL), organski sloj izdvoji, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. U dobijeni ostatak se dodaju MeOH (40 mL) i 5M vodeni rastvor HCl (20 mL) i zagrevaju približno 1 h na 50 °C. Smeša se koncentruje pod vakuumom, razblaži sa DCM i dodaje čvrsta NaHCO3sve dok se smeša ne neutrališe do približno pH 7. Organski sloj se izdvoji, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije sirovi metil 4-metil-5-(metilamino)-tiofen-3-karboksilat. ES/MS (m/z): 186 (M+H).

[0167] Sirovi metil 4-metil-5-(metilamino)-tiofen-3-karboksilat se rastvori u DCM (20 mL), doda se 1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-on (1.16 g, 7.40 mmol) uz 30 minuta mešanja, nakon toga se doda natrijum triacetoksiborohidrid (3.13 g, 14.8 mmol) i meša na RT još 30 min. Doda se još 1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-ona (0.289 g, 1.85 mmol), meša 15 min, doda još natrijum triacetoksiborohidrida (0.784 g, 3.70 mmol) i dobijena smeša meša u toku noći na RT. Reakcija se razblaži sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(10 mL) i DCM (40 mL), meša 1 h, organski sloj izdvoji, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (1.21 g, 50% prinos) kao bezbojno ulje. ES/MS (m/z): 326 (M+H).

Izrada 49

Metil 2-bromo-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0168]

[0169] U metil 5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat (1.13 g, 3.47 mmol) u DCM (11 mL) se na RT doda N-bromosukcinimid (0.701 g, 3.82 mmol). Nakon 5 min, reakcija se razblaži sa DCM (40 mL) i ispere sa 0.1M rastvorom NaOH (2 x 10 mL). Organski sloj se izdvoji, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje (1.47 g, kvantitativni prinos) kao braon ulje. ES/MS (m/z): (<79>Br/<81>Br) 404/406 (M+H).

Izrada 50

Metil 2-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0170]

[0171] Toluen (15 mL) i voda (2.5 mL) se dodaju u sirovi metil 2-bromo-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]- 4-metiltiofen-3-karboksilat (1.36 g, 3.20 mmol), kalijum benzil N-[2-(trifluoroboranuidil)etil]karbamat (1.25 g, 4.15 mmol) i Cs2CO3(3.64 g, 11.2 mmol) u boci. Smeša se prečisti sa N2, nakon toga se doda RuPhos (0.0761 g, 0.160 mmol) i druga generacija Ruphos prekatalizatora (0.124 g, 0.160 mmol). Smeša se energično meša i zagreva 18 h na 100 °C. Ohladi na RT i reakcija se razblaži sa EtOAc (40 mL) i vodom (10 mL). Organski sloj se izdvoji, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-30% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.93 g, 58% prinos) kao narandžasto ulje. ES/MS (m/z): 503 (M+H).

Izrada 51

2-[1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0172]

[0173] U metil 2-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat (0.93 g, 1.86 mmol) u MeOH (10 mL) se dodaju 20% Pd(OH)2na ugljeniku (0.500 g, 3.56 mmol) i TEA (0.78 mL, 5.57 mmol). Reaktivna posuda se napuni sa H2(345 kPa) i meša na RT. Nakon približno 1.5 h katalizator se ukloni filtriranjem, a zatim smeša zagreva 5 h na 70 °C. Smeša se ohladi na RT i koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.513 g, 82% prinos) kao žuta pena, dovoljno za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 337 (M+H).

Izrada 52

Metil 5-[{trans-4-[(terc-butoksikarbonil)amino]cikloheksil}(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0174]

[0175] Natrijum triacetoksiborohidrid (441 g, 2.05 mol) se na RT doda u rastvor metil 5-amino-4-metiltiofen-3-karboksilata (98 g, 0.57 mol) u DCE (1000 mL) koji sadrži terc-butil (4-oksocikloheksil)karbamat (156.7 g, 0.75 mol) i AcOH (118 mL). Dobijena smeša se meša 30 min na RT, doda se acetaldehid (63.7 mL, 1.15 mol), meša narednih 45 min i doda se voda a nakon toga zasićeni vodeni rastvor NaHCO3(pH ~9-10). Vodena smeša se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 3 L), kombinovani organski ekstrakti isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa 5% EtOAc u heksanima, da se nakon uklanjanja rastvarača dobije 337 g cis-/trans- smeše. Cis- i trans- izomeri se razdvoje višestrukom sekvencijalnim asimetričnim SFC propuštanjem (CHIRALPAK® AD, 5 µm, 5 x 25 cm; eluent: izokratična smeša 5% MeOH u CO2; temperatura kolone: 50 °C; brzina protoka: 400 g/min) da se nakon uklanjanja rastvarača dobije čisto trans- naslovljeno jedinjenje (183 g, 76% prinos) kao braon čvrsta supstanca. Rt = 3.54 min. ES/MS (m/z): 397 (M+H).

Izrada 53

Metil 5-[(trans-4-aminocikloheksil)(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0176]

[0177] Rastvor metil 5-[[4-(terc-butoksikarbonilamino)cikloheksil]-etil-amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (40 g, 100.9 mmol) u THF (200 mL) se ohladi na 0 °C. U kapima se doda 4M rastvor HCl u dioksanu (250 mL, 1000 mmol) i dobijena smeša meša 16 h na RT. Koncentruje pod vakuumom do ~1/4 zapremine, dodaju se EtOAc (400 mL) i zasićeni vodeni rastvor K2CO3(200 mL) i dobijena smeša meša 1 h na RT. Dobijene faze se razdvoje, vodena faza ispere sa EtOAc (2 x 100 mL), organski slojevi kombinuju i isperu po redu sa vodom (100 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (100 mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (31.7 g, kvantitativni prinos) kao tamno braon ulje. ES/MS (m/z): 297 (M+H).

Izrada 54

2-Metoksipropan-1,3-diol

[0178]

[0179] U hladan rastvor dimetil 2-metoksipropandioata (25 g, 154.19 mmol) u THF (300 mL) se na -15 °C, u kapima doda 2.3M rastvor LAH u 2-metiltetrahidrofuranu (170 mL, 150 g, 385.47 mmol) i meša 2 h na 0 °C, nakon toga 1 h na RT. Ponovo se ohladi na -15 °C i polako neutrališe sa vodom (15 mL), 2N rastvorom KOH (15 mL) i vodom (30 mL) i dobijena smeša meša 30 min na RT. Dobijene bele čvrste supstance se filtriraju, čvrste supstance isperu sa EtOAc (250 mL) a nakon toga sa 40% (v/v) MeOH/EtOAc (500 mL) i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-20% MeOH u EtOAc, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao bezbojno ulje (6.66 g, 40% prinos).<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3) δ 2.50 (bs, 2H), 3.47 (s, 3H), 3.36 (kvintet, J= 4.5 Hz, 1H), 3.69 (dd, J= 4.6, 11.7 Hz, 2H), 3.79 (dd, J= 4.2, 11.7 Hz, 2H).

Izrada 55

Metil 5-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0180]

[0181] Trifluorometansulfonski anhidrid (36.47 mL, 61.16 g, 214.6 mmol) se u kapima na -20 °C dodaje u rastvor 2-metoksipropan-1,3-diola (14.81 g, 139.6 mmol) u ACN (500 mL) u toku 45 min. Nakon toga se u kapima dodaje DIPEA (44.4 mL, 32.9 g, 255 mmol) u toku 35 min i dobijena smeša meša 45 min na -15 °C. Smeša se ohladi na -25 °C i u kapima dodaje DIPEA (44.4 mL, 32.9 g, 255 mmol) u toku 20 min. U kapima se dodaje rastvor metil 5-[(trans-4-aminocikloheksil)(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (31.72 g, 107.0 mmol) u ACN (300 mL) u toku 30 min. Reakcija se zagreje na RT i nakon toga meša još 1 h na 70 °C. Smeša se ohladi na RT, razblaži sa EtOAc (500 mL) i vodom (500 mL), faze razdvoje i vodena faza ekstrahuje sa EtOAc (2 x 250 mL). U kombinovane organske ekstrakte se doda 4M vodeni rastvor K2CO3(250 mL) i meša 2 h na RT. Faze se razdvoje, organski sloj ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (250 mL), a organski sloj suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% MeOH u EtOAc, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (29.2 g, 74% prinos) kao braon čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 367 (M+H).

Izrada 56

Metil 2-bromo-5-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0182]

[0183] Metil 5-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat (29.17 g, 79.59 mmol) i NBS (17.00 g, 95.51 mmol) se izmešaju u DMF (400 mL) i dobijena smeša meša 2 h na RT. Smeša se razblaži sa EtOAc (400 mL) i vodom (250 mL), faze razdvoje i organski sloj po redu ispere sa 4M vodenim rastvorom K2CO3(2 x 200 mL), vodom (200 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (200 mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (32.4 g, 89% prinos) kao braon ulje, pogodno da se koristi u sledećoj fazi bez naknadnog prečišćavanja. ES/MS (m/z) (<79>Br/<81>Br): 445, 447 (M+H).

Izrada 57

Metil 2-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-5-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0184]

1

[0185] U rastvor K2CO3(657.8 g, 414.3 mmol) u vodi (123 mL, 6828 mmol) se u kapima doda kalijum benzil N-[2-(trifluoroboranuidil)etil]karbamat (23.62 g, 82.85 mmol) a nakon toga rastvor metil 2-bromo-5-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino }-4-metiltiofen-3-karboksilata (32.37 g, 69.04 mmol) u toluenu (450 mL). Smeša se blago prečisti sa N2uz zagrevanje na 90 °C u toku 30 min, nakon toga se dodaju 2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-diizopropoksi-1,1’-bifenil (2.46 g, 5.18 mmol) i hlor(2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-diizopropoksi-1,1’-bifenil)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum (II) (4.02 g, 5.18 mmol). Dobijena smeša se meša 4 h na 105 °C, ohladi na RT, razblaži sa EtOAc (300 mL) i vodom (100 mL), faze razdvoje, vodena faza ekstrahuje sa EtOAc (3 x 100 mL) i kombinovani organski slojevi isperu po redu sa 4M vodenim rastvorom K2CO3(2 x 100 mL), vodom (150 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (150 mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrat koncentruje pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-5% MeOH u EtOAc, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (23.1 g, 51% prinos) kao braon ulje. ES/MS (m/z): 544 (M+H).

Izrada 58

Metil 5-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-2-(2-{[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]amino}etil)-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0186]

[0187] Pd(OH)2na ugljeniku, 20% bezvodna baza, ovlažen vodom (5.75 g) se doda u smešu

2

metil 2-(2-{[(benziloksi)ugljenik-il]amino}etil)-5-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-4-metiltiofen-3-karboksilata (23.00 g, 35.11 mmol) i 2-metoksi-4,6-dimetil-piridin-3-karbaldehida (7.03 g, 42.13 mmol) u EtOH (280 mL) i meša 24 h na 50 °C u atmosferi H2(70 psi). Smeša se filtrira kroz diatomejsku zemlju, ispere sa EtOH i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-25% MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (18.4 g, 89% prinos) kao braon ulje. ES/MS (m/z): 559 (M+H).

Izrada 59

2-{Etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0188]

[0189] Smeša metil 5-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-2-(2-{[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]amino}etil)-4-metiltiofen-3-karboksilata (18.35 g, 30.21 mmol) i AcOH (9.07 g, 151.1 mmol) u toluenu (175 mL) se meša 3 h na 110 °C. Smeša se ohladi, razblaži sa EtOAc (250 mL) i vodom (150 mL), faze razdvoje, vodena faza ekstrahuje sa EtOAc (3 x 100 mL), kombinovani organski ekstrakti isperu po redu sa 4M vodenim rastvorom K2CO3(2 x 100 mL), vodom (150 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (150 mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom, da se dobije naslovljeno jedinjenje (16.42 g, 95% prinos) kao braon ulje pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 527 (M+H).

Izrada 60

Metil 5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0190]

[0191] U rastvor metil 5-amino-4-metiltiofen-3-karboksilata (43 g, 251 mmol), 1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-ona (39.23 g, 251 mmol) i AcOH (47 mL) u DCE (430 mL) se polako dodaje natrijum triacetoksiborohidrid (159.6 g, 754 mmol) na temperaturi ispod 25 °C. Smeša se meša 30 min na RT i nakon toga se doda acetaldehid (28 mL, 503 mmol). Smeša se meša 30 min na RT. Sadržaji smeše se sipa u ledenu vodu i zaalkališu dodavanjem zasićenog vodenog rastvora NaHCO3do pH 7.0-7.5. Dobijena smeša se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 3 L), ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa 5% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (55 g, 67% prinos) kao čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 340 (M+H).

Izrada 61

Metil 2-bromo-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0192]

[0193] U bocu okruglog dna tri grla opremljenu sa dodatnim levkom se sipa rastvor metil 5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (91 g, 268.1 mmol) u

4

DCM (1.2 L). Boca se ohladi na 0 °C, nakon toga se u porcijama u toku 1 h dodaje NBS (58.4 g, 322 mmol). Ledeno kupatilo se ukloni i reaktivna smeša meša 2 h na RT. Doda se voda, organski sloj izdvoji i organska faza koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu u četiri serije, svaka eluira sa 10-50% EtOAc u heksanima. Kombinovane frakcije iz prve dve serije se koncentruju da se dobije ulje.

Materijal se suši pod vakuumom u toku noći da se dobije bela čvrsta supstanca (40.9 g).

Frakcije iz serija tri i četiri se koncentruju da se dobije braon ulje. Dobijeni materijal se tretira sa malom količinom heksana sve do pojave čvrste supstance, filtrira i suši pod vakuumom u toku noći da se dobije svetlo braon čvrsta supstanca (37.9 g). Dve dobijene sakupljene serije se kombinuju da se dobije naslovljeno jedinjenje (78.8 g, 70% prinos) kao braon uljasta čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): (<79>Br/<81>Br) 418/420 (M+H).

Izrada 62

Metil 2-bromo-5-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0194]

[0195] U metil 2-bromo-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat (7.81 g, 18.7 mmol) u THF (140 mL) se doda 1M vodeni rastvor HCl (100 mL). Reakcija se meša približno 25 h na RT. Reaktivna smeša se razblaži sa EtOAc (200 mL) i slojevi razdvoje. Organski sloj se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(2 x 25 mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje (6.71 g, 96% prinos) kao crvenkasto braon gusto ulje, dovoljno za upotrebu u sledećoj fazi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): (<79>Br/<81>Br) 374/376 (M+H).

Izrada 63

Metil 2-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0196]

[0197] U smešu metil 2-bromo-5-[1,4- dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (20 g, 48 mmol), kalijum benzil N-[2-(trifluoroboranuidil)etil]karbamata (17.5 g, 58.9 mmol), (2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-diizopropoksi-1,1’-bifenil)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) metansulfonata (4.1 g, 4.8 mmol) i Cs2CO3(47 g, 144 mmol) se u dve odvojene serije dodaju toluen (428 mL) i voda (100 mL). Reaktivna smeša se ispere sa N2, a nakon toga zagreva 4 h na 80 °C. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladnu vodu, doda se EtOAc, slojevi razdvoje, organska faza filtrira preko diatomejske zemlje i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 5-40% EtOAc u heksanima a dobijene željene frakcije koncentruju i suše pod vakuumom 72 h da se dobije naslovljeno jedinjenje (41.9 g kombinovana masa, 85% kombinovani prinos iz dve probe) kao braon ulje. ES/MS (m/z): 517 (M+H).

Izrada 64

2-[1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0198]

[0199] Par boca se očisti sa N2, doda se 20% Pd(OH)2na ugljeniku (40 g, 284.9 mmol), ponovo boca prečisti sa N2i dodaju TEA (150 mL, 1080 mmol), MeOH (500 mL) i rastvor metil 2-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (39.5 g, 76.5 mmol) u MeOH (500 mL). Boca se zatvori, očisti sa N2, očisti sa H2gasom i sistem napuni sa H2(414 kPa). Meša se približno 4 h na RT i reaktivna smeša ostavi da stoji 72 h. Dobijena suspenzija se filtrira, filtrat koncentruje pod vakuumom, dobijeni ostatak rastvori u EtOAc i dodaje malo Et2O dok se ne formira čvrsta supstanca. Dobijena čvrsta supstanca se filtrira i sakupi da se dobije naslovljeno jedinjenje (15.3 g) kao bela čvrsta supstanca. Žuti filtrat se koncentruje i dobijeni ostatak podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 10-60% EtOAc u heksanima, da se dobije dodatna količina naslovljenog jedinjenja (8 g). Filtriran i hromatografisan materijal se kombinuje za narednu upotrebu (23.3 g, 86% prinos). ES/MS (m/z): 351 (M+H).

Izrada 65

terc-Butil 4-{etil[4-(metoksikarbonil)-3-metiltiofen-2-il]amino}piperidin-1-karboksilat

[0200]

[0201] U bocu sa okruglim dnom se dodaju metil 5-amino-4-metiltiofen-3-karboksilat (-50% čistoće, 34 g, 99 mmol), terc-butil-4-oksopiperidin-1-karboksilat (25.7 g, 129 mmol) u DCE (408 mL) i AcOH (17 mL, 297 mmol), meša 10 min na RT, nakon toga ohladi na 0 °C i polako dodaje natrijum triacetoksiborohidrid (54.2 g, 248 mmol) u porcijama. Reaktivna smeša se postepeno zagreva na RT i meša 2 h. Doda se acetaldehid (11.1 mL, 199 mmol) u kapima i nakon toga meša 72 h. Reaktivna smeša se ohladi na 0 °C, neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i razblaži sa DCM. Slojevi se razdvoje, vodeni sloj ekstrahuje sa DCM, organske faze kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (6.4 g, 17% prinos) kao narandžasta čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 383 (M+H).

Izrada 66

terc-Butil 4-{[5-bromo-4-(metoksikarbonil)-3-metiltiofen-2-il](etil)amino}piperidin-1-karboksilat

[0202]

[0203] U bocu sa okruglim dnom se doda terc-butil 4-{etil[4-(metoksikarbonil)-3-metiltiofen-2-il]amino}piperidin-1-karboksilat (6.4 g, 17 mmol) u DCM (84 mL), ohladi na 0 °C, u porcijama doda NBS (3.3 g, 18 mmol) i meša 1 h. Reaktivna smeša se razblaži sa vodom, slojevi razdvoje, vodeni sloj ekstrahuje sa dodatnom količinom DCM, organske faze kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-20% EtOAc u heksanima, da se nakon uklanjanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (6.7 g, 87% prinos) kao narandžasto ulje. ES/MS (m/z): (<79>Br/<81>Br) 405/407 (M+H - t-butil).

Izrada 67

terc-Butil 4-{[5-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-4-(metoksikarbonil)-3-metiltiofen-2-il](etil)amino}piperidin-1-karboksilat

[0204]

[0205] Terc-butil 4-{[5-bromo-4-(metoksikarbonil)-3-metiltiofen-2-il](etil)amino)piperidin-1-karboksilat (0.900 g, 1.95 mmol), kalijum benzil N-[2-(trifluoroboranuidil)etil]karbamat (0.695 g, 2.34 mmol), (2-dicikloheksil-fosfino-2’,6’-diizopropoksi-1,1’-bifenil)[2-(2’-amino-1,1’-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (0.167 g, 0.195 mmol), Cs2CO3(1.91 g, 5.85 mmol), toluen (9.75 mL) i voda (3.55 mL) se u dve odvojene serije sipaju u bocu sa okruglim dnom. Svaka smeša se degasira 15 min sa N2, nakon toga zagreva na 90 °C u toku noći. Svaka reaktivna smeša se ohladi na RT i kombinuje. Neutrališe sa ledenom vodom, razblaži sa EtOAc, slojevi razdvoje, vodeni sloj ekstrahuje sa dodatnom količinom EtOAc, organske faze kombinuju i suše preko Na2SO4. Filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijent 0-30% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (1.29 g, 59% prinos) kao žuto ulje. ES/MS (m/z): 460 (M+H- BOC).

Izrada 68

terc-Butil 4-[etil(3-metil-4-okso-4,5,6,7-tetrahidrotieno[3,2-c]piridin-2-il)amino]piperidin-1-karboksilat

[0206]

[0207] U bocu sa okruglim dnom se doda terc-butil 4-{ [5-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-4-(metoksikarbonil)-3-metiltiofen-2il](etil)amino}piperidin-1-karboksilat (1.29 g, 2.30 mmol) u MeOH (23 mL) i THF (15 mL), degasira sa N2~10 min, dodaju se 10% Pd na ugljeniku (1.29 g) i TEA (0.400 mL, 2.84 mmol), nakon toga ostavi u atmosferi H2i meša približno 72 h na RT. Reaktivna smeša se filtrira kroz diatomejsku zemlju, ispere sa MeOH i filtrat koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prenese u mikrotalasnu posudu, doda TEA (0.300 mL) i zagreva 2 h na 90 °C. Ohladi na RT uz mešanje u toku noći, a reaktivna smeša nakon toga koncentruje pod vakuumom.

Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-30% ACN u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.466 g, 51% prinos) kao žuta pena. ES/MS (m/z): 394 (M+H).

Izrada 69

Metil 2-(3-{[(benziloksi)karbonil]-amino}prop-1-in-1-il)-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metil-tiofen-3-karboksilat

[0208]

[0209] U smešu sirovog metil 2-bromo-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-il)etil]-4-metil-tiofen-3-karboksilata (10.1 g, 25.0 mmol), CuI (1.91 g, 10.0 mmol) i benzil prop-2-in-1-ilkarbamata (11.4 g, 60.3 mmol) u 1,4-dioksanu (130 mL) se doda TEA (52 mL, 369 mmol). Degasira i smeša očisti sa N2, nakon toga se doda bis(trifenilphosfin)paladijum(II) dihlorid (3.6 g, 5.1 mmol). Meša 1 h na 40 °C. Smeša se filtrira preko diatomejske zemlje i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-20% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (10.8 g, 80% prinos) kao svetlo braon ulje. ES/MS (m/z): 512 (M+H).

Izrada 70

Metil 2-(3-aminopropil)-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0210]

[0211] TEA (0.500 mL, 3.55 mmol) se doda u smešu metil 2-(3-{[(benziloksi)karbonil]-amino}prop-1-in-1-il)-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metil-tiofen-3-karboksilata (10 g, 19.55 mmol) u MeOH (150 mL). Smeša se degasira i očisti sa N2, doda se 20% Pd(OH)2na ugljeniku (4.10 g, 5.84 mmol), reaktivna posuda napuni sa H2(414 kPa) i meša u toku noći. Doda se još jedna porcija 20% Pd(OH)2na ugljeniku (500 mg, 0.712 mmol) i TEA (0.500 mL, 3.55 mmol), ponovo degasira sa N2i reaktivna posuda napuni sa H2(414 kPa). Meša se još 6 h, reakcija filtrira preko diatomejske zemlje i filtrat koncentruje pod vakuumom do žutog ulja. Dobijeno ulje se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-30% MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (6.6 g, 89% prinos) kao žuto ulje. ES/MS (m/z): 382 (M+H).

Izrada 71

2-[(1R)-1-(1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0212]

1

[0213] U mikrotalasnu bočicu se sipa rastvor metil 2-(3-aminopropil)-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilata (1.5 g, 3.9 mmol) u toluenu (8 mL), nakon toga se doda KOtBu (940 mg, 7.87 mmol). Smeša se meša na 90 °C u toku noći.

Reakcija se sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje i organski sloj koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-5% MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (1.3 g, 85% prinos) kao svetlo braon čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 350 (M+H).

Izrada 72

2-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0214]

[0215] U rastvor 2-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-ona (1.1 g, 3.1 mmol) u THF (10 mL) se doda mleveni KOH (700 mg, 12.4 mmol). Meša se 30 min, nakon toga se doda 3-(hlormetil)-2-metoksi-4,6-dimetil-piridin (700 mg, 3.77 mmol) rastvoren u THF (1 mL) i dobijena smeša meša 2 h. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje i organski sloj koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se suši pod vakuumom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje (2.2 g, 87% prinos) kao braon ulje, pogodno za sledeću upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 499 (M+H).

Izrada 73

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-

2

oksocikloheksil)etil]-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0216]

[0217] PTSA (1.3 g, 7.2 mmol) se doda u sirovi 2-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (1.0 g, 1.2 mmol) u DMF (10 mL) i dobijena smeša meša 2 h na 70 °C. Smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje i organski sloj koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-5% MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (680 mg, kvantitativni prinos) kao svetlo braon ulje. ES/MS (m/z): 441 (M+H).

Izrada 74

2-[(1R)-1-{Trans-4-[3-(ciklopropoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0218]

[0219] Titanijum(IV) izopropoksid (1.40 g, 4.9 mmol) i 3-(ciklopropiloksi)azetidin hidrohlorid (0.74 g, 4.9 mmol) se dodaju u rastvor 3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.72 g, 2.5 mmol) u DCM (10 mL) koji sadrži DIPEA (0.87 mL, 4.9 mmol), dobijena reaktivna smeša meša 18 h na RT i reaktivna smeša koncentruje pod vakuumom. U preostali ostatak se dodaju THF (4 mL) i MeOH (6 mL) i dobijeni rastvor ohladi na -78 °C. U kapima se doda 2M rastvor LiBH4u THF (1.9 mL, 3.8 mmol) i postepeno zagreje na RT u toku 3 h. Reaktivna smeša se razblaži sa 1:1 smešom DCM/CHCl3(100 mL) i 50% zasićenim rastvorom NaHCO3(50 mL), dobijeni slojevi razdvoje, kombinovani organski ekstrakti se suše preko MgSO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 10-50% smeše 10% MeOH u DCM i DCM da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.40 g, 42% prinos). ES/MS (m/z): 389 (M+H).

[0220] Naredna jedinjenja se izrađuju u suštini isto kao po postupku za Izradu 74 koristeći odgovarajuće supstituisani azetidin.

4

n l

Izrada 81

2-[(1R)-1-{Trans-4-[3-(metoksimetil)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin- 4(5H)-on

[0221]

[0222] Smeša 3-(metoksimetil)azetidin hidrohlorida (368 mg, 2.67 mmol) i DIPEA (400 mg, 3.06 mmol) u MeOH (5 mL) se meša 10 min u atmosferi N2na RT, doda se 3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (400 mg, 1.37 mmol) i smeša meša 4 h. Ohladi na -78 °C, polako dodaje 2M rastvor LiBH4u THF (0.90 mL, 1.8 mmol) i postepeno zagreva na RT u toku noći. Smeša se koncentruje pod vakuumom, dobijeni ostatak razblaži sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, ekstrahuje sa DCM i dobijeni slojevi razdvoje. Organski sloj se suši preko MgSO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-80% smeše (10% 2N rastvor NH3MeOH) u DCM i DCM. Frakcije koje sadrže željeni produkt se kombinuju i koncentruju pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji na C- 18-silika gelu (40 g), uz eluiranje sa 10 mM NH4HCO3, pH 10, u 5% smeši MeOH/voda i ACN koristeći fazni gradijent od 100% 10 mM NH4HCO3u 5% MeOH/voda u toku 5 min, nakon toga 25% ACN/10 mM NH4HCO3u 5% smeši MeOH/voda u toku 5 min, nakon toga linearni gradijent 25%-90% ACN/10 mM NH4HCO3u 5% MeOH/voda. Čiste frakcije se kombinuju i koncentruju pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (114 mg, 22% prinos). ES/MS (m/z): 377 (M+H).

Izrada 82

5-{[2-(Benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(ciklopropiloksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0223]

[0224] 0.7M rastvor KHMDS u toluenu (1.2 mL, 0.84 mmol) se polako dodaje u rastvor 2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(ciklopropoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (230 mg, 0.59 mmol) u THF (10 mL) na RT u toku 30 min i meša dodatnih 30 min. U kapima se doda rastvor 2-benziloksi-3-(hlormetil)-4,6-dimetilpiridina (200 mg, 0.76 mmol) u THF (5 mL) i meša 18 h na RT. Reaktivna smeša se zagreje na 55 °C, meša 1 h, ohladi na RT, sipa u ledeno hladan vodeni rastvor NaHCO3i ekstrahuje sa EtOAc. Slojevi se razdvoje, organski ekstrakt ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši preko MgSO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 10-50% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (210 mg, 57% prinos). ES/MS (m/z): 614 (M+H).

[0225] Naredna jedinjenja se izrađuju u suštini isto kao po postupku za Izradu 82 i odgovarajuće supstituisanog 6,7-dihidro-5H-tieno[3,2-c]piridin-4-ona.

Izrada 90

Metil 5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-2-(2-{[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]amino}etil)-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0226]

[0227] Metil 2-(2-{[(benziloksi)karbonil]amino}etil)-5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-4-metiltiofen-3-karboksilat (77 g, 153.5 mmol) i 2-metoksi-4,6-dimetil-piridin-3-karbaldehid (23.3 g, 140 mmol) se rastvore u EtOH (500 mL) u Par reaktoru i doda Pd(OH)2na ugljeniku, 20% bezvodna baza, ovlažena vodom (11.5 g). Posuda se napuni sa H2(100 psi) i meša 3.5 h na 50 °C. Nakon hlađenja na RT, smeša se filtrira kroz diatomejsku zemlju i ispere sa EtOH. Filtrat se koncentruje pod vakuumom, u ostatak doda toluen (800 mL) i nastavi parcijalna destilacija isparljivih komponenti do konačne težine od približno 400 g, da se dobije naslovljeno jedinjenje kao rastvor u toluenu, pogodno da se koristi u sledećoj fazi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS uparenog uzorka (m/z): 517 (M+H).

Izrada 91

Metil 2-(2-{[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]amino}etil)-4-metil-5-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]tiofen-3-karboksilat

[0228]

[0229] U sirovi rastvor metil 5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il)etil]-2-(2-{[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]amino}etil)-4-metiltiofen-3-karboksilata, iz Izrade 90, u toluenu (približno 76 g) doda se 1M vodeni rastvor HCl (800 mL) i meša 1 h na RT. Slojevi se razdvoje, organski sloj po redu ispere sa 2M vodenim rastvorom HCl (2 x 50 mL) i kombinovani kiseli vodeni slojevi isperu sa toluenom (100 mL). U vodeni sloj se dodaju toluen (0.4 L) i 6M vodeni rastvor K2CO3do pH 9, meša 5 min, faze razdvoje, organski sloj ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, a nakon toga propusti kroz kratku ploču Na2SO4. Zatim se Na2SO4ploča ispere sa toluenom da se dobije rstvor sirovog naslovljenog jedinjenja u toluenu (približna zapremina 1 L), pogodnog da se koristi u sledećoj fazi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS uparenog uzorka (m/z): 473 (M+H).

Izrada 92

5-[(2-Metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0230]

[0231] AcOH (9 mL, 157.1 mmol) se doda u sirovi rastvor metil 2-(2-{ [(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]amino}etil)-4-metil-5-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]tiofen-3-karboksilata (1 L, približno 79 g, iz Izrade 91) i meša 2 h na 90 °C. Smeša se ispere dva puta sa 2M vodenim rastvorom HCl (ukupno 0.15 L) i po redu svaki put jedanput ispere sa vodom, 1M vodenim rastvorom K3PO4i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (svaki 0.1 L). Organski sloj se suši preko MgSO4, filtrira i filtrat upari pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao narandžasto viskozno ulje (40.98 g, 48.5% prinos). ES/MS (m/z): 441 (M+H).

Izrada 93

5-[(2-Metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-2-{(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0232]

[0233] DIPEA (29 mL, 21.5 g, 166 mmol) se doda u rastvor 3-metoksiazetidin hidrohlorida (18.7 g, 151 mmol) u MeOH (280 mL) i meša 30 minuta na RT. Ova smeša se doda u 5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (27.55 g, 56.28 mmol), meša 1.5 sat na RT u atmosferi N2i nakon toga se doda THF (50 mL). Reakcija se ohladi na -70 °C i dodaje 2M rastvor LiBH4u THF (40 mL, 80 mmol) u toku 30 minuta. Reakcija se meša 2 h na istoj temperaturi. Reakcija se neutrališe sporim sipanjem reakcije u 1M vodeni rastvor HCl (približno 1 L) u toku 10 minuta. Ispere se sa MTBE (2 x0.25 L), nakon toga vodena faza tretira sa 2M vodenim rastvorom K3PO4do pH 9 i ekstrahuje sa EtOAc (približno 0.5 L). Organska faza se po redu ispere sa 3M vodenim rastvorom K2CO3i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (svaki približno100 mL), suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 10-25% 20% rastvor 7N NH3/MeOH u EtOAc da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (19.5 g, 68% prinos). ES/MS (m/z): 512 (M+H).

Izrada 94

5-[2-Metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil-3-metil-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(3-metil-1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on i

5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-[trans-4-[3-(5-metilpirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil]etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on (smeša regioizomera)

[0235] Rastvor smeše 1-(azetidin-3-il)-3-metil-1H-pirazola i 1-(azetidin-3-il)-5-metil-pirazola (0.53 g, 3.59 mmol, smeša regioizomera), DIPEA (1.37 mL, 7.79 mmol) i 4N rastvor HCl u dioksanu (1.8 mL, 7.190 mmol) se izmešaju u MeOH (5 mL) u toku 30 min na RT. Ovo se doda u rastvor 5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (600 mg, 1.2 mmol) u MeOH (19 mL) i meša 2 h na RT. Smeša se ohladi na -78 °C i doda 2M rastvor LiBH4u THF (0.78 mL, 1.56 mmol); postepeno zagreje na RT i reaktivna smeša meša u toku noći. Reaktivna smeša se koncetruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji preko SCX (25 g kertridž), uz eluiranje sa MeOH (2 x 100 mL) a nakon toga sa 2N rastvorom NH3u MeOH. Frakcija MeOH se koncentruje u NH3pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao smeša regioizomera kao bledo žuto ulje (0.51 g, 65% prinos). ES/MS (m/z): 562 (M+H).

[0236] Naredna jedinjenja se izrađuju u suštini isto kao po postupku za Izradu 94 koristeći 5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on i odgovarajuće supstituisani azetidin.

1

Izrada 99

5-[(2-Metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-2-[(1R)-1-{4-[3-(2-metoksietoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (smeša diastereomera)

[0237]

2

[0238] DIPEA (0.45 mL, 2.49 mmol) se doda u rastvor 3-(2-metoksietoksi)azetidin hidrohlorida (0.42 g, 2.38mmol) u MeOH (5.6 mL) i meša 30 min na RT. Doda se 5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.62 g, 1.12 mmol) i meša na RT u toku noći. Smeša se ohladi na -78 °C, doda 2M rastvor LiBH4u THF (0.74 mL, 1.47 mmol), zagreje na RT i meša u toku noći. Doda se zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa EtOAc i slojevi razdvoje. Organska faza se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao ulje (0.5 g, 98% prinos). ES/MS (m/z): 556 (M+H).

Izrada 100

2-{(1R)-1-[Trans-4-(benzilamino)cikloheksil]etil}-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0239]

[0240] Rastvor benzil amina (0.257 g, 2.397 mmol), DIPEA (0.95 mL, 5.39 mmol) i 4N rastvor HCl u dioksanu (600 µL, 2.397 mmol) se mešaju u MeOH (5 mL) u toku 30 min na RT. Ova smša se doda rastvor 5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.6 g, 1.2 mmol) u MeOH (19 mL) i dobijena smeša meša 18 h na RT. Smeša se ohladi na -70 °C i doda 2M rastvor LiBH4u THF (0.78 mL, 1.558 mmol). Ostavi se da se postepeno zagreje na sobnu temperaturu. Doda se ledeno hladan zasićeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa EtOAc (100 mL), slojevi razdvoje, organski ekstrakt ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl i organski ekstrakti suše preko Na2SO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (0.75 g, 99% prinos) pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 532 (M+H).

Izrada 101

2-[(1R)-1-(Trans-4-aminocikloheksil)etil]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0241]

[0242] Rastvor 2-{(1R)-1-[trans-4-(benzilamino)cikloheksil]etil}-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (750 mg, 1.19 mmol) se meša u MeOH (20 mL). Doda se 10% Pd-C (500 mg, 0.474 mmol) i meša u atmosferi H2pod pritiskom od 30 psi na RT u toku noći. Filtrira se preko diatomejske zemlje i ispere sa MeOH. Filtrat se upari da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (0.5 g, 80% prinos), pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 442 (M+H).

Izrada 102

2-{(1R)-1-[Trans-4-(dimetilamino)cikloheksil]etil}-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

4

[0244] Rastvor 2-[(1R)-1-(trans-4-aminocikloheksil)etil]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.5 g, 0.95 mmol) se meša u MeOH (10 mL). Dodaju se AcOH (172 mg, 2.85 mmol) i 37% razblaženi formaldehid (232 mg, 2.853 mmol). Rastvor se ohladi u ledenom kupatilu i doda triacetoksiborohidrid

(605 mg, 2.853 mmol). Ostavi se da se postepeno zagreje na RT i meša u toku noći. Doda se ledeno hladan zasićeni rastvor NaHCO3i ekstrahuje sa DCM (2 x 100 mL). Slojevi se razdvoje, organske faze kombinuju i kombinovani organski ekstrakti isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl. Suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (390 mg, 70% prinos), pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 470 (M+H).

Izrada 103

5-{[2-(Benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0245]

[0246] U 2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.51 g, 1.53 mmol) u THF (5 mL) se na 0 °C doda 1M rastvor KHMDS u THF (2.14 mL, 2.14 mmol). Zagreje se na RT i posle 15 min doda se 2-benziloksi-3-(hlormetil)-4,6-dimetil-piridin (0.60 g, 2.29 mmol). Meša se približno 17 h na RT, nakon toga neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (1 mL). Smeša se razblaži sa EtOAc (40 mL) i vodom (5 mL), organski sloj izdvoji, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.94 g, 92% prinos) kao žuto ulje, pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 562 (M+H).

Izrada 104

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[metil(4-oksocikloheksil)amino]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0247]

[0248] U sirovi 5-{[2-(benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.94 g, 1.4 mmol) u THF (14 mL), doda se 1M vodeni rastvor HCl (14 mL, 14 mmol), smeša zagreva 8 h na 50 °C i meša 2 dana na RT. Dodaju se čvrsti NaHCO3(1.8 g, 21 mmol) i EtOAc (125 mL), organski sloj izdvoji i suši preko Na2SO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% 7N metanolnim NH3u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.408 g, 62% prinos) kao žuta pena. ES/MS (m/z): 428 (M+H).

Izrada 105

2-[1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0249]

[0250] 0.91M rastvor kalijum bis(trimetilsilil)amida u THF (22 mL, 20 mmol) se u dve odvojene serije polako dodaje u rastvor 2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (6 g, 17.12 mmol) u THF (70 mL) na RT u toku 30 min. Dobijene smeše se mešaju još 30 min na RT, nakon toga se u kapima doda 3-(hlormetil)-2-metoksi-4,6-dimetil-piridin (3.4 g, 18 mmol) u THF (10 mL). Dobijene smeše se mešaju na RT u toku noći. Obe smeše se kombinuju, sipaju u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3i ekstrahuju sa EtOAc. Faze se razdvoje, organski ekstrakti suše preko MgSO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (ukupno 18.55 g, kvantitativni prinos) kao žuta guma, pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 500 (M+H).

Izrada 106

2-[Etil(4-oksocikloheksil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0251]

[0252] 6M vodeni rastvor HCl (20 mL, 120 mmol) se doda u rastvor sirovog 2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (18.05 g, 36.12 mmol) u THF (20 mL). Dobijena smeša se zagreva 2 h na 50 °C i meša na RT u toku noći. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje i organski sloj koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 10-50% EtOAc u heksanima da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (4.01 g, 24% prinos) kao svetlo žuto ulje. ES/MS (m/z): 456 (M+H).

Izrada 107

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0253]

[0254] U epruvetu sa zatvarače se doda rastvor 2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (6.3 g, 14 mmol) u DMF (50 mL) epruveta se zatvori, ohladi na 0 °C i doda LiCl (3 g, 70 mmol) a nakon toga PTSA (13 g, 72 mmol). Dobijena smeša se zagreva 2 h na 70 °C. Ohladi na RT i polako sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3(400 mL). Precipitirana čvrsta supstanca se filtrira i ispere sa vodom. Čvrsta supstanca se prenese u bocu sa okruglim dnom, razblaži sa MeOH i koncentruje pod vakuumom. Čvrsta supstanca se ponovo azeotropira sa MeOH i THF pod vakuumom, nakon toga ostatak suši u vakuumskoj pećnici u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (6.1 g, 100% prinos) kao braon čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 442 (M+H).

Izrada 108

2-{[Trans-4-(benzilamino)cikloheksil](etil)amino}-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0255]

[0256] U bocu sa okruglim dnom se fenilmetanamin (0.445 mL, 4.076 mmol) i 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.600 g, 1.359 mmol) dodaju u THF (25 mL) i MeOH (5 mL) i mešaju na RT u toku noći. Reaktivna smeša se ohladi na -78 °C i u kapima doda 2M rastvor LiBH4u THF (1.698 mL, 3.397 mmol). Reakcija se stavi u ledeno kupatilo i ostavi 3 h uz mešanje da se zagreje na RT. Reaktivna smeša se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i razblaži sa DCM. Organski sloj se izdvoji i dodati vodeni sloj ekstrahuje sa DCM. Organske faze se kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% MeOH u DCM i dobijena smeša trans- i cis- izomera koncentruje pod vakuumom. Dobijena smeša se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji, uz eluiranje sa gradijentom 10-75% ACN u 10 mM vodenom rastvoru NH4CO3/voda, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.132 g, 18% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 533 (M+H).

Izrada 109

2-[(Trans-4-aminocikloheksil)(etil)amino]-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0257]

[0258] U bocu sa okruglim dnom se dodaju 2-{[trans-4-(benzilamino)cikloheksil](etil)amino5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.095 g, 0.178 mmol), 10% Pd na ugljeniku (0.095 g) i NH4HCO2(0.057 g, 0.892 mmol) u vlažnom 90% EtOH (0.89 mL). Degasira 10 min sa N2, reaktivna posuda zatvori i zagreva na 90 °C u toku noći. Reaktivna smeša se ohladi na RT, filtrira kroz diatomejsku zemlju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 7-100% 87.5:11:1.5 rastvor DCM:MeOH:NH4OH/ DCM da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.045 g, 57% prinos) kao beli prašak. ES/MS (m/z): 443 (M+H).

Izrada 110

terc-Butil 4-(etil{5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-4-okso-4,5,6,7-tetrahidrotieno[3,2-c]piridin-2-il}amino)piperidin-1-karboksilat

[0259]

[0260] U bocu sa okruglim dnom se dodaju terc-butil 4-[etil(3-metil-4-okso-4,5,6,7-tetrahidrotieno[3,2-c]piridin-2-il)amino]piperidin-1-karboksilat (0.770 g, 1.957 mmol) i 3-(hlormetil)-2-metoksi-4,6-dimetil-piridin (0.436 g, 2.348 mmol) u THF (20 mL) koji sadrži rastvor KHMDS u THF (0.91M, 2.6 mL, 2.348 mmol). Reaktivna smeša se meša 4 h na RT, neutrališe sa ledeno hladnim zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, razblaži sa EtOAc, slojevi razdvoje i vodeni sloj ekstrahuje sa dodatnom količinom EtOAc. Organske faze se kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.17 g, 99% prinos) kao žuto ulje, dovoljno za upotrebu bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 543 (M+H).

Izrada 111

1

2-(Etil{4-[(2-metoksietil)(metil)amino]cikloheksil}amino)-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (smeša cis- i trans- diastereomera)

[0261]

[0262] 2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.57 g, 1.25 mmol) se doda u rastvor 2-metoksietanamina (0.19 g, 2.64 mmol) u MeOH (10 mL) i smeša meša 4 h. Ohladi na -78 °C i doda se 2M rastvor LiBH4u THF (0.82 mL, 1.63 mmol). Temperatura se polako poveća na RT i meša 1 h. Smeša se koncentruje pod vakuumom, doda zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa EtOAc, dobijeni slojevi razdvoje, organski sloj suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se rastvori u DCM (6.2 mL) i doda 37% formaldehid u H2O (0.27 mL, 3.7 mmol), dobijena smeša meša 15 min na RT, nakon toga se doda natrijum triacetoksiborohidrid (1.06 g, 5.03 mmol) i dobijena smeša meša na RT u toku noći. Sadržaj reaktivne smeše se nanese na SCX kertridž, eluira prvo sa MeOH nakon toga sa 2M NH3u MeOH i frakcije metanolnog amonijaka koncentruju pod vakuumom da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao ulje (0.57 g, 86% prinos). ES/MS (m/z): 529 (M+H).

Izrada 112

2-[{4-trans-[Ciklopropil(metil)amino]cikloheksil}(etil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0263]

1 1

[0264] 2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.57 g, 1.26 mmol) se doda u rastvor ciklopropanamina (0.15 g, 2.641 mmol) u MeOH (10 mL) i smeša meša 4 h. Ohladi na -78 °C i doda 2M rastvor LiBH4u THF (0.82 mL, 1.64 mmol). Reaktivna smeša se polako zagreva na RT i meša 1 h. Rastvarač se ukloni pod vakuumom, doda zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa EtOAc, dobijeni slojevi razdvoje i organska faza suši preko Na2SO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se rastvori u DCM (6.2 mL), doda rastvor 37% formaldehida u H2O (0.27 mL, 3.77 mmol) i meša 15 min. Nakon toga se doda natrijum triacetoksiborohidrid (0.8 g, 5.03 mmol) i meša na RT u toku noći. Reaktivna smeša se prenese direktno na SCX kertridž, eluira prvo sa MeOH, nakon toga sa 2M NH3u MeOH. Frakcije metanolnog amonijaka se koncentruju pod vakuumom da se nakon uparavanja rastvarača dobije ulje (0.56 g, 87% prinos), pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 511 (M+H).

Izrada 113

Metil 2-bromo-5-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0265]

1 2

[0266] U sirovi uzorak metil 2-bromo-5-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (2.17 g, 5.80 mmol) u DCM (20 mL) se dodaju titanijum(IV) izopropoksid (6.79 g, 23.2 mmol) i 3-etoksiazetidin hidrohlorid (1.60 g, 11.6 mmol). Reakcija se meša približno 18 h na RT. Doda se THF (20 mL), a nakon toga smeša koncentruje pod vakuumom do približno 20 mL. Dobijena smeša se ohladi na -78 °C, nakon toga se doda MeOH (25 mL) a nakon toga u kapima doda 2M LiBH4u THF (4.34 mL, 8.70 mmol). Dobijena smeša se meša približno 3 h, nakon toga se hladno kupatilo ukloni i smeša ostavi da se polako zagreje na RT. Reaktivna smeša se razblaži sa EtOAc (200 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(50 mL), čvrste supstance uklone filtrianjem, filtrat koncentruje pod vakuumom, ostatak razblaži sa EtOAc (50 mL) i čvrste supstance ponovo filtriraju. Organski sloj se koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.25 g, 78 % prinos) kao žuta guma, pogodno da se koristi bez razdvajanja izomera ili dalje hromatografije. ES/MS (m/z): (<79>Br/<81>Br) 459/461 (M+H).

Izrada 114

Metil 2-{2-[(terc-butoksikarbonil)amino]etil}-5-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0267]

[0268] Kalijum terc-butil N-[2-(trifluoroboranuidil)etil]karbamat (0.47 g, 1.8 mmol) i cezijum karbonat (0.89 g, 2.7 mmol, 0.89 g) u vodi (0.6 mL) se dodaju u sirovi metil 2-bromo-5-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat (0.68 g, 1.4 mmol) u toluenu (6 mL), nakon toga se dodaju paladijum(II) acetat (0.031 g, 0.14 mmol) i 2-dicikloheksilfosfino-2’,6’-diizopropoksi-1,1’-bifenil (0.13 g, 0.27 mmol). Dobijena smeša se degasira u struji N2. Dobijena smeša se zagreva približno 2 h na 100 °C, smeša razblaži sa

1

EtOAc (60 mL) i slojevi razdvoje. Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% 7N NH3u MeOH/DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.401 g, 44% prinos) kao žuta guma. ES/MS (m/z): 524 (M+H).

Izrada 115

Metil 2-(2-aminoetil)-5-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0269]

[0270] 4M rastvor HCl u dioksanu (5 mL, 20 mmol) se na RT doda u metil 2-{2-[(tercbutoksikarbonil)amino]etil}-5-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat (0.401 g, 0.605 mmol) u DCM (5 mL). Reakcija se meša približno 2 h na RT i smeša koncentruje pod vakuumom. Doda se MeOH (5 mL) i smeša ponovo koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se razblaži sa DCM (25 mL), ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(3 mL), slojevi razdvoje i organski sloj suši preko Na2SO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje (0.380 g, 95% prinos) kao žuta guma, pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 424 (M+H).

Izrada 116

2-{[Trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

1 4

[0272] Metil 2-(2-aminoetil)-5-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-4-metiltiofen-3-karboksilat (0.380 g, 0.574 mmol) u MeOH (4 mL) se zagreva 3 h pod refluksom, reaktivna smeša koncentruje pod vakuumom i ostatak podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (WATERS™ XBRIDGE® OBD, 30 x 75 mm, 5 µm), uz eluiranje sa gradijentom 20-90% ACN u 10 nM vodenog rastvora NH4CO3koji sadrži 5% MeOH, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.113 g, 50% prinos) kao beličasta guma. ES/MS (m/z): 392 (M+H).

Izrada 117

5-{[2-(Benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0273]

[0274] 2-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin- 4(5H)-on (0.113 g, 0.289 mmol) u THF (2 mL) se ohladi u ledenom kupatilu, doda 1M rastvor KHMDS u THF (0.404 mL, 0.404 mmol), ledeno kupatilo ukloni, rastvor zagreje na RT i smeša meša 30 min. U kapima se doda 2-benziloksi-3-

1

(hlormetil)-4,6-dimetil-piridin (0.113 g, 0.433 mmol) u THF (2 mL). Reaktivna smeša se meša 22 h na RT. Reaktivna smeša se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (2 mL), ekstrahuje sa EtOAc (40 mL), organski sloj izdvoji, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% 7N NH3/MeOH u DCM, da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.084 g, 45% prinos) kao žuta guma. ES/MS (m/z): 617 (M+H).

Izrada 118

5-[(4-Hloro-2-etoksi-6-metilpiridin-3-il)metil]-2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0275]

[0276] Pulverizovani KOH (0.427 g, 7.53 mmol) se u jednoj porciji doda u rastvor 2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-3-metil- 6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.660 g, 1.88 mmol) u THF (10 mL). Dobijena smeša se meša 30 min, doda se 4-hlor-3-(hlormetil)-2-etoksi-6-metilpiridin (0.500 g, 2.27 mmol) u THF (1 mL) i dobijena smeša meša na RT u toku noći. Smeša se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje, organska faza suši preko anhidrovanog Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-100% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.988 g, 98% prinos), kao bledo žuto ulje. ES/MS (m/z): (<35>Cl/<37>Cl) 534/536 (M+H).

Izrada 119

5-[(4-Hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-

1

metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0277]

[0278] LiCl (0.395 g, 9.22 mmol) i PTSA (1.67 g, 9.21 mmol) se dodaju u rastvor 5-[(4-hlor-2-etoksi-6-metil-piridin-3-il)metil]-2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.985 g, 1.84 mmol) u DMF (20 mL) i dobijena smeša zagreva 1 h na 70 °C. Temperatura se poveća na 90 °C, meša 5 h, smeša ohladi na RT, doda se voda i meša na RT u toku noći. Smeša se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, dobijeni slojevi razdvoje i organska faza ispere sa 5% vodenim rastvorom LiCl. Slojevi se razdvoje, organska faza suši preko anhidrovanog Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-50% EtOAc u heksanima a nakon toga gradijentom 0-20% MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.450 g, 26% prinos), kao narandžasto ulje. ES/MS (m/z): (<15>Cl/<37>Cl) 462/464 (M+H).

Izrada 120

Metil 2-(3-{[(benziloksi)karbonil]amino}prop-1-in-1-il)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0279]

1

[0280] TEA (55.6 g, 550.0 mol) se doda u smešu metil 2-bromo-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (7.9 g, 19.0 mmol), CuI (1.5 g, 7.90 mmol) i benzil N-prop-2-inilkarbamata (8.9 g, 47 mmol) u THF (200 mL). Smeša se degasira u struji N2i doda bis(trifenilfosfin)paladijum (II)dihlorid (2.8 g, 3.9 mmol). Smeša se meša na RT u toku noći. Reaktivna smeša se filtrira preko diatomejske zemlje i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-60% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (8.2 g, 82% prinos). ES/MS (m/z): 513 (M+H).

Izrada 121

Metil 2-(3-aminopropil)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0281]

[0282] U posudu pod pritiskom se doda rastvor metil 2-(3-[(benziloksi)karbonil]amino}prop-1-in-1-il)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (7.6 g, 14 mmol) u MeOH (200 mL) koji sadrži TEA (1.0 mL, 7.1 mmol) i 10% Pd na ugljeniku (3 g, 2.82 mmol). Reaktivna posuda se napuni sa H2(414 kPa) i meša 4 h. Reaktivna smeša se filtrira preko diatomejske zemlje, filtrat koncentruje pod vakuumom do približno 150 mL, doda se 20 % Pd(OH)2na ugljeniku (2.0 g), degasira sa N2a nakon toga sa H2i meša u atmosferi H2u toku noći. Reaktivna smeša se filtrira preko ploče diatomejske zemlje, koncentruje pod vakuumom do pribilžno 100 mL, doda 20% Pd(OH)2na ugljeniku (1.2 g) i meša u atmosferi H2(414 kPa) u toku noći. Reakcija se filtrira preko diatomejske zemlje i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (6.5 g, kvantitativni prinos) kao braon ulje, pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 397 (M+H).

1

Izrada 122

2-[1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0283]

[0284] KOtBu (3 g, 25 mmol) se doda u rastvor metil 2-(3-aminopropil)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]- 4-metiltiofen-3-karboksilata (7.6 g, 19 mmol) u THF (200 mL) i TEA (1.0 mL, 7.1 mmol). Smeša se zagreva 4 h na 80 °C, ohladi na RT i doda se voda (100 mL). Cela smeša se koncentruje pod vakuumom i dobijeni ostatak tretira sa malom količinom MeOH sve do pojave čvrste supstance. Dobijena čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (Thermo Scientific Hypersil GOLD™), uz eluiranje sa gradijentom 0-50% ACN koji sadrži 0.1% mravlje kiseline i vodom koja sadrži 0.1% mravlje kiseline, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (1.7 g, 24% prinos) kao svetlo braon čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 365 (M+H).

Izrada 123

2-[1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0285]

1

[0286] U rastvor 2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-ona (1.7 g, 4.7 mmol) u dimetil sulfoksidu (20 mL) i THF (20 mL) doda se pulvarizovani KOH (1.1 g, 19 mmol). Smeša se meša 30 min, nakon toga se doda 3-(hlormetil)-2-metoksi-4,6-dimetil-piridin (1.0 g, 5.4 mmol). Dobijena smeša se meša 1 h, smeša sipa u ledeno hladan vodeni rastvor NaHCO3i ekstrahuje sa DCM. Dobijeni slojevi se razdvoje i organska faza koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.1 g, 61% prinos) kao braon ulje, pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 514 (M+H).

Izrada 124

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro- 4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0287]

[0288] LiCl (0.830 g, 19.4 mmol) i PTSA (3.5 g, 19 mmol) se dodaju u rastvor 2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(etil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-ona (2.0 g, 2.7 mmol, -70% čistoće) u DMF (20 mL) i dobijena smeša zagreva 1 h na 70 °C. Reaktivna smeša se ohladi na RT, sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM (2 x 100 mL) i slojevi razdvoje. Kombinovani organski slojevi se koncentruju pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (1.8 g, ~85% čistoće analiatičkim LCMS) kao svetlo braon ulje. ES/MS (m/z): 456 (M+H).

11

Izrada 125

Metil 2-(3-{[(benziloksi)karbonil]amino}prop-1-in-1-il)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0289]

[0290] TEA (35.4 g, 350.0 mmol) se doda u suspenziju metil 2-bromo-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]- 4-metiltiofen-3-karboksilata (5.40 g, 13.0 mmol), CuI (0.987 g, 5.18 mmol) i benzil N-prop-2-inilkarbamata (3.17 g 14.3 mmol, 85% čistoće) u 1,4-dioksanu (54 mL). Smeša se degasira u struji N2, doda bis(trifenilfosfin) paladijum(II) dihlorid (1.84 g, 2.59 mmol), smeša meša 1 h na 40 °C, doda još benzil N-prop-2-inilkarbamata (3.17 g, 14.3 mmol, 85% čistoće) i zagreva 1 h na 40 °C. Reaktivna smeša se koncetruje pod vakuumom, doda smeša DCM/heksani (približno 1:1), filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni braon uljani ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-75% MTBE u heksanima, hromatografske frakcije koncentruju pod vakuumom, dobijeni ostatak rastvori u MeOH i ponovo koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (5.23 g, 75% prinos) kao lepljivi braon ostatak. ES/MS (m/z): 513 (M+H).

Izrada 126

Metil 2-(3-aminopropil)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat

[0291]

[0292] U metil 2-(3-{ [(benziloksi)karbonil] amino}prop-1-in-1-il)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilat (5.23 g, 9.18 mmol) u MeOH (45 mL) i EtOAc (15 mL) se dodaju TEA (6.40 mL, 45.9 mmol) i 10% Pd na ugljeniku (2.6 g, 2.4 mmol). Reaktivna posuda se isprazni i sadržaj meša 5 h na RT u atmosferi H2(345 kPa). Doda se 20% Pd(OH)2na ugljeniku (2.78 g, 3.96 mmol), reaktivna posuda isprazni, napuni sa H2i meša približno 17 h na RT. Doda se još 20% Pd(OH)2na ugljeniku (1.0 g, 1.4 mmol), napuni sa H2i meša 4 h na RT. Reaktivna smeša se filtrira preko ploče diatomejske zemlje i filtrat koncentruje pod vakuumom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-12% 7N metanolnim NH3u DCM. Hromatografske frakcije se koncentruju pod sniženim pritiskom, dobijeni ostatak rastvori u MeOH i ponovo koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.60 g, 73% prinos) kao žuto ulje. ES/MS (m/z): 383 (M+H).

Izrada 127

2-[1,4-Dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4h-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0293]

[0294] KOtBu (20% mt. u THF, 5.46 g, 9.72 mmol) se doda u smešu metil 2-(3-aminopropil)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (2.53 g, 6.48 mmol) u toluenu (25 mL). Meša 1 h na 120 °C, ohladi na RT, doda propilfosforni anhidrid (50% mt. u etil acetatu, 0.386 mL 0.648 mmol) i meša 30 min. Reaktivna smeša se neutrališe sa zasićenim rastvorom NH4Cl, razblaži sa EtOAc (približno 50 mL) i slojevi razdvoje.

Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.21 g, 97% prinos) kao žuto ulje, pogodno da se koristi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 351 (M+H).

Izrada 128

5-{[2-(Benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0295]

[0296] U rastvor 2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4htieno[3,2-c]azepin-4-ona (2.21 g, 6.31 mmol) u THF (10 mL) i dimetil sulfoksidu (10 mL) se doda pulverizovani KOH (1.43 g, 25.2 mmol) u jednoj porciji, meša 30 min, a nakon toga se doda 2-benziloksi-3-(hlormetil)-4,6-dimetil-piridin (1.98 g, 6.81 mmol, 90% čistoće) rastvoren u THF (2 mL). Dobijena smeša se meša 4 h na RT, nakon toga sipa u ledeno hladan vodeni rstvor NaHCO3i ekstrahuje sa DCM. Slojevi se razdvoje i organski sloj koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-50% EtOAc u heksanima, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (3.2 g, 86% prinos). ES/MS (m/z): 576 (M+H).

Izrada 129

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[metil(4-oksocikloheksil)amino]-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0297]

11

[0298] LiCl (1.4 g, 33 mmol) i PTSA (5.8 g, 32 mmol) se dodaju u rastvor 5-{[2-(benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-ona (3.2 g, 5.4 mmol) u DMF (30 mL). Zagreva se 1 h na 70 °C, ohladi na RT, sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3i ekstrahuje sa DCM. Dobijeni slojevi se razdvoje i organska faza koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-5% 7N metanolnim NH3u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (1.7 g, 60% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 442 (M+H).

Izrada 130

5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-2-[(1R)-1-{trans-4-[2-metoksietil(metil)amino]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on

[0299]

[0300] 2-metoksietanamin (100 mg, 1.33 mmol) se rastvori u MeOH (4 mL) i doda 5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (160 mg, 0.36 mmol). Smeša se meša 4 sata. Ohladi na -78 °C i u kapima doda 2M rastvor LiBH4u THF (235 µL, 0.47 mmol). Dobijena smeša se meša 15 minuta i zagreje na RT uz mešanje u toku 1 h. Reaktivna smeša se koncetruje pod vakuumom i razblaži sa DCM i zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3. Slojevi se razdvoje, vodena faza ekstrahuje sa dodatnom količinom DCM, organski ekstrakti kombinuju i organska faza suši preko MgSO4. Filtrira i filtrat koncentruje da se dobije sirovi 5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-2-[(1R)-1-{trans-4-[(2-metoksietilamino)cikloheksil]etil}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on (150 mg, 83% prinos) kao ulje, dovoljno za upotrebu u sledećoj fazi bez dodatnog prečišćavanja. ES/MS (m/z): 500 (M+H).

[0301] Sirovi 5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-2-[(1R)-1-{trans-4-[(2-metoksietilamino)cikloheksil]etil}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on (100 mg, 0.20 mmol) se rastvori u DCM (2 mL) i doda vodeni rastvor 37%formaldehida (0.4 mL, 5.0 mmol); smeša meša 15 min na RT, doda se Na(OAc)3BH (170 mg, 0.80 mmol) i smeša meša približno 3 sata na RT. U reaktivnu smešu se doda još vodenog rastvora 37% formaldehida (1.5 mL, 18.75 mmol) i meša 2 h na RT. Reaktivna smeša se koncetruje pod vakuumom i doda se DCM (25 mL). Smeša se dalje suspenduje u MeOH (8 mL) sa TEA (1.5 mL, 11 mmol). Doda se vodeni rastvor 37%formaldehida (6 mL, 80.0 mmol). Smeša se meša na RT 1 h. Doda se Na(OAc)3BH (300 mg, 1.42 mmol) i dobijena smeša meša na RT približno 4 h. Reakcija se razblaži sa DCM (40 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(1.0 mL). Slojevi se razdvoje, organska faza suši preko MgSO4i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (48 mg, 47% prinos). ES/MS (m/z): 514 (M+H).

Izrada 131

Metil 5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-il)etil]-2-[3-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metilamino]propil]-4-metil-tiofen-3-karboksilat

[0302]

11

[0303] Rastvor metil 2-(3-{[(benziloksi)karbonil]amino}prop-1-in-1-il)-5-[1,4-dioksaspiro[4.5]dek-8-il(metil)amino]-4-metiltiofen-3-karboksilata (803 g, 1.57 mol), 2-metoksi-4,6-dimetil-piridin-3-karbaldehida (314.5 g, 1.90 mol) i paladijum Pd(OH)2na aktivnom ugljeniku (298 g) u EtOH (7.5 L) se podvrgne hidrogenaciji pod pritiskom od 100 psi na 60 °C. Nakon prestanka preuzimanja H2(18 h), reakcija se ohladi i dobijena smeša filtrira kroz diatomejsku zemlju i ispere sa EtOH (2 L). Rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (892 g, >99% prinos) kao ulje. ES/MS (m/z): 531 (M+H).

Izrada 132

5-[(2-Metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-7,8-dihidro-6H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0304]

[0305] Kalijum trimetilsilanolat (256.7 g, 2.0 mol) se doda u rastvor metil 5-[(1R)-1-(1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-il)etil]-2-[3-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metilamino]propil]-4-metil-tiofen-3-karboksilata (531.4 g, 1.0 mol) u THF (6.4 L). Smeša se zagreva 18 h na 65 °C, ohladi na 5 °C i po redu dodaju TEA (382 ml, 2.7 mol) i trietilamin hidrohlorid (471 g, 3.4

11

mol). Nakon 10 minuta mešanja, 30 minuta se dodaje 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioksatrifosforinan-2,4,6-trioksid u EtOAc (887 ml, 1.5 mol) održavajući temperaturu na ~5 °C. Reaktivna smeša se meša u toku noći na RT i doda se 2N vodeni rastvor HCl (5.0 L, 10.0 mol) na 23 °C. Reakcija se meša 16 h, razblaži sa EtOAc (6.5 L) i neutrališe sa 2M rastvorom K3PO4(6.5 L). Organski sloj se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (3.2 L), slojevi razdvoje, organski sloj suši preko Na2SO4, filtrira i dobijeni filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti hromatografijom na silika gelu (4 kg), uz eluiranje sa gradijentom 10 do 50% EtOAc u heptanima. Prečišćene frakcije se prečiste sa heptanima (2.3 L) i suše pod vakuumom na 40 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (196.2 g, 43% prinos). ES/MS (m/z): 455 (M+H).

Izrada 133

2-[(1R)-1-[4-(3-Metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-3-metil-7,8-dihidro-6H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0306]

[0307] 5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-7,8-dihidro-6H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (246.3 g, 0.5418 mol) se doda u rastvor 3-metoksiazetidin hidrohlorida (186.9 g, 1.51 mol) u MeOH (2.9L) koji sadrži DIPEA (573 ml, 3.29 mol). Dobijena reaktivna smeša se meša na RT u toku noći. Doda se THF (991 ml) i rastvor ohladi na -72 °C. Dodaje se 2M rastvor LiBH4u THF (379 ml, 0.758 mol) u kapima u toku 45 min, uz održavanje unutrašnje temperature ispod -70 °C. Nakon 2.5 h mešanja, reakcija se neutrališe dodavanjem reaktivne smeše u 1M vodeni rastvor HCl (6.6 L) u toku 20 min. Smeša se meša 10 min i pH podesi na ~ 9 sa 6M vodenim rastvorom K2CO3(1.25 L). Dobijena smeša se koncentruje da se uklone isparljive supstance a preostala vodena

11

smeša se razblaži sa EtOAc (6 L). Slojevi se razdvoje i organski sloj po redu ispere sa 3M rastvorom K2CO3(1.65 L) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl. Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti preko silike gela (3.2 kg), uz eluiranje sa gradijentom 0 do 5% 7N NH3/MeOH u EtOAc, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (208.6 g, 73% prinos). ES/MS (m/z): 526 (M+H).

Primer 1

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0308]

[0309] LiCl (9.83 g, 230 mmol) i PTSA (41.6 g, 230 mmol) se dodaju u rastvor 5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-2-{(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (23.5 g, 45.9 mmol) u DMF (188 mL). Dobijena smeša se meša 8 h na 50 °C i 16 h na RT. Dodaju se voda (400 mL) i 2M vodeni rastvor K2CO3(300 mL), ekstrahuje sa EtOAc (2 x 250 mL), slojevi razdvoje, kombinovane organske faze suše preko MgSO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijena čvrsta supstanca se suspenduje u heptanu (400 mL) i zagreva 3 h na 80 °C.

Suspenzija se ohladi, filtrira i suši pod vakuumom 16 h na 45 °C. Dobijena čvrsta supstanca se suspenduje u diizopropil etru (195 mL), zagreva 2 h na 70 °C, suspenzija ohladi, filtrira i suši pod vakuumom 16 h na 45 °C. Sakupljena čvrsta supstanca se suspenduje u vodi (180 mL) i zagreva 5 h na 70 °C, nakon toga 5 h na RT. Dobijene čvrste supstance se filtriraju i suše pod vakuumom 16 h na 45 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca (16.6 g, 70% prinos). ES/MS (m/z): 498 (M+H). [α]D<20>= -68.93° (c=1.0, MeOH).

11

Primeri 2 i 3

Primer 2: 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(3-metil-1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0310]

Primer 3: 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1H-piridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-[4-[3-(5-metilpirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil]etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on

[0311]

[0312] U rastvor 5-[2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(3-metil-1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona i 5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-[trans-4-[3-(5-metilpirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil]etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-ona (800 mg, 0.925 mmol, smeša regioizomera) u DMF (5 mL) se na 0 °C dodaju LiCl (198 mg, 4.63 mmol) i PTSA

11

(839 mg, 4.63 mmol). Dobijena suspenzija se zagreva na 50 °C u toku noći. Doda se ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM (2 x 100 mL), slojevi razdvoje, organske faze kombinuju, isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (XBRIDGE™, 5 µm, 19 x 100 mm, brzina protoka: 25 mL/min), koristeći gradijent 40-60% 20 mM vodeni rastvor NH4HCO3(pH 9) u ACN, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje kao smeša regioizomera kao bledo žuta čvrsta praškasta supstanca (130 mg, 26%). Regioizomeri se razdvoje preparativnom SFC hromatografijom (CHIRALPAK® IA, 35% EtOH (0.2% IPAm)/CO2, 21 x 250 mm) i strukture odrede na bazi 1H i HSQC spektroskopije. Regioizomer 1 (Primer 2): 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(3-metil-1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on, ES/MS (m/z): 548 (M+H), tR = 2.93 min (analitička SFC CHIRALPAK® IA, 35% (0.2% IPAm)/CO2, 5 mL/min, 225 nm, 5 x 25 mm).<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3): δ 0.87-1.04 (m, 4H), 1.22 (d, J= 6.8 Hz, 3H), 1.31-1.25 (m, 1H), 1.60-1.69 (m, 1H), 1.69-1.79 (m, 1H), 1.86-1.91 (m, 1H), 1.92-2.01 (m, 1H), 2.08-2.17 (m, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 2.79-2.89 (m, 3H), 3.33-3.43 (m, 2H), 3.62-3.71 (m, 2H), 3.77 (q, J= 6.8 Hz, 2H), 4.71 (s, 2H), 4.85 (kvintet, J= 7.2 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 6.01 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 7.36 (d, J= 2.0 Hz, 1H),12.53-12.55 (bs, 1H). C5 pirazola pokazuje rotaciju ugljenika od 128.6 ppm u HSQC spektroskopiji. Regioizomer 2 (Primer 3): 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1H-piridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-[4- [3-(5-metilpirazol-1-il)azetidin-1-il] cikloheksil]etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on, ES/MS (m/z): 548 (M+H), tR = 3.69 min (analitička SFC CHIRALPAK® IA, 35% (0.2% IPAm)/CO2, 5 mL/min, 225 nm, 5 x 25 mm).<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3): δ 0.90-1.04 (m, 4H), 1.21 (d, J= 6.9 Hz, 3H), 1.25-1.31 (m, 1H), 1.62-1.67 (m, 1H),1.79 (s, 1H), 1.84-1.91 (m, 1H), 1.99-2.01 (m, 1H), 2.09-2.19 (m, 1H), 2.23 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 2.81-2.89 (m, 3H), 3.50-3.56 (m, 2H), 3.62-3.71 (m, 2H), 3.79 (q, J= 6.7 Hz, 2H), 4.71 (s, 2H), 4.81-4.88 (m, 1H), 5.92 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 7.43 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 12.32-12.34 (bs, 1H). C3 pirazola pokazuje rotaciju ugljenika od 138.4 ppm u HSQC spektroskopiji.

[0313] Naredna jedinjenja se izrađuju u suštini isto kao po postupku za Primer 2 koristeći odgovarajući 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1H-piridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-[4-supstituisanicikloheksil]etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on i prečišćavanjem ili normalnom- ili reverzno-faznom hromatografijom.

12

Primer 9 2-[(1R)-1-[4-[3-(ciklopropoksi)azetidin-1-il]cikloheksil]etil]-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1H-piridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on

[0314]

[0315] Smeša 5-{[2-(benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(ciklopropiloksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (200 mg, 0.33 mmol) u THF (6 mL) i 1N rastvor HCl (10 mL) se mešaju 2 h na 90 °C. Ohladi na RT i smeša sipa u zasićeni vodeni rastvor NaHCO3sa ledom i nakon toga ekstrahuje dva puta sa EtOAc. Kombinovani ekstrakti se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko MgSO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 20-50% smeše (10% 7N NH3MeOH) u DCM i DCM da se nakon uparavanja rastvarača dobije 66 mg čistog produkta. Manje čiste kombinovane frakcije (54 mg nakon uparavanja rastvarača) se podvrgnu reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (Phenomenex LUNA®, 5 µm C-18 AXIA®, 30 x 75 mm, temperatura kolone 25 °C, 85 mL/min), koristeći gradijent 10-75% ACN u 10 nM NH4HCO3(pH 10) u vodi. Slične frakcije se kombinuju, koncentruju pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 20-50% smeše (10% 7N NH3u MeOH) u DCM i DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije još 22 mg naslovljenog jedinjenja. Materijali iz dva prečišćavanja se kombinuju kao naslovljeno jedinjenje (88 mg, 51% prinos). ES/MS (m/z): 524 (M+H).<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3): 0.40-0.47 (m, 2H), 0.49-0.55 (m, 2H), 0.91-1.01 (m, 4H), 1.20 (d, J= 6.9 Hz, 3H), 1.24-1.29 (m, 1H), 1.55-1.65 (m, 1H), 1.67-1.76 (m, 1H), 1.76-1.82 (m, 1H), 1.86-1.97 (m, 2H), 2.30 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.38 (s, 3H), 2.77-2.89 (m, 5H), 3.17-3.22 (m, 1H), 3.57-3.69 (m, 4H), 4.71 (s, 2H), 4.20 (kvintet, J= 6.0 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 12.81-12.83 (bs, 1H).

[0316] Naredna jedinjenja se izrađuju u suštini isto kao po postupku za Primer 9, koristeći odgovarajuće supstituisani 5-[(2-benziloksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-2-[(1R)-1-[4-azetidin-1-il]cikloheksil]etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on.

[0317] Primer 12:<1>H NMR (399.8 MHz, CDCl3): 1.05-1.07 (m, 2H), 1.32-1.46 (m, 2H), 1.83-

12

1.85 (m, 2H), 1.93-1.94 (m, 2H), 2.14-2.16 (m, 1H), 2.25 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 2.58-2.67 (m,1H), 2.76-2.80 (m, 2H), 3.43-3.47 (m, 2H), 3.62-3.66 (m, 2H), 3.77-3.81 (m, 2H), 4.69 (s, 2H), 4.92-4.95 (m, 1H), 5.90 (s, 1H), 6.24 (t, J= 2.0 Hz, 1H), 7.46 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 7.53 (d, J= 1.9 Hz, 1H). (Promenljivi NH proton nije uočen.)

Primer 15

2-{(1R)-1-[Trans-4-(azetidin-1-il)cikloheksil]etil}-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0318]

[0319] Smeša 2-{(1R)-1-[trans-4-(azetidin-1-il)cikloheksil]etil}-5-{[2-(benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (190 mg, 0.34 mmol) i 10% Pd na ugljeniku (60 mg) se meša u MeOH (15 mL) u atmosferi H2pod pritiskom od 60 psi u toku noći. Reaktivna smeša se filtrira preko ploče diatomejske zemlje i filtrat koncentruje. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-60% smeše 10% 7N NH3MeOH /DCM u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (117 mg, 73% prinos). ES/MS (m/z): 468 (M+H).

Primer 16

2-[(1R)-1-{Trans-4-[3-(ciklopropilmetoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0320]

[0321] Smeša 5-{[2-(benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(ciklopropilmetoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (96 mg, 0.15 mmol), LiCl (34 mg, 0.79 mmol) i p-toluensulfonske kiseline monohidrat (135 mg, 0.77 mmol) u DMF (3 mL) se meša 1.5 h na 62 °C i reaktivna smeša koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-70% smeše 10% 2N NH3u MeOH/DCM u DCM da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (40 mg, 48% prinos). ES/MS (m/z): 538 (M+H).

Primeri 17 i 18

Primer 17: 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[(1R)-{trans-4-[3-(2-metoksietoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil)]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0322]

Primer 18: 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[(1R)-{cis-4-[3-(2-metoksietoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil)]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

12

[0324] LiCl (0.2 g, 5.57 mmol) i PTSA (1.01 g, 5.578 mmol) se dodaju u rastvor 5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-2-[(1R)-1-{4-[3-(2-metoksietoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.62 g, 1.11 mmol, smeša cis- i trans- diastereomera) u DMF (5.6 mL) i mešaju 2 h na 90 °C. Doda se zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa EtOAc, suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji preko SCX (10 g), eluira prvo sa MeOH a nakon toga sa 2M NH3u MeOH. MeOH se koncentruje u frakciji amonijaka pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (Xterra XBRIDGE® kolona, 5 µm, 19 x 100 cm), uz eluiranje sa gradijentom 35-55% 20 mM NH4CO3(pH 9) u vodi/ACN u toku 3 min pri 25 mL/minut, da se nakon uparavanja rastvarača dobije prvo eluirano trans- jedinjenje Primer 17 kao čvrsta supstanca (0.148 g, 25% prinos), ES/MS (m/z): 541 (M+H) i drugo eluirano cis- jedinjenje Primer 18 kao čvrsta supstanca (0.027 g, 4.5% prinos), ES/MS(m/z): 541 (M+H).

Primer 19

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil](metil)amino}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0325]

12

[0326] 3-metoksiazetidin hidrohlorid (0.304 g, 2.460 mmol) u MeOH (5 mL) i THF (5 mL) se meša sa DIPEA (0.308 mL, 1.77 mmol) 30 min na RT. Doda se 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[metil(4-oksocikloheksil)amino]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.28 g, 0.49 mmol) i meša 1 h na RT. Smeša se ohladi na -78 °C i doda rastvor 2M LiBH4u THF (6.4 mL, 13 mmol), dobijena smeša meša 1 h na -78 °C i zagreje na RT. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje, organski ekstrakti suše preko Na2SO4, filtriraju i organski ekstrakt koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-50% 10% 7N metanolnog rastvora NH3u DCM do DCM.

Hromatografske frakcije koje sadrže trans- i cis- izomere se sakupe i koncentruju pod vakuumom. Trans- i cis- izomeri se razdvoje reverzno faznom hromatografijom preko C-18 silika gela (30 g Thermo Scientific Hypersil GOLD™), eluiraju sa gradijentom 10-100% ACN u 10 mM vodenom rastvoru NH4CO3da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.064 g, 26% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z):

499(M+H).

Primer 20

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-(metil{trans-4-[3-(1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}amino)-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0327]

12

[0328] Titanijum(IV) izopropoksid (0.373 g, 1.27 mmol) se na RT doda u 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[metil(4-oksocikloheksil)amino]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.148 g, 0.32 mmol) u DCM (2.5 mL) a nakon toga se doda 1-(azetidin-3-il)pirazol dihidrohlorid (0.187 g, 0.955 mmol). Nakon 3 h, doda se THF (2.5 mL), a zatim smeša koncentruje do pribilžno 2.5 mL pod vakuumom. Dobijena smeša se ohladi na -78 °C, doda se MeOH (2.5 mL) a nakon toga rastvor 2M LiBH4u THF (0.24 mL, 0.48 mmol) i postepeno zagreje na RT i meša u toku noći. Smeša se razblaži sa DCM (50 mL) i vodom (10 mL), filtrira preko ploče diatomejske zemlje i filter pogača ispere sa DCM (100 mL). Filtrat se koncentruje pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (WATERS™ XBRIDGE®, 30 x 75 mm, 5 µm), uz eluiranje sa gradijentom 20-60% ACN u 10 mM vodenom rastvoru NH4CO3koji sadrži 5% MeOH, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.025 g, 14% prinos) kao tanki providan film. ES/MS (m/z): 535 (M+H).

Primer 21

5-[(4-Hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0329]

[0330] 3-metoksiazetidin hidrohlorid (0.300 g, 2.43 mmol) u metanol (5 mL) se doda u bocu sa okruglim dnom koja sadrži THF (5 mL) i DIPEA (0.306 mL, 1.75 mmol), meša 30 min na RT, nakon toga se u rastvor doda 5-[(4-hlor-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.450 g, 0.487 mmol, 50% čistoće) i meša 1 h na RT. Reaktivna smeša se ohladi na -78 °C i doda

12

rastvor 2M LiBH4u THF (0.63 mL, 1.3 mmol). Meša se 1 h, nakon toga smeša postepeno zagreje na RT, smeša sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje, organska faza suši preko anhidrovanog Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-40% 10% smeše 7N NH3/MeOH u DCM/DCM. Frakcije koje sadrže produkt se upare kako bi se cis- i trans- izomeri razdvojili i dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (15.5 g Thermo Scientific Hypersil GOLD™), uz eluiranje sa gradijentom 10-100% ACN u 10 mM NH4CO3koji sadrži 5% MeOH, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.120 g, 46% prinos), kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): (<35>Cl/<37>Cl) 533/535 (M+H).

Primer 22

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0331]

[0332] LiCl (6.13 g, 143.2 mmol) se doda u smešu 2-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-5-[(2- metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (16.40 g, 28.65 mmol) i PTSA (25.96 g, 143.2 mmol) u DMF (100 mL) i meša 9 h na 50 °C i nakon toga 18 h na RT. Razblaži sa EtOAc (400 mL) i 4M vodenim rastvorom K2CO3(200 mL). Faze se razdvoje, vodena faza ekstrahuje sa EtOAc (3 x 100 mL) i po redu kombinovani organski slojevi isperu sa 4M vodenim rastvorom K2CO3(2 x 100 mL), vodom (100 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (100 mL). Organska faza se suši preko Na2SO4, filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom da se dobije bledo braon čvrsta supstanca. Čvrsta suptanca se prevede u žitku masu sa EtOAc (100 mL) i meša 1 h na RT. Doda se dietil etar (100 mL), meša 2 h na RT, čvrsta supstanca filtrira, ispere sa

12

hladnim dietil etrom (50 mL) i suši pod vakuumom. U smešu dobijene čvrste supstance u ACN (500 mL) doda se TEA (21.54 g, 212.8 mmol) i meša 24 h na 85 °C. Smeša se ohladi, koncentruje pod vakuumom, dobijeni ostatak suspenduje u vodi (165 mL) i meša 4 h na RT. Dobijena čvrsta supstanca se filtrira, ispere sa vodom (50 mL) i suši 16 h pod vakuumom na 50 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (10.83 g, 76% prinos) kao bleda čvrsta supstanca boje slonovače. ES/MS (m/z): 513 (M+H).

Primer 23

2-[{Trans-4-[3-(ciklopropiloksi)azetidin-1-il]cikloheksil}(etil)amino]-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0333]

[0334] U bocu sa okruglim dnom se dodaju 3-(ciklopropoksi)azetidin hidrohlorid (0.6776 g, 4.529 mmol), MeOH (4 mL), DIPEA (0.5853 g, 4.529 mmol), 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.500 g, 1.13 mmol) i THF (20 mL). Dobijeni rastvor se meša na RT u toku noći. Reaktivna smeša se ohladi na -78 °C i u kapima doda 2M rastvor LiBH4u THF (1.13 mL, 2.26 mmol). Reakcija se stavi u ledeno kupatilo na 0 °C i ostavi 1.5 h da se polako zagreje na RT. Reaktivna smeša se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3, razblaži sa DCM, slojevi razdvoje i vodena faza ekstrahuje sa još DCM. Organske faze se kombinuju, suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela. Tražene frakcije se koncentruju pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.092 g, 15%) kao beli prašak. ES/MS (m/z): 539 (M+H).

Primeri 24 i 25

1

Primer 24: 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-(etil{trans-4-[3-(1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}amino)-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0335]

Primer 25: 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-(etil{cis-4-[3-(1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}amino)-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0336]

[0337] U bocu sa okruglim dnom se dodaju 1-(azetidin-3-il)pirazol dihidrohlorid (0.266 g, 1.36 mmol), MeOH (6.8 mL) i DIPEA (0.239 mL, 1.36 mmol) i mešaju 30 min na RT. U reaktivnu smešu se doda 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.150 g, 0.340 mmol) i meša 3 h. Reaktivna smeša se ohladi na -78 °C, nakon toga se u kapima doda 2M LiBH4u THF (0.255 mL, 0.510 mmol) i meša 3 h. Reaktivna smeša se zagreje na RT, sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, dobijena suspenzija razblaži sa smešom DCM/voda i tri puta ekstrahuje sa DCM. Slojevi se razdvoje, organske faze kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela, uz eluiranje sa gradijentom 0-55%

1 1

ACN u 10 mM NH4CO3/voda, da se dobije trans- naslovljeno jedinjenje Primer 24 (0.088 g, 47% prinos) kao bela čvrsta supstanca, ES/MS (m/z): 549 (M+H) i cis- naslovljeno jedinjenje Primer 25 (0.048 g, 26% prinos) kao bela čvrsta supstanca, ES/MS (m/z): 549 (M+H).

Primer 26

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-(etil{trans-4-[3-(2-metoksietoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}amino)-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0338]

[0339] U bocu sa okruglim dnom se dodaju 3-(2-metoksietoksi)azetidin hidrohlorid (1.5 g, 8.9 mmol) i DIPEA (2 mL, 11.5 mmol) u MeOH (20 mL). Meša se 30 min na RT, nakon toga se doda 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (1.0 g, 2.3 mmol) u THF (5 mL) i dobijena smeša meša na RT u toku noći. Reaktivna smeša se ohladi na -78 °C i u kapima doda 2M LiBH4u THF (2.8 mL, 5.6 mmol). Reakcija se stavi u ledeno kupatilo i polako zagreva 2 h na RT. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje i organski ekstrakti koncentruju pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-3% smeše 7N NH3/MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije trans- izomer (0.450 g, 36% prinos) kao nečista svetlo braon čvrsta supstanca i cis- izomer (0.220 g, 17% prinos) kao svetlo braon ulje. Trans- izomer se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji na C-18 silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-60% ACN u 10 mM NH4CO3/voda, da se nakon uparavanja rastvarača dobije trans- naslovljeno jedinjenje (233 mg, 18% prinos) kao svetlo braon čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 557 (M+H).<1>H NMR (400.1 MHz, CDCl3): 0.94 (t, J=

1 2

7.0 Hz, 3H), 0.98-1.03 (m, 2H), 1.20-1.28 (m, 2H), 1.78-1.81 (m, 2H), 1.86-1.92 (m, 3H), 2.29 (s, 3H), 2.35 (s, 6H), 2.67-2.77 (m, 1H), 2.83 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.85-2.95 (m, 4H), 3.39 (s, 3H), 3.59 (dd, J= 6.1, 7.5 Hz, 2H), 3.52 (s, 4H), 3.69 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 4.13 (kvintet, J= 5.9 Hz, 1H), 4.73 (s, 2H), 5.94 (s, 1H), 12.24-12.25 (bs, 1H).

Primer 27

2-{[Trans-4-(dimetilamino)cikloheksil](etil)amino}-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0340]

[0341] U mikrotalasnu bočicu zapremine 5 mL se dodaju 2-[(trans-4-aminocikloheksil)(etil)amino]-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidro-piridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on (0.050 g, 0.113 mmol), sirćetna kiselina (0.019 mL, 0.339 mmol) i 37% vodeni rastvor formaldehida (0.025 mL, 0.3389 mmol) u MeOH (4 mL). Bočica se ohladi na 0°C i u reaktivnu smešu polako dodaje NaCNBH4(0.0213 g, 0.3389 mmol). Zagreje se na RT, meša 4.5 h, nakon toga reaktivna smeša koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se razblaži sa DCM i vodom, slojevi razdvoje i vodeni sloj ekstrahuje sa novom količinom DCM. Organske faze se kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (50 g), uz eluiranje sa ACN u 10 nM NH4CO3/voda, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.0135 g, 25% prinos) kao beli prašak. ES/MS (m/z): 471 (M+H).

Primer 28

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(piperidin-4-il)amino]-3-metil-

1

6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0342]

[0343] U mikrotalasnu bočicu se doda terc-butil 4-(etil{5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-4-okso-4,5,6,7-tetrahidrotieno[3,2-c]piridin-2-il}amino)piperidin-1-karboksilat (0.700 g, 1.290 mmol) u DMF (6.45 mL). Ohladi na 0 °C, nakon toga se dodaju LiCl (0.276, 6.45 mmol) i PTSA (1.17 g, 6.45 mmol). Dobijena smeša se zagreva na 90 °C u toku noći, reaktivna smeša ohladi na RT, neutrališe sa ledeno hladnim zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i razblaži sa DCM. Slojevi se razdvoje, vodeni sloj ekstrahuje sa novom količinom DCM, organske faze kombinuju, suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% 7N NH3u MeOH/DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.284 g, 51% prinos) kao bež čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 429 (M+H).

Primeri 29 i 30

Primer 29: 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-(etil{trans-4-[(2-metoksietil)(metil)amino]cikloheksil}amino)-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0344]

Primer 30: 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-(etil{cis-4-[(2-

1 4

metoksietil)(metil)amino]cikloheksil}amino)-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0345]

[0346] LiCl (0.22 g, 5.20 mmol) i PTSA (0.94 g, 5.20 mmol) se dodaju u rastvor 2-(etil{4-[(2-metoksietil)(metil)amino]cikloheksil}amino)-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.55 g, 1.04 mmol, smeše cis- i transdiastereomera) u DMF (5.2 mL) i zagrevaju 1 h na 90 °C u zatvorenoj epruveti. Reakcija se ohladi na RT, doda zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa EtOAc i organski ekstrakt koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se nanese na SCX kertridž (25 g), eluira prvo sa MeOH i nakon toga sa 2M NH3u MeOH. Frakcije metanolnog amonijaka se koncentruju pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne superkritičnoj tečnoj hromatografiji (CHIRALCEL® OD, 5 um, 2 x 25 cm), uz izokratno eluiranje na 30% sa mobilnom fazom CO2/MeOH koja sadrži 0.2% DMA pri 65 mL/min, da se dobiju naslovljena jedinjenja: 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-(etil{trans-4-[(2-metoksietil)(metil)amino]cikloheksil}amino)-3-metil-6,7-dihidro-tieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on, Primer 29, (0.07 g, 13% prinos), ES/MS (m/z): 515 (M+H).5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2- dihidropiridin-3-il)metil]-2-(etil{cis-4-[(2-metoksietil)(metil)amino]cikloheksil}-amino)-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on, Primer 30, (0.04 g, 8% prinos), ES/MS (m/z): 515 (M+H).

Primer 31

2-[{Trans-4-[ciklopropil(metil)amino]cikloheksil}(etil)amino]-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0347]

1

[0348] LiCl (0.23 g, 5.38 mmol) i PTSA (0.97 g, 5.38 mmol) se dodaju u rastvor 2-[{4-trans-[ciklopropil(metil)amino]cikloheksil}(etil)amino]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetilpiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.55 g, 1.07 mmol) u DMF (5.4 mL) i zagrevaju 1 h na 90 °C. Ohladi na RT i doda se zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa EtOAc i slojevi razdvoje. Organska faza se suši preko anhidrovane Na2SO4, filtrira, koncentruje pod vakuumom i dobijeni ostatak nanese na SCX kertridž, eluira prvo sa MeOH i nakon toga sa 2M NH3u MeOH. Frakcije metanolnog amonijaka se koncentruju pod vakuumom i dobijeni ostatak podvrgne hromatografiji pomoću SFC (CHIRALCEL® OD, 5 mm, 2 x 25 cm), uz izokratno eluiranje na 30% sa mobilnom fazom CO2/MeOH koja sadrži 0.2% DMA pri 65 mL/minute, da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (0.15 g, 29% prinos). ES/MS (m/z): 497 (M+H).

Primer 32

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on

[0349]

[0350] 10% Pd na ugljeniku (0.035 g, 0.033 mmol) se doda u rastvor 5-{ [2-(benziloksi)-4,6-dimetilpiridin-3-il]metil}-2-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](etil)amino}-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (0.084 g, 0.13 mmol) u EtOAc (2 mL) i MeOH (2

1

mL). Reaktivna posuda se napuni sa H2(345 kPa), meša približno 3 h, reaktivna smeša filtrira i koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 20% EtOAc u DCM a nakon toga 0-10% 7N NH3/MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.041 g, 57% prinos) kao žuta guma. ES/MS (m/z): 527 (M+H).

Primer 33

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-(etil{trans-4-[3-(1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}amino)-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4h-tieno[3,2-c] azepin-4-on

[0351]

[0352] 1-(azetidin-3-il)pirazol (0.600 g, 4.87 mmol) se doda u rastvor MeOH (10 mL) koji sadrži DIPEA (1.5 mL, 8.6 mmol), meša 30 min na RT, a nakon toga se doda 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (0.800 g, 1.76 mmol) u THF (10 mL). Meša se 1 h na RT, reaktivna smeša ohladi na -78 °C i doda rastvor 2M LiBH4u THF (0.9 mL, 1.8 mmol). Dobijena smeša se meša 3 h, postepeno zagreje na RT i meša u toku noći. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje i organska faza koncentruje pod vakuumom. Ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji na C-18 silika gelu (100 g, Thermo Scientific Hypersil GOLD™), uz eluiranje sa gradijentom 0-50% ACN koji sadrži 0.1% mravlje kiseline i vode koja sadrži 0.1% mravlje kiseline, rastvarač upari i dobijeni ostatak dodatno podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela (100 g, Thermo Scientific Hypersil GOLD™), uz eluiranje sa gradijentom 0-40% ACN koji sadrži 0.1% mravlje kiseline i vode koja sadrži 0.1% mravlje kiseline. Kombinovane hromatografske frakcije se tretiraju sa zasićenim vodenim rastvorom

1

NaHCO3, ekstrahuju sa DCM, slojevi razdvoje, organska faza suši preko MgSO4, filtrira, filtrat koncentruje pod vakuumom i suši u vakuumskoj pećnici u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje kao pojedinačni izomer (0.047 g, 4.7% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 563 (M+H).

Primer 34

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{etil[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]amino}-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c] azepin-4-on

[0353]

[0354] 3-metoksiazetidin hidrohlorid (0.580 g, 4.69 mmol) se doda u rastvor MeOH (5 mL) i DIPEA (1 mL, 5.7 mmol), meša 30 min na RT, a nakon toga se doda 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[etil(4-oksocikloheksil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (0.600 g, 1.12 mmol, 85% čistoće) u THF (5 mL). Dobijena smeša se meša 1 h na RT, ohladi na -78 °C i doda rastvor 2M LiBH4u THF (1.2 mL, 2.4 mmol).

Dobijena smeša se meša 1 h, zagreje na RT uz mešanje u toku 2 h, a nakon toga reaktivna smeša sipa u ledeno hladan zasićeni rastvor NaHCO3. Ekstrahuje sa DCM (3 x 100 mL), slojevi razdvoje i organska faza koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% MeOH u DCM, da se nakon uparavanja rastvarača dobije smeša trans- i cis-izomera. Trans- i cis- izomeri se razdvoje reverzno faznom hromatografijom preko C-18 silika gela (100 g, Thermo Scientific Hypersil GOLD™), eluiraju sa gradijentom 0-60% ACN u 10 nM vodenom rastvoru NH4CO3, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.0779 g, 13% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 527 (M+H).

1

Primer 35

2-[{Trans-4-[3-(ciklopropiloksi)azetidin-1-il] cikloheksil} (metil)amino]-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0355]

[0356] 3-(ciklopropoksi)azetidin hidrohlorid (0.400 g, 2.67 mmol) se prevede u žitku masu u MeOH (10 mL), dodaju se THF (10 mL) i DIPEA (0.600 mL, 3.44 mmol), meša 30 min na RT, doda se 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[metil(4-oksocikloheksil)amino]-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (0.300 g, 0.577 mmol, 85% čistoće) i dobijena smeša meša na RT u toku noći. Smeša se ohladi na -78 °C i doda rastvor 2M LiBH4u THF (0.700 mL, 1.4 mmol). Dobijena smeša se meša 1 h na -78 °C. Smeša se zagreje na RT, meša 1 h, reaktivna smeša sipa u ledeno hladan zasićeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje i organski sloj koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-5% 7N metanolnog rastvora NH3u DCM. Hromatografske frakcije koje sadrže trans- i cis- izomer se sakupe i koncentruju pod vakuumom. Trans- i cis- izomeri se razdvoje reverzno faznom hromatografijom preko C-18 silika gela (40 g, Thermo Scientific Hypersil GOLD™), uz eluiranje sa gradijentom 5-60% ACN u 10 nM vodenog rastvora NH4CO3, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.0662 g, 21% prinos) kao svetlo braon čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 539 (M+H).

Primer 36

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{(trans-4-[3-(2-

1

metoksietoksi)azetidin-1-il]cikloheksil}(metil)amino]-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0357]

[0358] 3-(2-metoksietoksi)azetidin (0.437 g, 2.460 mmol) u MeOH (5 mL) i THF (5 mL) koji sadrži DIPEA (0.418 mL, 2.40 mmol) se meša 30 min na RT. Doda se 5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[metil(4-oksocikloheksil)amino]-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (0.35 g, 0.67 mmol) i meša 1 h na RT. Smeša se ohladi na -78 °C i doda rastvor 2M LiBH4u THF (0.87 mL, 1.7 mmol), dobijena smeša se meša 2 h na -78°C i zagreje na RT u toku noći. Smeša se ohladi na -78 °C, doda rastvor 2M LiBH4u THF (0.5 mL, 1.0 mmol) i zagreje na RT. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje, organski ekstrakti suše preko Na2SO4, filtriraju i organski ekstrakti koncentruju pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-40% 10% 7N metanolnog rastvora NH3/DCM u DCM. Hromatografske frakcije koje sadrže trans- i cis- izomere se sakupe i koncentruju pod vakuumom. Trans- i cis- izomeri se razdvoje reverzno faznom hromatografijom preko C-18 silika gela (15.5 g Thermo Scientific Hypersil GOLD™), uz eluiranje sa gradijentom 10-100% ACN u 10 nM vodenog rastvora NH4CO3koji sadrži 5% MeOH, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.036 g, 9% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 557(M+H).

Primer 37

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{[trans-4-(3-etoksiazetidin-1-il)cikloheksil](metil)amino}-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

14

[0360] U 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[metil(4-oksocikloheksil)amino]-5,6,7,8- tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (0.320 g, 0.616 mmol) u THF (10 mL) se dodaju 3-etoksiazetidin hidrohlorid (0.424 g, 3.08 mmol) u MeOH (5 mL) i DIPEA (0.55 mL, 3.15 mmol). Meša se 30 min na RT. Smeša se ohladi na -78 °C i polako dodaje rastvor 2M LiBH4u THF (0.650 mL, 1.3 mmol), Dobijena smeša se meša 1 h na -78°C, zagreje na RT i meša 1 h. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, slojevi razdvoje, organski ekstrakti suše preko Na2SO4, filtriraju i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-70% 10% 7N metanolnog rastvora NH3u DCM do DCM. Hromatografske frakcije koje sadrže trans- i cis- izomere se sakupe i koncentruju pod vakuumom. Trans- i cis- izomeri se razdvoje reverzno faznom hromatografijom preko C-18 silika gela (Phenomenex Luna), eluiraju sa gradijentom 40-75% ACN u 10 nM vodenom rastvoru NH4CO3koji sadrži 5% MeOH, da se nakon uparavanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (0.099 g, 37% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z):

527(M+H).

Primer 38

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil}-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0361]

[0362] U 3-metoksiazetidin hidrohlorid (480 mg, 3.88 mmol) u MeOH (10 mL) i THF (10 mL) se doda DIPEA (1.0 mL, 5.7 mmol) i meša 30 min na RT. U rastvor se doda 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (0.25 g, 0.57 mmol) i meša 1 h na RT.

Reaktivna smeša se ohladi na -78 °C i nakon toga se doda 2M litijum borohidrid u THF (1.0 mL, 2.0 mmol). Nakon 3 h, kupatilo za hlađenje se ukloni i smeša meša 1 h na RT. Reaktivna smeša se sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3i koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji, uz eluiranje sa gradijentom 0-50% ACN (koji sadrži 0.1% mravlje kiseline) u vodi (koja sadrža 0.1% mravlje kiseline). Čiste frakcije se sakupe i koncentruju da se dobije produkt kao so mravlje kiseline. Produkt se kombinuje sa materijalom iz prethodne reakcije koja je izvedena približno 2 puta po sličnom postupku. U kombinovanu smešu produkta se doda zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM, ispere sa slanim rastvorom, suši preko MgSO4i filtrira. Filtrat se koncentruje pod vakuumom i suši u pećnici u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.057 g kombinovana masa, 6% kombinovan prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 512 (M+H). [α]D<20>= -42.80° (c=1.0, MeOH).

Alternativni postupak za Primer 38

[0363] Hlortrimetilsilan (233 ml, 1.83 mol) se u toku 10 minut na temperaturi 25 do 34 °C dodaje u smešu 2-[(1R)-1-[4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil]-5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-3-metil-7,8-di-hidro-6H-tieno[3,2-c]azepin-4-ona (240 g, 0.456 mol) i NaI (267 g, 1.78 mol) u acetonitrilu. Reakcija se zagreva 2 h na 33 do 41 °C. Ohladi na RT i razblaži dva puta sa acetonitrilom (4 L), koncentrujući smešu svaki put do originalne zapremine pod sniženim pritiskom. Smeša se razblaži sa etil acetatom (2.4 L) i vodom (2.4 L) i podesi na pribilžno pH 10 sa NH4OH (380 ml). Dobijeni slojevi se razdvoje, a organski sloj ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (1.9 L). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti filtriranjem preko ploče silika gela, eluira prvo sa 10% EtOH u EtOAc, nakon toga sa smešom 5% 7N NH3u MeOH i 10% EtOH u EtOAc. Metanolni amonijum filtrat se upari i dobijeni ostatak triturira sa acetonom (3 zapremine) na 0 °C. Suši se pod vakuumom na RT da se dobije naslovljeno jedinjenje (186.4 g, 80% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 512 (M+H).

Primer 39

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1H-piridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-[4-(3-pirazol-1-ilazetidin-1-il)cikloheksil]etil]-7,8-dihidro-6H-tieno[3,2-c]azepin-4-on

[0364]

[0365] THF (5 mL) i DIPEA (0.500 mL, 2.87 mmol) se dodaju u rastvor 1-(azetidin-3-il)pirazola (0.380 g, 3.09 mmol) u MeOH (5 mL), Dobijena smeša se meša 30 min na RT, doda se 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-(4-oksocikloheksil)etil]-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on (0.400 g, 0.763 mmol, 84% čistoće) i smeša meša u toku noći na RT. Reaktivna smeša se ohladi na -78 °C i doda se rastvor 2M LiBH4u THF (0.720 mL, 1.4 mmol), Dobijena smeša se meša 2 h na -78 °C, zagreje na RT, meša 2 h, smeša sipa u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHCO3, ekstrahuje sa DCM (3x100 mL), slojevi razdvoje i kombinovane organske faze koncentruju pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne reverzno faznoj hromatografiji preko C-18 silika gela, uz eluiranje sa gradijentom 5-60% ACN u 10 nM vodenom rastvoru NH4CO3, da se nakon uparavanja rastvarača i sušenja pod vakuumom dobije naslovljeno jedinjenje (0.110 g, 26% prinos) kao bela čvrsta supstanca i. ES/MS (m/z): 548 (M+H).

14

Primer 40

2-{(1R)-1-[Trans-4-(dimetilamino)cikloheksil]etil}-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on metansulfonat

[0366]

[0367] MsOH (9.1 mg, 94.3 mmol) se doda u suspenziju 2-{(1R)-1-[trans-4-(dimetilamino)cikloheksil]etil}-5-[(4,6-dimetil-2-okso-1 ,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (42.9 mg, 90.5 mmol) u MeOH (2 mL) i sonicira da se dobije bezbojni rastvor. Rastvor se koncentruje pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (47.8 mg, 93.8% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 454.3 (M-H).

Primer 41

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(5-metil-1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on metansulfonat

[0368]

[0369] Rastvor MsOH (1.55 µL, 0.0238 mmol) u MeOH (1 mL) se doda u rastvor 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1H-piridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-[4-[3-(5-metilpirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil]etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-ona (12.7 mg, 0.023 mmol) u MeOH (2 mL). Smeša se sonicira da se dobije bistar rastvor. Koncentruje se pod vakuumom i dobijeni ostatak suši u pećnici na približno 40 °C, nakon toga nekoliko dana na RT da se dobije naslovljeno jedinjenje (13.8 mg, 84% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 548 (M+H).

Primer 42

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(3-metil-1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-on metansulfonat

[0370]

[0371] MsOH (1.73 µL, 0.0265 mmol) se doda u suspenziju 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-3-metil-2-[(1R)-1-{trans-4-[3-(3-metil-1H-pirazol-1-il)azetidin-1-il]cikloheksil}etil]-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4(5H)-ona (14.5 mg, 0.027 mmol) u MeOH (2 mL). Rastvor se koncentruje pod vakuumom i dobijeni ostatak suši 2 h u vakuumskoj pećnici na 50 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (15.1 mg, 89% prinos) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS (m/z): 548 (M+H).

Primer 43

14

5-[(4,6-Dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-[(1R)-1-{trans-4-[(2-metoksietil)(metil)amino]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-C]piridin-4(5H)-on

[0372]

[0373] 5-[(2-metoksi-4,6-dimetil-3-piridil)metil]-2-[(1R)-1-{trans-4-[2-metoksietil(metil)amino]cikloheksil}etil]-3-metil-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridin-4-on (48.0 mg, 0.093 mmol) se rastvori u DMF (3.0 mL). Dodaju se LiCl (30.0 mg, 0.71 mmol) i PTSA (30mg, 0.16 mmol). Smeša se zagreva 4 h na 60 °C. Ohladi na RT i meša u toku noći.

Razblaži sa EtOAc (30 mL) i vodom (3 mL). Sloj etil acetata se ekstrahuje sa vodom i EtOAc faze suše preko MgSO4. Filtrira i filtrat koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu, uz eluiranje sa gradijentom 0-10% MeOH u DCM, da se nakon uklanjanja rastvarača dobije naslovljeno jedinjenje (47 mg, kvantitativni prinos) kao beli prašak. ES/MS (m/z): 500 (M+H).

Biološka ispitivanja

[0374] Ekspresija EZH2 je u literatura bila povezana sa više tipova kancera, na primer, limfomima (Velichutina, I. i saradnici (2010) Blood 116:5247-55; Sneeringer, C.J. i saradnici (2010) Proc Natl Acad Sci USA.107:20980-5; McCabe i saradnici (2012) Nature 492:108-12. Béguelin, W. i saradnici (2013) Cancer Cell 23:677-92; Knutson, S.K. i saradnici Mol Cancer Ther 13:842-54), rabdoidnim tumorima (Knutson, S.K. i saradnici (2013) Proc Natl Acad Sci U S A.110: 7922-7), tumorima koji nemaju ili su deficitarni sa SNF5 (Wilson, B.G. i saradnici (2010) Cancer Cell 18:316-28), sarkomima (Kadoch i Crabtree (2013) Cell 153:71-85; Shen i saradnici (2016) Sci Rep 6:25239), multiple mijelomima (Kalushkova, A. i saradnici (2010) PLoS One 5:e11483; Popovic, R. i saradnici (2014) PLoS Genet.10:e1004566; Hernando, H. i saradnici (2016) Mol Cancer Ther.15(2):287-98;

14

Agarwal, P i saradnici (2016) Oncotarget 7:6809-23), melanomom (Zingg i saradnici(2015) Nat Commun. 6:6051; Barsotti, A.M. i saradnici (2015) Oncotarget 6(5):2928-38; Souroullas, G.P. i saradnici (2016) Nat. Med.22:632-40), kolorektalnim kancerom (Nagarsheth, N. i saradnici (2016) Cancer Res. 76:275-82), kancerom pluća (Byers, L.A. i saradnici (2012) Cancer Discov.2:798-811; Behrens, C. i saradnici (2013) Clin Cancer Res.19:6556-65;

Riquelme, E. i saradnici (2014) Clin Cancer Res.20:3849-61; Fillmore, C.M. i saradnici (2015) Nature 520:239-42), kancerom bubrega (Adelaiye, R. i saradnici (2015) Mol Cancer Ther.14(2):513-22), kancerom dojke (Kleer, C.G. i saradnici (2003), Proc Natl Acad Sci U S A. 100:11606-11; Ren i saradnici (2012) Cancer Res 72:3091-104), kancerom jajnika (Bitler i saradnici (2015) Nat Med 21:231-8) i kancerom prostate (Varambally, S. i saradnici (2002) Nature 419:624-9; Yu, J. i saradnici (2007) Cancer Res.67:10657-63; Varambally, S. i saradnici (2008) Science 322:1695-9; Yu, J. i saradnici (2010) Cancer Cell 17:443-54).

[0375] Rezultati niže navedenih ispitivanja pokazuju da su jedinjenja iz primera 1-43 EZH2 inhibitori i da jedinjenja iz ovog pronalaska, na primer, Primeri 1, 9, 13, 22 i 38, mogu da budu korisna u lečenju kancera. Kako se ovde koristi, "IC50" se odnosi na koncentraciju sredstva koja produkuje 50% maksimalno mogućeg inhibitornog odgovora za to sredstvo, (relativna IC50) ili koncentraciju sredstva koja produkuje 50% inhibicije aktivnosti ciljanog enzima u poređenju sa placebo kontrolom (apsolutna IC50).

Biohemijsko ispitivanje EZH2 WT/Y641N mut na ploči sa 384 udubljenja

[0376] Cilj ovog ispitivanja je da se izmeri efekat jedinjenja na katalitičku aktivnost EZH2 WT/Y641N u kontekstu PRC2 kompleksa.

[0377] Ekspresuju se FLAG-označeni EZH2 ili EZH2 Y641N kao PRC25-članog (5-mer) kompleksa koji se sastoji od EZH2, EED, SUZ12, RBBP4 i AEBP proteina upotrebom sistema ekspresije bakulovirusa u Sf9 ćelijama i prečiste koristeći FLAG® Affinity Purification (Sigma-Aldrich). Kompleks enizima se razblaži do osnovnog rastvora od 3.33 nM (6.67 nM za mut analizu) sa puferom za analizu (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 10 mM DTT, 0.005% TRITON®-X 100). U WT analizi, razblaži se non-biotin lizin 27 tri-metilovani histon H3 (21-44) koaktivator peptida (CPC Scientific Cat # 869799) u prethodnom osnovnom rastvoru enzima do finalne koncentracije od 13.33 nM. Razblaži se biotin histon H3 (21-44) supstrat peptida (ostaci 21-44, CPC Scientific Cat# 811115) za WT analizu ili biotin lizin 27 di-metilovanog histona H3 (21-44) supstrat peptida (CPC Scientific, Cat# 830754) za mut

14

analizu sa 3H-SAM (adenozil-L-metionin, S-(metil)-3H(Adomet), lot 169500/12, 15 Ci/mmol ili 0.55 mCi/mL, 36.7 µM, Perkin Elmer NET155) do finalne koncentracije od 4 µM (WT analiza) ili 2 µM (mut analiza) u puferu za analizu.

[0378] Dodaju se test jedinjenja u 100% DMSO (50 µL od 4 mM osnovnog rastvora za WT analizu ili 50 µL od 0.2 mM osnovnog rastvora za mut analizu) u NUNC™ ploču sa 384 udubljenja (Thermo Scientific, Cat# 264573). Stavi se 20 µL 100% DMSO u udubljenja za razblaživanje. Izvrše se 3x serijska razblaženja prenošenjem po 10 µL iz jednog udubljenja u sledeće. U WT analizi, izmeša se 2 µL serijski razblaženog jedinjenja sa 38 µL DMSO u Labcyte ploči sa 384 udubljenja (Cat# P-05525), dok se u mut analizi, prenese svih 20 µL serijski razblaženog jedinjenja u Labcyte ploču sa 384 udubljenja male zapremine (Cat# LP-0200). 200 nL (WT analiza) ili 100 nL (mut analiza) jedinjenja se akustično prenese u prijemnu ploču za analizu sa 384 udubljenja (Corning 3706). U WT analizi, dispenzuje se 15 µL smeše enzim/tri-metil H3 ko-aktivatora peptida u ploči za analizu, a nakon toga se doda 5 µL smeše biotin H3 peptid supstrat/3H-SAM. Ploče se zatvore i mućkaju 2 h na RT. Finalni uslovi analize su 2.5 nM enzim kompleksa, 10 nM tri-metil histon/ko-aktivator H3 peptida, 1 µM biotin supstrata peptida, 1 µM 3H-SAM i test jedinjenje u najvećoj koncentraciji od 1 µM (WT analiza); ili 5 nM enzim kompleksa, 0.5 µM biotin supstrata peptida, 0.5 µM 3H-SAM i test jedinjenje u najvećoj koncentraciji od 1 µM (mut analiza). Rekonstitutuišu se itrijum silikat streptavidin SPA perlice (Perkin Elmer, Cat# RPNQ0012) od 1 mg/mL (WT analiza) ili 0.5 mg/mL (mut analiza) u 3 M gvanidin-HCL. Smeša perlica se doda u ploče za analizu u količini od 20 µM po udubljenju, mućka 10 min i ostavi da stoji 1 h na RT pre brojanja na MICROBETA®. Izračunaju se osnovni rezultati (CPM) i usklade sa % inhibicije koristeći Genedata Assay analajzer kao % inhibicije = 100 - [(CPM test jedinjenja – CPM srednjeg minimuma) / (CPM srednjeg maksimuma – CPM srednjeg minimuma) x 100]. Nanesu se usklađeni rezultati i izrade krive koristeći GENEDATA® Condoseo kao % inhibicije (y osa) u odnosu na log koncentracije jedinjenja (x-osa) i odrede IC50vrednosti koristeći 4-parametarski nelinearni logistički algoritam. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se testiraju ovom analizom u osnovi isto kako je prethodno opisano. Na primer, jedinjenja iz Primera 1 i 20 imaju biohemijske IC50resultate koji pokazuju inhibiciju aktivnosti metiltransferaze rekombinantnog WT/mut EZH2 u kontekstu PRC2 kompleksa. Na primer, jedinjenje iz Primera 1 pokazuje IC50od 2.06±1.90 nM (n=5) za WT 5-mer EZH2 i 2.1160.58 nM (n=2) za mut 5-mer EZH2. Jedinjenje iz Primera 22 pokazuje IC50od 3.2961.24 nM (n=3) za WT 5-mer EZH2 i 7.21 nM (n=1) za mut 5-mer EZH2. Jedinjenje iz Primera 38 pokazuje

14

IC50od 0.92360.091 nM (n=2) za WT 5-mer EZH2 i 2.65 nM (n=1) za mut 5-mer EZH2.

ELIZA na bazi H3K27me3 ćelija

[0379] Cilj ove analize je da se proceni sposobnost jedinjenja da inhibira funkcionalnu aktivnost EZH2 u ćelijama merenjem nivoa tri-metilisanog H3K27 u ćeliji. Stave se Karpas-422 (EZH2 Y641N) ćelije u količini od 5,000 ćelija/100 µL/udubljenje u crne poli-lizin ploče BD BIOCOAT® Cellware sa 96 udubljenja (BD Biosciences, Cat# 354640). Jedinjenje se pripremi u pločama u NUNC™ polipropilen MICROWELL™ ploči sa 96 udubljenja (Thermo Scientific Cat# #249944) dodavanjem po 40 µL/udubljenje od 10 mM jedinjenja (što predstavlja početnu finalnu koncentraciju od 20 µM) ili po 40 µM DMSO, a nakon toga se izrade serijska razblaženja prenošenjem po 20 µM iz jednog udubljenja u sledeće. Doda se 5 µM test jedinjenja u 245 µL/udubljenje medijuma za rast u posebnoj NUNC™ polipropilen MICROWELL™ ploči sa 96 udubljenja i po 11 µL smeše jedinjenje/medijum se nanese na ploče sa ćelijama. Ploče sa ćelijama se ostave 48 h u inkubatoru na 37 °C. Nakon toga se ploče izvade iz inkubatora, ostave na sobnoj temperaturi 15-20 minuta a nakon toga centrifugiraju 5 minuta pri 1000 opm. Ćelije se fiksiraju sa 30 µL 16% paraformaldehida 15 min na RT. Paraformaldehid se ukloni a ćelije se permeabilizuju sa 100 µL/udubljenje PBS bez kalcijuma ili magnezijuma (-/-) koji sadrži 0.1% TRITON® X-10020 min na RT. Ploče se isperu sa PBS(-/-) (2x), a nakon toga inkubiraju 2 h na RT sa 50 µL/udubljenje rastvora primarnog antitela (Diagenode anti-H3K27me3 MAb-181-050; 1:3000 razblaženje u PBS plus kalcijum i magnezijum (+/+) koji sadrži 1% BSA). Ploče se isperu sa PBS-/-, (3x) a nakon toga inkubiraju sa 50 µL/udubljenje rastvora sekundarnog antitela (Invitrogen kozji anti-mišji IgG Alexa 488, Cat# A11001; 1:1000 razblaženje u PBS+/+) u toku 1 h na RT zaštićeno od svetlosti. Ploče se isperu sa PBS-/-, (3x), a nakon toga se doda po 50 µL/udubljenje od 5 µg/mL propidijum jodida (Invitrogen; Cat# p3566) rastvora za bojenje u PBS koji sadrži 200 µg/mL RNase (Invitrogen; Cat# 12091021). Ploče se pokriju sa crnim prekrivačem ploča i skeniraju na ACUMEN® laser skenirajućem citometru (TTP Lab Tech) sa Ex 488nm/Em 505 nm-530 nm (H3K27m3 signal) i LP655nm (signal nuklearnih ćelija). Jedinjenja iz pronalaska mogu da se testiraju ovim analizama u potpunosti kako je prethodno opisano. Na primer, jedinjenje iz Primera 1 pokazuje IC50za H3K27me3 ćelije od 19.2±1.55 nM (n=2) ili 23.6±20.5 nM (n=6) u MDA MB-231 i Karpas-422, tim redom. Jedinjenje iz Primera 22 pokazuje IC50za H3K27me3 ćelije <1 nM (n=1) ili 0.0148±0.0147 nM (n=6) u

14

MDA MB-231 i Karpas-422, tim redom. Jedinjenje iz Primera 38 pokazuje IC50za H3K27me3 ćelije od 0.00973±0.00956 nM (n=4) u Karpas-422.

Ispitivanje proliferacije za Karpas-422

[0380] Cilj ove analize je da pokaže sposobnost test jedinjenja da inhibira rast ćelija tumora in vitro.

[0381] Karpas-422 ćelije u gustini od 5000 ćelija/100 µL/udubljenje se nanesu u 96 udubljenja, crnih BD BIOCOAT® Cellware, polilizin ploča sa 96 udubljenja (BD Biosciences, Cat# 354640).40 µL od 10 mM test jedinjenja (predstavlja početnu finalnu koncentraciju od 20 µM) ili 100% DMSO se doda u NUNC™ polipropilen MICROWELL™ ploču sa 96 udubljenja (Thermo Scientific Cat# #249944). Izrade se serijska razblaženja prenosom po 20 µL iz jednog udubljenja u naredno. Doda se 5 µL jedinjenja u 245 µL/udubljenje medijuma za rast u posebnoj NUNC™ polipropilen MICROWELL™ ploči sa 96 udubljenja i po 11 µL smeše jedinjenje/medijum se nanese na ploče sa ćelijama. Ploče sa ćelijama se inkubiraju 7 dana na 37 °C. U ploče sa ćelijama se doda 100 µL/udubljenje Cell Titer GLO® reagensa (Promega, Cat# G7671). Mućka se 2 minuta i meri luminescencija pomoću čitača ploča. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se testiraju ovom analizom u potpunosti kako je prethodno opisano. Na primer, jedinjenje iz Primera 1 pokazuje IC50od176±165 nM (n=5). Jedinjenje iz Primera 22 pokazuje IC50od 84.5±42.7 nM (n=5).

Jedinjenje iz Primera 38 pokazuje IC50od 10.1±4.6 nM (n=4).

Ksenograft studije

[0382] Cilj ove analize je da se proceni sposobnost test jedinjenja da inhibira funkciju EZH2 tumora i rast tumora posredstvom EZH2 in vivo.

[0383] Sprovedu se in vivo studije ciljane inhibicije i efikasnosti sa jedinjenjem iz Primera 1 pomoću Karpas-422 ksenograft modela u potpunosti kako su opisali McCabe i saradnici (2012) Nature 492:108-12, uz sledeće izmene/specifikacije: 1) korišćena je hidroksietilceluloza (1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipeneće sredstvo) umesto 20% CAPTISOL® u formulaciji vehikuluma; 2) jedinjenje je primenjeno oralnom gavažom pre nego intraperitonealnom injekcijom; 3) tretman sa jedinjenjem je započet kada su zapremine tumora dostigle opseg od 150-200 mm<3>za eksperiment efikasnosti i 300-350 mm<3>za

1

eksperimente ciljane inhibicije i; 4) merenje inhibicije metilacije tumora ili ekspresije TNFRSF21 na dan 7 umesto na dan 10.

Merenje tri metiliranih H3K27 izdvojenih iz tumora pomoću ELISA

[0384] Za kiseli ekstrakt histona iz tumora, isečci tumora od približno 0.5 cm sa 0.25 cm ili 20-30 mg težine se stave u Lysing Matrix D 500 x 2 mL. Doda se u epruvete sa perlicama za homogenizaciju bez RNASE/DNASE (MP Biomedicals, Cat# 6913-500). Doda se 650 µL pufera za kiselu lizu (0.4 N HCl koji sadrži Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche; Cat# 11836153001)). Uzorci tumora se homogenizuju 2-3 puta brzinom od 6 m/sekundi u toku 20 sekundi u FASTPREP® FP120 homogenizatoru. Uzorci se ostave 1 sat na ledu da se razdvoje. Supernatanti se prenesu u Eppendorf kivetu i stave na rotator kivete za lizu u toku noći na 4°C. Uzorci se centrifugiraju 10 minuta pri 8000 opm na 4°C. Supernatanti se prenesu u novu kivetu i meri koncentracija proteina.

[0385] Doda se 150 µL/udubljenje MSD blokirajućeg rastvora A (Meso Scale Discovery (MSD); finalne koncentracije od 3%) u MULTI-SPOT® Tri-metil-histon H3(K27) SINGLEPLEX® ploču (MSD; Cat#: N45CA-1). Mućka se 1 h na RT. Ploča se ispere jedanput sa IX MSD Tris Wash Buffer™ (MSD), (3x). Prenese se po 0.25 µg lizata tumora u 25 µL pufera za kiselu lizu po udubljenju, u triplikatu. Mućka se u toku noći na 4 °C. Ploča se tri puta ispere sa IX MSD Tris Wash Buffer™. Doda se 25 µL/udubljenje SULFO-TAG™ -Trimetil-Histone H3 (K27) antitela za detekciju razblaženog do finalne koncentracije od 1.5 µg/µL u puferu za razblaženje antitela (finalne koncentracije 1% MSD Blocker-A; 0.1% MSD Blocker D-B i 0.1% MSD® Blocker D-G). Mućka se 1-2 h na RT. Ploča se ispere tri puta sa IX MSD Tris puferom za ispiranje. Ploča se fiksira dodavanjem 100 µL/udubljenje 4% formaldehida u PBS. Mućka se 30 min na RT. Ploče se isperu tri puta sa 1x MSD Tris puferom za ispiranje. Doda se 150 µL/udubljenje IX MSD® pufera za očitavanje i meri hemoelektroluminescencija pomoću MSD SECTOR® Imager 6000 instrumenta. Jedinjenje iz pronalaska može da se testira ovom analizom u potpunosti kako je prethodno opisano. Na primer, BID primena na miševima 50 mpk jedinjenja iz Primera 1 ima za rezultat 53% inhibicije metilacije tumora (n=8 miševa; p<0.0001). BID primena na miševima 15 mpk jedinjenja iz Primera 38 ima za rezultat 73% inhibicije metilacije tumora (n=8 miševa; p<0.0001).

1 1

Merenje ekspresije TNFRSF21 mRNK dobijene iz tumora na bazi qPCR

[0386] Za izdvajanje RNK iz tkiva tumora, isečci tumora od približno 0.5 cm sa 0.25 cm ili 20-30 mg težine se stave u Lysing Matrix D 500 x 2 mL. Doda se u epruvete sa perlicama za homogenizaciju bez RNKSE/DNASE (MP Biomedicals, REF: 6913-500). Doda se 650 µL RLT pufera RNEASY® Kit (Qiagen; Cat#74104). Uzorci se homogenizuju 2 do 3 puta pri brzini 6 u toku 20 sekundi u FASTPREP® FP120 homogenizatoru. Uzorci se ostave 10 minuta na ledu da se ohlade. Centrifugiraju se 10 minuta pri 13000 opm na 4°C. Supernatanti se stave u QIA kivetu i RNK izoluje koristeći RNEASY® Kit (Qiagen; Cat#74104).

[0387] Izradi se cDNK od 3 µg RNK tumora koristeći kit reverzne transkripcije cDNK velikog kapaciteta (Applied Biosystems; Cat# 4368813) i uzorci inkubiraju u PCR Thermocikleru uz sledeće uslove ciklusa: 10 min na 25 °C; 2 h na 37 °C, zadržavanje na 4°C. Produkt cDNK se pojača koristeći Thermo Scientific ABsolute Blue QPCR ROX Mix (Applied Biosystems; Cat# AB-4139) i Taqman probe za TNFRSF21 (Applied Biosystems; Cat# Hs01560899_ml) i GAPDH gen sa stabilnom ekspresijom (Applied Biosystems; Cat# Hs02758991-gl) u Applied Biosystems ViiA 7™ Real-Time PCR cikleru. Izračunaju se vrednosti praga TNFRSF21 ciklusa i normalizuju sa vrednostima GAPDH njihovih odgovarajući uzoraka. Jedinjenje iz ovog pronalaska može da se testira ovom analizom u potpunosti kako je prethodno opisano. Na primer, BID primena 50 mpk jedinjenja iz Primera 1 ima za rezultat povećanje od 25 puta u ekspresiji TNFRSF21 gena tumora (n=8 miševa; p<0.0001). BID primena 15 mpk jedinjenja iz Primera 38 ima za rezultat povećanje od 60 puta u ekspresiji TNFRSF21 gena tumora (n=8 miševa; p<0.0001).

Kombinovani tretmani sa EZH2 inhibitorima i drugim hemoterapeutskim sredstvima za kancer

[0388] Naredni odeljci obezbeđuju dokaz kojim se podržava upotreba EZH2 inhibitora, uključujući, ali bez ograničenja na Primer 1 ili Primer 38, samog i/ili u kombinaciji sa standardnim vodičem za upotrebu u hemoterapiji (SoC), u tretmanu kancera jajnika, želuca, pluća i kolorektuma zajedno sa kombinacijama mutacija u komponentama SWI/SNF kompleksa i/ili MLL kompleksa i/ili PI3K puta. Ovo uključuje ali bez ograničenja samo na kancere jajnika koji nemaju ekspresiju ARID1A proteina kombinovano sa mutacijama u PTEN ili PIK3CA i/ili ekspresiju konstitutivnog proteina fosforilisanog Akt na treoninu 308

1 2

(Thr308). Pored toga, ovo uključuje ali bez ograničenja samo na, kancere jajnika kod kojih nema ekspresije ni SMARCA2 ni SMARCA4 proteina. Pored toga, ovo uključuje ali bez ograničenja samo na kancere želuca zajedno sa mutacijama heterozigotnog gubitka funkcije (LOF) (uključujući ali bez ograničenja na, mutacije gluposti, okvira i kodiranje-spajanje) u kombinaciji ARID1A sa mutacijama heterozigotnog LOF u MLL2 i koji ne podnosi homozigotne mutacije u TP53. Pored toga, ovo uključuje ali bez ograničenja samo na kancere želuca kod kojih postoji heterozigotna LOF mutacija (uključujući ali bez ograničenja na, mutacije gluposti, okvira i kodiranje-spajanje) u kombinaciji ARID1A sa mutacijom u PTEN ili PIK3CA i/ili ekspresiju Akt fosforilisanog konstitutivnog proteina na Thr308 i koji ne podnosi homozigotnu mutaciju u TP53. Pored toga, ovo uključuje ali bez ograničenja samo na kancere pluća sa heterozigotnim LOF mutacijama u MLL3. Pored toga, ovo uključuje ali bez ograničenja samo na kancere kolorektuma sa heterozigotnim LOF mutacijama u ARID1A u kombinaciji sa mutacijama u PTEN ili PIK3CA i/ili ekspresiju Akt fosforilisanog konstitutivnog proteina na Thr308.

[0389] Testirane su ćelijske linije kancera jajnika na odgovor na Primer 1 ili Primer 38 u analizi proliferacije 7 dana ili 10 dana. Svaka ćelijska linija se optimizuje za broj ćelija i raspored cepanja kojim se maksimizuje logaritam faze rasta u formatu sa 96 udubljenja u periodu od 7 ili 10 dana. Ćelije se stave u crnu ploču providnog dna sa 96 udubljenja obloženih poli-D-lizinom (BD BioSciences; BD BIOCOAT™ Cellware, Poly-Lysine, Cat. #354640) na dan 0 u ukupnoj zapremini od 90 µL medijuma za ćelijsku kulturu i inkubiraju 18-24 h na 37 °C/5% CO2. Na dan 1 se pripremi ploča za razblaživanje jedinjenja dodavanjem 150 µL medijuma koji sadrži 2% dimetil sulfoksida (DMSO; Sigma-Aldrich Cat. #D2438) u kolone 3-12 ploče sa 96 udubljenja ravnog providnog dna (CORNING® COSTAR® ploča za kulturu ćelija Cat #3596). Izrade se osnovni rastvori Primera 1 ili Primera 38 koncentracije 10 mM u 100% DMSO i dalje razblaže do potrebne koncentracije od 200 µM u medijumu za kultuturu ćelija. Doda se 225 µM Primera 1 ili Primera 38 u kolonu 2 ploče za razblaženje jedinjenja i izrade 1:3 serijska razblaženja test jedinjenja u 10 tačaka u kolonama 3 do 12. U ploče sa ćelijama se doda po 10 µL serijski razblaženog jedinjenja, čime se dobija finalna koncentracija test jedinjenja u rasponu od 1 nM do 20 µM i finalna koncentracija DMSO od 0.2%. Na kraju perioda ispitivanja od 7 ili 10 dana, ćelije se podvrgnu CELLTITER-GLO® luminiscentnom ispitivanju vijabilnosti ćelija (Promega, Cat. #G7570) kako sledi: 1) otopi se CELLTITER- GLO® pufer i uravnoteži na sobnoj temperaturi; 2) liofilizirani CELLTITER-GLO® supstrat se uravnoteži na sobnoj temperaturi; 3) CELLTITER-GLO® pufer se prenese

1

u bocu sa supstratom da se formira CELLTITER-GLO® reagens; 4) ploče sa ćelijama se uravnoteže na sobnoj temperaturi; 5) samo za adherentne ćelije – iz ploča sa ćelijama se ukloni medijum; 6) u svako udubljenje se doda po 25 µL CELLTITER-GLO® reagensa; 7) ploče se ostave da se inkubiraju dodatnih 20-30 minuta na sobnoj temperaturi; 8) luminescencija se očitava na Perkin Elmer EnVision 2104 Multi Detection Microplate čitaču.

[0390] Izdvoje se lizati celih ćelija ćelijskih linija kancera jajnika kako su opisali Ye, X.S. i saradnici (1997) Methods Enzymol.283:520-32 i mere Western blot postupkom na ekspresiju proteina SWI/SNF kompleksa, MLL kompleksa i komponenti PI3K puta, uključujući ARID1A, SMARCA2, SMARCA4 (koristeći 3-8% SDS-PAGE) i fosforilisani Akt na Thr308 (koristeći 4-20% SDS-PAGE), korišćenjem sledećih antitela: anti-ARIDIA (Betil, Cat.

#A301-040A); anti-SMARCA2/BRM (Abcam, Cat. # ab15597); anti-BRG1/SMARCA4 (Betil, Cat. #A300-813A) i anti-fosfo-Akt (Thr308) antitelo D25E6 (Cell Signaling, Cat. #13038). Za merenje ukupnog Akt i nivoa aktina kao kontrole za ukupne proteine, koriste se anti-Akt (pan) antitelo 40D4, (Cell Signaling, Cat. #2920) i anti-β-aktin AC-74 (Sigma, Cat. #A2228) antitela.

[0391] U Tabeli 1 su sumirani efekti Primera 38 na panel ćelijskih linija jajnika i pokazana je osetljivost na EZH2 inhibitore u ćelijskim linijama kancera jajnika koje su ili obe AR1D1A-negativne i fosforilisane na Thr308 na Akt ili nema ekspresije ni u SMARCA2 ni u SMARCA4.

1 4

Tabela 1. Efekat Primera 38 na proliferaciju 9 ćelijskih linija kancera jajnika, kao i na profile ekspresije proteina njihovih SWI/SNF i komponenti PI3K puta

[0392] Efekat Primera 38 u poređenju sa SoC terapijom kancera jajnika sa karboplatinom plus paklitakselom je testiran in vivo koristeći A2780 ksenograft model. Subkutano se implantira 2 miliona A2780 ćelija u 50% MATRIGEL® u desni zadnji bok 10 atimičnih obrijanih miševa (Envigo RMS, Inc., Indianapolis, IN) po grupi. Tretman se započinje kada zapremine tumora dostignu 100-150 mm<3>. Životinje se prvo 5 dana tretiraju sa Primerom 38 a nakon toga se zajedno primene Primer 38 i SoC najmanje naredna 23 dana ili sve dok tumor tretiran vehikulumom ne dostigne zapreminu od 2000 mm<3>. Primer 38 se formuliše u 1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipenećeg sredstva i primeni 50 mpk dva puta dnevno (BID) oralnom gavažom (p.o.). Karboplatin (APP Pharmaceuticals NDC 63323-172-60) se formuliše u puferu fosfatnih soli (PBS) i primeni 60 mpk svake 2 nedelje (Q14D) intraperitonealnom (i.p.) injekcijom. Paklitaksel (Hospira, Inc NDC 61703-342-50) se formuliše u PBS i primeni 10 mpk Q14D intravenskom (IV) injekcijom. Meri se inhibicija rasta tumora kao ΔT/C (%), izračuna se kao prosek pojedinačne životinje [(zapremina tumora 28 dana tretiranog Primerom 38 minus zapremina na dan 0), podeljeno sa (zapremina tumora tretiranog 28 dana vehikulumom minus zapremina tumora na dan 0)] pomnoženo sa 100. U Tabeli 2 su sumirani

1

rezultati efekata Primera 38 i SoC za kancer jajnika na rast A2780 tumora na dan 28 tretmana. Nasuprot slabom efektu samog SoC na rast A2780 tumora, uočena je značajna inhibicija rasta A2780 tumora nakon tretmana sa 50 mpk BID p.o. samog Primera 38 i nakon tretmana sa 50 mpk QD p.o. Primera 38 u kombinaciji sa SoC.

Tabela 2: efekat Primera 38, SoC za kancer jajnika karboplatin plus paklitaksel i Primera 38 u kombinaciji sa SoC na rast A2780 tumora, na dan 28 doziranja.

[0393] START Discovery (http://startdiscovery.net/) ima platformu modela tumora dobijenih od pacijenta. Izaberu se dva START Discovery modela jajnika dobijenih od pacijenta na bazi prisustva ili odsustva gubitka funkcije SWI/SNF i mutacija PI3K puta i ispita se START Discovery na efekat Primera 1 na rast tumora. Dve grupe sa po 2 miša se tretiraju 28 dana. Grupa 1 se tretira sa standardnim protokolom (SoC) za karcinom jajnika jedinjenjima karboplatin (formulisan u 0.9% NaCl i primenjen kao 60 mpk Q14D i.p.) i paklitaksel (formulisan u 0.9% NaCl i primenjen kao 10 mpk Q14D IV). Grupa 2 se prethodno tretira sa Primerom 1 (formulisan u 1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipenećeg sredstva i primenjeno kao 50 mpk BID p.o.) u toku 5 dana, a nakon toga se zajedno primenjuju Primer 1 i SoC u toku 23 dana ili dok zapremina tumora ne dostigne 2000 mm<3>. Modeli koji ispoljavaju staze ili regresiju tumora sa kombinovanim tretmanom na dan 28 se nakon prekida doze prate sve dok se ne uoči ponovni rast tumora. Poredi se prosečan % promene u zapremini tumora u poređenju sa zapreminom početnog tumora na dan 0 i izračuna se kao prosek za pojedinačnu životinju [(zapremina tumora na dan x tretmana minus zapremina tumora na dan 0), podeljeno sa zapreminom tumora na dan 0], pomnoženo sa 100. U Tabeli 3 je sumiran efekat tretmana sa Primerom 1 na rast modela tumora jajnika dobijenih od dva pacijenta. ST884 – model tumora jajnika dobijen od pacijenta pokazuje značajnu inhibiciju rasta tumora koji ima homozigotnu mutaciju u ARID1A kombinovanu sa mutacijom u PIK3CA tretmanom sa

1

Primerom 1. Nasuprot tome, ST416 - model tumora jajnika dobijen od pacijenta koji je heterozigotni mutant ARID1A i i bez mutacije u PIK3CA ili PTEN – ne pokazuje inhibiciju rasta tumora tretmanom sa Primerom 1.

Tabela 3: efekat standardnog protokola (SoC) za kancer jajnika sa karboplatinom i paklitakselom ili kombinacije Primer 1 plus SoC, na rast modela tumora jajnika dobijenih od 2 pacijenta.

[0394] Oncotest (http://www.oncotest.com/) je takođe formirao veliku kolekciju isečaka tumora pacijenata prenetih direktno od pacijenata i subkutano unetih u obrijane miševe kao PDXs. Izabere se 9 Oncotest gastričnih PDXa na bazi prisustva gubitka funkcije (LOF) SWI/SNF i/ili mutacija MLL kompleksa i testira sa Oncotest na efekat Primera 1 ili vehikuluma na rast tumora. Za modele GXA-3011, testira se 5 životinja po grupi i 28 dana tretira ili sa vehikulumom (1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipeneće sredstvo) ili sa Primerom 1 sa 50 mpk BID p.o. Modeli koji ispoljavaju staze ili regresiju tumora na dan 28 nakon prekida doze se prate sve dok se ne uoči ponovni rast tumora. Izračunava se ΔT/C (%) kao prosek za pojedinačnu životinju [(zapremina tumora nakon tretmana Primerom 1 ≥ 28 dana minus zapremina tumora na dan 0), podeljeno sa (zapremina tumora tretirana vehikulumom ≥ 28 dana minus zapremina tumora na dan 0)], pomnoženo sa 100.

[0395] Za druge Oncotest gastrične PDXs, tretirane su 2 grupe svaka sa po 2 miša u toku 28 dana. Grupa 1 je tretirana po standardnom protokolu za gastrični kancer (SoC) jedinjenjima oksaliplatin (formulisano u 5% glukoze i primenjeno 8 mpk Q14D i.p.) i paklitakselom (formulisano u 0.9% NaCl i primenjeno 10 mpk Q14D IV). Grupa 2 životinja je prethodno

1

tretirana sa Primerom 1 (formulisano u 1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05% antipenećeg sredstva i primenjeno 50 mpk BID p.o.) u toku 5 dana, a nakon toga je 23 dana tretirana zajedno sa Primerom 1 i SoC ili dok zapremine tumora ne dostignu 2000 mm<3>. Izračuna se prosečan % promene u zapremini tumora kao prosek za pojedinačnu životinju [(zapremina tumora za dane tretmana ≥ 28 minus zapremina tumora na dan 0), podeljeno sa zapreminom tumora na dan 0], pomnoženo sa 100.

[0396] U Tabeli 4 su sumirani rezultati efekata tretmana Primerom 1 na rast modela gastričnog kancera dobijenog od pacijenta (karcinomi ili adenokarcinomi) i pokazuju da modeli čiji je rast sprečen tretmanom sa Primerom 1 nose dve mutacije: 1) najmanje jednu heterozigotnu LOF mutaciju u ARID1A i 2) ili heterozigotnu LOF u MLL2 (nađeno u PDXs GXA-3052, GXA-3079, GXA-3083) i/ili mutaciju koja pogađa komponente PI3K puta (uključujući ali bez ograničenja na PIK3CA i PTEN; nađeno u PDXs GXA-3002 i GXA-3005). Modeli čiji rast nije ograničen nakon tretmana sa Primerom 1 imaju homozigotnu mutaciju u p53, nezavisno od statusa LOF mutacije u ARID1A ili MLL2 (kao u PDX GXA 3011) i nezavisno od statusa mutacije komponenti PI3K puta (kao u PDX GXA-3069).

1

Tabela 4: efekat SoC oksaliplatin plus paklitaksel ili kombinacije Primera 1 plus SoC, na rast modela gastričnog kancera dobijenog od pacijenta.

[0397] Slično tome, rast od pacijenta dobijenog LXFE 937 modela tumora pluća koji nosi dve heterozigotne mutacije gubitka funkcije MLL3, je značajno inhibiran nakon tretmana sa Primerom 1 u kombinaciji sa SoC za kancer pluća gemcitabinom (formulisan u 0.9% NaCl i primenjen jedanput nedeljno od 120 mpk i.p) plus cisplatin (formulisan u 0.9% NaCl i primenjen subkutano od 3.2 mpk jedanput nedeljno). Rezultati su pokazani u Tabeli 5.

Tabela 5: efekat standardnog protokola (SoC) gemcitabin plus cisplatin ili kombinacije Primera 1 plus SoC, na rast NSCLC modela karcinoma skvamoznih ćelija dobijenog od pluća pacijenta.

1

[0398] Slično tome, rast kolorektalnog tumora CXF 1034 dobijenog od pacijenta, u kome se ne ekspresuje ARID1A protein i nosi mutacije u PIK3CA i PTEN, je značajno inhibiran kada se testira sa Primerom 1 u kombinaciji sa SoC irinotekan hidrohlorid trihidrat (formulisan u 0.9% NaCl i primenljen kao 20 mpk Q7D IV) plus oksaliplatin (formulisan u 5% glukozi i primenjen kod 8 mpk Q14D i.p.). Rezultati su pokazani u Tabeli 6.

Tabela 6: efekat standardnog protokola (SoC) irinotekan plus oksaliplatin ili kombinacije Primera 1 plus SoC, na rast modela kolorektalnog karcinoma dobijenog od pacijenta.

[0399] Kao zaključak, prethodno opisani rezultati obezbeđuju dokaze koji podržavaju upotrebu EZH2 inhibitora, uključujući ali bez ograničenja na Primer 1 ili Primer 38, samih i/ili u kombinaciji sa hemoterapijom po standardnom protokolu (SoC), u tretmanu kancera jajnika, želuca, pluća ili kolorektuma koji nose kombinacije mutacija u komponentama SWI/SNF kompleksa i/ili MLL kompleksa i/ili PI3K puta.

[0400] Jedinjenja iz ovog pronalaska su preferirano formulisana kao farmaceutske kompozicije koje se primenjuju različitim načinima. Najpoželjnije, ove kompozicije su za oralnu primenu. Ove farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (D. Troy, i saradnici, eds., 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005).

[0401] Doze SoC jedinjenja za pacijente mogu da se primene po odobrenom doziranju ili mogu da variraju u skladu sa preporukom lekara. Primeri doza za SoC jedinjenja mogu da budu, na primer, kako sledi: za kancer jajnika, doze karboplatina plus paklitaksela mogu da budu 175 mg/m<2>IV svake 3 nedelje paklitaksela a nakon toga 175 mg/m<2>IV svake 3 nedelje

1

karboplatina. Za kancere želuca, doze paklitaksela plus oksaliplatin mogu da budu 50 mg/m<2>IV nedeljno paklitaksela i AUC 2 mg/mL nedeljno oksaliplatina. Za kancer pluća, doze gemcitabina plus cisplatin mogu da budu 1250 mg/m<2>IV svake 3 nedelje gemcitabina plus 75 mg/m<2>IV svake 3 nedelje cisplatina. Za kolorektalne kancere, doze irinotekana plus oksaliplatin mogu da budu 125 mg/m<2>IV nedeljno ili 350 mg/m<2>IV svake 3 nedelje irinotekana i 85 mg/m<2>IV svake 2 nedelje oksaliplatina. (Reference za doze SoC treatmana mogu takođe da se nađu u http://www.cancertherapyadvizor.com/gastrointestinalcancers/gastric-cancer-treatment-regimens/article/218159/).

[0402] EZH2 jedinjenja iz ovog pronalaska su generalno efektivna u širokom rasponu doze. Na primer, dnevne doze mogu da budu u rasponu do 5000 mg/dan, preferirano približno 100-2000 mg/dan, primenjeno u jednoj ili više doza. Međutim, razumljivo je da će stvarnu količinu jedinjenja koja se primenjuje da odredi lekar u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući stanje koje se tretira, izabrani način primene, tačno jedinjenje ili jedinjenja koja se primenjuju, godine starosti, težinu i odgovor pojedinačnog pacijenta i ozbiljnost simptoma pacijenta.

1 1

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:

pri čemu: X je -CH2- ili -CH2-CH2- grupa; Y’ je -NR<4>R<5>, -CH(CH3)-cikloheksil-4-il-N-metil-N-metoksietil ili -CH(CH3)-cikloheks-4-ilazetidin-1-il gde je azetidin-1-il opciono supstituisan sa metoksi, 2-propoksi, metoksimetil, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, pirazolil, metilpirazolil, triazolil, pirolidinil, tetrahidrofuraniloksi ili morfolinil grupom; R<4>je cikloheks-4-il supstituisan sa N-metil-N-metoksietilamino, N-metil-N-ciklopropilamino ili azetidin-1-il grupom gde je azetidin-1-il supstituisan sa metoksi, etoksi, metoksietoksi, ciklopropiloksi ili pirazolil grupom; R<5>je metil ili etil grupa; i R<6>je metil grupa ili hlor; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je X -CH2- grupa.
3. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je X -CH2-CH2- grupa.
4. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa jednim od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što je Y’ -CH(CH3)-cikloheksil-4-il-N-metil-N-metoksietil ili -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il naznačeno time što je azetidin-1-il grupa opciono supstituisana sa metoksi, 2-propoksi, metoksimetil, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, pirazolil, metilpirazolil, triazolil, pirolidinil, tetrahidrofuraniloksi ili morfolinil grupom.
5. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa jednim od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time što je Y’ -CH(CH3)-cikloheks-4-il-azetidin-1-il, pri čemu je azetidin-1-il grupa opciono supstituisana sa metoksi, 2-propoksi, metoksimetil, metoksietoksi, ciklopropiloksi, ciklopropilmetoksi, pirazolil, metilpirazolil, triazolil, pirolidinil, tetrahidrofuraniloksi ili morfolinil grupom.
6. Jedinjenje ili so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5, naznačeno time što je R<6>metil grupa.
7. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa jednim od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što je Y’ -NR<4>R<5>grupa.
8. Jedinjenje u skladu ili sa patentnim zahtevom 1 ili sa patentnim zahtevom 3, naznačeno time što je to

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
9. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačeno time što je to 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{(1R)-1-[4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil}-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so
10. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačeno time što je to 5-[(4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil]-2-{(1R)-1-[trans-4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil]etil}-3-metil-5,6,7,8-tetrahidro-4H-tieno[3,2-c]azepin-4-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 1
11. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje ili njegovu so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-10 i jednu ili više farmaceutski prihvatljivih podloga, nosača ili razblaživača.
12. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa jednim od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
13. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa jednim od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu kancera.
14. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačeno time što je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od limfoma, rabdoidnih tumora, tumora koji nemaju ili su deficitarni u jednoj ili više komponenti SWI/SNF kompleksa, MLL kompleksa i konstitutivno aktivnog PI3K puta, sarkoma, multiple mijeloma, melanoma, gastrointestinalnog kancera, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika i kancera prostate
15. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačeno time što je kancer difuzni limfom velikih B-ćelija ili folikularni limfom.
16. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu ili sa patentnim zahtevom Claim 14 ili patentnim zahtevom 15, naznačeno time što je kancer difuzni limfom velikih B-ćelija.
17. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačeno time što je kancer rabdoidni tumor koji nema SNF5.
18. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačeno time što je kancer gastrični kancer.
19. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačeno time što je kancer kancer jajnika.
20. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačeno time 1 4 što je kancer multiple mijeloma.
21. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što je za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa karboplatinom i paklitakselom u tretmanu kancera jajnika.
22. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što je za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa oksiplatinom i paklitakselom u tretmanu gastričnog kancera.
23. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što je za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa gemcitabinom i cisplatinom u tretmanu kancera pluća.
24. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što je za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa irinotekanom i oksaliplatinom u tretmanu kolorektalnog kancera. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 1