TW201919659A - 經由速流合成以製備磷醯二胺嗎啉代寡聚物之製程 - Google Patents

經由速流合成以製備磷醯二胺嗎啉代寡聚物之製程 Download PDF

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Abstract

本文提供用於製備寡聚物(例如，嗎啉代寡聚物)之製程。本文所闡述之該等合成製程可有利地在維持所合成寡聚物之總產率及純度的同時放大寡聚物合成之規模。

Description

經由速流合成以製備磷醯二胺嗎啉代寡聚物之製程
反義技術提供調節一或多種特定基因產物(包括選擇性剪接產物)之表現之手段，且在多種治療、診斷及研究應用中係唯一可用的。反義技術背後之原理在於與靶標核酸雜交之反義化合物(例如，寡核苷酸)經由多種反義機制中之任一者調節基因表現活性(例如轉錄、剪接或轉譯)。反義化合物之序列特異性使得其作為用於靶標驗證及基因功能化之工具以及選擇性調節疾病中所涉及基因之表現的治療劑而具吸引力。
杜興氏肌肉營養不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)係由蛋白質肌肉萎縮蛋白(dystrophin)之表現缺陷而引起。編碼該蛋白質之基因含有79個外顯子，展開覆蓋DNA之超過2百萬個核苷酸。改變外顯子之閱讀框，或引入終止密碼子，或特徵在於移除全部框外外顯子或一或多個外顯子之重複之任何外顯子突變均有可能破壞功能性肌肉萎縮蛋白之產生，從而導致DMD。
測試用於治療DMD之剪接轉換寡核苷酸(SSO)之安全性及效能的近期臨床試驗係基於SSO技術以藉由剪接體之空間阻斷來誘導前mRNA之選擇性剪接(Cirak等人，2011；Goemans等人，2011；Kinali等人，2009；van Deutekom等人，2007)。然而，儘管已取得該等成功，但可用於治療DMD之藥物選擇有限。
依替利森(Eteplirsen)係磷醯二胺嗎啉代寡聚物(PMO)，其經設計以跳讀患有DMD之患者中人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51，該等患者適於外顯子51跳讀以恢復閱讀框並產生肌肉萎縮蛋白之功能性較短形式。依替利森已獲得美國食品藥品管理局(United States Food and Drug Administration，FDA)批准用於治療DMD。
儘管在反義技術領域中已獲得顯著進展，但業內仍需要製備具有改良之反義或反基因性能之磷醯二胺嗎啉代寡聚物之方法。
本文提供用於製備磷醯二胺嗎啉代寡聚物(PMO)之製程。本文所闡述之合成製程容許在維持所合成PMO之總產率及純度的同時使用路易斯酸(Lewis acid)觸媒進行有效PMO合成。本文進一步提供流通式(flow-through) PMO合成程序。
因此，在一態樣中，本文提供使用路易斯酸觸媒以製備式(I)之寡聚化合物之製程：

(I)。
在另一態樣中，本文提供用於製備式(A11)之寡聚化合物之連續製程：

(A11)。
在一實施例中，用於製備式(A11)之寡聚化合物之連續製程係在流通式反應器中進行。
相關申請案
本申請案主張於2017年9月25日提出申請之美國臨時專利申請案第62/562,741號之優先權權益，該臨時專利申請案之內容係以全文引用的方式併入本文中。
本文提供用於製備嗎啉代寡聚物之製程，該嗎啉代寡聚物可用於針對反義療法之應用。反義療法係用於治療嚴重遺傳疾病及病毒感染之具吸引力之途徑。反義治療劑係經由互補性沃森-克裡克(Watson-Crick)鹼基配對結合至mRNA且引起選擇性剪接或轉譯抑制，從而使得蛋白質改變或蛋白質含量降低之合成核鹼基聚合物(S. Cirak、V. Arechavala-Gomeza、M. Guglieri、L. Feng、S. Torelli、K. Anthony、S. Abbs、M. E. Garralda、J. Bourke、D. J. Wells等人，Lancet 2011 , 378, 595-605) (J. H. Chan、S. Lim、W. F. Wong，Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2006 , 33, 533-540)。以此方式，可使關鍵病毒蛋白去活化，可切除具有致命框移突變之外顯子以產生功能性截短蛋白質，或可抑制致癌基因表現。磷醯二胺嗎啉代寡聚物(PMO)係一類反義治療劑，其中RNA之5員核糖基環已經6員嗎啉環替代，且磷酸酯鍵聯已經不帶電之磷醯二胺替代(J. Summerton、D. Weller，Antisense Nucleic Acid Drug Dev .1997 , 7, 187-195)。該等修飾使得PMO對核酸酶具有抗性(R. M. Hudziak、E. Barofsky、D. F. Barofsky、D. L. Weller、S.-B. Huang、D. D. Weller，Antisense Nucleic Acid Drug Dev .1996 , 6, 267-272)，且可能較裸RNA更具細胞滲透性(V. Arora、D. C. Knapp、M. T. Reddy、D. D. Weller、P. L. Iversen，J. Pharm. Sci .2002 , 91, 1009-1018)。目前正在研究若干種PMO，包括稱為PMO-X™之第二代結構類似物及稱為PPMO之肽-PMO偶聯物。FDA近期批准一種首創杜興氏肌肉營養不良症藥物Exondys 51™ (依替利森) (C. A. Stein，Mol. Ther .2016 , 24, 1884-1885)，且正在進行用於治療以下之試驗：登革熱(Dengue) (K. L. Holden、D. A. Stein、T. C. Pierson、A. A. Ahmed、K. Clyde、P. L. Iversen、E. Harris，Virology 2006 , 344, 439-452)、馬爾堡病(Marburg)(P. L. Iversen、T. K. Warren、J. B. Wells、N. L. Garza、D. V Mourich、L. S. Welch、R. G. Panchal、S. Bavari，Viruses 2012 , 4, 2806-30)、伊波拉病(Ebola)(P. L. Iversen、T. K. Warren、J. B. Wells、N. L. Garza、D. V Mourich、L. S. Welch、R. G. Panchal、S. Bavari，Viruses 2012 , 4, 2806-30)及流行性感冒病毒感染(Q. Ge、M. Pastey、D. Kobasa、P. Puthavathana、C. Lupfer、R. K. Bestwick、P. L. Iversen、J. Chen、D. A. Stein，Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50, 3724-33)。
儘管潛在疾病目標廣泛，但PMO之漫長製備限制其開發及應用。為緩和此問題，且使得能夠有效地鑑別且產生該等組合物，本文提供使用路易斯酸以及流通式PMO合成程序之有效PMO合成。
定義
下文列示用於闡述本揭示內容之各個術語之定義。除非在特定情況下另有限制，否則在整個本說明書及申請專利範圍中個別地或作為較大基團之一部分使用該等術語時，該等定義適用於該等術語。
「鹼基保護(base-protected或base protection)」係指利用適於在逐步寡聚物合成期間防止鹼基配對基團反應或干擾之保護基團對嗎啉代亞單元上之鹼基配對基團(例如，嘌呤或嘧啶鹼基)之保護。(鹼基保護嗎啉代亞單元之實例係在下文所繪示之胞嘧啶胺基上具有CBZ保護基團之經活化之C亞單元化合物(C))。
「經活化之磷醯胺基團」通常係氯磷醯胺基團，其在氮處具有寡聚物中最終磷醯二胺鍵聯所期望之取代。實例係(二甲基胺基)氯磷醯胺，即-O-P(=O)(NMe2)Cl。
術語「載體結合」係指化學實體共價連接至載體介質。
術語「載體介質」係指包括(例如)寡聚物可在其上附接或在其上合成或可經修飾用於附接或合成寡聚物之任何粒子、珠粒或表面之任何材料。代表性基材包括(但不限於)無機載體及有機載體，例如玻璃及經修飾或功能化玻璃、塑膠(包括丙烯酸系樹脂、聚苯乙烯及苯乙烯與其他材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺基甲酸酯、鐵氟龍(TEFLON)等)、多醣、耐綸或硝化纖維素、陶瓷、樹脂、二氧化矽或基於二氧化矽之材料(包括矽及改質矽)、碳、金屬、無機玻璃、塑膠、光纖束及多種其他聚合物。對於一些實施例尤其可用之載體介質及固體表面位於流通式反應器內。在本文所述製程之一些實施例中，載體介質包含具有1%交聯二乙烯基苯之聚苯乙烯。
在一些實施例中，代表性載體介質包含至少一個用於附接或合成寡聚物之反應性位點。舉例而言，在一些實施例中，本揭示內容之載體介質包含一或多個能夠與用於附接或合成寡聚物之後續亞單元或其他活化基團形成化學鍵之末端胺基或羥基。
適用於本文所闡述製程之一些代表性載體介質包括(但不限於)以下：可控孔徑玻璃(CPG)；草醯基可控孔徑玻璃(例如，參見Alul等人，Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527)；含二氧化矽之粒子，例如多孔玻璃珠粒及矽膠(例如由三氯-[3-(4-氯甲基)苯基]丙基矽烷與多孔玻璃珠粒之反應所形成者) (參見Parr及Grohmann，Angew. Chem. Internatl. Ed. 1972, 11, 314，由Waters Associates, Framingham, Mass., USA以商標「PORASIL E」來銷售)；1,4-二羥基甲苯與二氧化矽之單酯(參見Bayer及Jung，Tetrahedron Lett ., 1970, 4503，由Waters Associates以商標「BIOPAK」來銷售)；TENTAGEL (例如，參見Wright等人，Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373)；交聯苯乙烯/二乙烯基苯共聚物珠粒狀基質，或POROS，即聚苯乙烯/二乙烯基苯之共聚物(可自Perceptive Biosystems獲得)；可溶載體介質，例如聚乙二醇PEG (參見Bonora等人，Organic Process Research & Development 2000, 4, 225-231)；PEPS載體，其為具有側鏈長鏈聚苯乙烯(PS)接枝之聚乙烯(PE)膜(參見Berg等人，J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 8024及國際專利申請案WO 1990/02749)；二甲基丙烯醯胺與N,N′-雙丙烯醯基乙二胺(包括已知量之N-第三丁氧基羰基-β-丙胺醯基-N′-丙烯醯基六亞甲基二胺)交聯之共聚物(參見Atherton等人，J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 6584,Bioorg. Chem. 1979, 8, 351及J. C. S. Perkin I 538 (1981))；經疏水性交聯苯乙烯聚合物塗覆之玻璃粒子(參見Scott等人，J. Chrom. Sci. 1971, 9, 577)；其上已接枝聚苯乙烯之氟化乙烯聚合物(參見Kent及Merrifield，Israel J. Chem. 1978, 17, 243及van Rietschoten，Peptides 1974, Y. Wolman編輯, Wiley and Sons, New York, 1975, 第113-116頁)；經丙烯酸羥基丙基酯塗覆之聚丙烯膜(Daniels等人，Tetrahedron Lett. 1989, 4345)；丙烯酸接枝之聚乙烯棒(Geysen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3998)；含有傳統使用之聚合物珠粒之「茶包」(Houghten，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 5131)；及其組合。
術語「流通式反應器」係指包含表面(例如，固體表面)之室，一或多種流體試劑(例如，液體或氣體)可跨越該表面流動。在一實施例中，該室可係(但不限於)連接混合器、混合容器、盤管反應器、管式反應器、旋轉盤式反應器、旋轉管式反應器、多室流動反應器、振盪流動反應器或微反應器。在另一實施例中，該室含有固體支持之化學反應物。在特定實施例中，固體支持之化學反應物由過濾器限於室內。
術語「解封端劑」係指包含用於去除保護基團之化學酸或化學酸之組合之組合物(例如，溶液)。用於解封端劑中之例示性化學酸包括鹵代酸，例如氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸及三氟乙酸。在一些實施例中，解封端劑自(例如)寡聚物、載體結合寡聚物、載體結合亞單元或其他經保護之氮或氧部分去除一或多個三苯甲基。
術語「鹵素」及「鹵基」係指選自由氟、氯、溴及碘組成之群之原子。
術語「封端劑」係指包含酸酐(例如，苯甲酸酐、乙酸酐、苯氧基乙酸酐及諸如此類)之組合物(例如，溶液)，其可用於封阻(例如)與後續亞單元或其他活化基團形成化學鍵之載體介質之反應性位點。
術語「裂解劑」係指包含化學鹼(例如，氨或1,8-二氮雜二環十一-7-烯)或化學鹼之組合之組合物(例如，液體溶液或氣態混合物)，其可用於(例如)自載體介質裂解載體結合寡聚物。
術語「去保護劑」係指包含化學鹼(例如，氨、1,8-二氮雜二環十一-7-烯或碳酸鉀)或化學鹼之組合之組合物(例如，液體溶液或氣態混合物)，其可用於去除保護基團。舉例而言，在一些實施例中，去保護劑可自(例如)嗎啉代亞單元、嗎啉代寡聚物之嗎啉代亞單元或其載體結合形式去除鹼基保護。
術語「溶劑」係指溶質溶解於其中之溶液或混合物之組分。溶劑可係無機或有機溶劑(例如，乙酸、丙酮、乙腈、乙醯丙酮、2-胺基乙醇、苯胺、茴香醚、苯、苯甲腈、苯甲醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、2-丁酮、第三丁醇、二硫化碳、四氯化碳、氯苯、氯仿、環己烷、環己醇、環幾酮、鄰苯二甲酸二正丁基酯、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、二乙胺、二乙二醇、二乙二醇二甲醚、二甲氧基乙烷(乙二醇二甲醚)、N,N-二甲基苯胺、二甲基甲醯胺、鄰苯二甲酸二甲基酯、二甲基亞碸、二噁烷、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙醯乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙二醇、甘油、庚烷、1-庚醇、己烷、1-己醇、甲醇、乙酸甲酯、甲基第三丁基醚、二氯甲烷、1-辛醇、戊烷、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、1-丙醇、2-丙醇、吡啶、四氫呋喃、甲苯、水、對二甲苯)。
片語「嗎啉代寡聚物」及「磷醯二胺嗎啉代寡聚物」或「PMO」係指藉由磷醯二胺鍵聯使嗎啉代亞單元連接在一起，從而將一個亞單元之嗎啉代氮接合至毗鄰亞單元之5'-環外碳之寡聚物。每一嗎啉代亞單元包含藉由核鹼基特異性氫鍵有效結合至靶標中之核鹼基之核鹼基配對部分。
術語「EG3尾」係指偶聯至寡聚物(例如，在其3’-或5’端)之三乙二醇部分。舉例而言，在一些實施例中，偶聯至寡聚物之3’端之「EG3尾」可具有以下結構：
。
術語「約」或「大約」通常為相關主題領域之熟習者所理解，但在某些情況下可意指在既定值或範圍之±10%內或±5%內。
以批式或速流程序製備嗎啉代寡聚物之製程
本文提供使用路易斯酸之有效PMO合成。本文亦提供流通式PMO合成程序(在本文中亦稱為「連續合成」或「速流合成」)。
如本文所闡述，合成通常係在載體介質上進行。在一實施例中，本文提供第一合成組元(例如單體，例如嗎啉代亞單元)，其首先附接至載體介質，且然後在路易斯酸觸媒存在下藉由將亞單元依序偶合至載體結合合成組元來合成寡聚物。此迭代伸長最終產生最終寡聚化合物。此製程可經由本文所闡述之速流合成來完成。速流之優點在於反應更快速、最佳化較快、產物更清潔、易於擴大規模、反應更安全且集成通常單獨之製程。
適宜載體介質可係可溶的或不溶的，或可在不同溶劑中具有可變溶解性以容許載體結合聚合物根據期望於溶液中或溶液外。傳統載體介質大部分係不溶的且常規置於反應容器中，同時試劑及溶劑與生長鏈反應及/或洗滌生長鏈直至寡聚物達到目標長度為止，在此之後將其自載體裂解，且若需要，進一步處理以產生最終聚合化合物。更近期之方法已引入可溶載體(包括可溶聚合物載體)以容許在合成中之期望點沈澱及溶解迭代合成之產物(Gravert等人，Chem. Rev., 1997, 97,489-510)。
本文亦提供用於製備嗎啉代寡聚物之製程。
因此，在一態樣中，本文提供用於製備式(I)之寡聚化合物之製程：

(I)；
其中
n係9至39之整數；
T係OH或；且
每一R2 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(C)、(G)、(T)、(A)、
(5mC)、(U)及(I)；
其中該製程包含以下連續步驟：
(a) 使式(A1)化合物：

(A1)；
其中
B係或；
R1 係載體介質；且
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；
與解封端劑接觸以形成式(II)化合物：

(II)；
其中B係
或；且
R1 係載體介質；
(b) 使式(II)化合物與式(A2)化合物接觸：

(A2)；
其中R5 係
或；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
以形成式(A3)化合物：

(A3)；
其中
B係或；
R1 係載體介質；
R5 係或；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(c) 使該式(A3)化合物與解封端劑接觸以形成式(IV)化合物：

(IV)；
其中B係
或；
R1 係載體介質；
R6 係或；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(d) 在路易斯酸觸媒存在下使該式(IV)化合物與式(A4)化合物接觸：

(A4)；
其中
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
以形成式(A5)化合物：

(A5)；
其中R7 具有式(A5a)或式(A5b)：
(A5a)或
(A5b)；
B係
或；
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(e) 實施以下連續步驟之Y個反覆：
(e1) 使由緊接之先前步驟所形成之產物與解封端劑接觸；及
(e2) 在路易斯酸觸媒存在下使由緊接之先前步驟所形成之化合物與式(A8)化合物接觸：

(A8)；
其中
若R7 具有式(A5a)，則Y係n-1，或若R7 具有式(A5b)，則Y係n-2；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 獨立於每一式(A8)化合物係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
以形成式(A9)化合物：

(A9)；
其中R8 係
或；
B係
或；
n係9至39之整數；
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；且
(f) 使該式(A9)化合物與解封端劑接觸以形成式(A10)化合物：

(A10)；
其中R9 係
或；
B係
或；
n係9至39之整數；
R1 係載體介質；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(g) 使該式(A10)化合物與裂解劑接觸以形成式(A11)化合物：

(A11)；
其中
R9 係
或；
C係或H；
n係9至39之整數；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；且
(h) 使該式(A11)化合物與去保護劑接觸以形成式(I)之該寡聚化合物。
在一實施例中，步驟(d)或(e2)中之一者進一步包含使由緊接之先前步驟所形成之化合物與封端劑接觸。
在另一實施例中，步驟(a)、(c)、(e1)或(f)中之至少一者進一步包含使解封端之化合物與中和劑接觸。
在另一實施例中，步驟(a)、(c)、(e1)及(f)進一步包含使每一步驟之解封端化合物與中和劑接觸。
在另一實施例中，解封端步驟係在介於室溫與110℃之間運行。
在另一實施例中，解封端步驟係在介於50℃與100℃之間運行。
在特定實施例中，解封端步驟係在介於70℃與90℃之間運行。
在一實施例中，封端劑係在包含N-乙基嗎啉及甲基吡咯啶酮之溶液中。
在另一實施例中，封端劑係酸酐。
在特定實施例中，封端劑係苯甲酸酐。
在一實施例中，式(A4)及式(A8)之化合物各自獨立地在包含N-乙基嗎啉及二甲基咪唑啶酮之溶液中。
在另一實施例中，裂解劑包含二硫蘇糖醇及1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一-7-烯。
在另一實施例中，裂解劑係在包含N-甲基-2-吡咯啶酮之溶液中。
在另一實施例中，去保護劑包含NH3 。
在另一實施例中，去保護劑係於水溶液中。
在一實施例中，載體介質包含具有1%交聯二乙烯基苯之聚苯乙烯。
在一實施例中，在步驟(a)-(g)中，B係且在步驟(h)中，C係。
在另一實施例中，該製程係以批式合成或以連續合成來實施。
在另一實施例中，步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e1)、(e2)、(f)、(g)或(h)中之任一者係以批式合成或以連續合成來實施。
在特定實施例中，步驟(a)、(b)、(g)及(h)係以批式合成來實施且步驟(c)、(d)、(e1)、(e2)及(f)係以連續合成來實施。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含鹵代酸之溶液。
在另一實施例中，解封端劑係選自由以下組成之群：氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸及三氟乙酸。
在特定實施例中，解封端劑係三氟乙酸。
在一實施例中，路易斯酸可溶於偶合溶劑中。
在另一實施例中，路易斯酸係選自由以下組成之群：LiCl、LiBr、LiI及LiOTf。
在特定實施例中，路易斯酸係LiBr。
在一實施例中，中和劑係在包含鹵化溶劑及異丙醇之溶液中。
在另一實施例中，鹵化溶劑係二氯甲烷或二氯乙烷。
在另一實施例中，中和劑係單烷基胺、二烷基胺或三烷基胺。
在另一實施例中，中和劑係N,N-二異丙基乙胺。
在另一實施例中，中和劑係N-乙基嗎啉。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇及水。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：4-氰基吡啶、二氯乙烷、三氟乙酸、三氟乙醇及水。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：3,5-二甲基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇及水。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：3,5-二甲基吡啶、二氯乙烷、三氟乙酸、三氟乙醇及水。
用於製備嗎啉代寡聚物之連續製程
本文提供用於製備嗎啉代寡聚物之連續(流通式)製程。
因此，在一態樣中，本文提供用於製備式(A11)之寡聚化合物之連續製程：

(A11)；
其中R9 係
或；
C係或H；
n係9至39之整數；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
其中該製程包含以下連續步驟：
(a) 於反應器容器中使解封端劑與式(A3)化合物接觸：

(A3)；
其中B係
或；
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；
R5 係
或；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
以形成式(IV)化合物：

(IV)；
其中B係
或；
R1 係載體介質；
R6 係
或；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(b) 用洗滌溶劑及中和劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使洗滌溶劑及中和劑穿過該反應器容器；
(c) 用洗滌溶劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(d) 用偶合溶劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(e) 向該反應器容器引入路易斯酸及式(A4)化合物：

(A4)；
其中
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
使得該式(A4)化合物接觸該式(IV)化合物以形成式(A5)化合物：

(A5)；
其中R7 具有式(A5a)或式(A5b)：
(A5a)或
(A5b)；
B係
或，
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(f) 用偶合溶劑洗滌該式(A5)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(g) 實施以下連續步驟之Y個反覆：
(g1) 用洗滌溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(g2) 將解封端劑引入至該反應器容器中，從而使得其接觸由緊接之先前步驟所形成之產物；
(g3) 用洗滌溶劑及中和劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑及中和劑穿過該反應器容器；
(g4) 用洗滌溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(g5) 用偶合溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(g6) 向含有由緊接之先前步驟所形成產物之該反應器容器引入路易斯酸及式(A8)化合物：

(A8)；
其中
若R7 具有式(A5a)，則Y係n-1，或若R7 具有式(A5b)，則Y係n-2；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 獨立於每一式(A8)化合物係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
從而使得該式(A8)化合物接觸由緊接之先前步驟所形成之化合物以形成式(A9)化合物：

(A9)；
其中R8 係
或
；
B係
或；
n係9至39之整數；
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(h) 用偶合溶劑洗滌該式(A9)化合物以去除該式(A8)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(i) 用洗滌溶劑洗滌該式(A9)化合物以去除該偶合溶劑，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(j) 於反應器容器中使解封端劑與式(A9)化合物接觸以形成式(A10)化合物：

(A10)；
其中R9 係
或；
B係
或；
n係10至40之整數；
R1 係載體介質；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；且
(k) 於反應器容器中使裂解劑與式(10)化合物接觸以形成式(A11)化合物。
在一實施例中，本文提供用於製備式(A11)之寡聚化合物之連續製程：

(A11)；
其中R9 係
；
C係；
n係9至39之整數；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
其中該製程包含以下連續步驟：
(a) 於反應器容器中使解封端劑與式(A3)化合物接觸：

(A3)；
其中B係
；
R1 係載體介質；
R5 係
；且
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；
以形成式(IV)化合物：

(IV)；
其中B係
；
R1 係載體介質；
R6 係
；
(b) 用洗滌溶劑及中和劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使洗滌溶劑及中和劑穿過該反應器容器；
(c) 用洗滌溶劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(d) 用偶合溶劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(e) 向該反應器容器引入路易斯酸及式(A4)化合物：

(A4)；
其中
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
使得該式(A4)化合物接觸該式(IV)化合物以形成式(A5)化合物：

(A5)；
其中R7 具有式(A5a)或式(A5b)：
(A5a)；
B係
，
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(f) 用偶合溶劑洗滌該式(A5)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(g) 實施以下連續步驟之Y個反覆：
(g1) 用洗滌溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(g2) 將解封端劑引入至該反應器容器中，從而使得其接觸由緊接之先前步驟所形成之產物；
(g3) 用洗滌溶劑及中和劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑及中和劑穿過該反應器容器；
(g4) 用洗滌溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(g5) 用偶合溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(g6) 向含有由緊接之先前步驟所形成產物之該反應器容器引入路易斯酸及式(A8)化合物：

(A8)；
其中
Y係n-1；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 獨立於每一式(A8)化合物係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
從而使得該式(A8)化合物接觸由緊接之先前步驟所形成之化合物以形成式(A9)化合物：

(A9)；
其中R8 係
；
B係
；
n係9至39之整數；
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(h) 用偶合溶劑洗滌該式(A9)化合物以去除該式(A8)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(i) 用洗滌溶劑洗滌該式(A9)化合物以去除該偶合溶劑，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(j) 於反應器容器中使解封端劑與式(A9)化合物接觸以形成式(A10)化合物：

(A10)；
其中R9 係
；
B係
；
n係9至39之整數；
R1 係載體介質；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；且
(k) 於反應器容器中使裂解劑與式(10)化合物接觸以形成式(A11)化合物。
在一實施例中，步驟(a)、(g2)及(j)中之至少一者進一步包含使各別步驟之解封端化合物與中和劑接觸。
在另一實施例中，步驟(a)、(g2)及(j)進一步包含使各別步驟之解封端化合物與中和劑接觸。
在一實施例中，洗滌溶劑係鹵化溶劑。
在另一實施例中，洗滌溶劑係二氯甲烷或二氯乙烷。
在一實施例中，偶合溶劑係1,3-二甲基-2-咪唑啶酮或N-甲基-2-吡咯啶酮。
在一實施例中，裂解劑包含NH3 。
在另一實施例中，裂解劑係於水溶液中。
在另一實施例中，載體介質包含具有1%交聯二乙烯基苯之聚苯乙烯。
在一實施例中，步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g1)、(g2)、(g3)、(g4)、(g5)、(g6)、(h)、(i)、(j)及(k)中之任一者係在介於70℃與90℃之間運行。
在另一實施例中，步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g1)、(g2)、(g3)、(g4)、(g5)、(g6)、(h)、(i)、(j)及(k)中之每一者係在介於70℃與90℃之間運行。
在特定實施例中，步驟(e)及(g6)中之每一者係在介於70℃與90℃之間運行。
在一實施例中，步驟(a)、(g2)及(j)中之每一者係在介於70℃與90℃之間運行；且每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：3,5-二甲基吡啶、二氯乙烷、三氟乙酸及三氟乙醇。
在一實施例中，步驟(a)、(g2)及(j)中之每一者係在介於70℃與90℃之間運行；且每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：3,5-二甲基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸及三氟乙醇。
在另一實施例中，步驟(a)、(g2)及(j)中之每一者係在介於室溫與70℃之間運行；且每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：4-氰基吡啶、二氯乙烷、三氟乙酸及三氟乙醇。
在另一實施例中，步驟(a)、(g2)及(j)中之每一者係在介於室溫與70℃之間運行；且每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸及三氟乙醇。
在一實施例中，在步驟(a)-(j)中，B係且在步驟(k)中，C係。
在一實施例中，步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g1)、(g2)、(g3)、(g4)、(g5)、(g6)、(h)、(i)、(j)及(k)中之任一者視情況係以批式製程來實施。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含鹵代酸之溶液。
在另一實施例中，解封端劑係選自由以下組成之群：氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸及三氟乙酸。
在特定實施例中，解封端劑係三氟乙酸。
在一實施例中，路易斯酸可溶於偶合溶劑中。
在另一實施例中，路易斯酸係選自由以下組成之群：LiCl、LiBr、LiI及LiOTf。
在特定實施例中，路易斯酸係LiBr。
在一實施例中，中和劑係在包含鹵化溶劑及異丙醇之溶液中。
在另一實施例中，鹵化溶劑係二氯甲烷或二氯乙烷。
在另一實施例中，中和劑係單烷基胺、二烷基胺或三烷基胺。
在另一實施例中，中和劑係N,N-二異丙基乙胺。
在另一實施例中，中和劑係N-乙基嗎啉。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇及水。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：4-氰基吡啶、二氯乙烷、三氟乙酸、三氟乙醇及水。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：3,5-二甲基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇及水。
在一實施例中，每一步驟中所使用之解封端劑係包含以下之溶液：3,5-二甲基吡啶、二氯乙烷、三氟乙酸、三氟乙醇及水。
在式(A11)之寡聚化合物之實施例中，n係30，且R4 在1至30且5’至3’之每一位置處係：
在式(A11)之寡聚化合物之實施例中，n係10，且R4 在1至10且5’至3’之每一位置處係：
於流通式反應器中製備嗎啉代寡聚物之連續製程
本文提供於流通式反應器中製備嗎啉代寡聚物之連續(流通式)製程。
因此，在一態樣中，本文提供用於製備式(A11)之寡聚化合物之連續製程：

(A11)；
其中R9 係
或；
C係或H；
n係9至39之整數；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
其中該製程包含以下連續步驟：
(a) 於反應器容器中使解封端劑與式(A3)化合物接觸：

(A3)；
其中B係
或；
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；
R5 係
或；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
以形成式(IV)化合物：

(IV)；
其中B係
或；
R1 係載體介質；
R6 係
或；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(b) 用洗滌溶劑及中和劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使洗滌溶劑及中和劑穿過該反應器容器；
(c) 用洗滌溶劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(d) 用偶合溶劑洗滌該式(IV)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(e) 向該反應器容器引入路易斯酸及式(A4)化合物：

(A4)；
其中
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
使得該式(A4)化合物接觸該式(IV)化合物以形成式(A5)化合物：

(A5)；
其中R7 具有式(A5a)或式(A5b)：
(A5a)或
(A5b)；
B係
或，
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 係選自：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(f) 用偶合溶劑洗滌該式(A5)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(g) 實施以下連續步驟之Y個反覆：
(g1) 用洗滌溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(g2) 將解封端劑引入至該反應器容器中，從而使得其接觸由緊接之先前步驟所形成之產物；
(g3) 用洗滌溶劑及中和劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑及中和劑穿過該反應器容器；
(g4) 用洗滌溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(g5) 用偶合溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(g6) 向含有由緊接之先前步驟所形成產物之該反應器容器引入路易斯酸及式(A8)化合物：

(A8)；
其中
若R7 具有式(A5a)，則Y係n-1，或若R7 具有式(A5b)，則Y係n-2；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 獨立於每一式(A8)化合物係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
從而使得該式(A8)化合物接觸由緊接之先前步驟所形成之化合物以形成式(A9)化合物：

(A9)；
其中R8 係
或
；
B係
或；
n係9至39之整數；
R1 係載體介質；
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
(h) 用偶合溶劑洗滌該式(A9)化合物以去除該式(A8)化合物，其中洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器；
(i) 用洗滌溶劑洗滌該式(A9)化合物以去除該偶合溶劑，其中洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器；
(j) 於反應器容器中使解封端劑與式(A9)化合物接觸以形成式(A10)化合物：

(A10)；
其中R9 係
或
；
B係
或；
n係10至40之整數；
R1 係載體介質；且
R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；且
(k) 於反應器容器中使裂解劑與式(10)化合物接觸以形成式(A11)化合物；
其中該製程係在流通式反應器中進行，該流通式反應器至少包含：
(a) 進料區，其中該進料區包含一或多個各自裝配有幫浦之進料管線，且其中該等進料管線之入口區獨立地連接至包含以下之容器：中和劑、偶合溶劑、解封端劑、洗滌溶劑及式(A8)化合物：

(A8)；
其中
R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且
R4 獨立於每一式(A8)化合物係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；
其中該式(A8)化合物溶解於偶合溶劑中；
(b)反應區，其連接至該一或多個進料管線之出口區且其含有PMO合成樹脂；
(c) 出口區，在此可獨立地收集廢料流或產物；
(d) 壓力控制裝置；及
(e) 獨立地控制進料區及反應區之溫度之構件。
在一實施例中，中和試劑係於包含鹵化溶劑及異丙醇之溶液中之單烷基胺、二烷基胺或三烷基胺。
在另一實施例中，單烷基胺、二烷基胺或三烷基胺係N,N-二異丙基乙胺或N-乙基嗎啉。
在另一實施例中，鹵化溶劑係二氯甲烷或二氯乙烷。
在一實施例中，偶合溶劑係溶解於3-二甲基-2-咪唑啶酮或N-甲基-2-吡咯啶酮中之溴化鋰。
在另一實施例中，解封端劑係包含以下之溶液：4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸及三氟乙醇。
在另一實施例中，解封端劑係包含以下之溶液：4-氰基吡啶、二氯乙烷、三氟乙酸及三氟乙醇。
在另一實施例中，解封端劑係包含以下之溶液：3,5-二甲基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸及三氟乙醇。
在一實施例中，解封端劑係包含以下之溶液：3,5-二甲基吡啶、二氯乙烷、三氟乙酸及三氟乙醇。
在一實施例中，洗滌溶劑係二氯乙烷或二氯甲烷。
在另一實施例中，式(A8)化合物係於3-二甲基-2-咪唑啶酮或N-甲基-2-吡咯啶酮之溶液中。
在另一實施例中，幫浦係HPLC或注射幫浦。
在另一實施例中，進料區及反應區係由魯爾(luer)鎖連接器連接。
在一實施例中，反應區包含反應器容器及溫度控制浴。
在一實施例中，反應器容器裝配有玻料，從而使得PMO合成樹脂在製程期間不會去除。
在另一實施例中，反應器容器裝配有2 µm玻料。
在另一實施例中，壓力控制裝置係背壓調節器。
在特定實施例中，使用流通式反應器用於製備依替利森。
寡聚物
基於嗎啉基之亞單元之重要性質包括：1) 以寡聚形式藉由穩定不帶電或帶正電主鏈鍵聯連接之能力；2) 支持核苷酸鹼基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸苷、尿嘧啶、5-甲基-胞嘧啶及次黃嘌呤)，從而使得所形成之聚合物可與鹼基互補之靶標核酸(包括靶標RNA)雜交之能力；3) 寡聚物主動或被動轉運至哺乳動物細胞中之能力；及4) 寡聚物及寡聚物: RNA異源雙鏈體分別抵抗RNAse及RNase H降解之能力。
在一些實施例中，反義寡聚物含有鹼基修飾或取代。舉例而言，可選擇某些核鹼基以增加本文所闡述之反義寡聚物之結合親和力。已顯示，5-甲基胞嘧啶取代將核酸雙鏈體穩定性增加0.6-1.2℃，且可併入至本文所闡述之反義寡聚物中。在一個實施例中，寡聚物之至少一個嘧啶鹼基包含5-取代之嘧啶鹼基，其中嘧啶鹼基係選自由以下組成之群：胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶。在一個實施例中，5-取代之嘧啶鹼基係5-甲基胞嘧啶。在另一實施例中，寡聚物之至少一個嘌呤鹼基包含次黃嘌呤。
基於嗎啉基之寡聚物(包括反義寡聚物)詳細闡述於(例如)以下中：美國專利第5,698,685號、第5,217,866號、第5,142,047號、第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,521,063號、第5,506,337號、第8,299,206號及第8, 076,476號、國際專利申請公開案第WO/2009/064471號及第WO/2012/043730號及Summerton等人(1997, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-195)中，其各自係以全文引用的方式併入本文中。
本揭示內容之寡聚化合物可具有不對稱中心、手性軸及手性平面(如(例如) E. L. Eliel及S. H. Wilen，Stereo-chemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, 第1119-1190頁，及March, J.，Advanced Organic Chemistry, 第3版, 第 4章, John Wiley & Sons, New York (1985)中所闡述)，且可作為外消旋物、外消旋混合物及作為個別非鏡像異構物發生，以及其所有可能之異構物及混合物，包括光學異構物。本文所具體提及之本揭示內容之寡聚化合物(不對其立體化學作出任何指示)意欲表示其所有可能之異構物及混合物。
具體而言，不希望受限於任何特定理論，本揭示內容之寡聚化合物如本文所論述係自經活化之嗎啉代亞單元製備，該等經活化之嗎啉代亞單元包括此等非限制性實例(例如式(VIII)化合物)：

(VIII)；
其中R2 獨立於每一式(VIII)化合物係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)及(PA)。
以上所提及之式(VIII)化合物中之每一者可(例如)自如下文所繪示之相應β-D-呋喃核糖基來製備：

參見Summerton等人，Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195 (1997)。不受限於任何特定理論，兩個手性碳之立體化學在合成條件下保留，從而使得可基於選擇(例如) α-L-呋喃核糖基、α-D-呋喃核糖基、β-L-呋喃核糖基或β-D-呋喃核糖基起始材料產生每一嗎啉代亞單元之多種可能之立體異構物。
舉例而言，在一些實施例中，本揭示內容之式(VIII)化合物可具有式(VIIIa)：

(VIIIa)；
其中R2 獨立於每一式(VIIIa)化合物係選自由以下組成之群：
(PC)、(DPG)、
(T)及(PA)。
不受限於任何特定理論，舉例而言，將10至40種式(VIII)化合物併入至本揭示內容之寡聚化合物中可產生多種可能之立體異構物。
不希望受限於任何特定理論，本揭示內容之寡聚化合物包含一或多個含磷中間亞單元，其在每一磷處產生手性中心，其各自指定為如業內所理解之「Sp」或「Rp」構形。不希望受限於任何特定理論，此手性產生立體異構物，該等立體異構物具有相同之化學組成，但其原子之三維排列卻不同。
不希望受限於任何特定理論，每一磷亞單元間鍵聯之構形在(例如)本揭示內容之寡聚化合物之合成期間隨機發生。不希望受限於任何特定理論，合成製程產生指數級大量之本揭示內容之寡聚化合物之立體異構物，此乃因本揭示內容之寡聚化合物包含多個磷亞單元間鍵聯，其中每一磷亞單元間鍵聯具有隨機手性構形。具體而言，不希望受限於任何特定理論，額外嗎啉代亞單元之每一亞單元間鍵聯使得產物立體異構物之數量加倍，因此本揭示內容之寡聚化合物之習用製備實際上係2N 種立體異構物之高度異質混合物，其中N表示磷亞單元間鍵聯之數量。
因此，除非另有指示，否則包括所有此等異構物(包括非鏡像異構及鏡像異構混合物以及純鏡像異構物及非鏡像異構物)，例如當來自一或多個立體中心之一或多個鍵由「-」或「~~」或如業內應理解之等效形式指示時。
表1繪示本文所述製程中所提供之嗎啉代亞單元之各個實施例。
表 1 ： 嗎啉代亞單元之各個實施例。
實例
出於說明並闡述本揭示內容之某些具體實施例之目的，於下文闡述各實例。然而，申請專利範圍之範圍決不以任何方式受限於本文中所述之實例。熟習此項技術者將明瞭所揭示實施例之各種改變及修改，且可在不背離本揭示內容之精神及隨附申請專利範圍之範圍的情況下作出此等改變及修改，其包括(但不限於)與本揭示內容之化學結構、取代基、衍生物、調配物或方法相關之彼等。本文方案中之結構中之變量的定義與本文所呈現各式中之相應位置之彼等變量相稱。
實例 1 ： NCP2 錨合成
1. 4-氟-3-硝基苯甲酸甲基酯(1 )之製備
向100 L燒瓶裝填12.7 kg之4-氟-3-硝基苯甲酸，並添加40 kg甲醇及2.82 kg濃硫酸。將混合物在回流(65℃)下攪拌36小時。將反應混合物冷卻至0℃。在38℃下形成晶體。將混合物在0℃下保持4小時，然後在氮下過濾。洗滌該100 L燒瓶，並用10 kg已冷卻至0℃之甲醇洗滌濾餅。將固體濾餅在漏斗上乾燥1小時，轉移至托盤，並在真空烘箱中在室溫下乾燥至恆重13.695 kg 4-氟-3-硝基苯甲酸甲基酯(100%產率；HPLC 99%)。
2. 3-硝基-4-(2-側氧基丙基)苯甲酸之製備
A. (Z)-4-(3-羥基-1-甲氧基-1-側氧基丁-2-烯-2-基)-3-硝基苯甲酸甲基酯(2 )
向100 L燒瓶裝填3.98 kg來自先前步驟之4-氟-3-硝基苯甲酸甲基酯(1 )、9.8 kg DMF、2.81 kg乙醯乙酸甲酯。攪拌混合物並冷卻至0℃。經約4小時向此添加3.66 kg DBU，同時將溫度維持在5℃或5℃以下。將混合物再攪拌1小時。向反應燒瓶添加8.15 kg檸檬酸於37.5 kg純化水中之溶液，同時將反應溫度維持在15℃或15℃以下。添加後，將反應混合物再攪拌30分鐘，然後在氮下過濾。使濕濾餅與14.8 kg純化水一起返回至該100 L燒瓶。將漿液攪拌10分鐘，然後過濾。使濕濾餅再次返回至該100 L燒瓶，與14.8 kg純化水一起製漿10分鐘，且過濾為粗製(Z)-4-(3-羥基-1-甲氧基-1-側氧基丁-2-烯-2-基)-3-硝基苯甲酸甲基酯。
B. 3-硝基-4-(2-側氧基丙基)苯甲酸
在氮下向100 L反應燒瓶裝填粗製(Z)-4-(3-羥基-1-甲氧基-1-側氧基丁-2-烯-2-基)-3-硝基苯甲酸甲基酯。向此添加14.2 kg 1,4-二噁烷並攪拌。經2小時向混合物添加16.655 kg濃HCl及13.33 kg純化水(6 M HCl)之溶液，同時將反應混合物之溫度維持在15℃以下。當添加完成時，將反應混合物在回流(80℃)下加熱24小時，冷卻至室溫，並在氮下過濾。將固體濾餅與14.8 kg純化水一起研磨，過濾，再與14.8 kg純化水一起研磨並過濾。使固體與39.9 kg DCM一起返回至100 L燒瓶，並在攪拌下回流1小時。添加1.5 kg純化水以溶解剩餘固體。將底部有機層分離至預熱之72 L燒瓶，然後返回至乾淨之乾100 L燒瓶。使溶液冷卻至0℃，保持1小時，然後過濾。將固體濾餅洗滌兩次，每次用9.8 kg DCM及5 kg庚烷之溶液，然後在漏斗上乾燥。將固體轉移至托盤並乾燥至恆重1.855 kg 3-硝基-4-(2-側氧基丙基)苯甲酸。化合物1 之總產率為42%。HPLC 99.45%。
3. N-三苯甲基六氫吡嗪琥珀酸鹽(NTP)之製備
在氮下向72 L夾套燒瓶裝填1.805 kg三苯基氯甲烷及8.3 kg甲苯(TPC溶液)。攪拌混合物直到固體溶解為止。在氮下向100 L夾套反應燒瓶添加5.61 kg六氫吡嗪、19.9 kg甲苯及3.72 kg甲醇。攪拌混合物並冷卻至0℃。經4小時分多次向此緩慢添加TPC溶液，同時將反應溫度維持在10℃或10℃以下。將混合物在10℃下攪拌1.5小時，然後使其升溫至14℃。將32.6 kg純化水裝填至72 L燒瓶，然後轉移至100 L燒瓶，同時將內部批料溫度維持在20+/-5℃。使各層分離，並將底部水層分離並儲存。將有機層萃取三次，每次用32 kg之純化水，並將水層分離且與儲存水溶液合併。
使剩餘有機層冷卻至18℃並分多次將847 g琥珀酸於10.87 kg純化水中之溶液緩慢添加至有機層。將混合物在20+/-5℃下攪拌1.75小時。過濾該混合物，並將固體用2 kg TBME及2 kg丙酮洗滌，然後在漏斗上乾燥。將濾餅與每次5.7 kg之丙酮一起研磨兩次並過濾，且在研磨之間用1 kg丙酮洗滌。將固體在漏斗上乾燥，然後轉移至托盤並在真空烘箱中在室溫下乾燥至恆重2.32 kg NTP。產率80%。
4. (4-(2-羥基丙基)-3-硝基苯基)(4-三苯甲基六氫吡嗪-1-基)甲酮之製備
A. 1-(2-硝基-4(4-三苯甲基六氫吡嗪-1-羰基)苯基)丙-2-酮之製備
在氮下向100 L夾套燒瓶裝填2 kg 3-硝基-4-(2-側氧基丙基)苯甲酸(3 )、18.3 kg DCM、1.845 kg N-(3-二甲基胺基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)。攪拌溶液直至形成均質混合物為止。在室溫下經30分鐘添加3.048 kg NTP並攪拌8小時。將5.44 kg純化水添加至反應混合物並攪拌30分鐘。使各層分離，並將含有產物之底部有機層排乾並儲存。用5.65 kg DCM將水層萃取兩次。將合併之有機層用1.08 kg氯化鈉於4.08 kg純化水中之溶液洗滌。使有機層經1.068 kg硫酸鈉乾燥並過濾。用1.3 kg DCM洗滌硫酸鈉。將合併之有機層與252 g矽膠一起製漿並經由含有252 g矽膠床之過濾漏斗過濾。用2 kg DCM洗滌矽膠床。將合併之有機層在旋轉蒸發儀上蒸發。將4.8 kg THF添加至殘餘物且然後在旋轉蒸發儀上蒸發直至達到於THF中2.5體積之粗製1-(2-硝基-4(4-三苯甲基六氫吡嗪-1-羰基)苯基)丙-2-酮為止。
B. (4-(2-羥基丙基)-3-硝基苯基)(4-三苯甲基六氫吡嗪-1-基)甲酮(5 )之製備
在氮下向100 L夾套燒瓶裝填3600 g來自先前步驟之4 及9800 g THF。使攪拌溶液冷卻至≤5℃。用11525 g乙醇稀釋該溶液且在≤5℃下經約2小時添加194 g硼氫化鈉。將反應混合物在≤5℃下再攪拌2小時。用約1.1 kg氯化銨於約3 kg水中之溶液藉由緩慢添加以將溫度維持在≤10℃來使反應淬滅。將反應混合物再攪拌30分鐘，過濾以去除無機物，且重新裝填至100 L夾套燒瓶並用23 kg DCM萃取。分離有機層，且將水層再萃取兩次，每次用4.7 kg之DCM。將合併之有機層用約800 g氯化鈉於約3 kg水中之溶液洗滌，然後經2.7 kg硫酸鈉乾燥。過濾懸浮液，並用2 kg DCM洗滌濾餅。將合併之濾液濃縮至2.0體積，用約360 g乙酸乙酯稀釋並蒸發。在氮下將粗產物裝載至填充有DCM之4 kg二氧化矽之矽膠柱上，並用於7.2 kg DCM中之2.3 kg乙酸乙酯溶析。將合併部分蒸發並將殘餘物溶於11.7 kg甲苯中。過濾甲苯溶液並將濾餅洗滌兩次，每次用2 kg之甲苯。將濾餅乾燥至恆重2.275 kg化合物5 (自化合物3 46%產率)，HPLC 96.99%。
5. 碳酸(1-(2-硝基-4-(4-三苯基甲基六氫吡嗪-1羰基)苯基)丙-2-基)酯2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(NCP2 錨 )之製備
在氮下向100 L夾套燒瓶裝填4.3 kg化合物5 (基於殘餘甲苯藉由H1 NMR調整重量；此後相應地縮放所有試劑之規模)及12.7 kg吡啶。向此裝填3.160 kg DSC (78.91重量%，H1 NMR)，同時將內部溫度維持在≤35℃。將反應混合物在周圍環境下老化約22小時，然後過濾。用200 g吡啶洗滌濾餅。在兩個各自包含½濾液體積之批料中，將濾液洗滌液緩慢裝填至含有約11 kg檸檬酸於約50 kg水中之溶液之100 L夾套燒瓶並攪拌30分鐘以使固體沈澱。利用過濾漏斗收集固體，用4.3 kg水/洗滌洗滌兩次，並在真空下在過濾漏斗上乾燥。
將合併之固體裝填至100 L夾套燒瓶並溶解於28 kg DCM中，且用900 g碳酸鉀於4.3 kg水中之溶液洗滌。1小時後，使各層分離並去除水層。用10 kg水洗滌有機層，分離，且經3.5 kg硫酸鈉乾燥。將DCM過濾，蒸發，並在真空下乾燥至6.16 kgNCP2 錨 (114%產率)。
實例 2 ：載錨樹脂合成
向具有鐵氟龍停止旋塞之75 L固相合成反應器裝填約52 L NMP及2300 g胺基甲基聚苯乙烯樹脂。將樹脂於NMP中攪拌以溶脹約2小時，然後排乾。將樹脂用約4 L DCM /洗滌洗滌兩次，然後用39 L中和溶液/洗滌洗滌兩次，然後用39 L DCM /洗滌洗滌兩次。將NCP2錨溶液緩慢添加至攪拌樹脂溶液，在室溫下攪拌24小時並排乾。將樹脂用39 L NMP /洗滌洗滌四次，並用39 L DCM /洗滌洗滌六次。將樹脂用½ DEDC封端溶液處理並攪拌30分鐘，排乾，並用第二個½ DEDC封端溶液處理並攪拌30分鐘且排乾。將樹脂用39 L DCM /洗滌洗滌六次，然後於烘箱中乾燥至恆重3573.71 g載錨樹脂。
實例 3 ：經活化之 EG3 尾之製備
1. 三苯甲基六氫吡嗪胺基甲酸苯基酯35之製備
向NTP於二氯甲烷(6 mL/g NTP)中之冷卻懸浮液添加碳酸鉀(3.2 eq)於水(4 mL/g碳酸鉀)中之溶液。向此兩相混合物緩慢添加氯甲酸苯基酯(1.03 eq)於二氯甲烷(2 g/g氯甲酸苯基酯)中之溶液。將反應混合物升溫至20℃。在反應完成後(1-2小時)，分離各層。用水洗滌有機層，且經無水碳酸鉀乾燥。產物35係藉由自乙腈結晶來分離。產率=80%
2. 胺基甲酸酯醇36之製備
將氫化鈉(1.2 eq)懸浮於1-甲基-2-吡咯啶酮(32 mL/g氫化鈉)中。向此懸浮液添加三乙二醇(10.0 eq)及化合物35 (1.0 eq)。將所得漿液加熱至95℃。在反應完成後(1-2小時)，使混合物冷卻至20℃。向此混合物添加30%二氯甲烷/甲基第三丁基醚(v:v)及水。用NaOH水溶液、琥珀酸水溶液及飽和氯化鈉水溶液相繼洗滌含有產物之有機層。產物36係藉由自二氯甲烷/甲基第三丁基醚/庚烷結晶來分離。產率=90%。
3. EG3尾酸37之製備
向化合物36於四氫呋喃中之溶液(7 mL/g 36)添加琥珀酸酐(2.0 eq)及DMAP (0.5 eq)。將混合物加熱至50℃。在反應完成後(5小時)，使混合物冷卻至20℃並利用NaHCO3水溶液調整至pH 8.5。添加甲基第三丁基醚，並將產物萃取至水層中。添加二氯甲烷，並利用檸檬酸水溶液將混合物調整至pH 3。用pH=3之檸檬酸鹽緩衝液及飽和氯化鈉水溶液之混合物洗滌含有產物之有機層。37之此二氯甲烷溶液不經分離即用於化合物38之製備中。
4. 經活化之EG3尾38之製備
向化合物37之溶液添加N-羥基-5-降莰烯-2,3-二甲酸醯亞胺(HONB) (1.02 eq)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP) (0.34 eq)及然後1-(3-二甲基胺基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) (1.1 eq)。將混合物加熱至55℃。在反應完成後(4-5小時)，使混合物冷卻至20℃，且相繼用1:1 0.2 M檸檬酸/鹽水及鹽水洗滌。二氯甲烷溶液經歷溶劑交換為丙酮且然後為N,N-二甲基甲醯胺，且產物係藉由自丙酮/N,N-二甲基甲醯胺沈澱至飽和氯化鈉水溶液中來分離。將粗產物於水中重新製漿若干次來去除殘餘N,N-二甲基甲醯胺及鹽。產率=自化合物36 70%之經活化之EG3尾38。
實例 4 ：二硫化物錨合成
向於矽烷化夾套肽容器中之胺基甲基聚苯乙烯樹脂(100-200目；—1.0 mmol/g N2取代；75 g, 1 eq, Polymer Labs, UK, 部件號1464-X799)添加1-甲基-2-吡咯啶酮(NMP；20 ml/g樹脂)，且使樹脂在混合下溶脹1-2小時。在將溶脹溶劑排空後，用二氯甲烷(2 × 1-2 min)、於25% 異丙醇/二氯甲烷中之5%二異丙基乙胺(2 × 3-4 min)及二氯甲烷(2 × 1-2 min)洗滌樹脂。在將最終洗滌液排空之後，用二硫化物錨34於1-甲基-2-吡咯啶酮(0.17 M；15 mL/g樹脂，—2.5 eq)中之溶液使樹脂流化，並將樹脂/試劑混合物在45℃下加熱60小時。反應完成後，中斷加熱且將錨溶液排空，並用1-甲基-2-吡咯啶酮(4 × 3-4 min)及二氯甲烷(6 × 1-2 min)洗滌樹脂。將樹脂用10% (v/v)二碳酸二乙基酯於二氯甲烷(16 mL/g；2 × 5-6 min)中之溶液處理且然後用二氯甲烷(6 × 1-2 min)洗滌。將樹脂40在N2流下乾燥1-3小時且然後在真空下乾燥至恆重(± 2%)。產率：原始樹脂重量之110%-150%。
實例 5 ：依替利森粗製原料藥之 250 mg 固相合成
1. 材料
表 2 ： 起始材料
起始材料之化學結構：
A. 經活化之EG3尾

化合物(B)
B. 經活化之C亞單元(關於製備，參見美國專利第8,067,571號)

化合物(C1)
C. 經活化之A亞單元(關於製備，參見美國專利第8,067,571號)

化合物(D1)
D. 經活化之DPG亞單元(關於製備，參見WO 2009/064471)

化合物(E1)
E. 經活化之T亞單元(關於製備，參見WO 2013/082551)

化合物(F1)
F. 載錨樹脂：NCP2

式(G1)
其中R1 係載體介質。
G. 載錨樹脂：二硫化物

式(H1)
其中R1 係載體介質。


表 3 ： 用於依替利森粗製原料藥之固相寡聚物合成之溶液之描述
2. 依替利森粗製原料藥之殘餘物1-10之合成
A. 樹脂溶脹
將250 mg載錨樹脂及NMP裝填至矽烷化反應器並攪拌3小時。將NMP排乾且將載錨樹脂用DCM洗滌兩次並用30% TFE/DCM洗滌五次。
B. 循環0：EG3尾偶合
將載錨樹脂用30% TFE/DCM洗滌三次並排乾，用CYTFA溶液洗滌15分鐘並排乾，且再次用CYTFA溶液洗滌15分鐘而不排乾，向其裝填1:1 NEM/DCM，且將懸浮液攪拌2分鐘並排乾。將樹脂用中和溶液洗滌5分鐘兩次並排乾，然後用每次DCM洗滌兩次並排乾。將經活化之EG3尾及NEM於DMI中之溶液裝填至樹脂且在室溫下攪拌3小時並排乾。將樹脂用中和溶液洗滌兩次(每次洗滌5分鐘)，並用DCM洗滌一次且排乾。裝填苯甲酸酐及NEM於NMP中之溶液並攪拌15分鐘且排乾。將樹脂與中和溶液一起攪拌5分鐘，然後用DCM洗滌一次並用30% TFE/DCM洗滌兩次。將樹脂懸浮於30% TFE/DCM中並保持14小時。
C. 亞單元偶合循環1-10
i. 偶合前處理
如表4中所描述在每一偶合循環之前，將樹脂：1) 用30% TFE/DCM洗滌；2) a) 用CYTFA溶液處理15分鐘且排乾，及b) 用CYTFA溶液處理15分鐘，向此添加1:1 NEM/DCM，攪拌，且排乾；3) 與中和溶液一起攪拌三次；及4) 用DCM洗滌兩次。參見表4。
ii. 偶合後處理
如表4中所描述在每一亞單元溶液排乾之後，將樹脂：1) 用DCM洗滌；及2) 用30% TFE/DCM洗滌兩次。若樹脂在下一偶合循環之前保持一段時期，則不將第二TFE/DCM洗滌液排乾，且將樹脂保留在該TFE/DCM洗滌溶液中。參見表4。
iii. 經活化之亞單元偶合循環
如表4中所描述進行偶合循環。
iv. 最終IPA洗滌
如表4中所描述在最終偶合步驟進行之後，將樹脂用IPA洗滌8次，且在真空下在室溫下乾燥約63.5小時至乾重為1.86 g。
D. 裂解
將上文樹脂結合之依替利森粗製原料藥分成兩份，如下對每一份進行處理。將929 mg份之樹脂：1) 與NMP一起攪拌2小時，然後將NMP排乾；2) 用30% TFE/DCM洗滌三次；3) 用CYTFA溶液處理15分鐘；及4) 用CYTFA溶液處理15分鐘，然後向此添加1:1 NEM/DCM溶液並攪拌2分鐘且排乾。將樹脂用中和溶液處理三次，用DCM洗滌六次且用NMP洗滌八次。用510 mg DTT及992 mg DBU於2.3 mL NMP中之裂解溶液將樹脂處理2小時以將依替利森粗製原料藥自樹脂分離。將裂解溶液排乾並保留在單獨容器中。用1.6 mL NMP洗滌反應器及樹脂，將其與裂解溶液合併。
表 4 ：



表 4 續。
E. 去保護
將合併之裂解溶液及NMP洗滌液轉移至壓力容器，向該壓力容器添加13.3 mL已在冷凍器中冷凍至-10℃至-25℃之溫度之NH4 OH (NH3 •H2 O)。將壓力容器密封並加熱至45℃持續16小時，然後使其冷卻至25℃。將此含有依替利森粗製原料藥之去保護溶液用純化水稀釋(3:1)並用2 M磷酸將pH調整至3.0，然後用NH4 OH調整至pH 8.03。
3. 依替利森粗製原料藥之合成
依替利森可使用如實例5之部分2中所闡述之步驟A-E及使用下表5中所給出之資訊來合成。
表 5 ：







實例 6 ：流動合成器之設計
流動PMO合成器示於(圖4)中。試劑儲器係GL45螺紋介質瓶，其裝配有蓋子以維持乾氮之正壓且容許無水轉移溶劑。每一試劑儲器連接至四位Swagelok SS-43ZFS2手動選擇閥上之四個可選埠中之一者。共用埠經由Swagelok (SS-QM2-B-200KR及SS-QM2-S-200)關斷快速連接器連接至HPLC幫浦，該關斷快速連接器可在不使用時斷開連接以防止增加溶劑之虹吸。HPLC幫浦係具有25 ml/min不銹鋼幫浦頭之Varian 210。低壓(入口側)管為1/8" OD、1/16" ID PFA。HPLC幫浦出口連接至40 psi背壓調節器(P-785)及使用1/16" OD、0.030" ID PFA管之陽魯爾鎖快速連接器(Idex P-655)。當使用HPLC幫浦時，此快速連接器與反應器入口管線上之陰魯爾鎖快速連接器配合。當不使用HPLC幫浦時，反應器入口管線附接至注射幫浦(Harvard Apparatus PhD 3000)上之偶合劑注射器。
反應器入口管線係由陰魯爾鎖快速連接器(Idex P-658)及止回閥(Idex CV-3316)組成，其利用約18英吋之1/16" OD PFA管經由Swagelok管套節(SS-100-6)接合至5英尺不銹鋼預熱迴路(1/16" OD, 0.030" ID, Idex U-107)。此預熱迴路連接至與先前針對肽合成所闡述之反應器相同之反應器。反應器出口連接至250 psi背壓調節器(Idex P-788)，可藉由打開旁通閥(Idex P-733)繞過該背壓調節器。旁通流體路徑在T (P-632)中重新連接背壓調節器之出口，通過止回閥(Idex P-788)及六英吋之管，之後到達甲烷磺酸T (Swagelok SS-100-3)。此時，視情況利用具有50 mL/min鈦頭之Knauer smartline HPLC幫浦輸注於DCM中之20% MeHSO4以再生三苯甲基陽離子以用於UV監測去保護。然後使混合流體通過UV檢測器(Agilent G1315D)、20 psi背壓調節器(Idex P-791)且至廢料。
在未闡述之情形下，HPLC幫浦及注射器下游之管為1/16" OD, 0.030" ID PFA。所有¼-28平底配件均係Idex超級無法蘭的(XP-131及XP-141)。
試劑儲器
試劑儲器提供有用於與具有孔之GL-45帽(Chemglass)一起使用之機器加工接頭。該等接頭具有三個¼-28螺紋埠(圖7)。兩個埠具有1/8"通孔；第三埠具有1/16"通孔。第一孔用於試劑抽出管線。第二孔用作填充埠，且第三孔用於氮氣供應(4 psi)。試劑抽出管線為插入至試劑儲器底部中之1/8"管線且利用超級無法蘭配件(Idex XP-131)適當密封。氮氣藉由抵靠1/16"通孔安置之1/8"管線供應且用超級無法蘭配件密封。填充埠係由插入至機器加工接頭底部正下方之薄壁1/8" OD、0.1" ID不銹鋼管組成且用超級無法蘭配件適當密封。自由側配有關斷快速連接器(Swagelok SS-QM2-B-200KR)，其在不使用時密封但可用於在稍高之壓力下自第二無水溶劑儲器填充儲器。該第二儲器具有類似設計且使用10 psi氬來轉移無水溶劑。在填充期間，容許氮系統經由5 psi背壓調節器及油鼓泡器排氣。
實例 7 ：流動合成之一般程序
使用以下程序用於流動合成。將樹脂裝載至反應器中，將反應器連接至HPLC幫浦，且以10 mL/min遞送鹵化洗滌溶劑以去除空氣。使流動停止且使樹脂充分溶脹10分鐘。利用初始鹵化溶劑以10 mL/min洗滌60秒起始流動方案。利用100 mM三氟乙酸吡啶以相同流速進行去三苯甲基化120秒。去三苯甲基化步驟亦可使用可力丁、盧剔啶或4-氰基吡啶(圖3A、圖3B、圖3C及圖3D)來進行。在30秒鹵化溶劑洗滌之後，利用5% DIEA或NEM進行中和60秒。然後每次以10 mL/min用鹵化溶劑及DMI將樹脂洗滌60秒。然後使HPLC幫浦停止以進行偶合步驟。將偶合溶液(於無水DMI中之0.2 M亞單元、0.4 M DIEA或NEM及0.21 M LiBr)置於10 mL注射器中且經由注射幫浦以3 mL/min經1分鐘(0.5 mmol單體)或2分鐘(1 mmol單體)來遞送。經測定，單體在溴化鋰存在下在介於90℃與110℃之間的溫度下穩定(圖1)。當所有溶液均遞送時，HPLC幫浦以3 mL/min遞送DMI達三分鐘。對每一殘餘物重複此方案直至合成完成為止。將成品樹脂自反應器移除，於燒結注射器(Torviq)中用DCM洗滌5次，且在真空下乾燥。如上進行裂解。
對於在升高溫度下之步驟而言，將反應器及預熱迴路置於恆溫水浴中。
對於HPLC純化，將樹脂在溫和條件下(4:1乙醇/氫氧化銨)裂解，且然後藉由固相萃取(SPE)分離。在使用該等溫和條件裂解之前，樹脂結合PMO對多種反應條件穩定(圖2)。首先，將裂解之樹脂過濾並用甲醇洗滌4次。收集裂解溶液及洗滌液，且使用旋轉蒸發器濃縮至乾燥。將殘餘物溶解於10 mL Milli-Q水中，之後進行SPE。單獨地，使用以下程序製備並調節SPE管柱。向來自Bio-Rad之20 mL Econo-Pac管柱中填充3-4 mL Amberchrome CG-300M樹脂並用玻料密封。然後，將8 mL以下溶液按順序添加至管柱且排乾，之後添加下一溶液：於1% NH4 OH中之80% ACN、於20% EtOH中之0.5 M NaOH、Milli-Q水、於80% ACN中之50 mM H3 PO4 、Milli-Q水、於20% EtOH中之0.5 M NaOH、Milli-Q水、1% NH4 OH。當調節完成時，在室溫下將管柱儲存於8 mL 1% NH4 OH中直至使用。將管柱用12 mL Milli-Q水沖洗兩次，之後將PMO裝載至管柱上。然後，將管柱用3 mL 1 M NaCl沖洗一次，之後用12 mL Milli-Q水沖洗三次且用3 ml 10%乙腈水溶液沖洗一次。然後用3 ml 50%乙腈水溶液沖洗兩次來溶析PMO。將來自50%乙腈洗滌液之溶析液收集至預稱重之50 mL錐形離心管中並凍乾，得到呈白色粉末之適於LC/MS分析及/或製備型HPLC純化之粗製PMO。
若干種PMO在質量定向純化系統上純化，該質量定向純化系統係由耦合至Agilent 6130單四極桿質譜儀之Agilent 1260 Infinity Quaternary HPLC組成(圖5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖5E、圖6A、圖6B、圖6C、圖6D及圖6E)。用於純化之溶劑混合物如下：A = 5 mM NH4 OAc (pH =8)，B = 90%乙腈+ 10% 5 mM NH4OAc (pH =8)。使用以下條件來進行純化：管柱：Zorbax 300-SB C3 (5 μm, 21.2 × 100 mm)；流速：20 mL/min；梯度：0-2 min 2% B、2-60 min 2-60% B、60-70 min 75% B。
表 6. 縮寫字
以引用方式併入
本申請案中通篇所引用之所有參考(包括參考文獻、授權專利、公開專利申請案及及共同待決之專利申請案)之內容均係以全文引用的方式明確地併入本文中。除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均符合熟習此項技術者所通常已知之含義。
等效形式
熟習此項技術者僅使用常規實驗即可識別或能夠確定本文中所闡述本揭示內容之具體實施例之多種等效形式。此等等效形式意欲涵蓋於以下申請專利範圍中。
圖 1 顯示腺苷單體在有LiBr或無LiBr之情形下在90℃、100℃、110℃及150℃下之穩定性。
圖 2 顯示樹脂結合PMO之穩定性。
圖 3 顯示使用以下在90℃下之去三苯甲基化：A) 可力丁(Collidine) TFA；B) 盧剔啶(Lutidine) TFA；C) 吡啶TFA；及D) 4-氰基吡啶TFA。
圖 4 顯示流動PMO合成器之完整示意圖。
圖 5A 、圖 5B 、圖 5C 、圖 5D 及圖 5E 顯示合成模型四聚體5’-尾-ACGT-3’-Trt之總離子層析圖。
圖 6A 、圖 6B 、圖 6C 、圖 6D 及圖 6E 顯示合成依替利森(1-10)之總離子層析圖。亦顯示MALDI-TOF質譜。
圖 7 顯示具有三個埠之分段試劑儲器頂部之示意圖。

Claims (20)

  1. 一種用於製備式(I)之寡聚化合物之方法， (I)； 其中 n係9至39之整數； T係OH或；且 每一R2 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：(C)、(G)、(T)、(A)、(5mC)、(U)及(I)； 其中該方法包含以下連續步驟： (a) 使式(A1)化合物： (A1)； 其中 B係或； R1 係載體介質；且 R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基； 與解封端劑接觸以形成式(II)化合物： (II)； 其中B係或；且 R1 係載體介質； (b) 使該式(II)化合物與式(A2)化合物接觸： (A2)； 其中R5 係或； R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 係選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； 以形成式(A3)化合物： (A3)； 其中 B係或； R1 係載體介質； R5 係或； R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 係選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； (c) 使該式(A3)化合物與解封端劑接觸，以形成式(IV)化合物： (IV)； 其中B係或； R1 係載體介質； R6 係或；且 R4 係選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； (d) 在路易斯酸(lewis acid)觸媒存在下使該式(IV)化合物與式(A4)化合物接觸： (A4) 其中 R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 係選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； 以形成式(A5)化合物： (A5)； 其中R7 具有式(A5a)或式(A5b)：(A5a)或(A5b)； B係或； R1 係載體介質； R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 係選自：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； (e) 實施以下連續步驟之Y個反覆： (e1) 使由緊接之先前步驟所形成之產物與解封端劑接觸；及 (e2) 在路易斯酸觸媒存在下使由緊接之先前步驟所形成之化合物與式(A8)化合物接觸： (A8) 其中 若R7 具有該式(A5a)，則Y係n-1，或若R7 具有該式(A5b)，則Y係n-2； R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 獨立於每一式(A8)化合物係選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； 以形成式(A9)化合物： (A9)； 其中R8 係或； B係或； n係9至39之整數； R1 係載體介質； R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；且 (f) 使該式(A9)化合物與解封端劑接觸以形成式(A10)化合物： (A10)； 其中R9 係或； B係或； n係9至39之整數； R1 係載體介質；且 R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； (g) 使該式(A10)化合物與裂解劑接觸以形成式(A11)化合物： (A11)； 其中 R9 係或； C係或H； n係9至39之整數；且 R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；且 (h) 使該式(A11)化合物與去保護劑接觸以形成式(I)之該寡聚化合物。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟(d)或(e2)中之一者進一步包含使由緊接之先前步驟所形成之化合物與封端劑接觸。
  3. 如請求項1至2中任一項之方法，其中步驟(a)、(c)、(e1)及(f)進一步包含使每一步驟之該解封端化合物與中和劑接觸。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該等式(A4)及式(A8)之化合物各自獨立地在包含N-乙基嗎啉及二甲基咪唑啶酮之溶液中。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該裂解劑包含二硫蘇糖醇及1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一-7-烯。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中對於步驟(a)至(g)而言，B係，且對於步驟(h)而言，C係。
  7. 如請求項1之方法，其中步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e1)、(e2)、(f)、(g)或(h)中之任一者係以批式合成或以連續合成來實施。
  8. 一種用於製備式(A11)之寡聚化合物之連續方法， (A11)； 其中R9 係； C係； n係9至39之整數；且 R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； 其中該方法包含以下連續步驟： (a) 於反應器容器中使解封端劑與式(A3)化合物接觸： (A3)； 其中B係； R1 係載體介質； R5 係；且 R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基； 以形成式(IV)化合物： (IV)； 其中B係； R1 係載體介質； R6 係； (b) 用洗滌溶劑及中和劑洗滌該式(IV)化合物，其中該洗滌包含使洗滌溶劑及中和劑穿過該反應器容器； (c) 用洗滌溶劑洗滌該式(IV)化合物，其中該洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器； (d) 用偶合溶劑洗滌該式(IV)化合物，其中該洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器； (e) 向該反應器容器引入路易斯酸及式(A4)化合物： (A4)； 其中 R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 係選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； 使得該式(A4)化合物接觸該式(IV)化合物以形成式(A5)化合物： (A5)； 其中R7 具有式(A5a)：(A5a)； B係， R1 係載體介質； R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 係選自：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； (f) 用偶合溶劑洗滌該式(A5)化合物，其中該洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器； (g) 實施以下連續步驟之Y個反覆： (g1) 用洗滌溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中該洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器； (g2) 將解封端劑引入至該反應器容器中，從而使得其接觸由緊接之先前步驟所形成之產物； (g3) 用洗滌溶劑及中和劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中該洗滌包含使洗滌溶劑及中和劑穿過該反應器容器； (g4) 用洗滌溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中該洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器； (g5) 用偶合溶劑洗滌由緊接之先前步驟所形成之產物，其中該洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器； (g6) 向含有由緊接之先前步驟所形成產物之該反應器容器引入路易斯酸及式(A8)化合物： (A8)； 其中 Y係n-1； R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 獨立於每一式(A8)化合物係選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； 從而使得該式(A8)化合物接觸由緊接之先前步驟所形成之化合物以形成式(A9)化合物： (A9)； 其中R8 係； B係； n係9至39之整數； R1 係載體介質； R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； (h) 用偶合溶劑洗滌該式(A9)化合物以去除該式(A8)化合物，其中該洗滌包含使偶合溶劑穿過該反應器容器； (i) 用洗滌溶劑洗滌該式(A9)化合物以去除該偶合溶劑，其中該洗滌包含使洗滌溶劑穿過該反應器容器； (j) 於反應器容器中使解封端劑與式(A9)化合物接觸以形成式(A10)化合物： (A10)； 其中R9 係； B係； n係9至39之整數； R1 係載體介質；且 R4 在每次出現時係獨立地選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)；且 (k) 於反應器容器中使裂解劑與式(10)化合物接觸以形成式(A11)化合物。
  9. 如請求項8之方法，其中步驟(a)、(g2)及(j)進一步包含使每一各別步驟之該解封端化合物與中和劑接觸。
  10. 如請求項8至9中任一項之方法，其中該洗滌溶劑係鹵化溶劑。
  11. 如請求項8至10中任一項之方法，其中該偶合溶劑係1,3-二甲基-2-咪唑啶酮或N-甲基-2-吡咯啶酮。
  12. 如請求項8至11中任一項之方法，其中對於步驟(a)至(j)而言，B係，且對於步驟(k)而言，C係。
  13. 如請求項8至12中任一項之方法，其中步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g1)、(g2)、(g3)、(g4)、(g5)、(g6)、(h)、(i)、(j)及(k)中之任一者視情況係以批式製程來實施。
  14. 如請求項8之方法，其中該方法係在流通式反應器中進行，該流通式反應器至少包含： (a) 進料區，其中該進料區包含一或多個各自裝配有幫浦之進料管線，且其中該等進料管線之入口區獨立地連接至包含以下之容器：中和劑、偶合溶劑、解封端劑、洗滌溶劑及式(A8)化合物： (A8)； 其中 R3 係選自由以下組成之群：三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基及三甲氧基三苯甲基；且 R4 獨立於每一式(A8)化合物係選自由以下組成之群：(PC)、(DPG)、(T)、(PA)、(P5mC)、(U)、(I)及(PG)； 其中該式(A8)化合物溶解於偶合溶劑中； (b) 反應區，其連接至該一或多個進料管線之出口區且其含有PMO合成樹脂； (c) 出口區，在此可獨立地收集廢料流或產物； (d) 壓力控制裝置；及 (e) 獨立地控制該進料區及該反應區之溫度之構件。
  15. 如請求項14之方法，其中該流通式反應器係用於依替利森(Eteplirsen)之製備。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該解封端劑係選自由以下組成之群：氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸及三氟乙酸。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中每一步驟中所使用之該解封端劑係包含鹵代酸之溶液。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該路易斯酸係選自由以下組成之群：LiCl、LiBr、LiI及LiOTf。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該中和劑係在包含鹵化溶劑及異丙醇之溶液中。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該中和劑係單烷基胺、二烷基胺或三烷基胺。 [1] ml指示1:1 NEM/DCM之量 [2] ml指示1:1 NEM/DCM之量
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