TW296431B - - Google Patents

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A7 B7 —---------—-- 五、發明説明（1 ) M .明啥署、 本發明係有闞檢測及計算血樣中網織紅血球數之方法。 更特定言之，本發明係有關一種染料，其適合為核糖核酸 (RNA)及核糖核酸聚合物染色，且特，別適合利甩#光流動 细胞計數器技術檢測網織紅血球。 祖_M枝蓊 網織紅血球為沒有核心之未成熟紅血球（RBC)。已知網 織紅血球含有RKA ，且血樣中網織紅血球之檢測及計數具 有臨床價值。血樣中網織紅血球數已用為紅血球製造活性 之指標，在急性出血、溶血性貧血及骨髄移植上具有診斷 及預後之價值，且可測定對锇、維生素B12及葉酸療法之 反應。如相關技藝已知者，網織紅血球為形成成熟紅血球 之前體，因此網織紅血球一詞涵括形成成熟紅血球之细胞 之進化及發展。 nn IH9 m^i tln ^^^^1 B— nn a^^i— ^^—B— m • 4^.--5· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 過去，血樣中網織紅血球之測定係利用手動及自動二種 方法’使用適當染色劑如：新亞甲藍（NMB)、亮甲苯藍

使用新亞#藍染料之活染色法被視為測定網織紅血球之 參考方法，且使用此染料時，^使沉澱。該方法為手 歯ί式：’需要利用顯微鏡計算大量细胞（例如：5 0 0至 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 ’ 〇〇〇) ’因此媛慢、單調，且會出現統計錯誤。新亞甲藍 為非蛮光性，且真正沉澱之RNA經常很難與沉溅之染色點 區分。 橙有時候會利用手動及自動二種過程用來染色網織 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（2丨似加公餐） 296431 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2 ) 紅血球。吖啶橙使R H A沉澱；但由於可能發生消光現象， 因此無法定量估算RNA含量。此外，吖啶橙無法使染色之 细胞產生擴散之螢光分佈，使得细胞i年龄分佈祖肜（根 據RNA含量與螢光之比例）不可靠。吖啶橙對流動细胞計數〜 器之塑膠管有很大親和力，造成背景增加，且需耗費冗長 手績來排除流動細胞計數器之管子中之染料。此外，經吖 啶橙染色之细胞很難與紅血球自發性螢光尖峰區分，且網 織紅血球數經常低於Μ新亞甲藍测得之數。 使用焦寧丫時，需先Μ搐馬林固定紅血球；此舉費事、 費時，且經常產生不良結果。此外，焦寧丫之量子效率極 低，產生之螢光訊號極低。 使用噻唑橙檢測網織紅血球之實例可見於美國專利案 No. 4,883,867(1989年 11月 28日發佈），其係 1985 年 11月 1日申請之專利案糸列N 〇 . 7 9 3，8 1 3之部份連續案，該方 法目前已放棄不用了。 使用硫黃素T檢測網織紅血球之實例可見於1986年2月 1δ日ΙΓ佈之美國專利案No, 4,571,388。 夏皮洛（Shapiro) ，Μ.哈沃德（Howard)之”實用流動妞 胞計數學 ” （Practical Flow Cytometry) ， P.144，亞蘭 R·李斯公司（Alan R. Liss, Inc.) 1985年，在 7-3 表中 列出用來染色DNA及/或RNA之三環糸雜芳糸化合物。雖然 表7-3列出黃精膦0 (CP0)，但並未K CP0作為網嫌紅血球 或R N A之染色劑。 發明概蓉 --J-----^--:衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •ΙΊ訂 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_5_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 ) •本發明提供一種染料及含此染料之試劑，供定量血樣中 之網織紅血球。 本發明提供一種定量網織紅血球之古法，其中.廣料為黃 精鱗 0。(y> · 本發明尚提供一種檢測網織紅血球之方法，其包括Μ黃 精膦0為樣本染色；Κ激發波長之光線激發樣本；並测定 該樣本發射之螢光。 亦提供一種檢測網織紅血球之方法，其中樣本受到激發 *利用流動细胞計數器測定螢光。 本發明尚提供一種差別染色细胞之方法，所受到血小板 ，有核紅血球及豪威爾-左里二氏小體（Howe丨卜Jolly

Bod ies)之干擾較少。 本發明提供一種為细胞染色之方法，該方法所產生之 RNA -染料複合物比依其他已知方法產生之複合物更安定， 且-染料複合物所產生總色彩之可見時間加長。 臞示之簡蓉銳明 圖出示執行本發明方法所採用之流動细胞計數器之光 學圖解ί 圖2出示來自一位正常提血者之流動佃胞計數分析圖之 實例； 圖3出示來自一位異常（高）患者之流動细胞計數分析圖 之實例； 圖4出示RNA與黃精膦0試劑之劑最/效應圃； 圖5出示本發明CP0法對噻唑橙法之相翮性； (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I) 訂 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -6- A7 B7 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 、發明説明（4 阖6出示CPO之安定性； 圖7出示紅血球及血小板之分析圖；及 阃8出示紅血球及白血球之分析圖二 一 -- 發昍夕註钿說明 . 為了方便起見，本發明為網織紅血球染色之染料稱為g 精膦0 (CP0)，亦已知為餘性黃色七號。黃精膦0可得自 康乃狄克州華特堡瓦茲與包爾公司之阿塞德分公司 ^Pfaltz & Bauer, Inc. Division.of Aceto Corporation, tfaterbury , Connecticut) 〇 本申請者已發現黃精膦0為染色網織紅血球之有效染料 。網織紅血球染色之功能為進一步顯現網嫌紅血球，供用 於流動细胞計數器中進行光散射計數。因此使用黃精滕0 作為染料，即可檢測及計算全血樣中之網織紅血球數。黃 精膦0為一種螢光染料，不會使網織紅血球之细胞内核酸 沉澱。 使用黃精膦0之優點為可差別染色细胞，受血小板、有 核紅ώΓ球及豪威爾-左里二氏小球之干擾較少。黃精膦〇 另一個儍點為提高R Η Α-染料複合物之安全性，藉以使RH A -染料複合物所產生總色彩之可見時間加長。因此所產生 之色彩之安定時間遠比相闞技藝所使用染料之安定時間長 ，例如：使用噻唑橙所產生之色彩可安定保持約2小時， 而使用黃精膦0所產生之色彩則可安定保持約8至24小時 〇 根據本發明，當血樣中網織紅血球染色時，最好使用黃 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- ----- —Ί--1 :衣.------.-訂 < (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 / 五、發明説明（5 ) 精膦0之水溶液，最好使用等張性生溫食鹽溶液，最佳者 為ISO TON*® I (美國專利案No. 3,962,125，佛羅里達州邁 阿密市高特公司（Coulter Corporative n, Miami _____

Florida)，CPO濃度約0.8至80毫克/升，1-40毫克/升較佳〜 ，5-10毫克/升最佳，該溶液可包含少量甲醇。血樣（可 為全血或血液分離部份）經黃精膦0溶液之染色法係由血樣 與黃精膦0溶液混合。血樣及溶液之使用體積應使得RBC 之濃度足以在儀器中操作。因此，.濃度範圍在1:50 -1 : 5000，Μ 1 : 1 00- 1 : 1000 較佳，1:200- 1:800最佳。樣 沐至少培養約60秒至約8小時，Μ30分鐘較佳，然後方進 入流動细胞計數器中。本申請者發現，CP0為活染料，因 此不需要固定。 當黃精膦0不與核糖核酸（RNA)结合時，產生很少或沒 有紅色螢光，且在約491.5 nm出現強烈级收峰。當黃精膦 0與網織紅色血球中之RNA結合時，其光學性質則有大幅 變化。特定言之，黃精膦0與網嫌紅血球中RNA结合時， 出現¥'烈紅色螢光。激發最大值出現在約49 1.5 nm，發射 最大值出現在約630 - 700 nm ，史托克遷移（Stokes shift)約160 nm。由於已結合之黃精膦0之激發高峰約 490 nm，因此使用自動化流動细胞計數器時，光源可為能 .. ——-. ι 量線約485 η#水銀蟛，或強烈發射約488 n 離子笛 射。雖然可在其他波長進行激發，但經黃精膦0染色之網 織紅血球最好在約 當黃精膦0不與白血球之去氧核糖核酸（DNA)结合時， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X-297公釐）_8 — --1---II - η 裝-----ΙΊ 訂—' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6) 產生很少或沒有綠色螢光，而當黃精膦0與白血球中DNA 结合時，則出現強烈綠色螢光。黃精膦0不與核酸结合時 ’不產生黃精膦〇染料之螢光，因此背景值低，..虞操作者 得Μ為自動化流動細胞計數器選擇螢光閥值（或”阿檻"）。 由於CPO與RNA結合時會發射紅色螢光，與DNA结合時 會發射綠色螢光，因此使用CPO之優點在於差別染色细胞 ，受到血小板、有核紅血球、白血球、及豪威爾一左里二 氏小體之干擾較少。此舉僅容許紅血球進入测定，因此計 數更正確。 此外，當CPO已结合時，綠色螢光量或強度與CPO因與 ”其他”结構物结合而產生之背景或非專一性染色量成比例 。此等细胞结構物或元素包括细胞層次Μ下之囊胞如：溶 小體、内囊胞、及小顆粒。此等元素均可依不同程度與 CPO結合，產生不同量之螢光。然而，僅單股RNA會與 CPO结合，且僅產生紅色螢光。吾等測定成熟紅血球族群 之綠色螢光之最大量，作為紅血球與網織紅血球之”閥值 "Γ有其他细胞之綠色螢光均超出此閥值。綠色螢光之 強度差異具有差別染色细胞之優點，可Μ淘汰非專一性细 胞如：血小板及白血球。 黃精膦0染料不會使RNA沈澱，因此Μ黃精膦0染色之 網織紅血球仍保持相當均一分佈之细胞内RNA ，因此個別 網織紅血球所測得螢光訊號與其RNA含量之間里幾近線性 之關係。臨床上，此點為醫生提供除了網織紅血球數Μ外 之資料，因為RNA含量為網織紅血球年舲之函數。因此， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210Χ297公釐） --J-------'装 I I---訂一Τ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 細431 B7 五、發明説明（7 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用黃精膦〇時，醫生即可得到網織紅血球年龄圖及簡單 之網織紅血球數。 使用黃精膦0為血樣中網纈紅血球;染色時，已多色之網 織紅血球之螢光訊號即可與成熟紅血球之螢光訊號區分，〜 因此不需再處理數據即可直接自流動細胞計數器中讀數。 經CPO染色之網織紅血球，RNA或DNA雖然最好使用自動 化流動细胞計數器計數，但亦可使用手動式過程或自動化 顯微鏡計數。 流動细胞計數器之基本觀念在於使细胞一次一涸通過專 一性感光區。利用水動力集中法 > 使單一细胞通過感光區 ，其中包括聚焦雷射光源及檢測糸統，可測定散射光及螢 光。 自動化流動细胞計數器係相關技藝習知者，且本發明不 限於使用任何特定流動畑胞計數器。 本發明所使用流動细胞計數器之光學實例說明於下文中 \/請參考圖1 。圖1之光學圖係用於流動细胞計數器中， 供測定右邊角度之散射光…紅色螢光及綠色螢光。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 以10表示之光學圖使用(JT離?^射12作為光源，其操作 波長為488 ηπ^輸出量15 mW3 由雷射12發射之光由一個 'η,-..,-.-— 柱形鏡聚集，依一般方式，照亮流經流動測光管14之血樣 Ο 當樣本中已染色之紅血球受到雷射光照射時，產生散射 光及螢光。右邊角度之散射光與螢光經過凝集鏡18聚集後 ，通過小孔20，落至雙色鏡22上。雙色鏡22會反射右邊角 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）_ι〇_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 度之散射光24，透射出螢光26。雙色鏡22所反射右逄角度 之散射光24則由光電倍加管或光二極管28檢測°通過雙色 鏡22之螢光26中，綠色螢光32被雙色:鏡30反射，色蛮光 38則透射通過雙色鏡。反射之綠色螢光32通過有色滤片〜 34，並由光電倍加管36檢測。透射之紅色螢光通過有色滤 片40，由光電倍加管42檢測。 因此，例如：Μ黃精膦0染色之網織紅血球可於 COULTER® XL流動细胞計數器（佛羅里達州邁阿密市高特 公司出售）中檢測及計數。使用此等自動化流動细胞計數 -器時，使用血樣中成熟紅血球之位置來設定螢光閥值’然 後設定螢光閥值來計算網織紅血球數。 使用自動化流動细胞計數器檢測及計算涇黃精膦〇染色 之網織紅血球數之结果與依已知標準方法使用亞甲藍或吖 啶橙，或噻唑橙計算網織紅血球數之结果圼緊密相關性。 自動化流動细胞計數器中使用經黃精膦0染色之網織紅 血球之特別優點在於螢光背景低，且容易選擇螢光閥值。 此外Γ不會使細胞内網識紅·血球R N A沉澱，因此不需要固 定细胞-。此外，個別網織紅血球之螢光訊號與網織紅血球 年龄之間圼線性相關性，因此亦提供了網織紅血球年舲之 訊息。 K黃精膦0染色之網織紅血球雖然最好使用自動化流動 细胞計數器計數，但亦可利用手動過程或自動化顯微鏡測 定。 因此，本方法包括下列步驟： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210XZW—公釐） · 1 裝 訂 J ?*·'" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（9 ) (a) 由待測試之樣本與含有本衍生物染料組合物之本試 劑姐合物混合，形成细胞懸浮液； (b) 該细胞懸浮液於至少2 t：但不25 t：之溫.J| _下.培養 至少1分鐘但不超過2 4小時； · (c) 於流動细胞計數器上測定细胞產生之螢光； (d) 由光散射時所區分之紅色螢光對綠色螢光（LFS對 SS)產生相關數據分析圖； (e) 選擇網織紅血球族群之螢光.閥值；及 (f) 計算網織紅血球總數，為網織紅血球百分比XRBC 總數之值（RBC缌數（十億單位數/毫升）*係得自血液分析 儀如：COULTER STKS (佛羅里達州遇阿密市高特公司）。 下列不設限實例說明本發明各種特色。利用下列染色實 例得到之结果示於圖4 - 8。 竄例.1 樣本收集在三磷酸鹽EDTA (K3 EDTA)中。取0.002毫升 之患者全血樣加至1.0毫升試劑中。樣本混合，於室溫下 培養¥少1 5分鐘，但不超過θ小時。即將於刻度化之XL流 動细胞計數器上分析之前，方再度混合樣本。 圖2-4出示正常及異常血液使用CP0分析網雛紅血球之 數據，特定言之，圖2出示正常人血液之螢光圖，由525 nm光電倍加管及630 nra光電倍加管檢測紅血球之分佈。如 圖2所示，Ε區之網織紅血球可與白血球及血小板區隔。 圖3出示異常血液之螢光圖，由525 nm光電倍加管及 630 nm光電倍加管檢測紅血球之分佈。由圖3可見，網織 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X7297公釐） I I J- I IN I I - ^ I - I - n ΙΪ —J. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（10) 紅血球區（E區）之數量增加。如圖3所示，CP0與RHA有專 —性反應，樣本中RNA量增加造成螢光增加。 圖4出示試劑與增加量之核耱核酸C( R N A )混合.狡二随劑 量赛化之效應圖。RNA添加量愈多，螢光強度增加愈多。— 圖5出示本發明CP0法對噻唑橙法（參考方法）之相闞性 。如圖5所示，CP0之结果與參考方法之结果相同，因此 CP0可测定網織紅血球。 圖6出示，CP0之安定性，為時間對網嫌紅血球數百分 比之函數。圖6顯示血液與試劑混合後，需15分鐘方達到 平衡。一旦達到平衡後，CP0-RNA複合物保持安定至少8 小時。另一方面，噻唑橙、吖啶橙及硫黃素T之安定性則 小於2小時。 圖7出示紅血球與血小板之分析圖。使用血小板数增加 之樣本。紅血球與血小板之分析顯示，血小板之分佈不同 於網織紅血球之分佈。 圖8出示紅血球與白妞球之分析圖。使用白血球數增加 之樣本f。紅血球與白血球之分析顯示，白血球之分佈不同 於紅血球及網織紅血球之分佈。 根據上述技術可為本發明進行各種修飾與變化，因此可 別於本文之特別說明來進行本發明。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210XW7公釐）_13_ m —^ϋ 1m am m· tl^i> ^^^^1 nn n. t 1 nn —Bn ίβ i J V. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1. 第84105347號專利申請累 中文申講專利範匾修正本（85年2月）

   申請專利範圍 :充 Γΐ. 一種檢測全血櫟本中網孅紅血球之方法，其特m在於該 方法包括下列步驟： ⑶ Μ黃精賊0 (coriphosphine 0)染色樣本； (b) 以激發波長之光激發樣本；及 (〇 測定該樣本發射之螢光。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步特徵在於該 樣本受到激發，並利用流動细胞計數器測定螢光。 3. 根據申誚專利範圍第1項之方法》其進一步特徽在於該 樣本受到檄發，並利用螢光顯微鏑測定螢光。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步特徽在於該 樣本於流動细胞計數器中受到來自水銀弧燈之光激發。 6 . n^i i ml —^ϋ I n^i i In I- n I. . · m ΐ J . 〆 穿 . 、\έ (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 9. 根據申請 樣本於流 根據申請 嫌魟血球 根據申講 嫌紅血球 一種為全 試劑之特 張中性溶 一種於樣 RHA-染料 專利範 動细胞 專利範 未經遇 專利範 輿白血 血樣中 徹在於 液。 本中產 複合物 圍第1項之方法， 計數器中受到來自 圍第1項之方法， 固定即可檢測。 圃第1項之方法， 球和血小板係差別 之網嫌紅血球染色 其中包含黃精膦0 生安定之RHA-染料 可安定8至24小時 其進一步特徴在於該 蠹雷射之光激發。 其進一步特激在於網 其進一步特微在於網 染色。 K供定量之試劑*該 溶於出6.0至8.0之等 複合物之方法，該 ，該方法特撖在於下 列步驟： ^ 將待测樣本與含有溶於等張中性溶液之黄精膦〇之 本紙張尺咬迺用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X29^^ ) A8 B8 C8 D8 試 (b> 讓 網 1 〇. —種利 方法* (a) 液之黃 (b) •使網 (c) (d) 綠色螢 (e) 申請專利範圍 劑涓合；及 樣本輿試劑反應不少於1分鳙旦不多於24小時使 嫌紅血球有效吸收該試劑。 用流動细胞計數器定量全血樣中網嫌紅血球數·之 其包括下列步骤： 將待測試之全血血液樣本與包含溶於等張中性溶 精膦0之試劑混合； 讓樣本及試劑反應不少於1分鏡且不多於24小時 嫌紅血球有效吸收該試劑； 使混合物通過流動细胞計數器； 測定紅血球族群於光散射時所區分之紅色费光對 光之強度； 由該測定值決定樣本中網織紅血球數百分比量 -I.----I ^^1 111 _ 11 I ,.--：--—訂 (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X294%公釐）